CH648846A5 - Verfahren zur herstellung von mutterkornalkaloiden, insbesondere ergokornin und beta-ergokryptin. - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Mutterkornalkaloiden, insbesondere Ergokornin und ß-Ergo-kryptin, durch Verwendung eines neuen Stammes von Claviceps purpurea.

Es ist bekannt, dass der durch Hydrieren des Ergotoxins erhaltene Arzneimittelwirkstoff Dihydroergotoxin ein Gemisch aus Dihydroergokristin, Dihydroergokornin und Di-hydroergokryptin ist (ungarische Patentschrift Nr. 129 061). 1967 wurde bekannt, dass das Ergokryptin in zwei Formen existiert: neben dem bereits früher identifizierten -a-Ergo-kryptin kann auch ß-Ergokryptin aus der Mutterkorndroge isoliert werden (W. Schliem u. a.: Experientia 23, 991, [1967]). Das mittels Drogenextraktion beziehungsweise halbsynthetisch hergestellte ß-Ergokryptin wurde pharmakologisch untersucht und erwies sich als geeignet zur Beeinflussung der andronolytischen Aktivität, des Serotonin-Anta-gonismus, der Uterusmotilität und dss vasoculären Tonus.

In der belgischen Patentschrift Nr. 824 987 ist der erste Claviceps purpurea Stamm beschrieben, der hauptsächlich ß-Ergokryptin produziert. Dieser Stamm trägt in der eigenen Sammlung der Farmitalia die Bezeichnung FI 7374.

Wird dieser Stamm in einem als Kohlenstoffquelle zum Beispiel Saccharose, Glucose, Mannit, als Stickstoffquelle zum Beispiel Asparagin, Peptone, hydrolysiertes Casein und Ammoniumsalze enthaltenden Nährmedium unter Belüftung bei 24°C gezüchtet, so ist innerhalb von 10-16 Tagen ein Gesamtalkaloidspiegel von 950-1240 Gamma/ml erreichbar. Das hauptsächlich ß-Ergokryptin enthaltende Alkaloidge-misch ist jedoch reich an Ergosin und kann deshalb nicht unmittelbar (ohne die Abtrennung des Ergosins) zur Ergo-toxinherstellung verwendet werden.

In eigenen Versuchen wurde aus dem in einem nicht künstlich inokulierten Roggenfeld wachsenden Claviceps-Sklerotium der Pilz gezüchtet und aus diesem gemäss der ungarischen Patentschrift Nr. 151 724 durch wiederholte Selektion unter abwechselnder Isolierung der Kolonien und Anreicherung in der flüssigen Kultur ein stabiler Variant des Stammes Claviceps purpurea erhalten.

Die Grundlage der Selektion besteht darin, dass auf dem in der genannten Patentschrift beschriebenen Nährboden der alkaloidproduzierende Stamm farbige Kolonien bildet, die von den weissen Kolonien der nicht produzierenden Stämme gut unterschieden werden können.

Die Kolonien des alkaloidproduzierenden neuen Stammes werden isoliert und zum Zwecke der Anreicherung auf ein sog. differenzierendes Nährmedium überimpft. Das differenzierende Nährmedium enthält neben anorganischen Phosphaten und anderen Mineralsalzen in erster Linie Saccharose, Bernsteinsäure und Glycin.

Durch mehrfaches Wiederholen der Schritte Isolierung und Anreicherung wird der neue Variant des Stammes erhalten. Der Variant (Hausbezeichnung: CLY) wächst langsamer als die Kultur des Feldstammes Claviceps, er erzeugt 5 keine Konidien und ist in sämtlichen Nährmedien morphologisch der Hefe ähnlich, d.h. die für die Mycelform charakteristischen fadenartigçn Hyphen fehlen.

Makroskopische Beschreibung des Stammes io Auf dem zum Selektieren verwendeten, Stärke und Tryptophan enthaltenden Agarmedium sind nach 10 Tagen die Kolonien von gerunzelter Oberfläche und orange-rosa Färbung, sie sind scharf abgegrenzt, ihr Durchmesser beträgt 6-8 mm. Nach 20 Tagen haben die Kolonien einen Durch-is messer von 20-25 mm, weisen in der Mitte eine Erhebung auf und sind radial gerunzelt, ihre Farbe ist rosa-lila. Die Unterseite der Kolonien ist dunkelbraun, der Nährboden in ihrer Umgebung ist lila verfärbt.

Auf Malzagar bildet der Stamm im Alter von 10 Tagen 20 hellbeigefarbene Kolonien von 1-2 mm Durchmesser und regelmässiger Halbkugelgestalt. Im Alter von 20 Tagen haben die Kolonien einen Durchmesser von 2-4 mm, ihr Wachstum ist schwach, ihre Farbe hat sich nach bräunlich vertieft. Auf St-Agar sind die Kolonien des Stammes im Alter von 25 10 Tagen scharf umgrenzt, in Richtung auf die Mitte zu gerunzelt, haben in der Mitte eine spitze Erhebung und weisen einen Durchmesser von 8-12 mm auf. Die Spitze ist 3-5 mm hoch. Die Farbe der Kolonien ist beige bis hellbraun. Nach 20 Tagen ist die Oberfläche der Kolonien stark und 30 zum Rande hin sich verzweigend gefurcht, die Spitze ist kraterförmig. Die Kolonien sind von hellbrauner Farbe, mit einer kakaoähnlichen Schattierung, ihr Durchmesser ist verschieden und liegt zwischen 25-40 mm, die Höhe beträgt 6-8 mm. Die Kolonien lassen sich schlecht von der Ober-35 fläche des Agars ablösen. Sie bilden keine Sporen.

Mikroskopische Charakterisierung des Stammes in flüssiger Kultur

Im Nährmedium GK nach 40 Stunden Kultivierung: 40 Kolonien aus wenigen Zellen beziehungsweise zum grossen Teil einzelne Zellen. Die Zellen sind 4-8 X 8-20 [i gross, zylindrisch, abgerundet oder von unregelmässiger Form. Teilung am Zellenende oder durch Seitenverzweigung kann gleichermassen häufig beobachtet werden. Die Zellenreihen 4s sind kurz, bestehen aus einigen Zellen. Unter dem Phasenkontrastmikroskop erscheinen die Zellen stark gekörnt, die älteren Zellen enthalten Vakuolen. Keine Sporenbildung.

Im St-Nährmedium nach 40 Stunden Kultivierung: Das Mikroskopische Bild ist mit dem bereits beschriebenen so identisch mit dem Unterschied, dass auf diesem Nährmedium die Bildung von Kolonien beziehungsweise Zellenreihen häufiger ist. Die einzelnen Zellen sind grösser, die grösseren, älteren Zellen enthalten keine Vakuolen.

Die bei der Untersuchung der makroskopischen und miss kroskopischen Erscheinung verwendeten Nährmedien werden zum Teil im folgenden angegeben, während die Nährmedien St-Nährmedium, St-Agar und Nährmedium GK im Beispielteil beschrieben werden.

60 Stärke-Tryptophan-Agar

Stärke 20 g

Tryptophan 1 g

Kaliumchlorid 1 g

Diammoniumhydrogenphosphat 2 g

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Der pH-Wert wird auf 6,6-6,8 eingestellt und das Volumen mit Wasser auf 1000 ml aufgefüllt; zu der Flüssigkeit werden 25 g Agarpulver (Difco) gegeben, das Nährmedium

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wird aufgekocht, zu je 150 ml in Flaschen gefüllt und sterilisiert.

Malzagar-Nährmedium

Malzextrakt 60 g

Wasser ad 1000 ml

Agarpulver (Difco) 25 g

Das Nährmedium wird aufgekocht, zu je 150 ml in Flaschen gefüllt und sterilisiert.

Biochemische Charakteristika des Stammes

Zersetzt mit dem Enzym ß-Fruchto-furanosidase Saccharose und bildet Transfer-Oligosaccharide; verwertet Ci-tronensäure gut; produziert ein in erster Linie aus Hydroxy-anthrachinonen bestehendes Pigment von Anthrachinon-charakter.

Wird der neue Stamm an aus der Literatur bekannten, Zucker und das Ammoniumsalz einer organischen Säure enthaltenden Nährmedien gezüchtet, so produziert er Alkaloide. 25-30% des entstehenden Alkaloidgemisches sind ß-Ergokryptin, die Hauptmenge, 55-60%, ist Ergokornin, der verbleibende Anteil a-Ergokryptin. Ausser den charakteristischen Peptidalkaloiden bildet der Stamm nur Ergometrin.

Der oben beschriebene neue Variantstamm von Claviceps purpurea wurde beim Hungarian National Collection of Medicai Bacteria Gyali ut 2-6, H-1966 Budapest am 9. Mai 1979 unter der Bezeichnung 00186 MNG deponiert.

Bei der Untersuchung der Anwendungsgebiete des unter der Bezeichnung MNG 00186 deponierten Stammes wurde gefunden, dass der Stamm bei unter aeroben Bedingungen vorgenommener Fermentierung an einem Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, Mineralsalze und gegebenenfalls weitere Zusätze enthaltenden Nährmedium gewisse Komponenten des Ergotoxins, nämlich Ergokornin, a- und ß-Ergokryptin, produziert.

Ferner wurde gefunden, dass die Menge der produzierten Alkaloide in der Fermentierungsflüssigkeit ansteigt, wenn man während der Fermentierung als Präkursor der entstehenden Verbindungen Valin und/oder Isoleucin zu der Fermentierungsflüssigkeit gibt.

Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Herstellung von Mutterkornalkaloiden, insbesondere Ergokornin und ß-Ergokryptin durch unter aeroben Bedingungen vorgenommene Fermentierung vom Mikroorganismus Claviceps purpurea an einem Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, Mineralsalze und gegebenenfalls sonstige Zusätze enthaltenden Nährmedium. Für das Verfahren ist kennzeichnend, dass man als Mikroorganismus den Variantstamm Claviceps purpurea MNG 00186 verwendet.

Erfindungsgemäss wird die Fermentierung vorzugsweise in Submerskultur, unter aeroben Bedingungen in einem Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, Mineralsalze und gegebenenfalls sonstige Zusätze enthaltenden flüssigen Nährmedium vorgenommen.

Fermentiert wird bei Temperaturen zwischen 20 und 26°C, bei einem pH-Wert von 5,2-6,8 vier bis acht Tage lang.

Bei der Fermentierung werden gegebenenfalls die Menge der gebildeten Alkaloide steigernde Zusätze (Präkursoren), zum Beispiel Valin und/oder Isoleucin verwendet.

Der Präkursor wird der Kulturbrühe in einer Menge von 0,05-0,5 g/100 ml, vorzugsweise 0,1-0,3 g/100 ml, in Form einer wässrigen, eventuell schwach sauren Lösung nach dem Sterilisieren des Nährmediums zugesetzt. Der Präkursor kann auf einmal, in mehreren Portionen oder in einer Periode der Ferment-erung kontinuierlich zugesetzt werden.

In der Literatur wird die Produktion häufig durch die spektrophotometrisch gewonnenen Werte des Gesamtalka-loidgehaltes charakterisiert. Auch bei den hier beschriebenen Versuchen wurden auf der Grundlage von Farbreaktionen die Gesamtalkaloidwerte photometrisch gemessen; sie erwiesen sich jedoch als unspezifisch.

Zur Charakterisierung der Fermentation wurden die einzelnen Ergotoxin-Komponenten durch Elutionschromato-graphie oder quantitative Flüssigkeitschromatographie bestimmt. Die Verwendung des Stammes hat gegenüber den bisher bekannten Verfahren folgende Vorteile:

1. Die Produktion durch Fermentierung ist moderner als die Verfahren der Drogenextraktion. Die allgemeinen Nachteile der Zusammenarbeit mit der Landwirtschaft fallen fort, und das Verfahren kann durch unmittelbares technisches Eingreifen bei jeder Charge gesteuert werden.

2. Verglichen mit den aus einer langen Reihe von Reaktionen aufgebauten halbsynthetischen Verfahren wird im Falle der Fermentierung das komplizierte Molekül aus einfachen, leicht zugänglichen Stoffen (Saccharose, Ammoniumsalze) mit Hilfe der lebenden Zelle bei 24°C unter Zuführung von Luft hergestellt. Auch hat das halbsynthetische Verfahren nur die Synthese des Peptidteiles gelöst, der Ly-sergsäureteil muss unverändert durch Fermentierung aufgebaut werden.

3. Der Stamm produziert praktisch nur die Komponenten des Ergotoxins. Die geringe Menge Ergometrin kann, da Ergometrin wasserlöslich ist, leicht von den für die Ergo-toxinherstellung in Frage kommenden Peptidalkaloiden abgetrennt werden.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert, ist jedoch nicht auf die Beispiele beschränkt.

Beispiel 1

Die auf St-Agar-Nährboden gewachsene Kultur von Claviceps purpurea MNG 00186 wird auf 100 ml in einem 500 ml-Erlenmeyerkolben befindliches Nährmedium GK geimpft und bei 24°C auf dem Schütteltisch (Frequenz: 300/ min) 4 Tage lang inkubiert. Je 10 ml der erhaltenen Kultur werden auf insgesamt acht weitere, je 100 ml St-Nährmedium enthaltende Kolben überimpft. Diese Kulturen werden bei 24°C auf dem Schütteltisch 7 Tage lang fermentiert. Zu vier Kolben wird kein Präkursor gegeben, dem Inhalt der übrigen vier Kolben werden zu Beginn der Fermentation je 2 g Valin als Präkursor zugegeben. Am 7. Tag wird die Fermentation unterbrochen. Die Kulturbrühen ohne Präkursor werden vereinigt, ihr Alkaloidgehalt wird bestimmt. Der Ergokorninge-halt beträgt 80 y/ml, der a-Ergokryptingehalt 15 y/ml und der ß-Ergokryptingehalt 30 Y/ml.

Die mit Präkursor bereiteten Kulturbrühen werden ebenfalls vereinigt, ihr Alkaloidgehalt wird bestimmt. Sie enthalten 250 y/ml Ergokornin, 25 y/ml a-Ergokryptin und 30 y/ml ß-Ergokryptin.

Die verwendeten Nährböden:

Nährmedium GK

Trypcasin 7,0 g

Citronensäure 4,1 g

Kaliumdihydrogenphosphat 0,3 g

Magnesiumsulfat 0,3 g

Ammoniumhydroxyd ad pH 5,7-5,8

Wasser ad 840 ml

Je 84 oder 840 ml des Nährmediums werden in Kolben gefüllt und unter sterilen Bedingungen mit je 16 beziehungsweise 160 ml 50%iger Glucoselösung versetzt.

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St-Nährmedium

Saccharose 100,0 g

Bernsteinsäure 10,0 g

Kaliumdihydrogenphosphat 0,25 g

Magniesumsulfat 0,25 g

Ammoniumnitrat 1,0 g

Calciumchlorid 1,0 g Ammoniumhydroxyd ad pH 5,2-5,3

Wasser ad 1000 ml 100,0 g

Das Nährmedium wird in Portionen zu 100 ml in Erlen-meyerkolben oder in einer Menge von 100 Liter in einem halbtechnischen Fermentor sterilisiert.

Das St-Agar-Nährmedium (Blake) unterscheidet sich dadurch von dem flüssigen St-Nährmedium, dass ihm pro Liter 25 g Agarpulver zugesetzt werden. Nach dem Zusatz des Agars wird das Nährmedium aufgekocht, in Portionen von je 150 ml in Flaschen gefüllt und sterilisiert.

Beispiel 2

Die typischen, auf St-Agar-Nährmedium gewachsenen, 20 Tage alten Kolonien von Claviceps purpurea MNG 00186 werden von der Fläche des Agar abgelöst, in 20 ml steriler physiologischer Kochsalzlösung homogenisiert, und 10 ml der Suspension werden zu 100 ml vorsterilisiertem, in 500 ml-Erlenmeyerkolben befindlichem St-Nährmedium gegeben. Die Kultur wird 6 Tage lang bei 24 °C auf dem Schütteltisch gezüchtet und dann auf 100 ml in einem 500 ml-Erlenmeyerkolben befindliches Nährmedium TC-54 überimpft. Nach 3 Tagen Fermentierung auf dem Schütteltisch werden 10 ml der Kultur auf 100 ml in einem 500 ml-Erlenmeyerkolben befindliches, sterilisiertes St-Nährmedium überimpft. Diese Kultur wird unter den genannten Bedingungen auf dem Schütteltisch 7 Tage lang gezüchtet. Danach enthält sie folgende Alkaloidmengen: Ergokornin 150 Y/ml, a-Ergo-kryptin 40 y/nil und ß-Ergokryptin 90 y/ml.

Die Zusammensetzung des St-Nährmediums und des St-Agar-Nährmediums (Blake) wurde bereits in Beispiel 1

angegeben. Das Nährmedium TC-54 hat folgende Zusammensetzung:

Saccharose 100,0 g

5 Citronensäure 10,0 g

Natriumchlorid 10,0 g

Kaliumdihydrogenphosphat 0,5 g

Magnesiumsulfat 0,5 g

Ammoniumhydroxyd ad pH 5,7-5,8 io Wasser ad 1000 ml

Das Nährmedium wird zu je 100 ml in Erlenmeyerkol-ben von 500 ml Volumen oder zu je 10 Liter in Laborfermentoren von 15 Liter Volumen sterilisiert.

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Beispiel 3

Eine 25 Tage alte Kultur von Claviceps purpurea MNG 00186 auf St-Agar-Nährboden wird durch Abkratzen von 20 der Oberfläche des Agars entfernt und in 100 ml physiologischer Kochsalzlösung homogenisiert. Mit der erhaltenen Suspension wird 1 Liter Nährmedium GK (vorsterilisiert in einem Erlenmeyerkolben von 3 Liter Volumen) beimpft. Die Kultur wird bei 24°C 44 Stunden lang geschüttelt. Dann 25 wird die Kultur in einen Fermentor von 15 Liter Volumen eingebracht, in dem sich 10 Liter Nährmedium TC-54 befinden. Fermentiert wird bei 24°C unter Zuführung von 0,25 Liter/Liter, min Luft und einer Drehzahl von 240 min-1. Nach drei Tagen wird die Kultur in einen säurefesten 30 Laborfermentor (150 1) überführt, in dem sich 100 Liter St-Nährmedium befinden. Diese Kultur wird bei 22°C, einer Drehzahl von 150 min-1 und einer zugeführten Luftmenge von 0,35 Liter/Liter, min 6 Tage lang gezüchtet. Am 2., 3. und 5. Tag werden je 100 g Valin und 20 g Isoleucin zu 35 der Kulturbrühe gegeben.

Nach sechstägiger Fermentierung enthält die Kulturbrühe 320 y/nil Ergokornin, 60 y/ml a-Ergokryptin und 160 y/ml ß-Ergokryptin.

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Claims (4)

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1. Verfahren zur Herstellung von Mutterkornalkaloiden durch unter aeroben Bedingungen vorgenommene Fermentierung vom Mikroorganismus Claviceps purpurea an einem Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und Mineralsalze enthaltenden Nährmedium, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismus Claviceps purpurea MNG 00186 verwendet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Fermentierung bei 20 bis 26°C und einem pH-Wert von 5,2 bis 6,8 vornimmt.

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PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Valin und/oder Isoleucin zu der Fermentierungs-flüssigkeit gibt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man Ergokornin und ß-Ergo-kryptin herstellt.