DE1617951C3 - Process for the preparation of kasugamycin - Google Patents

Description

C₁₄H₂₅O₉N₃ · HCI · H₂OC ₁₄ H ₂₅ O ₉ N ₃ • HCl • H ₂ O

HCl · H₂OHCl · H ₂ O

Der Diaminozucker ist 2,3,4,6-Tetradesoxy-2,4-diamino-D-mannose. Die glykosidische Bindung ist in der α-Stellung. Der rechte Teil ist i>Inosit. Die Wasserstoffatome in den Stellungen C₁, C₂, C₃ und C₆ in dem D-Inosit sind axial, während die Wasserstoffatome in den Stellungen C₄ und C₅ äquatorial sind.The diamino sugar is 2,3,4,6-tetradeoxy-2,4-diamino-D-mannose. The glycosidic bond is in the α-position. The right part is i> inositol. The hydrogen atoms in the C ₁ , C ₂ , C ₃ and C _{6 positions} in the D-inositol are axial, while the hydrogen atoms in the C ₄ and C _{5 positions are} equatorial.

Kasugamycin inhibiert Piricularia oryzae, welche den Reisbrand verursachen, sowie Pseudomonas und zeigt gegenüber Menschen, Tieren, Fischen und Pflanzen eine geringe Toxizität. Dieses Antibiotikum wird zur Verhütung des Reisbrandes auf den Markt gebracht und wird außerdem als Chemotherapeutikum gegen Pseudomonas-Infektionen beim Menschen verwendet. Kasugamycin inhibits Piricularia oryzae, which cause the rice blight, as well as Pseudomonas and shows low toxicity to humans, animals, fish and plants. This antibiotic is marketed to prevent rice blight and is also used as a chemotherapy drug used against Pseudomonas infections in humans.

Experimentelle MethodenExperimental methods

1. Wertbestimmung von Kasugamycin: Pseudomonas fluorescens (ein Saprophyt, welches verschiedene fluoreszierende Pigmente erzeugt) wird auf ein Schrägagar aufgeimpft, das aus 0,2% Natriumglutamat, 0,2% K₂HPO₄, 0,1% MgCl₂-OH₂O, 0,01% FeSO₄-7H₂O, 2,0% Rohrzucker, 0,2% Nährhefe, 0,5% Pepton und 1,2% Agar (pH 6,8) besteht, und bei 27°C 24 Stunden lang inkubiert. Aus diesem Schrägagar wird das Impfmaterial in eine Fleischbrühe eingeimpft, die 1% Glukose enthält, und 24 Stunden lang bei 27° C inkubiert. Dann werden 10 ecm eines Mediums, das aus 0,5% Glukose, 0,5% Pepton und 2,0% Agar besteht, in eine Petri-Schale (Durchmesser 9 cm) gegeben und mit der Züchtungsschicht überschichtet, die aus 5 ecm des gleichen Mediums hergestellt wurde, welches mit der vorstehenden Kulturbrühe mit einer Konzentration von 0,5% beimpft worden war. Scheiben mit einem Durchmesser von 8 cm, die eine Testprobe enthalten, werden 17 bis 18 Stunden lang bei 27° C inkubiert. Die Probe1. Determination of the value of kasugamycin: Pseudomonas fluorescens (a saprophyte which produces various fluorescent pigments) is inoculated onto an agar slant made of 0.2% sodium glutamate, 0.2% K ₂ HPO ₄ , 0.1% MgCl ₂ -OH ₂ O, 0.01% FeSO ₄ -7H ₂ O, 2.0% cane sugar, 0.2% nutritional yeast, 0.5% peptone and 1.2% agar (pH 6.8), and at 27 ° C 24 Incubated for hours. From this agar slant, the inoculum is inoculated into a meat broth containing 1% glucose and incubated at 27 ° C. for 24 hours. Then 10 ecm of a medium consisting of 0.5% glucose, 0.5% peptone and 2.0% agar, placed in a Petri dish (diameter 9 cm) and covered with the culture layer, which consists of 5 ecm des the same medium inoculated with the above culture broth at a concentration of 0.5%. 8 cm diameter disks containing a test sample are incubated for 17-18 hours at 27 ° C. The sample

und der Standard (reines Kasugamycinhydrochlorid) werden mit einem PhosphatpuiTer mit einem pH-Wert von 7,0 verdünnt. Kasugamycin zeigt gewöhnlich bei 400mcg/ml eine Hemmung mit einem Durchmesser von ungefähr 22 mm.and the standard (pure kasugamycin hydrochloride) are mixed with a phosphate pen with a pH value diluted by 7.0. Kasugamycin usually shows inhibition with a diameter at 400mcg / ml of about 22 mm.

2. Schüttelkultur: Sie wird in Kolben mit einem Inhalt von 500 ecm auf einer sich hin und her bewegenden Schüttelmaschine (Amplitude 8 cm bei 150 Hin- und Herbewegungen pro Minute) oder in Erlenmeyer-Kolben mit einem Inhalt von 500 ecm auf einer Dreh-Schüttelmaschine (2CO UpIA) durchgeführt. 2. Shaking culture: it is placed in flasks with a content of 500 ecm on a shaking machine that moves back and forth (amplitude 8 cm at 150 back and forth movements per minute) or in Erlenmeyer flasks with a content of 500 ecm on a rotary Shaking machine (2CO UpIA) carried out.

3. Identifizierung von Kasugamycin: Kasugamycin in dem Kulturfiltrat wird an einem Kationenaustauscherharz (Harze mit Sulfonsäureradikalen als ,₅ aktive Gruppen) adsorbiert, das Sulfonsäure als aktive Gruppe enthält, die als H⁺- oder NH₄ ^1--TyP verwendet wird; das adsorbierte Kasugamycin wird mit verdünntem wäßrigem Ammoniak eluiert und nach der Neutralisation mit verdünnter HCl und _20: erfolgter Konzentration mit Äthanol ausgefällt und getrocknet. Das Pulver wird einer Elektrophorese mit hoher Spannung unterzogen, wobei gleichzeitig zu Vergleichszwecken reines Kasugamycin bei 3000V/ 40 cm behandelt wird. Erforderlichenfalls wird es in ₂$ Form seines Hydrochlorids aus Wasser durch Zugabe von Äthanol umkristallisiert.3. Identification of kasugamycin: kasugamycin in the culture filtrate is adsorbed on a cation exchange resin (resins having sulfonic acid radicals as ₅ active groups) containing sulfonic acid as an active group, which is used as H ⁺ or NH ₄ ^1- type; the adsorbed kasugamycin is eluted with dilute aqueous ammonia and, after neutralization with dilute HCl and ₂₀ % concentration, precipitated with ethanol and dried. The powder is subjected to high voltage electrophoresis while, for comparison purposes, pure kasugamycin is treated at 3000V / 40 cm. When required, it is recrystallized its hydrochloride from water by addition of ethanol in ₂ $ form.

Verschiedene Kohlenstoffquellen werden einem Medium zugesetzt, das aus 2,5% Sojabohnenmehl, 0,3% Natriumchlorid, 0,1% K₂HPO₄ und 0,05% MgSO₄ · 7H₂O besteht, worauf die Kasugamycin-Ausbeute in den verschiedenen Medien bestimmt wird. 70 ecm eines jeden Mediums werden in jeweils einen Kolben gegeben und unter Schütteln gezüchtet. Das Medium wird 15 Minuten lang bei 120⁰C sterilisiert. Eine Sporensuspension einer Kultur von Streptomyces kasugaensis (britische Patentschrift 1149 080 und schweizerische Patentschrift 473 893) wird aufgeimpft. Nach 6 oder 7 Tagen wird die höchste Ausbeute in allen Fällen bestimmt, wobei folgende Ergebnisse erhalten werden: 1360mcg/ml mit 3,0% Maltose, 1400mcg/ml mit 1,0% Sojabohnenöl, 2240mcg/ml mit 2,0% Sojabohnenöl und 2120mcg/ml mit 3,0% Sojabohnenöl. Man sieht also, daß das Sojabohnenöl gegenüber Maltose als Kohlenstoffquelle zur Herstellung von Kasugamycin nicht unterlegen, sondern überlegen ist. Verunreinigungen der Maltose vermindern oft die Ausbeute an Kasugamycin, so daß aus praktischen Gründen Sojabohnenöl gegenüber Maltose zur Herstellung weit überlegen ist. Maltose oder Glycerin ist als beste Kohlenstoffquelle für die Herstellung bekanntgeworden. Unter Verwendung des gleichen Grundmediums, welches vorstehend beschrieben wird, werden verschiedene öle oder Fette in einer Menge von 2,0% zugesetzt und die gleiche Kultur von Streptomyces kasugaensis unter Schütteln gezüchtet. Anschließend werden folgende maximale Ausbeuten ermittelt: 2400mcg/ccm mit Kokosnußöl, 2750 mcg/ccm mit Erdnußöl, 1800 mcg/ccm mit Olivenöl, 2500 mcg/ml mit Sojabohnenöl, 2300 mcg/ccm mit Leinsamenöl, 2400 mcg/ccm mit Rapsöl, 2350 meg/ ecm mit Baumwollsamenöl, 2050 mcg/ccm mit Walöl, 2400 mcg/ccm mit Schweinefett und 2300 mcg/ccm mit Butter. Bei den vorstehend beschriebenen Versuchen wird ein Sojabohnenmehl in Pulverform verwendet, aus welchem öle und Fette entfernt worden sind. Enthält ein als Stickstoffquelle verwendetes Material öle oder Fette, dann können die öle oder Fette in diesem Material zur Herstellung mit oder ohne Zugabe von ölen nutzbar gemacht werden, öle oder Fette in Materialien, wie Sojabohnensamen, Erdnußsamen oder Baumwollsamen können als Kohlenstoffquelle für die Herstellung von Kasugamycinstämmen und zur Herstellung von Kasugamycin verwendet werden. Das Verfahren zur Herstellung und Gewinnung des neuen Antibiotikums Kasugamycin ist in der deutschen Auslegeschrift 1 236 727 beschrieben. Dabei werden die Stämme ATCC 15714 und ATCC 15715 verwendet.Various carbon sources are added to a medium consisting of 2.5% soybean meal, 0.3% sodium chloride, 0.1% K ₂ HPO ₄ and 0.05% MgSO ₄ · 7H ₂ O, whereupon the kasugamycin yield in the various Media is determined. 70 cc of each medium is placed in each flask and cultured with shaking. The medium is ^{sterilized at 120 °} C. for 15 minutes. A spore suspension of a culture of Streptomyces kasugaensis (British patent 1149 080 and Swiss patent 473 893) is inoculated. After 6 or 7 days, the highest yield is determined in all cases, the following results being obtained: 1360mcg / ml with 3.0% maltose, 1400mcg / ml with 1.0% soybean oil, 2240mcg / ml with 2.0% soybean oil and 2120mcg / ml with 3.0% soybean oil. It can thus be seen that soybean oil is not inferior but superior to maltose as a carbon source for the production of kasugamycin. Impurities in the maltose often reduce the yield of kasugamycin, so that for practical reasons soybean oil is far superior to maltose for production. Maltose, or glycerin, has become known as the best source of carbon for manufacturing. Using the same basic medium as described above, various oils or fats are added in an amount of 2.0% and the same culture of Streptomyces kasugaensis is grown with shaking. The following maximum yields are then determined: 2400 mcg / ccm with coconut oil, 2750 mcg / ccm with peanut oil, 1800 mcg / ccm with olive oil, 2500 mcg / ml with soybean oil, 2300 mcg / ccm with linseed oil, 2400 mcg / ccm with rapeseed oil, 2350 meg / ecm with cottonseed oil, 2050 mcg / ccm with whale oil, 2400 mcg / ccm with pork fat and 2300 mcg / ccm with butter. In the experiments described above, a soybean meal is used in powder form from which oils and fats have been removed. If a material used as a nitrogen source contains oils or fats, then the oils or fats in this material can be used for the production with or without the addition of oils; oils or fats in materials such as soybean seeds, peanut seeds or cottonseed can be used as a carbon source for the production of Kasugamycin strains and can be used for the production of kasugamycin. The process for producing and obtaining the new antibiotic kasugamycin is described in German Auslegeschrift 1,236,727. The strains ATCC 15714 and ATCC 15715 are used.

Bei einem ähnlichen Versuch, wie er vorstehend beschrieben wird, wird ein Kasugamycin erzeugender Stamm in ein Medium eingeimpft, das 6,0% vermahlenen Sojabohnensamen, 0,05% K₂HPO₄, 0,1% NaCl und 0,05% MgSO₄ · 7H₂O enthält; auf diese Weise werden 2720 mcg/ccm Kasugamycin nach 7tägigem, unter Schütteln erfolgendem Züchten gewonnen. Kasugamycin wird ■ ferner nach 7tägiger Züchtungsdauer in einem Medium, das 8,0% vermahlenen Erdnußsamen an Stelle des vermahlenen Sojabohnensamens enthält, in einer Ausbeute von 2460 mcg/ccm erhalten.In an experiment similar to that described above, a kasugamycin producing strain is inoculated into a medium containing 6.0% ground soybean _{seeds, 0.05% K 2} HPO ₄ , 0.1% NaCl and 0.05% MgSO ₄ · 7H ₂ O contains; in this way, 2720 mcg / cc of kasugamycin is obtained after 7 days of cultivation with shaking. Kasugamycin is also obtained in a yield of 2460 mcg / ccm after 7 days of cultivation in a medium containing 8.0% ground peanut seeds instead of ground soybean seeds.

öle oder Fette sind Kohlenstoffquellen, die zur Herstellung von Kasugamycin auch in solchen Medien geeignet sind, die andere Stickstoffquellen außer Sojabohnenmehl enthalten. Es werden hohe Kasugamycinausbeuten in Medien erzielt, die Nährhefe, Fleischextrakt, Pepton, Molke oder anorganischen Stickstoff als Stickstoffquelle enthalten. Nicht nur pflanzliche öle, pflanzliche Fette, tierische öle oder tierische Fette, sondern auch Fettsäuren oder deren Ester sind als Kohlenstoffquellen zur Herstellung von Kasugamycin geeignet. Nach der vorstehend beschriebenen Arbeitsweise werden Versuche durchgeführt, bei denen eine verschiedene Unterkultur von Streptomyces kasugaensis verwendet wird; es werden folgende Kasugamycinausbeuten in Medien erhalten, die 2,0% Fettsäure oder Fettsäureester enthalten: 1050 mcg/ccm mit Palmitinsäure, 1200 mcg/ccm mit Stearinsäure, 320 mcg/ccm mit Glycerintristearat, 3100 mcg/ccm mit Glycerintrioleat, 910 mcg/ccm mit Methylpalmitat, 1800 mcg/ccm mit Methyloleat, 1840 mcg/ccm mit Äthyloleat, 1800 mcg/ccm mit Butyloleat, 320 mcg/ccm mit 2,0% Glycerin und 880 meg/ ecm mit 3,0% Maltose. Es sind also nicht nur Glycerin, sondern auch Fettsäuren, die Hydrolyseprodukte von ölen oder Fetten darstellen, zur Herstellung von Kasugamycin geeignet. Der produktivste Stamm (s. deutsche Auslegeschrift 1 236 727) der erhalten werden kann, erzeugt bei einem unter Schütteln durchgeführten Züchtungsverfahren 10 000 mcg/ml Kasugamycin in einem Medium, das aus 6,0% Sojabohnenöl und 5,0% Sojabohnenmehl (der anfängliche pH-Wert wird auf 6,5 eingestellt) besteht.Oils or fats are carbon sources necessary for the production of kasugamycin also in such media containing nitrogen sources other than soybean meal are suitable. There are high yields of kasugamycin Achieved in media containing nutritional yeast, meat extract, peptone, whey or inorganic Contain nitrogen as a source of nitrogen. Not just vegetable oils, vegetable fats, or animal oils Animal fats but also fatty acids or their esters are used as carbon sources for the production of Kasugamycin suitable. According to the procedure described above, experiments are carried out using a different subculture of Streptomyces kasugaensis; it will the following kasugamycin yields are obtained in media containing 2.0% fatty acids or fatty acid esters: 1050 mcg / ccm with palmitic acid, 1200 mcg / ccm with stearic acid, 320 mcg / ccm with glycerol tristearate, 3100 mcg / ccm with glycerol trioleate, 910 mcg / ccm with methyl palmitate, 1800 mcg / ccm with methyl oleate, 1840 mcg / ccm with ethyl oleate, 1800 mcg / ccm with butyl oleate, 320 mcg / ccm with 2.0% glycerine and 880 meg / ecm with 3.0% maltose. So it is not only glycerine but also fatty acids that are the hydrolysis products of represent oils or fats, suitable for the production of kasugamycin. The most productive tribe (See German Auslegeschrift 1 236 727) which can be obtained, generated on one with shaking cultivation process carried out 10,000 mcg / ml kasugamycin in a medium consisting of 6.0% soybean oil and 5.0% soybean meal (the initial pH is adjusted to 6.5).

B e i s ρ i e 1 1B e i s ρ i e 1 1

70 ml eines Mediums, das 0,3% Nährhefe, 0,4% Pepton, 0,1% K₂HPO₄, 0,1% NaCl, 0,05% MgSO₄ · 7H₂O, 0,02% FeSO₄ · 7H₂O und 0,5% Sojabohnenöl enthält, werden in einen Kolben mit einem Inhalt von j 500 ecm gegeben und 20 Minuten lang bei 120° C sterilisiert. Eine Mischung aus Myzel und Sporen von Streptomyces kasugaensis (s. deutsche Auslegeschrift 1 236 727) auf einer Schrägagarkultur wird in 5 Kolben eingeimpft, die das sterilisierte Medium enthalten und unter Schütteln bei 28 bis 30° C gezüchtet.70 ml of a medium containing 0.3% nutritional yeast, 0.4% peptone, 0.1% K ₂ HPO ₄ , 0.1% NaCl, 0.05% MgSO ₄ · 7H ₂ O, 0.02% FeSO ₄ · 7H ₂ O and 0.5% soybean oil are placed in a flask with a capacity of 500 ecm and sterilized at 120 ° C for 20 minutes. A mixture of mycelium and spores of Streptomyces kasugaensis (see German Auslegeschrift 1 236 727) on a slant agar culture is inoculated into 5 flasks containing the sterilized medium and grown at 28 to 30 ° C. with shaking.

Während der unter Schütteln erfolgenden Züchtung werden alle 24 Stunden viermal 0,5% Sojabohnenöl zugesetzt. Die durchschnittliche Menge an Kasugamycin in den 5 Kolben beträgt 2880 mcg/ccm. Die Brühen in den 5 Kolben werden vereinigt und filtriert, wobei 280 ecm Filtrat erhalten werden, das 2900 mcg/ccm Kasugamycin enthält. Das Filtrat wird durch eine Säule mit einem Durchmesser von 1 cm geleitet, welche 50 ecm schwefelsaures Harz in der NH₄ ¹"-Form enthält. Nach der Durchschickung von 500 ml Wasser werden 0,5 η-ΝΗ,,/Η durchlaufen gelassen, wobei in einer Menge von 32 ecm ein Eluat erhalten wird, welches Aktivität besitzt. Es wird mit 1 n-HCl neutralisiert und liefert nach der Konzentrierung im Vakuum und nach dem Trocknen 2,1 g eines hellbraunen Pulvers. Es enthält 540 mg Kasugamycin, die Hochspannungs-Elektrophorose zeigt, daß es nur Kasugamycin als antimikrobielle Substanz enthält.During the cultivation with shaking, 0.5% soybean oil is added four times every 24 hours. The average amount of kasugamycin in the 5 flasks is 2880 mcg / ccm. The broths in the 5 flasks are combined and filtered to give 280 cc of filtrate containing 2900 mcg / cc of kasugamycin. The filtrate is passed through a column with a diameter of 1 cm which contains 50 ecm of sulfuric acid resin in the NH ₄ ¹ "form. After passing through 500 ml of water, 0.5 η-ΝΗ ,, / Η are allowed to pass through, an eluate with activity being obtained in an amount of 32 ecm. It is neutralized with 1N HCl and, after concentration in vacuo and after drying, yields 2.1 g of a light brown powder. It contains 540 mg of kasugamycin, which High voltage electrophoresis shows that it contains only kasugamycin as an antimicrobial substance.

Beispiel 2Example 2

Nach der im Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise wird derselbe Stamm unter Schütteln 48 Stunden lang in einem Medium gezüchtet, das 2,5% Sojabohnenmehl (das Fett ist entfernt), 0,1% K₂HPO₄,0,3% NaCl, 0,04% ZnSO₄ · 5H₂O, 0,3% Glukose und 1,5% Sojabohnenöl enthält. 75 ecm der auf diese Weise erhaltenen Brühe werden in 10 1 Medium eingeimpft, das aus 2,5% Sojabohnenmehl (das Fett ist entfernt), 0,1% K₂HPO₄, 0,05% MgSO₄-7H₂O, 2,2% gereinigtem Walöl und 0,02% Silikonharz als Antischaummittel (der anfängliche pH-Wert wird auf 6,8 eingestellt) enthält, worauf 25 Minuten lang in einem Fermentationsgefäß mit einem Inhalt von 201 bei 12O⁰C sterilisiert wird. Die Fermentation erfolgt unter Rühren (300 Upm), wobei 10 1 Luft/Minute bei einer Temperatur von 28⁰C durchgeleitet werden. Nach 96 Stunden werden 2350 mcg/ccm Kasugamycin erhalten. 300 ecm des Mediums werden entnommen, worauf das Kasugamycin nach der vorstehend beschriebenen Arbeitsweise extrahiert wird; auf diese Weise werden 2,1 g eines Pulvers erhalten, das 415 mg Kasugamycin enthält. Dieses Pulver wird in 100 ml destilliertem Wasser gelöst und durch eine Säule mit einem Durchmesser von 1 cm durchlaufen gelassen, die 50 ml eines stark sauren SO₃-Gruppen enthaltenden Austauscherharzes in der H⁺-Form enthält, worauf 50 ecm Wasser durchgeschickt werden. Das adsorbierte Kasugamycin wird mit 1 n-HCl eluiert. 23 ecm des Eluats mit antimikrobieller Aktivität werden mittels eines Anionenaustauscherharzes (Amberlite IRA 401 ist ein stark basisches Anionenaustauscherharz, und die aktiven Austauschradikale bestehen aus — N(CH₃)₂X) auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt und unter Vakuum auf 5 ecm konzentriert, worauf 50 ecm Äthanol zugesetzt werden. Auf diese Weise kristallisierten 210 mg Kasugamycinhydrochlorid (C₁₄H₂₅O₉N₃HCl · H₂O).Following the procedure described in Example 1, the same strain is grown with shaking for 48 hours in a medium containing 2.5% soybean meal (the fat has been removed), 0.1% K ₂ HPO ₄ , 0.3% NaCl, 0, Contains 04% ZnSO ₄ · 5H ₂ O, 0.3% glucose and 1.5% soybean oil. 75 ecm of the broth obtained in this way are inoculated into 10 1 medium consisting of 2.5% soybean meal (the fat has been removed), 0.1% K ₂ HPO ₄ , 0.05% MgSO ₄ -7H ₂ O, 2 , 2% purified whale oil and 0.02% silicone resin as an antifoaming agent (the initial pH is adjusted to 6.8) contains, after 25 minutes is sterilized in a fermentation vessel having a capacity of 201 at 12O ⁰ C. The fermentation is carried out with stirring (300 rpm), where 10 1 / minute of air are passed at a temperature of 28 ⁰ C. After 96 hours, 2350 mcg / ccm kasugamycin are obtained. 300 ecm of the medium are removed, whereupon the kasugamycin is extracted according to the procedure described above; in this way 2.1 g of a powder containing 415 mg of kasugamycin are obtained. This powder is dissolved in 100 ml of distilled water and passed through a column with a diameter of 1 cm which contains 50 ml of a strongly acidic SO ₃ -group-containing exchange ^{resin in the H +} form, whereupon 50 ecm of water are passed through. The adsorbed kasugamycin is eluted with 1N HCl. 23 ecm of the eluate with antimicrobial activity are adjusted to a pH of 5.0 by means of an anion exchange resin (Amberlite IRA 401 is a strongly basic anion exchange resin, and the active exchange radicals consist of - N (CH ₃ ) ₂ X) and adjusted to pH 5.0 and under vacuum 5 ecm concentrated, whereupon 50 ecm ethanol are added. In this way 210 mg of kasugamycin hydrochloride (C ₁₄ H ₂₅ O ₉ N ₃ HCl · H ₂ O) crystallized.

Beispiel 3Example 3

Nach der im Beispiel 2 beschriebenen Arbeitsweise wird ein Kasugamycin produzierender Stamm (ATCC 15714 oder ATCC 15715, s. deutsche Auslegeschrift 1 236 727) in einem Fermentationsgefäß gezüchtet. Das Medium in dem Fermentationsgefäß enthält 3,0% Nährhefe, 0,1% NaCl, 0,1% K₂HPO₄, 0,05% MgSO₄-7H₂O und 2,0% Schweinefettöl. Nach 92 Stunden werden 2860 mcg/ccm Kasugamycin erhalten. According to the procedure described in Example 2, a kasugamycin-producing strain (ATCC 15714 or ATCC 15715, see German Auslegeschrift 1 236 727) is grown in a fermentation vessel. The medium in the fermentation vessel contains 3.0% nutritional yeast, 0.1% NaCl, 0.1% K ₂ HPO ₄ , 0.05% MgSO ₄ -7H ₂ O and 2.0% lard oil. After 92 hours, 2860 mcg / ccm kasugamycin are obtained.

Beispiel 4Example 4

1 1 eines Mediums, das 4,0% Sojabohnenöl, 5,0% Sojabohnenmehl, 1,0% Glukose und 0,1% K₂HPO₄ enthält, wird in einen Erlenmeyer-Kolben mit einem Inhalt von 5 1 gegeben und 20 Minuten lang bei 120° C sterilisiert. Sporen einer Kultur von Streptomyces kasugaensis werden eingeimpft, worauf unter Schütteln mittels einer Drehschüttelmaschine 48 Stunden lang bei 27 bis 28⁰C gezüchtet wird. Der anfängliche pH-Wert des Mediums wird auf 6,5 eingestellt. Die auf diese Weise erhaltene Brühe wird in 1200 1 eines Mediums eingeimpft, das sich in einem aus rostfreiem Stahl bestehenden Fermentationsgefäß mit einem Inhalt von 2000 1 befindet. Das Medium enthält 4,0% Sojabohnenöl, 5,0% Sojabohnenmehl und 0,1% K₂HPO₄.1 liter of a medium containing 4.0% soybean oil, 5.0% soybean meal, 1.0% glucose and 0.1% K ₂ HPO ₄ is placed in an Erlenmeyer flask with a capacity of 5 1 and 20 minutes long sterilized at 120 ° C. Whereupon cultured with shaking by means of a Drehschüttelmaschine for 48 hours at 27 to 28 ⁰ C spores of a culture of Streptomyces kasugaensis be inoculated. The initial pH of the medium is adjusted to 6.5. The broth thus obtained is inoculated into 1200 liters of a medium contained in a fermentation vessel made of stainless steel with a capacity of 2000 liters. The medium contains 4.0% soybean oil, 5.0% soybean meal and 0.1% K ₂ HPO ₄ .

Der anfängliche pH-Wert wird auf 6,3 eingestellt. Die Fermentation wird bei 28⁰C unter Rühren (200 UpM) und unter Durchleiten von 4001 Luft/ Minute 24 Stunden lang durchgeführt. Die auf diese Weise erhaltene Brühe wird in 15 000 1 eines Mediums eingeimpft, das sich in einem Fermentationsgefäß aus Kohlenstoffstahl mit einem Fassungsvermögen von 25 000 1 befindet. Das Medium enthält 5,0% Sojabohnenöl, 7,0% Sojabohnenmehl und 0,.l% K₂HPO₄. Der anfängliche pH-Wert beträgt 6,3 bis 6,4. Die Fermentation wird unter Rühren (150UpM) und unter Durchleiten von 50001 Luft/Minute bei 28° C durchgeführt. Nach 20 Stunden steigt der pH-Wert auf 7,8 und wird anschließend durch Zugabe von Phosphorsäure auf 6,5 eingestellt. Diese Einstellung des pH-Wertes wird außerdem nach 25 und 29 Stunden durchgeführt. Nach 96 Stunden werden 2300 mcg/ccmThe initial pH is adjusted to 6.3. The fermentation is carried out at 28 ^° C. with stirring (200 rpm) and with 400 l air / minute passing through for 24 hours. The broth thus obtained is inoculated into 15,000 liters of a medium contained in a carbon steel fermentation vessel with a capacity of 25,000 liters. The medium contains 5.0% soybean oil, 7.0% soybean meal and 0.1% K ₂ HPO ₄ . The initial pH is 6.3 to 6.4. The fermentation is carried out with stirring (150 rpm) and passing through 50001 air / minute at 28 ° C. After 20 hours the pH rises to 7.8 and is then adjusted to 6.5 by adding phosphoric acid. This adjustment of the pH is also carried out after 25 and 29 hours. After 96 hours it becomes 2300 mcg / ccm

Kasugamycin erhalten, der pH-Wert beträgt 7,2. Nach 160 Stunden fallen 5900 mcg/ccm Kasugamycin bei einem pH-Wert von 5,0 an. Nach 220 Stunden beträgt die Menge des erhaltenen Kasugamycins 7900 mcg/ccm (der pH-Wert beträgt 5,3). Die Fermentation wird beendet und der pH mittels Schwefelsäure auf 5,0 eingestellt; dann wird unter Zusatz von 100 kg Diatomeenerde filtriert. Der Kuchen wird mit Wasser gewaschen, worauf das Waschwasser dem Filtrat zugesetzt wird; 300001 Flüssigkeit, die 111 kg Kasugamycin enthalten, werden auf diese Weise gewonnen. Die Flüssigkeit wird durch eine Säule mit einem Durchmesser von 2,5 m, die 5000 1 eines stark saure SO₃-Gruppen enthaltenden Austauscherharz in Na⁺- Form enthält, durchlaufen gelassen. Danach werden 0,5 n-NaOH nachgeschickt. Ein erstes, Kasugamycin enthaltendes Eluat (4000 1) ist neutral, während das zweite Eluat alkalisch ist und mit Carboxylharz in der H⁺-Form neutralisiert wird. Das vereinigte Eluat wird mittels Schwefelsäure auf einen pH von 5,0 eingestellt. Es wird mittels eines Filmverdampfers auf 500 1 konzentriert, worauf die konzentrierte Lösung unter Verwendung eines Sprühtrockners getrocknet wird. Auf diese Weise werden 198 kg eines Pulvers erhalten, das 83 kg Kasugamycin enthält. Dieses Pulver ist für eine Verwendung in der Landwirtschaft geeignet. 500 g dieses Pulvers werden in 3500 ecm destilliertem Wasser gelöst, worauf die Lösung durch eine Säule geschickt wird, die 1500 ecm eines An-Received kasugamycin, pH 7.2. After 160 hours, 5900 mcg / ccm of kasugamycin are obtained at a pH of 5.0. After 220 hours, the amount of kasugamycin obtained is 7900 mcg / ccm (the pH is 5.3). The fermentation is ended and the pH is adjusted to 5.0 using sulfuric acid; then it is filtered with the addition of 100 kg of diatomaceous earth. The cake is washed with water and the wash water is added to the filtrate; 300001 liquids containing 111 kg of kasugamycin are obtained in this way. The liquid is passed through a column with a diameter of 2.5 m which contains 5000 l of an exchange resin containing _{strongly acidic SO 3} ^{groups in Na +} form. Then 0.5 N NaOH is sent on. A first eluate containing kasugamycin (4000 l) is neutral, while the second eluate is alkaline and is ^{neutralized with carboxyl resin in the H +} form. The combined eluate is adjusted to a pH of 5.0 using sulfuric acid. It is concentrated to 500 liters using a film evaporator and the concentrated solution is dried using a spray dryer. In this way 198 kg of a powder containing 83 kg of kasugamycin are obtained. This powder is suitable for use in agriculture. 500 g of this powder are dissolved in 3500 ecm of distilled water, whereupon the solution is sent through a column containing 1500 ecm of an

Claims (1)

Patentanspruch:Claim: Verfahren zur Herstellung von Kasugamycin, durch Züchten eines Kasugamycin produzierenden Stammes unter submersen aeroben Bedingungen in Kulturmedien, dadurch gekennzeichnet, daß die Medien pflanzliche und tierische öle, pflanzliche und tierische Fette, Fettsäuren oder Fettsäureester als Hauptkohlenstoffquellen enthalten.A method for producing kasugamycin by cultivating a kasugamycin-producing one Strain under submerged aerobic conditions in culture media, characterized in that that the media are vegetable and animal oils, vegetable and animal fats, fatty acids or contain fatty acid esters as major sources of carbon. 1515th Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Kasugamycin durch Züchtungeines Kasugamycin produzierenden Stammes unter submersen aeroben Bedingungen in Kulturmedien, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Medien pflanzliche und tierische öle, pflanzliche und tierische Fette, Fettsäuren oder Fettsäureester als Hauptkohlenstoffquellen enthalten.The invention relates to a method for producing kasugamycin by growing a kasugamycin producing strain under submerged aerobic conditions in culture media, which is characterized is that the media is vegetable and animal oils, vegetable and animal fats, or fatty acids Contain fatty acid esters as the main sources of carbon. Zu dem Medium kann als Stickstoffquelle ein Stickstoff enthaltendes Nährmaterial zugegeben werden. Dies sind beispielsweise Peptone, Fleischextrakte, Maiswasser, Erdnuß- und Sojabohnenmehl, Hefeextrakt, Casein, Natriumnitrat, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat und dergleichen. Die Medien enthalten anorganische Salze, wie beispielsweise Natriumchlorid, Natriumsulfat, Kaliumphösphat, Kalziumkar-A nitrogen-containing nutrient material can be added to the medium as a nitrogen source. These are, for example, peptones, meat extracts, corn water, peanut and soybean flour, yeast extract, Casein, sodium nitrate, ammonium nitrate, ammonium sulfate and the like. The media included inorganic salts such as sodium chloride, sodium sulfate, potassium phosphate, calcium carbonate KasugamycinKasugamycin bonat und Magnesiumsulfat. Ein Material, wie vermahlener Sojabohnensamen oder vermahlener Erdnußsamen, das sowohl die Stickstoffquelle als auch öle oder Fette enthält, kann ebenfalls verwendet werden.bonate and magnesium sulfate. A material as if ground Soybean seeds or ground peanut seeds, which is both the source of nitrogen and Contains oils or fats can also be used. Kasugamycin ist ein Antibiotikum, das von Umezawa, Okami Mashimoto, Suhara, Hamada und Takeuchi (vgl. Journal of Antibiotics, Series A, 18, 101 bis 103, 1965) entdeckt wurde; es wird in Form des salzsauren Salzes, C₁₄H₂₅ O₉N₃ · HCl · H₂ O, kristallisiert, welches in Wasser löslich und in Methanol, Äthanol, Aceton, Äthylacetat, Äther, Chloroform und Benzol schwer löslich ist. Dieses Salz zeigt zwischen 220 und 400 ηΐμ keine maximale Absorption von ultraviolettem Licht und liefert mit einem Ninhydrin-Reagens in Pyridin eine positive Reaktion. Die Sakaguchi-, Molisch-, Elson-, Morgan-, Fehling-, Tollens- und Eisen(III)-chlorid-Reaktionen verlaufen negativ. Die Verbindung besitzt eine Rechtsdrehung von [>]^? ₀ ⁵ = +120⁰C (c = 1,6,H₂O), der Schmelzpunkt liegt bei 236 bis 239° C (Zersetzung), während die pK-Werte niedriger als 2, 7,1 und 10,6 sind. Kasugamycin kann ferner in Form der freien Säure, C₁₄H₂₅O₉N₃ · H₂O, zur Kristallisation gebracht werden und ist in dieser Form in Wasser löslich. Die Verbindung schmilzt bei 207 bis 216° C unter Zersetzung und besitzt eine Drehung von [«] ²S + 115° C (c = 1, H₂O). Die Struktur von Kasugamycin wurde von Subara, Maeda, Umezawa, Ohno (tetrahedron Letters, Nr. 12, 1239 bis 1244, 1966) untersucht und wie folgt gefunden:Kasugamycin is an antibiotic discovered by Umezawa, Okami Mashimoto, Suhara, Hamada and Takeuchi (see Journal of Antibiotics, Series A, 18, 101-103, 1965); it is crystallized in the form of the hydrochloric acid salt, C ₁₄ H ₂₅ O ₉ N ₃ · HCl · H ₂ O, which is soluble in water and sparingly soluble in methanol, ethanol, acetone, ethyl acetate, ether, chloroform and benzene. This salt shows no maximum absorption of ultraviolet light between 220 and 400 ηΐμ and gives a positive reaction with a ninhydrin reagent in pyridine. The Sakaguchi, Molisch, Elson, Morgan, Fehling, Tollens and iron (III) chloride reactions are negative. The connection has a clockwise rotation of [>] ^? ₀ ⁵ = +120 ⁰ C (c = 1.6, H ₂ O), the melting point is 236 to 239 ° C (decomposition), while the pK values are lower than 2, 7.1 and 10.6. Kasugamycin can also be made to crystallize in the form of the free acid, C ₁₄ H ₂₅ O ₉ N ₃ · H ₂ O, and in this form is soluble in water. The compound melts at 207 to 216 ° C with decomposition and has a rotation of [«] ² S + 115 ° C (c = 1, H ₂ O). The structure of kasugamycin was examined by Subara, Maeda, Umezawa, Ohno (tetrahedron Letters, No. 12, 1239 to 1244, 1966) and found as follows: