DE958241C - Verfahren zur Herstellung und Gewinnung einer antibiotisch wirkenden Verbindung - Google Patents

Description

AUSGEGEBEN AM 14. FEBRUAR 1957

B 23108 IVa130h

Die Erfindung betrifft die Herstellung neuer wertvoller antibiotischer Verbindungen und insbesondere die Herstellung solcher Verbindungen durch Züchtung geeigneter Mikroorganismen, die Konzentration der Kulturflüssigkeiten, die Gewinnung von Lösungen der Rohprodukte daraus, die Reinigung dieser rohen Lösungen und die Isolierung der reinen antibiotischen Verbindungen sowie ihrer Salze mit Basen und Säuren aus diesen Lösungen. Die neuen antibiotischen Verbindungen werden im folgenden mit dem Sammelbegriff »Amphomycin« bezeichnet werden. Dieser Ausdruck soll nicht nur für eine einzelne antibiotische Verbindung benutzt werden, sondern auch für eine Reihe nahe verwandter Verbindungen, die in ähnlicher Weise durch Züchtung von Mikroorganismen gewonnen werden und die während ihrer Isolierung und Reinigung etwa das gleiche Verhalten zeigen.

In den letzten Jahren ist eine Reihe von Stoffwechselprodukten, die bei der Züchtung von Bakterien und Schimmelpilzen auftreten und die, wie gefunden

wurde, wertvolle therapeutische Eigenschaften aufweisen, isoliert worden. Solche Stoffe sind z. B. Penicillin, Streptomycin, Gramicidin, Tyrocidin, Bacitracin, Subtilin, Streptothricin, Aureomycin und andere. Einige von diesen Antibiotika haben sich als außerordentlich wirksam gegen pathogene Mikroorganismen erwiesen. Andere dagegen fanden trotz hoher antibiotischer Wirksamkeit wegen ihrer erheblichen Giftigkeit keine praktische Anwendung. ' ίο Penicillin ist als ein besonders wertvoller Vertreter dieser Antibiotika bekannt. Es gehört zu der Klasse von Antibiotika, die vor allem gegen grampositive Bakterien wirksam sind. Es weist jedoch einige Mangel und Fehler auf, die die Suche nach anderen Antibiotika dieser Art zweckmäßig erscheinen lassen.

Die Erfindung betrifft nun die Herstellung hochwirksamer antibiotischer Verbindungen, die besonders in der Therapie von durch grampositive pathogene Mikroorganismen hervorgerufenen Infektionen Verwendung finden und die als »Amphomycin« bezeichnet werden sollen. Sie werden gemäß vorliegender Erfindung durch Züchtung eines bestimmten Streptomycesstammes, nämlich Streptomyces BL-456789, in einer wäßrigen kohlenhydrathaltigen Nährflüssigkeit im submersen Verfahren unter Luftdurchleitung, bis die Nährflüssigkeit eine erhebliche antibakterielle Wirksamkeit aufweist, worauf dann das erzeugte Amphomycin von der Gärflüssigkeit abgetrennt wird, gewonnen.

Ferner wurde gemäß vorliegender Erfindung eine Reihe von Maßnahmen und Verfahrensstufen gefunden, die die Gewinnung eines hochwirksamen reinen Amphomycins ermöglichen. So können die rohen Amphomycinlösungen leicht durch Aktivkohle entfärbt werden. Das Amphomycin selbst läßt sich aus der Nährlösung in guter Ausbeute unter stark sauren Bedingungen mit organischen Lösungsmitteln extrahieren, die mit Wasser nicht mischbar sind. Es wird 4.0 aus seinen wäßrigen Lösungen durch Einstellung des p_H auf einen Wert von etwa 3 bis 4 ausgefällt. Verunreinigungen lassen sich aus seinen stark sauren, wäßrigen Lösungen durch Extraktion mit Methylisobutylketon und Amylazetat abtrennen. Amphomycin selbst kann aus einer stark sauren Lösung in Butanol durch Behandlung mit Wasser bei einem höheren p_H als 4 extrahiert werden. Auch aus seinen Lösungen in mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln läßt es sich in wäßrige Lösung überführen, wobei das p_H dieser Lösungen höher als 6 sein soll. Es kann durch Bildung geeigneter unlöslicher Derivate seiner basischen oder auch seiner sauren funktioneilen Gruppen aus seinen Lösungen gefällt werden.

Die neu gefundenen antibiotischen Verbindungen, die z. B. das Wachstum von B.mycoides, B.aureus, M.tetragenus, Staph.aureus und B.subtilis wirksam zu hemmen vermögen, stellen amphotere Stoffe dar, die fähig sind, mit Säuren und Metallen Salze zu bilden.

Sie sind in Wasser löslich und zeigen im p_H-Bereich von 3 bis 4 die geringste Wasserlöslichkeit. Sie sind in Säureform und als Salze leicht in Methanol löslich, lösen sich dagegen in höheren Alkoholen nur in der Säureform. Sie lassen sich aus ihren wäßrigen Lösungen bei einem p_H von 2 mit Butanol und Pentanol extrahieren, nicht aber mit Methylisobutylketon, Benzol, Äther, Äthylazetat oder Amylazetat. Sie geben mit Ammoniumhydroxyd und Reineckes Salz feste antibakterielle Derivate und zeigen Ultraviolettabsorption zwischen 210 und 230 μ. Im Ninhydrin-, Sakaguchi-, MoHsch- und Ehrlich-Pauly-Test reagieren sie negativ. In wäßriger Lösung sind sie in einem p_H-Bereich von 2 bis 10 mindestens für 10 Tage stabil.

Die neuen antibiotischen Verbindungen bilden sich während der unter ganz bestimmten, genau einzuhaltenden Bedingungen erfolgenden Züchtung eines bisher noch nicht beschriebenen Streptomycesstammes, der, wie oben erwähnt, vorläufig Streptomyces BL-456786 genannt werden soll und der folgende Eigenschaften aufweist:

Streptomyces BL-456786 gehört zu der Gruppe von Mikroorganismen, die allgemein als Genus Streptomyces bezeichnet wird. Das gebildete Myzel zeigt verzweigte Hyphen. Die jüngeren Hyphen sind grampositiv, ältere zeigen wechselnde Gramfärbbarkeit. Sie bilden Konidienketten mit Konidien von kugel- oder eiförmiger Gestalt und einer Größe von 1 bis 1,2 μ zu 1,6 bis 1,8 μ.

Mäßiges bis gutes Wachstum auf Glucose-Asparagin-Agar bei 30⁰C, wobei ein gelbbraunes, sich in der Kulturflüssigkeit ausbreitendes Pigment gebildet wird.

Auf Kartoffel-Dextrose-Agar bilden sich bei zweiwöchiger Züchtung bei 24° dünne, faltige Kulturen. Die Bildung von Lufthyphen und Konidien wird jedoch gehemmt.

Die Erzeugung von Amphomycin soll natürlich nicht auf diesen bestimmten Mikroorganismus oder auf Mikroorganismen, die die obenerwähnten Eigenschaften besitzen, beschränkt sein. Diese Angaben dienen lediglich zur beispielsweisen Kennzeichnung geeigneter Mikroorganismen. Man kann natürlich auch Mutanten dieser Mikroorganismen verwenden, wie sie z. B. durch Röntgen- und Ultraviolettbestrahlung, Behandlung mit Stickstoffsenfgas und anderen mutierenden Mitteln erzeugt werden.

Amphomycin weist nur eine geringe Toxizität und, ebenso wie Penicillin, eine hohe Aktivität vor allem gegen grampositive Bakterien auf. Es stellt daher ein wertvolles therapeutisches Mittel für die Human- und Veterinärmedizin dar. Vor Penicillin Zeichnet es sich dadurch aus, daß es durch Penicillinase nicht inaktiviert wird und auch gegen penicillinresistente Stämme, die durch Penicillin nicht beeinflußt werden, hoch wirksam ist sowie bei gegenüber Penicillin empfindlichen Patienten keine Sensibilisierung hervorruft. Es wird ferner weder durch Wärme noch durch Wasser zersetzt bzw. unwirksam gemacht.

In vitro Untersuchungen mit Amphomycin haben gezeigt, daß es, wie gesagt, gegen grampositive Bakterien/wie Staphylococcus aureus, Bacillus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus mycoides und Micrococcus tetragenus, äußerst wirksam ist. Die folgende Tabelle eigt die hohe antibiotische Wirksamkeit von zwei festen Präparaten, die aus der Kulturflüssigkeit gewonnen wurden:

Amphomycin-Spektrum im Plattentest (5 mg festes Antibiotikum im ecm)

Mikroorganismus

Bodenheimer Organismus. ο ο

Proteus X19 ο ο

Sh. Sonnei ο ο

S. enteritidis ο ο

S. paratyphi A ο ο

S. pullorum ο ο

A. aerogenes ο ο

P. fluorescens ο ο

V. cholerae ο ο

Neisseria spp ο ο

AIc. fecalis ο ο

Pr. vulgaris ο ο

B. mycoides 15 17

B. cereus 15 14

S. marcescens ο ο

M. tetragenus 14 14

S. Flexneri ο ο

S. dysenteriae ο ο

C. albicans Nr. 520 ο ο

Staph. aureus 14 13

E. typhosa ο ο

E. coli ο ο

S. paratyphi B ο ο

K. pneumoniae ο ο

Ps. aeruginosa ο ο

S. gallinarum ο ο

B. anthracis ο ο

B. subtilis 16 11

Die Prüfung von Amphomycin auf sein antibakterielles Spektrum wird in folgender Weise durchgeführt:

Etwa 30 ecm steriler Kulturflüssigkeit, gewonnen aus einem Herzaufguß (Handelsprodukt »Difco«), werden mit 2% Agar versetzt, um den Aufguß zu verfestigen. Die Flüssigkeit wir^d dann in eine sterile Petrischale von etwa 9 cm Durchmesser gegeben und erstarren gelassen. Dann wird in dem erhaltenen Nährboden mit einem sterilen Spatel eine Vertiefung von 8 mm Weite und 40 mm Länge erzeugt. Der Boden dieser Vertiefung wird mit einem oder zwei Tropfen geschmolzenem Agar verschlossen. Darauf wird mit Hilfe einer kleinen Platinöse ein Impfstrich von der Wand der Petrischale her gegen den Rand der Vertiefung gezogen, wobei eine Nährbouillonkultur der jeweils zu prüfenden Bakterien, die zuvor 24 Stunden lang bei 37° bebrütet worden war, für die Beimpfung verwendet wird. Die Vertiefung wird darauf mit einer wäßrigen Lösung des Antibiotikums, die 5 mg Antibiotikum in ι ecm enthält, gefüllt und die Petrischale 18 bis 24 Stunden lang bei 37° bebrütet. Die Hemmungszone wird dann auf einer Linie ausgemessen, die vom Rande der Vertiefung bis zu der Stelle geführt wird, an der Wachstum des betreffenden Mikroorganismus einsetzt.

Im folgenden sei die Diffusionsplattenmethode zur Bestimmung der Aktivität von Amphomycin näher beschrieben:

Hemmungszone in mm

Feste

Substanz

Nr. 20

Feste

Substanz

Nr. Nährboden

Ein geeigneter Nährboden kann z. B. hergestellt werden, indem eine Mischung von 1,5 g Rindfleischextrakt, 3 g Hefeextrakt, 6 g Pepton und 15 g Agar in 11 destilliertem Wasser suspendiert wird, wobei der p_H-Wert zum Schluß 8 betragen soll. Man läßt die Suspension dann 5 Minuten stehen, rührt, bis eine völlig gleichförmige Suspension erhalten wird, und erhitzt diese vorsichtig unter Rühren. Die Suspension wird dann so lange gekocht, bis völlige Lösung eingetreten ist. Der Nährboden wird dann bei 121° sterilisiert; Dauer 15 Minuten.

Impfkultur

Als Testorganismus wird Bacillus subtilis A.T.C.C. 6633 verwendet. Eine Sporensuspension, die etwa 50 Millionen sichtbare Sporen im ecm enthält, wird dem geschmolzenen und auf 53⁰ abgekühlten Testagar in einer solchen Menge zugesetzt, daß die endgültige Impfkultur eine Konzentration von 2°/₀ aufweist.

Herstellung der Platten

Je 21 ecm steriler Testagar werden in waagerecht stehende sterile Petrischalen gegeben und erstarren gelassen. 4 ecm der oben beschriebenen Impfkultur werden dann gleichmäßig über die Oberfläche der Grundschicht verteilt. Darauf wird der Nährboden auf Zimmertemperatur abgekühlt, und aus nichtrostendem Stahl bestehende Testplatten werden auf den Nährboden aufgesetzt.

Pufferlösung

Eine Phosphatpufferlösung mit einem p_H von 8 wird für die Herstellung der verschiedenen Verdünnungen verwendet. Die Pufferlösung wird erhalten, indem 95 ecm einer molaren Kaliumdiphosphatlösung mit 5 ecm einer molaren Kaliummonophosphatlösung gemischt und die Mischung mit destilliertem Wasser auf ein Zehntel ihres Volumens verdünnt wird. Der p_H-Wert der Pufferlösung muß potentiometrisch nachgeprüft und, falls notwendig, durch Zusatz der einen oder anderen molaren Kaliumphosphatlösung genau auf ein p_H von 8 eingestellt werden. Schwankungen im p_H-Wert oder in der Konzentration der Pufferlösung üben einen deutlichen Einfluß auf die Größe der Hemmungszone aus. Die Pufferlösung braucht nicht sterilisiert zu werden. Die molaren Stammlösungen werden durch Zusatz von Chloroform oder Toluol konserviert. Die Pufferlösungen selbst werden täglich frisch hergestellt.

Prüfung auf antibiotische Wirksamkeit

Unbekannte Muster werden gegebenenfalls mit der Phosphatpufferlösung vom p_H 8 verdünnt. Drei Vertiefungen in jeder Platte dienen zur Aufnahme von drei Mustern der gleichen Verdünnung. Nach Bebrütung bei 32⁰ wird der Durchmesser der Hemmungszonen gemessen und das Mittel der erhaltenen Werte bestimmt.

Amphomycin unterscheidet sich von Endomycin dadurch, daß es in vitro keinerlei Aktivität gegen Trichophyton mentagrophytes, einen pathogenen Pilz, 12$ besitzt. Zur Prüfung werden 25 ecm eines sterilen

Nährbodens aus 2 % Dextrose, ι % Neopepton und 2 % Agar, dessen p_H auf 5,6 bis 5,8 eingestellt ist, in eine Petrischale gegeben und erstarren gelassen. Eine wäßrige Suspension von Trichophyton-mentagrophytes-Sporen, erhalten von einem schräg erstarrten Agarnährboden, wird über die Oberfläche des oben beschriebenen Nährbodens verteilt, sogenannte Stahlpenicylinder werden auf die Nährbodenoberfläche aufgesetzt, und die Petrischalen werden bei 30⁰ 24 Stunden lang bebrütet. Eine wäßrige Lösung, die 10 mg des zu untersuchenden Antibiotikums im ecm enthält, wird in die Zylinder gefüllt, worauf die Petrischalen erneut 48 Stunden lang bebrütet werden. Der Durchmesser der Hemmungszone um jeden Zylinder herum wird dann gemessen und das Mittel von mindestens drei Zonen genommen. Die folgenden Resultate wurden erhalten:

Antibiotikum	Hemmungszone in mm
Amphomycinposten Nr. 5 Endomycin Amphomvcinposten Nr. 1	keine 24 keine

Gemäß vorliegender Erfindung besteht das Verfahren der Züchtung dieser neuen und bisher imbekannten Streptomycesform, nämlich von Streptomyces BL-456786, darin, daß dieser Mikroorganismus bei etwa 24 bis 30⁰ und unter submersen aeroben Bedingungen und Rühren auf Nährböden gezüchtet wird, die eine Kohlenstoff- und eine Stickstoffquelle, das Wachstum fördernde Stoffe, Mineralsalze, wie Natriumchlorid, Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumnitrat, und gegebenenfalls eine Puffersubstanz, wie Calciumkarbonat, enthält.

Als Kohlenstoffquelle für den Nährboden kommen unter anderem in Frage gewöhnliche Stärke, lösliche Stärke, Rohrzucker, Glukose, Maltose, Dextrose, Glycerin, Galaktose, Xylose, Arabinose, Rhamnose, Fruktose, Laktose, InuHn, Dextrin.

Diese Kohlenstoffquellen können dem Nährboden in reiner Form oder in Form von Konzentraten zugesetzt werden. Die Menge, die zwecks Erzeugung bester Ausbeuten an antibiotischen Verbindungen zugesetzt wird, kann in beträchtlichen Grenzen schwanken und z. B. zwischen 0,5 und 5 Gewichtsprozent vom Gesamtgewicht des Nährbodens betragen.

Geeignete Quellen für Stickstoff und gleichzeitig für eine Reihe von das Wachstum fördernden Stoffen , stellen eine große Anzahl von Stoffen dar, wie Aminosäuren, hydrolysiertes und nicht hydrolysiertes Kasein, Molken oder Molkenkonzentrate, Weizenweichwasser, Fischmehl, Sojabohnenmehl, Fleischextrakte, Leberkuchen, Harnstoff, Nitrate, Ammoniumverbindungen, Rückstände von der Getreidevergärung zu Alkohol, Maisweichwasser, säurehydrolysiertes Maisgluten, säurehydrolysiertes Weizengluten, Pepton, Schlachtabfälle, Brauereihefe, Baumwollsamenmehl, Laktalbumin, Trypton.

Diese eiweißhaltigen Zusätze brauchen nicht im hochgereinigten Zustand zugesetzt zu werden; vielmehr können weniger reine Produkte, die häufig das Wachstum fördernde Stoffe und beträchtliche Mengen an mineralischen Nährstoffen enthalten, für diesen Zweck benutzt werden. Es ist wegen des Vorliegens vieler dieser stickstoffhaltigen Stoffe im nicht gereinigten Zustand nicht möglich, genaue Mengenangaben bezüglich ihres Zusatzes zu machen. In den meisten Fällen genügt ein Zusatz von 0,1 bis 5 Gewichtsprozent, berechnet auf in dem betreffenden Material enthaltene Trockensubstanz, zu dem Nährboden.

Der p_H-Wert der Gärflüssigkeit soll zu Beginn der Vergärung 7 bis 7,2 betragen. Die zweckmäßigste Gärtemperatur liegt bei etwa 26 bis 28°. Maximalausbeuten an antibiotischer Substanz werden, je nach dem angewandtenZüchtungsverf ahren und Nährboden, gewöhnlich innerhalb von 2 bis 7 Tagen erhalten.

Nach beendetem Wachstum wird das Myzel von der Kulturflüssigkeit, die nun das antibiotisch wirksame Amphomycin enthält, getrennt. Dieses wird daraus durch Extraktion mit geeigneten organischen Lösungsmitteln oder durch Ausfällung beim isoelektrischen Punkt oder auf andere für die Gewinnung von Antibiotika gebräuchliche Weise gewonnen. Das so erhaltene neue Antibiotikum Amphomycin besitzt wertvolle und nur ihm eigene Eigenschaften, die es von allen bekannten und bisher beschriebenen Antibiotika unterscheiden.

Wie Penicillin, so wirkt auch Amphomycin in vivo sowohl wie in vitro und zeigt eine bemerkenswerte chemotherapeutische Wirksamkeit gegen experimentelle Infektionen bei Mäusen. Die folgende Tabelle gibt das Ergebnis solcher Versuche sowie von Versuchen z'-jr Toxizitätsbestimmung wieder:

Ergebnisse von Prüfungen in vivo

Amphomycin Partie Nr.	Hemmungszone in mm (Plattentest)	Verdünnung 1:4	Akute LD60 bei der Maus	CD50 bei der Maus i. p.	Chronische Toxizität bei Mäusen im Verlaufe von
		23,1	i. v., mg/kg	mg/kg	5 Wochen
	ohne Verdünnung	27,0			mg/kg
7	26,0			1,8	>i5o
8	28,9	Ve dünnung 1:64	—	0,68	>i5o
!7		21,7	^215	2,2
	Verdünnung 1:16
28	25,0	46 bis 116	o,57	50 bis 100
Penicillin			etwa 20

Der Ausdruck »CD₅₀ «r bedeutet die minimale Dosis curativa bei intraperitonealer Verabreichung von Amphomycin, die erforderlich ist, um 50% einer Gruppe von Mäusen, denen intraperitoneal 100 bis 1000 LD₅₀-Gaben von Diplococcus pneumoniae injiziert wurde, zu heilen, d. h. am Leben zu erhalten. Dabei würde jede. LD₆₀-Gabe für sich gegeben ausreichen, um 50% der so infizierten Mäuse zu töten. Die Infektion wird sofort nach Verabreichung der ersten Gabe des zu prüfenden Antibiotikums gesetzt. Das Antibiotikum selbst wird in zwei gleichen Gaben mit einem Zwischenraum von etwa 18 Stunden verabfolgt. Die Tiere werden 4 Tage lang beobachtet, und die Todesfälle in jeder Gruppe werden als Prozente aller Tiere einer jeden Gruppe berechnet. Die Prozentzahlen der Todesfälle werden dann in »probit«- Werte umgewandelt, und diese werden dann als Logarithmus der Dosis in mg pro kg Gewicht der Maus graphisch dargestellt. Der Punkt, an dem sich die »Probitcc-5-Linie und die günstigste Linie, die durch die Versuchspunkte gelegt werden kann, schneiden, gibt die Konzentration des Arzneimittels an, durch die die Hälfte der Tiere unter den Versuchsbedingungen gegen die gesetzte Infektion geschützt wird. Der Antilogarithmus dieses Ausdruckes wird CD₅₀-Wert genannt.

Amphomycin besitzt seine geringste Löslichkeit in Wasser bei einem p_H von 3,3 bis 3,6. Unterhalb oder oberhalb dieses p_H-Bereiches ist es jedoch sehr stark wasserlöslich. Es ist leicht löslich in Methanol, und zwar sowohl in Säureform als auch in Salzform, während es, wie oben bereits ausgeführt, in höheren Alkoholen nur in der Säureform löslich ist. Aus \räßriger Lösung wird es bei einem p_H-Wert von 2 durch Butanol und Amylalkohol extrahiert, nicht aber durch Methylisobutylketon oder Amylazetat. Aus seiner sauren Butanollösung geht es bei einem p_H-Wert über 3 oder 4 wieder in die wäßrige Phase über.

Saure Lösungen des Amphomycin in Butanol können durch Aktivkohle entfärbt werden, und die Säureform des Antibiotikums kann durch Zusatz nicht polarer Lösungsmittel, wie Äthylazetat, Äther u. dgl., daraus gefällt werden.

Eine 5- bis 20%ige wäßrige Lösung der Säureform des Amphomycins gibt bei der Einstellung des p_H-Wertes der Lösung mit Alkali auf 3,4 bis 3,5 einen reichlichen Niederschlag. Der Niederschlag geht wieder in Lösung, wenn der p_H-Wert erhöht oder erniedrigt wird.

Unlösliche Derivate der basischen Gruppen des Amphomycins sind hergestellt worden. So erhält man bei der Behandlung der Lösung des Natriumsalzes des Amphomycins in Wasser mit Reineckes Salz einen Niederschlag des wirksamen Reineckates des Amphomycin in guter Ausbeute, jedoch erst, wenn der pg-Wert der Lösung auf 2 bis 3 herabgesetzt wird. Das Antibiotikum kann daraus leicht wiedergewonnen werden, indem das Reineckat in Aceton gelöst und Ammoniumhydroxyd zu dieser Lösung zugesetzt wird, wobei das wirksame Ammoniumsalz des Amphomycin ausgefällt wird. Das Reineckat konnte bisher noch nicht in kristalliner Form erhalten werden. Ein öliges Pikrat ließ sich in ähnlicher Weise gewinnen.

Amphomycin ist in wäßriger Lösung stabil. Solche wäßrigen Lösungen zeigen bei einem p_H von 2, 7 oder 10 bei zehntägiger Lagerung bei Zimmertemperatur kein Nachlassen der Wirksamkeit. Festes Amphomycin ist bei Zimmertemperatur praktisch unbegrenzt haltbar.

Das reinste bisher gewonnene Amphomycin zeigt Ultraviolettabsorption nur zwischen- 210 und 230 μ und reagiert negativ im Ninhydrin-, Sakaguchi-, Molisch- und Ehrlich-Pauly-Test. Amphomycin enthält Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Stickstoff. Die gewonnenen Produkte sind weiße oder fast weiße nicht kristalline Pulver. Sie geben eine positive Biuretreaktion. Das durch Hydrolyse mit 6 n-Salzsäure während 24 Stunden bei ioo° erhaltene Spaltprodukt reagiert im Ninhydrintest positiv. Papierchromatographische Untersuchung des Hydrolysates läßt das Vorliegen mehrerer verschiedener im Ninhydrintest positiv reagierender Verbindungen erkennen.

Diese Eigenschaften des Amphomycin ermöglichen es, dieses Antibiotikum von anderen Antibiotika zu unterscheiden, die durch Aktinomyceten erzeugt werden.

Von den Aktinomycetenantibiotika, die saure Eigenschaften aufweisen, sind Antimycin, Actinor- go hodin und die Streptomycesantibiotika X-2o6, X-464 und X-537 stickstofffreie Verbindungen ohne basische Eigenschaften. Die freie Säure dieser Verbindungen ist löslich in nicht polaren Lösungsmitteln, wie Äther, Benzol u. dgl., während Amphomycin darin unlöslich ist.

Litmocidin und Rhodomycetin sind gefärbte Pigmente, während die hochwirksamen Amphomycinpräparate weiße Pulver darstellen.

Von den sauren, stickstoffhaltigen oder amphoteren Actinomycetenantibiotika läßt sich Borrelidin bei saurem p_H durch Benzol extrahieren, Amphomycin dagegen nicht. Borrelidin hat, im Vergleich zu Amphomycin, auch nur ein sehr beschränktes antibakterielles Spektrum. Endomycin und Musarin in Form der freien Säuren sind in Wasser unlöslich, während Amphomycin bei p_H 2 eine Löslichkeit in Wasser aufweist, die 5% übersteigt. Amphomycin unterscheidet sich von Aureomycin und Tetramycin besonders dadurch, daß es im Bereich von 220 bis 400 μ keine Ultraviolettabsorption aufweist.

Die Gewinnung des Amphomycin und seiner Salze sei in den folgenden Ausführungsbeispielen näher erläutert, ohne die Erfindung jedoch hierauf zu beschränken.

Beispiel 1
Herstellung des antibiotischen Wirkstoffes

in Schüttelkulturen

Zur Gewinnung kleiner Mengen an Amphomycin wird die Züchtung in Flaschen durchgeführt, wobei die Kulturen geschüttelt und dem Luftzutritt ausgesetzt sind. Die Flaschen sind durch einen Wattestopfen vor dem Zutritt von Verunreinigungen geschützt. Der Streptomycesstamm BL-456786 wird

in einer geeigneten Nährflüssigkeit im submersen Verfahren gezüchtet, wobei Rühren und Belüftung der Kultur dadurch bewirkt werden, daß die Kulturnaschen in eine hin und her gehende Schüttelvorrichtung eingespannt werden, die für ein gründliches Versprühen, Verspritzen und Vermischen der Kulturflüssigkeit in und mit der sauerstoffhaltigen Atmosphäre Sorge trägt. So werden z.B. je 500 ecm einer Kulturflüssigkeit, die i°/₀ Sojabohnenmehl, i°/o wasserfreie Dextrose, 0,5 °/₀ Natriumchlorid, 0,05 % lösliche Schlempebestandteile, 0,1 % Kalziumkarbonat enthält, in Vierliterflaschen gefüllt und sterilisiert. Nach Sterilisation im Autoklav wird die Nährflüssigkeit mit etwa 1 Volumprozent einer trüben

ig wäßrigen Suspension von Sporen von im schräg gestellten Agarröhrchen gezüchteten BL-456 786 beimpft. Der p_H-Wert der Kulturflüssigkeit zu Beginn der Bebrütung ist 7 bis 7,2. Der Flascheninhalt wird dann bei 26 bis 28° 120 Stunden lang bebrütet, wobei die Flaschen kräftig geschüttelt werden, und zwar mit 130 Schüttelbewegungen in der Minute und einem horizontalen Hub von etwa 3,2 cm. Nach dieser Bebrütungszeit enthält die Flüssigkeit antibiotische Verbindungen von folgender Wirksamkeit. Die Wirksamkeit wird dabei ausgedrückt in mm des Durchmessers der Hemmungszone bei den angegebenen Verdünnungen: unverdünnt 29,2 mm, vierfach verdünnt 26,2 mm. Die Hemmwirkung wurde dabei nach der oben näher beschriebenen Diffusionsplattenmethode bestimmt. Der p_H-Wert der Kulturflüssigkeit betrug gegen Ende der Bebrütung 7,8.

Beispiel 2
Herstellung einer Impflösung im Versuchsbetrieb

Für die großtechnische Gewinnung von Amphomycin benötigt man eine Impflösung, die in folgender Weise gewonnen wird: Eine Nährlösung, die in 2500 ecm 1% Sojabohnenmehl, i°/₀ wasserfreie Dextrose, 0,5% Natriumchlorid, 0,05% lösliche Schlempebestandteile und 0,1% Kalziumkarbonat enthält, wird in eine Zehnliterflasche gefüllt und bei 118 bis 120° während einer Stunde dampfsterilisiert.

Nach dem Erkalten wird die Nährlösung mit etwa 0,5 Volumprozent einer trüben, wäßrigen Suspension von Sporen von im schräg gestellten Agarröhrchen gezüchtetem Streptomyces BL-456 786 beimpft. Der Flascheninhalt wird dann 72 bis 96 Stunden lang bei 26 bis 28° bebrütet, wobei die Flasche auf einer hin und her gehenden Schüttelvorrichtung kräftig geschüttelt wird. Aus dieser Flasche wird dann die Streptomyces BL-456 786 enthaltende Impf lösung unter völlig aseptischen Bedingungen in den Gärtank übergeführt.

Beispiel 3
Großtechnische Produktion von Amphomycin

Amphomycin kann großtechnisch nach dem submersen oder Tiefenkulturverfahren gewonnen werden. Feststehende Gärbottiche, die mit geeigneten Rühr- und Belüftungsvorrichtungen versehen sind, haben sich für diesen Zweck als brauchbar erwiesen. Eine wäßrige Nährlösung, die in 5675 1 57 kg Sojabohnenmehl, 57 kg Dextrose und 28 kg Kalziumkarbonat enthält, wird in einem senkrechten, 7500 1 fassenden stählernen Gärbottich, der mit Glas ausgekleidet und mit einem Wassermantel zur Regelung der Temperatur versehen ist, hergestellt. Dieser Gärbottich weist außerdem einen ankerartigen Rührer und einen zweiarmigen Plattensprinkler auf, beide aus nichtrostendem Stahl bestehend. Die Nährfiüssigkeit wird mit Dampf unter Druck sterilisiert und abgekühlt. Sie weist dann einen p_H-Wert von 6,98 auf und wird darauf mit 15 Volumprozent einer 48 Stunden alten Kultur beimpft, die in einem ähnlichen Gärbottich vorher mit der im Beispiel 2 beschriebenen Impflösung beimpft worden war. Die erhaltene Kulturlösung wird dann im 7500-l-Gärbottich 50 Stunden lang bei 28⁰ bebrütet. Während der Bebrütung wird der Rührer mit etwa 90 Umdrehungen in der Minute umlaufen gelassen und sterile Luft in einer Menge von etwa 0,284 ^{m3 m} der Minute in die Kulturflüssigkeit eingeleitet. Die Bestimmung des p_H-Wertes am Ende der Bebrütungsperiode ergibt ein p_H von 7,6. Die Aktivität der Nährflüssigkeit, bestimmt nach der oben beschriebenen Diffusionsplattenmethode, ergibt eine Hemmungszone mit einem Durchmesser von 18,7 mm im unverdünnten Zustand und von 14 mm bei vierfacher Verdünnung des ursprünglichen Volumens.

Die Isolierung und Reindarstellung von festem Amphomycin von dieser Kulturflüssigkeit wird in den folgenden Beispielen beschrieben.

Beispiel 4

Isolierung und Reinigung Extraktion der Kulturflüssigkeit

Die Verfahrensprodukte werden auf ihre antibiotische Wirksamkeit nach der Zylinderplattentestmethode geprüft, wobei die Hemmungszone in mm gemessen wird. Lösungen derselben werden in verschiedenen Verdünnungen geprüft und so miteinander verglichen.

30 1 der filtrierten Kulturlösung werden mit Salzsäure auf p_H 1,95 angesäuert und durch eine Schicht Diatomeenerde nitriert, wobei eine klare Lösung erhalten wird. Das klare Filtrat wird 15 Minuten lang mit 151 n-Butanol gerührt. Danach werden die beiden Phasen voneinander getrennt. Diese Extraktion wird mit weiteren 481 Kulturflüssigkeit wiederholt, und die Butanolextrakte (insgesamt 40 1) werden mit 10 1 mit Salzsäure auf ein p_H von 2 angesäuertem Wasser gewaschen. Das Butanol wird dann mit 10 1 Wasser gerührt und die Mischung auf ein p_H von 6,4 eingestellt. Der wäßrige Extrakt wird nach 30 Minuten langem Rühren entfernt, im Vakuum iao konzentriert und durch Sublimation aus dem gefrorenen Zustand (lyophil) getrocknet. Ausbeute 20,2 g eines braunen Pulvers. Wiederholt man die oben beschriebene Butanolextraktion, so erhält man nach ähnlicher Aufarbeitung zusätzlich 6,6 g eines braunen Pulvers.

Die Prüfung auf antibiotische Wirksamkeit nach dem Diffusionsplattentest ergab folgendes Resultat:

Geprüftes Material Unverdünnt

Verdünnt 1:4

Ausgangskulturflüssigkeit

klare Kulturflüssigkeit

extrahierte Kulturnüssigkeit

die ersten 30 1

die zweiten 48 1

saures Waschwasser

erster wäßriger Extrakt (10 1)

zweiter wäßriger Extrakt

feste Bestandteile des ersten Extraktes konzentriert auf 1 mg/ccm:

Festprodukt Nr. 7

feste Bestandteile des zweiten Extraktes konzentriert auf 1 mg/ccm:

Festprodukt Nr. 8

24,2 mm
25,2 mm

14.8 mm
10,4 mm

keine Hemmung
30,0 mm
26,0 mm

26,0 mm

28.9 mm

20.0 mm 20,4 mm

keine Hemmung keine Hemmung

28,2 mm

23.1 mm

23,1 mm 27,0 mm

Beispiel 5 Isolierung des Wirkstoffes

Der Wirkstoff kann auch wie folgt isoliert werden: 2930 1 nicht nitrierte Kulturflüssigkeit werden auf einen p_H-Wert von 2,3 eingestellt und mit 1175 1 n-Butanol extrahiert. Der Butanolextrakt wird abgetrennt und mit 150 1 angesäuertem Wasser (p_H 2) gewaschen. Der Extrakt wird dann mit 150 1 Wasser gemischt, mit Natronlauge auf ein p_H von 7,3 bis 7,4 eingestellt und die wäßrige Schicht abgetrennt. Der extrahierte Butylalkohol wird erneut, diesmal mit 75 1 Wasser gemischt, mit Natronlauge auf ein p_H von 7,3 bis 7,4 eingestellt und die wäßrige Schicht wiederum abgetrennt. Die vereinigten wäßrigen Extrakte werden darauf erneut der gleichen Behandlung unterworfen, nämlich einer Extraktion mit n-Butanol bei einem p_H von 2 und einer Extraktion mit Wasser bei einem p_H von 7,3 bis 7,4. Dabei erhält man schließlich 12,11 eines angereicherten wäßrigen Extraktes, der, nach dem Zerstäubungsverfahren getrocknet, 480 g des rohen Natriumsalzes des Amphomycins ergibt.

Beispiel 6

Klärung mit Aktivkohle und Ausfällung eines Rohproduktes mit Lösungsmitteln

20 g rohes Natriumsalz des Amphomycins, wie es nach Beispiel 5 erhältlich ist, werden in 500 ecm Wasser gelöst, der p_H-Wert der Lösung wird mit Phosphorsäure auf 2 eingestellt, und die saure Lösung wird mit 300 ecm n-Butanol extrahiert. Man erhält einen dunkelbraunen Extrakt. Die abgetrennte Butanolschicht wird durch Diatomeenerde filtriert, um Spuren von nicht gelöstem Wasser zu entfernen, und wird mit 20 g Aktivkohle 30 Minuten lang gerührt. Die Kohle wird dann abfiltriert und die hellgelbe Butanollösung im Vakuum auf ein Volumen von 100 ecm eingedampft. Dieses Konzentrat wird zu 2000 ecm Äthylazetat hinzugesetzt, wobei ein reichlicher Niederschlag von Amphomycin erhalten wird, der abfiltriert, mit Aceton gewaschen und getrocknet wird. Ausbeute 3,4 g eines leicht kremfarbenen festen Produktes, das folgende antibiotische Wirksamkeit im Diffusionsplattentest zeigt:

Zu prüfendes Material Unverdünnt

Verdünnt

1:4

1:16

20 g Ausgangsmaterial 1 mg im ecm .. 3>4 S gereinigtes Produkt 1 mg im ecm 23,1 mm
23,0 mm

21,1 mm
27,0 mm

15,8 mm 18,0 mm

Beispiel 7 Isoelektrische Fällung 10 g Amphomycin, erhalten nach Beispiel 6 durch 50 Butanolextraktion, Behandlung mit Aktivkohle und Fällung mit Äthylazetat, werden in 100 ecm Wasser gelöst. Man erhält bei einem pH von 2,2 eine klare Lösung. Diese Lösung wird mit verdünnter Natron lauge auf ein pH von 3,4 eingestellt. Dabei fällt ein 55 viskoser öliger Niederschlag aus. Die Mutterlauge	wird durch Dekantieren abgetrennt, mit Natronlauge auf ein pH von 6,6 eingestellt und lyophil getrocknet. Ausbeute 4,55 g eines Produktes A. Der ölige Nieder schlag wird in Wasser gelöst, ebenfalls auf ein pH von 6,6 eingestellt und lyophil getrocknet, wobei 5,68 g eines Produktes B erhalten werden. Die anti biotische Wirksamkeit dieser Stoffe im Vergleich zum Ausgangsmaterial wurde im Diffusionsplattentest be stimmt.	Verdünnung 1:16	1:64
Zu prüfendes Material	1:4	23,7 mm 21,0 mm 24,0 mm	14,7 mm 11,0 mm 17,0 mm
60 Ausgangsmaterial 1 mg im ecm nicht ausgefälltes Produkt A ausgefälltes Produkt B	29,0 mm 26,7 mm 29,0 mm

Beispiel 8

Reinigung mit Reineckes Salz 25 g des Natriumsalzes des Amphomycins werden in loo ecm Wasser gelöst und mit Phosphorsäure auf ein p_H von 2 angesäuert. Die Lösung wird dann mit ecm n-Butanol extrahiert. Der feuchte Butanolextrakt wird während einer halben Stunde mit 25 g Aktivkohle gerührt und filtriert. Das Filtrat wird mit ecm Wasser bei einem p_H von 7 extrahiert. Die abgetrennte wäßrige Schicht wird im Vakuum etwas konzentriert, um darin vorhandenes Butanol zu entfernen, und mit Phosphorsäure auf ein p_H von 1,9 eingestellt. 25 g Reineckes Salz werden in 200 ecm Wasser gelöst. Die Lösung wird auf ein p_H von 1,9 eingestellt und zu der Amphomycinlösung zugesetzt. Dabei fällt ein Niederschlag aus, der nach Stehenlassen über Nacht im Eisschrank abfiltriert wird. Der Niederschlag wird erneut in Wasser gelöst, indem das p_H der Lösung auf 7 eingestellt wird, und wird aus der erhaltenen Lösung durch Ansäuern auf einen p_H-Wert von 2 wieder ausgefällt. Das so umgefällte Produkt wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen, in ecm Aceton gelöst und nitriert. Zusatz von 11 Aceton- und konzentriertem Ammoniak bis zu einem p_H von 7,5 fällt das Ammoniumsalz des Amphomycins, das gewaschen und getrocknet wird. Ausbeute 12,4 g. Die Prüfung auf antibiotische Wirksamkeit im Diffusionsplattentest ergab folgendes Resultat:

Zu prüfendes Material 1:16

Verdünnung
1:64

ι: 256

Ausgangsmaterial 1 mg/cem
Endprodukt 1 mg/cem

Wie oben erwähnt, sind wäßrige Lösungen von

Amphomycin während mehrerer Tage beständig und zeigen keinen Wirkungsabfall. Lösungen dieser Art können daher mit Erfolg als Desinfektionsmittel und Antiseptika Verwendung finden.

Claims (11)

PATENTANSPRÜCHE:

1. Verfahren zur Herstellung und Gewinnung einer antibiotisch wirkenden Verbindung bzw. ihrer Salze, dadurch gekennzeichnet, daß ein Streptomycesstamm BL-456786 in einer wäßrigen kohlenhydrathaltigen Nährlösung, zweckmäßig unter submersen Bedingungen und unter Belüftung gezüchtet wird, bis die Nährlösung erhebliche antibakterielle Wirksamkeit, vor allem gegen grampositive Mikroorganismen aufweist, worauf die antibiotisch wirkende Verbindung Amphomycin bzw. ihre Salze aus der Nährlösung isoliert werden.

2. Ausführungsform des Verfahrens nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung bei einer Temperatur von etwa 24 bis 30⁰ während einer Dauer von 2 bis 7 Tagen und zweckmäßig bei einem p_H zwischen 7 und 7,8 durchgeführt wird.

3. Ausführungsform des Verfahrens nach Anspruch ι und 2, dadurch gekennzeichnet, daß zur Gewinnung von Amphomycin die rohen Amphomycinlösungen mit Aktivkohle entfärbt werden.

4. Ausführungsform des Verfahrens nach Anspruch ι bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Amphomycin aus seinen wäßrigen Lösungen mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel unter stark sauren Bedingungen, zweckmäßig mit n-Butanol oder Pentanol bei einem p_H von etwa 2, extrahiert wird.

5. Ausführungsform des Verfahrens nach Anspruch ι bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß Amphomycin aus seiner wäßrigen Lösung durch 25,3 mm
26,0 mm

20.7 mm

21.8 mm

i6,o mm 17,5 mm

Einstellung des p_H-Wertes zwischen 3 und 4, zweckmäßig auf 3,4 bis 3,5, gefällt wird.

6. Ausführungsform des Verfahrens nach Anspruch ι bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß Amphomycin aus seinen stark sauren Lösungen in mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln, insbesondere aus seinen Lösungen in Butanol, mit Wasser bei einem 4 übersteigenden p_H-Wert, vorzugsweise bei einem p_H von 7,3 bis 7,4, extrahiert wird.

7. Ausführungsform des Verfahrens nach Anspruch ι bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß Verunreinigungen von stark sauren wäßrigen Amphomycinlösungenmit Methylisobutylketon oderAmylazetat extrahiert und entfernt werden.

8. Ausführungsform des Verfahrens nach Anspruch ι bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß Amphomycin aus seinen Lösungen durch Reaktion seiner basischen oder sauren Gruppen mit in diesen Gruppen unter Bildung unlöslicher Derivate reagierenden Verbindungen, wie mit Reineckes Salz, gefällt wird.

9. Ausfiihrungsform des Verfahrens nach Anspruch ι bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß Amphomycin aus seinen Lösungen in Form der freien Säure durch Zusatz nicht polarer Lösungsmittel, wie Äthylazetat, Äther, gefällt wird.

10. Ausführungsform des Verfahrens nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lösung eines Alkalisalzes des Amphomycins und von Reineckes Salz auf einen p_H-Wert von 2 bis 3 eingestellt wird, wobei das Reineckat des Amphomycins ausfällt.

11. Ausführungsform des Verfahrens nach Ansprach 10, dadurch gekennzeichnet, daß aus einer Lösung des Reineckates das Amphomycin durch Zusatz von Ammoniak, zweckmäßig bis zu einem p_H von 7,5, das Ammoniumsalz des Amphomycin gefällt wird. lao

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