DE2916155A1

DE2916155A1 - Verbindung dc-11, verfahren zu ihrer herstellung, pharmazeutische zubereitung und mikroorganismenstamm zur durchfuehrung des herstellungsverfahrens

Info

Publication number: DE2916155A1
Application number: DE19792916155
Authority: DE
Inventors: Masaji Kasai; Nobuo Nakamura; Tetsuo Oka; Shuji Okubo; Kunikatsu Shirahata; Tatsuya Tamaoki; Fusao Tomita
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1978-04-20
Filing date: 1979-04-20
Publication date: 1979-10-31
Also published as: GB2019388A; DE2916155C2; FR2423539B1; JPS54138501A; FR2423539A1; GB2019388B; IT1119917B; IT7967842A0; JPS5638159B2

Description

Die Erfindung betrifft den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Es besteht ein ständiger Bedarf nach Verbindungen mit antibakterieller oder antineoplastischer Wirksamkeit. Von Seiten der Erfinder wurde eine neue Art eines Mikroorganismus aus einer Bodenprobe in Sendai-shi, Miyagi-ken, Japan, isoliert. Die aufgefundene neue Art bildet bei ihrer Züchtung in einem Nährmedium eine Verbindung mit antibakterieller Wirksamkeit.

Eine Untersuchung der morphologischen Eigenschaften des Mikroorganismus¹ führt zu der Erkenntnis, daß es sich bei diesen um einen neuen Stamm der Gattung Mikromonospora handelt.

Eine Untersuchung der chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften der isolierten aktiven Verbindung führt zu dem Ergebnis, daß es sich dabei um eine neue Verbindung handelty die als DC-11 bezeichnet wird.

Erfindungsgemäß wird die neue Verbindung DC-11 hergestellt, indem man einen Mikroorganismus der Gattung Micromonospora, der zur Bildung der neuen Verbindung DC-11 in der Lage ist, in einem Nährmedium züchtet. Nach beendeter Züchtung wird die erfindungsgemäße neue Verbindung DC-11 aus der Kulturflüssigkeit in an sich bekannter Weise, beispielsweise durch Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz, isoliert.

Die Verbindung DC-11 gemäß der Erfindung weist eine antibakterielle Wirksamkeit auf und ist deshalb unter anderem auch zur Reinigung und Sterilisation von Laboratoriums-

L _J

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Glasgeräten und chirurgischen Instrumenten geeignet. Ferner kann sie zusammen mit Seifen, Waschmitteln und Waschlösungen für sanitäre Zwecke eingesetzt werden. Die Verbindung der Erfindung ist aufgrund ihrer antibakteriellen Eigenschaften auch zur Behandlung von bakteriellen Infektionen bei Tieren geeignet. Darüberhinaus eignet sich die erfindungsgemäße Verbindung DC-11, wie aus der nachstehenden Beschreibung deutlich wird, auch als antxneoplastisches Mittel bei Tieren.

Die neue Verbindung DC-11 gemäß der Erfindung weist somit antibakterielle und antineoplastische Eigenschaften auf vmd ist durch die nachstehenden physxkochemxschen Eigenschaften gekennzeichnet:
(1) Schmelzpunkt: 225 bis 228°C (u.Zersetzung),

(2) Elementaranalyse: H = 6,9 %, C = 59,0, N = 2,0 %;

(3) IR-Spektrum (KBr-Pressling gemäß nachstehender Figur 1),

(4) UV-AbsorptionsSpektrum in Methanol gemäß nachstehender Figur 2,

(5) PMR-Spektrum in CDCl₃ (internes TMS) :

9,62, 6,92, 5,87-2,26 (viele Peaks), 2,09, 1,82, 1,64, 1,60, 1,53, 1,36, 1,29, 1,27, 1,21, 1,18, 1,13 (ppm),

(6) CMR-Spektrum in CDCl₃ (internes TMS):

14,0, 14,2, 15,1, 16,1, 16,9, 17,0-21,0 (ca. 4 Peaks) 22,1, 25,3, 26,8-28,0 (ca. 2 Peaks), 29,7, 31,2, 34,0-37,0 (ca. 3 Peaks), 38,5, 41,8, 43,2, 44,9, 51,2, 52,8, 53,8, 54,3, 60,0-68,0 (ca. 5 Peaks), 69,3, 70,0-78,0 (ca. 6 Peaks), 83,9, 91,4, 91,5-100,0 (ca. 5 Peaks), 100,8, 118,2, 123,0, 125,9, 126,3, 136,0/ 136,3, 141,3, 149,6, 157,3, 166,5, 170,4, 17O,8, 192,6, 201,4; 206,4 (ppm) und

(7) Spezifischer Drehwert:

[a]^° = -0,52° (c=2,0, Aceton),

(8) Löslichkeit:

Die Verbindung DC-11 ist löslich in Methanol, Äthanol, Butanol, Aceton, Äthylacetat und Chloroform; geringfü-

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gig löslich in Benzol und Wasser und unlöslich in Diäthyläther, Petroläther und n-Hexan.

Das Massenspektrum, zeigt kein ausgeprägtes Molekülion. 5

Aus der Elementaranalyse und dem CMR-Spektrum wird der Verbindung DC-11 die empirische Formel Cg_4-72 ^Hgo-102 ^N2 °26-3O zugeordnet, sowie ein Molekulargewicht von 1204 bis 1476.

Wie aus der nachstehenden Experimentalanalyse hervorgeht, wurde festgestellt, daß die Struktur der Verbindung DC-11 L-Digitoxose sowie L—Amicetose als Bestandteile enthält.

Gemäß der vorstehend genannten Experimentalanalyse wird 1,5 g der Verbindung DC-11 in einem Lösungsmitteigemisch aus 75 ml 0,2 N HCl und 150 ml Aceton gelöst. Die Lösung wird 17 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Anschließend wird Aceton unter vermindertem Druck abdestilliert. Das entstandene Gemisch wird viermal mit jeweils 50 ml Chloroform extrahiert.

Die entstandene wäßrige Phase wird unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 10 ml eingeengt,und das entstandene Konzentrat wird durch eine mit einem Kationenaustauscherharz, Dowex 1x4 (OH ), gefüllte Säule, geleitet. Anschließend wird das Austauscherharz gründlich mit Wasser gewaschen.

Das Eluat wird unter vermindertem Druck eingeengt und der entstandene Rückstand wird säulenchromatographisch, unter Verwendung von Kieselgel, behandelt. Die Säule x^ird mit einem Gemisch aus Chloroform und Methanol (9 ; 1 Volumteile) entwickelt. Man erhält Fraktionen, die L-Amicetose enthalten, sowie Fraktionen, die L-Digitoxose enthalten.

Die ersteren Fraktionen werden eingeengt, bis ein Rückstand von 218 mg einer ölartigen Substanz verbleibt. Die letzteren

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Fraktionen werden zur Trockene eingeengt, inn 196 mg eines Feststoffs zu ergeben.

Die ölartige Verbindung wird bei einem Druck von 0,1 Torr destilliert, wobei ein gereinigtes Öl entsteht. Die feste Substanz wird aus einem Gemisch von η-Hexan und Aceton umkristallisiert. Man erhält farblose Prismen.

Nachstehend sind die physikochemischen Eigenschaften des gereinigten Öls zusammengestellt j

(1) Erscheinungsform: farbloses öl;

(2) Siedepunkt: 75°C/O,1 Torr;

(3) spezifische Drehung:

[a]p² = -50,9° (c=1,08, Aceton);

(4) die physikochemischen Eigenschaften des 2,4-Dinitro- phenylhydrazons, das durch Umsetzung der ölartigen Substanz mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin erhalten wird, sind nachstehend zusammengestellt:

Schmelzpunkt: 160 bis 161°C,

PMR-Spektrum des 2 „4-Dinitrophenylhydrazons in d,--Pyridin und internem TMS (ö, ppm) : 1,56{d, 6,1, 3H), 2,2O(m, 2H), 2_f85(m, 2H), 3,94 (m, 1H), 4,14(dq, 6,1, 6,1, 1H), 7,91(d, 9,5,1H), 7,96Ct, 5,3, 1H)_f 8,29(dd, 9,5, 2,7, 1H), 9,O4(d, 2,7, 1H) .

Elementaranalyse des 2,4-Dinitrophenylhydrazons:

^C12^H16^N4°6^{: C} HN

ber.: 46,15 5,16 17,94

gef„: 46,13 5,14 17,94.

Aus dem Vorstehenden ergibt sich, daß die ölartige Substanz als L-Amicetose identifiziert wird.

Nachstehend sind die physikochemischen Eigenschaften der vorstehend erwähnten unkristallisierten farblosen Prismen zusammengestellt:

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1 (1) Erscheinungsform: farblose Prismen,

(2) Schmelzpunkt! 110 - 112⁰C,

(3) Spezifische Drehung:

[a]p²· = -37,3° (c =1,11, Methanol),

5 (4) PMR-Spektrum in CD₃OD und mit internem TMS (δ, ppm): 1,23(d, 6,1, 3H), 1,61(ddd, 13,7, 9,5, 2,8, 1H), 2,02 (ddd, 13,7, 3,7, 2,8, 1H), 3,14(dd, 9,5, 3,2, 1H), 3,77 (dg, 9,5, 6,1, 1H), 4,0Ö(ddd, 3,7, 3,2, 2,8, 1H), 5,06 (dd, 9,5, 2,4, 1H).
10 (5) Elementaranalyse:

C₆H₁₂O₄: C H

ber.: 48,64 8,16

gef.: 48,47 8,34.

15 Aus den vorstehenden Ergebnissen geht hervor, daß die farblosen Prismen als L-Digitoxose identifiziert werden können.

In der nachstehenden Tabelle I sind die R_f-Werte der Verbindung DC-11 bei Kieselgel-Dünnschichtchromatographie (DC) 20 unter Verwendung verschiedener Entwickler zusammengestellt:

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1	Träger	O	Tabelle I	R_f-Werte
I 5		Entwickler (V/V)	0,55
		Benzol j Aceton (35 : 65)	0,48
		Toluol : Aceton (4 : 6)	0,60
	Chloroform
II	(9	0,70
Chloroform ,
(92,5 :	O₇67
Chloroform .
(85 .	0,50
Chloroform ; (9 .
: Methanol
: D
: Dioxan
7,5)
. Tetrahydrofuran
15)
• Aceton : D

III Aceton : Dioxan : 0,35

10 % Ammoniumacetat (5:5:1)

+1: Kieselgel für DC, Nr. 5715, hergestellt von der „λ Firma Merck & Co.₇ Inc.

II: Kieselgel für "reversed phase" DC, Nr. 5747, hergestellt von Merck & Co., Inc.

III: Aluminiumoxid für DC, Nr. 5727, hergestellt von

Merck & Co., Ine.

Die Verbindung DC-11 der Erfindung wird durch Züchtung eines Mikroorganismus* der Gattung Micromonospora, der die Fähigkeit zur Bildung der erfindungsgemaßen Verbindung aufweist, 30

hergestellt. Ein besonders bevorzugter Stamm ist Micromonospora sp. KY 11091. Der vorstehende Stamm wurde bei der Kultursammlung der Northern Utilization Research and Development Division, Agricultural Research Service, U.S.

Department of Agriculture (ehemals Northern Regional 35

Research Agriculture), Peoria, Illinois 61604 unter der Hinter legungs -Nr . NRRL 11289 hinterlegt und ist öffentlich zugänglich.

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■j Der genannte Stamm wurde auch beim Fermentation Research Institute, Japan, unter der Hinterlegungs-Nr. FERM-P-Nr.4458 hinterlegt.

Der genannte Stamm KY 11091 ist durch die nachstehenden Eigenschaften gekennzeichnet j

I. Morphologische Eigenschaften:

Gut entwickeltes, verzweigtes, nicht septiertes Substrat — .Myzel mit einem Durchmesser von etwa 0,5 μ, jedoch wird kein echtes Luftmyzel gebildet. Sporen werden sehr gut ausgebildet und einzelne Sporen werden an den Enden von einfachen Sporophoren (Länge etwa 0,3 bis 1,0 μ), die sich aus dem Substrat-Myzel abzweigen, gebildet. Viele Sporen werden am Ende des Substrat-Myzels gebildet,. Gereifte Sporen weisen einen Durchmesser von etwa 1,0 μ auf und sind kugelförmig.

Wenn der Stamm im flüssigem Medium gezüchtet wird, ist das Wachstum anfänglich hellorange und wechselt in den späteren Stadien in ein Dunkelbraun. Es werden viele Sporen gebildet.

Sofern der Stamm in einem Agar-Medium gezüchtet wird, entsteht auf dem Medium, in dem die Sporen leicht gebildet werden, eine ziegelrote, glänzende, wachsartige Sporenschicht -

II ο Wuchsformen:

Wachsturnsgrad, Farbe des Substrat-Myzels sowie das eventuelle Auftreten löslicher Pigmente bei der Züchtung des Stammes· KY 11091 in verschiedenen Nährböden sind in nachstehender Tabelle II zusammengefaßt ο Die englischen Farbangaben richten sich nach der Klassifizierung in dem Color Harmony Manual (Container Corporation of America). Die Bestimmung der Eigenschaften erfolgt nach einer Züchtung bei 30°C während 2 Wochen.

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	Tabelle II	Farbe	Lösliche Pigmente
Nährboden	Wachstum	Black-olive (1 po), schwarz-oliv	keine
Sucrose-Nitrat-Agar	gut, flach	White (a), weiß	keine
Glucose-Asparagin-Agar	spärlich, flach	White (a), weiß	keine
Glycerin-Asparagin- Agar	spärlich, flach	Black-olive (1 po), Schwarz-oliv	keine
Stärke-anorganische Salze-Agar	gut, flach	Black-olive (1 po) schwarzoliv	keine
Tyrosin-Agar	mäßig	Apricot (4 ca), aprikosenfarben	keine
Nähragar	mäßig, flach	Apricot (4 ca), aprikos enfarben	keine
Hafermehl-Agar	mäßig, flach	Black-olive (1 po) s chwarz-oIiν	keine
Hefe-Malz-Agar	gut, erhaben	Orange (4 la), orange	keine
Pepton-Hefe-Agar	mäßig, flach

III. Physiologische Eigenschaften: Die physiologischen Eigenschaften des Stammes KY 11091 gehen aus der nachstehenden Tabelle III hervor, in der die optimale Wachstumstemperatur nach 5-tägiger Züchtung festgestellt wird und die Eigenschaften gegenüber Milch sowie im Hinblick auf die Zersetzung von Cellulose nach Imonatiger Züchtung festgestellt werden. Die sonstigen Eigenschaften werden nach Züchtung bei 27 C während 2 Wochen festgestellt.

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- 11 Tabelle III

(1) Verwertung von Kohlenstoffquellen

Kohlenstoffquelle D-Arabinose D-Xylose D-Glucose ■ D-Fructose Sucrose Inosit L-Rhamnose D-Raffinose D-Mannitol

(2) Sonstige Eigenschaften

Verflüssigung von Gelatine Verflüssigung von Milch Peptonisierung von Milch Zersetzung von Cellulose Hydrolyse von Stärke optimaler pH-Wert des Wachsturas optimale Temperatur des Wachstums Bildung von Tyrosinase Bildung von melanoiden Pigmenten

Verwertung

Negativ Positiv Negativ schwach positiv 6,6 - 7,5

28 - 38°C keine

keine

Wie aus den vorstehenden Ergebnissen hervorgeht, bildet der Stamm KY 11O91 kein echtes Luftmyzel in einem Agar-Nährboden und bildet Einzelsporen an dem Substrat—Myzel. Durch Analyse der Zellwand kann festgestellt werden, daß der Stamm Mesodiaminopimelinsäure enthält.

Der Stamm KY 11091 wird somit der Gattung Micromonospora zugeordnet und der Stamm der Erfindung (KY 11091) erzeugt in einer biologisch reinen Kultur bei der Züchtung die erfindungsgemäße Verbindung DC-11 in verwertbarer Ausbeute.

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Wie im Fall von anderen Stämmen von Actinomyzeten kann der zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignete Mikroorganismus einer an sich bekannten künstlichen Mutationsbehandlung, beispielsweise durch UV-Bestrahlung, Co -Bestrahlung, Röntgenbestrahlung und Mutation durch verschiedene, die Mutation induzierende chemische Wirkstoffe, wie N-mathyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin und dergleichen, unterworfen werden. Deshalb ist für das erfindungsgemäße Verfahren jeder Stamm, selbst nach erfolgter Mutation, geeignet, soweit er die Fähigkeit zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung DC-11 aufweist.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens können herkömmliche Verfahren zur Züchtung von Actinomyzeten verwendet werden. Im Züchtungsmedium können verschiedene Nährstoff quellen eingesetzt werden. Beispiele für geeignete Kohlenstoffquellen sind Glucose, Stärke, Mannose, Dextrin, Fructose, Sucrose (= Saccharose) und/oder Melassen. Kohlenwasserstoffe und Alkohole, organische Säuren und dergleichen können, je nach ihrer Verwertbarkeit durch die verwendeten Mikroorganismen, ebenfalls verwendet werden. Beispiele für anorganische oder organische Stickstoffquellen sind Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Harnstoff, Ammoniumnitrat und Natriumnitrat. Diese können allein oder zusammen mit natürlichen Stickstoffquellen, wie Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Trockenhefe, Maisquellflüssigkeit, Soyabohnenpulver, Kasaminsäure und löslichen Pflanzenproteinen, verwendet werden. Gegebenenfalls können anorganische Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Calciumcarbonat, Kaliumdihydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Eisensulfat, Calciumchlorid, Mangansulfat, Zinksulfat, oder Kupfersulfat, dem Medium zugesetzt werden. Außerdem können organische und anorganische Produkte, beispielsweise Vitamin B₁, Biotin und dergleichen, die das Wachstum des speziellen Stammes und die Bildung der Verbindung DC-11 fördern, dem Medium zugegeben werden.

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Vorzugsweise wird die Züchtung in einem flüssigen Medium, insbesondere unter Rühren im Submersverfahren, durchgeführt. Die Züchtungstemperaturen betragen nach Möglichkeit 25 bis 40⁰C, vorzugsweise 28 bis 38°C. Die Züchtung wird bevorzugt bei einem pH-Wert von 4 bis 10, insbesondere 6 bis 8, durchgeführt, wobei der gewünschte pH-Wert mittels einer wäßrigen Ammoniaklösung oder einer Ammoniumcarbonatlösung eingestellt wird.

Im allgemeinen hat sich nach 1 bis 7-tägiger Züchtung im flüssigen Medium die Verbindung DC-11 in der Kulturflüssigkeit gebildet und angereichert. Wenn die Ausbeute der Verbindung DC-11 in der Kulturflüssigkeit ein Maximum erreicht, wird die Züchtung abgebrochen. Das gewünschte Produkt wird nach dem Entfernen der Mikroorganismenzellen aus der Kulturflüssigkeit, beispielsweise durch Abfiltrieren, isoliert und gereinigt.

Die Isolierung und Reinigung der Verbindung DC-11 wird nach an sich üblichen Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Mikroorganismen-Stoffwechselprodukten auf Kulturflüssigkeiten durchgeführt. Beispielsweise wird das zellfreie Kulturfiltrat (pH-Wert 6,0) über einen mit einem nicht-ionischen porösen Austauscherharz, wie HP-20 (Warenzeichen der Firma Mitsubishi Chemical Industries) bepackte Säule gegeben, damit die aktiven Bestandteile adsorbiert werden. Die Desorption der aktiven Bestandteile erfolgt unter Verwendung von Methanol, Aceton, fithylacetat oder dergleichen. Das entstandene Eluat wird zur Trockene eingeengt und der Rückstand wird in Wasser gelöst. Anschließend wird die Lösung durch eine mit Aktivkohle gefüllte Säule geleitet und die Elution erfolgt mit einem organischen Lösungsmittel, wie Äthylacetat. Das Eluat wird zur Trockene eingeengt und der Rückstand wird in Chloroform gelöst. Die entstandene Lösung wird sodann durch eine Säule geleitet, die mit in Chloroform suspendiertem Kieselgel gefüllt ist, wobei gelb-

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liehe Verunreinigungen entfernt werden. Die Elution erfolgt mit einem Lösungsmittelgemisch aus Chloroform und Methanol (98 ; 2 Volumteile) und das Eluat wird zur Trockene eingeengt. Man erhält die aktive Verbindung. Das gleiche, vor-

stehend beschriebene Chromatographierverfahren oder ein Chromatographierverfahren unter Verwendung eines vernetzten Polysaccharid-Dextrans, wie Sephadex LH-2O (Warenzeichen der Firma Pharmacia Fine Chemicals Inc., Schweden), kann zur weiteren Reinigung des erwünschten Produktes wiederholt werden. Die auf diese Weise erhaltene erfindungsgemäße Verbindung DC-11 weist die vorstehend geschilderten physikochemischen Eigenschaften auf.

Die biologischen Eigenschaften der Verbindung DC-11 werden nachstehend geschildert.

In der nachstehenden Tabelle IV ist das in vitro gemessene antibakterielle WirkungsSpektrum der Verbindung DC-11, nach der Blättchen-Methode (Hemmhoftest-Methode) gemessen

(pH 8,0) angegeben.

Tabelle IV

Mindesthemmkonzentration (pg/ml) 25

Mikroorganismen MlC

Staphylococcus aureus ATCC 6538 P 100

Bacillus subtilus Nr. 10707 1,6

Klebsiella pneumoniae ATCC 10031 >100

Escherichia coli ATCC 26 >100

Shigella sonnei ATCC 9290 >100

Salmonella typhosa ATCC 9992 >100

Die akute Toxizität (LD₅₀ -Wert) für die Verbindung DC-11 beträgt bei intraperitonealer Verabfolgung für Mäuse 54 mg/kg.

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Die antineoplastische Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindung DC-11 ergibt sich aus den nachstehenden Untersuchungen :

Wirkung bei Sarkom 180 Ascitestumoren Sechs männliche ddY-Stamm-Mäuse mit einem jeweiligen Gewicht von 2O g werden für jede Gruppe als Testtiere eingesetzt. Es werden jeweils 5 χ 10 Sarkon 180 Ascitestumorzellen den Tieren implantiert. 24 Stunden nach erfolgter Implantation wird den Tieren jeweils intraperitoneal 0,2 ml Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), die jeweils unterschiedliche Konzentrationen der erfindungsgemäßen Verbindung DC-11 enthalten, verabfolgt. Die vorstehend genannte PBS besteht aus 0,8 g/dl Kochsalz, 0,02 g/dl KCl, 1i-15 g/dl Na₃HPO₄ und 0,02 g/dl KH₂PO₄ (pH 7,2).

Zum Vergleich werden 0,2 ml PBS-Lösungen, die als Testverbindung Mitomycin C enthalten, einer Gruppe von Tieren während der gleichen Zeit, bei der den anderen Versuchsgruppen die erfindungsgemäße Verbindung verabfolgt wird, gegeben.

7 Tage nach erfolgter Implantation wird bei den Versuchstieren das durchschnittliche Tumorvolumen T (mm ); und der Wert T/C (T = durchschnittliches Tumorvolumen nach Verabfolgung der erfindungsgemäßen Testverbindung; C = durchschnittliches Tumorvolumen ohne Verabfolgung einer Testverbindung) bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle V zusammengefaßt.

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Tabelle V

Testverbindung	Dosis (mg/kg)	T (mm )	T/C
Kontrolle	0	1405	—
DC-11	25	1096	0,78
DC-11	50	730	0,52
DC-11	70	590	0,42
Mitomycin C	4,2	450	0,32

Ti durchschnittliches Tumorvolumen

(2) Wirkung auf den Lymphozytenleukämie P-388 Tumor Als Testtiere werden für jede Versuchsgruppe fünf männliche CDF₁-MaUSe mit einem jeweiligen Gewicht von etwa 22 g verwendet. Den Testtieren werden jeweils 1 χ 10 -Zellen Lymphozytenleukämie P-388 Tumor-Zellen intraperitoneal implantiert. 24 Stunden nach erfolgter Implantation erfolgt die intraperitoneale Zugabe von 0,2 ml PBS-Lösung, die die Verbindung DC-11 in jeweils verschiedenen Konzentrationen enthält.

Zum Vergleich mit einer Gruppe der Testtiere wird gleichzeitig eine Lösung von 0,2 ml PBS, die als Testverbindung Mitomycin C enthält, intraperitoneal verabreicht.

Die nach der Implantation erhaltenen Versuchsergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle VI zusammengefaßt. In der Tabelle bedeuteten die Ausdrücke ASP (average survival period) die durchschnittliche Überlebensdauer nach der Verabfolgung, ausgedrückt in Tagen. Der Quotient ASP/C stellt das Verhältnis der durchschnittlichen tiberlebensdauer (in Tagen) aus der Gruppe der Versuchstiere, denen die erfindungsgemäße Testverbindung verabfolgt wurde und der durchschnittlichen Überlebensdauer (in Tagen) C von Versuchstieren, denen keine Testverbindung verabfolgt wurde, dar,

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	- 17 -	ASP (Tage)	2916155	"I
	Tabelle VI	9,4
Testverbindung	Dosis (mg/kg)	11,2	ÄSP/C
Kontrolle	0	13,4	—
DC-It	6,25	13,0	1,20
DC-11	12,5	14,2	1,43
DC-11	25,0	1,38
Mitomycin C	4,2	1,51

Wie die vorstehenden Ergebnisse zeigen, ist die erfindungsgemäße Verbindung DC-11 sowohl als antxneoplastisches als auch als antibakterielles Mittel wirksam.

Die Verabfolgung der erfindungsgemäßen Verbindungen als pharmazeutische Präparate kann enteral, parenteral oder

lokal erfolgen.

Weiterhin können die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen übliche Trägerstoffe und/oder Verdünnungsmittel

und/oder Hilfsstoffe enthalten.
20

Die Verabfolgung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zu-. bereitungen kann in an sich bekannter Weise in Form von Tabletten, Kapseln oder als Flüssigkeiten, z.B. in Form von Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen, erfolgen.

Die Verabfolgung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen zur Verwendung als antineoplastische Mittel erfolgt vorzugsweise in Form von Injektionspräparaten.

Die jeweils geeignete Dosierung hängt von der erwünschten therapeutischen Wirkung der Verabfolgungsweise und der geplanten Behandlungsdauer ab. Im allgemeinen sind tägliche Dosierungen von etwa 0,1 bis 0,5 mg/kg Körpergewicht zum Erzielen einer antineoplastischen Wirksamkeit ausreichend.

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Das Beispiel erläutert die Erfindung. Hierbei wird die Anwesenheit der Verbindung DC-11 durch ein bio-assay-Verfahren unter Verwendung von Bacillus subtilus Nr. 10707 als Test-Mikroorganismus nachgewiesen.

Beispiel 1

Der Stamm Micromonospora sp. KY 11091, NRRL 11289 wird in einen 2 Liter fassenden Erlenmeyer-Kolben überimpft, der 30O ml eines Kulturmediums enthält, das wie folgt zusammen-" gesetzt ist: 4 g/Liter KCl, 0,5 g/Liter MgSO..7H„O, 1,5 g/Liter KH₂PO₄, 5,0 g/Liter (NH₄J₂SO₄, 20 g/Liter Sucrose, 10 g/Liter Fructose, 10 g/Liter Glucose, 5,0 g/Liter Maisquellwasser und 20 g/Liter CaCO₃ (pH 7,0). Die Züchtung wird 48 Stunden unter Rühren (220 Upm) bei 30⁰C durchgeführt. Sodann werden 0,75 Liter der auf diese Weise erhaltenen Vorkultur in einen 30 Liter fassenden Fermenter überimpft. Die Zusammensetzung des dort enthaltenen Kulturmediums ist wie folgt:
40 g/Liter lösliche Stärke, 8 g/Liter Hefeextrakt, 0,09 g/Liter MgSO₄^H₃O, 0,15 g/Liter KH₂PO₄, 0,21 g/Liter K₃HPO , 10 mg/Liter Vitamin B..HCl, 30 ug/Liter Biotin, 10 mg/Liter FeSO₄^H₃O, 30 mg/Liter CaCl₃, 4 mg/Liter MnSO₄, 30 mg/Liter ZnSO..7H₂O und 2 mg/Liter CuSO₄-SH₂O.

Vor der Sterilisation wird das Nährmedium mit NaOH auf einen pH-Wert von 7 eingestellt. Die Züchtung in dem Fermenter wird 72 Stunden unter Belüftung und Rühren (15 Liter/min, Belüftung; 150 Upm) bei 30°C durchgeführt. Der pH-Wert des Nährmediums wird während der Züchtung nicht kontrolliert.

Die entstandene Kulturflüssigkeit wird danach filtriert. Man erhält 13 Liter Filtrat. Das Filtrat wird auf eine mit 1 Liter eines nicht-ionischen porösen Austauscherharzes HP-10 (Warenzeichen der Firma Mitsubishi Chemical Industries) gegeben, um die aktiven Bestandteile zu adsorbieren. Anschließend wird das Austauscherharz zur Entfernung der Ver-

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unreinigungen mit einem Gemisch aus Wasser und 30 % (V/V) Aceton gewaschen. Die Elution erfolgt mit Aceton. Die vereinigten Acetonfraktionen werden zur Trockene eingeengt. Man erhält einen Rückstand/ der in einer 30prozentigen Acetonlösung gelöst wird.

Die entstandene Lösung wird auf eine mit 50 ml Aktivkohle gefüllte Säule gegeben. Anschließend wird die Säule mit einer 30prozentigen Acetonlösung gewaschen. Die Elution erfolgt mit Aceton, wobei der größte Teil der in der Lösung als Verunreinigungen anwesenden Pigmente entfernt wird.

Die aktiven Fraktionen werden vereint und zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wird in etwa 10 ml Chloroform gelöst. Die Chloroformlösung wird auf eine mit 500 ml Kieselgel (Silic AR CC-4, Warenzeichen der Firma Mallinckrodt Co., U.S.A.), das in Chloroform suspendiert ist, gefüllte Säule gegeben und mit etwa 2 Liter Chloroform gewaschen.

Die Elution erfolgt mit einem Lösungsmittelgemisch aus Chloroform und Methanol (98 : 2 Volumteile'. Man erhält DC-11 enthaltende Fraktionen. Die Fraktionen werden vereint und zur Trockene eingeengt. Man erhält 55 mg eines Rohproduktes. Das Rohprodukt wird wie vorstehend beschrieben, unter Verwendung von Kieselgel, chromatographiert. Man erhält 32 mg eines gereinigten Pulvers, dessen physikochemische Eigenschaften und dessen antibakterielle und antineoplastische Wirksamkeit mit den vorstehend geschilderten Eigenschaften übereinstimmen.

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Claims

u.Z.ι Ρ 140 (PT/kä)
Case: 232-4

KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD.
Tokyo, Japan
10

" Verbindung DC-11, Verfahren zu ihrer Herstellung, pharmazeutische Zubereitung und Mikroorganismenstamni zur Durchführung des Herstellungsverfahrens "

Priorität: 2O. April 1978, Japan, Nr. 45 916/1978

Patentansprüche

1= Verbindung DC-11, gekennzeichnet durch folgende Kenndaten:

(1) Schmelzpunkt: 225 bis 228°C (übersetzung),
(2) Elementaranalyse: H = 6,9 %,.C = 59,0, N = 2,0 %,

(3) IR-Spektrum (KBr-Pressling gemäß nachstehender Figur 1)

(4) UV-Absorptionsspektrum in Methanol gemäß nachstehender Figur 2, *

(5) PMR-Spektrum in CDCl₃ (internes TMS) ι

9,62, 6,92, 5,87-2,26 (viele Peaks), 2,09, 1,82, 1,64, 1,60, 1,53, 1,36, 1,29, 1,27, 1,21, 1,18, 1,13 (ppm),

(6) CMR-Spektrum in CDCl₃ (internes TMS):

14,0, 14,2, 15,1, 16,1, 16,9,'17,0-21,0 (ca. 4 Peaks)
22,1 _s 25,3, 26,8-28,0 (ca. 2 Peaks), 29,7, 31,2,
34,0-37,0 (ca. 3 Peaks), 38,5, 41,8, 43,2, 44>9, 51,2, 52,8, 53,8, 54,3, 60,0-68,0 (ca. 5 Peaks), 69,3,

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^Γ -2 -

70,0-78,0 (ca. 6 Peaks), 83,9, 91,4, 91,5-100,0 (ca. 5 Peaks), 100,8, 118,2, 123,0, 125,9, 126,3, 136,O,

136.3, 141,3, 149,6, 157,3, 166,5, 170,4, 170,8, 192,6,

201.4, 206,4 (ppm) und
(7) Spezifischer Drehwert:

[a]p° = -0,52° (c=2,0, Aceton).
2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung DC-11 gemäß Anspruch \, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus der Gattung Micromonospora, der die Fähigkeit zur Bildung der Verbindung DC-11 besitzt, in einem Nährmedium züchtet , bis sich in der Kulturflüssigkeit eine wesentliche antibakterielle Aktivität nachweisen läßt und daran anschließend die Verbindung DC-11 aus der Kulturflüssigkeit isoliert.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Micromonospora sp.· KY 11091, NRRL 11289 verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung bei einer Temperatur von 25 bis 40 C während 1 bis 7 Tagen bei einem pH-Wert von etwa 4 bis 10 vornimmt.
5. Pharmazeutische Zubereitung, enthaltend die Verbindung gemäß Anspruch 1 und übliche Trägerstoffe und/oder Verdünnungsmittel und/oder Hilfsstoffe.
6. Biologisch reiner Mikroorganismenstamm Micromonospora sp. KY 11091 zur Durchführung des Verfahrens gemäß den Ansprüchen 2 bis 4, der die Kenndaten des hinterlegten Stammes NRRL 11289 aufweist, gekennzeichnet durch dessen Fähigkeit, die Verbindung DC-11 gemäß Anspruch 1 in ausreichenden Mengen durch Züchtung in einem Nährmedium zu bilden. 35

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