DE2261832C3 - 5-Dihydrocoriolin C und Verfahren zu seiner Gewinnung - Google Patents
5-Dihydrocoriolin C und Verfahren zu seiner GewinnungInfo
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Description
OH
2. Verfahren zur Gewinnung von 5-Dihydrocoriolin C aus einem Filtrat, das durch Züchten
des Stammes Coriolus consors ATCC 20105 in einem zur Bildung von 5-Dihydrocoriolin C geeigneten
Medium bei einer Temperatur von 15— 300C unter aeroben Bedingungen, Abtrennen
eines Teils des gebildeten Mycels, Exiraktion desselben mit einem organischen Lösungsmittel,
Einengen des Extraktes und Abfiltrieren des ausgeschiedenen Coriolins B erhalten worden ist,
dadurch gekennzeichnet, daß man die erhaltene Mutterlauge noch weiter einengt, das ausgeschiedene
5-Dihydrocoriolin C abfiltriert und gewünschtenfalls umkristallisiert oder aber das 5-Dihydrocoriolin
C enthaltende Filtrat in üblicher Weise Chromatographien.
Gegenstand des Patents 21 06696 ist ein Verfahren
zur Herstellung von Coriolin B durch aerobe Kultivierung von Mikroorganismen des Stamms Coriolus
consors ATCC 20305 bei 15—300C und Abtrennung
aus dem Nährmedium mit Hilfe eines Lösungsmittels.
Das Verfahren der Erfindung ist nun dadurch gekennzeichnet, daß man die vorstehend erhaltene
Mutterlauge noch weiter einengt, das ausgeschiedene 5-Dihydrocoriolin C abfiltriert und gewünschtenfalls
umkristallisiert oder aber das 5-Dihydrocoriolin C enthaltende Filtrat in üblicher Weise chromatographiert.
Das erfindungsgemäße 5-Dihydrocoriolin C ist eine neue Substanz, die in der Lage ist, durch Oxidation
Coriolin C und 2'»Dehydrocoriolin C mit antibakterieller und Antitumorwirkung zu bilden.
Das IR-Absorptionsspektrum des erfindungsgemäßen
5-Dihydrocoriolin C (bestimmt an einer Tablette aus 5-Dihydrocoriolin C und Kaliumbromid)
ist der angefügten Zeichnung zu entnehmen.
Das gemäß der Erfindung erhaltene 5-Dihydrocoriolin C wird in rohem und kristallinem Zustand
gewonnen und besitzt selbst keine antibakterielle oder Antitumorwirkung, jedoch zeigen Coriolin C und
2'-Dehydrocoriolin C, die durch Oxidation von 5-Dihydrocoriolin C mi'i einem Oxidationsmittel erhalten
werden, eine antibakterielle Wirkung gegenüber Staphylococcus aureus und Bacillus subtilis und eine
lebensverlängernde Wirkung beim Ehrlich-Ascitestumor bei der Maus und Mäuse-Leukämie L-1210,
wie aus den nachfolgenden Versuchsergebnissen hervorgeht (bzgl. Coriolin C siehe Umezawa u.a.:
Tetrahedron betters, Nr. 19 [1970], Seiten 1637—1639;
2'-Dehydrocoriolin C ist eine neue Verbindung).
Die Ergebnisse einer Untersuchung der antibal teriellen Wirkungen von Coriolin C und 2'-Dehydr<
coriolin C nach der Agar-Agar-Verdünnungsmethoc sind in der nachfolgenden Tabelle 1 angegeben.
Antibakterielle Wirkung von Coriolin C
und 2'-Dehydrocoriolin C
und 2'-Dehydrocoriolin C
Test-Organismen Coriolin C
St. aureus
FDA 209-P 1,56*)
Terajima 1,56
Smith 1,56
M. flavus FDA-16 <0,78
B. anthracis <0,78
B. subtilis NRR B-558 <0,78
E. coli NIHJ 25,0
S. typhi-T63 > 100,0
enteritis 12,5
enteritis 12,5
Ps. aeruginosa AS > 100,0
·) Mindesthemmkonzentralion (iig/ml).
·) Mindesthemmkonzentralion (iig/ml).
2-Dehydrok'oriolin
C
1,56*) 1,56
L,56
1,56
L,56
1,56
<0,78
1,56
1,56
100,0
> 100,0
12.5
100,0
Diese beiden Verbindungen hemmen das Wachstun von grampositiven Mikroorganismen, und mit beidei
Substanzen können nahezu gleiche Wirkungen erziel werden.
Die Wirkungen von Coriolin C und 2'-Dehydro coriolin C auf den Ehrlich-Ascitestumor bei de
Maus, Mäuse-Leukämie L-1210 und das Wachstun
von Yoshida-Sarkomzellen in Gewebskulturen wurdet untersucht und folgende Ergebnisse erhalten:
Die Behandlung von Ehrlich-Ascitestumoren be
Mäusen wurde mit einer täglichen Verabreichung vor 0,19 bis 12,5 mg/kg von jeder der beiden Verbindung«
über 10 Tage hinweg durchgeführt. Während aiii
Kontrolltiere innerhalb von 2"* Tagen nach Ein
impfung der Tumorzellen tot waren, überlebtet Mäuse, die mit 12,5, 6,25, 3,12, 1,56 und 0,678 rng/kj
Coriolin C oder 2'-Dehydrocoriolin C unter Ver abreichung in die Bauchhöhle behandelt wordei
waren, zu 90%, 80%, 65%, 63% und 60% (bei Ver abreichung von Coriolin C) mehr als 50 Tage und zi
80%, 75%, 60%, 60% und 50% (bei Verabreichuni von 2'-Dehydrocoriolin C) mehr als 50 Tage, und e;
wurde keine Ascitesretentin beobachtet.
Eine Behandlung von Mäuse-Leukämie L-121C durch tägliche Verabreichung von 6 bis 100 mg/kg
Coriolin C oder 2'-Dehydrocoriolin C über 10 Tag« hinweg ergab bei Mäusen, denen 6, 12,5, 25, 50 bzw
100 mg/kg Coriolin C oder 2'-Dehydrocoriolin C verabreicht
worden waren, eine lebensverlängernde Wirkung von 119%, 131%, 140%, 150% bzw. 175% bei
Coriolin C und von 115%, 120%, 125%, 135% bzw 160% beim 2'-Dehydrocoriolin C (bezogen auf die
Überlebensdauer der Kontrolltiere [100%]).
Bei der Untersuchung der Wachstumshemmung an Gewebskulturen von Yoshida-Sarkomzellen bei
Ratten wurde eine 60%ige Fortpflanzungsinhibition mit 0,75 μg/mg mit Coriolin C bzw. 2-Dehydrocoriolin
C erhalten.
Untersuchungen der akuten Toxizität von Coriolin C und 2-Dehydrocoriolin C bei Mäusen ergaben,
daß die DL50 bei Verabreichung in die Bauchhöhle
über 50 mg/kg und bei subkutaner Verabreichung über 90 mg/kg liegt. Ferner überlebten im Falle der
kontinuierlichen Verabreichung in die Bauchhöhle über 10 Tage hinweg alle geprüften Mäuse für mehr
als 50 Tage, selbst wenn die Gesamtdosis 100 mg/kg erreichte, und es wurde gefunden, daß die Toxizität
gering ist.
Aus dem Vorstehenden folgt, daß Coriolin C und 2'-Dehydrocoriolin C eine ausgezeichnete antibakterielle
und Antitumorwirkung besitzen.
Zwischen den Eigenschaften des 5-DihydrocoriolinsC
OH
OH
O—CO-CH-(CH2I5-CH,
OH
Coriolin C
Coriolin C
Ο—CO—C—(CH2J5-CH,
O
2'-Dehydrocoriolin C
O—CO—CH-(CH2J5-CH3
OH
und den vorteilhaften pharmakologischen Eigenschaften der daraus durch Oxidation zugänglichen Coriolinen
40
45
besteht dabei ein eindeutiger Kausalzusammenhang, wie der Strukturvergleich der entsprechenden Formeln
zeigt, wobei der Ketogruppe in 5-SteIlung vermutlich eine entscheidende Rolle für die pharmakologische
Wirkung zukommt.
Coriolin C kann zwar direkt durch Gärung hergestellt werden, jedoch ist die Ausbeute so gering,
daß ein solches Verfahren industriell kaum durchgeführt werden kann. Dagegen wird 5-Dihydrocorio-Hn
C gemäß der Erfindung in hoher Ausbeute erhalten, und es kann glatt durch bestimmte Oxidationsmittel
in Coriolin C umgewandelt werden. Die Herstellung von Coriolin C durch Oxidation von 5-Dihydrocoriolin
C ist daher vorteilhafter und wirtschaftlicher als auf direktem fermentativen Wege.
Das gemäß der Erfindung erhaltene 5-Dihydrocoriolin C hat folgende Eigenschaften:
5-Dihydrocoriolin C wird in Form von farblosen Kristallen erhalten, die bei 183° C schmelzen und in
Methanol, Äthanol, Äthylacetat, Aceton, Chloroform und Benzol löslich, aber in Wasser und Petroläther
wenig oder nicht löslich sind. 5-Dihydrocorioün C zeigt folgendes IR-Absorptionsspektrum (gemessen an
KBr-Tabletten). Die Hauptabsorptionen liegen bei
den Wellenzahlen (cm"1) 3490, 3360, 2950, 1741, 1649,
1460, 1419, 1389. 1370, 1340, 1315, 1270, 1184, 1139. 1109, 1081, 1032, 1003, 983, 965, 949, 921, 891, 868,
841, S09, 788, 781, 751, 716 und 672. Das Spektrum ist in der angefügten Zeichnung dargestellt.
5-Dihydrocoriolin C hat ein Molekulargewicht von 424 (massenspektrometrisch bestimmt) und zeigt bei
der Elementaranalyse folgende Werte: C 65,07% und H 8,55%; es enthält keinen Stickstoff.
Anhand der obigen Werte der Elementaranalyse und des massenspektrometrisch ermittelten Molekulargewichts
wurde als Summenformel C23H36O7 (Molekulargewicht:
424) gefunden.
Die obige Strukturformel des 5-Dihydrocoriolin C wurde aufgrund der Analyse des NMR-Spektrums
sowie seines Verhaltens gegenüber Reagentien ermittelt.
5-Dihydrocoriolin C wird auch von Basisdiomyceten gebildet, unterscheidet sich jedoch hinsichtlich
der physikalischen und chemischen Eigenschaften, Summenformel und Strukturformel von den bereits
bekannten Produkten Coriolin, Coriolin B, Corio-Hn C, 5-Ketocoriolin B oder Hirustinsäure C. Es ist
neu. Zur Herstellung des als Ausgangsmaterial verwendeten 5-Dihydrocoriolin C enthaltenden Filtrats
wird zunächst nach Patent 21 06 696 ein Mikroorganismus, der befähigt ist, 5-Dihydrocoriolin C zu bilden,
nämlich Coriolus consors (Berk) Imaz ATCC Nr. 20 305, der von Honshu bis Kyushu (Japan) weit
verbreitet und im Detail im »Zoku Genshoku Nippon Kinrui Zukan« (farbiges japanisches »Bakterienbilderbuch«,
Forts.) von Rokuya I m a ζ e k i und Jiro Hongo, Seiten 141 und 142, Hoikusha Publishing
Co., Japan, Auflage von 1968 beschrieben ist, in einem geeigneten Medium unter aeroben Bedingungen gezüchtet.
Obwohl es möglich ist, für die Züchtung eine Feststoffkulturmethode anzuwenden, wird für die
Massenproduktion ein flüssiges Kulturverfahren bevorzugt, üblicherweise wird die Züchtung bei 15 bis
30° C und insbesondere bei 25 bis 280C durchgeführt.
Als Kulturmedium für die Bildung von 5-Dihydrocoriolin C kann ein eine Kohlenstoffquelle, eine
Stickstoffquelle, anorganische Salze, Produktinspromotoren usw. enthaltendes Medium verwendet werden.
Als Kohlenstoffquelle können handelsüblich erhältliche Zucker, öle und Fette usw. verwendet werden
wie beispielsweise Glucose, Glycerin, Stärke, Dextrin, Maltose, Lactose, Saccharose, öl und Fett oder
Melassen in reinem oder rohem Zustand.
Als Stickstoffquelle können Sojabohnenpulver, Fleischextrakt, Pepton, getrocknete Bierhefe, Hefeextrakt,
Getreideweichlaugen, Casein, Baumwollsamenöl, Fischmehl, Nitrate, Ammoniumsalze, Harnstoff
oder Aminosäuren wie Glutaminsäure od. dgl verwendet werden.
Als anorganische Salze kommen Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Calciumcarbonat
oder Phosphate oder sehr geringe Mengen von Salzen von Schwermetallen wie Kupfer, Mangan, Eisen oder
Zink in Betracht. Ferner erhöht die Zugabe, insbesondere Teilzugabe von Essigsäure oder Malonsäure
bzw. Mevalonsäure die Bildung von 5-Dihydrocoriolin C während der Züchtune.
5 J 6
Ein Beispiel für ein geeignetes Kulturmedium für 5-Ketocoriolin B enthalten. Da jedoch Coriolin B in
die Herstellung des 5-Dihydrocoriolin C enthaltenden Äthylacetat am wenigsten löslich ist, wird es durch
Filtrats wird nachfolgend angegeben: Einengen des flüssigen Extraktes zuerst ausgeschieden
, ., . .. und kann durch Filtrieren entfernt werden.
Zusammensetzung I (Impfmedium) s Erfahrungsgemäß wird nun 5-Dihydrocoriolin C
Glukose 5,0% aus der dabei erhaltenen Mutterlauge durch Einengen
Pepton 0,2% und Stehenlassen der eingeengten Flüssigkeit in Form
Getrocknete Bierhefe 0,3% von nadelähnichen Kristallen ausgeschieden, da 5-Di-
Kaliurndihydrogenphosphat 0,3% hydrocoriolin C besser kristallisierbar ist als 5-Keto-
Magnesiumsulfat 0,1 % ι ο corolin B.
Polyoxyäthylengruppen enthaltendes Wenn jedoch im Extrakt viel Verunreinigungen
grenzflächenaktives Mittel 0,01% enthalten sind, ist die Ausscheidung von 5-Dihydrocoriolin
C-Kristallen schwierig, und das 5-Dihydro-
Zusammensetzung II (Produktionsmedium) coriolin c wird daher vom 5.Ketocoriolin B üblicher-
Glukose 5,0% 15 weise durch chromatographische Methoden unter
Pepton 0,2% Verwendung von Silikagel als Trägermedium und einer
Getrocknete Bierhefe 0,3% Lösungsmittelmischung von Methanol-Chloroform,
Kaliumdihydrogenphosphat 0,3% Chloroform oder Benzol als Elutionsmittel getrennt.
Magnesiumsulfat 0,1% Bei der Elution wird 5-Ketocoriolin B zuerst eluiert
Polyoxyäthylengruppen enthaltendes 20 und dann das 5-Dihydrocoriolin C. Ihre Trennung
grenzflächenaktives Mittel 0,01% ist zufriedenstellend möglich, da sich die beiden Ver-
Calciumcarbonat*) 1,6% bindungen duron zwei Hydroxylgruppen im MoIe-
*) Gesondert sterilisiert und zum Medium zu Beginn der Kultur kül unterscheiden
zugesetzt Das durch Eindampfen des 5-Dihydroconolin C
25 enthaltenden Eluats zur Trockne erhaltene rohe PuI-
Eine inkubierte Impfflüssigkeit der Zusammen- ver wird in einer geringen Menge eines organischen
Setzung I wird dann unter Schütteln in dem als Lösungsmittels gelöst und das 5-Dihydrocoriolin C
Zusammensetzung II bezeichneten Medium einige daraus in Form von nadelähnlichen Kristallen durch
Tage lang bei 15 bis 30°C kultiviert. Im Falle der Zugabe von Lösungsmitteln, in denen 5-Dihydro-
Züchtung in großem Maßstab unter Verwendung 30 coriolin C schwer löslich ist, beispielsweise n-Hexan
eines Fermentationstanks wird das Beimpfen und oder Wasser, ausgeschieden.
Kultivieren in zwei Stufen durchgeführt. Zur überführung von 5 - Dihydrocoriolin C in
Gemäß der üblichen Verfahrensweise wird die Coriolin C bzw. 2'-Dehydrocoriolin C durch Oxidurch
Kultivierung in einem Impfmedium in einer dation stehen unterschiedliche Methoden zur Ver-Schüttelflasche
erhaltene erste Impfflüssigkeit zunächst 35 Fügung: (1) die Oxidation mit Chromsäure in Pyridin,
in einen vorangehend mit Impfmedium versehenen (2) die Oxidation mit Mangandioxid in neutraler
Fermentationstank überführt und der Kultivierung Lösung oder (3) die Oxidation mit einer Dicyclohexylunterworfen.
Anschließend wird die zweite Impfflüssig- carbodiimidlösung in Dimethylsulfoxid. Vorteilhaft
keit in das in einem anderen Fermentationstank werden jedoch die Verfahrensweisen (1) und (2) angeenthaltene
Produktionsmedium angeimpft und der 40 wandt.
Kultivierung unterworfen; die zweite Stufe kann Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Bei-
jedoch auch weggelassen werden. spielen erläutert.
Bei dieser Kultivierung werden Coriolin, Coriolin B,
B-Ketocoriolin B und 5-Dihydrocoriolin C gebildet; Beispiel 1
da das Coriolin hauptsächlich im flüssigen Anteil 45
vorliegt, während Coriolin B, 5-Ketocoriolin B und a) Ausgangsmaterial
5-Dihydrocoriolin C hauptsächlich im Mycel vorhanden sind, wird der Coriolin B, 5-Ketocoriolin B 25 g Holzschnitzel (entsprechend ca. 0,3 bis 0,85 mm und 5-Dihydrocoriolin C enthaltende Mycelanteil der lichter Maschenweite) von Magnolia hypoleuca wur-Kulturflüssigkeit nach allgemein bekannten Methoden, 50 den in einen Erlenmeyerkolben von 1 1 Fassungswie Filtrieren oder Zentrifugieren, abgetrennt. Wenn vermögen gebracht und mit 170 ml eines 2% Glukose dieser Mycelanteil einer Extraktion mit organischen und 0,5% getrocknete Bierhefe enthaltenden flüssigen Lösungsmitteln, wie Methanol, Aceton, Äthylacetat, Kulturmediums (nachfolgend mit »GY-Medium« be-Butylacetat oder Methylisobutylketon unterworfen zeichnet) versetzt Dann wurde die Flasche in einem wird, wird das 5-Dihydrocoriolin C in die organische 55 Autoklav bei 120° C 20 min lang sterilisiert und da-Lösungsmittelschicht übergeführt nach mit zur Bildung von 5-Dihydrocoriolin C beWenn bei der Extraktion ein mit Wasser mischbares fähigten Mikroorganismen (ATCC 20305) von einer organisches Lösungsmittel, beispielsweise Aceton, Me- Agar-Schrägkultur beimpft, die 10 bis 14 Tage lang thanol oder Äthanol, als Extraktionsmittel verwendet bei 25 bis 27° C kultiviert worden waren. Die resulwird, wird die Extraktflüssigkeit unter vermindertem 60 tierende Kultur wurde als Holzschnitzel-Impfvorrat Druck eingeengt und die eingeengte Flüssigkeit dann verwendet.
5-Dihydrocoriolin C hauptsächlich im Mycel vorhanden sind, wird der Coriolin B, 5-Ketocoriolin B 25 g Holzschnitzel (entsprechend ca. 0,3 bis 0,85 mm und 5-Dihydrocoriolin C enthaltende Mycelanteil der lichter Maschenweite) von Magnolia hypoleuca wur-Kulturflüssigkeit nach allgemein bekannten Methoden, 50 den in einen Erlenmeyerkolben von 1 1 Fassungswie Filtrieren oder Zentrifugieren, abgetrennt. Wenn vermögen gebracht und mit 170 ml eines 2% Glukose dieser Mycelanteil einer Extraktion mit organischen und 0,5% getrocknete Bierhefe enthaltenden flüssigen Lösungsmitteln, wie Methanol, Aceton, Äthylacetat, Kulturmediums (nachfolgend mit »GY-Medium« be-Butylacetat oder Methylisobutylketon unterworfen zeichnet) versetzt Dann wurde die Flasche in einem wird, wird das 5-Dihydrocoriolin C in die organische 55 Autoklav bei 120° C 20 min lang sterilisiert und da-Lösungsmittelschicht übergeführt nach mit zur Bildung von 5-Dihydrocoriolin C beWenn bei der Extraktion ein mit Wasser mischbares fähigten Mikroorganismen (ATCC 20305) von einer organisches Lösungsmittel, beispielsweise Aceton, Me- Agar-Schrägkultur beimpft, die 10 bis 14 Tage lang thanol oder Äthanol, als Extraktionsmittel verwendet bei 25 bis 27° C kultiviert worden waren. Die resulwird, wird die Extraktflüssigkeit unter vermindertem 60 tierende Kultur wurde als Holzschnitzel-Impfvorrat Druck eingeengt und die eingeengte Flüssigkeit dann verwendet.
einer erneuten Extraktion mit einem nicht-hydro- Dieser wurde dann zu 500 ml sterilisiertem GY-philen
organischen Lösungsmittel wie beispielsweise Medium hinzugegeben. Je 100 ml der Mikroorganis-Äthylacetat
oder Methylisobutylketon unterworfen, men-Suspension wurden in 5 Erlenmeyerkolben von
wodurch wasserlösliche Verunreinigungen entfernt 65 5 1 Inhalt mit 1 1 Medium der folgenden Zusammenwerden.
Setzung I gebracht und 72 Stunden auf einem dreh-In der Extraktflüssigkeit sind neben dem gewünsch- baren Schüttelkultivator mit 190 U/Minute bei 27° C
ten 5-Dihydrocoriolin C zusätzlich Coriolin B und kultiviert.
Zusammensetzung I (Impfmedium)
Glukose 5,0%
Pepton 0,2%
Getrocknete Bierhefe 0,3%
Kaliumdihydrogenphosphat 0,3%
Magnesiumsulfat 0,1 %
Polyoxyäthylengruppen enthaltendes grenzflächenaktives
Mittel 0.01% ίο
Mittel 0.01% ίο
Die Gesamtmenge dieser ersten Impfflüssigkeit wurde in einen 200-1-Fermentationstank aus rostfreiem
Stahl mit 1201 eines Mediums mit der gleichen Zusammensetzung wie oben eingebracht und κ
72 Stunden lang unter Rühren (200 U/Minutc) und mit einer Belüftungsrate von 120 l/Minute bei 27'C
kultiviert.
Danach wurden 12 1 der erhaltenen zweiten Impfflüssigkeit in einen 200-1-Fermentationstank aus rost- zo
freiem Stahl mit 1201 Medium der nachfolgenden Zusammensetzung II gebracht und 168 h lang unter
den gleichen Kulturbedingungen wie oben kultiviert.
Zusammensetzung 11 (Produktionsmedium)
Glukose 5,0%
Pepton 0,2%
Getrocknete Bierhefe 0,3%
Kaliumdihydrogenphosphat 0,3%
Magnesiumsulfat 0,1 % \o
Polyoxyäthylengruppen enthaltendes grenzflächenaktives
Mittel 0,01%
Calciumcarbonate 1.6%
·) Getrennt sterilisiert und zum Medium bei Beginn der Kulti- ^
vierung zugesetzt.
Nach Beendigung der Kultivierung wurde die erhaltene Kulturflüssigkeit filtriert, wodurch 5,5 kg feuchtes
Mycel erhalten wurden. Dieses wurde in einen Behälter überführt und mit 9 1 Aceton versetzt. Nach
Durchrühren wurde die Lösung abfiltriert und das Mycel weiter mit 31 Aceton gewaschen und die
Waschflüssigkeit sowie das Filtrat vereinigt und eingeengt. Die erhaltene eingeengte Flüssigkeit wurde
mit 5 1 Äthylacetat gemischt, gerührt und extrahiert.
Die Lösungsmittelschicht wurde abgetrennt und unter vermindertem Druck auf 350 ml eingeengt und
stehengelassen, wobei sich Kristalle von Coriolin B abschieden. Die Kristalle wurden abfiltriert und mit
einer kleinen Menge Benzol gewaschen.
b) Erfindungsgemäß wurden nun die Waschflüssigkeit und das Filtrat vereinigt und weiter auf 150 ml
eingeengt, wobei ein 5-Dihydrocoriolin C-Niederschlag
abgeschieden wurde. Dieser wurde abfiltriert, mit Benzol gewaschen und getrocknet, wodurch 8,59 g
rohe Kristalle erhalten wurden.
Die rohen Kristalle wurden aus einer wäßrigen 80%igen Methanollösung umkristallisiert, wodurch
5,19 g reines 5-Dihydrocoriolin C (F.: 183°C) erhalten
wurden.
Beispiel 2
a) Ausgangsmaterial
a) Ausgangsmaterial
Je 10 ml der in gleicher Weise wie im Beispiel 1 erhaltenen zweiten Impfflüssigkeit wurden in 150
Schüttelflaschen mit einem Fassungsvermögen von 500 ml mit 125 ml des Mediums gemäß Zusammensetzung
II gegeben und 7 Tage lang bei 27° C auf einer hin- und hergehenden Schüttelmaschine mit
130 Hin- und Herbewegungen pro Minute kultiviert. 15,5 1 der erhaltenen Kulturflüssigkeit wurden filtriert,
wodurch 550 g feuchtes Mycel erhalten wurden.
Dieses feuchte Mycel wurde mit 2 1 Aceton gemischt, gerührt, extrahiert, filtriert und mit 1 1 Aceton
gewaschen. Die Waschflüssigkeit und das Filtrat wurden vereinigt und unter vermindertem Druck
eingeengt. 600 ml der eingeengten Flüssigkeit wurden mit 1,21 Äthylacetat gemischt und extrahiert. Die
erhaltene Lösungsmittelschicht wurde abgetrennt, unter vermindertem Druck auf etwa 50 ml eingeengt
und stehengelassen, wodurch Kristalle von Coriolin B ausgeschieden wurden. Die Kristalle wurden abfiltriert
und mit Benzol gewaschen.
b) Erfindungsgemäß wurden nun das Filtrat und die Waschflüssigkeit vereinigt und unter vermindertem
Druck zur Trockne eingeengt, wodurch 5,6 g eines das gewünschte 5-Dihydrocoriolin C enthaltenden
öligen Materials erhalten wurden.
Dieses ölige Material wurde in einer geringen Menge Chloroform gelöst und über eine mit 250 ml
Silikagel (suspendiert in Chloroform) gepackte Säule gegeben. Danach wurde eine 1% Methanol-Chloroform-Lösungsmittelmischung
in einer etwa der Säule gleichen Volumenmenge durch die Säule geschickt, wodurch 5-Kctocoriolin B als erstes eluiert wurde.
Anschließend wurde durch weiteres Durchleiten der Lösungsmittelmischung in einer etwa dem Zweifachen
des Säulenvolumens entsprechende Menge durch die Säule das gewünschte 5-Dihydrocoriolin C eluiert.
Die 5-Dihydrocoriolin C-Fraktion wurde gesammelt, unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt
und aus einer wäßrigen 80%igen Methanollösung umkristallisiert, wodurch 2.34 g reines 5-Dihydrocoriolin
C (F.: 183 C) erhalten wurden.
Die Weiterverarbeitung des 5-Dihydrocoriolins C geht aus folgenden Beispielen hervor.
3 g 5-Dihydrocoriolin C wurden in 30 ml Pyridin
gelöst und mit einer Suspension eines Chromsäure-Pyridin-Komplexes in Pyridin, der durch Zugabe
von 2.5 g Chromsäure zu 40 ml Pyridin erhalten worden war, unter Rühren gemischt und 6 Tage lang bei
3 bis 5° C zur Reaktion gebracht.
Nach der Reaktion wurden 350 ml Äthylacetat hinzugegeben und die abgeschiedenen Verunreinigungen
abfiltriert. Das Filtrat wurde schrittweise mit insgesamt 500 ml Wasser gewaschen, die obere
Schicht abgetrennt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wodurch 2,53 g Rohprodukt
erhalten wurden.
Das Rohprodukt wurde in 10 ml Äthanol gelöst und in einer mit 100 ml eines Dextranderivates, das
zur Gelfiltration in organischen Lösungsmitteln verwendet wird (»Sephadex LH 20«), gefüllten Säule
chromatographiert. Die Säule wurde mit insgesamt 85 ml Äthanol eluiert. Die letzten 25 ml der eluierten
Flüssigkeit wurden gesammelt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Der eingeengte
Rückstand wurde in 5 ml Chloroform gelöst und in einer mit 50 ml Silikagel gefüllten Säule chromatographiert.
Die Säule wurde mit 100 ml einer 1% M ethanol - Chloroform - Lösungsmittelmischung eluiert,
wodurch eine eluierte Fraktion von 2'-Dehydrocoriolin C erhalten wurde.
709 623/203
Die Säule wurde dann mit 100 ml einer 2% Methanol-Chloroform-Lösungsmittelmischung
eluiert, wodurch eine eluierte Coriolin C-Fraktion erhalten
wurde.
Beide Fraktionen wurden getrennt unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wodurch 267 g
pulverförmiges 2'-Dehydrocoriolin C (Schmelzpunkt: 51 bis .55°C) und 851 mg rohe Kristalle von Coriolin C
erhalten wurden.
Die rohen Kristalle von Coriolin C wurden aus η-Hexan umkristallisiert, wodurch 722 mg Coriolin C
(F.: 73 bis 75"C) erhalten wurden.
Das im vorliegenden Beispiel erhaltene Coriolin C ist eine bekannte Substanz der bereits genannten
Strukturformel
OH
-0-CO-CH-(CH1I5-CH3
OH
Das 2'-Dehydrocoriolin C ist dagegen eine neue Verbindung mit folgenden Eigenschaften: Farbloses
Pulver; F.: 51—55°C; [«]? - 19,0" (c = 1%. Chloroform);
löslich in Methanol, Äthanol, Äthylacetat. Aceton, Chloroform, Benzol und Tetrachlorkohlenstoff,
jedoch wenig oder nicht löslich in Wasser, η-Hexan und Petroläther. Die Elementaranalyse von
2'-Dehydrocoriolin C ergibt 65,69% C und 7,67% H, woraus sich unter Berücksichtigung des massenspektrometrisch
ermittelten Molekulargewichts eine Summenformel von C23H32O7 ergibt. Als Ergebnis
der Analyse des NMR-Spektrums wurde gefunden, daß das 2'-Dehydrocoriolin C die bereits genannte
Strukturformel
OH
J 1—r>—cn—r—
besitzt.
O—CO—C—(CH2Ij-CH3
O
1 g 5-Dihydrocoriolin C wurde in 100 ml wasserfreiem
Benzol gelöst und mit 8 g Mangandioxid unter Rühren gemischt und bei Zimmertemperatur 32 h
lang zur Reaktion gebracht. Die Reaktionsmischung wurde filtriert und der Niederschlag mit wasserfreiem
Benzol gewaschen. Das Filtrat und die Waschflüssigkeit wurden vereinigt und unter vermindertem Druck
zur Trockne eingeengt, wodurch 610 mg festes Malerial erhalten wurden.
Dieses feste Material wurde in 3 ml Äthanol gelöst und in einer mit 25 ml »Sephadex LH 20« gefüllten
Säule Chromatographien. Die Säule wurde mit insgesamt 25 ml Äthanol eluiert. Die letzten 9 ml der
ίο eluierten flüssigen Fraktionen wurden gesammelt
und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt.
Der eingeengte Rückstand wurde in 1,2 ml Chloroform gelöst und in einer mit 15 ml Silikagel gefüllten
Säule Chromatographien. Die Säule wurde mit 30 ml einer 1% Methanol - Chloroform - Lösungsmittelmischung
eluiert, wodurch eine eluierte Fraktion von 2'-Dehydrocoriolin C erhalten wurde. Danach
wurde durch Elution der Säulen mit 30 ml einer 2% Methanol-Chloroform-Lösungsmittelmischung
eine eluierte Fraktion von Coriolin C erhalten. Beide Fraktionen wurden unter vermindertem Druck zur
Trockne eingeengt, wodurch 62 mg pulverförmiges 2'-Dehydrocoriolin C (F.: 51— 55°C) und 180mg
rohe Kristalle von Coriolin C erhalten wurden.
Die letzteren wurden aus η-Hexan umkristallisiert, wodurch 132 mg Coriolin-C-Kristalle mit einem
Schmelzpunkt von 73—75' C erhalten wurden.
200 mg 5-Dihydrocoriolin C wurden in einer Lösungsmittelmischung von 1,2 ml wasserfreiem Dimethylsulfoxid,
0,7 ml Benzol, 0,077 ml Pyridin und 0,038 ml Trifluoressigsäure gelöst und mit 300 mg
Dicyclohexylcarbodiimid unter Rühren gemischt. Die Lösung wurde 1 h bei Raumtemperatur stehengelassen
und dann weiter 15 h bei 3—4°C zur Reaktion
gebracht.
Nach Beendigung der Reaktion wurden 12 ml Äther und 130 mg Oxalsäure (als 10%ige Lösung in
Methanol) hinzugegeben und nach 30 Minuten 12 ml Wasser zugesetzt. Die erhaltenen Niederschläge wurden
abfiltriert und mit Äther gewaschen.
Die ätherische Schicht wurde vom Filtrat abgetrennt und mit einer 5%igen wäßrigen Natriumbicarbonatlösung
und dann mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat
wurde durch Chromatographie an Silikagel in gleicher Weise wie beim Beispiel A getrennt, wodurch
42 mg Coriolin C-Kristalle (F.: 73—75°C) und
13 mg pulverförmiges 2'-Dehydrocoriolin C (F.: 51 — 55 C) erhalten wurden.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen
Claims (1)
- Patentansprüche:I. 5-Dihydrocoriolin C der Formel
OHHOγν-* -0-CO-CH-(CH2)S-CH,
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10350971 | 1971-12-20 | ||
| JP46103509A JPS515478B2 (de) | 1971-12-20 | 1971-12-20 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE2261832A1 DE2261832A1 (de) | 1973-06-28 |
| DE2261832B2 DE2261832B2 (de) | 1976-10-21 |
| DE2261832C3 true DE2261832C3 (de) | 1977-06-08 |
Family
ID=
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