DE2224640A1

DE2224640A1 - Verbessertes Fermentationsverfahren

Info

Publication number: DE2224640A1
Application number: DE19722224640
Authority: DE
Inventors: Jerome Morganville; Inamine Edward Rahway; N.J. Birnbaum (V.St.A.). P
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1971-05-20
Filing date: 1972-05-19
Publication date: 1972-12-07
Also published as: ZA723446B; DD96975A5; CH584285A5; HU165579B; DK130845B; FR2143671B1; SE385020B; GB1361764A; DE2224640B2; ES402904A1; CA986862A; JPS5249071B1; FI49838B; AU458631B2; NO135186C; AU4233972A; NL7204619A; FI49838C; DK130845C; DE2224640C3

Description

Verbessertes Fermentationsverfahren

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Fermentationsverfahren zur Erzeugung des Antibioticums 7-(D-5~Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein verbessertes Verfahren zur Herstellung dieses Antibioticums durch¹ Fermentation von Nährmedien mit geeigneten Stämmen des' Mikroorganismus Streptomyces lactamdurans.

Die Streptomyces lactamdurans-Kultur ist ein neuer Actinomycetenstamm, und eine Probe dieses Mikroorganismus ist unter der Bezeichnung MA-2908 in der KuItürSammlung von Merck & Co., Inc., Rahway, New Jersey, USA, niedergelegt worden. Eine Probe dieser Kultur ist auch für die Dauer in der KuItürSammlung der "Northern Utilization Research and Development Branch of the U.S. Department of Agruculture" in Peoria, Illinois, USA, niedergelegt worden. Diese Kultur hat die Bezeichnung NRRL 3802 erhalten.

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7-(D-S-Amino-S-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure (nachstehend als das "Antibioticum" bezeichnet) entsteht bei der aeroben Fermentation geeigneter wässriger Bfährmedien unter gesteuerten Bedingungen.' Hierfür eignen sich wässrige Medien wie diejenigen, die auch zur Herstellung anderer Antibiotica verwendet werden. Solche Nährmedien enthalten durch Mikroorganismen assimilierbare Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff sowie anorganische Salze. Ausserdem enthalten die Permentationsmedien Spurenmetalle, die für das Wachstum des Mikroorganismus notwendig sind und gewöhnlich als Verunreinigungen in den übrigen Bestandteilen des Nährmediums enthalten sind. Im allgemeinen kann man Kohlehydrate, wie Zucker, z.B. Saccharose, Maltose, fructose, Lactose und dergleichen, und Stärken, wie Korn, z.B. Hafer und Roggen, Maisstärke, Maismehl und dergleichen, für sich allein oder in Kombination als Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff in dem Nährmedium verwenden. Die genaue Menge der Kohlehydrate in dem Nährmedium richtet sich zum Teil nach den anderen Bestandteilen des Nährmediums. Es wurde jedoch gefunden, dass Kohlehydratmengen zwischen etwa 1 und 6 Gewichtsprozent des Nährmediums genügen. Man kann eine einzige Kohlenstoffquelle verwenden, aber auch mehrere Kohlenstoffquellen in dem Nährinedium kombinieren.

Zufriedenstellende Quellen für Stickstoff sind die zahlreichen Eiweissstoffe, wie die verschiedenen Formen von Caseinhydrolysaten, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, lösliche Schlempebestandteile, Hefeprodukte, Tomatenbrei und dergleichen. Die verschiedenen Stickstoffquellen können ebenfalls für sich allein oder in Kombination miteinander verwendet werden und werden dem wässrigen Medium gewöhnlich in Mengen von 0,2 bis 6 Gewichtsprozent zugesetzt.

Als "komplexe organische Medien" werden hier Nährmedien bezeichnet, in denen einige der Bestandteile nicht chemisch definiert sind. Ein Beispiel für solche Nährmedien besteht aus

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"Grescent"-Hafer, Sojabohnenmehl, Natriumeitrat, Polyglykol und löslichen Schlempebestandteilen.

Die Fermentation wird bei Temperaturen von 20 bis 37 G durchgeführt; zur Erzielung der besten Ergebnisse führt man die Fermentation jedoch vorzugsweise bei Temperaturen von etwa bis 5-2° C durch. Der pH-Wert des Nährmediums für das Wachstum der Kultur von Streptomyces lactamdurans und zur Erzeugung des Antibioticums soll im Bereich von etwa 6,0 bis 8,0 liegen.

7- (D-5-Amino-5~carboxyvaleramido )-3- (carbamoyloxyme thyl )-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure hat die planare Strukturformel

0 NH, 0 " ^0CH-

HOG -GH-CHp-CHp-CHp-G-I

¹ " ■ 0

3H₂OOlSH₂ ι

COOH

Diese Verbindung (I) entsteht bei der oben beschriebenen aeroben Fermentation eines Stammes von Streptomyces lactamdurans, der imstande ist, diese Verbindung zu erzeugen, z.B. durch Fermentation des bei der "northern Utilization Research and Development Branch" unter der Nummer NERL 3802 permanent deponierten Stammes. Man kann auch andere Stämme dieser Gattung, wie z.B. Mutanten, verwenden, die mit Hilfe von Mutationsmitteln erhalten oder aus der Natur.isoliert worden sind. Das Antibioticum (I) ist eirie amphotere Verbindung mit einem scheinbaren isoelektrischen Punkt bei einem pH von etwa 3,5 und ist in Lösung bei pH-Werten von etwa 1,5 bis 9*0 beständig.

Das Antibioticum und seine Salze sind nicht nur gegen Penicillinase, sondern auch gegen die Cephalosporinasen beständig und zeigen eine erhöhte Wirksamkeit gegen gram-negative Mikroorga-

- 3 209850/1208 ^GSNAt INSPECTED

nismen. Zum Unterschied von Cephalosporin C, das eine verhältnismässig geringe antibakteriell Wirksamkeit hat, weisen das Antibioticum gemäss der Erfindung und seine Salze eine beträchtliche Wirkung in vivo gegen gram-negative Mikroorganismen mit einer Stärke auf, die im allgemeinen höher ist als diejenige des Cephalothins. Zu dieser Aktivität gehört Wirksamkeit in vivo gegen Proteus morganii und ausserdem Wirksamkeit gegen die folgenden gram-negativen Bakterien: Escherichia coli, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Salmonella schottmuelleri, Klebsiella pneumoniae AD, Klebsiella pneumoniae B und Paracolobactrum arizoniae.

Die biologische Analyse auf dieses Antibioticum wird nach der Scheiben-Plattenmethode unter Verwendung von 9,5 cm-Filterpapierscheiben durchgeführt. Die Testplatten werden mit 10 ml Difco-Nähragar je Platte + 2,Og Difco-Hefeextrakt je liter vorbereitet. Eine Übernacht hergestellte Kultur des Testorganismus Yibrio percolans MB-1272 wird mit steriler Kochsalzlösung zu einer Suspension verdünnt, die bei einer Wellenlänge von 660 ΐημ eine Lichtdurchlässigkeit von 40 $ aufweist. Diese Suspension wird in einer Konzentration von 20 ml/l dem Nährmedium zugesetzt, bevor dieses auf die Platten gegossen wird. Der Organismus Yibrio percolans ist in der "Culture Collection of the American Type Culture Collection" deponiert, wo er unter der Bezeichnung "Yibrio percolans MB-1272, ATTC 8461" zur Verfugung steht.

Die Testplatten werden bis zur Verwendung, aber nicht langer als 5 Tage, bei 4 C aufbewahrt. Nach dem Auflegen der mit dem Antibioticum gesättigten Prüfscheiben werden die Platten 8'bis 24 Stunden bei 28 C inkubiert. Dann werden die Hemmungszonen in mm Durchmesser festgestellt. An diesen Werten werden die relativen Stärken oder, wenn, man sie mit einer gereinigten Bezugsnorm vergleicht, die Stärke in γ/ml bestimmt.

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In Anbetracht der Schwierigkeit der Abtrennung der reinen 7-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)--7-methoxy-3-cephem-4—carbonsäure von den grossen Mengen an Verunreinigungen in der Fermentationsflüssigkeit ist es von . grosser Bedeutung, dass ein Weg gefunden wird, um die Konzentration dieses Antibiqticums im Verhältnis zur Gesamtmenge der Peststoffe in der Fermentationsflüssigkeit zu erhöhen.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine Methode zur Erhöhung der Ausbeute an dem Antibioticum bei einem Fermentationsverfahren zur Verfügung zu stellen, bei der unaufwendige, leicht erhältliche chemische Zusätze verwendet werden.

Es wurde gefunden; dass- die Produktion von 7-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure durch Zusatz von Glycin, L-Phenylalanin, einem Carbaminsäureester der allgemeinen Formel II oder einem Amid der allgemeinen Formel III zu komplexen organischen und chemisch definierten Fermentationsmedien erhöht wird. Der Carbaminsäureester bzw. das Amid haben die allgemeinen Formeln

⁰T? ^x P

II . III

worin R einen Alkylrest, z*B. einen niederen Alkylrest, wie den Äthyl-, n-Propyl- oder n-Butylrest und dergleichen, bedeutet, R₁ und R₂ gleich oder verschieden sein können und Wasserstoffatome, AlkyIreste, z.B. niedere Alkylreste, wie den Methyl-, Äthyl-, n-Propyl- oder n-Butylrest und dergleichen, oder niedere Hydroxyalkylreste, z.B. den 2-Hydroxyäthyl- oder 3-Hydroxypropylrest und dergleichen, bedeuten können, R* ein Wasserstoffatom, einen Alkylrest, wie den-Methyl-, Äthyl-, n-Propyl-, η-Butyl-, n-Pentyl- oder Undecyl rest und dergleichen, einen oxo-substituierten niederen Al-

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2098EO/1208 OR.G.NAL !MSPECTED

kylrest, wie den 2-Oxopropylrest und dergleichen, oder einen Arylrest, z.B. einen einkernigen Arylrest, wie den Phenylrest, und R. und R₁-, die ebenfalls gleich oder verschieden sein können, Wasserstoffatome, Alkylreste, z.B. niedere Alkylreste, wie den Methyl-, Äthyl-, n-Propyl-, n-Butyl-, Isobutyl- oder n-Pentylrest und dergleichen, oder niedere Hydroxyalkylreste, wie den 2-Hydroxyäthyl- oder 3~Hydroxypropylrest und dergleichen, bedeuten können, während X Sauerstoff oder Schwefel bedeutet.

Die zur Förderung der Erzeugung des Antibioticums erforderliche Menge an Glycin, L-Phenylalanin, Carbaminsäureester (II) oder Amid (III) richtet sich nach dem jeweiligen Medium. Im allgemeinen wird eine erhöhte Erzeugung des Antibioticums in Nährmedien beobachtet, die 0,01 bis 0,10 # (alle hier für diese Zusätze angegebenen Prozentwerte beziehen sich auf Gewichtsteile je 100 Raumteile Nährmedium) Glycin und 0,05 bis 0,3 $ L-Phenylalanin enthalten. Bevorzugt werden Konzentrationen von 0,05 $ Glycin und 0,3 $> L-Phenylalanin. Die Carbaminsäureester (II) und die Amide (III) werden in Mengen von etwa 0,0156 bis 2,0 fo zugesetzt, und besonders gute Ausbeuten erhält man mit N-2-Hydroxyäthylcarbaminsäurealkylestern, beispielsweise mit 0,2 bis 0,8 tfo N-2-Hydroxyäthylcarbarainsäureäthylester.

Ferner wurde gefunden, dass der Zusatz eines Amides der nachstehend angegebenen allgemeinen Formel zu dem Fermentationsmedium einen bedeutenden Anstieg in der Ausbeute des Antibioticums zur Folge hat:

⁰ T?
ti y"-n

R.
6 _p

In dieser allgemeinen Formel bedeuten Rg ein Wasserstoffatom oder einen niederen Alkylrest, wie den Methyl- oder Äthylrest, und R₇ und Rq Wasserstoffatome oder niedere Alkylreste, insbesondere Isobutylreste. Besonders bevorzugt wird Έ,N-Di-

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H 054 * "222Λ640

isobutylpropionsäureamid; der Zusatz dieser Verbindung zum Nährmedium in Konzentrationen von 0,063 Ms 0,125 Gewichtsteilen je 100 Raumteile Nährmedium ergibt besonders gute Ausbeuten. Glycinkonzentrationen von mehr als 0,3 $, L-Phenylalaninkonzentrationen von mehr als 0,5 Ü> und Carbaminsaureesterkonzentrationen von mehr als 0,8 ^ vermindern die Erzeugung des Antibioticums.

Glycin, L-Phenylalanin, der Carbaminsäureester der allgemeinen Formel II und/oder das Amid der allgemeinen Formel III brauchen nicht für sich allein angewandt zu werden, sondern können miteinander kombiniert werden, um einen Zusatz zu erhalten, der eine besonders gute Ausbeute an dem Antibioticum ergibt. So eignet sich z."B. die Kombination von 0,05 f° Glycin, 0,3 f° L-Phenylalanin und einer gewissen Menge Carbaminsäureester (II) und/oder Amid (III) im Bereich einer Endkonzentration von 0,0156 bis 2,0 fo besonders zur Erhöhung der Ausbeute an dem Antibioticum. Torzugsweise ist der Carbaminsäureester in dieser Kombination K-2-Hydroxyäthylcarbaminsäureäthylester, seine Konzentration im Nährmedium beträgt 0,2 bis 0,8 $, und das Amid ist ΪΓ,ΙΤ-Diisobutylpropionsäureamid, und dessen Konzentration im Nährmediura beträgt 0,063 bis 0,125 #.

Die obige Beschreibung bezieht sich in erster Linie auf Fermentationen unter Yerwendung des Mutterstammes Streptomyces laetamdurans. Man kann jedoch auch andere Stämme dieses Organismus, wie Mutanten, verwenden, um das Antibioticum zu erzeugen. Die Carbaminsäure- oder Amidzusätze (II) bzw. (III) können auch zur Erhöhung der Ausbeute an dem Antibioticum verwendet werden, wenn sie den Fermentationsansätzen züge-, setzt werden. Im Bahmen der Erfindung liegen dem Fachmann ohne weiteres geläufige Abänderungen in den günstigsten Zusatzkonzentrationen, dem Zeitpunkt des Zusatzes bei der Fermentation usw., unabhängig davon, welcher Stamm von Streptomyces laetamdurans zur Erzeugung der 7-(D-5-Amino-5-carboxy-

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_mPBcrBD

valeramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem--4-car- , "bonsäure {I) verwendet wird.

Obwohl das Antibioticum (I) gemäss der Erfindung in Oberflächenkultur oder in Submerskultur erzeugt werden kann, führt man die Fermentation zur Zeit vorzugsweise in Submerskultur durch. Fermentationen in kleinem Massstabe werden zweckmässig durchgeführt, indem man geeignete Mengen des Nährmediums in Kolben einbringt, die Kolben und ihren Inhalt durch Erhitzen auf 120 C sterilisiert, die Kolben entweder mit Sporen oder mit einer vegetativen Zellenkultur eines 7-(D-5-Amino-5~ carboxyvaleramido )-3-( earbamoyloxymethyl )~7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure erzeugenden Stammes von Streptomyces beimpft, die Hälse der Kolben locker mit Watte verschliesst und die Fermentation 3 bis. 5 Tage bei einer konstanten Raumtemperatur von etwa 28 C in der Schüttelmaschine durchführt. Für Arbeiten in grösserem Massstab führt man die Fermentation vorzugsweise in grossen Behältern mit Rührwerk und Belüftungseinrichtung für das Fermentationsmedium durch. Bei dieser Methode wird das Währmedium im Behälter angemacht und durch Erhitzen auf 120° C sterilisiert. Nach dem Kühlen wird das sterilisierte Medium mit einer vegetativen Zellenkultur des Stfeptomyces beimpft und die Fermentation 2 bis 4 Tage unter Rühren und/oder Belüftung des Nährmediums und Innehaltung einer Tem- ' peratur von etwa 28° G durchgeführt. Diese Methode zur Erzeugung von 7-(D-5-Amino~5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4~carbonsäure eignet sich besonders für die Herstellung des neuen Antibiotikums in grossen Mengen.

Die Fermentation unter Verwendung des 7-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido) -3- (carbamoyloxyine tliyl}- 7-methoxy-3~cephem-4~ carbonsäure erzeugenden Mikroorganismus kann bei Temperature» von etwa 20·bis 37° C durchgeführt werden. Zur Erzielung der besten Ergebnisse ist es jedoch am zweokmässigsten, die Fermentationen bei Temperaturen zwischen 26 und 30° C durchzu-

- 8 2 0 9 8 5 0/1208 ORIGINAL INSPECTED

führen. Der pH-Wert des zum Züchten des Streptomyces und zur Erzeugung des Antibiotikums geeigneten Nährmediums kann im Bereich von etwa 5 "bis 9 variieren. Vorzugsweise arbeitet man jedoch bei pH-Werten von etwa 6,0 bis.7>5.

Zur Durchführung der Erfindung stellt man eine Zellensuspension her, indem man steriles Medium zu einer Agar-Schrägröhrchenkultur eines 7~(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure erzeugenden Mikroorganismus zusetzt. Das Erzeugnis der Schrägröhrchenkultur wird dann zum Beimpfen eines Saatkolbens verwendet, und der Saatkolben wird 1 bis 3 Tage bei 28° C geschüttelt, um ein gutes Wachstum zu erzielen. Dann wird der Saatkolben zur Beimpfung der Produktionskolben verwendet. Man kann den Saatkolben auch mit einer gefriergetrockneten Kultur oder einem eingefrorenen Impfgut beimpfen.

Die Beimpfung wird im allgemeinen mit T ml je 40 ml Produktionsmedium durchgeführt. Dann werden die Zusätze in den gewünschten Konzentrationen in die Produktionskolben eingegeben, und die Fermentation wird 2 bis 4 Tage unter Rühren und/oder Belüftung des Nährmediums und Innehaltung der Temperatur von etwa 28° 0 durchgeführt. Alle Produktionskolben, d.h. diejenigen Kolben, die die Zusätze enthalten, und diejenigen Kolben,.die für die Leerversuche verwendet werden, werden dann, im allgemeinen nach 96 Stunden, analysiert, um die Menge an Antibioticum zu bestimmen, die sich in. jedem Kolben gebildet hat.

Das Antibioticum 7-(D-5-Aminp-5-carboxyvalerami'do)-3-(carbamoyloxymethyl)~7-methoxy-3-eephem-4-carbonsäure wird zweckmässig nach der Scheiben-Plattenmethode unter Verwendung.von Vibrio percolans MB-1272 (ATCG 8461) als TestOrganismus analysiert. Ma*n verwende t ,Scheiben von 9,5 cm Durchmesser. Aus bekannben Konzentrationen des Anbibiotxcums wird eine. Standardkurvc erstellt, imd die Aktivität wird in γ je ml

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20 98 50/ ΓΌ0 ORDINAL

H 054 Λ> , 222464ft:

freier Säure ausgedrückt.

Dann werden die Produktionskolben analysiert, indem man die Probe mit 0,02-molarer Phosphatpufferlösung (pH 7) auf eine geeignete Konzentration verdünnt. Der Testorganismus ist Vibrio percölans MB-1272 (ATCC 8461), und als Analysenmedium verwendet man Difco-Nahragar + 0,2 $ Difeo-Hefeextrakt. Die Scheiben werden in eine genormte Lösung des Antibiotikums getaucht, die 5 γ Antibioticum je ml enthält, und abwechselnd mit der Probe auf die Platte gelegt. Die Platten werden 18 Stunden bei 37° G inkubiert, worauf man die Zonendurchmesser in Millimeter bestimmt. Es werden fünf EFormplatten verwendet, die vier Konzentrationen des genormten Antibioticums von 2,5 bis 20 γ/ml enthalten. Die Analyse wird mit Hilfe eines Nomogramms berechnet, und die Ergebnisse werden in γ/ml angegeben.

Das Antibioticum lässt sich aus dem Fermentationsmedium nach verschiedenen Verfahren gewinnen. Man kann die filtrierte . Fermentationsflüssigkeit durch eine oder mehrere Ionenaustauschersäulen hindurchleiten. Da das Antibioticum (I) eine amphotere Verbindung ist, kann man sowohl mit Kationen- als . auch mit Anionenaustauschharzen arbeiten, um die beste Gewinnung zu erzielen. Das adsorbierte Antibioticum wird dann, vorzugsweise mit einem flüchtigen Lösungsmittel, wie Pyridin, das sich leicht entfernen lässt, eluiert.

Das Antibioticum 7-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure (I) und seine Salze hemmen das Wachstum von verschiedenen gram-negativen und gram-positiven Mikroorganismen.

- IO -? 0 9 B ', f) / 1 > η B

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Beispiel 1 ·

Herstellung des Antiobioticums; durch Zusatz von Glycin abgeändertes ITermentationsverfahren:

Stufe A; Schrägröhrchen

Ein gefriergetrocknetes Glas mit einer Kultur von Streptomyees lactamdurans (MA-2908) wird aseptisch geöffnet und der Mikroorganismus auf ein Medium der folgenden Zusammensetzung übertragen:

Medium I;

1 $ Melasse (Blackstrap)
1 fo Brauereihefe
2,5 ^ Difco-Agar, pH 7,0
mit Wasser aufgefüllt.

Die Sehrägröhrchen werden 7 Tage bei 28° G inkubiert. Wenn sie in der Kälte aufbewahrt werden, halten sie sich langer als Wochen.

Stufe B: Saatstufen: Zweistufiges System

Erste Aussaat: Die erste Aussaat wird direkt aus dem Sehrägröhrchen der Stufe A auf 40 ml 1-prozentiger primärer Tr okkenhefe N. F. (der Yeast Product Corporation) bei einem pH-Wert von 7,0 in einem 250 ml-Erlenmeyerkolben mit Umlenkorganen aufgeimpft. Dann werden die Kolben 2 bis 3 Tage bei 28° C in einer rotierenden Schüttelmaschine mit 220 U/min bei einem Hub von 5 cm geschüttelt.

Zweite Aussaat: Ein 2,5-prozentiges Impfgut von der ersten Aussaat wird in einen Kolben eingegeben, der. 2 $ Hefeautolysat (Fleischraann S-150) bei einem pH-Wert von 7,0 enthält. In dieser Stufe ist die Kultur charakteristisch hell, und die Inkubation, die so wie in der ersten Stufe bei 28° C durchgeführt wird, wird nicht über 48 Stunden hinaus ausgedehnt.

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H054 /J, 222^40

Stufe C: Grundproduktionsmedium

Das Grundproduktionsmedium hat die folgende Zusammensetzung: Medium II:

. '— JL

lösliche Schlempebestandteile 3,0 primäre Trockenhefe 0,75

Schaumverhütungsmittel

("Mobil par-S") 0,25

Dieses Medium wird mit etwas konzentrierter Natronlauge auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt, auf Erlenmeyerkolben verteilt und 15 Ms 20 Minuten bei 121° C im Autoklav behandelt. Nach dem Kühlen wird das Medium mit einem 2,5-prozentigen Impfgut der in Stufe B durchgeführten zweiten Aussaat beimpft.. Die Inkubation erfolgt drei Tage bei 28° C mit 220 U/min in einer Schüttelmaschine bei einem Hub von 5 cm.

Wenn die Fermentation beendet ist, werden die Zellen abzentrifugiert, und die Fermentationsflüssigkeit wird mit Phosphatpufferlösung (pH 7,0) verdünnt. Die Konzentration der 7-('D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxvmethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure in der Fermentationsflüssigkeit wird nach der biologischen Scheibenanalysenmethode bestimmt. Als Testorganismus verwendet man Vibrio percolans (ATCO 8461). Filterpapierscheiben werden in verdünnte Fermentationsflüssigkeiten getaucht und auf agarhaltige Petrischalen aufgelegt, die mit dem Testorganismus Yibrio percolans (ATCG 8461) beimpft worden sind. Ferner werden auf diese Petrischalen Scheiben aufgelegt, die zuvor in genormte Lösungen mit bekannten Konzentrationen von 842A getaucht worden . sind. Die Scheiben werden Übernacht bei 28 C inkubiert und die Durchmesser der Hemmungszonen verzeichnet. Die Konzentration an 842A in der Fermentationsflüssigkeit wird durch Interpolieren aus' der Standardkurve berechnet, die die Beziehung zwischen dem Hemmungszonendurchmesser und bekannten Konzentrationen der 842A-Normlösungen angibt. Nach diesem Verfahren

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OBIGINAL INSPECTED

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14 054

2 2 2 4 B A 0

wird berechnet, dass Streptomyces laotamdurans MB-2908 in dem Grundproduktionsmedium im Mittel 80,4 γ/ml 7-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure erzeugt.

Stufe D: Zusatz von Glycin

Der Zusatz von Glycin zu dem Medium II· in Stufe 0 erhöht die Ausbeute an 7-(D-5-Amino-5~carboxyvaleramido)-3-(carbamoyl~
oxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure beträchtlich. Das Ausmaß dieser Produktionssteigerung für verschiedene Konzentrationen ergibt sich aus Tabelle I. Die Werte dieser Tabelle stammen aus drei Versuchsreihen, in denen der'Leerversuch jeweils in der für die Stufen A bis 0 beschriebenen Weise durchgeführt wird, während die übrigen Versuche in der gleichen
Weise, aber mit Zusatz der angegebenen Menge an Glycin, durchgeführt werden. -Die Analysen werden ebenso, wie in Stufe C
durchgeführt. -

	T a	belle I	Zunahme gegen über Leerver such, io
Versuch	Glycinzusatz zu Medium II,	Antibioticum- erzeugung, γ/ml
leerversuch		77	10
1	0,01	84	26
2	0,10	97
Leerversuch	■ - ____	76	41
1	0,05	106	22
2	0,10	93	__
Leerversuch		88	28
1	0,075	113	28
2	0,100	113	11
3	0,125	98.

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ORiGiWAL INSPECTED

14 054

jtf

2 2 2 A': A ο

Hieraus ergibt sich, dass ein Zusatz von 0,05 $ Glycin zu dem Produktionsmedium die Ausbeute an 7-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(carbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure am wirksamsten erhöht.

Beispiel 2 Herstellung des Antibioticums; Zusatz von Ii-Pheny!alanin

Man arbeitet nach Beispiel 1, jedoch unter Verwendung von verschiedenen Konzentrationen an L-Phenylalanin anstelle des Glycins in Stufe D. In der folgenden Tabelle sind die Konzentrationen, in denen das L-Phenylalanin zugesetzt wird, und die darauf zurückzuführenden Ausbeutesteigerungen an Antibioticum (I) angegeben.

	T a b e	lie II	8 1 34
Versuch	L-Phenyi- alaninzusatz zu Medium II, 1°		18
leerversuch 1 2 3	0,05 0,1 0,3	Antibioticum- Zunahme gegen- erzeugung, über Leerver- γ/ml such, rfo	L-Phenylalanin
Leerversuch 1 B e i s ρ i	0,1 e 1 3	76 82 77 90
Herstellung und G-Iyc in	des Antibioticums;	85 100
Zusatz von

Man arbeitet nach Beispiel 1, jedoch unter Zusatz von L-Phenylalanin zu dem Grund produktionsmedium, welches bereits 0,05 °l° Glycin enthält. Dieses Medium, das nachstehend als Medium III bezeichnet wird, hat die folgende Zusammensetzung:

14 -

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14 054

Medium III:

Lösliche Sclileinpestandteile primäre Trockenhefe Ή.Ι.

S chaumve rhütungs mi 11 e1 (»Mobil par-S»)

Glycin

3,0 0,7-5

0,25 0,05

In der folgenden Tabelle sind die Konzentrationen, in denen das L-Phenylalanin zugesetzt wird, und die darauf zurückzuführenden Ausbeuteerhöhungen an Antibioticum (I) angegeben.

- Tabelle III

Versuch	L-Phenyl-r alaninzusatz zu Medium III, $	Antibioticum- erzeugung, γ/ml	Zunahme gegen über Leerver such, °/o
Leerversuch ■ 1	0,1	101 ^: 124	23
Leerversuch 1;	0,3	103 118	15
Leerversuch 1 B e i s ρ i	0,3 el 4	110 121	10
Herstellung des Antibioticums äthylester und Glycin	; Zusatz von Carbaminsäure-

Man arbeitet nach Beispiel 3_} jedoch mit Carbaminsäureäthylester anstelle des L-Phenylalanins. Als Produktionsmedium verwendet man das Medium III des Beispiels 3, welches 0,05 f» Glycin enthält. In der folgenden Tabelle sind die Konzentrationen an Oarbaminsäureäthylester und die darauf zurückzuführenden Ausbeutesteigerungen an Antibioticum (I) angegeben.

- 15 -209850/1208

14 054	T a b e	lie IT	222^40
	Carbaminsäure- äthylesterzusatz zu Medium III, ίο	Antibioticum- erzeugung*, γ/ml
Versuch	___	109	Zunahme gegen über Leerver such, $>
Leerversuch	0,01	101	——
1	0,1	112
2	0,5	141	2,8
3	·—— «	86	30
Leerversuch	0,3	126
1	0,4	124	47
2	• 0,5	118	.45
3	0,6	115	39
4	0,7	98	35
5	0,8	92	15
6		113	8
Leerversuch	0,1	126
1	. 0>2	146	11
2	0,3	157	29
3	0,4	169	38
4	0,5	165	49
5	0,6	168	45
6		4:8

* Jeder Ausbeutewert ist der Mittelwert aus acht Einzelanalysen. :

Aus den obigen Zahlen ergibt sich, dass ein Zusatz von 0,4 Carbaminsäureäthylester zu dem Medium III die Ausbeute an Antibioticum (I) am wirksamsten erhöht.

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Η 054 " ' J) 222Λ640

Beispiel 5 ·'

Herstellung des Antibioticums; Zusatz von Amiden

Man arbeitet nach den Stufen A bis C des Beispiels 1, jedoch mit einer Inkubationszeit in der Stufe C von vier Tagen bei 28° C und mit einem G-rundproduktionsmedium der folgenden Zu-

sammensetzung:	JL 3,0
Medium IV:	■ 1,0
Lösliche Schlempebestandteile	0,05
primäre Trockenhefe	0,3
Glycin . ■
L-nPhe nyl al anin	0,25
S chaumν e rhütung s m it t e1	0,1
. ("Mobil par-S")	2,0
Natriumthiosulfat
Maisstärke

Wenn man die in Tabelle V angegebenen Amide zu dem Medium IY zusetzt und,im übrigen nach dem Verfahren, der Stufe O des Beispiels 1 arbeitet, erzielt man eine Ausbeuteerhöhung an Antibioticum (I). Die ^Amide, ihre Konzentrationen und die auf ihren Zusatz zurückzuführenden Ausbeuteerhöhungen ergeben sich aus Tabelle V. ■

Tabelle V

Antibioticumerzeugung, γ/ml,

_ ,. mit Zusatz/leerversuch Endkonzen- ^L

Zusatz	tration, γ>	1	2
Formamid	0,25 0,50		332/256 . 354/256
N-Me thylformamid	1,0 2,0	285/254 312/254	y

- 17 -

2 Ü 9 8 5 (J / 1 2 0 8

14 054	¹ Tabelle V	2 2 2 Α Γ ^- 0	(Fortsetzung)	2
		Antibioticumerzeugung, γ/ml,
		mit Zusatz/Leerversuch	301/256
	tration, fo	1.
Zusatz	0,25	287/238	328/256
Ν,Ν-Dimethyl-	0,40	346/273	387/256
formamid	0,50	297/238	•
	0,80	381/273
	1,0	388/273
	0,25	309/254
Ν,Ν-Diäthyl-	0,5	351/254
formamid	1,0	391/254	310/256
	0,125	260/254	338/256
N,N-Dibutyl-	0,25	285/254	372/256
formamid	0,25		293/256
N-2-Hydroxyäthyl-	0,50		313/256
forraamid	1,0		369/256
	0,0312
N,N-Dimethyl-	0,0625
benzamid	0,125
	0,5	360/254
Ν,Ν-Dimethyl-	1,0	354/254
acetamid	2,0	449/254	■
	0,25	276/238
N,N-Diäthyl-	0,5	379/238
acetamid	1,0	■ 335/238	296/256
	0,16	340/238	330/256
N,N-Dipropyl-	0,31	390/238	322/256
acetamid	0,063
Ν,Ν-Dimethylthlo-	0,125	288/254
acetamid	0,25	145/254
	0,5	293/154
N,N-Dimethyl-	1,0	286/154
acetoace taraid	2,0	380/254

ORiGlMAL INSPECTED

14 054

. 2 2 2 A R 4 0

.Tabelle V (Fortsetzung)

Antibioticumerzeugung, γ/ml,

Zusatz

Endkonzentration, fa

mit Zusatz/Leerversuch 1

ΙΤ,ΪΤ-Dimethyl- propionamid	0,5 1,0 2,0	363/254 369/254 282/254	418/256 528/256 350/256
N,N-3)ibutyl- propionamid	0,0156 0,0312 0,0625		497/256 530/256
N,N-Diisobutyl- propionaroid	0,063 0,125
N,N-Dimethyl- butyramid	0,125 0,25 0,5	322/254 303/254 318/254
Ν,Ν-Dimethyl- valeramid	0,063 0,125 0,25	308/254 325/254 355/254	291/256
N,N-Diraethyl- dodecanamid	0,0156

Beispiel 6 Herstellung des Antibioticums; Zusatz von Carbaminsäureestern

Man arbeitet nach Beispiel 5, jedoch mit verschiedenen Carbaminsäureestern anstelle der dort angegebenen Amide. In der
folgenden Tabelle sind die Carbaminsäureester, ihre' Konzentrationen und die auf ihren Zusatz zurückzuführenden Ausbeutesteigerungen an Antibioticum (I) angegeben.

- 19 209 8 50/1208

ORiQiMAL

14 054

.Tabelle TI

Zusatz

Antibioticumerzeugung, γ/ml, Endkonzen- mit Zusatz/Leerversuch

tration, $ 1 2

Carbaminsäure- äthylester	0,2 0,4	353/254 347/254	398/273 395/273
Carbaminsäure- n-propylester	0,1 - 0,2	360/254 348/254	386/273 417/273
öarbaminsäure- n-butylester	0,1		345/273-
N-Me thy1c arbam in- säureäthylester	0,2. 0,4	321/254 333/254	360/273- 323/273
N-Äthylcarbamin- säureäthylester	0,1 0,2	343/254	317/273 391/273
N-Propylcarbamin- säureäthylester	0,1 0,2	361/254 363/254.	389/273 - 409/273·
N-2-Hydroxyäthyl- carbaminsäure- äthylester	0,2 0,4 0,8	331/254 353/254 34 9/254	345/273 442/273· 428/273
N,N-Dimetliyl- carbaminsäure- äthylester	.0,2 0,4		292/273 339/273

- 20 -

.... 20985 0/12

INSPECTED

Claims

Merck ft Co., Inc. . 1Ä ΠΑΓ 1972

14 054

Pat entans prüche

[Λ¹. Verfahren zur Herstellung von 7-(D-5-Amino-5-carboxyvaler-.*■ amido )-3-( car"bamoyloxymethyl)-7-niethoxy-3-cephem-4-carTDonsäure durch Züchten eines neuen Actinomyceten in einem Iiährmedium, dadurch gekennzeichnet, dass man zu dem Fer-r mentationsmedium Glycin, L-Phenylalanin, einen Carbaminsäureester, ein Amid oder Gemische dieser Stoffe zusetzt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Actinomyceten Streptomyces lactamdurans verwendet.
3·. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man ein wässriges Nährmedium mit einem pH-Wert im Bereich von etwa 6,0 "bis 8,0 verwendet, das etwa 1 bis 6-Gewichtsprozent Kohlehydrat und etwa 0,2 bis 6 Gewichtsprozent nutzbaren Stickstoff enthält.
4., Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Carbaminsäureester eine Verbindung der allgemeinen !Formel

ROCN^ '

in der R einen Alkylrest bedeutet und R. und R₂ gleich oder verschieden sein können und Wasserstoffatome, Alkyl- oder ,niedere Hydroxyalkylres te- bedeuten, und als Amid eine Verbindung der allgemeinen Formel

- 2 I 2 0 9 P> F) f) / J 2 Γ) Π ORlGJMAL INSPECTED

H 054 «g, 2 2 2 Λ Γ 4 Π

■ ·'■ ^χ τ?

^ ⁴

verwendet, in der IU ein Wasserstoffatom, einen Alkylrest, einen oxo-substituierten niederen Alkylrest oder einen Arylrest bedeutet, während R. und R,- gleich oder verschieden sein können und Wasserstoff atome, Alkylreste oder niedere Hydroxyalkylreste bedeuten.
5. Verfahren nach Anspruch 4> dadurch gekennzeichnet, dass · man als Amid Formamid oder ein Ν,Η-Di-nied.alkylformaDiid verwendet.
6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als Amid Ν,Ν-Diisobutylpropionsäureamid in Konzentrationen von etwa 0,063 "bis 0,125 Gewichtsteilen je 100 Raumteile Fermentationsmedium verwendet.
7· Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als Carbaminsäureester einen N-2-Hydroxyäthiocarbaminsäureester in Konzentrationen von etwa 0,2 bis 0,8 Gewichtsteilen je 100 Raumteile Fermentationsmedium verwendet.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Glycin in Konzentrationen von etwa 0,01 bis 0,10 Gewichtsteilen je 100 Raumteile Fermentationsmedium verwendet.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man L-Phenylalanin in Konzentrationen von etwa 0,05 bis 0,3- Gewichtsteilen je 100 Raumteile Fermentationsmediuin verwendet.
10. Verfahren nach Anspruch 4» dadurch gekennzeichnet, dass man den Carbaminsäureester oder das AmLd in IConzentra-

- 22 -

2 0 9 f! Γ) i) / I ;> i.i f.:

ORIGINAL INSPECTED

H 054 $3 222ABAO

tionen von etwa 0,0156 Ms 2,0 Gewicht steilen 3^e 100 Raumteile lermentationsmedium verwendet.
11. Verfahren zur Herstellung· von 7-(D-5-Amino-5-carboxyvaleramido)-3-(oarbamoyloxymethyl)-7-methoxy-3-cephem-4--earbonsäure durch Züchten von'Streptomyees lactamdurans in einem Nährmedium, dadurch gekennzeichnet,, dass man dem Fermentationsmediuia zur Verbesserung der Ausbeute an Antibioticum 0,05 Gewichtsteile Glycin, 0,3 Gewichtsteile !-Phenylalanin, 0,2 "bis 0,8 Gewichtsteile Ιί-2-Hydroxyäthylcarba- . minsäureäthylester oder 0,063 Ms 0,125 Gewichtsteile Ν,ϊϊ-Diisobutylpropionsäureamid, "bezogen auf je 100 Raumteile Fermentationsmedium, zusetzt.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass man einen N-2-Hydroxyäthylcarbaminsäureester oder N,N-DiisQbutylpropionsäureamid in Kombination mit Glycin und !-Phenylalanin als Zusatz verwendet.
13. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als Amid Ν,ΙΤ-Dimethylformamid verwendet.

• I

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