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Verfahren zur Herstellung von 12 a-Hydroxylverbindungen der Tetracyclinreihe
Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von 12 a-Hydroxylverbindungen
der Tetracyclinreihe.
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Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Hydroxylgruppe in die
12a-Stellung eines 12 a-Desoxytetracyclins eingeführt, indem man diese Verbindung
der Einwirkung eines Stamms oder mehrerer solcher Stämme von Mikroorganismen der
Klasse Fungi Imperfecti unterwirft.
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12 a-Desoxy tetracycline sind neue Verbindungen der Tetracyclinreihe.
12 a-Desoxytetracyclin beispielsweise wird durch chemische Reduktion von Tetracyclin
mit metallischem Zink in einer wäßrigen Lösung von Ammoniak hergestellt. Das wäßrige
Ammoniak wird vorzugsweise als 10- bis 20°/oige Lösung verwendet. Die Verwendung
von wäßrigem Ammoniak als Lösungsmittel hat sich als notwendig erwiesen, da andere
Lösungsmittel, z. B. ein schwach saures Medium, entweder die Reduktion von Tetracyclin
zu dem 12a-Desoxytetracyclin nicht fördert oder aber zur Bildung weiterer unerwünschter
Reduktionsprodukte Anlaß gibt. Die Umsetzung kann bei Temperaturen zwischen etwa
10 und 50°C durchgeführt werden, wird aber vorzugsweise bei etwa Zimmertemperatur,
z. B. zwischen etwa 20 und 25°C, durchgeführt. Die Reaktionszeit ist nicht besonders
kritisch und liegt im allgemeinen zwischen 1 und 4 Stunden. Eine Konzentration von
etwa 4°/0 (Gewicht/Volumen) des Tetracyclinantibiotikums in dem wäßrigen Ammoniak
reicht für die Reaktion aus. Das für die Umsetzung verwendete Zink liegt vorzugsweise
in feinverteilter Form z. B. als Zinkstaub vor und wird in einem Verhältnis von
wenigstens 2 Gewichtsteilen je Gewichtsteil des Tetracyclinantibiotikums eingesetzt.
Mengenverhältnisse von mehr als etwa 4 Gewichtsteilen Metall sind im allgemeinen
nicht erforderlich.
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In gleicher Weise erhält man 6-Desmethyl-12a-desoxytetracyclin durch
chemische Reduktion von 6-Desmethyltetracyclin; 7-Chlor-6-desmethyl-12a-desoxytetracyclin
durch chemische Reduktion von 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin; 6,12a-Didesoxytetracyclin
durch Reduktion von 6-Desoxytetracyclin und 6-Desmethyl-6,12a-didesoxytetracyclin
durch Reduktion von 6-Desmethyl-6-desoxy-tetracyclin.
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Die 12a-Desoxytetracycline sind wertvolle Zwischenprodukte für die
Herstellung von 12 a-Desoxyanhydrotetracyclinen. 12a-Desoxyanhydrotetracyclin kann
z. B. durch Behandlung von 12 a-Desoxytetracyclin mit einem Dehydratisierungsmittel,
z. B. einer beliebigen starken Mineralsäure oder einer organischen Säure, wie Eisessig,
bei einer Temperatur zwischen etwa 0 und 100°C hergestellt werden. Das erhaltene
12 a-Desoxyanhydrotetracyclin ist biologisch aktiv und weist eine Wirksamkeit gegen
eine Anzahl grampositiver und gramnegativer Mikroorganismen, insbesondere gegenüber
manchen tetracyclinresistenten Stämmen von Bakterien auf.
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Zu den Species der Klasse Fungi Imperfecti, die sich als für die Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet erwiesen haben, gehören unter anderen
Myrothecium roridum, Hormodendrum hordei, Hormodendrum pallidum, Curvularia lunata
(NRRL 2380), Curvularia lunata (QM 34B), Curvularia pallescens (NRRL 2381) und Botrytis
cinerea (ATCC 12481) (j. C. Gilman, »A Manual of Soil Fungi, 2. Auflage, 1957, S.
300, 330, 338 und 398, Iowa State College Press, Ames Iowa).
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Diese Mikroorganismen sind handelsüblich. Man kann. sie aber auch
aus natürlichen Quellen gewinnen, wobei die dem Mikrobiologen geläufigen Arbeitsweisen
angewendet werden.
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Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das zu
oxydierende 12a-Desoxytetracyclin der Einwirkung eines oder mehrerer Stämme von
Fungi Imperfecti unterworfen. Dies wird zweckmäßigerweise dadurch erreicht, daß
der Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen in einem geeigneten Nährmedium in
inniger Berührung mit dem zu oxydierenden 12a-Desoxytetracyclin gezüchtet und die
Züchtung so lange geführt wird, bis die gewünschte Hydroxylierung der 12a-Stellung
eingetreten ist. Das Verfahren kann aber auch in der Weise durchgeführt werden,
daß man zunächst den Mikroorganismus in einem geeigneten Nährmedium unter
aeroben
Bedingungen züchtet, dann die Zellen abtrennt und schließlich das mit dem 12 a-Desoxytetracyclin
versetzte zeltfreie Filtrat eine zur Erzielung des gewünschten Hydroxylierunggrades
ausreichende Zeit belüftet.
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Das 12a-Desoxytetracyclin kann dem Nährmedium als Suspension in einem
geeigneten Lösungsmittel, wie Wasser, oder als Lösung in einem organischen Lösungsmittel,
wie Aceton, Propylenglykol oder Dimethylformamid, zugesetzt werden. Im allgemeinen
ist es zweckmäßig, wenn das 12a-Desoxytetracyclin in feinverteilter Form vorliegt,
um einen möglichst guten Kontakt mit dem oxydierend wirkenden Kulturmedium zu erreichen
und einen vollständigen Ablauf der Reaktion zu gewährleisten.
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Die Fermentationsbedingungen sind im allgemeinen die gleichen wie
diejenigen, die bei den bekannten Verfahren der fermentativen Herstellung von Tetracyclin
angewendet werden. Das Fermentationsmedium enthält die üblichen Nähr- und Mineralstoffe.
Zu geeigneten Nährstoffen, welche die notwendigen Substanzen liefern, gehören unter
anderem Stärke, Dextrose, Rohrzucker, Glukose, Melasse, Sojabohnenmehl, Erdnußmehl,
Hefe, Fleischextrakte, Pepton, Ammoniumsulfat, Harnstoff, Maisquellwasser und Fischmehl.
Als anorganische Salze sind beispielsweise verwendbar: Calciumcarbonat, Ammoniumsulfat,
Ammoniumchlorid, Natriumdihydrogenphosphat und die verschiedenen Spurenelemente,
wie Mangan, Kobalt, Zink, Kupfer und Eisen.
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Die anderen Fermentationsbedingungen, wie Wasserstoffionenkonzentration,
Temperatur, Zeit, Belüftungsgeschwindigkeit, Herstellung der erforderlichen Impfmenge,
Sterilisation und Beimpfung, sind die üblicherweise angewendeten und können ähnlich
denjenigen ausgewählt werden, die für die Herstellung von Tetracyclin in der USA.-Patentschrift
2 734 018 beschrieben sind.
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Im folgenden werden Beispiele für geeignete wäßrige Nährmedien angegeben,
die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Hydroxylierung von 12 a-Desoxytetracyclinen
verwendet werden können.
| Medium Nr. 1 |
| Maisquellwasser ..................... 20 g/1 |
| Rohrzucker ......................... 30 g/1 |
| CaCO3 ............................. 7 g/1 |
| (NH,)2S04 ......................... 2 g/1 |
| Medium Nr.2 |
| Maismehl ........................... 20 g/1 |
| Casein-Hydrolysat ................... 10 g/1 |
| Cerelose (Maiszucker) ................. 10 g/1 |
| Hefeextrakt ........................ 2 g/1 |
| K2 H P 04 ........................... 1 g/1 |
| Ca C 03 ............................. 5 g/1 |
Leitungswasser wird bis zu einem Gesamtvolumen von 1 1 zugesetzt, der pH-Wert auf
6,5 bis 7,0 eingestellt und die Lösung im Autoklav behandelt.
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Wie oben erwähnt, eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren vor allem
für die Oxydation von 12a-Desoxytetracyclin, die Erfindung soll jedoch nicht auf
die Hydroxylierung dieses speziellen 12a-Desoxytetracyclins beschränkt werden. Vielmehr
können auch die anderen 12a-Desoxytetracycline, nämlich die aus 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin,
6-Desoxytetracyclin, 6-Desmethyltetracyclin und 6-Desmethyl-6-desoxytetracyclin
erhaltenen in der gleichen Weise in 12a-Stellung oxydiert werden. Die beschriebene
Hydroxylierung wurde ferner mit Erfolg auf 12a-Desoxydesdimethylaminotetracyclin
angewendet, wobei Desdimethylaminotetracyclin gebildet wurde. Das als Ausgangsstoff
verwendete 12 a-Desoxydesdimethylaminotetracyclin kann durch Behandlung von Tetracyclin
mit metallischem Zink in einem schwach sauren Medium, z. B. Eisessig, in wenigstens
72 Stunden hergestellt werden. Dabei wird die Hydroxylgruppe in 12a-Stellung und
die Dimethylaminogruppe in 4-Stellung des Tetracyclingerüsts entfernt. Die gebildete
Verbindung kann als 12 a-Desoxydesdimethylaminotetracyclin bezeichnet werden. Diese
Reaktion ist für Chlortetracyclin als Ausgangsstoff und 12a-Desoxydesdimethylaminochlortetracyclin
als Endprodukt in Journ. Amer. Chem. Soc., Bd. 76, 1954, S. 3575, beschrieben.
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Das 12 a-Desoxytetracyclin kann erfindungsgemäß nach folgender Arbeitsweise
oxydiert werden: Ein steriles Kulturmedium, z. B. das oben angegebene Medium Nr.
1, wird zunächst beimpft, indem man eine kleine Menge der Sporensuspension oder
des vegetativen Wachstums eines Stamms von Fungi Imperfecti, z. B. von Curvularia
lunata, einführt. Das beimpfte Nährmedium wird dann 48 Stunden auf einer Schüttelvorrichtung
mit Hin- und Herbewegung bei 28°C bebrütet. Ein aliquoter Anteil wird dann entnommen
und in einen das Medium Nr. 2 enthaltenden Fermentationskolben eingebracht. Der
beimpfte Fermentationskolben wird auf einer Rundschüttelvorrichtung wenigstens 20
Stunden bebrütet, ehe man das 12 a-Desoxytetracyclin zugibt, das in Form einer wäßrigen
Suspensionslösung mit einem Gehalt von 10 bis 20 mg/ml eingesetzt wird. Das Bewegen
und die Belüftung des Nährmediums wird etwa 2 bis 72 Stunden oder so lange fortgesetzt,
bis die Oxydation vollständig ist. Die Oxydation kann sowohl in der Fermentationsflüssigkeit
in der beschriebenen Weise als auch durch Zugabe des 12a-Desoxytetracyclins zu der
durch Filtrieren derselben erhaltenen zeltfreien Flüssigkeit durchgeführt werden,
wobei die Bebrütung eine gewisse Zeit weitergeführt wird, bis die Oxydation vollständig
ist.
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Nach dem Ende der Oxydation kann das Tetracyclin aus der Fermentationsflüssigkeit
oder aus der zeltfreien Flüssigkeit auf beliebige Weise gewonnen werden. Zur Gewinnung
von Tatracyclin aus Fermentationsflüssigkeiten geeignete Verfahren wurden in größerer
Anzahl bereits beschrieben und können zur Gewinnung des nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren erhaltenen Tetracyclins angewandt werden.
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Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Für die Herstellung
der Ausgangsverbindungen wird Schutz im Rahmen der vorliegenden Erfindung nicht
beansprucht. Beispiel 1 Etwa 50 ml eines Kulturmediums mit der als Medium Nr. 1
beschriebenen Zusammensetzung werden20 Minuten bei 150°C in einem 500-ml-Kolben
sterilisiert. Das Medium wird dann mit etwa 2 ml einer wäßrigen Suspension von Curvulaxia
Lunata (NRRL 2380 [vegetatives Wachstum]) beimpft. Das Gemisch wird 48 Stunden auf
einer Schüttelvorrichtung mit Hin- und Herbewegung bei 28°C bebrütet. Danach wird
ein 40/, ausmachender aliquoter Anteil entnommen und in einen 500-ml-Kolben eingebracht,
der 50 ml eines Mediums mit der als Medium Nr. 2 beschriebenen Zusammensetzung enthält.
Der beimpfte Fermentationskolben wird 24 Stunden auf einer Rundschüttelvorrichtung
bebrütet. Danach werden 2 ml einer 0,25°/oigen Lösung von 12a-Desoxytetracyclin
in den Fermentationskolben gegeben. Nach 1stündiger Fermentation ergibt die Prüfung
der Fermentationsflüssigkeit einen Gehalt von 31,9 y/ml Tetracyclin, wohingegen
die Prüfung einer Probe vor Beginn einen Gehalt von 2,5 y/ml ergab.
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Ausbeute 46 °/o. Das Tetracyclin konnte praktisch quantitativ als
kristallines Material isoliert werden.
Beispiel 2 Es wird, wie im
Beispiel 1 beschrieben, gearbeitet, nur daß eine durch 48stündige Vergärung erhaltene
Fermentationsfiüssigkeit filtriert wird. 6 ml der zellfreien Flüssigkeit werden
zusammen mit 3,8 ml eines mit einem pH-Wert von 3,8 hergestellten Natriumcitrat-Phosphat-Puffers
und 0,2 ml einer 2,5°/oigen Lösung von 12a-Desoxytetracyclin in einen 250-ml-Kolben
gegeben. Der Kolben wird auf einer Schüttelvorrichtung mit Hin- und Herbewegung
bei 28°C 2 Stunden bebrütet. Die antibakterielle Wirksamkeit steigt von einem Anfangswert
von 12 y/ml auf 186 y/ml.
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Beispiel 3 Die im Beispiell beschriebene Arbeitsweise wird wiederholt,
nur daß das Medium mit einer Kultur. von Myrothecium roridum beimpft wird. Nach
24stündiger Fermentation wird 1 ml einer 0,25°/oigen Lösung von 12a-Desoxytetracyclin
in den Fermentationskolben eingeführt. Der Kolben wird 72 Stunden bei 28°C auf einer
Rundschüttelvorrichtung bebrütet. Danach beträgt die als Tetracyclin gemessene antibakterielle
Aktivität 34,1 y/ml. Die ursprüngliche antibakterielle Aktivität beträgt 2,6 -y/ml.
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Beispiel 4 Die im vorhergehenden Beispiel beschriebene Arbeitsweise
wird wiederholt, nur daß eine Kultur von Hormodendrum hordei verwendet wird. Die
Du(chführung der Fermentation und die Zugabe des 12a-Desoxytetracyclins erfolgen
wie im Beispie13 angegeben. Nach 72stündiger Fermentation liegt die antibakterielle
Aktivität gemessen als Tetracyclin bei 17,3 y/ml.
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Beispiel 5 Die im vorhergehenden Beispiel beschriebene Arbeitsweise
wird wiederholt, mit der Ausnahme, daß eine Kultur von Hormodendrum pallidum verwendet
wird. Die Durchführung der Fermentation und die Zugabe des 12 a-Desoxytetracyclins
erfolgen wie im Beispiel 3 beschrieben. Nach 72stündiger Fermentation beträgt die
antibakterielle Aktivität, bestimmt als Tetracyclin, 23,0 y/ml. Beispiel 6 Die im
Beispie12 beschriebene Arbeitsweise wird wiederholt, nur daß eine Kultur von Curvularia
pallescens (NRRL 2381) verwendet wird. 12a-Desoxytetracyclin wird wie im Beispie12
beschrieben zu der zellfreien Flüssigkeit gegeben. Nach 2stündiger Bebrütung beträgt
die antibakterielle Wirksamkeit, bestimmt als Tetracyclin, 93,8 -y/ml.
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Beispiel 7 Die im vorhergehenden Beispiel beschriebene Arbeitsweise
wird wiederholt, mit der Ausnahme, daß eine Kultur von Botrytis cinerea (ATCC 12481)
verwendet wird. Das 12a-Desoxytetracyclin wird, wie im Beispiel 2 angegeben, der
zellfreien Flüssigkeit zugesetzt. Nach 2stündiger Bebrütung beträgt die antibakterielle
Aktivität, bestimmt als Tetracyclin, 185 y/ml.
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Beispiel 8 5 ml einer Lösung von 12a-Desoxydesdimethylaminotetracyclin
in Methanol mit einer Konzentration von 1 mg/ml, die durch 72stündige Behandlung
von Tetracyclin mit metallischem Zink in Eisessig hergestellt worden war, werden
zu 2 ml eines auf einen pH-Wert von 3,8 eingestellten Natriumcitrat-Phosphat-Puffers
und 3,0 ml eines Gärmaischefiltrats gegeben, das durch Fermentation einer Kultur
von Curvularia lunata (NRRL 2380) hergestellt worden war. Der Kolben wird 2 Stunden
bei 28°C auf einer Schüttelvorrichtung mit Hin- und Herbewegung geschüttelt. Die
Hydroxylierung ,des Ausgangsmaterials in 12a-Stellung ergibt sich durch eine Abnahme
der Absorption bei 465 m#t in m/10-Natriumboratlösung zu erkennen, die für die 12
a-Desoxydesdimethylaminoverbindung charakteristisch ist und durch die Zunahme der
antibakteriellen Aktivität, wie sie durch die turbidimetrische Prüfung mit Hilfe
von Micrococcus pyogenes bestimmt wird.
| Zeit |
| Optische Dichte bei 465 mA y/ml als Desdimethyl- |
| Minuten in m/10 Natriumboratlösung |
| arninotetracyclin |
| 0 0,442 50,3 |
| 30 0,291 121,0 |
| 120 0,152 149,0 |
Außerdem zeigt auch die Papierchromatographie die erfolgte Hydroxylierung in 12a-Stellung
an.
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Beispiel 9 Eine wäßrige Suspension von Curvularia lunata (NRRL 2380)
von einem Kartoffeldextrose-Schrägagar wird in vier sterile 500-ml-Kolben überimpft,
die jeweils 50 ml eines Mediums mit der als Medium Nr. 1 beschriebenen Zusammensetzung
enthalten. Die Kolben werden dann 48 Stunden auf einer Schüttelvorrichtung mit Hin-
und Herbewegung bei 28°C bebrütet. Danach wird eine 40/, ausmachende Menge zur Beimpfung
zu einer Reihe von Kolben gegeben, die jeweils 50 ml eines Mediums mit der als Medium
Nr.2 beschriebenen Zusammensetzung enthalten. Diese beimpften Fermentationskolben
werden 44 Stunden bei 28°C auf einer Rundschüttelvorrichtung bebrütet. Danach wird
das Mycel von der Gärmaische durch Filtrieren durch Seitz-Filterkissen abgetrennt,
1044m1 einer derartigen zellfreien Flüssigkeit werden mit 66 ml einer Suspension
von 850 mg 12a-Desoxytetracyclin versetzt. Läßt man das Reaktionsgemisch etwa 24
Stunden bei Zimmertemperatur stehen, dann steigt die antibakterielle Aktivität (als
Tetracychn) auf etwa das 10fache. Die Reaktionsgeschwindigkeit kann durch Belüftung
des Reaktionsgemischs, z. B. mittels Durchleiten von Luft oder durch Rühren des
das Reaktionsgemisch enthaltenden Kolbens auf einer Schüttelvorrichtung mit Hin-
und Herbewegung gesteigert werden. Das Reaktionsgemisch wird dann auf einen pH-Wert
von 8,5 bis 8,6 eingestellt und mehrmals mit Butanol extrahiert. Die vereinigten
Butanolextrakte werden auf ein geringes Volumen eingeengt, und das rohe Tetracyclin
wird durch Zugabe von 10 Volumina Petrol äther gefällt. Das Tetracyclin wird von
dem Hauptteil der Verunreinigungen durch Verteilungschromatographie und anschließende
Kristallisation befreit. Das erhaltene kristalline Tetracyclin wird durch Infrarot-
und Ultraviolettbestimmungen, Papierchromatographie und auf Grund der mikrobiologischen
Aktivität identifiziert.