DE2239321A1 - Herstellung von cephalosporin c - Google Patents
Herstellung von cephalosporin cInfo
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Description
Alfa Farmaceutici S.p.A.
Via Ragazzi
•99 n. 5 -7. August 1972
40133 Bologna, Italien . Fr/Me
Herstellung von Cephalosporin C
Die Erfindung betrifft die Herstellung von Cephalosporin C
mit Hilfe neuer Mikroorganismen mit Namen Cephalosporium Sp.
Stamm F 12. .
Cephalosporin C ist ein Wertvolles Antibiotikum, da es
gleichermaßen gegen grampositive und gramnegative Bakterien wirksam ist und sowohl säurestabil sowie resistent gegenüber
Penicillinase ist. Cephalosporin C ist ausführlich in der Literatur beschrieben, z. B. in der Arbeit "The
Cephalosporins" von E„P. Abraham, Pharmacologial Reviews,
Bd. 14, S..477 - 500. Cephalosporin C wird bislang in der
Praxis nicht als Antiviotikum zur Behandlung von durch grampositive oder gramnegative Bakterien hervorgerufene
Infektionen verwendet, da seine Wirksamkeit verhältnismäßig schwach ist. Seine Aktivität gegenüber einer Reihe von
grampositi und gramnegativen Bakterien beträgt z. B«, nur
Oj1 % der Aktivität des Benzylpenicillins. Indessen dient
Cephalosporin C als Ausgangsmaterial zur Herstellung einer großen Zahl sogenannter semisynthetischer Cephalosporine,
von denen einige eine größere Anwendung als antimikrobisch.es Mittel gegen mit breitem antibakteriellem Spektrum Anwendung
gefunden haben. Insofern ist Cephalosporin C selbst ein wichtiges Produkt..
309808/1388
Cephalosporin C wird aus Kulturen verschiedener Cephalosporin-Spezies
unter geeigneten Bedingungen gewonnen, wobei neben Cephalosporin C andere antibiotische Produkte, nämlich
Cephalosporin N und Cephalosporin P gebildet werden. Cephalosporin P ist die Bezeichnung für eine Familie
steroiclischer Verbindungen mit einer gewissen antibakteriellen Wirkung gegenüber grampositivem und gramnegativen
Bakterien^-Cephalosporin N (Penicillin N) ist eine Penicillin-Verbindung
mit einer^-Aminoadipylseitenkette.
Die physikalischen Eigenschaften von Cephalosporin C und Cephalosporin N sind außerordentlich ähnlich, so daß es
schwierig ist, Cephalosporin C durch Abtrennen des Cephalosporin N zu reinigen. Es ist daher außerordentlich erwünscht,
den Anteil an in der Kultur der Mikroorganismen sich bildenden Cephalosporin N zu reduzieren, z. B. durch Auswahl
der Nährstoffe im Nährmedium, so daß Cephalosporin C gegenüber anderen antibiotischen Produkten in größeren
absoluten Mengen gebildet wird.
Durch die für die Produktion von Cephalosporin C bekannten Mikroorganismen, z. B. den Original- Brotzu-Stamm, wird
Cephalosporin N jedoch in verhältnismäßig großen Mengen gebildet, und die anteilige Menge an dem gewünschten Endprodukt
Cephalosporin C bleibt oft verhältnismäßig niedrig. Es wird z. B. in dem US Patent 3>082,155 ein Verfahren beschrieben,
wonach die Mutation eines Cephalosporium Sp. Stammes ATCC 14553 zur Produktion von Cephalosporin C
dient. Jedoch wird selbst unter den günstigsten Fermenationsbedingungen
lediglich eine Cephalsoporin C -Ausbeute von nur 500 Mikrogramm/ml erzielt.
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■ _ 3 —
Demgemäß umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Cephalosporin C gekennzeichnet durch die
Züchtung der Mikroorganismen Cephalo'sporium Sp. Stamm F
unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium mit assimilierbaren 'Quellen für 'Kohlenstoff und Stickstoff, einem oder
mehreren anorganischen Salzen und mit einer organischen Quelle für Schwefel.
Cephalosporin Sp. Stamm F 12 ist eine Mutation von Cephalosporin
Sp. ATCC 11550 und ist von der American Typ Culture
.Collection unter der Qrdnungs-Nr. ATCC 20339 eingeordnet
•worden. Das Centralbureaü voor Schimmelcultures, Baarn, Niederlande, klassifiziert diesen Organismus unter der
Ordnungs-Nr. CBS 53571. "
Cephalosporin Sp. Stamm F 12 besitzt die folgenden charakteristischen
Eigenschaften: .
Bei Züchtung auf festem Nährboden, z. B. Sabouraud,
Hafer-Agar, Bennet, Kartpffel-Agar und Waksman-Medium
zeigt sich der Mikroorganismus mit flachen, leuchtenden und etwas rundlichen, durchgehende oder leicht unregelmäßige
Kanten besitzenden Kolonien mit farblosem oder " leicht gelblich gewachsenem Myzel. Die Farbe verbreitet
sich, falls vorhanden, im Nährboden aus. Kein aus der Luft stammendes Wachstum, keine Konidien oder Konidienträger
werden gebildet. Bei Züchtung in einigen Nährmedien, wie z. B. im Bennet-Nährmedium, zeigt das Myzel begrenzte oder
eingeschobene Chiamydοsporen. Die Oberfläche der Kolonien
zeigt vielstrahlige Runzeln, die verzweigt oder auch nicht
verzweigt sein können. Die Hyphen sina septiert, im allge-
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meinen verzweigt und zeigen manchmal kleine Fettropfen. Der Stamm benötigt keine Nitrate als Stickstoffquelle
im Züchtungsmedium.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird mit Vorteil unter submersen
aeroben Bedingungen, vorzugsweise bei einer Temperatur von 20 - 30° C ausgeführt.
Die assimilierbare Quelle für Kohlenstoff im Nährmedium der Mikroorganismen ist zweckmäßigerweise ein Kohlenwasserstoff,
der ein Monosaccharid, Disaccharid oder PoIysaccharid sein kann. Beispiele für geeignete Kohlenwasserstoffe
sind Glucose , Sucrose, Galactose, Lactose, Fructose, Mannit, Sorbit, Dextrin, lösliche und unlösliche Stärken
und Rübenmelassen. Die Kohlei Wasserstoffe der Nährmedien
kommen vorzugsweise in Form einer Mischung aus Monosacchariden, Disacchariden und Polysacchariden zur Anwendung; die Konzentration
der Kohlenwasserstoffe im Nährmedium soll zwischen 2 und 10 % betragen.
Das Nährmedium enthält vorzugsweise auch ein Glycerid oder ein hydrolysiertes Glycerid, wie z. B. Olivenöl, Erdnussöl,
Sonnenblumenöl, Kokosnussöl, Palmöl, Leinsamenöl sowie gesättigte und ungesättigte Fettsäuren und Ester oder Teilester
derselben aus einwertigen oder mehrwertigen niedrigen Alkoholen. Besonders geeignete Glyceride oder Hydrolysate
derselben sind Lardöl . (Schmalzöl), Sonnenblumenöl, Maisöl, Oleinsäure, Ricinolsäure, Linolsäure, Lineolsäure
und Arachidonsäure. Besonders geeignete Ester der ungesättigten Fett .säuren sind Methyllinolat, Glycerolmonooleat,
Polyäthylon-glykolmonooleat und/oder Polyäthylenglykoldioleat.
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Die Glyceride und Hydroyseprodukte derselben sollen vorzugsweise in Mengen von 1-8 Gew. % im Nährmedium enthalten
sein. Es wird angenommen, daß diese Produkte, insbesondere die Ester der ungesättigten Fettsäuren, die
Bildung von Nebenprodukten inhibieren und somit die Bildung von Cephalosporin C begünstigen.
Das für das erfindungsgemäße Verfahren geeignete Nährmedium enthält auch eine organische-Stickstoffquelle, der
in Mengen von 0,01 bis..0,1 Gew.% an verfügbarem Stickstoff,
bezogen auf das Gewicht d'es gesamten Mediums, anwesend sein soll. Die Quelle für organischen Stickstoff besteht im allgemeinen
aus einem pflanzlichen oder tierischen Protein oder einem Abbau- oder Hydrolyseprodukt derselben, wie z. B.
einem Polypeptid, Pepton, Trypton oder einer Aminosäure. Bevorzugte Quellen für organischen Stickstoff sind Baumwollsamenmehl,
Fischmehl, Maismehl, Getreidemehl, pflanzliche Mehle (z.B. Sojabohnenmehl, Zwergerbsenmehl oder Erdnussmehl),
Hefeextrakt, fleischextrakt sowie Nebenprodukte aus der alkoholischen Gärung und aus der Zersetzung von Mais.
Das Nährmedium gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren enthält schließlich ein für die verbesserte Biosynthese des Cephalosporin
C wirksames anorganisches Salz, wie z. B. Calciumcarbonat, Borax, Ammoniumacetat, Ammoniumsulfat und/oder
ein Alkalimetallphosphat. Derartige anorganische Salze sollen im Nährmedium, vorzugsweise in einer Menge von 0,5 1,5
Gew.% enthalten sein.
30 96 0 87 13B8
Wie eingangs erwähnt, enthält das Nährmedium eine Quelle
für organisch gebundenen Schwefel. Insbeonsere Methionin vorzugsweise in Mengen von 0,5 - 2,5 Gew.% des Mediums ist
geeignet. Andere für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignete schwefelhaltige Verbindungen sind
solche der nachfolgenden Formel
R1 - χ - CH(R2) - CO - Y - R5
12 3
worin R , R und R dieselbe oder eine verschiedene Bedeutung
besitzen und jedes dieser Radikale ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1-5 C-Atomen bedeutet,
und worin X und/oder Y ein Schwefelatom darstellen und ggf.
X oder Y ein Sauerstoffatom repräsentiert. Beispiele für derartige Verbindungen sind Thioglykolsäure, Thioessigsäure,
Methylthioglykolat und Methylthioacetat,_Derartige organische
Quellen für Schwefel sollen in dem Nährmedium vorzugsweise in Mengen von 0,05 bis 1*Gew.?<
> enthalten sein. Es erscheint bemerkenswert, daß die Züchtung von Cephalosporium Sp*
Stamm F 12 das Vorhandensein einer organischen Quelle für Schwefel unbedingt erfordert, während andere Cephalospörin-Spezies
in Gegenwart von anorganischen Quellen für Schwefel gezüchtet werden können. Einige Quellen für organischen
Schwefel, wie z. B. Thioglykolsäure sind sogar toxisch für andere Cephaloporin-Spezies, indessen nicht toxisch für
Cephalosporium Sp. Stamm F 12.
Das Verfahren gemäß der Erfindung wird im allgemeinen wie
folgt ausgeführt:
Zunächst■werden die Mikroorganismen auf Schrägnährboden
während einer Zeit von 10 - 15 Tagen bei einer Temperatur von etwa 28 - 30° C bebrütet. Die gewachsenen Myzele werden
sodann mit Wasser gewaschen und die so erhaltene Lösung als Inoloilum für ein Reifemedium verwendet. Das Reifemedium
wird unter Rühren bei einer Temperatur von etwa 25 - 30° C während 48 - 96 Stunden unter aerobischen Bedingungen gehalten.
Das sich daraus ergebende gereifte Medium dient der Impfung des endgültigen Kulturmediums und wird diesem vorzugsweise
in Mengen von. 5 Gew„$>
bezogen auf das Kulturmedium zugeführt. v - . , -
Die Kultur des beimpften" Kulturmediums wird entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren, vorzugsweise für eine
Zeit von 96-130 Stunden, auf einer Temperatur von.20 30°
Q vorzugsweise 22 -■ 28° C, gehalten. Die Ausbeute an Cephalosporin C wird entweder spektrofotometrisch (vgl.
Claridge, Vaughan, Kresse! und Gourevitch': "Antimicrobial
Agents and Chemotherapy",, 1969, S.· 131) oder mikrobiologisch bestimmt. ,
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch kontinuierlich
durchgeführt werden, indem,man sich für kontinuierliche
Arbeitsweise ausgestalteter Züchtungsapparate bedient, die mit Einrichtungen zur Zufuhr steriler Nährmedien.zu einem,
oder mehreren Züchtungsbehältern und mit Leitungen zur automatischen Entnahme der Zellsuspension ausgestattet sind.'
Von Zeit zu Zeit wird ein Teil der Fermentationsbrühe abgezogen und eine entsprechende VÖluraenmenge an frischem Nährrnedium
der Kultur zugesetzt. Zumeist geschieht dies nach
Giner Anlaufzeit von 75 - 110 Stunden. Frisches Nährmediura
3 0^8087^388
kann in das System mit Hilfe einer kontinuierlich arbeitenden Dosierpumpe eingeführt werden. Die Menge an ablaufender
Suspension wird so geregelt, daß ein konstantes Arbeitsvolumen und eine gleichbleibende Dichte an Organismen in
den Behälter aufrechterhalten wird. Die Durchflußmenge an kontinuierlich geführter Kultur soll im allgemeinen pro
Tag etwa 0,2 - 0,8, vorzugsweise 0,4 - 0,5 des Gesamtvolumens betragen.
Das erfindungsgemäß erzeugte Cephalosporin C kann aus der
Kulturbrühe gemäß der üblichen Technik isoliert und die sich ergebende rohe Fermentationsmischung in üblicher
Weise gereinigt werden, z. B. durch Filtration, Klärung mittels Kohle, Adsorption an einem Harz-Ionenaustauscher,
Elution mittels wässeriger Base, z. B. Pyridin und Verdampfung des Lösungsmittels zur Erzeugung kristallinen
Materials.
In den nachfolgenden Beispielen, die das erfindungsgemäße Verfahren noch besser erläutern sollen, sind alle Teile,
soweit nicht anders ausdrücklich erwähnt, als Gewichtsteile zu verstehen.
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Ein Nährmedium der nachfolgenden Zusammensetzung wurde in einem 27 Liter fassenden durchlüfteten Rührbehälter aus
rostfreiem Stahl eingefüllt:
Teile
-Erdnussmehl .... .. ... 60 . . . '■-...-
Stärke -' ' - 4O
Methyloleat 8
Lardöl 60
Sucrose 5
d-Glucose 7
CaCO3 10
Borax 0,5
dl-Methionin 15
Viasser „zu 1000 ·
Der pH-Wert des Mediums wurde auf einen Endwert von 7,2 -7,8
eingestellt. Das_ Medium wurde über 25 - 30 Minuten bei 120°C mit Dampf, sterilisiert.
Der Fermentationsbehälter wurde sodann mit 5 - 10 Vol.-Teilen
einer Züchtung von Cephalosporium Sp. Stamm 12 beimpft, erhalten durch Einimpfen von Sporen der Mikroorganismen in ein Medium
der nachfolgenden Zusammensetzung:
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Lardöl 0,1 %
Kornquellmasse flüssig 2,0 %
Ammoniumacetat 0,6 %
Sucrose 2,0%
und Bebrütung des geimpften Mediums in einer belüfteten flachen Flasche während 72 Stunden bei 24 - 28°C.
Der das Nährmedium enthaltende beimpfte Fermentationsbehälter wurde sodann 130 Stunden auf 22 - 28 C gehalten und in dieser
Zeit durch einen Luftstrom von 1 Liter/Liter/min unter Belüftung gehalten, wobei gleichzeitig mit 300 - 450 U/min gerührt
wurde. Die erhaltene Kultur enthielt 4500 - 5000 Mikrogramm /Milliliter an Cephalosporin C (Durchschnittswert).
Das Wachstum der Fläche eines Schrägbodens von 2,54 χ 2,54 cm
einer Kultur von Cephalosporium Sp. Stamm F 12 wurde in 5 ml sterilem Wasser suspendiert und für die Beimpfung von 500 ml
eines Reifemediums folgender Zusammensetzung benutzt.
Teile
Flüssige Kornquellmasse 25
Sucrose 20
Ammoniumacetat 4,5
Lardöl 0,5
Wasser zu 1000
09Hf)O/ I IBB
Das beimpfte Medium wurde bei 24 - 28 C auf einem rotierenden Schüttler bei 220 U/min während 72 Stunden bebrütet, wobei
verschiedene Schwefeiverbindungen in Beträgen von einem
Äquivalent Schwefel (0,01 Mol pro 1000 ml) anwesend waren.-60 ml von jedem der 4 nachfolgend aufgeführten Medien wurden
sodann mit dem erhaltenen vegetativen Medium beimpft und über 114 Stunden bei 22 - 28°C gehalten, wobei auf einem rotierenden
Schüttler mit 250 U/min durchmischt wurde. Dabei wurden die folgenden Ausbeuten an Cephalosporin C, ausgedrückt in Mikrogramm/ml
erhalten:
ί Medium -1 Medium 2 Medium 3 Medium 4
Erdnussmehl Stärke 'Methyioieat
Lardöl
Sucrose
Cerelose (brauner Zucker)
CaCO3 Borax
dl-Methionin
Methyl-Thioglykolat Thioessigsäure Thioglykolsäure
Teile | Teile | Teile | Teile· |
.» 60 | 60 | 60 | 60 |
40 ■ |
40 | 40 . | 40 |
6 | 6 | 6 | 6 |
60 | 60 | 60 | 60 |
5 | 5 | _.5 | 5 |
. 7 | 7 | 7 ' | 7 |
10 | 10 | 10 | 10 |
0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
1.49 |
0.06
0.76
Viasser
zu
1,000
1,000 1,000
Cephalosporin C Ausbeute: lOO
309808/1388
160
0.92 1,
100
- 12 Beispiel 3
60 ml des nachfolgenden | Mediums wurden mit dem vegetativen | Teile |
Medium gemäss Beispiel 2 | geimpft | 60 |
40 | ||
Erdnussmehl | 6 | |
Stärke | 60 | |
Methyloleat | 5 | |
Lardöl | 7 | |
Sucrose | 10 | |
Cerelose | , 0,5 | |
CaCO3 | 2 | |
Borax | 1 | |
dl-Serin | zu 1000 | |
Thioessigsäure | ||
Wasser |
Das beimpfte Medium wurde bei 22 - 28 C auf einem rotierenden Schüttler bei 250 U/min während 100 Stunden bebrütet und ergab
eine Brühe mit 330 - 360 Mikrogramm/ml Cephalosporin C.
•Beispiel 4
Das Beispiel 1 wurde wiederholt jedoch unter Verwendung des
nachfolgenden Nährmediums:
Teile
Erdnussmehl 50
Stärke 60
Methyloleat 25
Sucrose 5
Glucose 7
CaCO3 10
Borax 0,5
dl~Methionin 15
Wasser zu 1000
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Die erhaltene Kultur enthielt 4500 - 5000 Mikrograrnm/ml
Cephalosporin C.
Das vegetative Medium gemäss Beispiel 2 diente zur Beimpfung von 60 ml der nachfolgenden Nährmedien, wobei jedes Medium
danach unter Rühren auf'einem Schüttler mit 250 ü/min für 110 Stunden auf 22 - 28°C gehalten wurde.
Medium
Erdnussmehl t
Stärke Methyllinoleat
Glycerinmonooleat Polyglykolmonooleat Polyglykoldioleat
Sucrose Glucose
CaCO3 Borax
dl-Methionin Wasser zu
40
25
Teile Teile Teile
60 60
60 60
40
25
40
25
Teile 60
5 | 5 . | 7 | 5 |
7 | 7 | 10 | 7 |
10 | 10 | 0. 5 | 10 |
0.5 | 0.5 | 15 | 0 |
15 | 15 | 1000 | 15 |
1000 | 1000 | 1000. | |
3 ü 9 Ü 0 ö / I 3 0 8
In allen Fällen wurde ein Cephalosporin C-Gehalt im Medium
zwischen 3000 und 3500 Mikrogramm/ml erreicht.
Das folgende Nährmedium wurde in einem 27 Liter fassenden
belüfteten Fermentationsrührbehälter^ aus rostfreiem Stahl
eingeführt:
• - Teile
Erdnussmehl - 60
Stärke 40
Methyloleat 25
Sucrose 5
d-Glucose 7
CaCO3 * 10
Borax 0,5
dl-Methionin - 15
Wasser zu 1000
Der pH-Wert des Mediums wurde auf einen Endwert von 7,2 - 7,8 eingestellt und das Medium mit Dampf 20 Minuten bei 120 C
sterilisiert. Das Fermentationsniedium wurde sodann mit
5-10 Vol.& einer Züchtung von Cephalosporin Sp. Stamm F beimpft, hergestellt durch Beimpfung mit Sporen des Mikroorganismus
in !folgendem Medium:
Teile
Lardöl 1
Kornquellmasse ' "20
Ammoniurnacetat 6
Sucrose 20
Dieses beimpfte Medium wurde in einer belüfteten flachen
Flasche 72 Stunden lang bei 26 - 3Ö°Cbebrütet.
Das beimpfte Nährmedium des Fermentationsbehälters wurde sodann während 92 Stunden auf 22 - 28°C ,gehalten. Weitere
Nährmedien wurden sodann dem Fermentationsbehälter in Mengen von 260 ml/Stunde zugeführt/ so dass die Menge an durchgesetzter
Brühe ungefähr 1/4 des Volumens/Tag betrug.
Die Temperatur wurde auf 22 - 24 C gehalten, die Rührgeschwindigkeit
betrug 350 U/min und die Belüftung lag- bei 0,5 - 1 Liter pro Liter/Minute während des gesamten kontinuierlichen "Bebrütungsprozesses.
Während 15 Tagen nach Ingangsetzen-des ,kontinuierlichen Prozesses wurden 93,6 1 einer Nährbrühe
gewonnen, die eine Cephalosporin C-Konzentration gemäss der nachfolgenden Tabelleibesaß:
- 16 -
3-0 9808/1388
Bebrütungszeit (Stunden) |
Gewonnenes Volumen (ml) |
92 | 0 |
116 | 6240 |
140 | 6240 |
164/ | .6240 |
188 | 6240 |
212 | 6240 |
236 | 6240 |
260 | 6240 |
284 | 6240 |
308 | 6240 |
332 | * 6240 |
356 | 6240 |
380 | 6240 |
404 | 6240 |
428 | 6240 |
452 | 6240 |
Cephalosporin C Konz. (Mikrograiran/ml)
2180 2090 2260 2010 2375 2400 2130 2210 2175 2200 2190
2000 2260 2190 2290 2070
93,600
30 9808/1388 - 17 -
-· .17 -
4 Fermentationsbehälter mit je 6 Liter Nährmedium gemäss Beispiel 6 wurden mit Cephalosporium Sp. Stamm F 12 geimpft.
Die Fermentationstemperatur wurde bei 23° t 0/50C gehalten.
Die Belüftung betrug etwa 0,5 Liter/Minute. Ein Fermentationsbehälter, bezeichnet mit J-I, diente zur Kontrolle. Die
übrigen 3 Fermentationsbehälter J-2,- J-3 und J-4 wurden nach 96 Stunden mit. frischem, und sterilem Nährmedium versorgt...
Die Geschwindigkeit dieser -Nachfüllung betrug in der Reihenfolge der vorstehend erwähnten Behälter 0,014 Vol./Stunde,
0,015 Vol./Stunde und 0,0208 Vol./Stunde. Die Mengen an gewonnener
Brühe und ihre Konzentration an Cephalosporin C zeigt die nachfolgende Tabelle 2. In den die einzelnen Fermentationsbehälter betreffenden Kolonnen gibt der 1. Wert das jeweils
gewonnene Volumen in Litern an für die jeweils an der linken Seite angegebenen Zeit, während die 2. Angabe die entsprechende
Cephalosporin ,C-Konzentration angibt, die im Nährmedium
in Mikrogramm/ml in dieser Zeit erreicht wurde.
- 18 -
6 | Tabelle | J-I | 2 | 1.5 | 2,150 | 2. | J- | 3 | 2, | 360 | 3 | J-4 | |
- | 2,200 | 1.5 | 2,230 | 2. | 25 | 2, | 280 | 3 | 2,090 | ||||
Bebrütungszeit (Stunden) — |
- | - | 1.5 | 2,180 | 2. | 25 | 9 | 320 | 3 | 2,300 | |||
- | - | 1.5 | 2,200 | 2. | 25 | 2, | 370 | 3 | 2,170 | ||||
96 | 6 | - | 1.5 | 2,310 | 2. | 25 | 2, | 150 | 3 | 2,220 ' | |||
120 | - | 2,280 | 1.5 | 2,090 | 2. | 25 | 2, | 410 | 3 | 2,295 | |||
144 | - | - | Fermentationsbehälter | 1.5 | 2,050 | 2. | 25 | 2, | 295 | 3 | 2,170 | ||
168 | - | - | J-2 | 1.5 | 2,190 | 2. | 25 | 2, | 420 | 3 | 2,260 | ||
192 | 6 | - | 1.5 | 2,235 | 2. | 25 | 2, | 290 | 3 | 2,300 | |||
216 | - | 2,120 t | 1.5 | 2,000 | 2. | 25 | 2, | 450 | 3 | 2,100 | |||
240 | - | - | 1.5 | 1,900 | 2. | 25 | 2, | 500 | 3 | 2,250 | |||
2G4 " | - | -' | 1.5 | 1,970 | 2. | 25 | 2, | 490 | 3 | 2,300 | |||
288 | 6 | '- | 1.5 | 1,720 | 2. | 25 | 2, | 370 | 3 | 2,350 j |
|||
312 | - | 2,220 | 1.5 | 1,810 | 2. | 25 | 2, | 415 | 3 | ! 2,300 j |
|||
. 336 | - | - | 1.5 | 1,700 | 2. | 25 | 2, | 500 | 3 | 2,280 | |||
360 | - | - | 1.5 | 1,700 | 2. | 25 | 2, | 480 | 3 | 2,320 | |||
384 | 6 | - | 6.0 | 1,780 | 6. | 25 | 2, | 515 | 6 | 2,310 ί | |||
408 | 2,250 | ί 0 ;:; / | 1 .· | 0 | 2,320 | ||||||||
432 | 3 ü 9' | ||||||||||||
456 | |||||||||||||
480 | |||||||||||||
Tabelle 3 zeigt das innerhalb von 20 Tagen durch die Fermentation
erreichte gesamte Ausbeute-Volumen und die mittlere »Ausbeute an Cephalosporin C sowie die absolute Menge an
Cephalosporin C, die innerhalb der besagten 20 Tage in jedem
Fermentationsbehälter, gewonnen wurde.
Gesamtvolumen der Ausbeute (in Litern)
Mittlere Menge (in Mikrogfamm/ml)
Gesamtmenge an Cephalosporin C erzeugt innerhalb von 20 Tagen (in g)
.Fermentationsbehälter | J-2 | . J-3 | J~4 |
J-I | 30 | 42 | 54 , |
30 | 2012 | 2390 | 2250 |
2214- | 60.4 | 100.4 | 121. 5 |
66.4 |
- 20 -
Claims (14)
1) Verfahren zur Herstellung von Cephalosporin C durch
Züchten eines Cephalosporin erzeugenden Stammes von Mikroorganismen in einem geeigneten Nährmedium mit
assimilierbaren Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und Schwefel und einem oder mehreren anorganischen Salzen,
dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Cephalosporin Sp. Stamm F. 12 (ATCC 20339) und die
Schwefelquelle eine organische Schwefelquelle ist.
2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung unter submersen aeroben Bedingungen ausgeführt
wird. >...·.. .....·'·■..
3) Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Quellen für Kohlenstoff in dem Nährmedium ein
Kohlenwasserstoff, vorzugsweise eine Mischung aus einem oder mehreren Monosacchariden, einem oder mehreren Disacchariden,
oder einem oder mehreren Polysacchariden sind.
4) Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium 2-10 Gew.% an Kohlenwasserstoffen
enthält.
5) Verfahren nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium ein Glycerid oder ein Hydrolyseprodukt
desselben enthält, vorzugsweise einen wasserlöslichen Ester aus einer ungesättigten Fettsäure und einem niedrigen
Alkohol, wie z. B. Methyl-linoleat, Glycerolmonooleat,
Polyäthylenglykolmonooleat und/oder Polyäthylenglykoldioleat.
- 21 -
309808/1388
6) Verfahren nach Anspruch 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß die Stickstoffquelle im Nährmedium eine organische
Stickstoffquelle ist wie z. B. ein tierisches oder
pflanzliches Protein oder ein Abbau oder Hydrolyseprodukt derselben,anwesend in Mengen von 0,01 - 0,1 Gew,%
an verfügbarem Stickstoff, bezogen auf das Gewicht des Nährmediums. .
7) Verfahren nach Anspruch JL_- 6±_dadurch gekennzeichnet,
daß'das anorganische Salz im Nährmedium Calciumcarbonat, Borax,
Ammpniumacetat"," Ammoniumsulfat und/oder ein Alkalimetall- .
phosphat ist.
8) Verfahren nach Anspruch 1 - 7, dadurch gekennzeichnet,
daß das Nährmedium 0,5 - 1,5 Gew.% an anorganischen Salzen enthält.
9) Verfahren nach Anspruch 1 -8, ^adurch gekennzeichnet,
daß die organische Quelle für Schwefel das Methionin ist.
10) Verfaliren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, '
daß die organische Quelle für Schwefel eine Verbindung der nachfDlgenden Formel ist:
I R1 - X - CH(R2) -CO-Y-R3
1 \ 2 3
worin R , R und R- dieselbe oder eine verschiedene Bedeutung
besitzen und jedes dieser "Radikale ein Wasseroder eine Alkylgruppe n4t 1-5 C-Atomen bedeutet
stoffatom
und X und^oder Y ein Schwefelatom^darstellen und ggf. X
oder Y ein Sauerstoffatom repräsentiert.
3098087 1388 - 22 -
223932-t
- .22 -
11) Verfahren nach Anspruch 1 - 10, dadurch gekennzeichnet, daß im Nährmedium die organische Quelle für Schwefel
in Mengen von 0,05 -. 1 Gew.% enthalten ist.
12) Verfahren nach Ansprach 1 - 11, dadurch gekennzeichnet,
daß die Kultur des mit dem Mikroorganismus beimpften Mediums auf eine Temperatur von 20 - 30° C, vorzugsweise
22 - 28° C, gehalten wird.
13) Verfahren nach Anspruch 1 - 12, dadurch gekennzeichnet,
daß das beimpfte Kulturmedium 96 - 130 Stunden bebrütet wird«
14) Cephalosporin C hergestellt nach den Verfahren gemäß irgendeinem der vorstehenden Ansprüche.
309808/1388
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