DE2213674C3 - Gemisch aus Pepstatin B und Pepstatin C, Verfahren zu dessen Herstellung und dieses Gemisch enthaltende Arzneimittel - Google Patents

Description

in der für Pepstatin B, R n-Hexanoyl und für Pepstatin C, R 4-Methylpentanoyl ist.

2. Verfahren zur Herstellung eines Gemisches von Pepstatin B und Pepstatin C, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces testaceus ATCC 21469 oder Streptomyces argenteolus var. toyonakensis ATCC 21468 unter aeroben Bedingungen in einem assimilierbare Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen enthaltendem Nähr.iedium 3 bis 10 Tage züchtet, die Pepstatine durch Extraktion und Konzentrieren des Extrakts ewinnt und gegebenenfalls in an sich bekannter Weise über ihre Natriumsalze oder Ester mit niederen Alkoholen reinigt.

3. Arzneimittel, bestehend aus einem Pepstatin-Gemisch nach Anspruch 1 und üblichen Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln und/oder Hilfsstoffen.

Die Erfindung betrifft den in den vorstehenden Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Es ist bekannt, daß Pepstatin ein Wirkstoff gegen Magengeschwüre ist. Pepstatin wird durch die Mikroorganismen Streptomyces testaceus Hamada und Okami und Streptomyces argenteolus var. toyonakensis erzeugt. Die Eigenschaften dieser Stämme und deren Hinterlegungsnummern ATCC 21469 sowie ATCC 21468 sind im einzelnen in der DT-OS 20 28 403, Seite 4, Zeile 8 von unten beziehungsweise Seite 9, Zeile 4 von unten offenbart.

Pepstatin ist ein Pentapeptid, in dem R in der in Anspruch 1 angegebenen allgemeinen Formel die Bedeutung 3-Methylbutanoyl hat (J. Antibiotics 23, 259-262,1970, ibid. 23,263-265.1970). Pepstatin kann erhalten werden, indem ein pepstatinerzeugendcr Stamm in einem Peplon oder andere Stickstoffquellen enthaltenden Nährmedium kultiviert wird und das Pepstatin aus dem Kulturfiltrat extrahiert und dann gereinigt wird. Das Pepstatin kann ebenfalls in Form seiner Metallsalze, Amide oder Ester erhalten werden, wie dies in der DTOS 20 28 403 beschrieben wird. Das Kulturmedium der oben angegebenen pepstatiner/eugenden Stämme wurde auf weitere Pepsininhibitoren untersucht, und man konnte noch zwei pepstatinähnliche Substanzen teststellen, die Antipepsinaktivität wie das Pepstatin selbst besitzen, sich jedoch vom Pepstatin bei der Kieselgel-Dünnschichtchromatographie unterscheiden und, wie durch Gaschromatographie der Säurehydrolysale des Pepstatins nachgewiesen wurde, einen anderen Fettsäureanteil enthalten.

Ein Gemisch der Methylester von Pepstatin B und C kann in Form von feinen Nadeln aus methanolischer Lösung auskristallisiert werden. Es zersetzt sich bei etwa 254—255° C. Die Elementaranalyse ergibt C : 60,4%, H : 9,38%, N : 9,74%. Daraus wurde die Summenformel C36H67N5O9 errechnet (C: 60,6%, H :9,4%, N : 9,82%). [λ] Γ -95,5° /e=0,5. Essigsäure). Die Rydon-Smith-Reaktion ergibt eine blaue Farbe (wie Pepstatin), die Hydroxylamin-Fisen(III)chlorid-Reaktion eine rote Farbe. Das Gemisch der Methylester von Pepstatin B und C ist leicht löslich in Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Essigsäure, jedoch schwer löslich in Wasser, Chloroform, Benzol, Äthylacetat und Äther.

Es ist löslicher in Methanol als Pepstatinmethylester (5—IO mg/ml). Ein durch Einwirkung von 20%iger Salzsäure (16 Stunden bei 105⁰C) erhaltenes Säurehydrolysat von Pepstatin B- und C-Methylester wurde mit Äther extrahiert und einer gaschromatographischen Analyse und einer zweidimensional^ Dünnschichtchroniatographie unterworfen. In dem Ätherextrakt konnte man n-Hexansäure feststellen. In der wäßrigen Schicht wurden Valin und Alanin (2:1) zusätzlich zu 3-Hydroxy-4-amino-6-methylheptansäure festgestellt. Daraus konnte gefolgert werden, daß die Struktur von Pepstatin B eine Pepstatinstruktur ist, deren Acylrest sich von n-Hexansäure ableitet. Bei der Kieselgel-Dünnschichtchromatographie in dem Lösungsmittelsystem Chloroform : Methanol : Essigsäure 95 :4 : 1 ergab Pep-

fto statin B= und DMethylester nach Änfärbung gemäß Rydon-Smith einen Rf-Wert von 0,39, Pepstatinmethylester einen Rf-Wert von 0.35. Das Gemisch von Pepstatin B- und C Methylester zeigte ebenfalls Antipepsinaktivität wie Pepstatinmethylester.

'•s Aus vorstehendem ergibt sich, daß pepstatiner/.eugendc Stämme auch Pepstatin B erzeugen. Aufgrund dieser Feststellung ist zu erwarten, daß weitere pepstatinähnliche Verbindungen, die sich im Fettsäure-

anteil unterscheiden, gewonnen werden können. Es konnte festgestellt werden, daß im Kulturmedium noch ein anderes Pepstatin vorhanden ist, das als Pepstatin C bezeichnet wird und den 4-Methylpentanoylrest enthält. Pepstatin C-Methylester zeigt den gleichen Rf-Wert von 039 wie Pepstatin B-Methylester.

Nach dem Verfahren der Erfindung können die neuen Pepstatine durch folgende Verfahrensweise erhalten werden:

Ein pepstatinerzeugender Stamm wurde in ein Nährmedium inokuliert bzw. eingeimpft, das Kasein, entrahmte Milch und/oder Sojabohnenmehl als Stickstoffquelle enthält, und 3—10 Tage unter normalen aeroben Bedingungen inkubiert, bis die Antipepsinaktivität des Nährmediums ihr Maximum erreicht Der aktive Bestandteil kann mit n-Butanol aus der kultivierten Nährbrühe oder dem Filtrat extrahiert werden oder mit Methanol aus der Mycelmasse. Der so erhaltene Extrakt wurde zu einem Syrup konzentriert. Dann wurde der Syrup zu fünf bis zwanzig Volumen Wasser tropfenweise zugesetzt. Es entstand ein goiber Niederschlag.

Der Niederschlag wurde abfiltriert und getrocknet, wodurch ein Gemisch von Pepstatin B und C als Rohprodukt erhalten wurde. Das Rohpepstatin wurde in einem niederen Alkohol aufgelöst und verestert, indem mehrere Stunden bei Raumtemperatur mit einer geringen Menge eines Veresterungskatalysators, wie beispielsweise Salzsäure, Schwefelsäure, p-ToluolsuI-fonsäure, Thionylchlorid, Phosphorpentachlorid oder Phosphoroxitrichlorid stehengelassen oder erhitzt wurde. Der Methylester der Rohpepstatine, der bei Einwirkung von Methanol entsteht, ist ein Substanzgemisch. Die Hauptmenge des Pepstatinmethylesters kann aus einer Methanollösung auskristallisiert werden. Diese kristalline Fraktion wurde mittels Dünnschichtchromatographie untersucht, und man konnte die Methylester des bekannten Pepstatins und der Pepstatine B und C in einem Verhältnis 1 : 1 feststellen. Von letzteren ist eine weitere Menge in der Mutterlauge enthalten, die konzentriert werden kann.

Die Kristalle werden aus Methanol umkristallisiert. Die Mutterlauge wird von den Kristallen abgetrennt. In dieser Mutterlauge kann dann fast kein Methylester des bekannten Pepstatins nachgewiesen werden. Der Methylester der Pepstatine B und C kann aus dieser Mutterlauge in Form feiner Nadeln gewonnen werden.

Das Verfahren nach der Erfindung schließt auch die Herstellung von Natrfnm-Salzen des Gemisches von Pepstatin B und C mittels alkalischer Hydrolyse der betreffenden Pepstatinester ein, die durch Neutralisation in das Gemisch von Pepstatin B und C übergeführt werden können. Die alkalische Hydrolyse kann nach dem Verfahren gemäß DT-OS 20 28 403 durchgeführt werden. Das in dieser Weise erhaltene Gemisch der Natriumsalze von Pepstatin B und C ist ein weißes amorphes Pulver, das einen Zersetzungspunkt von 250 bis 255°C aufweist. Die Antipepsinaktivität (ID50) des Gemisches von Pepstatin B und C in Form der Natriumsalze ist 0,055 \ig. Das Pepstatin B= und C-Gemisch mit freier Carboxylgruppe ist ein amorphes weißes Pulver, das durch Umkristallisieren aus Methanol/H2O (2:1) erhalten wurde. Es zersetzt sich bei etwa 210-220°C.[<x] -85" (C = 1,0, Methanol); 11>,„0,05 Hg. Das lnfrarotspektr_.m wird in F i g. 2 dargestelh.

Dieses Verbindungsf;emiscli ist leicht löslich in Methanol (100 mg/ml), d. h. etwa lOmal so gut wie das bekannte Pepstatin. Es ist ebenfalls löslich in wäßrigem Butanol, Äthanol, Isopropylalkohol, Dimethylformamid, Dimethyisulfoxid, Essigsäure und Pyridin und leicnt löslich in wäßrigem Aceton, jedoch schwer löslich in wasserfreiem Aceton, wasserfreiem Butanol, Chloroform. Benzol, Äther und Wasser. Es weist anderen Pepstatinderivaten gegenüber ferner unerwartet eine erheblich verbesserte Antireninaktivität auf.

Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele erläutert:

Beispiel 1
A.) Herstellung von Pepstatinen als Rohprodukt

Streptomyces testaceus ATCC 21469 wurde in ein sterilisiertes Nährmedium eingeimpft, das 5,5% Glukose, 2,0% Sojabohnenöl, 4,5% entrahmte Milch, 5,0% Milchkasein, 0,15% K₂HPO₄, 0,35% NaCI und 0,15% MgSO₄ · 7H₂O (pH 6,45) in einem Volumen von 2900 1 enthielt und unter Belüftung und führen über einen Zeitraum von 112 Stunden bei 23—24°C inkubiert wurde. Die Konzentration aller Pepstatine (d. h. Pepstatin, Pepstatin B und C) in der Kulturbrüh;: wurde aus dem Analysenwert der Antipepsinaktivität zu 2260

^5 μg/ml berechnet. Der pH-Wert des Mediums wurde mittels verdünnter Schwefelsäure auf 2,5 eingestellt. Dann wurden 36001 Methanol zugegeben. Anschließend wurde die Flüssigkeit 40 Minuten bei !5—2O⁰C gerührt, 4% Filterhilfe zugesetzt, und dann filtriert und

}o gewaschen. Das so hergestellte wäßrig-methanolische Filtrat von 63001 wurde mittels NaOH auf einen pH-Wert von 10 eingestellt und das Methanol im Vakuum abgedampft Man erhielt dabei einen wäßrigen Rückstand von 19001. Zu diesem wäßrigen Rückstand

.15 wurden 800 I n-Butanol zugesetzt und der pH-Wert der Mischung auf 7,0 eingestellt. Nach 30 Minuten langem Rühren bei 20⁰C trennte man einen Butanolextrakt von 9601 ab. Der pH-Wert dieses Butanolextraktes wurde auf 3,0 eingestellt, und es wurde im Vakuum konzentriert. Man erhielt 551 eines konzentrierten Syrups. Der so hergestellte Syrup wurde tropfenweise unter Rühren über einen Zeitraum von 60 Minuten in 8001 Wasser hineingegeben. Der dabei erhaltene Niederschlag wurde abfiltriert, mit Wrsser ge'.vaschen und lyophilisiert, wodurch 7990 g eines gelb gefärbten Rohpulvers der Pepstatine B und C erhalten wurden. Die Reinheit des Gemisches dtr Pepstatine B und C des so erhaltenen Pulvers betrug 64%.

B.) Veresterung des Rohprodukts mit Methanol

Das bei dem obigen Verfahren erhaltene pulverförmige uo'.imaterial (6080 g) wurde in 33 I Methanol gelöst und es wurde 1,25 kg Aktivkohle zwecks Entfärbung zugesetzt. Zu dieser entfärbten methanoliscnen Lösung wurden 125 ml konzentrierte Schwefelsäure zugesetzt und bei 6O⁰C über einen Zeitraum von 2,5 Stunden gerührt. Das Reattionsgemisch wurde durch Zusatz von 0,631 Triäthylamin neutralisiert und weitere 120

'« Minuten bei 50-60°C gerührt.

Man erhielt dabei ein weißes kristallines Pulver, das gewaschen und im Vakuum getrocknet wurde. Man erhielt 3230 g des Gemisches von Pepstatin-Methylestern mit einer Ar'.ipepsinaktivität (IDi₁₁) von 0,056 μg.

<«■ Der Zersetzungspunkt liegt bei 250-25TC.[α] -90'-(C=I₁O, Essigsäure). Das Pulver enthielt mehr als 80% des Gemisches von Pepstatin B- und C-Methylester (Rf 0,39. Dünnschichtchromatographie auf Kieselfrel).

C.) Verseifung des Gemisches der Methylester

310Og des gemäß Verfahrensstufe B erhaltenen Pepstatin-Mlethylesters wurden in 130 1 9()prozentigmethanoliseher, 0,2 N-Natronlauge bei 60°C gelöst und über einen 2'eitraum von 2 Stunden verseift. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum konzentriert, um das Methanol zu entfernen. Man erhielt ein trübes Konzentrat. Das Konzentrat wurde in 20 I n-Butanol gelöst, da;> mit Wasser gesättigt war. Dann wurden 15 I Wasser zugegeben, und der pH-Wert wurde mittels verdünnter Schwefelsäure auf 3,0 eingestellt. Anschließend wurde 20 Minuten lang gerührt, und die obere Butanolschicht von 18 1 wurde tropfenweise in 270 1 Wasser hineingegeben. Der so erhaltene Niederschlag wurde 60 Minuten lang gerührt, filtriert und mit Wasser gewaschen. Der gewaschene Niederschlag wurde dann im Vakuum getrocknet und ergab 25öö g eines weiSen Pulvers. Dieses Pulver zersetzt sich bei 205—21O⁰C, [λ]

-84° (C=I₁O, Methanol). Der IDw- Wert (50% Inhibierung gegen Pepsin) lag bei 0,055 μg. Die Titrationskurve zeigte, daU 700 mg einer Probe 9.7 ml einer0.1 N-NaOlI verbrauchten.

D.) Umkristallisieren des Gemisches der Methylester gemäß Verfahrensstufc B

100 g der erhaltenen Pepstatin-Methylester wurden in 41 absolutem Methanol gelöst und mit 20 g Aktivkohle entfärbt. Man ließ die Methanollösung über

im Nacht stehen und erhielt so 24 g weiße Kristalle. Die methanolische Mutterlauge wurde auf 1,3 1 konzentriert. Es fiel ein Niederschlag aus. Dieser Niederschlag kristallisierte nach 60minütigem Rühren bei 6O⁰C aus. Eine zweite Kristallfraktion ergab über Nacht weitere

ii 55,0 g an weißen Kristallen (Fraktion Eh), welche in 1,5 1 heißem Methanol gelöst und mit Aktivkohle behandelt wurden. Die methanolische Lösung ließ man über Nacht siehen und eriiicli i 2,0 g wciuc Kristalle (Traktion £?j).

Die nach der obigen Verfahrensweise erhaltenen drei kristallinen Substanzen zeigten folgende physikalischchemischen Eigenschaften:

	Di	Ch	D,
Zersetzungstemperatur, °C	250-251	253-254	254-255
[«]■:■', Grad (c = 0,5, Essigsäure)	-90,5	-91,5	-95,5
IDso-Wert (gamma) Rf-Werte»)	0,05 0,35 und 0,39 Mengen-Verhältnis: 1 : 1 bis 1 : 2	0,05 0,39 Hauptmenge 0,42 Spuren	0,05 0,39") Hauptmenge 0,42 Spuren

^a) Dünnschichtchromatographie
Adsorbens: Kieselgel

Laufmittelsystem: Chloroform/Methanol/Essigsäure 95 :4 -.

^b) Gemisch aus Pepstatin B- und C-Methylester.

Das Infrarotspektrum der Kristallfraktion Lh ist in F i g. 1 dargestellt.

Beispiel 2
A.) Herstellung von Pepstatinen als Rohprodukt

Streptomyces argenteolus var. toyonakensis ATCC 21468 wurde in 1301 eines sterilisierten Mediums eingeimpft, das 6,0% Glukose, 2,0% Glyzerin, 4,0% abgerahmte Milch, 4,5% Milchkasein, 0,1% K₂HPO*. 0,3% NaCI und 0,1 % MgSO₄ · 7 H₂O (pH 6,8) enthielt und unter den gleichen Bedingungen wie bei Beispiel 1 137 Stunden inkubvdrt Die 1251 Kulturbrühe wiesen Antipepsinaktivität auf, die 170 g Pepstatin äquivalent war. Es wurden 601 n-Butanol zugesetzt und 40 Minuten bei Raumtemperatur gerührt Anschließend wurden die Butanolschicht, die Wasserschicht und die feste Schicht (Mycelmasse) durch Zentrifugieren getrennt. Die Butanolschicht wurde mit Wasser gewaschen und im Vakuum auf 1,5 1 Syrup konzentriert. Der pH-Wert des Syrups wurde auf 3,0 eingestellt und es wurden 7,5 1 η-Hexan zugesetzt, wobei unter Rühren ein gelbbrauner Niederschlag entstand. Es wurde weiterhin 60 Minuten gerührt, der Niederschlag wurde abfiltriert, gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhielt 164 g eines Rohpepsiatins mit einer Antipepsinaktivität ID« 0,075 ug-

B.) Reinigung des Rohpepstatins durch Umfallen

150 g des gemäß Verfahrensstufe A erhaltenen RohDeDStatins wurden in !,51 90%ig. Methanol bei 40—50⁰C gelöst und mit 150 g Aktivkohle entfärbt. 1,6 der entfärbten methanolischen Lösung wurden be Raumtemperatur mit 1,01 Wasser versetzt. Man erhiel einen gelartigen Niederschlag, der abfiltriert, mit 50%ig Methanol gewaschen und lyophilisiert wurde. Mar erhielt 94 g eines leicht gelblichen Pulvers mit einen ID₅₀-Wert von 0,062 μg. Dieses Pulver wurde in 90%ig Methanol gelöst und zweimal wie vorher mit Aktivkoh Ie behandelt. Man erhielt 45 g eines weißen Pepstatin pulvers. Der IDso-Wert lag bei 0,055 μg, die Zerset Zungstemperatur bei 198 —205⁰C, [ac];' —79° (c=1,C Methanol). Bei Dünnschichtchromatographie zeigt« dieses Pulver Rf-Werte von 035 (Pepstatin-Mei.iyl ester), von 039 (Pepstatin B- und C-Methylester) um von 0,42.

Ci) Herstellung des Äthylesters

4,0 g des gemäß Verfahrensstufe B erhaltener Pepstatins wurden in 100 ml absolutem Äthanol untei Erwärmen gelöst, und es wurden 0,2 ml konzentrierte Schwefelsäure zugesetzt. Diese Mischung wurde f t-.o Stunden unter Rückfluß erhitzt und im Vakuum au 50 ml konzentriert. Der dabei gebildete Niederschlaf wurde abfiltriert, mit Äthanol gewaschen, getrockne und ergab 1,6 g eines Pulvers. Dieses Pulver wurde au 100 ml absolutem Methanol umkristallisiert. Man erhiel f>5 1,15 g eines weißen Pulvers des Pepstatin B- um C-Äthylesters mit ID50 0,054 μ& einem Zersetzungs punkt von 250—25 Γ C und einer Drehung von [α -90° (c= 0,5, Essigsäure).

('..) Herstellung des n-Propylesters

0,3 g des gemäß Ver.ihtuMSMufi: Ii erhaltenen Pepstaims wurden in 100 ml absolutem n-Propylalkohol unter Erhitzen gelöst. Dann wurden 0.2 ml konzentrierte Sch> jfelsäure zugesetzt, und es wurde 6 .Stunden bei 80°C verestert. Die Reaktionsmischling wurde im Vakuum auf 20 ml konzentriert, und es entstand ein Niederschlag. Der Niederschlag wurde abfiltriert, mit n-Propylalkohol gewaschen und getrocknet. Man erhielt 900 mg eines weißen Pulvers, das aus 40,0 ml absolutem Propylalkohol umkristallisiert wurde und 480 mg Pepsialin-ß und C n-Propylester ergab. Dieses zeigte IDiH 0,073 ng, einen Zersetzungspunkt bei 218-220'CundH -89.5" (c = 0.5, Essigsäure).

Beispiel 3
A.) Herstellung von Pepstatinen als Rohprodukt

Streptomyces testaceus ATCC 21469 wurde in I 30 1 eines sterilisierten Mediums eingeimpft, das 6,0% Glukose, 2,0% Glyzerin, 1,5% abgerahmte Milch, 1,5% Kasein, 5,7% Sojabohnenmehl, 0,1% K₂HPO₁, 0,3% NaCI und 0,1% MgSO₄ ■ 7 H₂O(pH 5,5) enthielt und 137 Stunden lang unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel I inkubiert. 1101 der Kulturbrühe mit einem Wirkstoffgehalt, der 132 g Pepstatin äquivalent war, wurde inter Zusatz von 7 kg Filterhilfe filtriert, und der pH-Wert wurde mittels verdünnter Schwefelsäure auf 2,0 eingestellt. Dann wurden i3 kg eines Mycelkuchens (Naßgewicht) und 75 I Filtrat abgetrennt. Der Mycelkuchen wurde zu 83 1 absolutem Methanol zugegeben, und man erhielt nach 40 Minuten langem Rühren eine Aufschlämmung. Die Aufschlämmung wurde filtriert, und der Kuchen wurde zweimal mit 40 I eines 70%ig. Methanols gewaschen. Man erhielt 1401 eines wäürigmethanolischen Extrakts. Zu 75 I der obigen filtrierten Brühe wurden 35 I n-Butanol zugesetzt, und es wurde 1 5 Minuten lang gerührt. 37 I einer Butanol-Schicht wurden von 73 1 einer wäßrigen Schicht abgetrennt. 1401 des obigen wäßrig-methanolischen Extrakts, der von dem Mycelkuchen erhalten worden war. wurde im Vakuum zu 27 I einer wäßrigen Lösung konzentriert unü mit 37 I des oben angegebenen Butanolextrakts vermischt. Diese Mischung wurde zentrifugiert, um die wäßrige Schicht zu entfernen, und man erhielt 351 eines Butanolextrak:s. Der Butanolextrakt wurde auf einen pH-Wert von 3,0 eingestellt und im Vakuum auf I I Syrup konzentriert. Dieser Syrup wurde tropfenweise in 15 1 Wasser hineingegebeben und 60 Minuten lang gerührt. Der dabei erhaltene Niederschlag wurde abfiltriert, m't Wasser gewaschen und bei 60 —70⁰C getrocknet. M.in erhielt 158 g eines gelblichen Pulvers von Pepstatin I! und C. Die 50%igo Inhibieriing geget Pepsin (ID-,,,) lag bei 0.072 (ig.

B.) Veresterung des Rohprodukts mit Methanol

Das so hergestellte Pulver wurde wie in Beispiel I Verfahrensstufe B, mit Methanol verestert und ergab h.' g eines weißen kristallinen Pulvers von Pepstatin Ii- und ( Meihylester mit einem ID-.n-Wcrt von 0,05 jig Zerset/ungspunkt 250-252 ¹C. O] -90,6 (c-0,5 Essigsäure). Bei der Dünnschichtchromatographie wurde festgestellt, daß das so hergestellte weiße kristalline Pulver hauptsächlich aus Pepstatin B- und C-Methyl ester (Rf = 0,39) besteht und Spuren von Pepstatinmethylester enthalten sind.

C.) Verseifung des Gemisches der Methylester

30 g des SO erhaltenen PcpaidiiiiiViciilyicMcis winden in 450 ml 0,2 N-NaOH in 90%igcm Methanol zwei Stunden bei 60⁰C verseift. Die Reaktionsmischung wurde mittels verdünnter Salzsäure auf einen pH-Wert von 8,5 eingestellt und auf 150 ml konzentriert, wobei ein weißer Niederschlag entstand. Der Niederschlag wurde abfiltriert, mit Methanol gewaschen und im Vakuum getrocknet und ergab 17,9 g eines weißen Natriumsalz-Pepstatinpulvers mit ID™ 0,05 pg, einem Zersetzungspunkt von 245 —249°C und einer Drehung von [λ] -84° (C=I₁O, Methanol). Bei der Titration verbrauchten 700 mg dieses Materials 10,1 ml einer 0,1 N-HCI.

Beispiel 4
A.) Herstellung von Pepstatinen als Rohprodukt

Streptomyces argenteolus var. toyonakensis AICC 21468 wurde in 1301 eines sterilisierten Mediums eingeimpft, das 6,0% Glukose, 2,0% Glyzerin, 4,2% Milchkasein, 1,0% Pepton, 0,1% K₂HPO₄, 0,3% NaCI und 0,1% MgSO₄ · 7 H₂O (pH 7,0) enthielt und zu den gleichen Bedingungen wie in Beispiel I über einen Zeitraum von 132,5 Stunden inkubiert. 130 1 des Kulturmediums, mit einem Wirkstoffgehalt, der 111 g Pepstatin äquivalent war, wurde in der gleichen Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben aufgearbeitet und ergab 133 g Rohpepstatin mit einem ID₁₀ gegen Pepsin 0,076 μg.

B.) Veresterung des Rohprodukts mit Methanol

Das so erhaltene gelbe Pulver wurde wie in Beispiel 1 B behandelt, und man erhielt 58,5 g Pepstatinmethylester mit ID50 0,051 μξ, einem Zersetzungspunkt bei 255-256°C und einer Drehung [λ] -95,5° (c=0,5. Essigsäure). Bei der Dünnschichtchromatographie erhielt man einen Rf = 0,35 und einen Rf = 0,39 (I :l). jedoch wurde ein Rf-Wert von 0,42 nicht festgestellt.

Hierzu 2 Iil:ili

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Gemisch aus Pepstatin B und Pepstatin C der allgemeinen Formel

CH₁

CH₃ CH₃ CH-CH₃

CH-CH₃ CH-CH₃ CH₂ OH CH₃

R — NH—CH —CO-NH—CH —CO —NH-CH CH-CH₂-CO-NH-CH-Co

CH₁

CH-CH₃ CH₂ OH NH—CH CH-CH₂-COOH