WO2004080462A1

WO2004080462A1 - c-Kitキナーゼ阻害剤

Info

Publication number: WO2004080462A1
Application number: PCT/JP2004/003087
Authority: WO
Inventors: Yuji Yamamoto; Tatsuo Watanabe; Masayuki Okada; Akihiko Tsuruoka
Original assignee: Eisai Co., Ltd.
Priority date: 2003-03-10
Filing date: 2004-03-10
Publication date: 2004-09-23
Also published as: US20040253205A1; ATE508747T1; EP1604665A4; EP1604665B1; JPWO2004080462A1; EP1604665A1; US7994159B2

Description

明糸田書

c-Kitキナーゼ阻害剤

技術分野

【0 0 0 1】本発明は、 c-Kitキナーゼ阻害剤、及び c_Kitキナーゼ阻害剤を有効成分とする c-Kit キナーゼの過剰な活性化により引き起こされた疾患の治療剤に関する。

背景技術

【0 0 0 2】受容体型チロシンキナーゼによる細胞内情報伝達は、細胞増殖、分化および代謝に寄与し、その結果、癌を始めとした種々の疾患の原因となっている（Kolibaba K. S. et al. , Β. Β. A. 1333, F217-F248, 1997； Sheijen Β. et al. , Oncogene 21, 3314-3333， 2002) 。

【0 0 0 3】受容体型チロシンキ^ "一ゼの一つである C- Kit キナーゼは、それに対する特異的なリガンドである SCF (Stem cell factor)と結合することにより、それ自身の 2量体化に引き続きキナーゼ活性が活性化され、その結果細胞内に存在する種々の c - Kit キナーゼの基質がリン酸化を受けることが知られている（Blume— J ensen P. et al. , EMB0 J. 10, 4121—4128， 1991； Lev S. et al.， EMB0 J.， 10, 647-654, 1991) 。

【0 0 0 4】 C- Kit キナーゼの異常な活性化は、ある種（例を下記に記載）の癌細胞で増殖シグナルとなつて癌化や悪性化の原因になっていると考えられている。

【 0 0 0 5】（ 1 ) 急性骨髓性白血病 ( acute myelogenous leukemia, AMD ：多くの（60-80%)急性骨髄性白血病の患者で c - Kit キナーゼの発現が見られ、それらの患者由来の芽球の増殖が SCF刺激で促進された。更に、 1V18例の患者において、 SCF刺激無しで C- Kitキナーゼの活性化が見られ、これらの患者では c_Kit キナーゼに活性化変異が生じていると考えられた（Lev S. et al. , EMB0 J. , 10， 647-654, 1991； Wang C. et al. Leukemia 3, 699 - 702, 1989； Kanakura Y. et al. Leuk. Lymph. 10, 35-41, 1993； Ikeda H. et al. Blood, 78， 2962 - 2968， 1991 ； Ikeda H. et al. Exp. Hematol. 21， 1686—1694， 1993) 。

【0 0 0 6】（2 ) 肥満細胞性白血病（mast cell leukemia) ：肥満細胞症患者が発症する肥満細胞性白血病の細胞株において c_Kit キナーゼの活性化変異の存在が報告されている（Furitsu T. et al. , J. Clin. Invest. , 92, 1736-1744, 1993) 。

【0 0 0 7】（3 ) 小細胞肺癌 (small cell lung carcinoma, SCLC) ： SCLC の 70%以上の細胞株で c- Kitキ "一ゼの高発現が見られた。一方、非小細胞肺癌 (Non-small cell lung carcinoma) の細胞株では c-Kitキナーゼの発現量は少ないか検出限界以下であった。また小細胞肺癌の細胞株ではリガンドである SCF も発現しており、オートクラインで増殖が促進されている可能性が示唆された ( Hibi K. et al.， Oncogene, 6, 2291-2296, 1991 ； Sekido Y. et al. , Cacer Res. , 51， 2416-2419， 1991) 。

【0 0 0 8】（4 ) GIST (gastrointestinal stromal tumors) ： GIST は c -

Kit キナーゼを発現している消化管に発生する間質系癌と定義される。 GIST では約半数で活性化変異が見られ、 — J変異は悪性度の高い GIST においてより高頻度に存在しており、予後因子となる可能性が示唆されている（Lasota J. et al. , Am. J. Pathol. , 157， 109ト 1095, 2000； Taniguchi M. et al. , Cancer Res. , 59, 4297-4300, 1999) 。

【0 0 0 9】（5 ) 睾丸腫瘍（testicular cancer) ：睾丸腫瘍は、前癌病変と考られる carcinoma in situ (CIS) 力、進 frして seminoma と non— seminoma と呼ばれる腫瘍になる。 C - Kit キナーゼは、 CIS と seminoma における高発現が報告されている（Strohmeyer T. et al. , Cancer Res.， 51, 1811—1816， 1991) 。更に近年、 seminoma において活性化変異を起こした c- Kit キナーゼの発現が報告されている（Tian Q.， et al. Am. J. Pathol. , 154, 1643-1647， 1999) 。

【0 0 1 0】（6 ) 卵巣癌（ovarian cancer) ：正常の卵巣上皮では SCF が発現しているだけで c- Kit キナーゼの発現が見られないが、癌化初期で良性の卵巣癌では c-Kit キナーゼおよび SCF の両方が発現し、更に悪性化した卵巣癌では逆に C- Kit キナーゼの発現が低下する事が報告されている。 'この結果より、 c-Kit キナーゼが卵巣癌の発生に重要な役割を果たしていることが示唆された

(Tonary A. T.， Int. J. Cancer, 89， 242—250， 2000) 。

【0 0 1 1】（7 ) 乳癌（breast cancer) ：乳癌は周囲の正常組織に比べ c- Kit キナーゼの発現が低下するという報告が有る（Natali P. et al.， Int. J. Cancer, 52， 713-717, 1992) 、その後の研究で乳癌では正常組織で検出されなかった c_Kit キナーゼの発現が見られ、更に SCF の発現も検出され、オートクライン刺激で増殖が促進されている事が示唆された（Hines S. J. et al. , Cell Growth & Differentiation, 6， 769-779, 1995) 。

【0 0 1 2】（8 ) 脳腫瘍（brain cancer) ：脳腫瘍の中で最も悪性度の高い神経膠芽腫（glioblastoma) の細胞株および組織において c- Kit キナーゼの発現が見られ、 c-Kitキナーゼを発現する神経膠芽腫の細胞株が SCF刺激により増殖が促進されたことが報告さ、 .'、る（Berdel W. E. et al. , Cancer Res. , 52， 3498-3502, 1992) 。

【0 0 1 3】（9 ) 神経芽細胞腫（neuroblastoma) ：子供に発生する癌として有名な神経芽細胞腫の細胞株および組織標本において、 SCFと C- Kitキナーゼが共に発現している例が多く、抗 C- Kit キナーゼ抗体により神経芽細胞腫の細胞株の増殖が抑制され、オートクラインにより増殖が促進されている事が報告されている（Cohen P. S.， Blood, 84, 3465-3472， 1994) 。

【0 0 1 4】（1 0 ) 大腸癌（colorectal cancer) ： c-Kit キナーゼとそのリガンドである SCF は大腸癌組織における共発現が見られたのに対し正常粘膜組織では両者の発現が見られなかった。また大腸癌細胞株は SCF刺激により増殖が促進された。（Bellone G. , et al. J. Cel l. Physiol. , 172, 1-11， 1997) 。

【0 0 1 5】また、 SCF刺激による c_Kitキナーゼの活性化が肥満細胞の増殖と分化に必須である事が報告されている（Hamel et al.， J. Neuro-Onc. , 35， 327-333, 1997； Kitaraura et al. , Int. Arch. Aller. Immunol. , 107， 54 - 56，

1995) 。従って、 c- Kit キナーゼの過剰な活性化は、肥満細胞の過剰によって引き起こされる肥満細胞症、喘息、慢性鼻炎などの免疫異常の原因となっていると考えられている。

【0 0 1 6】（1 ) 肥満細胞症（Mastocytosis) ：肥満細胞の過剰増殖によつて特徴付けられる色々な状態の病態の総称である。（Metcalfe, J. Invest.

Derm. , 93， 2S-4S, 1991； Golkar et al. , Lancet, 349, 1379 - 1385， 1997 ) 。肥満細胞症患者では、 1 ) c- Kit キナーゼの過剰発現（Nagata et al.， Mastocytosis Leuk. , 12， 175 - 181， 1998 ) 、 2 ) 可溶型 SCF 量の増加 (Longley et al. , New Engl. J. Med.， 328, 1302—1307， 1993) 、 3 ) c— Kit キナーゼの活†生化変異（Nagata et al. Mastcytosis Leuk. , 12, 175-181，

1998； Longley et al. , Nat. Gen. , 12, 312-314， 1996) などが報告されており、これら力 S c-Kit キナーゼを^ に活性化して肥満細胞症を引き起こすと考えられている。

【0 0 1 7】（2 ) アレルギー、喘息：肥満細胞と好酸球は炎症、アレルギー、喘息などの発症において重要な細胞である（Thomas et al. Gen. Pharmacol. ,

27， 593-597, 1996 ； Metcalfe et al. Physiol. Rev. , 77, 1033—1079， 1997) 。この事は慢性鼻炎やアレルギーに伴う炎症に対して現在最も効果が有るとされているコルチコステロイドが、循環および浸潤する肥満細胞と好酸球の数を減少させるという報告からも示唆される（Naclerio et al. , JAMA, 278, 1842-1848， 1997； Meltzer, Aller. 52, 33-40, 1997) 。 SCF刺激に伴う c- Kit キナーゼの活性化は、肥満細胞の分化、生存、増殖に必須であるだけでなく、 mast cell からの種々の因子の誘導を促進し、これらの因子が好酸球の分化、生存、浸潤性に重要な機能を果たしている事が報告されている（Okayaraa et al. , Int. Arch. Aller. Immunol. , 114, 75 - 77， 1997； Okayama et al. , Eur. J. Immunol. , 28, 708 - 715， 1998 ； Metcalf et al.， Proc. Natl. Acad. Sci.， 95, 6408-6421, 1998； Kay et al.， Int. Arch. Aller. Immunol. , 113, 196—

L99, 1997； Hogaboam et al. J. Immunol. 160， 6166-6171, 1998； Luckas et al. J. Immunol. 156, 3945-3951, 1996) 。従って c-Kit キナ^"ゼの阻害により喘息、アレルギーなどの患者において、活性化した肥満細胞と好酸球を阻害できると考えられる。

【0 0 1 8】以上に述べた通り、 C- Kit キナーゼは幾つかの癌の発生や悪性化や、肥満細胞の過剰が原因と考えられる疾患に密接に関係していると考えられ、その阻害剤は、これら疾患の治療剤として有用であると考えられた。

発明の開示

【0 0 1 9】本発明の課題は、 C- Kit キナーゼ阻害活性を示す新たな化合物を見出し、 c - Kit キナーゼが原因となっている疾患の治療剤を開発することにある。【0 0 2 0】 C- Kit キナーゼ阻害作用を示す化合物として、これまでにィンドリン骨格を有する化合物が、報告ている (W0 01/45689) 。また、キナゾリン骨格を有する化合物の c- Kitキ^ ""一ゼ阻害作用が報告され（W0 01/47890) 、類縁の化合物（KRN633) も c-Kit キナーゼ阻害作用を持つことが報告されている（久保和生ら、第 22 回メデイシナルケミストリーシンポジウム講演要旨集 P275-277, 2P-320, 2002) 。また最近、 c- Kit阻害に基づいた GISTに対する治療剤としてグリーベック（STI571 ) が米国、欧州および日本で承認された (Drugs, 63： 513-22, 2003) 。

【0 0 2 1】我々は、下記一般式 Iで表される化合物が VEGF受容体の kinase 活性を抑制し、 VEGF， FGF2, HGF刺激による内皮細胞の管腔形成を阻害することを報告した（W0 02/32872) 。そして、下記一般式 Iで表される化合物が VEGF kinase のみならず、 c_Kit キナーゼに対し強い阻害作用を有する事を見出し. 更に c-Kit キナーゼを発現する癌細胞に対して増殖を抑制する活性を有するとを見出した。

【0022】すなわち本発明は、以下に関する。

1. —般式 I ：

〔式 I中、

R¹はメチル基、 2—メトキシェチル基または式 I I

(式 I I中、 R ^{a 3}はメチル基、シクロプロピルメチル基またはシァノメチル基を意味する； R ^{a 1}は水素原子、フッ素原子または水酸基を意味する； R³²は、

1一ピロリジ-ル基、 1一ピぺリジニル基、 4一モルフォリュル基、ジメチルァミノ基またはジェチルァミノ基を意味する。）の何れかで表される基を意味する；

R²はシァノ基または式一 CONHR^a4 (式中、 R^a4は水素原子、 C — ₆アルキル基、 C ₃— ₈シクロアルキル基、 Ci— ₆アルコキシ基または C ₃— ₈シクロアルコキシ基を意味する。）で表される基を意味する；

R³は水素原子、メチル基、トリフルォロメチル基、塩素原子またはフッ素原子を意味する；

R⁴は水素原子、メチル基、ェチル基、 n—プロピル基、シクロプロピル基、 2 一チアゾリル基または 4—フルオロフェエル基を意味する。〕で表される化合物もしくはその塩またはそれらの水和物を有効成分とする C- Kit キナーゼ阻害剤。 2. R¹がメチル基である、 1記載の C- Kitキナ,ーゼ阻害剤。

3. R⁴がメチル基、ェチル基またはシクロプロピル基である 1または 2記載の c- Kitキナーゼ阻害剤。

4. R ³が水素原子、塩素原子またはフッ素原子である 1〜 3いずれか 1に記載の C- Kitキナーゼ阻害剤。

5. R²が式一 CONHR^a4 (式中、 R^a4は水素原子またはメトキシ基を意味する。）で表される基である、 1〜4いずれか 1に記載の c-Kit キナーゼ阻害剤。

6 · 一般式 Iで表される化合物が、

(1) 4一（3—クロロー 4— (シクロプロピノレアミノカノレポ-ノレ）ァミノフエノキシ）一 7—メトキシー 6—キノリンカルポキサミド、

(2) 4一（3—クロロー 4一（ェチルァミノカルボ-ル）アミノフエノキシ）一 7—メトキシー 6 _キノリンカ， .'キサミド、 -

(3) N6—メトキシー 4一（3—クロロー 4一 ( ( (シクロプロピルァミノ）カルボニル）ァミノ）フエノキシ）一 7—メトキシー 6—キノリンカルボキサミドおよび

(4) N6—メトキシー 4— (3—クロロー 4一 ( ( (ェチルァミノ）力ルポ二ル）ァミノ）フエノキシ）一 7—メトキシー 6—キノリンカルボキサミドからなる群から選ばれるいずれか 1の化合物である、 1〜 5いずれか 1に記載の c-Kitキナーゼ阻害剤。

7. 1〜 6いずれか 1に記載の C- Kit キナーゼ阻害剤を有効成分とする、 c -

Kitキナーゼを過剰発現する、または変異型 c-Kitキナーゼを発現する癌を治療する抗癌剤。

8 . c-Kitキ ^ "一ゼを過剰発現する、または変異型 c- Kitキナーゼを発現する癌が、急性骨髄性白血病、肥満細胞性白血病、小細胞肺癌、 GIST、睾丸腫瘍、卵巣癌、乳癌、脳腫瘍、神経芽細胞腫または大腸癌である 7に記載の抗癌剤。 9 . C- Kitキナーゼを過剰発現する、または変異型 C- Kitキナーゼを発現する癌が、急性骨髄性白血病、小細胞肺癌または GISTである 7に記載の抗癌剤。

1 0 . 患者から取り出した癌細胞が c_Kit キナーゼを過剰発現する、または変異型 c - Kit キナーゼを発現することを確認した後に投与することを特徴とする、 7〜 9いずれか 1に記載の抗癌剤。

1 1 . 1 ~ 6いずれか 1に記載の C- Kit キナーゼ阻害剤を有効成分とする、肥満細胞症、ァレルギ一または喘息の治療剤。

1 2 . c-Kitキナーゼを過剰発現する、または変異型 c- Kitキナーゼを発現する癌を治療する抗癌剤の製造のための、 1〜6いずれか 1に記載の c- Kit キナーゼ阻害剤の使用。

1 3 . C- Kitキナーゼを過剰発現する、または変異型 c- Kitキナーゼを発現する癌が、急性骨髄性白血病、 J巴満細胞性白血病、小細胞肺癌、 GIST、睾丸腫瘍、卵巣癌、乳癌、脳腫瘍、神経芽辄〜 Jまたは大腸癌である、 1 2に記載の使用。 1 4 . c-Kitキナーゼを過剰発現する、または変異型 c- Kitキナーゼを発現する癌が、急性骨髄性白血病、小細胞肺癌または GIST である、 1 2に記載の使用。 1 5 . 肥満細胞症、アレルギーまたは喘息の治療剤の製造のための、 1〜6レヽずれか 1に記載の c-Kitキナーゼ阻害剤の使用。

【0 0 2 3】強い c- Kitキナーゼ阻害活性を示す化合物が見出され、 c-Kitキナーゼの活性化が原因と考えられる、ある種の癌の癌化や悪性化を抑制する治療剤、あるいは c - Kit キ "一ゼが原因と考えられる Mastocytosis アレルギー、喘息などの疾患に対する治療剤が可能となつた。

図面の簡単な説明【0 0 2 4】図 1は、 SCF刺激によるリン酸化 C- Kitキナーゼのィムノブ口ットの結果を示した図である。

【0 0 2 5】図 2は、 H562 をヌードマウスに移植した場合の、移植後の日数と主要体積の関係を示したグラフである。

【0 0 2 6】図 3は、 H562 をヌードマウスに移植した場合の、リン酸化 c- Kit キナーゼ、 C- Kit キナーゼおよび |3—ァクチンのィムノプロットの結果を示した図である。

発明を実施するための最良の形態

【0 0 2 7】以下に本発明の実施の形態について説明する。

【0 0 2 8】本明細書中においては、化合物の構造式が便宜上一定の異性体を表すことがあるが、本発明には化合物の構造上生ずる全ての、幾何異性体、不斉炭素に基づく光学異性体、立体異性体、互変異性体などの総ての異性体および異性体混合物を含み、便宜上の式の記載に限定されるものではない。また、本発明化合物が生体内で酸化、還元、加水分解、抱合などの代謝を受けてなお所望の活性を示す化合物をも包含し、さらに本発明は生体内で酸化、還元、加水分解などの代謝を受けて本発明化合物を生成する化合物をも包含する。さらに、水をはじめとする溶媒和物も本発明に含ま ' ―'。

【0 0 2 9】本明細書中において — ₆アルキル基」とは、炭素数 1 ~ 6の直鎖もしくは分枝鎖状のアルキル基を示し、具体的には例えばメチル基、ェチル基、 n—プロピル基、 i 一プロピル基、 n—ブチル基、 i 一プチル基、 s e c— プチノレ基、 tーブチノレ基、 n—ペンチノレ基、 i—ペンチノレ基、 s e c—ペンチノレ基、 t一ペンチル基、ネオペンチル基、 1一メチルブチル基、 2—メチルプチル基、 1 ， 1ージメチルプロピル基、 1 , 2—ジメチルプロピル基、 n—へキシル基、 i —へキシル基、 1—メチルペンチル基、 2—メチルペンチル基、 3—メチルペンチル基、 1 , 1ージメチルブチル基、 1 ， 2—ジメチルブチル基、 2， 2 ージメチルブチル基、 1 ， 3—ジメチルブチル基、 2 , 3—ジメチルプチル基、 3 , 3—ジメチルブチル基、 1一ェチルブチル基、 2—ェチルプチル基、 1， 1， 2—トリメチルプロピル基、 1， 2， 2—トリメチルプロピル基、 1ーェチルー 1ーメチルプロピル基、 1ーェチルー 2—メチルプロピル基などが挙げられ、好ましくは、メチル基、ェチル基、 n—プロピル基、 i 一プロピル基、 n一プチル基、 i 一ブチル基、 s e c—プチル基、 t一ブチル基、 n—ペンチル基、 i ーぺンチノレ基、 s e c—ペンチノレ基、 t一ペンチ/レ基、ネオペンチノレ基、 1ーメチノレプチノレ基、 2—メチ Λ ^プチノレ基、 1 , 1ージメチノレプロピ /レ基、 1 , 2—ジメチルプロピル基、 n—へキシル基、 i 一へキシル基であり、より好ましくは、メチル基、ェチル基、 n—プロピル基、 i一プロピル基、 n—プチル基、 i 一ブチル基、 s e c—プチノレ基、 t一ブチル基、 n—ペンチノレ基、 i—ペンチノレ基、 s e c—ペンチル基、 t一ペンチル基、ネオペンチル基、 1一メチルプチル基、 2 - メチルブチル基、 1， 1ージメチルプロピル基、 1， 2—ジメチルプロピル基、さらに好ましくはメチル基、ェチル基、 n—プロピル基、 i一プロピル基、 n— ブチル基、 i 一ブチル基、 s e c—プチル基、 t一プチル基であり、もっとも好ましくはメチル基、ェチル基、 n—プロピル基、 i一プロピル基である。

【0 0 3 0】本明細書中において「C ₃一 ₈シクロアルキル基」とは、炭素数 3 〜 8の環状のアルキル基を意味し、二.本的には例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロへキシル基が挙げられる。好ましくはシクロプロピル基である。 , 【0 0 3 1】本明細書中において「0 ^ 6アルコキシ基」とは、酸素原子に前記「〇卜₆アルキル基」が結合した置換基を意味し、具体的には例えばメトキシ基、エトキシ基、 n—プロポキシ基、 i—プロポキシ基、 n—ブトキシ基、 i一ブトキシ基、 s e c—ブトキシ基、 t一ブトキシ基、 n—ペンチノレォキシ基、 i 一ペンチノレォキシ基、 s e c一ペンチルォキシ基、 t一ペンチルォキシ基、ネオペンチノレォキシ基、 1ーメチノレプトキシ基、 2—メチノレブトキシ基、 1， 1ージメチルプロポキシ基、 1 ， 2—ジメチルプロポキシ基、 n—へキシルォキシ基、 i 一へキシルォキシ基、 1ーメチルペンチルォキシ基、 2—メチルペンチルォキシ基、 3—メチルペンチルォキシ基、 1， 1ージメチルブトキシ基、 1， 2—ジメチルブトキシ基、 2， 2—ジメチルブトキシ基、 1， 3—ジメチルブトキシ基、 2 , 3—ジメチルプトキシ基、 3 , 3—ジメチルブトキシ基、 1ーェチルブトキシ基、 2—ェチルブトキシ基、 1 , 1， 2—トリメチルプロポキシ基、 1， 2 , 2 _トリメチルプロポキシ基、 1—ェチル一 1—メチルプロポキシ基、 1—ェチルー 2—メチルプロポキシ基などが挙げられ、好ましくはメトキシ基、エトキシ基、 n—プロポキシ基、 i一プロポキシ基、 n—ブトキシ基、 i一ブトキシ基、 s e c—ブトキシ基、 t一ブトキシ基、 n—ペンチルォキシ基、 i—ペンチルォキシ基、 s e c一ペンチルォキシ基、 t一ペンチノレォキシ基、ネオペンチ/レオキシ基、 1一メチルブトキシ基、 2 _メチルブトキシ基、 1 , 1ージメチルプロボキシ基、 1， 2—ジメチルプロポキシ基、 n—へキシルォキシ基、 i —へキシルォキシ基であり、より好ましくはメトキシ基、エトキシ基、 n—プロポキシ基、 i 一プロポキシ基、 n—ブトキシ基、 i 一ブトキシ基、 s e c—ブトキシ基、 t —プトキシ基、 n—ペンチノレォキシ基、 i 一ペンチルォキシ基、 s e c—ペンチノレォキシ基、 t—ペンチルォキシ基、ネオペンチルォキシ基、 1—メチルブトキシ基、 2—メチルブトキシ基、 1 , —ージメチルプロポキシ基、 1， 2 _ジメチルプロポキシ基、さらに好ましくはメトキシ基、エトキシ基、 n—プロポキシ基、 i 一プロポキシ基、 n—ブトキシ基、 iープトキシ基、 s e c—プトキシ基、 t —ブトキシ基、もっとも好ましくはメトキシ基、エトキシ基、 n—プロポキシ基、 i—プロポキシ基である。

【0 0 3 2】本明細書中において「C ₃一 ₈シクロアルコキシ基」とは、炭素数 3〜 8の環状のアルコキシ基を意味し、具体的には例えば、シクロプロポキシ基、シクロブトキシ基、シクロペンチルォキシ基、シクロへキシルォキシ基が挙げられる。好ましくはシクロプロポキシ基である。

【0 0 3 3】本発明にかかる一般式 Iで表される化合物は、 W0 02/32872 に記載の方法によって製造することができる。

【0 0 3 4】本明細書中において「薬理学的に許容できる塩」としては、特に種類は限定されないが、たとえば塩酸塩、硫酸塩、炭酸塩、重炭酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩などの無機酸の付加塩；酢酸塩、マレイン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、トリフルォロ酢酸塩などの有機カルボン酸の付加塩；メタンスルホン酸塩、ヒドロキシメタンスルホン酸塩、ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、タウリン塩などの有機スルホン酸の付加塩；トリメチルァミン塩、トリェチルァミン塩、ピリジン塩、プロ力イン塩、ピコリン塩、ジシクロへキシルァミン塩、 N, N，一ジベンジルエチレンジアミン塩、 N—メチルダルカミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールァミン塩、トリス（ヒドロキシメチルァミノ）メタン塩、フエネチルベンジルァミン塩などのァミンの付加塩；アルギニン塩、リジン塩、セリン塩、グリシン塩、ァスパラギン酸塩、グルタミン酸塩などのアミノ酸の付加塩などを挙げることができる。

【0 0 3 5】本努明に係る医薬の投与量は症状の程度、年齢、性別、体重、投与形態、疾患の種類などにより異なるが、通常成人 1日当たり 100 /z _g〜10 gであり、 1〜数回に分けて投与され

【0 0 3 6】本発明に係る医薬の投与形態は特に限定されず、通常用いられる方法により経口または非経口的に投与することができる。

【0 0 3 7】これら製剤化には通常用いられる賦形剤，結合剤，滑沢剤，着色剤，矯味矯臭剤など、および必要により安定化剤，乳化剤，吸収促進剤，界面活性剤などを使用することができ、一般に医薬品製剤の原料として用いられる成分を配合して常法により製剤化される。

【0 0 3 8】これらの成分としては例えば、動植物油（大豆油、牛脂、合成グリセライドなど）、炭化水素（流動パラフィン、スクヮラン、固形パラフィンなど）、エステル油（ミリスチン酸オタチルドデシル、ミリスチン酸ィソプロピルなど）、高級アルコール（セトステアリルアルコール、ベへニルアルコールなど）、シリコン樹脂、シリコン油、界面活性剤（ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシェチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ひまし油、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマーなど）、水溶性高分子（ヒドロキシェチルセルロース、ポリアクリル酸、カルポキシビュルポリマー、ポリエチレングリコーゾレ、ポリビニノレピロリドン、メチ /レセノレロースなど）、ァノレコール（エタノール、イソプロパノールなど）、多価アルコール（グリセリン、プロピレンダリコール、ジプロピレングリコール、ソルビトールなど）、糖（ダルコース、ショ糖など）、無機粉体（無水ケィ酸、ケィ酸アルミニウムマグネシウム、ケィ酸アルミニウムなど）、精製水などが挙げられる。 p H調製のためには無機酸（塩酸、りん酸など）、無機酸のアルカリ金属塩（りん酸ナトリウムなど）、無機塩基（水酸化ナトリウムなど）、有機酸（低級脂肪酸、クェン酸、乳酸など）、有機酸のアルカリ金属塩（タエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウムなど）、有機塩基（アルギニン、エタノールァミンなど）などを用いることができる。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤などを添加することができる。

[実施例]

【0 0 3 9】以下に、具体的な例をもって本発明を示すが、本発明はこれに限られるものではない。

【0 0 4 0】 [実施例 1 ] SCF刺激の細胞増殖に対する影響

【0 0 4 1】 c- Kit キナーゼを発現している小細胞肺癌細胞株 H526 (ATCC より購入、 CRL-5811) の増殖に対する下記の化合物 1、化合物 2、化合物 3およぴ化合物 4の影響を調べた。

化合物 1 ： 4一（3—クロロー 4一（シクロプロピルアミノカ^/ポニル）ァミノフエノキシ）一 7—メトキシー 6—キノリンカルポキサミド

化合物 2 ： 4 - ( 3—クロロー 4一（ェチルァミノカルボニル）アミノフエノキシ）一 7—メトキシー 6—キノリンカルポキサミド

化合物 3 ： N 6—メトキシー 4一（3—クロロー 4— ( ( (シクロプロピルアミノ）カルボニル）ァミノ）フエノキシ）一 7—メトキシー 6—キノリンカルボキサミド

化合物 4 ： N 6—メトキシー 4一（3—クロ口 _ 4一 ( ( (ェチノレアミノ）カルボニル）ァミノ）フエノキシ）一 7—メトキシー 6—キノリンカルボキサミド【0 0 4 2】化合物 1〜 4の'構造式を以下に示す。

化合物: 化合物 2

化合物 3 化合物 4

【0 0 4 3】化合物 1は W0 02/32872 の実施例 368 に記載の方法に従って製造した。化合物 2は W0 02/32872の実施例 583に記載の方法に従って製造した。化合物 3は W0 02/32872の実施例 417に記載の方法に従って製造した。化合物 4 は TO 02/32872の実施例 702に記載の方法に従って製造した。

【0 0 4 4】 H526は、 10% FCS (Cell Culture Technologies社より購入）を含む RPMI 1640 培地（日水製薬株式会社製）で 5% C0₂インキュベーター（3 7 °C) で培養した。培養後、 H526細胞を PBS で 3回洗诤し、 0. 1°/。 BSA (Sigma 社製）を含む RPMI 1640培地（以下、 BSA-RPMI1640) で 1. 0 x I0⁵ cells/ml に懸濁し、この細胞懸濁液を 50μ 1 づっ丸底 96 ゥェルプレートに播種して、 5% C0₂インキュベーター（3 7°C) で一晚培養した。ー晚培養後、 200 ng/ml SCF (R & D 社製）を含む BSA- RPMI1640 50 1、及び希釈した被検物質を含む BSA- RPMI1640 100 1を添加した。

【0 0 4 5】被検物質添加開始日より 7日目に、 Cell Counting Kit- 8 (同仁学研究所製） 20μ 1 を加え、 5% C0₂インキュベーター（3 7°C) で約 2時間培養した。発色後、測定波長 450 nm、対照波長 660 nmで各ゥエルの吸光度をプレートリーダー MTP-32 (コロナ電気社製）を用いて測定した。各ゥエルの吸光度を SCF を添加していないゥエルの吸光度で引き、被検物質を添加していないゥエルの吸光度に対する、被検物質を添加したゥエルの吸光度の比を求め、この比の値から細胞増殖を 50 %阻害するのに必要な被検物質の濃度（IC₅。）を求めた。【0 04 6】その結果下表に示す通り、化合物 1、化合物 2、化合物 3及ぴ化合物 4は、 SCFで刺激される細胞増殖を抑制し、 c-Kit キナーゼ阻害活性を有していると考えられた。また、久保和生ら、第 22 回メディシナルケミストリーシンポジゥム講演要旨集 p275- 277, 2P-320, 2002 に記載の化合物 KRN633 の IC₅。は 301 nMで、化合物 1、化合物 2、化合物 3及び化合物 4と比較して、弱い活性しか示さなかった。また、 c - K]' 、ナーゼ阻害剤として知られる STI571 の IC₅₀は 190 nMであった。

【0 04 7】

[表 1 ]

化合物 I c₅₀ (nM)

化合物 1 9. 3 6

化合物 2 1 2. 8

化合物 3 2 1 4

化合物 4 5 6. 3

【0 04 8】 [実施例 2 ] SCF刺激よる c - Kitキナーゼリン酸化に対する化合物 1の影響【0 0 4 9】 c- Kitキナーゼ発現小細胞肺癌細胞株 H526細胞 c- Kitキナーゼ分子の、 SCF刺激によるリン酸化に対する化合物 1の影響を調べた。

【0 0 5 0】 H526は、 10% FCSを含む RPMI1640培地で 5% C0₂インキュベータ一 ( 3 7 °C ) で培養した。培養後、 H526 細胞を PBS で 3 回洗浄し、 BSA - RPMI1640で 5. 0 X 10⁵ cells/mlに懸濁し、この細胞懸濁液を 1 mlづっ 24 ゥェルプレートに播種して、 5% C0₂インキュベーター（3 7 °C) で 6時間培養した。 6時間培養後、希釈した被検物質を含む BSA- RPMI1640 1 ml を添加し 5% C0₂ィンキュベータ一（3 7 °C) で 1時間培養した後、 10 g/ml SCF (R & D 社製） 10 Ai l を添加して、 5% C0₂インキュベーター（3 7 °C) で更に 5分間培養した。 5分間培養後、 PBS で洗浄し、 SDS サンプルローデイングバッファー ΙΟΟ μ 1 を添加して cell lysate サンプルを調整し、 94°C · 10 分間熱処理を行った後一 20°Cで凍結保存した。

【 0 0 5 1】その後、 cell lysate サンプノレ 20 μ 1 を 4-20% gradient polyacrylamide gel (第一化学薬品株式会社製）で電気泳動を行った。泳動後、 PVDF membrane (Araersham pharmacia biotech 社製）に 3時間で卜ランスファ一し、トランスファーしたメンプレンを、 1次抗体として phospho- c-kit (Tyr719) antibody (Cell Sign 一- 社製）、 2次抗体として anti- rabbit IgG, HRP- linked antibody (Cell Signaling社製）を用いてィムノブロットを行った。メンプレンを洗浄後、 Super Signal (PIERCE社製）で発色させた。

【0 0 5 2】その結果、図 1に示す通り、 SCF非存在下では c- Kitキぅ ^一ゼはリン酸化されず（一番左のレーン）、 SCFの存在下で起こる c- Kitキナーゼのリン酸化は、化合物 1の添加により濃度依存的に抑制された。 c-Kit キナーゼ阻害剤として知られる STI571 のリン酸化阻害活性は化合物 1の約 1 / 1 0であった。

【0 0 5 3】 [実施例 3 ] ヌードマウスに移植した H562腫瘍増殖に対する化合物 1の影響

【0 0 5 4】 H526は、 10°/。 FCSを含む RPMI1640培地で 5°/。 C0。インキュベータ一（3 7 °C) で培養した。培養液を回収後、 PBSで 2回洗浄し、 PBSで 5. 0 X 10⁷ cells/ml に懸濁した。この細胞懸濁液を 6週齢の雌 Balbん nu/nu mice (チヤールズリバ一社より購入）の右脇腹皮下部に 0. 1 ml で移植した。移植後、腫瘍体積が約 150 mm³になった時点から、被検物質の投与を開始し、 1日 2回、 1 4 日間の経口投与を行った。被検物質は 0. 1 ml/10 g体重の投与量になるように、 0, 5%メチルセルロース（和光純薬工業株式会社製）溶液に懸濁した。 .

【0 0 5 5】投与期間中に、 1週間に 2回、腫瘍体積をキヤリ.パーで測定した。腫瘍体積はキヤリパーで腫瘍の長径と短径を測定し、 1/2 X長径 X短径 X短径で計算した。なお、実験はビークルコントロール群（溶媒投与群）を 10 匹、被検物質投与群を 1群 5匹で行った。

【0 0 5 6】その結果、図 2に示す通り、化合物 1は用量依存的にヌ一ドマゥスに移植した H526腫瘍の増殖を抑制した。また、 c- Kit キナーゼ阻害剤として知られる STI571は 160 mg/kgの投与においても殆ど抗腫瘍効果を示さなかった。【0 0 5 7】 [実施例 4 ] ヌードマウスに移植した H562腫瘍増殖の c- Kit リン酸化に対する化合物 1の影響

【0 0 5 8】 5. 0 X 10⁷ cells/ml の濃度に調製した H526の細胞懸濁液 0. 1 ml を、 6週齢の雌 Balbん nu/nu mi„ ：チャールズリバ一社より購入）の右脇腹皮下部に移植した後、腫瘍体積が 300〜1000 匪³になった時点で、ビークルコントロール群（溶媒投与群）と被検物質投与群に分けて被検物質の投与を行った。摘出した腫瘍を cell lysate buffer (50 mM HEPES (pH7. 4) , 150 mM NaCl, 10% gycerol, 1% Triton X_100， 1. 5 mM MgCl₂， 1 raM EDTA, 100 mM NaF, 1 mM PMSF, 10 μ g/ml aprotinin, 50 μ g/ml leupeptin, 1 μ g/ml peptatin A, 1 mM Na₃V0₄, 25 mM β -glycerophosphate, phophatase inhibitor cocktail II ) に入れてホモジナイズした。遠心した後に上清をタンパク定量し、 3 X SDS サンプノレローデイングバッファーを添加して cell lysate サンプルを作った。その後、 cell lysateサンプルを 94°C · 10分間熱処理をし、 - 20°Cで凍結保存した。【0 0 5 9】その後、タンパク量として 30 / g相当の cell lysate サンプルを 4-20% gradient polyacrylaraide gel (第一化学薬品株式会社製）で電気泳動を行つ 7"こ。泳動後、 PVDF membrane (Amersham pharmacia biotech 社製) に 3時間でトランスファーした。リン酸化 c - Kit、 c- Kit及び ]3ァクチンを定量するために、それぞれ、 phospho-c-kit (Tyr719) antibody (Cell Signaling 社製）、抗 c- Kit抗体（Cell Signaling社製）及ぴ抗 j8ァクチン抗体（Sigma社製）を 1次抗体として用い、 anti - rabbit IgG, HRP- linked antibody (Cell Signaling社製）を 2次抗体として用いてィムノプロットを行った。メンプレンを洗浄後、 Super Signal (PIERCE社製）で発色させた。

【0 0 6 0】その結果、図 3に示すように、化合物 1は 30, 100 mg/kg 投与で腫瘍組織におけるリン酸化 C- Kitの量を減少させたが、 C- Kit及び i3ァクチンの量は変化させなかった。化合物 1が 30， 100 rag/kg投与で完全なリン酸化の抑制を示したのに対し、 C- Kit キナーゼ阻害剤として知られる STI571 は 160 rag/kgでも部分的な抑制しか示さなかった。

【0 0 6 1】このことから、ィ匕合物 1は c- Kit の in vivo でのリン酸ィ匕を抑制することが示され、化合物 1は in vivo においても _c- Kit キナーゼの活性を抑制し、抗腫瘍活性を示している -—が確認された。

産業上の利用可能性

【0 0 6 2】一般式 Iで表される化合物が強い C- Kit キナーゼ阻害活性を示し、 in vitro及び in vivo で、 c- Kit キナーゼが活性化した癌細胞の増殖を抑制することが見出された。したがって、一般式 Iで表される化合物は、 c - Kit キナーゼの活性化により悪性化した癌に対する抗癌剤として利用可能であることが明らかとなった。また、一般式 Iで表される化合物を有効成分として含有する C- Kitキナーゼ阻害剤は、 c- Kitキ ~ "一ゼが原因と考えられる Mastocytosis 了レルギ一、喘息などの疾患に対する治療剤としても有効であることが示唆される。

Claims

請求の範函

-般式 I

〔式 I中、

R¹はメチル基、 2—メトキシェチル基または式 I I

(式 I I中、 R ^{a 3}はメチル基、シクロプロピルメチル基またはシァノメチル基を意味する； R^{a l}は水素原子、フッ素原子または水酸基を意味する； R^{a 2}は、 1一ピロリ.ジニル基、 1—ピペリ，ノレ基、 4—モルフオリニル基、ジメチルァミノ基またはジェチルァミノ基を意味する。）の何れかで表される基を意味する；

R²はシァノ基または式 _CONHR^a4 (式中、 R^a4は水素原子、〇 ₆アルキル基、 C₃— ₈シクロアルキル基、アルコキシ基または C₃— ₈シクロアルコキシ基を意味する。）で表される基を意味する；

R⁴は水素原子、メチル基、ェチル基、 n—プロピル基、シクロプロピル基、 2 一チアゾリル基または 4一フルオロフニル基を意味する。〕で表される化合物もしくはその塩またはそれらの水和物を有効成分とする c - Kit キナーゼ阻害剤。

2. R ¹がメチル基である、請求項 1記載の c-Kitキナーゼ阻害剤。

3. R ⁴がメチル基、ェチノレ基またはシクロプロピル基である請求項 1または 2記載の c-Kitキナーゼ阻害剤。

4. R ³が水素原子、塩素原子またはフッ素原子である請求項 1〜 3いずれか 1項に記載の C- Kitキナーゼ阻害剤。

5. R²が式 _CONHR^a4 (式中、 R^a4は水素原子またはメトキシ基を意味する。）で表される基である、請求項 1〜4いずれか 1項に記載の C- Kit キナーゼ阻害剤。

6. 一般式 Iで表される化合物が、

(1) 4一（3—クロロー 4一（シクロプロピルアミノカルボ-ル）ァミノフエノキシ）一 7—メトキシー 6—キノリンカポキサミド、

(2) 4一（3—クロロー 4一（ェチルァミノカルボニル）アミノフエノキシ）一 7—メトキシー 6—キノリンカルボキサミド、

(3) Ν6—メトキシー 4一（3—クロロー 4— ( ( (シクロプロピルァミノ）力ルポニル）ァミノ）フエノキシ）一 7—メトキシー 6—キノリンカルポキサミドおよび

(4) Ν6—メトキシー 4— (3—クロロー 4_ ( ( (ェチルァミノ）力ルポ二ル）ァミノ）フエノキシ）一 7—メトキシー 6—キノリンカルポキサミドからなる群から選ばれるいずれか 1の化合物である、請求項 1〜5いずれか 1項に記載の c- Kitキナーゼ阻害剤。

7. 請求項 1~6いずれか 1項に記載の c-Kit キナーゼ阻害剤を有効成分とする、 c-Kitキナーゼを過剰発現する、または変異型 c-Kitキナーゼを発現する癌を治療する抗癌剤。

8. c- Kitキ^ "一ゼを過剰発現する、または変異型 c-Kitキナーゼを発現する癌が、急性骨髄性白血病、肥満細胞性白血病、小細胞肺癌、 GIST、睾丸腫瘍、卵巣癌、乳癌、脳腫瘍、神経芽細胞腫または大腸癌である請求項 7に記載の抗癌剤。

9 . C- Kitキナーゼを過剰発現する、または変異型 _C- Kitキナーゼを発現する癌が、急性骨髄性白血病、小細胞肺癌または GIST である請求項 7に記載の抗癌剤。

1 0 . 患者から取り出した癌細胞が c- Kit キナーゼを過剰発現する、または変異型 c- Kit キナーゼを発現することを確認した後に投与することを特徴とする、請求項 7〜 9いずれか 1項に記載の抗癌剤。

1 1 . 請求項 1〜 6いずれか 1項に記載の C- Kit キナーゼ阻害剤を有効成分とする、肥満細胞症、アレルギーまたは喘息の治療剤。

1 2 . c - Kitキナーゼを過剰発現する、または変異型 c-Kitキナーゼを発現する癌を治療する抗癌剤の製造のための、請求項 1〜 6いずれか 1項に記載の c-Kitキナーゼ阻害剤の使用。

1 3 . c-Kitキナーゼを過剰発現する、または変異型 c-Kitキナーゼを発現する癌が、急性骨髄性白血病、肥満細胞性白血病、小細胞肺癌、 GIST、睾丸腫瘍、卵巣癌、乳癌、脳腫瘍、神経芽細胞腫または大腸癌である、請求項 1 2に記載の使用。

1 4 . c-Kitキナーゼを過剰発現する、または変異型 c-Kitキナーゼを発現する癌が、急性骨髄性白血病、小細胞肺癌または GIST である、請求項 1 2に記載の使用。

1 5 . 肥満細胞症、アレルギーまたは喘息の治療剤の製造のための、請求項 1〜 6いずれか 1項に記載の C- Kitキナーゼ阻害剤の使用。