JPH0923885A - 遺伝子発現ライブラリー及びその製造法 - Google Patents
遺伝子発現ライブラリー及びその製造法Info
- Publication number
- JPH0923885A JPH0923885A JP7176103A JP17610395A JPH0923885A JP H0923885 A JPH0923885 A JP H0923885A JP 7176103 A JP7176103 A JP 7176103A JP 17610395 A JP17610395 A JP 17610395A JP H0923885 A JPH0923885 A JP H0923885A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cdna
- protein
- expression library
- affinity
- library
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Abstract
(57)【要約】
【課題】 未知の蛋白質を見出す物質起源として、すべ
てのｃＤＮＡクローンが同じ割合で含まれる発現ライブ
ラリーを提供する。このライブラリーより医薬として利
用できる物質を選択する。 【解決手段】 蛋白質の翻訳領域を含んだ均一化したモ
ジュール構造含有ライブラリーをフィラメンタスファー
ジなどで構築し、発現した蛋白質をバイオパニングや酵
母の２ハイブリッド・システムで所望のクローンを選択
する。
てのｃＤＮＡクローンが同じ割合で含まれる発現ライブ
ラリーを提供する。このライブラリーより医薬として利
用できる物質を選択する。 【解決手段】 蛋白質の翻訳領域を含んだ均一化したモ
ジュール構造含有ライブラリーをフィラメンタスファー
ジなどで構築し、発現した蛋白質をバイオパニングや酵
母の２ハイブリッド・システムで所望のクローンを選択
する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子ライブラリーに
関し、特に様々な確率で存在するメッセンジャーＲＮＡ
（ｍＲＮＡ）の割合を均一化した相補的ＤＮＡ（ｃＤＮ
Ａ）がファージベクター表面に融合蛋白質ないし単一蛋
白質として発現する発現ライブラリーに関する。
関し、特に様々な確率で存在するメッセンジャーＲＮＡ
（ｍＲＮＡ）の割合を均一化した相補的ＤＮＡ（ｃＤＮ
Ａ）がファージベクター表面に融合蛋白質ないし単一蛋
白質として発現する発現ライブラリーに関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子ライブラリーに関しては、種々の
作製技術が知られている。更に、構造遺伝子をコ−ドし
ている遺伝子を対象として、発現しているｍＲＮＡを相
補的にＤＮＡ化する逆転写酵素などでｃＤＮＡを作製
し、カタログ化を図ることはやられている。ライブラリ
ー化に関しても、ライブラリーよりクローンを選択する
手段の対象がＤＮＡ、ＲＮＡまたは発現蛋白質により、
それぞれベクターが選択されている。
作製技術が知られている。更に、構造遺伝子をコ−ドし
ている遺伝子を対象として、発現しているｍＲＮＡを相
補的にＤＮＡ化する逆転写酵素などでｃＤＮＡを作製
し、カタログ化を図ることはやられている。ライブラリ
ー化に関しても、ライブラリーよりクローンを選択する
手段の対象がＤＮＡ、ＲＮＡまたは発現蛋白質により、
それぞれベクターが選択されている。
【０００３】ｍＲＮＡの割合を均一化しライブラリー化
しようという試みも、近年行われている。例えば、Mino
ru S.H.Ko はマウス線維芽様細胞 Ltk-細胞からｍＲＮ
Ａを得、ｃＤＮＡ化後、均一化サイクルと呼ばれる、一
本鎖ｃＤＮＡと二本鎖ｃＤＮＡの分離さらに一本鎖ｃＤ
ＮＡのＰＣＲ法により、二本鎖ｃＤＮＡの変性・再会合
を行うことで細胞のｍＲＮＡのサブトラクション（重複
しているｍＲＮＡ分子を差し引くすること）処理を行う
ことでｃＤＮＡ均一化ライブラリーＤＮＡを得、ローン
・リンカーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）
により増幅を行い、プラスミドベクターへ導入しライブ
ラリーを構築している。（Nucleic Acids Res.,18 p570
5-5711,1990)
しようという試みも、近年行われている。例えば、Mino
ru S.H.Ko はマウス線維芽様細胞 Ltk-細胞からｍＲＮ
Ａを得、ｃＤＮＡ化後、均一化サイクルと呼ばれる、一
本鎖ｃＤＮＡと二本鎖ｃＤＮＡの分離さらに一本鎖ｃＤ
ＮＡのＰＣＲ法により、二本鎖ｃＤＮＡの変性・再会合
を行うことで細胞のｍＲＮＡのサブトラクション（重複
しているｍＲＮＡ分子を差し引くすること）処理を行う
ことでｃＤＮＡ均一化ライブラリーＤＮＡを得、ローン
・リンカーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）
により増幅を行い、プラスミドベクターへ導入しライブ
ラリーを構築している。（Nucleic Acids Res.,18 p570
5-5711,1990)
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】未知の蛋白質を見つけ
出す方法として、まず発現しているｍＲＮＡをすべてカ
タログ化したｃＤＮＡライブラリーをその見つける物質
起源として、更に、発現している蛋白質の機能面を調べ
られるスクリーニングにかけられるものとして構築し、
これより種々のスクリーニング法、特にin vivo での蛋
白質などとの相互作用を見ることにより、医薬として利
用できる物質を選び出せるものはなかった。
出す方法として、まず発現しているｍＲＮＡをすべてカ
タログ化したｃＤＮＡライブラリーをその見つける物質
起源として、更に、発現している蛋白質の機能面を調べ
られるスクリーニングにかけられるものとして構築し、
これより種々のスクリーニング法、特にin vivo での蛋
白質などとの相互作用を見ることにより、医薬として利
用できる物質を選び出せるものはなかった。
【０００５】先に述べた、Minoru S.H.Ko のライブラリ
ーでは、ｍＲＮＡの重複を防ぐ点から、３’側に限定し
たｃＤＮＡが含まれており、構造遺伝子の部分がすべて
含まれているわけではなく、発現蛋白質をin vivo に近
い状態でスクリーニングすることはできない。
ーでは、ｍＲＮＡの重複を防ぐ点から、３’側に限定し
たｃＤＮＡが含まれており、構造遺伝子の部分がすべて
含まれているわけではなく、発現蛋白質をin vivo に近
い状態でスクリーニングすることはできない。
【０００６】本発明は、in vivo での蛋白質などとの相
互作用を見ることが可能な、つまり自然に近い状態でス
クリーニングが可能で、更に、スクリーニングしやすく
かつすべてのスクリーニング対象が並べられている発現
ｃＤＮＡ均一化ライブラリーを提供することにある。
互作用を見ることが可能な、つまり自然に近い状態でス
クリーニングが可能で、更に、スクリーニングしやすく
かつすべてのスクリーニング対象が並べられている発現
ｃＤＮＡ均一化ライブラリーを提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】未知の蛋白質を見つける
方法は、次のような手段が考えられている。
方法は、次のような手段が考えられている。
【０００８】（１）ある生理機能を反映するスクリーニ
ング法を用いて、考えられる物質起源のものを選び、そ
の生理機能に影響を及ぼす物質を精製し、最終的に単離
する方法。（２）ある物質（レセプター、リガンド、酵
素及び抗体等）に親和性を示すものを生化学的・物理化
学的手段を用いて特定していく方法。（３）既知の蛋白
質のアミノ酸やそれをコードする遺伝子配列のホモロジ
ーを利用して、その蛋白質に近縁なファミリーを決定し
ていく方法。
ング法を用いて、考えられる物質起源のものを選び、そ
の生理機能に影響を及ぼす物質を精製し、最終的に単離
する方法。（２）ある物質（レセプター、リガンド、酵
素及び抗体等）に親和性を示すものを生化学的・物理化
学的手段を用いて特定していく方法。（３）既知の蛋白
質のアミノ酸やそれをコードする遺伝子配列のホモロジ
ーを利用して、その蛋白質に近縁なファミリーを決定し
ていく方法。
【０００９】本発明は、このうちとりわけ（２）のスク
リーニングを行う上で有力な、スクリーニング対象とな
り得るライブラリーを提供することにある。更に、単な
る物質の集団ではなく、すべてのスクリーニング対象が
並べられている発現ｃＤＮＡ均一化ライブラリーを提供
することにある。
リーニングを行う上で有力な、スクリーニング対象とな
り得るライブラリーを提供することにある。更に、単な
る物質の集団ではなく、すべてのスクリーニング対象が
並べられている発現ｃＤＮＡ均一化ライブラリーを提供
することにある。
【００１０】蛋白質をコードする動物個体の遺伝子は、
５〜１０万種類あるといわれており、そのｍＲＮＡは様
々な確率で存在することが知られている。例えば、細胞
骨格系を形成するアクチン遺伝子のｍＲＮＡはほとんど
の細胞において構成的発現により比較的大量にいつでも
存在している。更に、常時大量に必要とするアルブミン
等の蛋白質生産を担当する細胞では、それぞれのｍＲＮ
Ａを数多く重複している。一方、生体の生理機能は、ホ
メオスタシスを維持する因子の相互作用により調節され
ており、その因子のいくつかは、そのコードするｍＲＮ
Ａが極めて微量でかつ誘導されなければ存在し得ないも
のもある。
５〜１０万種類あるといわれており、そのｍＲＮＡは様
々な確率で存在することが知られている。例えば、細胞
骨格系を形成するアクチン遺伝子のｍＲＮＡはほとんど
の細胞において構成的発現により比較的大量にいつでも
存在している。更に、常時大量に必要とするアルブミン
等の蛋白質生産を担当する細胞では、それぞれのｍＲＮ
Ａを数多く重複している。一方、生体の生理機能は、ホ
メオスタシスを維持する因子の相互作用により調節され
ており、その因子のいくつかは、そのコードするｍＲＮ
Ａが極めて微量でかつ誘導されなければ存在し得ないも
のもある。
【００１１】今まで作られた多くのｃＤＮＡライブラリ
ーは、ｍＲＮＡ起源となる細胞のｍＲＮＡの量比を反映
しているか、目的とする蛋白質、つまりｍＲＮＡの分子
数を増やすため誘導がかかる処理を施した細胞から作ら
れたものであった。
ーは、ｍＲＮＡ起源となる細胞のｍＲＮＡの量比を反映
しているか、目的とする蛋白質、つまりｍＲＮＡの分子
数を増やすため誘導がかかる処理を施した細胞から作ら
れたものであった。
【００１２】これらの多くのｃＤＮＡライブラリーで
は、ある遺伝子をクローニングするのに存在確率の差に
より、機能が明らかでも特定が難しかったり、目的のも
のの誘導の差によりスクリーニングの規模が決まってし
まうという欠点があった。
は、ある遺伝子をクローニングするのに存在確率の差に
より、機能が明らかでも特定が難しかったり、目的のも
のの誘導の差によりスクリーニングの規模が決まってし
まうという欠点があった。
【００１３】この欠点を、克服するため、先に述べたMi
noru S.H.Ko の均一化ｃＤＮＡライブラリーが作られて
いる。この均一化ｃＤＮＡライブラリーは、その目的と
して、生物個体で発現している遺伝子のカタログ化する
ことによる遺伝子単離方法の劇的な単純化と、低い確率
でしか存在しない遺伝子（例えば、数コピー／細胞のｍ
ＲＮＡ）の単離手段を提供することであった。
noru S.H.Ko の均一化ｃＤＮＡライブラリーが作られて
いる。この均一化ｃＤＮＡライブラリーは、その目的と
して、生物個体で発現している遺伝子のカタログ化する
ことによる遺伝子単離方法の劇的な単純化と、低い確率
でしか存在しない遺伝子（例えば、数コピー／細胞のｍ
ＲＮＡ）の単離手段を提供することであった。
【００１４】しかし、このライブラリーは、ｍＲＮＡの
重複を均一化サイクル処理（ＰＣＲ法と二本鎖ｃＤＮＡ
の変性・再会合を行うことでｍＲＮＡのサブトラクショ
ンを行う。）で除くため、遺伝子でもその特長がはっき
りしている３’側の配列、つまり構造遺伝子が含まれな
い非翻訳領域のｃＤＮＡ配列で構築されている。一度こ
のライブラリーで目的の遺伝子をクローニングても、再
度、構造遺伝子を含む遺伝子ライブラリーを釣り上げた
クローンでスクリーニングし、完全長のものを得なくて
はいけない。更に、構造遺伝子部分の蛋白質をスクリー
ニングの対象とすることはできなかった。
重複を均一化サイクル処理（ＰＣＲ法と二本鎖ｃＤＮＡ
の変性・再会合を行うことでｍＲＮＡのサブトラクショ
ンを行う。）で除くため、遺伝子でもその特長がはっき
りしている３’側の配列、つまり構造遺伝子が含まれな
い非翻訳領域のｃＤＮＡ配列で構築されている。一度こ
のライブラリーで目的の遺伝子をクローニングても、再
度、構造遺伝子を含む遺伝子ライブラリーを釣り上げた
クローンでスクリーニングし、完全長のものを得なくて
はいけない。更に、構造遺伝子部分の蛋白質をスクリー
ニングの対象とすることはできなかった。
【００１５】蛋白質との親和性を指標として目的物質を
スクリーニングするため、構造遺伝子部分を含むｃＤＮ
Ａを発現させなくてはいけない。しかも、均一化ライブ
ラリーを発現させるためには、従来のような特定遺伝子
の効率的な発現を目的としたベクターでは発現の偏りが
できると考えられ不適当である。
スクリーニングするため、構造遺伝子部分を含むｃＤＮ
Ａを発現させなくてはいけない。しかも、均一化ライブ
ラリーを発現させるためには、従来のような特定遺伝子
の効率的な発現を目的としたベクターでは発現の偏りが
できると考えられ不適当である。
【００１６】多種類の遺伝子を均一に発現できる系とし
てG.S.Smith が報告している、フィラメンタスファージ
による蛋白質発現系が挙げられる。（Science, 228 p13
15-1317 ,1985) この系は、フィラメンタスファージのマイナー・コート
蛋白質の一部であるｐIII 蛋白質領域に他の遺伝子を挿
入して融合蛋白質として発現させるものである。この融
合蛋白質は、ｐIII 蛋白質の機能である大腸菌への感染
開始能が保たれているばかりでなく、ファージ体表に発
現され、その蛋白質固有の結合能（親和性）を保持して
いることが示された。（S.F.Parmley and G.P.Smith, G
ene, 73p305-318) 更に、この優れた性質を活かし、ランダムなアミノ酸配
列をコードする合成ＤＮＡ混合物を挿入することで、J.
K.Scott and G.P.Smith はランダムペプチドライブラリ
ーを作製している。(Science, 249 p386-390, 1990) 本発明の均一化発現ｃＤＮＡライブラリーには、構造遺
伝子部分を挿入したフィラメンタスファージによる蛋白
質発現系が用いることができる。このファージには、抗
体遺伝子の発現例（J.D.Marks ら，J.Mol.Biol., 222 p
581-597, 1991)で示されるように８００〜１，０００塩
基長の遺伝子が挿入可能である。
てG.S.Smith が報告している、フィラメンタスファージ
による蛋白質発現系が挙げられる。（Science, 228 p13
15-1317 ,1985) この系は、フィラメンタスファージのマイナー・コート
蛋白質の一部であるｐIII 蛋白質領域に他の遺伝子を挿
入して融合蛋白質として発現させるものである。この融
合蛋白質は、ｐIII 蛋白質の機能である大腸菌への感染
開始能が保たれているばかりでなく、ファージ体表に発
現され、その蛋白質固有の結合能（親和性）を保持して
いることが示された。（S.F.Parmley and G.P.Smith, G
ene, 73p305-318) 更に、この優れた性質を活かし、ランダムなアミノ酸配
列をコードする合成ＤＮＡ混合物を挿入することで、J.
K.Scott and G.P.Smith はランダムペプチドライブラリ
ーを作製している。(Science, 249 p386-390, 1990) 本発明の均一化発現ｃＤＮＡライブラリーには、構造遺
伝子部分を挿入したフィラメンタスファージによる蛋白
質発現系が用いることができる。このファージには、抗
体遺伝子の発現例（J.D.Marks ら，J.Mol.Biol., 222 p
581-597, 1991)で示されるように８００〜１，０００塩
基長の遺伝子が挿入可能である。
【００１７】８００〜１，０００塩基長は、アミノ酸を
コードする数にして約２７０〜３３０にあたる。ヒトや
動物での全遺伝子の種類は５万種前後と考えられ、ｍＲ
ＮＡの長さは１，０００〜２，０００塩基長以上のもの
が数多く存在している。つまり、フィラメンタスファー
ジに構造遺伝子そのまま挿入するのは不可能と考えられ
る。
コードする数にして約２７０〜３３０にあたる。ヒトや
動物での全遺伝子の種類は５万種前後と考えられ、ｍＲ
ＮＡの長さは１，０００〜２，０００塩基長以上のもの
が数多く存在している。つまり、フィラメンタスファー
ジに構造遺伝子そのまま挿入するのは不可能と考えられ
る。
【００１８】しかし、蛋白質の相互作用を検索するに
は、ある構造遺伝子そのままの構造が必要であるわけで
はない。M.Goは、蛋白質の機能の系統的な進化を解明す
るために蛋白質の機能単位として物理化学的計算により
割り出すことができるモジュールと呼ばれる構造を想定
している。そして、このモジュールの組み合わせにより
特異な親和性が現れることを示している。( 郷通子、蛋
白質・核酸・酵素 ３９ｐ２４４９−２４５６、１９９
４） つまり、親和性を示す蛋白質部分、例えばモジュールを
含むものであれば蛋白質の相互作用を検索可能である。
は、ある構造遺伝子そのままの構造が必要であるわけで
はない。M.Goは、蛋白質の機能の系統的な進化を解明す
るために蛋白質の機能単位として物理化学的計算により
割り出すことができるモジュールと呼ばれる構造を想定
している。そして、このモジュールの組み合わせにより
特異な親和性が現れることを示している。( 郷通子、蛋
白質・核酸・酵素 ３９ｐ２４４９−２４５６、１９９
４） つまり、親和性を示す蛋白質部分、例えばモジュールを
含むものであれば蛋白質の相互作用を検索可能である。
【００１９】水溶性蛋白質は一般に球状のドメインが繋
がってできている。球状ドメインは普通５０〜２００ア
ミノ酸残基程度の固まりであるが、例外として３００残
基以上の大きなものも知られている。球状ドメインはモ
ジュールが組み合わさったものである。モジュールは連
続した１０〜４０残基前後のアミノ酸残基からできるコ
ンパクトな構造ユニットである。（郷 通子、分子進化
実験法、第１８章、日本生化学会編集、東京化学同人発
行、１９９３） モジュールは親和性を検索する対象として考えられるの
で、そのアミノ酸からコードされるＤＮＡの長さは３０
〜１２０塩基長となる。先に述べたフィラメンタスファ
ージの発現系では８００〜１，０００塩基長が挿入可能
なので、約７〜３３のモジュール構造を発現できる。
がってできている。球状ドメインは普通５０〜２００ア
ミノ酸残基程度の固まりであるが、例外として３００残
基以上の大きなものも知られている。球状ドメインはモ
ジュールが組み合わさったものである。モジュールは連
続した１０〜４０残基前後のアミノ酸残基からできるコ
ンパクトな構造ユニットである。（郷 通子、分子進化
実験法、第１８章、日本生化学会編集、東京化学同人発
行、１９９３） モジュールは親和性を検索する対象として考えられるの
で、そのアミノ酸からコードされるＤＮＡの長さは３０
〜１２０塩基長となる。先に述べたフィラメンタスファ
ージの発現系では８００〜１，０００塩基長が挿入可能
なので、約７〜３３のモジュール構造を発現できる。
【００２０】ｍＲＮＡの長さを考慮すると、均一化した
ｃＤＮＡを対象とすると、構造遺伝子部分を含むもの
を、そのオープンリーディングフレームの上流・中流・
下流に相当するｃＤＮＡ断片としてライブラリー化する
ことで親和性検索ライブラリーとして利用できる。更
に、蛋白質をコードする動物固体の遺伝子は、５〜１０
万種類といわれているので、均一化ライブラリーとして
ファージ１ｘ１０5 〜１ｘ１０6 をスクリーニングすれ
ば良いこととなる。このスクリーニングの数は、付番等
によるカタログ化の可能な数字である。
ｃＤＮＡを対象とすると、構造遺伝子部分を含むもの
を、そのオープンリーディングフレームの上流・中流・
下流に相当するｃＤＮＡ断片としてライブラリー化する
ことで親和性検索ライブラリーとして利用できる。更
に、蛋白質をコードする動物固体の遺伝子は、５〜１０
万種類といわれているので、均一化ライブラリーとして
ファージ１ｘ１０5 〜１ｘ１０6 をスクリーニングすれ
ば良いこととなる。このスクリーニングの数は、付番等
によるカタログ化の可能な数字である。
【００２１】つまり、均一化したｃＤＮＡよりなる、構
造遺伝子部分を含むライブラリーは、その中に含まれる
モジュール構造による親和性によるスクリーニングが可
能である。
造遺伝子部分を含むライブラリーは、その中に含まれる
モジュール構造による親和性によるスクリーニングが可
能である。
【００２２】このライブラリーのスクリーニングには、
特定の蛋白質をコートしたプレートを用いて、特異的に
結合するファージをパニング法等により選別することが
できる。コートする蛋白質としては、特に制限はない
が、特定の組織、細胞、更に、レセプターと生理現象に
関与していると考えられるものが好ましい。親和性を確
認後、選択されたファージの挿入ｃＤＮＡ断片の塩基配
列を決め、既知のものとは異なるものであれば、新規な
生理活性に関与する因子等が見つけられる。
特定の蛋白質をコートしたプレートを用いて、特異的に
結合するファージをパニング法等により選別することが
できる。コートする蛋白質としては、特に制限はない
が、特定の組織、細胞、更に、レセプターと生理現象に
関与していると考えられるものが好ましい。親和性を確
認後、選択されたファージの挿入ｃＤＮＡ断片の塩基配
列を決め、既知のものとは異なるものであれば、新規な
生理活性に関与する因子等が見つけられる。
【００２３】また、見つけられた因子を発現させ、その
親和性を阻害したり、影響を与えることが分かる実験系
を組めることから、阻害剤等のスクリーニング系が作製
可能となる。
親和性を阻害したり、影響を与えることが分かる実験系
を組めることから、阻害剤等のスクリーニング系が作製
可能となる。
【００２４】親和性を示すものが、抗体と抗原の関係と
なっていればどちらかが分かれば、スクリーニングで得
ることが可能である。得られた親和性の分析には、モジ
ュール構造を介して行える。これは、より早い分析手段
の材料を提供するものである。
なっていればどちらかが分かれば、スクリーニングで得
ることが可能である。得られた親和性の分析には、モジ
ュール構造を介して行える。これは、より早い分析手段
の材料を提供するものである。
【００２５】親和性を調べるよりin vivo に近い系とし
て、酵母のtwo-hybrid system（２ハイブリッド・シス
テム）が開発された。これは２種の融合蛋白質間(two-h
ybrid)の相互作用（結合活性）を、酵母細胞内転写の活
性化を指標に検出する実験系である。（Fields, S. and
Song, O., Nature, 340 p245-246,1989) ２ハイブリッド・システムでは、酵母の発現ベクター上
に転写因子ＳＲＦまたはＧＡＬ４の結合領域に目的の蛋
白質を融合させた形で遺伝子を構築し、β−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子（ＬａｃＺ）をレポーター遺伝子として持
った指示酵母株（６２Ｌ）に導入する。一方、ｃＤＮＡ
ライブラリー、本発明では均一化発現ライブラリーが構
築可能な、制限酵素切断部位が両端についているＤＮＡ
を酵母発現ベクター上で転写のアクチベーターであるＶ
Ｐ１６（またはＧＡＬ４）のアクチベタードメインの下
流に構築し、同様に導入する。ナイロンメンブレン上に
コロニーを形成させ、ガラクトース培地により両プラス
ミドからの発現を誘導させた後、Ｘ−ｇａｌを基質に
し、コロニーの青色を指標にスクリーニングする。レポ
ーター遺伝子としては、酵母遺伝子ＨＩＳ３を用いたも
のも知られている。
て、酵母のtwo-hybrid system（２ハイブリッド・シス
テム）が開発された。これは２種の融合蛋白質間(two-h
ybrid)の相互作用（結合活性）を、酵母細胞内転写の活
性化を指標に検出する実験系である。（Fields, S. and
Song, O., Nature, 340 p245-246,1989) ２ハイブリッド・システムでは、酵母の発現ベクター上
に転写因子ＳＲＦまたはＧＡＬ４の結合領域に目的の蛋
白質を融合させた形で遺伝子を構築し、β−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子（ＬａｃＺ）をレポーター遺伝子として持
った指示酵母株（６２Ｌ）に導入する。一方、ｃＤＮＡ
ライブラリー、本発明では均一化発現ライブラリーが構
築可能な、制限酵素切断部位が両端についているＤＮＡ
を酵母発現ベクター上で転写のアクチベーターであるＶ
Ｐ１６（またはＧＡＬ４）のアクチベタードメインの下
流に構築し、同様に導入する。ナイロンメンブレン上に
コロニーを形成させ、ガラクトース培地により両プラス
ミドからの発現を誘導させた後、Ｘ−ｇａｌを基質に
し、コロニーの青色を指標にスクリーニングする。レポ
ーター遺伝子としては、酵母遺伝子ＨＩＳ３を用いたも
のも知られている。
【００２６】
【発明の構成】すなわち本発明は、すべてのｃＤＮＡク
ローンが同じ割合で含まれる発現ライブラリーに関す
る。
ローンが同じ割合で含まれる発現ライブラリーに関す
る。
【００２７】更に、すべてのｃＤＮＡクローンが同じ割
合で含まれる発現ライブラリーが構築可能な、制限酵素
切断部位がＤＮＡ両端についているＤＮＡに関し、ここ
で言う制限酵素切断部位は、特に制限はないが、好まし
くは、発現ベクターに挿入可能な制限酵素部位が望まし
い。また、マルチ・クローニング部位として両端または
一方端につけてあっても良い。
合で含まれる発現ライブラリーが構築可能な、制限酵素
切断部位がＤＮＡ両端についているＤＮＡに関し、ここ
で言う制限酵素切断部位は、特に制限はないが、好まし
くは、発現ベクターに挿入可能な制限酵素部位が望まし
い。また、マルチ・クローニング部位として両端または
一方端につけてあっても良い。
【００２８】また、すべてのｃＤＮＡクローンが同じ割
合で含まれる発現ライブラリーが、ファージによって製
造されたものに関し、そのファージは挿入遺伝子が発現
可能なファージであればよく、好ましくは、ラムダファ
ージやフィラメンタスファージが挙げられる。
合で含まれる発現ライブラリーが、ファージによって製
造されたものに関し、そのファージは挿入遺伝子が発現
可能なファージであればよく、好ましくは、ラムダファ
ージやフィラメンタスファージが挙げられる。
【００２９】更に、すべてのｃＤＮＡクローンが同じ割
合で含まれる発現ライブラリーが、フィラメンタスファ
ージでよって製造されたもでのある発現ライブラリーに
関する。
合で含まれる発現ライブラリーが、フィラメンタスファ
ージでよって製造されたもでのある発現ライブラリーに
関する。
【００３０】本発明は、蛋白質の翻訳領域を含むｃＤＮ
Ａクローンに均一化操作を行い、得られたＤＮＡを、フ
ィラメンタスファージのマイナ−・コート蛋白質遺伝子
の一部と置き換え又は挿入により導入しライブラリーを
構築する、すべてのｃＤＮＡクローンが同じ割合で含ま
れる発現ライブラリーの製造法に関する。更に、蛋白質
の翻訳領域を含むｃＤＮＡクローンに均一化操作をロー
ン・リンカーを用いた均一化サイクル処理により行い、
得られたＤＮＡを、フィラメンタスファージのコート蛋
白質遺伝子の一部と置き換え又は挿入により導入するこ
とによりライブラリーを構築する、すべてのｃＤＮＡク
ローンが同じ割合で含まれる発現ライブラリーの製造法
に関する。
Ａクローンに均一化操作を行い、得られたＤＮＡを、フ
ィラメンタスファージのマイナ−・コート蛋白質遺伝子
の一部と置き換え又は挿入により導入しライブラリーを
構築する、すべてのｃＤＮＡクローンが同じ割合で含ま
れる発現ライブラリーの製造法に関する。更に、蛋白質
の翻訳領域を含むｃＤＮＡクローンに均一化操作をロー
ン・リンカーを用いた均一化サイクル処理により行い、
得られたＤＮＡを、フィラメンタスファージのコート蛋
白質遺伝子の一部と置き換え又は挿入により導入するこ
とによりライブラリーを構築する、すべてのｃＤＮＡク
ローンが同じ割合で含まれる発現ライブラリーの製造法
に関する。
【００３１】ローン・リンカーを用いた均一化サイクル
処理とは、Ko,M.S.H. らが述べているｃＤＮＡのセルフ
・サブトラクションを相補的ＤＮＡまたはＲＮＡ同士が
ハイブリッドを形成するという現象を利用して、キネテ
ィクスを考慮した条件で行い、ｃＤＮＡの均一化を図
り、このセルフ・サブトラクション後のＤＮＡ量の減少
を回復するために、ローン・リンカーと呼ばれる非接着
性の突出末端と平滑末端を持ったリンカー配列を用い
た、アンカードＰＣＲ法でｃＤＮＡを集団として増幅す
ることを言う。（Ko,M.S.H. ら, Nucleic Acids Res.,
18 p4293-4294, 1990) 更に、すべてのｃＤＮＡクローンが同じ割合で含まれて
いる発現ライブラリーよりある蛋白質との親和性によ
り、その蛋白質と親和性の高い蛋白質を選択する方法に
関する。
処理とは、Ko,M.S.H. らが述べているｃＤＮＡのセルフ
・サブトラクションを相補的ＤＮＡまたはＲＮＡ同士が
ハイブリッドを形成するという現象を利用して、キネテ
ィクスを考慮した条件で行い、ｃＤＮＡの均一化を図
り、このセルフ・サブトラクション後のＤＮＡ量の減少
を回復するために、ローン・リンカーと呼ばれる非接着
性の突出末端と平滑末端を持ったリンカー配列を用い
た、アンカードＰＣＲ法でｃＤＮＡを集団として増幅す
ることを言う。（Ko,M.S.H. ら, Nucleic Acids Res.,
18 p4293-4294, 1990) 更に、すべてのｃＤＮＡクローンが同じ割合で含まれて
いる発現ライブラリーよりある蛋白質との親和性によ
り、その蛋白質と親和性の高い蛋白質を選択する方法に
関する。
【００３２】親和性のスクリーニングは、べクターをフ
ィラメンタスファージを選べば、発現後、ある蛋白質に
親和性があるものを捜す目的のスクリーニングとして、
特定の蛋白質をコートしたプレートを用いて、特異的に
結合するファージをパニング法等で選別することが可能
であり、酵母の２ハイブリッド・システムを用いればよ
りin vivo を反映したスクリーニングが可能となる。
ィラメンタスファージを選べば、発現後、ある蛋白質に
親和性があるものを捜す目的のスクリーニングとして、
特定の蛋白質をコートしたプレートを用いて、特異的に
結合するファージをパニング法等で選別することが可能
であり、酵母の２ハイブリッド・システムを用いればよ
りin vivo を反映したスクリーニングが可能となる。
【００３３】また、親和性のスクリーニングで、ある蛋
白質が抗体であり、所望の抗原を親和性により選択する
方法に関する。
白質が抗体であり、所望の抗原を親和性により選択する
方法に関する。
【００３４】更に、ある蛋白質との親和性により選択す
る方法が、酵母の２ハイブリッド・システムである親和
性スクリーニング方法に関する。
る方法が、酵母の２ハイブリッド・システムである親和
性スクリーニング方法に関する。
【００３５】本発明は、すべてのｃＤＮＡクローンが同
じ割合で含まれる発現ライブラリーより親和性のスクリ
ーニング方法で得られた遺伝子産物に関し、この遺伝子
産物は、完全な構造遺伝子を得るためのプローブとな
り、また、モジュール単位の３次元構造解析などで親和
性が検討できる材料となりえる。目標とする組織、細
胞、レセプター、あるいは種々の因子に対し、親和性の
高いものから低いものへと種々の蛋白質の品揃えが見つ
けられれば、新たな生理活性を見つけられる可能性があ
り、しかもその分子生物学的な説明が早くできうるよう
な材料を提供することができる。
じ割合で含まれる発現ライブラリーより親和性のスクリ
ーニング方法で得られた遺伝子産物に関し、この遺伝子
産物は、完全な構造遺伝子を得るためのプローブとな
り、また、モジュール単位の３次元構造解析などで親和
性が検討できる材料となりえる。目標とする組織、細
胞、レセプター、あるいは種々の因子に対し、親和性の
高いものから低いものへと種々の蛋白質の品揃えが見つ
けられれば、新たな生理活性を見つけられる可能性があ
り、しかもその分子生物学的な説明が早くできうるよう
な材料を提供することができる。
【００３６】更に、すべてのｃＤＮＡクローンが同じ割
合で含まれる発現ライブラリーより得られる遺伝子産物
からなる医薬に関する。
合で含まれる発現ライブラリーより得られる遺伝子産物
からなる医薬に関する。
【００３７】親和性だけに着目しても、レセプターのア
ゴニストやアンタゴニストが簡単にしかも重要な親和性
に寄与しているモジュール構造のみで取り出せる可能性
があり、今まで知られていない医薬品となる可能性があ
る。
ゴニストやアンタゴニストが簡単にしかも重要な親和性
に寄与しているモジュール構造のみで取り出せる可能性
があり、今まで知られていない医薬品となる可能性があ
る。
【００３８】均一化発現ｃＤＮＡライブラリーのそれぞ
れのクローンを付番（タグ）によりカタログ化すること
ができ、１ｘ１０5 〜１０6 の個々のクローンを色々な
アッセイ系にかけ機能を明らかとしたクローンとしてデ
ータベース化できる。将来、調節蛋白質の組み合わせま
たは改変で、より緩やかな調節とか、機能を組み合わせ
ることにより、全く知られていなかった医薬品の開発に
応用できる蛋白質起源を提供できることとなる。
れのクローンを付番（タグ）によりカタログ化すること
ができ、１ｘ１０5 〜１０6 の個々のクローンを色々な
アッセイ系にかけ機能を明らかとしたクローンとしてデ
ータベース化できる。将来、調節蛋白質の組み合わせま
たは改変で、より緩やかな調節とか、機能を組み合わせ
ることにより、全く知られていなかった医薬品の開発に
応用できる蛋白質起源を提供できることとなる。
【００３９】ｃＤＮＡ化するｍＲＮＡの起源は特に制限
はないが、医薬を目的とする考えから、ヒト由来の細
胞、臓器が好ましい。細胞や臓器等からｍＲＮＡを抽出
する方法は一般的に知られており、例えば、塩酸グアニ
ジン法、リチウムクロライド法が挙げられる。ポリ
（Ａ）+ ＲＮＡの分離についても一般に知られており、
オリゴｄＴカラム法などで行えばよい。
はないが、医薬を目的とする考えから、ヒト由来の細
胞、臓器が好ましい。細胞や臓器等からｍＲＮＡを抽出
する方法は一般的に知られており、例えば、塩酸グアニ
ジン法、リチウムクロライド法が挙げられる。ポリ
（Ａ）+ ＲＮＡの分離についても一般に知られており、
オリゴｄＴカラム法などで行えばよい。
【００４０】得られたポリ（Ａ）+ ＲＮＡは、ポリＡ鎖
から合成すれば良い。例えば、オリゴｄＴ−ＮｏｔＩプ
ライマー（５’−ＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＴＴ
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’）を用い逆転写酵素で２
本鎖ｃＤＮＡとする。この時、合成条件を選べば２００
塩基対から数Ｋｂの塩基対のｃＤＮＡが合成できる。得
られたｃＤＮＡをアガロースゲル電気泳動などで所望の
塩基対の集団となるようにサイズ分画を行う。分画後、
エリューション、エタノール沈殿などで回収し、ｃＤＮ
Ａ両端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理で両端をそろえ
る。
から合成すれば良い。例えば、オリゴｄＴ−ＮｏｔＩプ
ライマー（５’−ＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＴＴ
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’）を用い逆転写酵素で２
本鎖ｃＤＮＡとする。この時、合成条件を選べば２００
塩基対から数Ｋｂの塩基対のｃＤＮＡが合成できる。得
られたｃＤＮＡをアガロースゲル電気泳動などで所望の
塩基対の集団となるようにサイズ分画を行う。分画後、
エリューション、エタノール沈殿などで回収し、ｃＤＮ
Ａ両端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理で両端をそろえ
る。
【００４１】得られたｃＤＮＡにローン・リンカーをラ
イゲースを用いて接続する。ローン・リンカーとして
は、例えばＬＬ−ＳａｌＩとして、ＬＬ−ＳａｌＩＡ
（５’−ＡＴＴＧＡＣＧＴＣＧＡＣＴＡＴＣＣＡＧＧ−
３’）及びＬＬ−ＳａｌＩＢ（５’−ＣＣＴＧＧＡＴＡ
ＧＴＣＧＡＣＧＴＣ−３’）を用いることができる。
（Ko, M.S.H.ら，Nucleic Acids Res.,18, p4293-4294,
1990 ） ＬＬ−ＳａｌＩＡ，Ｂをリン酸化し、アニーリングさせ
る。このアニーリングしたＬＬ−ＳａｌＩをブラント末
端としたｃＤＮＡとＴ４ＤＮＡライゲースを用い接続さ
せる。
イゲースを用いて接続する。ローン・リンカーとして
は、例えばＬＬ−ＳａｌＩとして、ＬＬ−ＳａｌＩＡ
（５’−ＡＴＴＧＡＣＧＴＣＧＡＣＴＡＴＣＣＡＧＧ−
３’）及びＬＬ−ＳａｌＩＢ（５’−ＣＣＴＧＧＡＴＡ
ＧＴＣＧＡＣＧＴＣ−３’）を用いることができる。
（Ko, M.S.H.ら，Nucleic Acids Res.,18, p4293-4294,
1990 ） ＬＬ−ＳａｌＩＡ，Ｂをリン酸化し、アニーリングさせ
る。このアニーリングしたＬＬ−ＳａｌＩをブラント末
端としたｃＤＮＡとＴ４ＤＮＡライゲースを用い接続さ
せる。
【００４２】得られたｃＤＮＡ−ローン・リンカー産物
をＰＣＲ法により増幅する。増幅したｃＤＮＡ−ローン
・リンカー産物を変性、再会合処理により、ハイブリッ
ドを形成させる。ハイブリッドを形成しない１本鎖のみ
をハイドロオキシアパタイドカラム（６５℃保温）で回
収する。
をＰＣＲ法により増幅する。増幅したｃＤＮＡ−ローン
・リンカー産物を変性、再会合処理により、ハイブリッ
ドを形成させる。ハイブリッドを形成しない１本鎖のみ
をハイドロオキシアパタイドカラム（６５℃保温）で回
収する。
【００４３】１本鎖ｃＤＮＡをＰＣＲ法により、増幅を
行ない２本鎖ｃＤＮＡとする。
行ない２本鎖ｃＤＮＡとする。
【００４４】変性、再会合処理の時、構造遺伝子の下流
域ｃＤＮＡを加えることで、構造遺伝子の中流・上流域
が１本鎖として得られ、また、構造遺伝子の中流と下流
域ｃＤＮＡを加えることで構造遺伝子の上流域が１本鎖
として得られる。
域ｃＤＮＡを加えることで、構造遺伝子の中流・上流域
が１本鎖として得られ、また、構造遺伝子の中流と下流
域ｃＤＮＡを加えることで構造遺伝子の上流域が１本鎖
として得られる。
【００４５】それぞれの１本鎖集団をＰＣＲ法で増幅す
ることにより、蛋白質モジュール・ライブラリーとし
て、構造遺伝子上流、中流及び下流の各ライブラリーを
構築できるｃＤＮＡ集団が得られる。
ることにより、蛋白質モジュール・ライブラリーとし
て、構造遺伝子上流、中流及び下流の各ライブラリーを
構築できるｃＤＮＡ集団が得られる。
【００４６】所望のｃＤＮＡ集団が得られたならば、親
和性を検索するベクターへの挿入などを考慮し、各種リ
ンカーを用意し結合すればよい。
和性を検索するベクターへの挿入などを考慮し、各種リ
ンカーを用意し結合すればよい。
【００４７】
【発明の効果】構築されたすべてのｃＤＮＡクローンが
同じ割合で含まれる発現ライブラリーは、新規な医薬と
なり得る物質を親和性などでスクリーニングし得られる
物質起源となる。また、親和性を基礎とした生理現象解
明の材料を提供できる。
同じ割合で含まれる発現ライブラリーは、新規な医薬と
なり得る物質を親和性などでスクリーニングし得られる
物質起源となる。また、親和性を基礎とした生理現象解
明の材料を提供できる。
【図１】図１は、均一化ｃＤＮＡ発現ライブラリーの作
製手順を示したものである。
製手順を示したものである。
【図２】図２は、均一化ｃＤＮＡ発現ライブラリーの利
用の例を示したものである。
用の例を示したものである。
Claims (11)
- 【請求項１】 すべてのｃＤＮＡクローンが同じ割合で
含まれる発現ライブラリー - 【請求項２】 すべてのｃＤＮＡクローンが同じ割合で
含まれる発現ライブラリーが構築可能な制限酵素切断部
位がＤＮＡ両端についているＤＮＡ - 【請求項３】 ファージによって製造された請求項１記
載の発現ライブラリー - 【請求項４】 ファージがフィラメンタスファージであ
る請求項３記載の発現ライブラリー - 【請求項５】 蛋白質の翻訳領域を含むｃＤＮＡクロー
ンに均一化操作を行い、得られたＤＮＡを、フィラメン
タスファージのコート蛋白質遺伝子の一部と置き換え又
は挿入により導入しライブラリーを構築する、すべての
ｃＤＮＡクローンが同じ割合で含まれる発現ライブラリ
ーの製造法 - 【請求項６】 均一化操作をローン・リンカーを用いた
均一化サイクル処理により行う、請求項５記載のすべて
のｃＤＮＡクローンが同じ割合で含まれる発現ライブラ
リーの製造法 - 【請求項７】 すべてのｃＤＮＡクローンが同じ割合で
含まれる発現ライブラリーよりある蛋白質との親和性に
より、その蛋白質と親和性の高い蛋白質を選択する方法 - 【請求項８】 ある蛋白質が抗体であり、所望の抗原を
親和性により選択する請求項７記載の方法 - 【請求項９】 ある蛋白質との親和性により選択する方
法が、酵母の２ハイブリッド・システムである請求項７
又は請求項８記載の方法 - 【請求項１０】 すべてのｃＤＮＡクローンが同じ割合
で含まれる発現ライブラリーより、請求項７、請求項８
または請求項９に記載の方法で得られた遺伝子産物 - 【請求項１１】 すべてのｃＤＮＡクローンが同じ割合
で含まれる発現ライブラリーより得られる遺伝子産物か
らなる医薬
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7176103A JPH0923885A (ja) | 1995-07-12 | 1995-07-12 | 遺伝子発現ライブラリー及びその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7176103A JPH0923885A (ja) | 1995-07-12 | 1995-07-12 | 遺伝子発現ライブラリー及びその製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0923885A true JPH0923885A (ja) | 1997-01-28 |
Family
ID=16007752
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7176103A Pending JPH0923885A (ja) | 1995-07-12 | 1995-07-12 | 遺伝子発現ライブラリー及びその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0923885A (ja) |
Cited By (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002103007A1 (fr) * | 2001-06-19 | 2002-12-27 | Eisai C0. Ltd. | Methode d'uniformisation des contenus de fragments d'adn et methode de soustraction |
| US7994159B2 (en) | 2003-03-10 | 2011-08-09 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | c-Kit kinase inhibitor |
| US8865737B2 (en) | 2006-08-28 | 2014-10-21 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Antitumor agent for undifferentiated gastric cancer |
| US8952035B2 (en) | 2007-11-09 | 2015-02-10 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Combination of anti-angiogenic substance and anti-tumor platinum complex |
| US8962655B2 (en) | 2007-01-29 | 2015-02-24 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Composition for treatment of undifferentiated gastric cancer |
| US8962650B2 (en) | 2011-04-18 | 2015-02-24 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Therapeutic agent for tumor |
| US8969344B2 (en) | 2005-08-02 | 2015-03-03 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Method for assay on the effect of vascularization inhibitor |
| US8969379B2 (en) | 2004-09-17 | 2015-03-03 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Pharmaceutical compositions of 4-(3-chloro-4-(cyclopropylaminocarbonyl)aminophenoxy)-7=methoxy-6-quinolinecarboxide |
| US9006256B2 (en) | 2006-05-18 | 2015-04-14 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Antitumor agent for thyroid cancer |
| US9012458B2 (en) | 2010-06-25 | 2015-04-21 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Antitumor agent using compounds having kinase inhibitory effect in combination |
| US9334239B2 (en) | 2012-12-21 | 2016-05-10 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Amorphous form of quinoline derivative, and method for producing same |
| US9945862B2 (en) | 2011-06-03 | 2018-04-17 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Biomarkers for predicting and assessing responsiveness of thyroid and kidney cancer subjects to lenvatinib compounds |
| US10259791B2 (en) | 2014-08-28 | 2019-04-16 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | High-purity quinoline derivative and method for manufacturing same |
| US10517861B2 (en) | 2013-05-14 | 2019-12-31 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Biomarkers for predicting and assessing responsiveness of endometrial cancer subjects to lenvatinib compounds |
| CN112981544A (zh) * | 2021-02-25 | 2021-06-18 | 通用生物***（安徽）有限公司 | 一种sgRNA文库构建方法 |
| US11090386B2 (en) | 2015-02-25 | 2021-08-17 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Method for suppressing bitterness of quinoline derivative |
| US11369623B2 (en) | 2015-06-16 | 2022-06-28 | Prism Pharma Co., Ltd. | Anticancer combination of a CBP/catenin inhibitor and an immune checkpoint inhibitor |
| US11547705B2 (en) | 2015-03-04 | 2023-01-10 | Merck Sharp & Dohme Llc | Combination of a PD-1 antagonist and a VEGF-R/FGFR/RET tyrosine kinase inhibitor for treating cancer |
-
1995
- 1995-07-12 JP JP7176103A patent/JPH0923885A/ja active Pending
Cited By (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002103007A1 (fr) * | 2001-06-19 | 2002-12-27 | Eisai C0. Ltd. | Methode d'uniformisation des contenus de fragments d'adn et methode de soustraction |
| US7994159B2 (en) | 2003-03-10 | 2011-08-09 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | c-Kit kinase inhibitor |
| US9504746B2 (en) | 2004-09-17 | 2016-11-29 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Pharmaceutical compositions of 4-(3-chloro-4-(cyclopropylaminocarbonyl)aminophenoxy)-7-methoxy-6-quinolinecarboxamide |
| US8969379B2 (en) | 2004-09-17 | 2015-03-03 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Pharmaceutical compositions of 4-(3-chloro-4-(cyclopropylaminocarbonyl)aminophenoxy)-7=methoxy-6-quinolinecarboxide |
| US8969344B2 (en) | 2005-08-02 | 2015-03-03 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Method for assay on the effect of vascularization inhibitor |
| US9006240B2 (en) | 2005-08-02 | 2015-04-14 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Method for assay on the effect of vascularization inhibitor |
| US9006256B2 (en) | 2006-05-18 | 2015-04-14 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Antitumor agent for thyroid cancer |
| US8865737B2 (en) | 2006-08-28 | 2014-10-21 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Antitumor agent for undifferentiated gastric cancer |
| US8962655B2 (en) | 2007-01-29 | 2015-02-24 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Composition for treatment of undifferentiated gastric cancer |
| US8952035B2 (en) | 2007-11-09 | 2015-02-10 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Combination of anti-angiogenic substance and anti-tumor platinum complex |
| US9012458B2 (en) | 2010-06-25 | 2015-04-21 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Antitumor agent using compounds having kinase inhibitory effect in combination |
| US8962650B2 (en) | 2011-04-18 | 2015-02-24 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Therapeutic agent for tumor |
| US9945862B2 (en) | 2011-06-03 | 2018-04-17 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Biomarkers for predicting and assessing responsiveness of thyroid and kidney cancer subjects to lenvatinib compounds |
| US11598776B2 (en) | 2011-06-03 | 2023-03-07 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Biomarkers for predicting and assessing responsiveness of thyroid and kidney cancer subjects to lenvatinib compounds |
| US9334239B2 (en) | 2012-12-21 | 2016-05-10 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Amorphous form of quinoline derivative, and method for producing same |
| US10517861B2 (en) | 2013-05-14 | 2019-12-31 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Biomarkers for predicting and assessing responsiveness of endometrial cancer subjects to lenvatinib compounds |
| US10259791B2 (en) | 2014-08-28 | 2019-04-16 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | High-purity quinoline derivative and method for manufacturing same |
| US10407393B2 (en) | 2014-08-28 | 2019-09-10 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | High-purity quinoline derivative and method for manufacturing same |
| US10822307B2 (en) | 2014-08-28 | 2020-11-03 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | High-purity quinoline derivative and method for manufacturing same |
| US11186547B2 (en) | 2014-08-28 | 2021-11-30 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | High-purity quinoline derivative and method for manufacturing same |
| US11090386B2 (en) | 2015-02-25 | 2021-08-17 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Method for suppressing bitterness of quinoline derivative |
| US11547705B2 (en) | 2015-03-04 | 2023-01-10 | Merck Sharp & Dohme Llc | Combination of a PD-1 antagonist and a VEGF-R/FGFR/RET tyrosine kinase inhibitor for treating cancer |
| US11369623B2 (en) | 2015-06-16 | 2022-06-28 | Prism Pharma Co., Ltd. | Anticancer combination of a CBP/catenin inhibitor and an immune checkpoint inhibitor |
| CN112981544A (zh) * | 2021-02-25 | 2021-06-18 | 通用生物***（安徽）有限公司 | 一种sgRNA文库构建方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH0923885A (ja) | 遺伝子発現ライブラリー及びその製造法 | |
| US5733731A (en) | Peptide library and screening method | |
| US6730482B2 (en) | Modified SELEX processes without purified protein | |
| US5843701A (en) | Systematic polypeptide evolution by reverse translation | |
| WO1993008278A1 (en) | Peptide library and screening method | |
| JP2001514488A (ja) | 遺伝子の量的発現を分析する方法 | |
| CA2337045A1 (en) | Cis acting nucleic acid elements and methods of use | |
| CN108300767A (zh) | 一种核酸复合体中核酸区段相互作用的分析方法 | |
| King | Chemistry or biology: which comes first after the genome is sequenced? | |
| US6333177B1 (en) | Selective technique for rapid identification of proteins and genes and uses thereof | |
| Valencia et al. | mRNA‐Display‐Based Selections for Proteins with Desired Functions: A Protease‐Substrate Case Study | |
| Haberkorn et al. | Molecular imaging and therapy—a programme based on the development of new biomolecules | |
| Robinson et al. | Recent advances in molecular biological techniques and their relevance to pulmonary research | |
| US20020098493A1 (en) | Drug-amino acids chimeric molecules | |
| EP0995797A1 (en) | Methods for detecting and isolating nuclear transport proteins | |
| Shiue | Identification of candidate genes for drug discovery by differential display | |
| WO2000049143A1 (fr) | Procede d'analyse d'une frequence d'expression genique | |
| Kurakin et al. | Target-assisted iterative screening reveals novel interactors for PSD95, Nedd4, Src, Abl and Crk proteins | |
| JP2002530074A (ja) | 細胞表現型に相関するポリペプチド標的を検証する方法 | |
| CA2362414A1 (en) | Methods and reagents for identifying synthetic genetic elements | |
| CN104419756B (zh) | 检测哺乳动物基因组三核苷酸重复序列的方法及其应用 | |
| US20020197685A1 (en) | Amplification of heterogeneous full-length mRNA | |
| US20060099713A1 (en) | Targeted-assisted iterative screening (tais):a novel screening format for large molecular repertoires | |
| JP2006506058A (ja) | 標的機能を決定して薬物リードを同定するためのプロセス | |
| Palzkill | Identification of Protein‐Ligand Interactions |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050118 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050322 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20050322 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20050510 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050609 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20050719 |
|
| A911 | Transfer of reconsideration by examiner before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20050818 |
|
| A912 | Removal of reconsideration by examiner before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20050916 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20070731 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070803 |