JPH06153952A - 微量未知二重鎖ｄｎａ分子の増幅、標識を行うための前処理方法 - Google Patents
微量未知二重鎖ｄｎａ分子の増幅、標識を行うための前処理方法Info
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- JPH06153952A JPH06153952A JP34145492A JP34145492A JPH06153952A JP H06153952 A JPH06153952 A JP H06153952A JP 34145492 A JP34145492 A JP 34145492A JP 34145492 A JP34145492 A JP 34145492A JP H06153952 A JPH06153952 A JP H06153952A
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- dna molecule
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 これまで、微量しか得られない未知ＤＮＡ
を、試験管内で増幅することは不可能であった。本申請
の目的は、全く未知のＤＮＡ分子が微量しか獲られず、
かつ様々なサイズの分子の混合液として存在するとき、
その全体を試験管内で増幅することを可能にする準備の
方法を確立することにある。加えて、ＤＮＡ複製の時に
標識モノマー（標識dNTP）を用いる場合、既知のプライ
マーを使った標識法を提供することにある。 【構成】 本発明の基本的方針は、ハイブリダイゼイシ
ョン法に使用可能な範囲で、分注した未知ＤＮＡ分子を
２種の制限酵素でそれぞれ細分化し、様々なサイズのＤ
ＮＡ分子それぞれにの端にアダプターを結合し、既知の
塩基配列を作ることにある。ＤＮＡの増幅、標識は、ア
ダプターを合成する際に混ぜ合わせた２種のオリゴヌク
レオチドの一方が、リバース、フォワードの両方のプラ
イマーとして働く。
を、試験管内で増幅することは不可能であった。本申請
の目的は、全く未知のＤＮＡ分子が微量しか獲られず、
かつ様々なサイズの分子の混合液として存在するとき、
その全体を試験管内で増幅することを可能にする準備の
方法を確立することにある。加えて、ＤＮＡ複製の時に
標識モノマー（標識dNTP）を用いる場合、既知のプライ
マーを使った標識法を提供することにある。 【構成】 本発明の基本的方針は、ハイブリダイゼイシ
ョン法に使用可能な範囲で、分注した未知ＤＮＡ分子を
２種の制限酵素でそれぞれ細分化し、様々なサイズのＤ
ＮＡ分子それぞれにの端にアダプターを結合し、既知の
塩基配列を作ることにある。ＤＮＡの増幅、標識は、ア
ダプターを合成する際に混ぜ合わせた２種のオリゴヌク
レオチドの一方が、リバース、フォワードの両方のプラ
イマーとして働く。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】いまＤＮＡを扱う分子生物学の応
用範囲は、日々広がり、医学分野の病名診断を始め、様
々な医学基礎研究においても重要な位置を占めている。
他に、理学、農学、薬学、微生物工学、挙げれば枚挙に
暇が無い。本申請が関わる研究手法には、ハイブリダイ
ゼイション法や微量ＤＮＡのクローニングと呼ばれるも
のが考えられるが、いずれもＤＮＡ分子生物学で最も頻
繁に用いられる手法で、上記のいずれの分野に於いて
も、常に用いられているものである。
用範囲は、日々広がり、医学分野の病名診断を始め、様
々な医学基礎研究においても重要な位置を占めている。
他に、理学、農学、薬学、微生物工学、挙げれば枚挙に
暇が無い。本申請が関わる研究手法には、ハイブリダイ
ゼイション法や微量ＤＮＡのクローニングと呼ばれるも
のが考えられるが、いずれもＤＮＡ分子生物学で最も頻
繁に用いられる手法で、上記のいずれの分野に於いて
も、常に用いられているものである。
【０００２】
【従来の技術】ＤＮＡの遺伝情報は、ＡＴＣＧの塩基の
配列に符号化されている。それ故ＤＮＡ分子の研究は、
同じ配列ないしは似通った配列があるかどうかを比較す
る研究手段が、頻繁に用いられる。この配列を比較する
方法の総称をハイブリダイゼイション法という。ハイブ
リダイゼイション法に用いる標識プローブは既知の物を
使うのみならず、未知のＤＮＡないしＲＮＡを用いるこ
とが、往々にある。この時標識プローブは、多量に準備
できるものであるなら問題はないが、一度に限られた量
しか得られないときには、再度標識プローブを得るため
に多くの手順を繰り返すことが必要であった。一度きり
しか資料が得られない場合には、標識プローブを使い果
たせば、それ以降の操作は不可能となっていた。
配列に符号化されている。それ故ＤＮＡ分子の研究は、
同じ配列ないしは似通った配列があるかどうかを比較す
る研究手段が、頻繁に用いられる。この配列を比較する
方法の総称をハイブリダイゼイション法という。ハイブ
リダイゼイション法に用いる標識プローブは既知の物を
使うのみならず、未知のＤＮＡないしＲＮＡを用いるこ
とが、往々にある。この時標識プローブは、多量に準備
できるものであるなら問題はないが、一度に限られた量
しか得られないときには、再度標識プローブを得るため
に多くの手順を繰り返すことが必要であった。一度きり
しか資料が得られない場合には、標識プローブを使い果
たせば、それ以降の操作は不可能となっていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】現在では、既知の塩基
配列が二カ所にあれば、米国特許 No. 4,683,195 及びN
o.4,683,202（日本では特開昭61-274697号公報及び特開
昭62-281号公報にて公開中）の方法（ＰＣＲ反応）で、
2000bpぐらいまでならばその間の部分のＤＮＡは試験管
内で増幅が可能である。しかし微量しか得られない全く
未知のＤＮＡを、試験管内で増幅することは不可能であ
った。本申請中の発明は、ハイブリダイゼイション法に
使用可能な範囲でＤＮＡ分子を細分化するものの、そし
て存在比率は維持できないかも知れないが、全く未知の
ＤＮＡを試験管内で増幅することを可能にするものであ
る。その結果として、ある細胞からその細胞内で発現し
ている遺伝子のライブラリーを作るとき、わずかしか発
現していない遺伝子をクローニングするのは難しいが、
発現遺伝子のｃＤＮＡを本発明をもちいて増幅すること
で、クローニング出来る可能性を高める。さらに、ＤＮ
Ａ複製の時に標識モノマー（標識dNTP）を用いるなら
ば、ファインバーグとボウゲルスタインの方法、Anal B
iochem 132 巻6ー13頁にあるランダムプライマー標識法
以上に効率よく標識出来る、既知のプライマーを使った
標識法を提供するものである。
配列が二カ所にあれば、米国特許 No. 4,683,195 及びN
o.4,683,202（日本では特開昭61-274697号公報及び特開
昭62-281号公報にて公開中）の方法（ＰＣＲ反応）で、
2000bpぐらいまでならばその間の部分のＤＮＡは試験管
内で増幅が可能である。しかし微量しか得られない全く
未知のＤＮＡを、試験管内で増幅することは不可能であ
った。本申請中の発明は、ハイブリダイゼイション法に
使用可能な範囲でＤＮＡ分子を細分化するものの、そし
て存在比率は維持できないかも知れないが、全く未知の
ＤＮＡを試験管内で増幅することを可能にするものであ
る。その結果として、ある細胞からその細胞内で発現し
ている遺伝子のライブラリーを作るとき、わずかしか発
現していない遺伝子をクローニングするのは難しいが、
発現遺伝子のｃＤＮＡを本発明をもちいて増幅すること
で、クローニング出来る可能性を高める。さらに、ＤＮ
Ａ複製の時に標識モノマー（標識dNTP）を用いるなら
ば、ファインバーグとボウゲルスタインの方法、Anal B
iochem 132 巻6ー13頁にあるランダムプライマー標識法
以上に効率よく標識出来る、既知のプライマーを使った
標識法を提供するものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、全く未知のＤ
ＮＡ分子が微量しか得られず、かつ様々なサイズの分子
の混合液として存在するとき、その全体を試験管内で増
幅することを可能にする準備手段であり、その基本的方
針は、様々なサイズの未知ＤＮＡ分子それぞれに対応し
て、既知の塩基配列を付加するところにある。 （A）まず未知二重鎖ＤＮＡ分子の断端は、平滑末端で
ある保証がないので、酵素処理により、陥没した領域に
はＤＮＡモノマーを付加し、突出した領域は一部削り取
って、全ての断端を平滑にする。 （B）65℃ 15分程度熱処理やフェノールクロロホルム処
理により、（A）の反応を止め、ＤＮＡを回収する。 （C）次に、平滑末端に結合できるアダプター（［実施
例１］に実例あり）を加え、T4リガーゼの作用により、
結合する。 （D）アダプターを結合したＤＮＡ溶液を３分注する。
ひとつは、そのままポリアクリルアミドゲルの電気泳導
に掛けゲルを切り出すか、分子ふるいのカラムに掛け、
例えば500bp 以上のＤＮＡ分子を精製する。 （E）残り２つの分注分は、４塩基対を認識し粘着末端
を作る２種の制限酵素で、それぞれを処理する。 （F）それぞれの粘着末端に結合できるアダプター
（［実施例２］に実例あり）を加え、断片化した未知Ｄ
ＮＡの両端に結合する。もとからの断端には、既にC,の
項目の所に記載された処理で、アダプターが結合されて
いる（図１）。 （G）アダプターを結合した２つの分注分は、ポリアク
リルアミドゲルの電気泳導に掛けゲルを切り出すか、分
子ふるいのカラムに掛け、例えば500bp 以上のＤＮＡ分
子を精製する。 （H）高塩基数ＤＮＡ分子の濃度を十分に高くし、米国
特許 No.4,683,195及びNo.4,683,202（日本では特開昭6
1-274697号公報及び特開昭62-281号公報にて公開中）の
方法（ＰＣＲ反応）を用いて、ＤＮＡの増幅を行う。 （H）高塩基数ＤＮＡ分子の濃度を十分に高くすること
で、ＰＣＲ反応を用いて、ＤＮＡの増幅を行っても、低
塩基数のＤＮＡのみが増幅され、高塩基数のＤＮＡ分子
は確認もできないと言うことは起こらない。
ＮＡ分子が微量しか得られず、かつ様々なサイズの分子
の混合液として存在するとき、その全体を試験管内で増
幅することを可能にする準備手段であり、その基本的方
針は、様々なサイズの未知ＤＮＡ分子それぞれに対応し
て、既知の塩基配列を付加するところにある。 （A）まず未知二重鎖ＤＮＡ分子の断端は、平滑末端で
ある保証がないので、酵素処理により、陥没した領域に
はＤＮＡモノマーを付加し、突出した領域は一部削り取
って、全ての断端を平滑にする。 （B）65℃ 15分程度熱処理やフェノールクロロホルム処
理により、（A）の反応を止め、ＤＮＡを回収する。 （C）次に、平滑末端に結合できるアダプター（［実施
例１］に実例あり）を加え、T4リガーゼの作用により、
結合する。 （D）アダプターを結合したＤＮＡ溶液を３分注する。
ひとつは、そのままポリアクリルアミドゲルの電気泳導
に掛けゲルを切り出すか、分子ふるいのカラムに掛け、
例えば500bp 以上のＤＮＡ分子を精製する。 （E）残り２つの分注分は、４塩基対を認識し粘着末端
を作る２種の制限酵素で、それぞれを処理する。 （F）それぞれの粘着末端に結合できるアダプター
（［実施例２］に実例あり）を加え、断片化した未知Ｄ
ＮＡの両端に結合する。もとからの断端には、既にC,の
項目の所に記載された処理で、アダプターが結合されて
いる（図１）。 （G）アダプターを結合した２つの分注分は、ポリアク
リルアミドゲルの電気泳導に掛けゲルを切り出すか、分
子ふるいのカラムに掛け、例えば500bp 以上のＤＮＡ分
子を精製する。 （H）高塩基数ＤＮＡ分子の濃度を十分に高くし、米国
特許 No.4,683,195及びNo.4,683,202（日本では特開昭6
1-274697号公報及び特開昭62-281号公報にて公開中）の
方法（ＰＣＲ反応）を用いて、ＤＮＡの増幅を行う。 （H）高塩基数ＤＮＡ分子の濃度を十分に高くすること
で、ＰＣＲ反応を用いて、ＤＮＡの増幅を行っても、低
塩基数のＤＮＡのみが増幅され、高塩基数のＤＮＡ分子
は確認もできないと言うことは起こらない。
【０００５】本発明の中では、様々な酵素が使われてい
る。例えば制限酵素というのは、二重鎖ＤＮＡを特定の
塩基配列を認識して切断する細菌性酵素のことである。
T4ポリメレースというのは、Panet et al. Biochemistr
y 12巻5045-5050 頁にあるように、二重鎖ＤＮＡ末端を
平滑化するのに効果的に働き、E. coli ＤＮＡポリメレ
ース・クレノー断片も Klenow et al. Eur. J. Biochem
45巻371 頁にあるように、平滑化に働くほか、ＤＮＡ
複製に働く。この様な酵素は、何れも、安価にて入手可
能なものである。更に本発明の中で使われる、プライマ
ーも、ビューケージとカルサース法 （Tetrahedron Le
tters 22巻1859-1862頁 1981年）に従って、多孔ガラス
担体を固層カラムとして合成することが可能である。ア
ダプターも、相補的なオリゴヌクレオチドを加熱し徐々
に冷却することで、調整することが出来る。
る。例えば制限酵素というのは、二重鎖ＤＮＡを特定の
塩基配列を認識して切断する細菌性酵素のことである。
T4ポリメレースというのは、Panet et al. Biochemistr
y 12巻5045-5050 頁にあるように、二重鎖ＤＮＡ末端を
平滑化するのに効果的に働き、E. coli ＤＮＡポリメレ
ース・クレノー断片も Klenow et al. Eur. J. Biochem
45巻371 頁にあるように、平滑化に働くほか、ＤＮＡ
複製に働く。この様な酵素は、何れも、安価にて入手可
能なものである。更に本発明の中で使われる、プライマ
ーも、ビューケージとカルサース法 （Tetrahedron Le
tters 22巻1859-1862頁 1981年）に従って、多孔ガラス
担体を固層カラムとして合成することが可能である。ア
ダプターも、相補的なオリゴヌクレオチドを加熱し徐々
に冷却することで、調整することが出来る。
【０００６】発明が解決しようとする課題の項目中に、
ＰＣＲ法では既知の塩基配列が二カ所にあれば、2000bp
ぐらいまでならばその間の部分のＤＮＡは試験管内で増
幅が可能であるとは書いたが、本発明の基本的方針にあ
る、様々なサイズの未知ＤＮＡ分子それぞれに対応し
て、既知の塩基配列を付加した場合には必ずしも当ては
まらない。2000bpまでも増幅可能なのは、テンプレート
になるＤＮＡ（２種のプライマーが相補的に結合できる
元のＤＮＡ分子）が、ＤＮＡ混液中にーカ所ないしは２
〜３カ所に限られているときである。ＰＣＲ反応で幾つ
もの増幅されたＤＮＡのバンドが電気泳導すると認めら
れる例がよく示されるが、プライマーの相補性が高い領
域が複数個ある場合である。本発明にあるように、プラ
イマーが結合する領域が多数ある場合は大きく状況が異
なる。まず、2000bpぐらいまでのＤＮＡ分子が増幅され
ていたものが、500bp を越える領域のＤＮＡ分子から増
幅されにくくなり、1000bp以上では不可能と思われる。
これは小さなＤＮＡ分子から大きなものまで、全てが同
じプライマーに相補的な領域を両端に有し、プライマー
や基質を競い合うとき、小さなＤＮＡが有利になり増幅
され易いためと考えられる。それ故、制限酵素による断
片化とアダプター結合の後、例えば500bp 以上のＤＮＡ
分子をアクリルアミドゲルで精製することにより、高塩
基数のテンプレートになるＤＮＡの濃度を上げた（ゲル
電気泳導による精製の精度は、米国特許No.4,683,195
日本では 特開昭61-274697号公報にあるＰＣＲ反応によ
る検出精度より遥かに低い）。もし低塩基数領域中にあ
るわずかのＤＮＡが失われるのを恐れるなら、例えば50
0bp 以下も精製してＰＣＲ反応を行えば良いが、高塩基
数領域のＤＮＡはほとんど増幅されない。例えば500bp
以上を精製してＰＣＲ反応を行えば、高塩基数領域に加
え、低塩基数領域も同時に増幅されてくる。
ＰＣＲ法では既知の塩基配列が二カ所にあれば、2000bp
ぐらいまでならばその間の部分のＤＮＡは試験管内で増
幅が可能であるとは書いたが、本発明の基本的方針にあ
る、様々なサイズの未知ＤＮＡ分子それぞれに対応し
て、既知の塩基配列を付加した場合には必ずしも当ては
まらない。2000bpまでも増幅可能なのは、テンプレート
になるＤＮＡ（２種のプライマーが相補的に結合できる
元のＤＮＡ分子）が、ＤＮＡ混液中にーカ所ないしは２
〜３カ所に限られているときである。ＰＣＲ反応で幾つ
もの増幅されたＤＮＡのバンドが電気泳導すると認めら
れる例がよく示されるが、プライマーの相補性が高い領
域が複数個ある場合である。本発明にあるように、プラ
イマーが結合する領域が多数ある場合は大きく状況が異
なる。まず、2000bpぐらいまでのＤＮＡ分子が増幅され
ていたものが、500bp を越える領域のＤＮＡ分子から増
幅されにくくなり、1000bp以上では不可能と思われる。
これは小さなＤＮＡ分子から大きなものまで、全てが同
じプライマーに相補的な領域を両端に有し、プライマー
や基質を競い合うとき、小さなＤＮＡが有利になり増幅
され易いためと考えられる。それ故、制限酵素による断
片化とアダプター結合の後、例えば500bp 以上のＤＮＡ
分子をアクリルアミドゲルで精製することにより、高塩
基数のテンプレートになるＤＮＡの濃度を上げた（ゲル
電気泳導による精製の精度は、米国特許No.4,683,195
日本では 特開昭61-274697号公報にあるＰＣＲ反応によ
る検出精度より遥かに低い）。もし低塩基数領域中にあ
るわずかのＤＮＡが失われるのを恐れるなら、例えば50
0bp 以下も精製してＰＣＲ反応を行えば良いが、高塩基
数領域のＤＮＡはほとんど増幅されない。例えば500bp
以上を精製してＰＣＲ反応を行えば、高塩基数領域に加
え、低塩基数領域も同時に増幅されてくる。
【０００７】米国特許 No.4,683,195 及び No.4,683,20
2（日本では特開昭61-274697号公報及び特開昭62-281号
公報にて公開中）の方法（ＰＣＲ反応）では、プライマ
ーは、リバースとフォワードのそれぞれは、違ったもの
として取り扱われていた。しかし、これは違った配列で
ある必要はなく、全く同じ物であっても構わないことが
分かり、本発明の中で利用されている。プライマーが安
定に相補的ＤＮＡ分子に付く温度のことを、アニーリン
グ温度と言うが、これはＧＣ含量に大きく依存する。塩
基配列が違えばこの温度も異なる。しかしプライマーが
リバースとフォワードとも同一であると、同一の温度で
二カ所に安定した相補的結合を作るので、理想的であ
る。適切なアダプター（実施例３では図３のアダプター
III やアダプターIV）を未知ＤＮＡの制限酵素処理前の
両端に結合するものに用いると、プライマーは（図１の
星印の付いた部分）一種類で、全てに対応するように仕
組むことが、可能である。
2（日本では特開昭61-274697号公報及び特開昭62-281号
公報にて公開中）の方法（ＰＣＲ反応）では、プライマ
ーは、リバースとフォワードのそれぞれは、違ったもの
として取り扱われていた。しかし、これは違った配列で
ある必要はなく、全く同じ物であっても構わないことが
分かり、本発明の中で利用されている。プライマーが安
定に相補的ＤＮＡ分子に付く温度のことを、アニーリン
グ温度と言うが、これはＧＣ含量に大きく依存する。塩
基配列が違えばこの温度も異なる。しかしプライマーが
リバースとフォワードとも同一であると、同一の温度で
二カ所に安定した相補的結合を作るので、理想的であ
る。適切なアダプター（実施例３では図３のアダプター
III やアダプターIV）を未知ＤＮＡの制限酵素処理前の
両端に結合するものに用いると、プライマーは（図１の
星印の付いた部分）一種類で、全てに対応するように仕
組むことが、可能である。
【０００８】
【作用】本申請中の発明は、ハイブリダイゼイション法
に使用可能な範囲でＤＮＡ分子を細分化するものの、全
く未知のＤＮＡを試験管内で増幅することを可能にす
る。ハイブリダイゼイション法に使用するプローブは、
様々な大きさのＤＮＡを用いることが可能であるが、低
塩基数のＤＮＡで遺伝子を検出するのに十分役立ち、高
塩基数のＤＮＡであればあるほど扱いが難しくなる。組
織中のＤＮＡ分子を検出するのに用いる、インサイチュ
ウハイブリダイゼイション法では、50-200bpぐらいが望
ましい。それ故、４塩基対を認識して切断する制限酵素
で処理することにより、ＤＮＡ分子の256bp （４の４
剰）に一カ所の確率で切断されるので、非常に都合のい
いサイズの分子が得られる。大きすぎるサイズや、小さ
すぎるサイズに切断される部分が出来るが、２種類の４
塩基対を認識して切断する制限酵素で、分注したそれぞ
れを処理すると、相補的に補い合うので、大きなＤＮＡ
分子であってもその塩基配列のほとんどの部分は、ハイ
ブリダイゼイション法で検出する対照とすることが出来
る（実施例２を参照）。最終的に一つの目的とするＤＮ
Ａ分子が、本発明の処理を経たものから見つかったな
ら、遺伝子全体の塩基配列はcDNAライブラリーから再ク
ローニングすることで知ることが出来る。それ故４塩基
対を認識して切断する制限酵素で処理することは、本発
明の利点となっても、欠点とはならない。更に、ある細
胞からその細胞内で発現している遺伝子のライブラリー
を作るとき、わずかしか発現していない遺伝子をクロー
ニングするのは難しいが、発現遺伝子のｃＤＮＡを本発
明を用いて増幅することで、代わりにそのｃＤＮＡの一
部をクローニングする可能性を高める。
に使用可能な範囲でＤＮＡ分子を細分化するものの、全
く未知のＤＮＡを試験管内で増幅することを可能にす
る。ハイブリダイゼイション法に使用するプローブは、
様々な大きさのＤＮＡを用いることが可能であるが、低
塩基数のＤＮＡで遺伝子を検出するのに十分役立ち、高
塩基数のＤＮＡであればあるほど扱いが難しくなる。組
織中のＤＮＡ分子を検出するのに用いる、インサイチュ
ウハイブリダイゼイション法では、50-200bpぐらいが望
ましい。それ故、４塩基対を認識して切断する制限酵素
で処理することにより、ＤＮＡ分子の256bp （４の４
剰）に一カ所の確率で切断されるので、非常に都合のい
いサイズの分子が得られる。大きすぎるサイズや、小さ
すぎるサイズに切断される部分が出来るが、２種類の４
塩基対を認識して切断する制限酵素で、分注したそれぞ
れを処理すると、相補的に補い合うので、大きなＤＮＡ
分子であってもその塩基配列のほとんどの部分は、ハイ
ブリダイゼイション法で検出する対照とすることが出来
る（実施例２を参照）。最終的に一つの目的とするＤＮ
Ａ分子が、本発明の処理を経たものから見つかったな
ら、遺伝子全体の塩基配列はcDNAライブラリーから再ク
ローニングすることで知ることが出来る。それ故４塩基
対を認識して切断する制限酵素で処理することは、本発
明の利点となっても、欠点とはならない。更に、ある細
胞からその細胞内で発現している遺伝子のライブラリー
を作るとき、わずかしか発現していない遺伝子をクロー
ニングするのは難しいが、発現遺伝子のｃＤＮＡを本発
明を用いて増幅することで、代わりにそのｃＤＮＡの一
部をクローニングする可能性を高める。
【０００９】本発明は、全く未知のＤＮＡ分子が微量し
か獲られず、かつ様々なサイズの分子の混合液として存
在するとき、存在比率は維持できないかも知れないが、
その全体を試験管内で増幅することを可能にした。さら
にＤＮＡ複製の時に標識モノマー（標識dNTP）を用いる
ならば、効率よく標識出来る、既知のプライマーを使っ
た標識法を提供するものである。
か獲られず、かつ様々なサイズの分子の混合液として存
在するとき、存在比率は維持できないかも知れないが、
その全体を試験管内で増幅することを可能にした。さら
にＤＮＡ複製の時に標識モノマー（標識dNTP）を用いる
ならば、効率よく標識出来る、既知のプライマーを使っ
た標識法を提供するものである。
【００１０】
【実施例１】本実験は、低塩基数ＤＮＡの平滑末端にそ
のままアダプターを結合する場合でも、本特許申請内容
が有効に働くことを示すために行った。模擬実験とし
て、バクテリオファージΦΧ174ＤＮＡを制限酵素 HaeI
IIで切断したものを、未知ＤＮＡ分子と見なし、アダプ
ターＩ（図３）をファージＤＮＡの平滑末端に、T4リガ
ーゼを作用させることにより、結合した。ファージＤＮ
Ａの液にアダプターＩを0.1μM以下ではあるが、ファー
ジＤＮＡ濃度よりは十分に高い濃度になるように加え
る。この混合液にT4リガーゼを加え、アダプターとファ
ージＤＮＡ断片を結合する。このリガーゼによる結合で
は、アダプター合成の際に、5'末端側に燐酸基を付けて
いないので、アダプター同士は同じ平滑末端を介しても
結合することはない。
のままアダプターを結合する場合でも、本特許申請内容
が有効に働くことを示すために行った。模擬実験とし
て、バクテリオファージΦΧ174ＤＮＡを制限酵素 HaeI
IIで切断したものを、未知ＤＮＡ分子と見なし、アダプ
ターＩ（図３）をファージＤＮＡの平滑末端に、T4リガ
ーゼを作用させることにより、結合した。ファージＤＮ
Ａの液にアダプターＩを0.1μM以下ではあるが、ファー
ジＤＮＡ濃度よりは十分に高い濃度になるように加え
る。この混合液にT4リガーゼを加え、アダプターとファ
ージＤＮＡ断片を結合する。このリガーゼによる結合で
は、アダプター合成の際に、5'末端側に燐酸基を付けて
いないので、アダプター同士は同じ平滑末端を介しても
結合することはない。
【００１１】バクテリオファージΦΧ174 ＤＮＡを制限
酵素 HaeIIIで切断したものは、(1,353 1,078 872 6
03 310 281 271 234 194 118 72)の塩基数であ
る。アダプターＩは、（化１、化２）の２つのオリゴデ
オキシリボヌクレオチドより合成した。
酵素 HaeIIIで切断したものは、(1,353 1,078 872 6
03 310 281 271 234 194 118 72)の塩基数であ
る。アダプターＩは、（化１、化２）の２つのオリゴデ
オキシリボヌクレオチドより合成した。
【００１２】
【化１】
【００１３】
【化２】
【００１４】オリゴヌクレオチド合成法 ビューケージとカルサース法（Tetrahedron Letters 22
巻1859-1862頁1981年）に従って、多孔ガラス担体を固
層カラムとして合成した。カラムからは、30%水酸化ア
ンモニウム溶液を注入し反応させ、カラムから生成物を
遊離させ、55℃で、一晩反応を進め、保護基を外す。濃
縮、沈澱、精製の処理後、260 nmの紫外光吸収度によ
り、その濃度を算出する。
巻1859-1862頁1981年）に従って、多孔ガラス担体を固
層カラムとして合成した。カラムからは、30%水酸化ア
ンモニウム溶液を注入し反応させ、カラムから生成物を
遊離させ、55℃で、一晩反応を進め、保護基を外す。濃
縮、沈澱、精製の処理後、260 nmの紫外光吸収度によ
り、その濃度を算出する。
【００１５】アダプターの合成法 精製されたオリゴヌクレオチド（化１）と（化２）の溶
液を等モル数量づつ混合し、一度95℃にまで加熱し、そ
の後緩やかに温度を室温にまで下げる。この段階で、オ
リゴヌクレオチド（化１）と（化２）は互いにハイブリ
ダイズし、二重鎖構造を持ったアダプターＩが調製され
る。
液を等モル数量づつ混合し、一度95℃にまで加熱し、そ
の後緩やかに温度を室温にまで下げる。この段階で、オ
リゴヌクレオチド（化１）と（化２）は互いにハイブリ
ダイズし、二重鎖構造を持ったアダプターＩが調製され
る。
【００１６】アダプターＩを結合したΦΧ174ＤＮＡの
混合物を、8%ポリアクリルアミドゲル電気泳導に掛ける
ことにより、500bp以上のＤＮＡ分子を精製した。増幅
のための準備が出来たかどうかを確かめる目的で、米国
特許 No. 4,683,195及び No.4,683,202（日本では特開
昭61-274697号公報及び特開昭62-281号公報にて公開
中）の方法（ＰＣＲ反応）で、精製前後のΦΧ174 ＤＮ
Ａをテンプレートとし、（化２）をプライマー、ＤＮＡ
合成酵素には TTHポリメレース（高度好熱菌ＤＮＡポリ
メレース）を用いて、増幅反応を試験管内で行った。テ
ンプレートＤＮＡには、非燐酸化5'末端を持つアダプタ
ーを結合し、ニックが入ったままの状態にあるので、Ｐ
ＣＲ反応サイクルには72℃で１分間ポリメレース反応に
より、ニックを除くステップを始めにおいた。
混合物を、8%ポリアクリルアミドゲル電気泳導に掛ける
ことにより、500bp以上のＤＮＡ分子を精製した。増幅
のための準備が出来たかどうかを確かめる目的で、米国
特許 No. 4,683,195及び No.4,683,202（日本では特開
昭61-274697号公報及び特開昭62-281号公報にて公開
中）の方法（ＰＣＲ反応）で、精製前後のΦΧ174 ＤＮ
Ａをテンプレートとし、（化２）をプライマー、ＤＮＡ
合成酵素には TTHポリメレース（高度好熱菌ＤＮＡポリ
メレース）を用いて、増幅反応を試験管内で行った。テ
ンプレートＤＮＡには、非燐酸化5'末端を持つアダプタ
ーを結合し、ニックが入ったままの状態にあるので、Ｐ
ＣＲ反応サイクルには72℃で１分間ポリメレース反応に
より、ニックを除くステップを始めにおいた。
【００１７】反応によって生成されたＤＮＡを8%ポリア
クリクアミドゲルで電気泳導し、増幅の程度を確かめた
（図２レーン２、３）。その結果、500bp 以上のＤＮＡ
分子を精製してテンプレートとしたものでは、500bp 以
上のＤＮＡ分子も増幅されていたが、500bp 以下のＤＮ
Ａ分子も効率よく増幅されていた。アクリルアミドゲル
による精製では、上記増幅反応でも増幅されないほどに
精度高く500bp 以下のＤＮＡ分子を除去出来なかったと
考えられる。
クリクアミドゲルで電気泳導し、増幅の程度を確かめた
（図２レーン２、３）。その結果、500bp 以上のＤＮＡ
分子を精製してテンプレートとしたものでは、500bp 以
上のＤＮＡ分子も増幅されていたが、500bp 以下のＤＮ
Ａ分子も効率よく増幅されていた。アクリルアミドゲル
による精製では、上記増幅反応でも増幅されないほどに
精度高く500bp 以下のＤＮＡ分子を除去出来なかったと
考えられる。
【００１８】実施例１により、1000bp以下の二重鎖ＤＮ
Ａ分子であるなら、両端にアダプターＩを結合し、ＰＣ
Ｒ反応に供する500bp 以上のテンプレートＤＮＡ分子濃
度を精製して高めることで、全体に均一ではないが増幅
可能であり、本特許申請内容の一部が、ＰＣＲ増幅反応
の前処理として有効に働くことが示された。
Ａ分子であるなら、両端にアダプターＩを結合し、ＰＣ
Ｒ反応に供する500bp 以上のテンプレートＤＮＡ分子濃
度を精製して高めることで、全体に均一ではないが増幅
可能であり、本特許申請内容の一部が、ＰＣＲ増幅反応
の前処理として有効に働くことが示された。
【００１９】
【実施例２】本実験は、高塩基数ＤＮＡを制限酵素で、
細分化した際にも、本特許申請内容が有効に働くことを
示すために行った。模擬実験として、pUC19プラスミッ
ドＤＮＡを未知ＤＮＡ分子と見なし、制限酵素 Sau3AI
ないしはHapIIで切断し、アダプターII（図３）をＤＮ
Ａの粘着末端に、T4リガーゼを作用させることにより、
結合した。
細分化した際にも、本特許申請内容が有効に働くことを
示すために行った。模擬実験として、pUC19プラスミッ
ドＤＮＡを未知ＤＮＡ分子と見なし、制限酵素 Sau3AI
ないしはHapIIで切断し、アダプターII（図３）をＤＮ
Ａの粘着末端に、T4リガーゼを作用させることにより、
結合した。
【００２０】pUC19プラスミッドＤＮＡ （2,686bp の環
状ＤＮＡ）を、制限酵素 Sau3AIないしはHapII で切断
したものは、 Sau3AI : 955 585 341 258 141 105 78 75 46
36 18 17 12 11 8 HapII : 501 489 404 331 242 190 147 111 1
10 67 34 34 26 の様な、それぞれ14本と12本の二重鎖ＤＮＡ分子に分か
れる。このうち、100bp以下の大きさのＤＮＡ分子は、
ハイブリダイゼイション法のプローブとしても、クロー
ニングする対象物としても小さすぎる。しかし元のＤＮ
Ａを含む溶液を、二分注しておき、一方をSau3AIで、他
方をHapII で切断するならば、相補的に一方では、100b
p以下の分子に切断される部分も、他方では100bp以上の
分子内に含まれ、ハイブリダイゼイション法のためのプ
ローブなどに使用することが出来る。pUC19ＤＮＡ分子2
686bp のうち、いずれの制限酵素処理でも100bp 以下の
ＤＮＡ分子中に含まれてしまう部分はなかった（図
４）。
状ＤＮＡ）を、制限酵素 Sau3AIないしはHapII で切断
したものは、 Sau3AI : 955 585 341 258 141 105 78 75 46
36 18 17 12 11 8 HapII : 501 489 404 331 242 190 147 111 1
10 67 34 34 26 の様な、それぞれ14本と12本の二重鎖ＤＮＡ分子に分か
れる。このうち、100bp以下の大きさのＤＮＡ分子は、
ハイブリダイゼイション法のプローブとしても、クロー
ニングする対象物としても小さすぎる。しかし元のＤＮ
Ａを含む溶液を、二分注しておき、一方をSau3AIで、他
方をHapII で切断するならば、相補的に一方では、100b
p以下の分子に切断される部分も、他方では100bp以上の
分子内に含まれ、ハイブリダイゼイション法のためのプ
ローブなどに使用することが出来る。pUC19ＤＮＡ分子2
686bp のうち、いずれの制限酵素処理でも100bp 以下の
ＤＮＡ分子中に含まれてしまう部分はなかった（図
４）。
【００２１】ここで用いたアダプターは、図３に記した
が、一方の端が、Sau3AIの切断に依って出来る粘着末端
に相補的な配列の突出があり、他方の端はHapII の切断
に依って出来る粘着末端に相補的な配列の突出がある。
さらにこのアダプター内部にNotIの認識部位があるの
で、アダプター結合がクローニングの際にも役立つ。さ
らに米国特許 No. 4,683,195 及び No.4,683,202（日本
では特開昭61-274697 号公報及び特開昭62-281号公報に
て公開中）の方法（ＰＣＲ反応）で増幅したときには、
制限酵素 EcoRIの認識部位も出来るように工夫されてい
る（図３）。アダプターIIは、（化３、化４）の２つの
オリゴデオキシリボヌクレオチドより合成した。
が、一方の端が、Sau3AIの切断に依って出来る粘着末端
に相補的な配列の突出があり、他方の端はHapII の切断
に依って出来る粘着末端に相補的な配列の突出がある。
さらにこのアダプター内部にNotIの認識部位があるの
で、アダプター結合がクローニングの際にも役立つ。さ
らに米国特許 No. 4,683,195 及び No.4,683,202（日本
では特開昭61-274697 号公報及び特開昭62-281号公報に
て公開中）の方法（ＰＣＲ反応）で増幅したときには、
制限酵素 EcoRIの認識部位も出来るように工夫されてい
る（図３）。アダプターIIは、（化３、化４）の２つの
オリゴデオキシリボヌクレオチドより合成した。
【００２２】
【化３】
【００２３】
【化４】
【００２４】精製されたオリゴヌクレオチド（化３）と
（化４）の溶液を等モル数量ずつ混合し、一度95℃にま
で加熱し、その後緩やかに温度を室温にまで下げる。こ
の段階で、オリゴヌクレオチド（化３）と（化４）は互
いにハイブリダイズし、二重鎖構造を持ったアダプター
IIが調製される。
（化４）の溶液を等モル数量ずつ混合し、一度95℃にま
で加熱し、その後緩やかに温度を室温にまで下げる。こ
の段階で、オリゴヌクレオチド（化３）と（化４）は互
いにハイブリダイズし、二重鎖構造を持ったアダプター
IIが調製される。
【００２５】HapII による切断の場合は、未知ＤＮＡは
アダプターIIのHapII 用粘着末端側で両側に結合する。
Sau3AIによる切断の場合は、未知ＤＮＡはアダプターII
のSau3AI用粘着末端側で両側に結合する（図３）。ＰＣ
Ｒ反応の際に必要とするプライマーは、HapII による切
断の場合は、どちらの方向の複製も（reverse andforwa
rd）同一のプライマー（化４）が働く。Sau3AI による
切断の場合は、どちらの方向の複製にも、同一のプライ
マー（化３）が働く。米国特許 No. 4,683,195及び No.
4,683,202（日本では特開昭61-274697号公報及び特開昭
62-281号公報にて公開中）の方法（ＰＣＲ反応）では、
双方向の複製に働くプライマーは、それぞれ異なったも
のとして記載されていたが、同一のものであってもその
増幅の効率は変わらないと思われた。増幅されたＤＮＡ
は、8%ポリアクリクアミドゲルに掛けて、図２のレーン
４〜８に示す（図２）。
アダプターIIのHapII 用粘着末端側で両側に結合する。
Sau3AIによる切断の場合は、未知ＤＮＡはアダプターII
のSau3AI用粘着末端側で両側に結合する（図３）。ＰＣ
Ｒ反応の際に必要とするプライマーは、HapII による切
断の場合は、どちらの方向の複製も（reverse andforwa
rd）同一のプライマー（化４）が働く。Sau3AI による
切断の場合は、どちらの方向の複製にも、同一のプライ
マー（化３）が働く。米国特許 No. 4,683,195及び No.
4,683,202（日本では特開昭61-274697号公報及び特開昭
62-281号公報にて公開中）の方法（ＰＣＲ反応）では、
双方向の複製に働くプライマーは、それぞれ異なったも
のとして記載されていたが、同一のものであってもその
増幅の効率は変わらないと思われた。増幅されたＤＮＡ
は、8%ポリアクリクアミドゲルに掛けて、図２のレーン
４〜８に示す（図２）。
【００２６】テンプレートＤＮＡには、非燐酸化5'末端
を持つアダプターを結合し、ニックが入ったままの状態
にあるので、ＰＣＲ反応サイクルには72℃で１分間ポリ
メレース反応により、ニックを除くステップを始めにお
いた。
を持つアダプターを結合し、ニックが入ったままの状態
にあるので、ＰＣＲ反応サイクルには72℃で１分間ポリ
メレース反応により、ニックを除くステップを始めにお
いた。
【００２７】
【実施例３】実際に、未知ＤＮＡ混合液で、実施例１、
実施例２を組み合わせて、増幅実験を行った。ラットの
脳の一領域を切り出し、この部分からｍＲＮＡを抽出し
て、ｃＤＮＡを合成した。ｍＲＮＡの抽出はPharmacia
P-L Biochemicals, Analects1988 16巻1- にある方法に
従い、ｃＤＮＡの合成は Gubler & Hoffman Gene,25
巻 263-269頁の方法に従った。ｃＤＮＡはＲＮＡ逆転写
酵素により、ｍＲＮＡにより合成され、ＲＮＡ，ＤＮＡ
ハイブリッドにＲＮａｓｅＨを作用させて切れ目を入
れ、ポリメレースＩとリガーゼにより二本鎖ＤＮＡにす
る、クレノーフラグメントによって、末端を平滑にし、
続いてGubler & Hoffmanの方法では、両端にリンカーを
付けるところを、代わりにアダプターＩ（図３）を結合
した。アダプターを0.1μM以下ではあるが、未知ＤＮＡ
濃度よりは十分に高い濃度になるように加える。この混
合液にT4リガーゼを加え、アダプターと未知ＤＮＡ断片
を結合する。このリガーゼによる結合では、アダプター
合成の際に、5'末端側に燐酸基を付けていないので、ア
ダプター同士は同じ平滑末端を介しても結合することは
ない。
実施例２を組み合わせて、増幅実験を行った。ラットの
脳の一領域を切り出し、この部分からｍＲＮＡを抽出し
て、ｃＤＮＡを合成した。ｍＲＮＡの抽出はPharmacia
P-L Biochemicals, Analects1988 16巻1- にある方法に
従い、ｃＤＮＡの合成は Gubler & Hoffman Gene,25
巻 263-269頁の方法に従った。ｃＤＮＡはＲＮＡ逆転写
酵素により、ｍＲＮＡにより合成され、ＲＮＡ，ＤＮＡ
ハイブリッドにＲＮａｓｅＨを作用させて切れ目を入
れ、ポリメレースＩとリガーゼにより二本鎖ＤＮＡにす
る、クレノーフラグメントによって、末端を平滑にし、
続いてGubler & Hoffmanの方法では、両端にリンカーを
付けるところを、代わりにアダプターＩ（図３）を結合
した。アダプターを0.1μM以下ではあるが、未知ＤＮＡ
濃度よりは十分に高い濃度になるように加える。この混
合液にT4リガーゼを加え、アダプターと未知ＤＮＡ断片
を結合する。このリガーゼによる結合では、アダプター
合成の際に、5'末端側に燐酸基を付けていないので、ア
ダプター同士は同じ平滑末端を介しても結合することは
ない。
【００２８】アダプターIの代わりに、制限酵素Sau3AI
で切断する分注分には、アダプターIII、HaeIII で切断
する分注分には、アダプターIV（図３）を結合すると、
ＰＣＲ反応の際のプライマーを一種類にすることができ
る。
で切断する分注分には、アダプターIII、HaeIII で切断
する分注分には、アダプターIV（図３）を結合すると、
ＰＣＲ反応の際のプライマーを一種類にすることができ
る。
【００２９】４分注して、一つは保存し、一つはポリア
クリルアミドゲルにかけて電気泳導し500bp 以上のサイ
ズのＤＮＡと以下のサイズのものとに分離した。
クリルアミドゲルにかけて電気泳導し500bp 以上のサイ
ズのＤＮＡと以下のサイズのものとに分離した。
【００３０】残り二つの1/4量は、一方はSau3AI で他方
はHaeIIIという二種類の制限酵素でＤＮＡ分子を切断し
た。そして、それぞれの液にアダプターII（図３）を0.
1μM以下ではあるが、未知ＤＮＡ濃度よりは十分に高い
濃度になるように加える。この混合液にT4リガーゼを加
え、アダプターと未知ＤＮＡ断片を結合する。このリガ
ーゼによる結合では、アダプター合成の際に、5'末端側
に燐酸基を付けていないので、アダプター同士は相補的
な粘着末端を介しても結合することはない。
はHaeIIIという二種類の制限酵素でＤＮＡ分子を切断し
た。そして、それぞれの液にアダプターII（図３）を0.
1μM以下ではあるが、未知ＤＮＡ濃度よりは十分に高い
濃度になるように加える。この混合液にT4リガーゼを加
え、アダプターと未知ＤＮＡ断片を結合する。このリガ
ーゼによる結合では、アダプター合成の際に、5'末端側
に燐酸基を付けていないので、アダプター同士は相補的
な粘着末端を介しても結合することはない。
【００３１】アダプターを結合した未知ＤＮＡは、ポリ
アクリルアミドゲルにかけて電気泳導し500bp 以上のサ
イズのＤＮＡと以下のサイズのものとに分離した。
アクリルアミドゲルにかけて電気泳導し500bp 以上のサ
イズのＤＮＡと以下のサイズのものとに分離した。
【００３２】それぞれの分注分で、直接及び、低塩基数
ＤＮＡ精製分、高塩基数ＤＮＡ精製分から、ＰＣＲ反応
のテンプレートとして一部を取り、（化３）ないし（化
４）をプライマーとしてＰＣＲ反応を行った。テンプレ
ートＤＮＡには、非燐酸化5'末端を持つアダプターを結
合し、ニックが入ったままの状態にあるので、ＰＣＲ反
応サイクルには72℃で１分間ポリメレース反応により、
ニックを除くステップを始めにおいた。
ＤＮＡ精製分、高塩基数ＤＮＡ精製分から、ＰＣＲ反応
のテンプレートとして一部を取り、（化３）ないし（化
４）をプライマーとしてＰＣＲ反応を行った。テンプレ
ートＤＮＡには、非燐酸化5'末端を持つアダプターを結
合し、ニックが入ったままの状態にあるので、ＰＣＲ反
応サイクルには72℃で１分間ポリメレース反応により、
ニックを除くステップを始めにおいた。
【００３３】ＰＣＲ反応産物を再びポリアクリルアミド
ゲルにかけて電気泳導し500bp 以上のサイズのＤＮＡを
得てテンプレートＤＮＡとして使用することもできる
が、できれば元の精製した溶液を使うことが望ましい。
ＰＣＲ反応を繰り返している間に、溶液中に含まれる分
子の多様性が失われて行くことが考えられるからであ
る。
ゲルにかけて電気泳導し500bp 以上のサイズのＤＮＡを
得てテンプレートＤＮＡとして使用することもできる
が、できれば元の精製した溶液を使うことが望ましい。
ＰＣＲ反応を繰り返している間に、溶液中に含まれる分
子の多様性が失われて行くことが考えられるからであ
る。
【００３４】増幅された反応産物を、同じく8%ポリアク
リルアミドゲルにかけて図５に示す。
リルアミドゲルにかけて図５に示す。
【００３５】
【発明の効果】［実施例１］から［実施例３］において
示された様に、本申請中の発明は、ハイブリダイゼイシ
ョン法に使用可能な範囲でＤＮＡ分子を細分化するもの
の、全く未知のＤＮＡを試験管内で増幅することを可能
にした。更に、ある細胞からその細胞内で発現している
遺伝子のライブラリーを作るとき、わずかしか発現して
いない遺伝子をクローニングするのは難しいが、発現遺
伝子のｃＤＮＡを本発明をもちいて増幅することで、代
わりにそのｃＤＮＡの一部をクローニングする可能性を
高める。
示された様に、本申請中の発明は、ハイブリダイゼイシ
ョン法に使用可能な範囲でＤＮＡ分子を細分化するもの
の、全く未知のＤＮＡを試験管内で増幅することを可能
にした。更に、ある細胞からその細胞内で発現している
遺伝子のライブラリーを作るとき、わずかしか発現して
いない遺伝子をクローニングするのは難しいが、発現遺
伝子のｃＤＮＡを本発明をもちいて増幅することで、代
わりにそのｃＤＮＡの一部をクローニングする可能性を
高める。
【００３６】本発明は、全く未知のＤＮＡ分子が微量し
か獲られず、かつ様々なサイズの分子の混合液として存
在するとき、存在比率は維持できないかも知れないが、
その全体を試験管内で増幅することを可能にした。さら
にＤＮＡ複製の時に標識モノマー（標識dNTP）を用いる
ならば、効率よく標識出来る、既知のプライマーを使っ
た標識法を提供するものである。
か獲られず、かつ様々なサイズの分子の混合液として存
在するとき、存在比率は維持できないかも知れないが、
その全体を試験管内で増幅することを可能にした。さら
にＤＮＡ複製の時に標識モノマー（標識dNTP）を用いる
ならば、効率よく標識出来る、既知のプライマーを使っ
た標識法を提供するものである。
【図１】未知ＤＮＡを増幅するための準備過程の、総合
した模式図。図にあるアダプターI とIIは、図３にその
実際例を示す。星印を付けたオリゴヌクレオチドは、Ｐ
ＣＲ増幅の際のプライマーとなる部分を示す。
した模式図。図にあるアダプターI とIIは、図３にその
実際例を示す。星印を付けたオリゴヌクレオチドは、Ｐ
ＣＲ増幅の際のプライマーとなる部分を示す。
【図２】実施例１、実施例２の準備処理後、ＰＣＲ増幅
を行ったＤＮＡ混液を、8%アクリルアミドゲルにて電気
泳導したもの。左の数は塩基数(bp)を示す。アダプター
を付け、高塩基数領域を精製したものをテンプレートＤ
ＮＡに用いたときに、より高塩基数領域まで増幅するこ
とが出来た。 レーン１：マーカー（バクテリオファージΦΧ174 ＤＮ
Ａを制限酵素 HaeIIIで切 断したもの） レーン２：ΦΧ174 ＤＮＡを制限酵素 HaeIIIで切断し
たものにアダプターIを付け電気泳導で高塩基数領域を
精製してＰＣＲ増幅を行ったＤＮＡ混液 レーン３：ΦΧ174 ＤＮＡを制限酵素 HaeIIIで切断し
たものにアダプターIを付け電気泳動せずにＰＣＲ増幅
を行ったＤＮＡ混液 レーン４：pUC19プラスミッドＤＮＡを、Sau3AI で切断
したものにアダプターIIを付け、電気泳導で高塩基数領
域を精製してＰＣＲ増幅を行ったＤＮＡ混液 レーン５：pUC19プラスミッドＤＮＡを、Sau3AI で切断
したものにアダプターIIを付け、電気泳導で低塩基数領
域を精製してＰＣＲ増幅を行ったＤＮＡ混液 レーン６：pUC19プラスミッドＤＮＡを、Sau3AI で切断
したものにアダプターIIを付け、電気泳導せず直接ＰＣ
Ｒ増幅を行ったＤＮＡ混液 レーン７：pUC19プラスミッドＤＮＡを、Sau3AI で切断
したものにアダプターIIを付け、電気泳導で高塩基数領
域を精製してＰＣＲ増幅を行ったＤＮＡ混液 レーン８：pUC19プラスミッドＤＮＡを、Sau3AI で切断
したものにアダプターIIを付け、電気泳導で低塩基数領
域を精製してＰＣＲ増幅を行ったＤＮＡ混液
を行ったＤＮＡ混液を、8%アクリルアミドゲルにて電気
泳導したもの。左の数は塩基数(bp)を示す。アダプター
を付け、高塩基数領域を精製したものをテンプレートＤ
ＮＡに用いたときに、より高塩基数領域まで増幅するこ
とが出来た。 レーン１：マーカー（バクテリオファージΦΧ174 ＤＮ
Ａを制限酵素 HaeIIIで切 断したもの） レーン２：ΦΧ174 ＤＮＡを制限酵素 HaeIIIで切断し
たものにアダプターIを付け電気泳導で高塩基数領域を
精製してＰＣＲ増幅を行ったＤＮＡ混液 レーン３：ΦΧ174 ＤＮＡを制限酵素 HaeIIIで切断し
たものにアダプターIを付け電気泳動せずにＰＣＲ増幅
を行ったＤＮＡ混液 レーン４：pUC19プラスミッドＤＮＡを、Sau3AI で切断
したものにアダプターIIを付け、電気泳導で高塩基数領
域を精製してＰＣＲ増幅を行ったＤＮＡ混液 レーン５：pUC19プラスミッドＤＮＡを、Sau3AI で切断
したものにアダプターIIを付け、電気泳導で低塩基数領
域を精製してＰＣＲ増幅を行ったＤＮＡ混液 レーン６：pUC19プラスミッドＤＮＡを、Sau3AI で切断
したものにアダプターIIを付け、電気泳導せず直接ＰＣ
Ｒ増幅を行ったＤＮＡ混液 レーン７：pUC19プラスミッドＤＮＡを、Sau3AI で切断
したものにアダプターIIを付け、電気泳導で高塩基数領
域を精製してＰＣＲ増幅を行ったＤＮＡ混液 レーン８：pUC19プラスミッドＤＮＡを、Sau3AI で切断
したものにアダプターIIを付け、電気泳導で低塩基数領
域を精製してＰＣＲ増幅を行ったＤＮＡ混液
【図３】実施例１、実施例２、実施例３にて使用した、
アダプターの構造を示す図。破線の囲みは、制限酵素No
tIの認識部位。
アダプターの構造を示す図。破線の囲みは、制限酵素No
tIの認識部位。
【図４】pUC19 を、制限酵素Sau3AIないしはHaeIIIで切
断した時の、制限酵素切断地図。pUC19ＤＮＡ分子2686b
p のうち、いずれの制限酵素処理でも100bp 以下のＤＮ
Ａ分子中に含まれてしまう部分はなく、ハイブリダイゼ
イション法のための対象領域になり得ることを示す。
断した時の、制限酵素切断地図。pUC19ＤＮＡ分子2686b
p のうち、いずれの制限酵素処理でも100bp 以下のＤＮ
Ａ分子中に含まれてしまう部分はなく、ハイブリダイゼ
イション法のための対象領域になり得ることを示す。
【図５】実施例３の準備処理後、ＰＣＲ増幅を行ったＤ
ＮＡ混液を、8%アクリルアミドゲルにて電気泳導したも
の。左の数は塩基数(bp)を示す。何れの例でも、高塩基
数領域を精製してＰＣＲ増幅したもので、相対的により
高塩基数領域までの増幅がみられた。精製せずに直接Ｐ
ＣＲ増幅したものと、低塩基数領域を精製してＰＣＲ増
幅したものでは、相対的に同様の低塩基数領域のＤＮＡ
が増幅されてきた。 レーン１：マーカー（バクテリオファージΦΧ174 ＤＮ
Ａを制限酵素 HaeIIIで切 断したもの） レーン２：ラットの脳の一部から取ったmRNAより二重鎖
cDNAを得て、アダプターＩを付け、直接ＰＣＲ増幅を行
ったＤＮＡ混液 レーン３：同cDNAにアダプターＩを付け、高塩基数領域
(500 bp以上)を精製してＰＣＲ増幅を行ったＤＮＡ混液 レーン４：同cDNAにアダプターＩを付け、低塩基数領域
(500 bp以下)を精製してＰＣＲ増幅を行ったＤＮＡ混液 レーン５：同cDNAにアダプターＩを付け、Sau3AI制限酵
素処理をし、さらにアダプターIIを付け、直接ＰＣＲ増
幅を行ったＤＮＡ混液 レーン６：同cDNAにアダプターＩを付け、Sau3AI制限酵
素処理をし、さらにアダプターIIを付け、高塩基数領域
(500 bp以上)を精製してＰＣＲ増幅を行ったＤＮＡ混液 レーン７：同cDNAにアダプターＩを付け、Sau3AI制限酵
素処理をし、さらにアダプターIIを付け、低塩基数領域
(500 bp以下)を精製してＰＣＲ増幅を行ったＤＮＡ混液 レーン８：同cDNAにアダプターＩを付け、HapII 制限酵
素処理をし、さらにアダプターIIを付け、直接ＰＣＲ増
幅を行ったＤＮＡ混液 レーン９：同cDNAにアダプターＩを付け、HapII 制限酵
素処理をし、さらにアダプターIIを付け、高塩基数領域
(500 bp以上)を精製してＰＣＲ増幅を行ったＤＮＡ混液 レーン１０：同cDNAにアダプターＩを付け、HapII 制限
酵素処理をし、さらにアダプターIIを付け、低塩基数領
域(500 bp以下)を精製してＰＣＲ増幅を行ったＤＮＡ混
液
ＮＡ混液を、8%アクリルアミドゲルにて電気泳導したも
の。左の数は塩基数(bp)を示す。何れの例でも、高塩基
数領域を精製してＰＣＲ増幅したもので、相対的により
高塩基数領域までの増幅がみられた。精製せずに直接Ｐ
ＣＲ増幅したものと、低塩基数領域を精製してＰＣＲ増
幅したものでは、相対的に同様の低塩基数領域のＤＮＡ
が増幅されてきた。 レーン１：マーカー（バクテリオファージΦΧ174 ＤＮ
Ａを制限酵素 HaeIIIで切 断したもの） レーン２：ラットの脳の一部から取ったmRNAより二重鎖
cDNAを得て、アダプターＩを付け、直接ＰＣＲ増幅を行
ったＤＮＡ混液 レーン３：同cDNAにアダプターＩを付け、高塩基数領域
(500 bp以上)を精製してＰＣＲ増幅を行ったＤＮＡ混液 レーン４：同cDNAにアダプターＩを付け、低塩基数領域
(500 bp以下)を精製してＰＣＲ増幅を行ったＤＮＡ混液 レーン５：同cDNAにアダプターＩを付け、Sau3AI制限酵
素処理をし、さらにアダプターIIを付け、直接ＰＣＲ増
幅を行ったＤＮＡ混液 レーン６：同cDNAにアダプターＩを付け、Sau3AI制限酵
素処理をし、さらにアダプターIIを付け、高塩基数領域
(500 bp以上)を精製してＰＣＲ増幅を行ったＤＮＡ混液 レーン７：同cDNAにアダプターＩを付け、Sau3AI制限酵
素処理をし、さらにアダプターIIを付け、低塩基数領域
(500 bp以下)を精製してＰＣＲ増幅を行ったＤＮＡ混液 レーン８：同cDNAにアダプターＩを付け、HapII 制限酵
素処理をし、さらにアダプターIIを付け、直接ＰＣＲ増
幅を行ったＤＮＡ混液 レーン９：同cDNAにアダプターＩを付け、HapII 制限酵
素処理をし、さらにアダプターIIを付け、高塩基数領域
(500 bp以上)を精製してＰＣＲ増幅を行ったＤＮＡ混液 レーン１０：同cDNAにアダプターＩを付け、HapII 制限
酵素処理をし、さらにアダプターIIを付け、低塩基数領
域(500 bp以下)を精製してＰＣＲ増幅を行ったＤＮＡ混
液
Claims (4)
- 【請求項１】 微量にしか得ることの出来ない、未知二
重鎖ＤＮＡ分子の両端を、酵素処理により平滑末端と
し、適切な大きさのアダプターを結合して、分子両端部
に既知領域を作る。含まれる高塩基数ＤＮＡ分子につい
ては細分化する目的で、２種以上の、ＤＮＡ鎖途中の４
塩基対を認識し粘着末端を作る制限酵素で、分注した溶
液中のＤＮＡをそれぞれ切断し、その粘着末端に結合で
きる適切な大きさのアダプターを結合して分子両端部に
既知領域を作る。この未知ＤＮＡ分子末端に作られた既
知領域に対するプライマーを用い、既存のＤＮＡ試験管
内増幅法を活用できるように準備する方法。 - 【請求項２】 微量にしか得ることの出来ない、未知二
重鎖ＤＮＡ分子の両端の３’端に、同種塩基を重合させ
る酵素を用い、分子両端部に既知領域を作る。以降［請
求項１］の制限酵素処理以下の操作をする方法。 - 【請求項３】 ［請求項１］［請求項２］にある方法
で、ＤＮＡ分子両端部に既知領域を作り、既知領域に対
するプライマー及び標識モノマー（標識dNTP）を用い
て、未知二重鎖ＤＮＡを標識する方法。 - 【請求項４】 微量未知ＤＮＡ分子を増幅する準備をす
るキットであって、（A）未知ＤＮＡの平滑末端に結合
するためのアダプター一種を入れたコンテナー、（B）
結合試薬を入れたコンテナー、（C）２種の粘着末端を
作る制限酵素を入れたコンテナー、（D）制限酵素によ
って出来た粘着末端に結合するアダプターを入れたコン
テナー、（E）上記のアダプターを構成し、増幅反応
や、標識反応のときのプライマーにな るオリゴヌ
クレオチドを入れたコンテナー、少なくとも以上のもの
を有するパッケージタイプの多コンテナー型ユニットか
ら成るキット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34145492A JPH06153952A (ja) | 1992-11-26 | 1992-11-26 | 微量未知二重鎖ｄｎａ分子の増幅、標識を行うための前処理方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34145492A JPH06153952A (ja) | 1992-11-26 | 1992-11-26 | 微量未知二重鎖ｄｎａ分子の増幅、標識を行うための前処理方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06153952A true JPH06153952A (ja) | 1994-06-03 |
Family
ID=18346201
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP34145492A Pending JPH06153952A (ja) | 1992-11-26 | 1992-11-26 | 微量未知二重鎖ｄｎａ分子の増幅、標識を行うための前処理方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06153952A (ja) |
Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002103007A1 (fr) * | 2001-06-19 | 2002-12-27 | Eisai C0. Ltd. | Methode d'uniformisation des contenus de fragments d'adn et methode de soustraction |
| US7994159B2 (en) | 2003-03-10 | 2011-08-09 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | c-Kit kinase inhibitor |
| US8865737B2 (en) | 2006-08-28 | 2014-10-21 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Antitumor agent for undifferentiated gastric cancer |
| US8952035B2 (en) | 2007-11-09 | 2015-02-10 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Combination of anti-angiogenic substance and anti-tumor platinum complex |
| US8962655B2 (en) | 2007-01-29 | 2015-02-24 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Composition for treatment of undifferentiated gastric cancer |
| US8962650B2 (en) | 2011-04-18 | 2015-02-24 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Therapeutic agent for tumor |
| US8969344B2 (en) | 2005-08-02 | 2015-03-03 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Method for assay on the effect of vascularization inhibitor |
| US9006256B2 (en) | 2006-05-18 | 2015-04-14 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Antitumor agent for thyroid cancer |
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| US9945862B2 (en) | 2011-06-03 | 2018-04-17 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Biomarkers for predicting and assessing responsiveness of thyroid and kidney cancer subjects to lenvatinib compounds |
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| US11090386B2 (en) | 2015-02-25 | 2021-08-17 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Method for suppressing bitterness of quinoline derivative |
| US11369623B2 (en) | 2015-06-16 | 2022-06-28 | Prism Pharma Co., Ltd. | Anticancer combination of a CBP/catenin inhibitor and an immune checkpoint inhibitor |
-
1992
- 1992-11-26 JP JP34145492A patent/JPH06153952A/ja active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| US11598776B2 (en) | 2011-06-03 | 2023-03-07 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Biomarkers for predicting and assessing responsiveness of thyroid and kidney cancer subjects to lenvatinib compounds |
| US9945862B2 (en) | 2011-06-03 | 2018-04-17 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Biomarkers for predicting and assessing responsiveness of thyroid and kidney cancer subjects to lenvatinib compounds |
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