KR20080090408A - 항-Ａβ 글로불로머 항체, 이의 항원-결합 잔기, 상응하는하이브리도마, 핵산, 벡터, 숙주 세포, 당해 항체의 제조방법, 당해 항체를 포함하는 조성물, 당해 항체의 용도 및당해 항체의 사용 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항-Aβ 글로불로머 항체, 이의 항원 결합 잔기, 상응하는 하이브리도마, 핵산, 벡터, 숙주 세포, 당해 항체를 제조하는 방법, 당해 항체를 포함하는 조성물, 당해 항체의 용도 및 당해 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 Aβ(1-42)글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성 보다 큰 Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 결합 친화성을 갖는 항-Aβ글로불로머 항체, 이의 항원 결합 잔기, 당해 항체를 생산하는 하이브리도마, 당해 항체를 암호화하는 핵산, 당해 핵산을 포함하는 벡터, 당해 벡터를 포함하는 숙주 세포, 당해 항체를 제조하는 방법, 당해 항체를 포함하는 조성물, 당해 항체의 치료학적 및 진단학적 용도 및 알츠하이머 질환 및 기타 아밀로이드증에 관한 상응하는 방법에 관한 것이다.

항-Aβ 글로불로머 항체, Aβ(1-42)글로불로머, Aβ(20-42) 글로불로머

Description

항-Ａβ 글로불로머 항체, 이의 항원-결합 잔기, 상응하는 하이브리도마, 핵산, 벡터, 숙주 세포, 당해 항체의 제조 방법, 당해 항체를 포함하는 조성물, 당해 항체의 용도 및 당해 항체의 사용 방법{Anti-Aβ globulomer antibodies, antigen-binding moieties thereof, corresponding hybridomas, nucleic acids, vectors, host cells, methods of producing said antibodies, compositions comprising said antibodies, uses of said antibodies and methods of using said antibodies}

본 발명은 항-Aβ 글로불로머 항체, 이의 항원 결합 잔기, 당해 항체를 생산하는 하이브리도마, 당해 항체를 암호화하는 핵산, 당해 핵산을 포함하는 벡터, 당해 벡터를 포함하는 숙주 세포, 당해 항체를 제조하는 방법, 당해 항체를 포함하는 조성물, 당해 항체의 치료학적 및 진단학적 용도 및 알츠하이머 질환 및 기타 아밀로이드증에 관한 상응하는 방법에 관한 것이다.

1907년에 알로이스 알츠하이머(Alois Alzheimer) 의사는 최초로 치매 형태의 신경병적 특징을 밝혔고 이후 그를 기리기 위해 명명되었다(Alzheimer 1907). 알츠하이머 질환(AD)는 노인층에서 가장 흔한 치매 원인이고 65세 이상의 집단에서 약 10%의 발병율을 나타낸다. 또한 나이가 들수록 당해 질환의 가능성이 증가한다. 전세계적으로, 약 1500만명의 사람들이 앓고 있으며 예상 수명이 추가로 증가 함에 따라 향후 몇십년동안에 당해 질환자 수가 약 3배 증가할 것으로 예상된다.

분자적 측면에서, 알츠하이머 질환(AD)은 ab-정상적으로 응집된 단백질의 침적물을 특징으로 한다. 세포외 아밀로이드 플라크의 경우에, 당해 침적물은 주로 아밀로이드-β-펩타이드 단편으로 이루어져 있고 세포내의 경우에는 tau 단백질의 신경원 섬유 덩어리(NFT)로 이루어져 있다. 아밀로이드 β (Aβ) 펩타이드는 단백질 분해 절단에 의해 β-아밀로이드 전구체 단백질로부터 생성된다. 이러한 절단은 α-, β- 및 γ-세크레타제로 명명되는 여러 프로테아제의 협력 활성에 의해 수행된다. 절단에 의해 상이한 길이의 다수의 특정 단편들이 생성된다. 아밀로이드 플라크는 주로 40개 또는 42개의 아미노산 길이를 갖는 펩타이드(Aβ40, Aβ42)로 이루어진다. 주요 절단 생성물은 Aβ40이지만 Aβ42는 보다 강한 독성 효과를 갖는다.

알츠하이머 질화에서 관찰되는 것들과 매우 유사한 뇌 아밀로이드 침적 및 인식 손상은 또한 다운 증후군(trisomy 21)의 특징이고 이의 발병 빈도는 800명의 출생아중 약 1명이다.

하디 및 히긴스(Hardy and Higgins)의 아밀로이드 캐스케이드 가설은 Aβ(1-42)의 증가된 생산이 Aβ 플라크의 주요 성분인 원섬유(protofibril) 및 피브릴(fibril)의 형성을 유도하고 이들 피브릴이 알츠하이머 질환 증상에 관여하는 것으로 추정하였다. 치매의 중증도와 침적된 Aβ 플라크 적재량간의 관계가 불명확하지만 당해 가설은 최근까지 선호되고 있다. AD 뇌에서 플라크 적재량 보다 AD 증상과 보다 관련이 있는 가용성 Aβ 형태의 발견은 아미로이드 캐스케이드 가설 이 수정되도록 하였다.

Aβ 펩타이드를 사용한 능동 면역화는 기존 플라크의 부분적 용해 뿐만 아니라 이의 형성을 감소시킨다. 이와 동시에, 이는 APP 유전자전이 마우스 모델에서 인식 결함을 완화시킨다.

Aβ 펩타이드에 대해 지시된 항체를 사용한 수동 면역화는 또한 Aβ 플라크 적재량을 감소시키는 것으로 밝혀졌다.

AN-1792 (섬유성 응집 증상에서 Aβ(1-42)펩타이드)을 사용한 능동 면역화의 상 IIa 시험(ELAN Corporation PIc, South San Francisco, CA, USA and Dublin, UK) 결과는 Aβ 펩타이드에 대해 지시된 면역치료가 성공적이었음을 시사한다. 30명 환자의 서브 그룹에서, MMSE 및 DAD 지수에 의한 측정시 항--Aβ 항체 역가가 양성이고 환자에서 질환의 진행이 상당히 감소하였다. 그러나, 본 연구는 뇌수막염 형태의 심각한 부작용 때문에 중단되었다(Bennett and Holtz- man, 2005, Neurology, 64, 10-12).

뇌수막염은 신경염증 및 T-세포의 뇌로의 침투를 특징으로 하였다. 추측컨대, 이것은 항원으로서 Aβ(1-42)의 주사에 의해 T-세포 면역 반응이 유도되었기 때문이다. 당해 면역 반응은 수동 면역 후에 예상되지 않았었다. 지금까지는 당해 사실에 관한 임상적 데이터가 유용하지 않다. 그러나, 당해 면역화 수동 방법과 관련하여, 5개월동안 주 1회 Aβ(1-42)의 N-말단 에피토프에 대해 지시된 항체를 투여받은 나이가 많은 APP23 마우스에서의 임상전 연구 때문에 우려의 목소리가 있다. 당해 마우스는 식염수로 처리된 대조군 동물과 비교하여 미세출혈의 빈 도수 및 중증도가 증가함을 보여주었다.(Pfeifer et al., 2002, Science, 298, 1379). 미세출혈의 상당한 증가가 또한 나이가 많은(24개월 초과) Tg2576 및 PDAPP 마우스에서 보고되었다(Racke et al., 2005, J Neurosci, 25, 629-636; Wilcock et al. 2004, J. Neuroinflammation, 1(1 ):24; De Mattos et al., 2004, Neurobiol. Aging 25(S2):577). 당해 마우스 종 둘다에서, 항체 주입은 미세출혈을 상당히 증가시켰다. 대조적으로, Aβ(1-42) 펩타이드의 중심 영역에 대해 지시된 항체는 미세출혈을 유도하지 않았다(de Mattos et al., supra). 미세출혈 유도 부재는 CAA 형태의 응집된 Aβ 펩타이드와는 결합하지 않는 항체 처리와 관련이 있었다(Racke et al., J Neurosci, 25, 629-636). 그러나, APP에 대한 유전자전이 마우스에서 미세출혈을 유도하는 정확한 기작은 불분명하다. 추측컨대, 뇌 아밀로이드 혈관병증(CAA)은 뇌 출혈을 유도하거나 적어도 심화시킨다. CAA는 거의 모든 알츠하이머 질환 뇌에 존재하고 당해 경우의 약 20%는 "중증 CAA"로서 간주된다. 따라서 수동 면역화는 미세출혈을 피할 목적으로 Aβ 펩타이드의 중심 또는 카복시 말단 영역을 인지하는 항체를 선택해야만 한다.

WO2004/067561는 안정한 Aβ(1 -42) 올리고머 (Aβ(1-42) 글로불로머) 및 글로불로머에 대해 특이적으로 지시된 항체를 기재하고 있다. 비특이적 프로테아제를 사용한 분해는 Aβ 글로불로머가 구형 코어 구조로부터 돌출한 친수성 N-말단으로 시작하도록 분해될 수 있음을 보여준다(Barghom et al., 2005, J Neurochem, 95, 834-847). 당해 N-말단 절단된 Aβ 글로불로머(Aβ(12-42) 및 Aβ(20-42) 글로불로머)는 당해 올리고머 Aβ의 기본 구조 단위를 나타낸다. 이들은 토끼 및 마 우스의 능동 면역화를 위한 매우 강력한 항원이고 높은 항체 역가를 유도한다(WO2004/067561). 생체내에서 N-말단 절단된 Aβ 형태의 추정 병리학적 역할은 AD 뇌에서의 이들의 존재에 대한 여러 최근 보고에 의해 시사되었다(Sergeant et al., 2003, J Neurochem, 85, 1581-1591 ; Thai et al., 1999, J Neuropathol. Exp Neurol, 58, 210-216). 생체내 분해 동안에 뇌에서 발견된 특정 프로테아제, 예를 들어, 네프릴라이신(NEP 24.11) 또는 인슐린 분해 효소(IDE)가 관여할 수 있다(Selkoe, 2001, Neuron, 32, 177-180).

본 발명의 목적은 면역치료에서 환자의 인식 수행능을 개선시키고 이와 동시에 뇌에서 단지 전량의 Aβ 펩타이드중 소분획하고 반응하는 Aβ 글로불로머에 대해 지시된 항체를 제공하는 것이다. 이것은 뇌 Aβ 균형의 실질적 교란을 예방하여 부작용을 감소시킬 것으로 예상된다. 예를 들어, 치료학적으로 의심스러운 뇌 용적의 감소가 응집의 섬유 증상에서 Aβ 펩타이드를 사용한 능동 면역화 연구에서 관찰되었다(AN1792를 사용한 ELAN 시험). 더욱이, 당해 시험에서 뇌수막염 형태의 심각한 부작용이 관찰되었다.

본 발명은 절단된 형태의 Aβ 글로불로머에 대해 고친화성인 글로불로머 특이적 항체를 제공함에 의해 당해 문제점을 해결하였다. 이들 항체는 기타 형태의 Aβ 펩타이드, 특히 단량체 및 피브릴 뿐만 아니라 절단된 형태의 Aβ 글로불로머를 식별할 수 있다.

따라서, 본 발명은 Aβ(1 -42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성 보다 큰, Aβ(20-42) 글로불로머에 대해 결합 친화성을 갖는 항체에 관한 것이다.

추가로, 본 발명은 Aβ(12-42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성 보다 큰, Aβ(20-42) 글로불로머에 대해 결합 친화성을 갖는 항체에 관한 것이다..

따라서, 특정 양태에 따라, 본 발명은 Aβ(1-42) 글로불로머 및 Aβ(12-42) 글로불로머 둘다에 대한 항체의 결합 친화성 보다 큰, Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 결합 친화성을 갖는 항체에 관한 것이다.

여기서, 용어 "Aβ(X-Y)"는 X 및 Y 둘다를 포함하는 사람 아밀로이드 β 단백질의 아미노산 위치 X에서 아미노산 위치 Y까지의 아미노산 서열, 특히, 아미노산 서열 DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV IAT (아미노산 1번 내지 43번에 상응하는)의 아미노산 위치 X에서 아미노산 위치 Y까지의 아미노산 서열 또는 임의의 이의 천연 발생 변이체, 특히, 위치 X 및 Y 둘다를 포함하는 A2T, H6R, D7N, A21G ("Flemish"), E22G ("Arctic"), E22Q ("Dutch"), E22K ("Italian"), D23N ("Iowa"), A42T 및 A42V(여기서, 숫자는 Aβ 펩타이드 개시 부위에 상대적인 것이다)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 변이체, 또는 글로불로머 형성을 차단할 수 없는 3개 이하의 추가의 아미노산 치환을 갖는 서열, 바람직하게는 아미노산 12번 또는 X(이의 번호보다 높은 위치에서도)에서 아미노산 42번 또는 Y(이의 번호보다 낮은 위치에서도)까지의 부분에 어떠한 추가의 아미노산 치환을 갖지 않는 서열, 보다 바람직하게는 아미노산 20번 또는 X(이의 번호 보다 높은 위치에서도)에서 아미노산 42번 또는 Y(이의 번호보다 낮은 위치에서도)까지의 부분에서 어떠한 추가의 아미노산 치환을 갖지 않는 서열, 및 가장 바람직하게는 아미노산 20번 또는 X(이의 번호보다 높은 위치에서도)에서 아미노산 40번 또는 Y(이의 번호보다 낮은 위치에서도)까지의 부분에 어떠한 추가의 아미노산 치환을 갖지 않는 서열을 언급하고, 여기서 추가의 아미노산 치환은 천연에서 발견되지 않는, 표준 서열로부터 일탈된 것이다.

보다 구체적으로, 당해 용어"Aβ(1-42)"는 1번 및 42번 둘다를 포함하는 사람 아밀로이드 β 단백질의 아미노산 1번에서 아미노산 42번까지의 아미노산 서열, 특히 아미노산 서열 DAEFRHDSGY EVHHQKL VFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGW IA 또는 이의 천연적으로 발생되는 임의의 변이체, 특히 1번 및 42번 둘다를 포함하는 A2T, H6R, D7N, A21G ("Flemish"), E22G ("Arctic"), E22Q ("Dutch"), E22K ("Italian"), D23N ("Iowa"), A42T 및 A42V(여기서, 숫자는 Aβ 펩타이드 개시 부위에 상대적인 것이다)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 변이체 또는 글로불로머 형성을 차단할 없는 3개 이항의 아미노산 치환체를 갖는 서열, 바람직하게는 아미노산 20번에서 아미노산 42번까지의 부분에 어떠한 추가의 아미노산 치환을 갖지 않는 서열을 언급한다. 또한, 본원의 용어 "Aβ(1-40)"는 1번 및 40번을 포함하는 사람 아밀로이드 β 단백질의 아미노산 1번 내지 아미노산 40번의 아미노산 서열, 특히 아미노산 서열 DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGW 또는 이의 천연적으로 발생하는 임의의 변이체, 특히, A2T, H6R, D7N, A21G ("Flemish"), E22G ("Arctic"), E22Q ("Dutch"), E22K ("Italian"), 및 D23N ("Iowa")(여기서, 숫자는 Aβ 펩타이드 개시 부위에 상대적인 것이다)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 변이체 또는 글로불로머 형성을 차단할 수 없는 3개 이하의 추가의 아미노산 치환체를 갖는 서열, 바람직하게, 아미노산 20번에서 아미노산 40번 까지의 부분에서 어떠한 추가의 아미노산 치환을 갖지 않는 서열을 언급한다.

보다 구체적으로, 본원에서 용어 "Aβ(12-42)"는 12번 및 42번 둘다를 포함하는 사람 아밀로이드 β 단백질의 아미노산 12번에서 아미노산 42번 까지의 아미노산 서열, 특히 아미노산 서열 VHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGW IA 또는 임의의 이의 천연적으로 존재하는 변이체, 특히, 12번 및 42번 둘다를 포함하는, A21 G ("Flemish"), E22G ("Arctic"), E22Q ("Dutch"), E22K ("Italian"), D23N ("Iowa"), A42T 및 A42V(여기서, 숫자는 Aβ 펩타이드 개시 부위에 상대적인 것이다)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 변이체 또는 글로불로머 형성을 차단할 수 없는 3개 이하의 추가의 아미노산 치환을 갖는 서열, 바람직하게는 아미노산 20번에서 아미노산 42번까지의 부분에서 어떠한 추가의 아미노산 치환을 갖지 않는 서열을 언급한다.

보다 구체적으로, 본원에서 용어 "Aβ(20-42)"는 20번 및 42번 둘다를 포함하는 사람 아밀로이드 β 단백질의 아미노산 20번에서 아미노산 42번까지의 아미노산 서열, 특히, 아미노산 서열 또는 이의 임의의 천연적으로 존재하는 변이체, 특히, 20번 및 42번 둘다를 포함하는 A21G ("Flemish"), E22G ("Arctic"), E22Q ("Dutch"), E22K ("Italian"), D23N ("Iowa"), A42T 및 A42V(여기서, 숫자는 Aβ 펩타이드 개시 부위에 상대적인 것이다)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 변이체 또는 글로불로머 형성을 차단할 수 없는 3개 이하의 아미노산 치환을 갖는 서열, 바람직하게 임의의 추가의 아미노산 치환을 갖지 않는 서열을 언급한다.

본원에서 용어 "Aβ(X-Y) 글로불로머" (Aβ(X-Y) 구형 올리고머)는 상기된 바와 같은 가용성, 구형, 비공유적으로 결합된 Aβ(X-Y) 펩타이드를 언급하고 균일성 및 독특한 물리적 특성을 갖는다. 한 측면에 따라, Aβ(X-Y) 글로불로머는 음이온 세제와의 항온처리에 의해 수득 가능한 Aβ(X-Y) 펩타이드의 안정하고 비-섬유성이고 올리고머성인 어셈블리이다. 단량체 및 피브릴과는 대조적으로 당해 글로불로머는 한정된 어셈블리 수의 서브유니트(예를 들어, WO2004/067561에 기재된 바와 같이 초기 어셈블리 형태, n=4-6, "올리고머 A", 및 후기 어셈블리 형태, n=12-14, "올리고머 B")를 특징으로 한다. 당해 글로불로머는 3차원 구형 구조("주조된 구형", 참조: Barghorn et al., 2005, J Neurochem, 95, 834-847)를 갖는다. 이들은 추가로 하나 이상의 하기 특징을 특징으로 할 수 있다:

- 절단된 형태의 글로불로머를 생성시키는 무차별적 프로테아제(예를 들어, 써모라이신 또는 엔도프로테이나제 GluC)를 사용한 N-말단 아미노산 X-23의 절단능;

- 무차별 프로테아제 및 항체에 대한 C-말단 아미노산 24-Y의 비-근접성;

- 절단된 형태의 당해 글로불로머는 당해 글로불로머의 3차원 코어 구조를 유지하여 이의 글로불로머 형태에서 코어 에피토프 Aβ(20-Y)의 보다 우수한 근접성을 갖는다.

본 발명에 따라 및 특히, 본 발명의 항체의 결합 친화성을 평가할 목적을 위해, 본원에서 용어 "Aβ(X-Y) 글로불로머"는 특히 본원에 참조로서 인용되는 WO2004/067561에 기재된 바와 같은 방법에 의해 수득가능한 생성물을 언급한다.

당해 공정은 천연, 재조합 또는 합성 Aβ(X-Y) 펩타이드 또는 이의 유도체를 개방(unfolding)시키는 단계; 적어도 부분적으로 개방된 Aβ(X-Y) 펩타이드 또는 이의 유도체를 세제에 노출시키는 단계, 세제 작용을 감소시키는 단계 및 항온처리를 계속 수행하는 단계를 포함한다.

펩타이드를 개방시킬 목적으로, 수소 결합 절단제, 예를 들어, 헥사플루오로이소프로판올(HFIP)이 단백질에 작용할 수 있다. 몇 분간의 작용 시간, 예를 들어, 약 10 내지 60분은 작용 온도가 약 20 내지 50℃인 경우, 특히 약 35 내지 40℃인 경우 충분하다. 바람직하게 농축된 형태로, 예를 들어, 디메틸 설폭사이드(DMSO)와 같은 수성 완충제와 혼화성인 적합한 유기 용매중에서 증발 건조된 잔사의 후속 용해는 후속적으로 사용될 수 있는 적어도 부분적으로 개방된 펩타이드 또는 이의 유도체의 현탁액을 생성시킨다. 경우에 따라, 스톡 현탁액은 일시적 기간동안 저온, 약 -20℃에서 보관될 수 있다.

또한, 펩타이드 또는 이의 유도체는 약산성, 바람직하게는 수용액, 예를 들어, 약 10mM의 HCl 수용액중에 용해시킬 수 있다. 통상 몇분의 항온처리 후, 불용성 성분은 원심분리로 제거한다. 10000 g에서의 몇분이 유리하다. 이들 방법 단계는 바람직하게 실온, 즉 20 내지 30℃ 범위의 온도에서 수행한다. 원심분리 후 수득된 상등액은 Aβ(X-Y) 펩타이드 또는 이의 유도체를 함유하고 일시적 기간동안 저온, 예를 들어, 약 -20℃에서 보관될 수 있다.

세제에 대한 하기 노출은 중간체 유형의 올리고머(WO 2004/067561에서 올리 고머 A로서 언급됨)를 수득하기 위한 펩타이드 또는 이의 유도체의 올리고머화하기 위한 것이다. 당해 목적을 위해, 충분한 중간체 올리고머가 제조될 때까지 적어도 부분적으로 개방된 펩타이드 또는 이의 유도체에 세제를 작용시킨다.

이온성 세제, 특히 음이온성 세제를 사용하는 것이 바람직하다.

특정 양태에 따라, 화학식 I의 세제가 사용된다.

R-X

상기식에서,

라디칼 R은 탄소 원자수 6 내지 20 및 바람직하게 탄소 원자수 10 내지 14의 직쇄 또는 측쇄 알킬 또는 탄소 원자수 6 내지 20 및 바람직하게는 10 내지 14인 직쇄 또는 측쇄 알케닐이고,

라디칼 X는 산성 그룹 또는 이의 염이고,

X는 바람직하게-COO^-M⁺, -SO₃-M⁺, 및 특히, -OSO₃-M⁺로부터 선택되고,

M⁺은 수소 양이온 또는 바람직하게 알칼리 금속 및 알칼린 토금속 양이온 및 암모늄 양이온으로부터 바람직하게 선택되는 무기 또는 유기 양이온이다.

R이 직쇄 알킬, 이중에서 특히 알킬-1-일 라디칼인 화학식 I의 세제가 유리하다. 나트륨 도데실 설페이트(SDS)가 특히 바람직하다. 라우르산 및 올레산이 또한 유리하게 사용될 수 있다. 세제 라우로일사르코신의 나트륨 염(또한 사르코실 NL-30 또는 Gardol^®로서 공지됨)이 또한 특히 유리하다.

특히 세제 작용 시간은 올리고머화에 적용된 펩타이드 또는 이의 유도체가 개방되는지의 여부 그렇다면 어느정도로 개방되는지에 의존한다. 개방 단계에 따라, 펩타이드 또는 이의 유도체가 미리 수소결합 절단제, 즉, 특히, 헥사플루오로이소프로판올로 처리되는 경우, 몇 시간 범위, 유리하게 약 1 내지 20시간 및 특히 2 내지 10시간의 작용 시간은 작용 온도가 약 20 내지 50℃이고 특히 약 35 내지 40℃인 경우 충분하다. 덜 개방되거나 필수적으로 개방되지 않은 펩타이드 또는 이의 유도체가 출발점인 경우, 상응하게 긴 작용 시간이 유리하다. 펩타이드 또는 이의 유도체가 예를 들어, HFIP 처리에 대한 또 다른 대안으로서 상기된 과정에 따라 전처리되는 경우 또는 당해 펩타이드 또는 이의 유도체가 직접 올리고머화에 적용되는 경우, 작용 온도가 약 20 내지 50℃, 특히 약 35 내지 40℃일때, 작용 시간 범위는 약 5 내지 30시간 및 특히 약 10 내지 20시간이면 충분하다. 항온 처리 후, 불용성 성분은 유리하게 원심분리에 의해 제거된다. 10000 g에서 몇분이 합당하다.

선택된 세제의 농도는 사용되는 세제에 의존한다. SDS가 사용되는 경우, 농도 범위는 0.01 내지 1중량%, 바람직하게는 0.05 내지 0.5중량%, 예를 들어, 약 0.2중량%인 것이 합당한 것으로 입증된다. 라우르산 또는 올레산이 사용되는 경우, 어느정도 보다 높은 농도, 예를 들어, 이의 농도 범위가 0.05 내지 2중량%, 바람직하게는 0.1 내지 0.5중량%, 예를 들어, 약 0.5중량%인 것이 합당하다.

세제는 대략 생리학적 범위의 염 농도에서 작용해야만 한다. 따라서, 특히, NaCl 농도 범위는 50 내지 500mM, 바람직하게는 100 내지 200mM 및 특히 약 140mM인 것이 합당하다.

추가의 올리고머화를 위해 세제 작용을 후속적으로 감소시키고 계속 항온처리하여 본 발명의 Aβ(X-Y) 글로불로머를 수득한다(WO 2004/067561에서 올리고머 B로서 언급됨). 이전의 단계로부터 수득된 조성물은 일반적으로 세제 및 생리학적 범위 농도의 염을 함유하기 때문에 세제 작용을 감소시키고 바람직하게는 염 농도를 감소시키는 것이 합당하다. 이것은 세제 및 염의 농도를 감소시켜 수행될 수 있는데 예를 들어, 간편하게 물 또는 보다 낮은 염 농도의 완충액(Tris-HCl, pH 7.3)으로 희석시켜 수행될 수 있다. 약 2 내지 10의 범위, 유리하게는 약 3 내지 8의 범위 및 특히 약 4의 희석 인자가 적합한 것으로 입증되었다. 세제 작용의 감소는 또한 당해 세제 작용을 중화시킬 수 있는 물질을 첨가하여 성취될 수 있다. 이들의 예는 정제 및 추출 과정중에 세포를 안정화시킬 수 있는 물질, 예를 들어, 특정 E0/P0 블록 공중합체, 특히, 상표명 Pluronic^® F68하의 블록 공중합체와 같이, 세제와 복합체를 형성할 수 있는 물질을 포함한다. 알콕실화되고 특히 에톡실화된 알킬 페놀, 예를 들어, Triton^® X 계열의 에톡실화된 알킬 페놀, 특히, Triton^® X100 또는 3-(3-콜라미도프로필디메틸암모니오)-1-프로판설포네이트(CHAPS^®) 및 에톡실화된 소르비탄 지방 에스테르, 예를 들어, 트윈 계열의 것들, 특히 Tween^® 20은 특정 임계 마이셀 농도 주변 또는 그 이상의 농도에서 동등하게 사용 될 수 있다.

이어서 당해 용액을 본 발명의 Aβ(X-Y) 글로불로머가 충분히 생성될때까지 항온처리한다. 작용 온도가 약 20 내지 50℃ 및 특히 약 35 내지 40℃일 때 작용 시간은 수시간 범위, 바람직하게는 약 10 내지 30시간 범위 및 특히 약 15 내지 25시간 범위이면 충분하다. 이어서 당해 용액을 농축시키고 가능한 잔류물을 원심분리로 제거할 수 있다. 여기서 또한 10000g에서 몇분이 합당한 것으로 입증된다. 원심분리 후 수득된 상등액은 본 발명의 Aβ(X-Y) 글로불로머를 함유한다.

본 발명의 Aβ(X-Y) 글로불로머는 최종적으로, 공지된 방식대로, 예를 들어, 한외여과, 투석, 침전 또는 원심분리에 의해 회수할 수 있다.

추가로 변성 조건하에, 예를 들어, SDS-PAGE에 의한 Aβ(X-Y) 글로불로머의 전기영동 분리가 이중 밴드(예를 들어, (Aβ(1-42)에 대한 겉보기 분자량이 38/48 kDa인)를 생성하는 경우가 바람직하고 특히 분리 전 글로불로머의 글루타르디알데하이드 처리시 2개의 밴드가 하나로 합쳐지는 경우가 바람직하다. 또한 글로불로머의 크기 배척 크로마토그래피가 단일 피크(예를 들어, 각각 Aβ(1-42) 글로불로머에 대해 약 100kDa의 분자량 또는 글루타르디알데하이드 가교 결합된 Aβ(1-42) 글로불로머에 대해 약 60kDa의 분자량에 상응하는)를 생성하는 경우 바람직하다.

당해 공정은 특히, Aβ(1-42) 펩타이드, Aβ(12-42) 펩타이드 및 Aβ(20-42) 펩타이드로부터 개시하여 Aβ(1-42) 글로불로머, Aβ(12-42) 글로불로머 및 Aβ(20-42) 글로불로머를 수득하는데 적합하다.

본 발명의 특정 양태에서, Aβ(X-Y)[여기서, X는 수치 2 내지 24로 이루어진 그룹으로부터 선택되고 Y는 상기 정의된 바와 같다] 글로불로머는 Aβ(1-Y) 글로불로머를 보다 짧은 형태[여기서, X는 수치 2 내지 24로 이루어진 그룹으로부터 선택되고 바람직하게 X는 20 또는 12이고 Y는 상기 정의된 바와 같다]로 절단함에 의해 수득할 수 있는 것들이고 이것은 적당한 프로테아제로 처리함에 의해 성취될 수 있다. 예를 들어, Aβ(20-42) 글로불로머는 Aβ(1-42) 글로불로머를 써모라이신 단백질분해에 적용함에 의해 수득될 수 있고 Aβ(12-42) 글로불로머는 Aβ(1-42) 글로불로머를 엔도프로테이나제 GluC 단백질분해에 적용함에 의해 수득될 수 있다. 목적하는 단백질분해 정도에 도달한 경우 프로테아제는 일반적으로 공지된 방식으로 불활성화된다. 이어서 수득한 글로불로머는 이미 본원에 기재된 과정에 따라 분리될 수 있고, 경우에 따라 추가의 후처리 및 정제 단계에 의해 추가로 가공될 수 있다. 당해 공정의 상세한 기재는 본원에 참조로서 인용되는 문헌[WO 2004/067561]에 기재되어 있다.

본 발명의 목적을 위한 Aβ(1-42) 글로불로머는 특히 본원의 실시예 1a에 기재된 바와 같은 Aβ(1-42) 글로불로머이고; Aβ(20-42) 글로불로머는 특히 본원의 실시예 1c에 기재된 바와 같은 Aβ(20-42) 글로불로머이고 Aβ(12-42) 글로불로머는 특히 본원의 실시예 1d에 기재된 바와 같은 Aβ(12-42) 글로불로머이다.

바람직하게, 글로불로머는 신경세포에 대해 친화성을 보여준다. 바람직하게, 글로불로머는 또한 신결 조절 효과를 나타낸다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, 글로불로머는 11 내지 16개 및 가장 바람직하게는 12 내지 14개의 Aβ(X-Y) 펩타이드로 이루어진다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, 본원에서 용어 "Aβ(X-Y) 글로불로머"는 필수적으로 Aβ(X-Y) 서브유니트로 이루어진 글로불로머를 언급하고 이때, 12개 서브유니트중 적어도 11개가 Aβ(X-Y) 유형인 경우가 바람직하고 보다 바람직하게는 글로불로머의 10% 미만이 임의의 비--Aβ(X-Y) 펩타이드를 포함하는 경우이고 가장 바람직하게는 비-Aβ(X-Y) 펩타이드의 함량이 검출 역치 미만인 경우이다.

보다 구체적으로, 본원에서 용어 "Aβ(1-42) 글로불로머"는 상기 정의된 바와 같이 Aβ(1-42) 유니트로 필수적으로 이루어진 글로불로머를 언급하고 본원에서 용어 "Aβ(12-42) 글로불로머"는 상기 정의된 바와 같이 Aβ(12-42) 유니트로 필수적으로 이루어진 글로불로머를 언급하고 본원에서 용어 "Aβ(20- 42) 글로불로머"는 상기 정의된 바와 같이 Aβ(20-42) 유니트로 필수적으로 이루어진 글로불로머를 언급한다.

본원에서 용어 "가교-결합된 Aβ(X-Y) 글로불로머"는 글로불로머의 구성 유니트의 가교 결합, 바람직하게는 화학적 가교 결합, 보다 바람직하게는 알데하이드 가교 결합, 가장 바람직하게는 글루타르알데하이드 가교 결합에 의해 상기된 바와 같은 Aβ(X-Y) 글로불로머로부터 수득 가능한 분자를 언급한다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 가교결합된 글로불로머는 필수적으로 유니트가 단지 비공유 상호작용에 의해 함께 유지되어 있기 보다는 적어도 부분적으로 공유 결합에 의해 결합된 글로불로머이다. 본 발명의 목적을 위해, 가교 결합된 Aβ(1-42) 글로불로머는 특히 본원에 실시예 1b에 기재된 바와 같이 가교 결합된 Aβ(1- 42) 올리고머이다.

본원에서 용어 "Aβ(X-Y) 글로불로머 유도체"는 특히 검출을 용이하게 하는 그룹, 바람직하게 형광단, 예를 들어, 플루오로세인 이소티오시아네이트, 피코에리트린, 아에쿠오레아 빅토리아 형광 단백질, 그물베도라치(Dictyosoma) 형광 단백질 또는 이의 임의의 배합물 또는 형광 활성 유도체; 발색단; 화학발광단, 예를 들어, 루시페라제, 바람직하게 포티누스 피랄리스(Photinus pyralis) 루시페라제, 비브리오 피셔리(Vibrio fischeri) 루시페라제, 또는 이의 임의의 배합물 또는 화학발광 활성 유도체; 효소 활성 그룹, 예를 들어, 퍼옥시다제, 예를 들어, 서양고추냉이 퍼옥시다제 또는 이의 임의의 효소적 활성 유도체; 전자 밀집 그룹, 예를 들어, 중금속 함유 그룹, 예를 들어, 골 함유 그룹; 합텐, 예를 들어, 페놀 유도된 합텐; 강한 항원성 구조, 예를 들어, 항원성으로인 것으로 추정되는, 예를 들어, 콜라스카 및 통가온카르(Kolaskar and Tongaonkar)의 알고리듬에 의해 항원성인 것으로 추정되는 펩타이드 서열; 또 다른 분자를 위한 압타머; 킬레이팅 그룹, 예를 들어, 헥사히스티디닐; 추가의 특이적 단백질-단백질 상호작용을 매개하는 중성 또는 중성 유도 단백질 구조, 예를 들어, fos/jun 쌍의 구성원; 자기 그룹, 예를 들어, 철자기 그룹; 또는 방사선활성 그룹, 예를 들어, 1H, 14C, 32P, 35S 또는 125I를 포함하는 그룹 또는 이의 임의의 배합 그룹에 공유적으로 결합됨에 의해 표지된 글로불로머; 또는 공유 결합 또는 비공유 고친화성 상호작용에 의해 부착된, 바람직하게는 불활성화, 격리, 분해 및/또는 침전을 촉진시키는 그룹에 공유적으로 결합된, 바람직하게는, 생체내 분해를 촉진시키는 그룹, 바람직하게는 유비퀴틴과 부착된(특히, 이 경우 부착된 올리고머가 생체내 어셈블리되는 것이 바람직하다) 글로불로머 또는 상기 임의의 조합에 의해 변형된 글로불로머를 언급한다. 당해 표 지 및 부착 그룹 및 이들을 단백질에 접착시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 표지 및/또는 부착은 글로불로머화전후 또는 글로불로머화동안에 수행될 수 있다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 글로불로머 유도체는 표지 및/또는 부착 반응으로부터 수득할 수 있는 분자이다.

상응하게, 본원에서 용어 "Aβ(X-Y) 단량체 유도체"는 특히 글로불로머에 대해 기재된 바와 같이 표지되고 부착된 Aβ 단량체를 언급한다.

유리하게, 본 발명의 항체는 1x10^-6 M 내지 1x10^-12 M 범위의 K_D로 Aβ(20-42) 글로불로머와 결합한다. 바람직하게, 당해 항체는 고친화성으로, 예를 들어, 1x10^-7 M 또는 이를 초과하는 K_D 친화성으로 , 예를 들어, 3x10^-8 M 또는 이를 초과하는 K_D 친화성으로, 1x10^-8 M 또는 이를 초과하는 K_D 친화성으로, 예를 들어, 3x10^-9 M 또는 이를 초과하는 K_D 친화성으로, 3x10^-9 M 또는 이를 초과하는 K_D 친화성으로, 예를 들어, 3x10^-10 M 이상의 K_D 친화성으로, 1x10^-10 M 이상의 K_D 친화성으로 , 예를 들어, 3x10^-10 M 이상의 K_D 친화성으로 또는 1x10^-11 M 이상의 K_D 친화성으로 Aβ(20-42) 글로불로머와 결합한다.

본원의 용어 "초과하는 친화성"은 한편의 미결합된 항체 및 미결합된 글로불 로머와 다른 한편의 항체-글로불로머 복합체간의 평형이 항체-글로불로머 복합체 쪽으로 선호되는 상호작용 정도를 언급한다. 또한, 본원의 용어 "보다 작은 친화성"은 한편 미결합된 항체 및 미결합된 글로불로머와 다른 판현의 항체-글로불로머 복합체간의 평형이 미결합된 항체 및 미결합된 글로불로머 쪽으로 선호되는 상호작용 정도를 언급한다. 당해 용어 "이상의 친화성"은 "보다 높은 친화성"이라는 용어와 동의어이고 용어 "보다 작은 친화성"은 "보다 낮은 친화성"이라는 용어와 동의어이다.

특정 양태에 따라, 본 발명은 1x10^-6 M 내지 1x10^-12 M 범위의 KD로 Aβ(20-42) 글로불로머에 결합하거나, 10^-12 또는 그 보다 작은 K_D의 친화성으로 Aβ(1-42) 글로불로머에 결합하는 항체에 관한 것이고, Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 결합 친화성은 Aβ(1-42) 글로불로머에 대한 결합 친화성 보다 크다.

본 발명의 항체의 Aβ(20-42) 글로불로머로의 결합 친화성은 Aβ(1 -42) 글로불로머에 대한 결합 친화성 보다 2배 이상, 예를 들어, 3배 이상 또는 5배 이상, 바람직하게는 10배 이상, 예를 들어, 20배 이상, 30배 이상 또는 50배 이상, 보다 바람직하게는 100배 이상, 예를 들어, 200배 이상, 300배 이상 또는 500배 이상 및 보다 더 바람직하게는 500배 이상, 보다 더 바람직하게는 1000배 이상, 예를 들어, 2000배 이상, 3000 배이상 또는 5000배 이상, 보다 더 바람직하게는 10000배 이상, 예를 들어, 20000배 이상, 30000배 이상 또는 50000배 이상, 가장 바람직하게는 100000배 이상인 것이 바람직하다.

특정 양태에 따라, 본 발명은 10^-12M 또는 그 보다 작은 K_D의 친화성으로 Aβ(12-42) 글로불로머에 결합하는 항체에 관한 것이고, Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 결합 친화성은 Aβ(12-42) 글로불로머에 대한 결합 친화성 보다 크다.

또한, Aβ(20- 42) 글로불로머에 대한 본 발명의 항체의 결합 친화성은 Aβ(12-42) 글로불로머의 결합 친화성 보다 2배 이상, 예를 들어, 3배 이상 또는 5배 이상, 바람직하게는 10배 이상, 예를 들어, 20배 이상, 30배 이상 또는 50배 이상, 보다 바람직하게는 100배 이상, 예를 들어, 200배 이상, 300배 이상 또는 500배 이상 및 보다 더 바람직하게는 1000배 이상, 예를 들어, 2000배 이상, 3000배 이상 또는 5000배 이상, 보다 더 바람직하게는 10000배 이상, 예를 들어, 20000배 이상, 30000배 이상 또는 50000배 이상 및 가장 바람직하게는 100000배 이상인 것이 바람직하다.

바람직하게, 본 발명의 항체는 상기된 바와 같이 하나 이상의 Aβ 글로불로머에 결합하고 Aβ의 비글로불로머 형태 하나 이상에 대해서는 비교적 보다 작은 친화성을 갖는다.

하나 이상의 Aβ 글로불로머에 대해서 보다 하나 이상의 비글로불로머 형태의 Aβ에 대해 비교적 보다 작은 친화성을 갖는 본 발명의 항체는 Aβ(1-42) 단량체에 대해서 보다 큰 Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 결합 친화성을 갖는 항체를 포함한다. 추가로, 대안적으로 또는 추가적으로Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성은 Aβ(1-40) 단량체에 대한 것 보다 큰 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 양태에서, Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 항체의 친화성은 Aβ(1-40) 및 Aβ(1-42) 단량체 둘다에 대한 이의 친화성 보다 크다.

본원에서 용어 "Aβ(X-Y) 단량체"는 Aβ(X-Y) 펩타이드의 분리된 형태를 언급하고 바람직하게는 필수적으로 기타 Aβ 펩타이드와의 비공유 상호작용이 없는 형태의 Aβ(X-Y) 펩타이드를 언급한다. 실질적으로, Aβ(X-Y) 단량체는 보통 수용액 형태로 제공된다. 본 발명의 특히 바람직한 양태에서, 단량체 수용액은 0.05% 내지 0.2%, 보다 바람직하게는 약 0.1%의 NH₄OH를 함유한다. 본 발명의 또 다른 특히 바람직한 양태에서, 단량체 수용액은 0.05% 내지 0.2%, 보다 바람직하게는 약 0.1% NaOH를 함유한다. 사용되는 경우(예를 들어, 본 발명의 항체의 결합 친화성을 측정하기 위해), 적당한 방식으로 용액을 희석시키는 것이 유리할 수 있다. 추가로, 이의 제조 후 보통 2시간 이내, 특히 1시간 이내 및 특히 30분 이내로 당해 용액을 사용하는 것이 합당하다.

보다 구체적으로, 본원에서 용어 "Aβ(1-40) 단량체"는 본원에 실시예 2에 기재된 바와 같이 Aβ(1-40) 단량체 제제를 언급하고 본원에서 용어 "Aβ(1-42) 단량체"는 본원에 실시예 2에 기재된 바와 같이 Aβ(1-42) 제제를 언급한다.

유리하게, 본 발명의 항체는 하나, 또는 보다 바람직하게는 2개의 단량체와 낮은 친화성, 가장 바람직하게는 1x10^-8 M 이하 K_D의 친화성, 예를 들어, 3x10^-8 M 이하 K_D의 친화성, 1x10^-7 M 이하 K_D의 친화성, 예를 들어, 3x1O^-7 M 이하 K_D의 친화 성, 또는 1x10^-6 M 이하 K_D의 친화성, 예를 들어, 3x10^-5 M 이하 K_D의 친화성, 또는 1x10^-5 M 이하 K_D의 친화성으로 결합한다.

특히, Aβ(20-42) 글로불로머로의 본 발명의 항체 결합 친화성은 하나 또는 보다 바람직하게는 2개의 단량체로의 항체의 결합 친화성 보다 2배 이상, 예를 들어, 3배 이상 또는 5배 이상, 바람직하게는 10배 이상, 예를 들어, 20배 이상, 30배 이상 또는 50배 이상, 보다 바람직하게는 100배 이상, 예를 들어, 200배 이상, 300배 이상 또는 500배 이상 및 보다 더 바람직하게는 1000배 이상, 예를 들어, 2000배 이상, 3000배 이상 또는 5000배 이상, 보다 더 바람직하게는 10000배 이상, 예를 들어, 20000배 이상, 30000배 이상 또는 50000배 이상 및 가장 바람직하게는 100000배 이상인 것이 바람직하다.

하나 이상의 Aβ 글로불로머에 대해 보다 Aβ 의 하나 이상의 비글로불로머 형태에 대해 비교적 작은 친화성을 갖는 본 발명의 항체는 추가로 Aβ(1-42) 피브릴에 대해서 보다 큰 Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 결합 친화성을 갖는 항체를 포함한다. 또한 또는 추가로 Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성은 Aβ(1-40) 피브릴에 대해서 보다 큰 것이 바람직하다.

본원에서 용어 "피브릴" 콩고 레드와 결합함에 이어서 편광하에 복굴절을 나타내며 X-선 회절 패턴이 가교-β 구조인, 전자 현미경에서 섬유 구조를 보여주는 비공유 연합된 개개의 Aβ(X-Y) 펩타이드의 어셈블리를 포함하는 분자 구조를 언급한다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 피브릴은 예를 들어, 0.1M HCl 중에 세제의 부재하에 적합한 Aβ 펩타이드가 자가 유도 중합체 응집을 포함하는 24 유니트 이상, 바람직하게는 100 유니트 이상의 응집체를 형성을 유도하는 공정에 의해 수득가능한 분자 구조이다. 당해 공정은 당업계에 널리 공지되어 있다. 유리하게, Aβ(X-Y) 피브릴은 수용액의 형태로 사용된다. 특히 바람직한 본 발명의 양태에서, 피브릴 수용액은 0.1% NH₄OH중에 Aβ 펩타이드를 용해시키고 이를20 mM NaH₂PO₄, 140 mM NaCl(pH 7.4)와 1:4fh 희석함에 이어서 pH를 7.4로 재조정하고, 20시간동안 37℃에서 용액을 항온처리함에 이어서 10분동안 10000g에서 원심분리하고, 20 mM NaH₂PO₄, 140 mM NaCl(pH 7.4)중에 재현탁시킴에 의해 수득된다.

본원에서 용어 "Aβ(X-Y) 피브릴"은 필수적으로 Aβ(X-Y) 서브유니트로 이루어진 피브릴을 언급하고 이때, 평균적으로 서브유니트의 90% 이상이 Aβ(X-Y) 유형인 경우가 바람직하고, 서브유니트의 98% 이상이 Aβ(X-Y) 유형인 경우가 보다 바람직하고 비-Aβ(X-Y) 펩타이드의 함량이 검출 역치 미만인 경우가 가장 바람직하다.

보다 구체적으로, 본원에서 용어 "Aβ(1-42) 피브릴"은 본원에서 실시예 3에 기재된 바와 같은 Aβ(1-42) 피브릴 제제를 언급한다.

유리하게, 본 발명의 항체는 하나 또는 보다 바람직하게는 2개의 피브릴과 낮은 친화성, 가장 바람직하게는 가장 바람직하게는 1x10^-8 M 이하 K_D의 친화성, 예 를 들어, 3x10^-8 M 이하 K_D의 친화성, 1x10^-7 M 이하 K_D의 친화성, 예를 들어, 3x1O^-7 M 이하 K_D의 친화성, 또는 1x10^-6 M 이하 K_D의 친화성, 예를 들어, 3x10^-5 M 이하 K_D의 친화성, 또는 1x10^-5 M 이하 K_D의 친화성으로 결합한다.

특히, Aβ(20-42) 글로불로머로의 본 발명의 항체 결합 친화성은 하나 또는 보다 바람직하게는 2개의 단량체로의 항체의 결합 친화성 보다 2배 이상, 예를 들어, 3배 이상 또는 5배 이상, 바람직하게는 10배 이상, 예를 들어, 20배 이상, 30배 이상 또는 50배 이상, 보다 바람직하게는 100배 이상, 예를 들어, 200배 이상, 300배 이상 또는 500배 이상 및 보다 더 바람직하게는 1000배 이상, 예를 들어, 2000배 이상, 3000배 이상 또는 5000배 이상, 보다 더 바람직하게는 10000배 이상, 예를 들어, 20000배 이상, 30000배 이상 또는 50000배 이상 및 가장 바람직하게는 100000배 이상인 것이 바람직하다.

하나의 특정 양태에 따라, 본 발명은 Aβ(1-40) 및 Aβ(1 -42) 피브릴 둘다에 대한 결합 친화성 보다 큰 Aβ(20-42) 글로불로머로의 결합 친화성을 갖는 항체에 관한 것이다.

특히 바람직한 양태에 따라, 본 발명은 하나 이상의 Aβ 글로불로머, 특히 Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 것 보다 단량체성 및 섬유 형태 둘다의 Aβ에 대해 비교적 작은 친화성을 갖는 항체에 관한 것이다.

본 발명의 항체는 추가로 가교 결합된 Aβ(1-42) 글로불로머, 특히, 본원에 실시예 1b에 기재된 바와 같은 글루타르알데하이드 가교결합된Aβ(1-42) 글로불로머에 대한 것 보다 큰 Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 결합 친화성을 갖는 항체를 포함한다.

본 발명의 특히 바람직한 양태에서, Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성은 가교 결합된 Aβ(1-42) 글로불로머에 대한 항체 결합 친화성 보다 2배 이상, 예를 들어, 3배 이상 또는 5배 이상, 바람직하게는 10배 이상, 예를 들어, 20배 이상, 30배 이상 또는 50배 이상, 보다 바람직하게는 100배 이상, 예를 들어, 200배 이상, 300배 이상 또는 500배 이상 및 보다 더 바람직하게는 1000배 이상, 예를 들어, 2000배 이상, 3000배 이상 또는 5000배 이상, 보다 더 바람직하게는 10000배 이상, 예를 들어, 20000배 이상, 30000배 이상 또는 50000배 이상 및 가장 바람직하게는 100000배 이상이다.

본 발명의 항체는 바람직하게 분리된, 특히 모노크로날 및 보다 특히 재조합체이다.

본 발명은 또한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) 기탁 번호 PTA-7241로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체(피검체)에 관한 것이다.

본 발명은 또한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) 기탁 번호 PTA-7239로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체(10F11)에 관한 것이다.

본 발명은 또한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) 기탁 번호 PTA-7240으로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체(7C8)에 관한 것이다.

본 발명은 또한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) 기탁 번호 PTA-7242로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체(4B7)에 관한 것이다.

본 발명은 또한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) 기탁 번호 PTA-7409로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체(6A2)에 관한 것이다.

본 발명은 또한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) 기탁 번호 PTA-7408로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체(2F7)에 관한 것이다.

본 발명은 또한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) 기탁 번호 PTA-7405로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체(4D10)에 관한 것이다.

본 발명은 또한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) 기탁 번호 PTA-7809로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체(7E5)에 관한 것이다.

본 발명은 또한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) 기탁 번호 PTA-7810으로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체(10C1)에 관한 것이다.

본 발명은 또한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) 기탁 번호 PTA-7851로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체(3B10)에 관한 것이다.

본 발명의 당해 항체 5F7, 10F11 , 7C6, 4B7, 6A2, 2F2, 4D10, 7E5, 10C1 및 3B10은 Aβ(1-42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성 보다 큰 Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 결합 친화성을 가짐을 특징으로 한다.

본 발명은 또한 당해 모노클로날 항체 5F7, 10F11 , 7C6, 4B7, 6A2, 2F2, 4D10, 7E5, 10C1 및 3B10의 어느 하나와 유사한 결합 프로필을 갖는 항체에 관한 것이다. 당해 모노클로날 항체중 어느 하나와 유사한 결합 프로필을 갖는 항체는 Aβ(1-42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성 보다 큰, Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 결합 친화성을 갖는 항체로 제한되지 않는 것으로 이해되어야만 한다.

당해 모노클로날 항체 5F7, 10F11 , 7C6, 4B7, 6A2, 2F2, 4D10, 7E5, 10C1 및 3B10중 어느 하나와 유사한 결합 프로필을 갖는 항체는 모노클로날 항체 5F7, 10F11 , 7C6, 4B7, 6A2, 2F2, 4D10, 7E5, 10C1 및 3B10과 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다.

5F7, 10F11 , 7C6, 4B7, 6A2, 2F2, 4D10, 7E5, 10C1 및 3B10으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 모든 모노클로날 항체는 20 및 40 Aβ 서열 범위, 특히, 20 내지 30 Aβ 서열 범위내에 포함된 에피토프와 결합한다. 이론에 국한되는 것 없이, 당해 에피토프는 아미노산 20번 및 40번 영역에서, 특히 아미노산 20번 및 30번에서의 서브유니트간에 구조적 비선형 에피토프가 있는 것으로 사료된다.

본 발명은 또한 5F7, 10F11 , 7C6, 4B7, 6A2, 2F2, 4D10, 7E5, 10C1 및 3B10으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상, 바람직하게는 모든 항체와 경쟁할 수 있는 항체에 관한 것이다.

본원에서 용어 "경쟁하는 항체"는 동일한 분자 또는 안정하지만 비공유 결합된 거대분자 실체, 바람직하게는 동일한 분자를 표적화하는 다수의 항체를 언급하고, 여기서, 하나 이상의 항체는 이의 표적 에피토프로의 기타 항체의 접근을 공간적으로 방해함에 의해 또는 기타 항체에 대한 표적의 친화성을 감소시키는, 표적 실체중의 형태를 유도하고/하거나, 보다 바람직하게는 이전 에피토프와 충분히 인접하거나, 특히 중접하거나 이와 동일한 에피토프, 가장 바람직하게는 중첩하거나 동일한, 특히 동일한 표적 에피토프에 대한 다른 항체의 접근을 직접 차단함에 의해 다른 항체의 측정 가능한 결합을 특이적으로 감소시킬 수 있다. 2개의 에피토프는 본원에서 이들이 화학적 구조, 바람직하게는 이들의 아미노산 서열의 일부를 공유하는 경우 중첩으로 언급되고 이들의 화학적 구조, 바람직하게는 이들의 아미노산 서열이 동일한 경우 동일한 것으로 언급된다.

따라서, 본 발명은 또한 표적 에피토프가 중첩하고, 바람직하게는 5F7, 10F11 , 7C6, 4B7, 6A2, 2F2, 4D10, 7E5, 10C1 및 3B10로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 항체중 어느 하나의 표적 에피토프와 중첩하고 바람직하게는 동일한 항체에 관한 것이다.

따라서, 당해 모노클로날 항체 5F7, 10F11 , 7C6, 4B7, 6A2, 2F2, 4D10, 7E5, 10C1 및 3B10중 어느 하나와 유사한 결합 프로필을 갖는 항체는 추가로 당해 모노클로날 항체 5F7, 10F11 , 7C6, 4B7, 6A2, 2F2, 4D10, 7E5, 10C1 및 3B10중 어느 하나의 항원 결합 잔기의 적어도 일부를 포함하는 항체를 포함한다. 바람직하게, 당해 일부는 당해 모노클로날 항체5F7, 10F11 , 7C6, 4B7, 6A2, 2F2, 4D10, 7E5, 10C1 및 3B10중 어느 하나의 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다.

따라서, 추가의 특정 양태에 따라, 본 발명은 모노클로날 항체 5F7, 10F11 , 7C6, 4B7, 6A2, 2F2, 4D10, 7E5, 10C1 또는 3B10의 중쇄 CDR3의 아미노산 서열 및/또는 경쇄 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 항체에 관한 것이다. 당해 항체의 특정 예는 또한 각각 모노클로날 항체 5F7, 10F11 , 7C6, 4B7, 6A2, 2F2, 4D10, 7E5, 10C1 또는 3B10의 중쇄 CDR2의 아미노산 서열 및/또는 경쇄 CDR2의 아미노산 서열을 포함하는 것들을 포함한다. 보다 더 구체적으로, 당해 항체는 각각 모노클로날 항체 5F7, 10F11 , 7C6, 4B7, 6A2, 2F2, 4D10, 7E5, 10C1 또는 3B10의 중쇄 CDR1 및/또는 경쇄 CDR1의 아미노산 서열을 포한 포함하는 것들을 포함한다.

따라서, 한 측면에서, 본 발명은 CDR3, CDR2 및/또는 CDR1 도메인이 모노클로날 항체 5F7, 10F11 , 7C6, 4B7, 6A2, 2F2, 4D10, 7E5, 10C1 또는 3B10의 중쇄 CDR3, CDR2 및/또는 CDR1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체에 관한 것이다.

따라서, 추가의 측면에서, 본 발명은 CDR3, CDR2 및/또는 CDR1 도메인이 각각 모노클로날 항체 5F7, 10F11 , 7C6, 4B7, 6A2, 2F2, 4D10, 7E5, 10C1 또는 3B10의 경쇄 CDR3, CDR2 및/또는 CDR1의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항 체에 관한 것이다.

바람직하게, 본 발명의 항체는 서열번호 3의 아미노산 잔기 31번 내지 35번, 서열번호 3의 아미노산 잔기 50번 내지 66번, 서열번호 3의 아미노산 잔기 99번 내지 109번, 서열번호 4의 아미노산 잔기 24번 내지 39번, 서열번호 4의 아미노산 잔기 55번 내지 61번, 서열번호 4의 아미노산 잔기 94번 내지 102번, 서열번호 7의 아미노산 잔기 31번 내지 35번, 서열번호 7의 아미노산 잔기 50번 내지 66번, 서열번호 7의 아미노산 잔기 97번 내지 109번, 서열번호 8의 아미노산 잔기 24번 내지 39번, 서열번호 8의 아미노산 잔기 55번 내지 61번, 서열번호 8의 아미노산 잔기 94번 내지 102번, 서열번호 11의 아미노산 잔기 31번 내지 35번, 서열번호 11의 아미노산 잔기 50번 내지 65번, 서열번호 11의 아미노산 잔기 98번 내지 107번, 서열번호 12의 아미노산 잔기 24번 내지 39번, 서열번호 12의 아미노산 잔기 55번 내지 61번, 서열번호 12의 아미노산 잔기 94번 내지 102번, 서열번호 15의 아미노산 잔기 31번 내지 35번, 서열번호 15의 아미노산 잔기 50번 내지 66번, 서열번호 15의 아미노산 잔기 99번 내지 107번, 서열번호 16의 아미노산 잔기 24번 내지 40번, 서열번호 16의 아미노산 잔기 56번 내지 62번, 서열번호 16의 아미노산 잔기 95번 내지 103번, 서열번호 19의 아미노산 잔기 31번 내지 35번, 서열번호 19의 아미노산 잔기 50번 내지 66번, 서열번호 19의 아미노산 잔기 99번 내지 109번, 서열번호 20의 아미노산 잔기 24번 내지 39번, 서열번호 20의 아미노산 잔기 55번 내지 61번, 서열번호 20의 아미노산 잔기 94번 내지 102번, 서열번호 23의 아미노산 잔기 31번 내지 35번, 서열번호 23의 아미노산 잔기 50번 내지 66번, 서열번호 23의 아미노산 잔기 99번 내지 109번, 서열번호 24의 아미노산 잔기 24번 내지 39번, 서열번호 24의 아미노산 잔기 55번 내지 61번, 서열번호 24의 아미노산 잔기 94번 내지 102번, 서열번호 27의 아미노산 잔기 31번 내지 35번, 서열번호 27의 아미노산 잔기 50번 내지 65번, 서열번호 27의 아미노산 잔기 98번 내지 101번, 서열번호 28의 아미노산 잔기 24번 내지 39번, 서열번호 28의 아미노산 잔기 55번 내지 61번, 서열번호 28의 아미노산 잔기 94번 내지 102번, 서열번호 31의 아미노산 잔기 31번 내지 35번, 서열번호 31의 아미노산 잔기 50번 내지 66번, 서열번호 31의 아미노산 잔기 99번 내지 107번, 서열번호 32의 아미노산 잔기 24번 내지 40번, 서열번호 32의 아미노산 잔기 56번 내지 62번, 서열번호 32의 아미노산 잔기 95번 내지 103번, 서열번호 35의 아미노산 잔기 31번 내지 35번, 서열번호 35의 아미노산 잔기 50번 내지 66번, 서열번호 35의 아미노산 잔기 99번 내지 107번, 서열번호 36의 아미노산 잔기 24번 내지 40번, 서열번호 36의 아미노산 잔기 56번 내지 62번, 서열번호 36의 아미노산 잔기 95번 내지 103번, 서열번호 38의 아미노산 잔기 31번 내지 35번, 서열번호 38의 아미노산 잔기 50번 내지 66번, 및 서열번호 38의 아미노산 잔기 98번 내지 109번으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 하나 이상의 CDR을 포함한다.

바람직한 양태에서, 항체는 상기된 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 3개 이상의 CDR을 포함한다. 보다 바람직하게, 선택된 3개 CDR은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 가변 도메인 CDR 세트로부터 기원하는 것이다:

하나의 양태에서, 본 발명의 항체는 2개 이상의 가변 도메인 CDR 세트를 포함한다. 보다 바람직하게, 2개의 가변 도메인 CDR 세트는 VH 5F7 CDR 세트 및 VL 5F7 CDR 세트; VH 10F11 CDR 세트 및 VL 10F11 CDR 세트; VH 7C6 CDR 세트 및 VL 7C6 CDR 세트; VH 4B7 CDR 세트 및 VL 4B7 CDR 세트; VH 2F2 CDR 세트 및 VL 2F2 CDR 세트; VH 6A2 CDR 세트 및 VL 6A2 CDR 세트; VH 4D10 CDR 세트 및 VL 4D10 CDR 세트; VH 7E5 CDR 세트 및 VL 7E5 CDR 세트; 및 VH 10C1 CDR 세트 및 VL 10C1 CDR 세트로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

또 다른 양태에서, 상기된 항체는 사람 수용체 골격을 추가로 포함한다.

바람직한 양태에서, 당해 항체는 CDR 접목 항체이다. 바람직하게, CDR 접목 항체는 상기된 하나 이상의 CDR을 포함한다.

바람직하게, CDR 접목 항체는 사람 수용체 골격을 포함한다.

바람직한 양태에서, 당해 항체는 사람화된 항체이다. 바람직하게, 사람화된 항체는 상기된 하나 이상의 CDR을 포함한다. 보다 바람직하게, 사람화된 항체는 상기된 3개 이상의 CDR을 포함한다. 가장 바람직하게, 사람화된 항체는 상기된 6개의 CDR을 포함한다. 특정 양태에서, CDR은 사람 수용체 골격의 사람 항체 가변 도메인에 혼입된다. 바람직하게, 사람 항체 가변 도메인은 컨센서스 사람 가변 도메인이다. 보다 바람직하게, 사람 수용체 골격은 주요 잔기에서 하나 이상의 골격 영역의 아미노산 치환을 포함하고 이때, 주요 잔기는 CDR에 인접한 잔기; 당화 부위 잔기; 희귀 잔기; Aβ(20-42) 글로불로머와 상호작용할 수 있는 잔기; CDR과 상호작용할 수 있는 잔기; 표준 잔기; 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역간의 접촉 잔기; 베르니어 영역내의 잔기; 및 코티아(Chothia) 한정된 가변 중쇄 CDR1 및 캐뱃(Kabat) 한정된 제1 중쇄 골격간에 중첩하는 영역내 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직하게 사람 수용체 골격은 하나 이상의 골력 영역 아미노산 치환을 포함하고, 이때, 골격의 아미노산 서열은 당해 사람 수용체 골격의 서열과 65% 이상 동일하고 당해 사람 수용체 골격과 동일한 70개 이상의 아미노산 잔기를 포함한다.

여전히 추가의 측면에서, 본 발명은 상기된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 둘다를 포함하는 항체에 관한 것이다.

바람직하게, 당해 항체는 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 11 , 서열번호 12, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 31 , 서열번호 32, 서열번호 35, 서열번호 36, 및 서열번호 38로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 보다 바람직하게, 당해 항체는 2개의 가변 도메인을 포함하고, 이때, 당해 2개의 가변 도메인은 서열번호 3 및 서열번호 4, 서열번호 7 및 서열번호 8 및 서열번호 11 및 서열번호 12, 서열번호 15 및 서열번호 16, 서열번호 19 및 서열번호 20, 서열번호 23 및 서열번호 24, 서열번호 27 및 서열번호 28, 서열번호 31 및 서열번호 32, 및 서열번호 35 및 서열번호 36으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다.

또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는 IgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgM, IgA, IgD, IgE 및 사람 IgG1 Ala234 Ala235 돌연변이 불변 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 특히, 당해 항체는 사람 불변 영역을 포함한다. 보다 바람직하게, 항체는 서열번호 39 내지 42로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. IgG1 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체가 바람직하다.

또 다른 양태에서, 당해 항체는 당화된다. 바람직하게, 당화 패턴은 사람 당화 패턴 또는 본원에 기재된 진핵 세포중 어느 하나, 특히 CHO 세포에 의해 나타나는 당화 패턴이다.

본 발명은 또한 본 발명의 항체의 항원 결합 잔기에 관한 것이다. 당해 항 원 결합 잔기는 Fab 단편, F(ab')₂ 단편 및 항체의 단일쇄 Fv 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 추가의 항원 결합 잔기는 Fab' 단편, Fv 단편, 및 디설파이드 연결된 Fv 단편이다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 항체의 어느 하나를 암호화하는 분리된 핵산을 제공한다. 추가의 양태는 본원에 기재된 분리된 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 당해 벡터는 특히, pcDNA; pTT (Durocher et al., Nucleic Acids Research 2002, VoI 30, No.2); pTT3 (추가의 다중 클로닝 부위를 갖는 pTT; pEFBOS (Mizushima, S. and Nagata, S., (1990) Nucleic Acids Research VoI 18, No. 17); pBV; pJV; 및 pBJ로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.

또 다른 측면에서. 숙주 세포는 본원에 기재된 벡터로 형질전환된다. 바람직하게, 숙주 세포는 진핵 세포이다. 보다 바람직하게, 숙주 세포는 이. 콜리이다. 관련 양태에서, 숙주 세포는 진핵 세포이다. 바람직하게, 진핵 세포는 원생 생물 세포, 동물 세포(예를 들어, 포유동물 세포, 조류 세포 및 곤충 세포), 식물 세포 및 진균 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 보다 바람직하게, 숙주 세포는 CHO 및 COS로 제한되지 않는 포유동물 세포; 또는 진균 세포, 예를 들어, 효모 세포, 예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae); 또는 Sf9과 같은 곤충 세포이다.

본 발명의 또 다른 측면은, 본원에 기재된 숙수 세포 또는 하이브리도마중 어느 하나를 항체를 생산하기에 적합한 조건하에서 배양 배지에서 배양함을 포함하는, 발명의 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 또 다른 양태는 본원에 기재된 방 법에 의해 수득가능한 항체를 제공한다.

본 발명의 항체는 공지된 방법대로 수득될 수 있다.

총 수 1000억개의 상이한 항체 특이성으로 이루어진 항체 레퍼토리를 포함하는 B 림프구는 포유동물 면역계의 일부이다. 특정 항원에 대한 정상적인 면역 반응은 당해 항원에 특이적으로 결합하는 당해 레퍼토리의 하나 이상의 항체의 선별을 의미하고 면역반응의 성공은 적어도 부분적으로 자극 항원을 특이적으로 인지하고(및 궁극적으로 제거하기 위한) 당해 항체 환경에서 기타 분자를 무시하는 당해 항체의 능력을 기초로한다.

하나의 특정 표적 항원을 특이적으로 인지하는 항체 유용성은 모노클로날 항체 기술의 개발을 유도하였다. 현재, 표준화된 하이브리도마 기술은 목적하는 항원에 대해 단일 특이성을 갖는 항체가 제조될 수 있게 한다. 보다 최근에, 항체 라이브러리의 시험관내 스크리닝과 같은 재조합 항체 기술이 개발되었다. 이들 기술은 또한 목적하는 항원에 대해 단일 특이성을 갖는 항체가 제조될 수 있도록 한다.

본 발명의 방법에서, 목적하는 항원이 생체내 또는 시험관내에서 항체 레퍼토리에 작용하도록 할 수 있다.

하나의 양태에 따라, 당해 항원은 생체내에서 동물을 당해 항원으로 면역화시킴에 의해 레퍼토리에 작용할 수 있도록 한다. 이러한 생체내 방법은 추가로 동물의 림프구로부터 다수의 하이브리도마를 확립하고 당해 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 분비하는 특정 하이브리도마를 선별함을 추가로 포함할 수 있다. 면 역화될 동물은 예를 들어, 마우스, 랫트, 토끼, 닭, 낙타 또는 양일 수 있거나 상기 언급된 유전자전이 버젼의 임의의 동물, 예를 들어, 항원 자극 후 사람 항체를 생산하는 사람 면역글로불린 유전자를 갖는 유전자전이 마우스일 수 있다. 면역화될 수 있는 기타 유형의 동물은 사람 말초 단핵 혈액 세포로 재구성된 중증 조합의 면역결핍을 갖는 마우스(키메라 hu-PBMC SCID 마우스) 또는 림프 세포 또는 이의 전구체로 재구성된 중증 조합의 면역결핍을 갖는 마우스, 및 치명적인 전신 조사로 처리됨에 이어서 중증 조합의 면역결핍(SCID)을 갖는 마우스로부터 골수 세포로 조사에 대해 보호받음에 이어서 기능성 사람 림프구("Timera" 시스템)를 이식받은 마우스를 포함한다. 면역화된 또 다른 유형의 동물(예를 들어, 마우스)은 목적하는 항원을 암호화하는 내인성 유전자가 예를 들어, 상동성 재조합에 의해 스위치 오프(녹 아웃)되어 항원으로 면역화 후 당해 동물이 당해 항원을 이물질로서 인지하는 동물(예를 들어, 마우스)이다. 당해 방법에 의해 생산되는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체는 ELISA 및 도트 블롯 기술을 포함하지만 이에 제한되지 않는 공지된 스크리닝 방법을 사용함에 의해 특징분석되고 선별됨이 당업자에게 명백하다.

또 다른 양태에 따라, 당해 항원은 재조합 항체 라이브러리를 당해 항원으로 스크리닝함에 의해 시험관내에서 항체 레퍼토리에 작용하도록 한다. 재조합 항체 라이브러리는 예를 들어, 박테리오파아지의 표면상에 또는 효소 세포의 표면상에 또는 세규 세포의 표면상에 발현될 수 있다. 다양한 양태에서, 재조합 항체 라이브러리는 예를 들어, scFv 라이브러리 또는 Fab 라이브러리이다. 또 다른 양태에 따라, 항체 라이브러리는 RNA-단백질 융합체로서 발현된다.

본 발명의 항체를 제조하는 또 다른 방법은 조합된 생체내 및 시험관내 방법을 포함한다. 예를 들어, 당해 항원은 당해 항원으로 생체내에서 동물을 면역화시킴에 이어서 당해 동물의 림프 세포로부터 제조된 재조합 항체 라이브러리를 또는 단일 도메인 항체 라이브러리(예를 들어, 중쇄 및/또는 경쇄를 함유하는) 당해 항원을 사용하여 시험관내에서 스크리닝함에 의해 항체 레퍼토리에 작용하도록 할 수 있다. 또 다른 방법에 따라, 당해 항원은 생체내에서 동물을 당해 항원으로 면역화시킴에 이어서 당해 동물의 림프 세포부터 제조된 재조합 항체 라이브러리 또는 단일 도메인 라이브러리를 친화성 성숙화에 적용함에 의해 항체 레퍼토리에 작용하도록 할 수 있다. 또 다른 방법에 따라, 당해 항원은 생체내에서 당해 항원으로 동물을 면역화시킴에 이어서 목적하는 항체를 분비하는 개별 항체 생산 세포를 선별하고 당해 선별된 세포로부터 중쇄 및 경쇄의 가변 영역에 대한 cDNA를 수득(예를들어, PCR을 수단으로)하고 시험관내에서 포유동물 숙주 세포내 중쇄 및 경쇄의 가변 영역에 대한 cDNA를 수득하고 시험관내에서 포유동물 숙주 세포에서 중쇄 및 경쇄의 당해 가변 영역을 발현시킴(이것은 선별된 림프구 항체 방법 또는 SLAM으로 언급됨)에 의해 선별된 항체 유전자 서열을 추가로 선별할 수 있고 조작할 수 있도록 함에 의해 항체 레퍼토리에 작용하도록 할 수 있다. 더욱이, 모노클로날 항체는 포유동물 세포에서 중쇄 및 경쇄에 대한 항체 유전자를 발현시키고 목적하는 결합 친화성을 갖는 항체를 분비하는 포유동물 세포를 선별함에 의한 클로닝 발현에 의해 선택될 수 있다.

본 발명은 스크리닝 및 역 스크리닝을 위한 규명된 항원을 제공한다. 따라 서, 당해 발명에 따라 상기 정의된 바와 같은 결합 친화성으로 Aβ(20-42) 글로불로머에 결합하는 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 선별할 수 있다.

항체를 제조하기 위한 본 발명의 방법은 다양한 유형의 항체를 제조하는데 사용될 수 있다. 이들은 모노클로날, 특히 재조합 항체, 특히 필수적으로 사람 항체, 키메라 항체, 사람화된 항체 및 CDR 접목 항체 및 또한 이의 항원 결합 잔기를 포함한다.

본 발명은 추가로 본 발명의 모노클로날 항체를 생산(분비)할 수 있는 하이브리도마에 관한 것이다. 본 발명의 하이브리도마는 PTA-7241 , PTA-7239, PTA-7240, PTA-7242, PTA-7408, PTA-7409, PTA- 7405, PTA-7809, PTA-7810 및 PTA-7851로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호로 지정된 것들을 포함한다.

본 발명의 항체는 또한 본원에 기재된 Aβ 글로불로머 이외의 다른 Aβ 형태에 반응성일 수 있고, 즉 이에 결합할 수 있는 것으로 주지된다. 이들 항원은 올리고머성 또는 글로불로머일 수 있거나 아닐 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체가 결합하는 항원은 본 발명의 항체가 반응성인 글로불로머 에피토프를 포함하는 임의의 Aβ 형태를 포함한다. 당해 Aβ 형태는 Aβ(20-42), Aβ(20-40), Aβ(12-42), Aβ(12-40), Aβ(1-42), 및 Aβ(1-40) 형태와 같은 절단되고 비절단된 Aβ(X- Y) 형태(X 및 Y는 상기 정의된 바와 같다)를 포함하고, 단, 당해 형태는 글로불로머 에피토프를 포함한다.

본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 잔기를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

특정 양태에 따라, 당해 조성물은 본 발명의 항체 또는 항원 결합 잔기 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다.

본 발명의 항체 또는 상기 정의된 바와 같은 항원 결합 잔기는 바람직하게 생체내 및 시험관내 둘다에서 당해 항체가 결합하는 Aβ 글로불로머 또는 이의 유도체의 활성을 중화시킬 수 있다. 따라서 당해 항체 또는 항원 결합 잔기는 예를 들어, 당해 글로불로머 또는 이의 유도체를 함유하는 제제 또는 당해 글로불로머 또는 이의 유도체가 존재하는 사람 개체 또는 기타 포유동물에서 당해 글로불로머 또는 이의 유도체의 활성을 억제하기 위해 사용될 수 있다.

하나의 양태에 따라, 본 발명은 당해 글로불로머 또는 이의 유도체의 활성을 억제하는 방법에 관한 것이고 이의 방법은 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 잔기가 글로불로머 또는 이의 유도체에 작용하도록 하여 당해 글로불로머 또는 이의 유도체의 활성을 억제함을 포함한다. 당해 활성은 예를 들어, 시험관내에서 억제될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 잔기는 샘플중에서 당해 글로불로머 또는 이의 유도체의 활성을 억제하기 위해, 당해 글로불로머 또는 이의 유도체를 함유하거나 함유할 것으로 의심되는 피검체 또는 세포 배양물로부터 유래된 샘플과 같은 제제에 첨가될 수 있다. 또한, 글로불로머 또는 이의 유도체의 활성은 생체내에서 개체에서 억제될 수 있다.

따라서, 본 발명은 추가로 아밀로이드증, 특히 알츠하이머 질환, 및 다운 증후군의 아밀로이드증으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아밀로이드증을 치료하 거나 예방하는 약제학적 조성물을 제조하기 위한 상기된 바와 같은 항체 또는 항원 결합 잔기의 용도에 관한 것이다. 따라서 본 발명의 용도의 한 측면은 상기 정의된 바와 같은 항체 또는 항원 결합 잔기를 피검체에 투여함을 포함하는, 이를 필요로 하는 피검체에서 아밀로이드증, 특히, 알츠하이머 질환 또는 다운 증후군의 아밀로이드증을 치료하거나 예방하는 방법이다. 아밀로이드증, 특히, 알츠하이머 질환 또는 다운 증후군의 아밀로이드증을 치료하고 특히 예방하기 위한 당해 항체 또는 항원 결합 잔기의 용도는 특히 수동 면역화를 위한 것이다. 따라서, 필요로 하는 피검체에서 아밀로이드증, 특히, 알츠하이머 질환 또는 다운 증후군의 아밀로이드증을 치료하거나 예방하는 방법에서, 항체 또는 항원 결합 잔기를 피검체에 투여하는 한가지 목적은 아밀로이드증, 특히, 알츠하이머 질환 또는 다운 증후군의 아밀로이드증에 대해 환자를 수동 면역화하기 위한 것이다.

상기 정의된 바와 같은 본 발명의 항체 또는 항원 결합 잔기는 바람직하게 시험관내 및 생체내 둘다에서 이것이 결합하는 Aβ 글로불로머 또는 이의 유도체를 검출할 수 있다. 따라서 당해 항체 또는 항원 결합 잔기는 예를 들어, 당해 글로불로머 또는 이의 유도체를 함유하는 제제에서 또는 당해 글로불로머 또는 이의 유도체가 존재하는 사람 개체 또는 기타 포유동물에서 당해 글로불로머 또는 이의 유사체를 검출하기 위해 사용될 수 있다.

하나의 양태에 따라, 본 발명은 당해 글로불로머 또는 이의 유도체를 검출하는 방법에 관한 것이고, 당해 방법은 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 잔기가 글로불로머 또는 이의 유도체에 작용시켜 당해 글로불로머 또는 이의 유도체에 결 합( 및 이에 의해 바람직하게 항체 또는 이의 항원 결합 잔기 및 글로불로머 또는 이의 유도체를 포함하는 복합체의 형성)하도록 함을 포함한다. 당해 글로불로머는 예를 들어, 시험관내에 검출될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 잔기는 제제에서 글로불로머 또는 이의 유도체를 검출하기 위해 예를 들어, 당해 글로불로머 또는 이의 유도체를 함유하거나 함유하는 것으로 의심되는 피검체 또는 세포 배양물로부터 유래하는 샘플인 제제에 첨가될 수 있다. 또한, 당해 글로불로머 또는 이의 유도체는 생체내 개체에서 검출될 수 있다.

따라서, 본 발명은 추가로, 아밀로이드증, 특히 알츠하이머 질환 또는 다운 증후군의 아밀로이드증을 진단하기 위한 조성물을 제조하기 위한 상기된 바와 같은 항체 또는 항원 결합 잔기의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 당해 용도의 한 측면은 상기된 바와 같은 항체 또는 항원 결합 잔기를 피검체에 투여함하고 항체 또는 항원 결합 잔기와 항원을 포함하는 복합체의 형성을 검출함을 포함하는, 아밀로이드증, 특히, 알츠하이머 질환 또는 다운 증후군의 아밀로이드증을 가질 것으로 의심되는 피검체에서 아밀로이드증, 특히 알츠하이머 질환 또는 다운 증후군의 아밀로이드증을 진단하는 방법이고 이때 복합체의 존재는 피검체에 아밀로이증, 특히, 알츠하이머 질환 또는 다운 증후군의 아밀로이드증을 지적한다. 본 발명의 당해 용도의 제2 측면은 피검체 기원의 샘플을 제공하고, 당해 샘플을 상기 정의된 바와 같은 항체 또는 항원 결합 잔기와 접촉시키고 항체 또는 항원 결합 잔기와 항원을 포함하는 복합체의 형성을 검출함을 포함하는, 아밀로이드증, 특히, 알츠하이머 질환 또는 다운 증후군의 아밀로이드증을 진단하는 방법이고, 이때, 복합체의 존재는 피검체에서 아밀로이드증, 특히, 알츠하이머 질환 또는 다운 증후군의 아밀로이드증을 지적한다.

본 발명의 항체의 결합 친화성은 ELISA, 도트 블롯 또는 BIAcore 분석(Pharmacia Biosen- sor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ)과 같은 표준화된 시험관내 면역분석을 사용하여 평가할 수 있다. 추가의 기재에 대해 문헌[Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51 :19-26; Jonsson, U., et al. (1991 ) Biotechniques 11 :620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. MoI. Recognit. 8:125-131 ; and Johnsson, B., et al. (1991 ) Anal. Biochem. 198:268-277]을 참조한다.

특정 양태에 따라, 본원에 정의된 친화성은 실시예 8에 기재된 바와 같은 도트 블롯을 수행하고 밀도 측정기에 의해 이를 평가함에 의해 수득되는 수치를 언급한다. 본 발명의 특정 양태에 따라, 도트 블롯에 의한 결합 친화성의 측정은 하기를 포함한다: 특정 양의 항원(예를 들어, 상기 정의된 바와 같은 Aβ(X-Y) 글로불로머, Aβ(X-Y) 단량체 또는 Aβ(X-Y) 피브릴) 또는 유리하게, 예를 들어, 20 mM NaH₂PO₄, 140 mM NaCl, pH 7.4, 0.2 mg/ml BSA중에서 예를 들어, 100 pmol/μl, 10 pmol/μl, 1 pmol/μl, 0.1 pmol/μl 및 0.01 pmol/μl의 항원 농도로의 적당한 희석물을 니트로셀룰로스 막에 점적함에 이어서 막을 밀크로 차단하여 비특이적 결합을 예방하고 세척함에 이어서 목적하는 항체와 접촉시킴에 이어서 효소 접합된 2차 항체 및 비색 반응을 수단으로 후자를 검출하고 한정된 항체 농도에서 결합된 항체의 양은 친화성 측정을 가능하게 한다. 따라서, 하나의 표적물에 대한 2개의 상이한 항체의 상대적 친화성은 본원에서 관찰되는 표적 결합 항체의 각각의 양과 다른 동일한 도트 블롯 조건하에서 2개의 항체 표적 조합체의 관계로서 정의된다. 웨스턴 블롯팅을 기준으로 하는 유사한 방법과 같지 않게, 도트 블롯 방법은 후자의 천연 형태에서 주어진 표적에 대한 항체의 친화성을 결정하고; ELISA 방법과 같지 않게, 도트 블롯 방법은 상이한 표적과 매트릭스간의 친화성 차이를 고려하지 않아 상이한 표적간의 보다 정확한 비교를 가능하게 한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "Kd"는, 당업계에 공지된 바와 같이 특정 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 언급하는 것으로 의도된다.

본 발명의 항체는 바람직하게 분리된 항체이다. "분리된 항체"는 상기된 바와 같은 결합 친화성을 갖고 결합 친화성이 상이한 기타 항체가 필수적으로 부재인 항체를 의미한다. 본원에서 용어 "필수적으로 부재"는 항체의 95% 이상, 바람직하게는 항체의 98% 이상 및 보다 바람직하게는 항체의 99% 이상이 목적하는 결합 친화성을 갖는 항체 제제를 언급한다. 또한, 분리된 항체에는 실질적으로 기타 세포 물질 및/또는 화학물질이 부재일 수 있다.

본 발명의 분리된 항체는 모노클로날 항체를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 "모노클로날 항체"는 상이한 아미노산 서열의 항체 혼합물을 함유하는 "폴리클로날" 항체 제제와는 반대로 공통된 중쇄 및 공통된 경쇄 아미노산 서열을 공유하는 항체 분자의 제제를 언급하는 것으로 의도된다. 모노클로날 항체는 하이브리도마 유래 항체(예를 들어, 표준 괴흘러 및 밀스테인(Kohler and Milstein) 하이브리도마 기술((1975) Nature 256:495-497)과 같은 하이브리도마 기술에 의해 제조되는 하이브리도마에 의해 분비되는 항체)에 의해 예시되는 전형적인 방법에 의한 것 뿐만 아니라 파아지, 세균, 효모 또는 리보솜 디스플레이와 같은 여러 신규 기술에 의해 제조될 수 있다. 따라서, 균일 서열을 갖는 비-하이브리도마-유래 항체는 비전형적 방법에 의해 수득될 수 있지만 본원에서 모노클로날 항체로서 여전히 언급되고 용어 "모노클로날"은 하이브리도마 유래 항체로 제한되지 않지만 하나의 핵산 클론으로부터 유래하는 모든 항체를 언급하는데 사용된다.

따라서, 본 발명의 모노클로날 항체는 재조합 항체를 포함한다. 본원에서 용어 "재조합"은 예를 들어, 화학적 합성에 의한 또는 유전자 조작 기술을 사용한 분리된 분절의 조작에 의한 2개의 달리 분리된 서열 분절의 임의의 인공 조합체를 언급한다. 특히, 당해 용어 "재조합 항체"는 재조합 발현 벡터가 숙주 세포내로 형질감염되어 발현되는 항체와 같이 재조합 수단에 의해 생산되거나 발현되거나 생성되거나 분리되는 항체; 재조합 배합 항체 라이브러리로부터 분리된 항체; 사람 면역글로불린 유전자로 인한 유전자 전이성인 동물(예를 들어, 마우스)로부터 분리된 항체(참조, Taylor, L.D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295); 또는 특정 면역글로불린 유전자 서열(예를 들어, 사람 면역글로불린 유전자 서열)이 기타 DNA 서열과 어셈블리되는 임의의 기타 방식으로 생산되거나, 발현되거나 생성되거나 분리된 항체를 언급한다. 재조합 항체는 예를 들어, 키메라, CDR 접목체 및 사람화된 항체를 포함한다. 당업자는 이종성 시스템에서 통상적인 하이브리도마 유래 모노클로날 항체의 발현이, 수득한 항체 단백질의 아미노산 서열이 변화되지 않거나 변회되도록 의도되지 않는다 하더라도 재조합 항체의 생성을 필요로 함을 알 것이다.

본 발명의 특정 양태에서, 항체는 사람화된 항체이다.

다중 양태에 따라, 항체는 사람 항체 또는 마우스 항체와 같은, 전반적으로 단일 종으로부터 유래된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다른 양태에 따라, 항체는 키메라 항체 또는 CDR 접목 항체 또는 또 다른 형태의 사람화된 항체일 수 있다.

용어 "항체"는 4개의 폴리펩타이드 쇄, 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)로 이루어진 면역글로불린을 언급한다. 당해 쇄는 보통 디설파이드 결합을 통해 서로 연결된다. 각각의 중쇄는 당해 중쇄의 가변 영역(본원에서 HCVR 또는 VH로 약칭) 및 당해 중쇄의 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3로 이루어진다. 각각의 경쇄는 당해 경쇄의 가변 영역(본원에서 LCVR 또는 VL로 약칭) 및 당해 경쇄의 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 CL 도메인으로 이루어진다. VH 및 VL 영역은 추가로 상보성 결정 영역(CDR)로서 언급되는 초가변 영역 및 초가변 영역이 점재되어 있는, 골격 영역(FR)로서 언급되는 보존 영역으로 분류될 수 있다. 따라서 각각의 VH 및 VL 영역은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어져 있고 이들은 N-말단에서 C-말단까지 하기의 순서로 배열되어 있다: FR1 , CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 이러한 구조는 당업자에게 널리 공지되어 있다.

용어 항체의 "항원-결합 잔기"(단순히 "항체 잔기")는 본 발명의 항체의 하나 이상의 단편을 언급하고, 당해 단편은 상기된 바와 같이 결합 친화성을 여전히 갖고 있다. 온전한 항체의 단편은 항체의 항원 결합 기능을 수행할 수 있는 것으로 나타났다. 용어 항체의 "항원 결합 잔기"에 따른 결합 단편의 예는 (i) Fab 단편, 즉, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편; (ii) F(ab')₂ 단편, 즉, 디설파이드 브릿지를 통해 힌지 영역에서 서로 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암의 FL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (v) VH로 이루어지거나 VH, CH1 , CH2, DH3, 또는 VH, CH2, CH3로 이루어진 dAb 단편(Ward ed a/., (1989) Nature 341 :544-546); 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. Fv 단편의 2개의 도메인, 즉, VL 및 VH가 별도의 유전자에 의해 암호화되어 있지만 이들은 추가로 합성 링커, 예를 들어, 폴리-G4S 아미노산 서열 및 재조합 방법을 사용하여 서로 연결되어 VL 및 VH 영역이 1가 분자를 형성하도록 조합되어 단일쇄((단일쇄 Fv (ScFv)로서 공지됨)로서 제조될 수 있다(문헌참조: 예를 들어,Bird et al. (1988) Science 242:423- 426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). 용어 항체의 "항원-결합 잔기"는 또한 당해 단일쇄 항체를 포함하는 것으로 의도된다. "이중항체(diabody)"와 같은 기타 형태의 단일쇄 항체가 또한 여기에 포함된다. 이중항체는 2가, 2특이적 항체이고 여기서 VH 및 VL 도메인은 단일 폴리펩타이드 쇄로 발현되지만 2개의 도메인이 동일 쇄상에 조합될 수 있도록 짧은 링커를 사용하여 당해 도메인이 상이한 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 형성하고 2개의 항원-결합 부위를 형성할 수 있다.(문헌참조: 예를 들어, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123). 면역글로불린 불변 영역은 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인을 언급한다. 사람 IgG 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있고 표 1에 나타낸다.

추가로, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 잔기는 당해 항체 또는 항체 잔기가 하나 이상의 추가의 단백질 또는 펩타이드와 공유 또는 비공유 연합하여 형성된 대형 면역접착 분자의 일부일 수 있다. 당해 면역 접착 분자와 관련하여 스트렙타비딘 코어 영역을 사용하여 사량체 scFv 분자를 제조하고(Kipriyanov, S. M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybri- domas 6:93-101 ) 시스테인 잔기, 마커 펩타이드 및 C-말단 폴리히스티디닐, 예를 들어, 헥사히스티디닐 태그를 사용하여 2가 및 비오티닐화된 scFv 분자를 제조한다(Kipriyanov, S.M., et al. (1994) MoI. Immunol. 31 :1047-1058).

용어 "사람 항체"는 가변 및 불변 영역이 문헌[참조: Kabat et al. (Kabat, et al. (1991 ) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)에 기재된 바와 같이 사람 배선의 면역글로불린 서열에 상응하거나 이로부터 유래하는 항체를 언급한다. 그러나, 본 발명의 사람 항체는 예를 들어, CDR에서 및 특히 CDR3에서 사람 배선 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이 유발 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 함유할 수 있다. 본 발명의 재조합 사람 항체는 가변 영역을 갖고 또한 사람 배선의 면역글로불린 서열로부터 유래된 불변 영역을 함유할 수 있다(문헌참조: Kabat, E. A., et al. (1991 ) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). 그러나, 특정 양태에 따라, 당해 재조합 사람 항체는 시험관내 돌연변이 유발(또는 사람 Ig 서열로 인한 유전자 전이 동물을 사용하는 경우에는 체세포 생체내 돌연변이 유발)에 적용하여 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열이 사람 배선의 VH 및 VL 서열과 관련되거나 이로부터 유래하는 것이지만 사람 항체 배선 레퍼토리내에서 생체내에 천연적으로 존재하지 않는 것이도록 한다. 특정 양태에 따라, 당해 종류의 재조합 항체는 선택적 돌연변이 유발 또는 복귀 돌연변이 또는 이 둘다의 결과물이다. 바람직하게, 돌연변이 유발은 모 항체의 친화성 보다 표적에 대한 친화성을 보다 증가시키고/시키거나 비표적 구조물에 대한 친화성은 감소시킨다.

용어 "키메라 항체"는 하나의 종 기원의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역에 대한 서열 및 또 다른 종 기원의 불변 영역 서열을 함유하는 항체를 언급하고, 예를 들어, 쥐의 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 사람 불변 영역에 연결된 항체가 있다.

용어 "CDR-접목 항체"는 하나의 종 기원의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하지만 여기서, VH 및/또는 VL의 CDR 영역의 하나 이상의 서열이 또 다른 종의 CDR 서열로 대체된 항체를 언급하고, 예를 들어, 쥐의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖지만 여기서 쥐 CDR(예를 들어, CDR3) 하나 이상이 사람 CDR 서열로 대체된 항체가 있다.

용어 "사람화된 항체"는 비사람 종(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 닭, 낙타, 양 또는 염소) 기원의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 서열을 함유하지만 VH 및/또는 VL 서열의 한 부분 이상이 보다 "사람형"이 되도록, 즉 사람 배선의 기변 영역에 보다 유사하도록 변화된 항체를 언급한다. 사람화된 항체의 한 유형은 사람 CDR 서열이 비사람 VH 및 VL 서열에 삽입되어 상응하는 비사람 CDR 서열을 대체하는 CDR 접목 항체이다.

용어 "캐뱃 넘버링", "캐뱃 정의" 및 "캐뱃 표지"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 당업계에서 인지되는 당해 용해는 항체 또는 이의 항원 결합부의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에서 기타 아미노산 잔기 보다 더 가변성(즉 초가변성)인 아미노산 잔기를 넘버링하는 시스템을 언급한다(문헌참조: Kabat er a/. (1971 ) Λnn. NY Acad, ScL 190:382-391 and Kabat, E. A., et al. (1991 ) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). 중쇄 가변 영역에 대해, 초가변 영역은 CDR1에서 아미노산 31번 내지 35번의 범위이고 CDR2에 대해서는 아미노산 50번 내지 65번의 범위이고 CDR3에 대해서는 아미노산 95번 내지 102번의 범위이다. 경쇄 가변 영역에 대해, 초가변 영역은 CDR1에 대해 아미노산 24번 내지 34번의 범위이고, CDR2에 대해서는 아미노산 50번 내지 56번의 범위이고 CDR3에 대해서는 아미노사 89번 내지 97번의 범위이다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "수용체" 및 "수용체 항체"는 하나 이상의 골격 영역의 아미노산 서열의 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 100%를 제공하거나 이를 암호화하는 항체 또는 핵산 서열을 언급한다. 몇몇 양태에서, 용어 "수용체"는 불변 영역을 제공하거나 암호화하는 항체 아미노산 또는 핵산 서열을 언급한다. 또 다른 양태에서, 용어 "수용체"는 하나 이상의 골격 영역 및 불변 영역을 제공하거나 암호화하는 항체 아미노산 또는 핵산 서열을 언급한다. 특정 양태에서, 용어 "수용체"는 하나 이상의 골격 영역의 아미노산 서열의 80% 이상, 바람직하게 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 100%를 제공하거나 암호화하는 사람 항체 아미노산 또는 핵산 서열을 언급한다. 당해 양태에 따라, 수용체는 사람 항체의 하나 이상의 특정 위치에 존재하지 않는 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 10개 이상의 아미노산 잔기를 함유할 수 있다. 수용체 골격 영역 및/또는 수용체 불변 영역은 예를 들어, 배선 항체 유전자, 성숙 항체 유전자, 기능성 항체(예를 들어, 당업계에 널리 공지된 항체, 개발중인 항체 또는 시판중인 항체)로부터 유래하거나 수득된 것일 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "CDR"은 항체 가변 서열내의 상보성 결정 영역을 언급한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 각각에 대해서 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 지정된 3개의 CDR이 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "CDR 세트"는 항원과 결합할 수 있는 단일 가변 영역에 존재하는 3개 CDR 그룹을 언급한다. 이들 CDR의 정확한 경계는 상이한 시스템에 따라 다르게 정의되었다. 문헌[Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) and (1991 )]에 기재된 시스템은 항체의 임의의 가변 영역에 적용될 수 있는 명확한 잔기 넘버링 시스템을 제공하고 3개의 CDR을 한정하는 정확한 잔기 경계선을 제공한다. 이들 CDR은 캐뱃 CDR로서 언급될 수 있다. 문헌[Chothia and coworkers (Chothia & Lesk, J. MoI. Biol. 196:901-917 (1987) and Chothia et al., Nature 342:877-883 (1989)]에서는 캐뱃 CDR내에서 특정 아부분이 거의 동일한 펩타이드 골격 형태를 취하고 있다고 밝혔지만 아미노산 서열에 있어서 상당한 다양성이 있다. 이들 아부분은 L1 , L2 및 L3 또는 H1, H2 및 H3으로서 지정되었고, 여기서, "L" 및 "H"는 각각 경쇄 및 중쇄 영역을 지칭한다. 이들 영역은 캐뱃 CDR과 중복하는 경계선을 갖는 코티아(Chotia) CDR로서 언급될 수 있다. 캐뱃 CDR과 중복하는 CDR을 한정하는 또 다른 경계선은 문헌[참조: Padlan (FASEB J. 9:133-139 (1995)) and MacCallum (J MoI Biol 262(5):732-45 (1996)]에 기재되었다. 여전히 다른 CDR 경계선 정의가 엄격히 상기 시스템중 하나를 따르지는 않지만 캐뱃 CDR과 중복할 것이고 이들은 특정 잔기 또는 잔기 그룹 또는 심지어 전체 CDR이 항원 결합에 상당한 영향을 주지않는 다는 예측 또는 실험적 발견 측면에서 단축되거나 연장될 수 있다. 본원에 사용된 방법은 당해 시임의의 시스템에 따라 한정된 CDR을 사용할 수 있지만 바람직한 양태는 캐뱃 또는 코티아 한정된 CDR이다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "표준" 잔기는 둘다 본원에 참조로서 인용되는 문헌[참조: Chothia et al. (J. MoI. Biol. 196:901- 907 (1987); Chothia et al., J. MoI. Biol. 227:799 (1992)]에 의해 정의된 바와 같은 특정 표준 CDR 구조를 한정하는 CDR 또는 골격에서의 잔기를 언급한다. 코티아 등에 따르면, 많은 항체의 CDR의 중요한 부분은 거의 동일한 펩타이드 골격 형태를 갖지만 아미노산 잔기 수준에서는 큰 다양성이 있다. 각각의 표준 구조는 주로 루프를 형성하는 아미노산 잔기의 연속 절편에 대한 특정 세트의 펩타이드 골격 비틀림 각을 특정한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "공여체" 및 "공여 항체"는 하나 이상의 CDR을 제공하는 항체를 언급한다. 바람직한 양태에서, 공여 항체는 골격 영역이 수득되거나 유래된 항체와는 상이한 종 기원의 항체이다. 사람화된 항체와 관련하여, 용어 "공여 항체"는 하나 이상의 CDR을 제공하는 비사람 항체를 언급한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "골격" 또는 "골격 서열"은 가변 영역에서 CDR을 제외한 나머지 서열을 언급한다. CDR 서열의 정확한 정의가 상이한 시스템을 사용하여 결정할 수 있기 때문에 골격 서열의 의미는 상응하게 다르게 해석된다. 6개의 CDR (경쇄의 CDR-L1 , -L2, 및 -L3 및 중쇄의 CDR-H1 , -H2, 및 -H3)은 또한 경쇄 및 중쇄상에서 골격 영역을 각각의 쇄상에서 4개의 아영역(FR1 , FR2, FR3 and FR4)으로 나누고 여기서, CDR1은 FR1과 FR2 사이에 위치하고 CDR2는 FR2와 FR3 사이에 위치하고, CDR3은 FR3과 FR4 사이에 위치한다. FR1 , FR2, FR3 또는 FR4로서 특정 아영역을 특정하는 것 없이, 기타 영역에 의해 언급되는 골격 영역은 단일의 천연적으로 존재하는 면역글로불린 쇄내에서 조합된 FR을 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같이, FR은 4개의 아영역중 하나를 나타내고 FR은 골격 영역을 구성하는 4개의 아영역중 2개 이상을 나타낸다.

사람 중쇄 및 경쇄 수용체 서열은 당업계에 공지되어 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "배선 항체 유전자" 또는 "유전자 단편"은 특정 면역글로불린의 발현을 위해 유전자 재배열 및 돌연변이 과정이 진행되지 않은 비림프 세포에 의해 암호화된 면역글로불린 서열을 언급한다(문헌참조: 예를 들어, Shapiro et al., Crit. Rev. Immunol. 22(3): 183-200 (2002); Marchalonis et al., Adv Exp Med Biol. 484:13-30 (2001 )). 본 발명의 다양한 양태에 의해 제공된 잇점 중 하나는 배선 항체 유전자가 성숙한 항체 유전자 보다 종에서 개체에 특징적인 필수 아미노산 서열을 보존할 가능성이 높고 따라서 당해 종에 사용되는 경우 비자가로서 인지될 가능성이 적다는 발견을 기초로 한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "주요" 잔기는 항체, 특히 사람화된 항체의 결합 특이성 및/또는 친화성에 대해 보다 영향을 갖는 가변 영역내 특정 잔기를 언급한다. 주요 잔기는 하기의 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: CDR에 인접한 잔기, 잠재적 당화 부위(N- 또는 O- 당화 부위일 수 있는), 희귀 잔기, 항원과 상호작용할 수 있는 잔기, CDR과 상호작용할 수 있는 잔기, 표준 잔기, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역간의 접촉 잔기, 베르니어 영역내 잔기 및 가변 중쇄 CDR1의 코티아 정의와 제1 중쇄 골격의 캐뱃 정의 사이에 중첩하는 영역내 잔기.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "사람화된 항체"는 구체적으로, 목적하는 항원과 면역특이적으로 결합하고 실질적으로 사람 항체의 아미노산 서열을 갖는 골격(FR) 영역 및 실질적으로 비사람 항체의 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 변이체, 유도체, 유사체 또는 이의 단편을 언급한다. 본원에 사용된 바와 같이, CDR과 관련하여 용어 "실질적으로"는 비사람 항체 CDR의 아미노산 서열과 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR을 언급한다. 사람화된 항체는 모든 CDR 영역 또는 실질적으로 모든 CDR 영역이 비사람 면역글로불린(즉, 공여 항체)의 서열에 상응하고 모든 골격 영역 또는 실질적으로 모든 골격 영역이 사람 면역글로불린 컨센서스 서열 영역인 실질적으로 하나 이상 및 전형적으로 2개의 가변 도메인(Fab, Fab', F(ab')₂, FabC, Fv) 모두를 포함한다. 바람직하게, 사람화된 항체는 또한 전형적으로 사람 면역글로불린의 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부를 포함한다. 몇몇 양태에서, 사람화된 항체는 적어도 중쇄의 가변 도메인 뿐만 아니라 경쇄 둘다를 포함한다. 항체는 또한 중쇄의 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 CH4 영역을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 사람화된 항체는 단지 사람화된 경쇄를 포함한다. 몇몇 양태에서, 사람화된 항체는 단지 사람화된 중쇄를 포함한다. 특정 양태에서, 사람화된 항체는 단지 경쇄 및/또는 사람화된 중쇄의 사람화된 가변 도메인을 포함한다.

사람화된 항체는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE, 및 제한없이, IgG1 , lgG2, lgG3 및 lgG4를 포함하는 임의의 아부류를 포함하는 임의의 부류의 면역글로불린으로부터 선택될 수 있다.

사람화된 항체의 골격 및 CDR 영역은 정확하게 모 서열과 상응할 필요는 없고 예를 들어, 공여 항체 CDR 또는 컨센서스 골격은 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환, 삽입 및/또는 결실에 의해 돌연변이되어 당해 부위에서 CDR 또는 골격 잔기가 공여 항체 또는 컨센서스 골격에 정확하게 상응하지 않게 될 수 있다. 바람직한 양태에서, 그러나 당해 돌연변이는 광범위하지 않다. 통상적으로, 사람화된 항체 잔기의 80% 이상, 바람직하게 85% 이상, 보다 바람직하게 90% 이상, 및 가장 바람직하게 95% 이상이 모 FR 및 CDR 서열 잔기에 상응한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "컨센서스 골격"은 컨센서스 면역글로불린 서열에서 골격 영역을 언급한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "컨센서스 면역글로불린 서열"은 관련 면역글로불린 서열 계열에서 가장 흔하게 나타나는 아미노산(또는 뉴클레오타이드)로부터 형성된 서열을 언급한다(문헌참조: Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987). 면역글로불린 계열에서, 컨센서스 서열내에 각각의 위치는 당해 계열내 당해 위치에서 가장 흔하게 나타나는 아미노산이 차지한다. 2개의 아미노산이 균등하게 흔하게 나타나는 경우, 어느 하나가 컨센서스 서열에 포함될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "베르니어" 영역은 문헌[Foote and Winter (1992, J. MoI. Biol. 224:487-499, 본원에 참조로서 인용됨]에 기재된 바와 같이 CDR 구조를 조정하고 항원에 대한 일치(fit)를 세부 조정할 수 있는 골격 잔기의 서브세트를 언급한다. 베르니어 영역 잔기는 CDR을 지탱하는 층을 형성하고 CDR의 구조 및 항체의 친화성에 영향을 줄 수 있다.

용어 "에피토프"는 면역글로불린에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 폴리펩타이드 결정요소를 포함한다. 특정 양태에서, 에피토프 결정요소는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 설포닐과 같은 분자의 화학적 활성 표면 배합을 포함하고 특정 양태에서, 특이적 3차원 구조 특징 및/또는 특이적 전하 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 항체에 의해 결합되는 항원 영역이다. 특정 양태에서, 항체는 이것이 단백질 및/또는 분자의 복합 혼합물에서 이의 표적 항원을 우선적으로 인지하는 경우 항원에 특이적으로 결합하는 것으로 일컬어진다.

본원에서 언급되는 바와 같은 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 2개 이상의 뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시뉴클레오타이드의 중합 형태 또는 당해 유형중 하나의 뉴클레오타이드의 변형된 형태를 의미한다. 당해 용어는 일본쇄 및 이본쇄 형태의 DNA를 포함하지만 바람직하게는 이본쇄 DNA이다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "분리된 폴리뉴클레오타이드"는 본래에 "분리된 폴리뉴클레오타이드"가 천연에서 발견되는 모든 또는 일부의 폴리뉴클레오타이드와 연합되어 있지 않고 천연에서 연결되어 있지 않은 폴리뉴클레오타이드와 작동적으로 연결되거나 대형 서열의 일부로서 천연에 존재하지 않는 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 게놈, cDNA 또는 합성 오리진 또는 이의 임의의 조합체의)를 의미한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 이것이 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 언급하는 것으로 의도된다. 한가지 유형의 벡터는 추가의 DNA 절편이 연결될 수 있는 환형 이본쇄 DNA를 언급하는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이고 여기서, 추가의 DNA 절편은 바이러스 게놈에 연결될 수 있다. 특정 벡터는 이들이 도입된 숙주 세포(예를 들어, 세균 복제 오리진을 갖는 세균 벡터 및 에피좀 포유동물 벡터)에서 자가 복제할 수 있다. 기타 벡터(예를 들어, 비-에피좀 포유동물 벡터)는 숙주 세포로의 도입시 숙주 세포의 게놈내로 통합될 수 있고 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 특정 벡터는 이들이 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 당해 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터"(또는 단순히 "발현 벡터")로서 언급된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에 사용하는 발현 벡터는 흔히 플라스미드 형태이다. 본원 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 가장 흔하게 사용되는 형태의 벡터이기 때문에 상호교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 기타 형태의 발현 벡터, 예를 들어, 동등한 기능을 제공하는 바이러스 벡터(예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스)를 포함하는 것으로 의도된다.

용어 "작동적으로 연결된"은 기재된 성분들이 이들의 의도된 방식으로 기능하도록 하는 관계에 있는 배치 상태를 언급한다. 암호화 서열에 "작동적으로 연결된" 대조군 서열은 암호화 서열이 대조군 서열에 적합한 조건하에서 성취되는 방식으로 발현되는 방식으로 연결되어 있다. "작동적으로 연결된" 서열은 목적하는 유전자와 연속성인 발현 조절 서열 및 목적하는 유전자를 조절하기 위해 트랜스로 또는 일정 거리에서 작용하는 발현 조절 서열 둘다를 포함한다. 본원에 기재된 바와 같은 용어 "발현 조절 서열"은 이들이 연결된 암호화 서열의 발현 및 프로세싱을 수행하는데 필요한 폴리뉴클레오타이드 서열을 언급한다. 발현 조절 서열은 적당한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 효율적인 RNA 프로세싱 시그날, 예를 들어, 스플라이싱 및 폴리아데닐화 시그날; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 해독 효율을 증진시키는 서열(즉, 코작(Kozak) 컨센서스 서열); 단백질 안정성을 증진시키는 서열; 및 경우에 따라, 단백질 분비를 증진시키는 서열을 포함한다. 당해 조절 서열의 특성은 숙주 유기체에 따라 상이하고, 원핵세포에서 당해 조절 서열은 일반적으로 프로모터, 리보솜 결합 부위 및 전사 종결 서열을 포함하고; 진핵세포에서 일반적으로 당해 조절 서열은 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다. 용어 "조절 서열"은 이의 존재가 발현 및 프로세싱에 필수적인 성분을 포함하는 것으로 의도되고 또한 예를 들어, 이의 존재가 유리한 유리한 추가의 성분, 예를 들어, 리더 서열 및 융합 파트너 서열을 포함할 수 있다.

본원에 정의된 바와 같은 "형질전환"은 외인성 DNA가 숙주 세포로 진입되도록 하는 임의의 공정을 언급한다. 형질전환은 당업계에 널리 공지된 다양한 방법을 사용한 천연 또는 인공 조건하에 수행할 수 있다. 형질전환은 외래 핵산 서열을 원핵 또는 진핵 숙주 세포로 삽입하기 위한 임의의 공지된 방법에 의존할 수 있다. 당해 방법은 형질전환되는 숙주 세포를 기초로 선별되고 바이러스 감염, 전기천공, 지질감염 및 입자 충격을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 당해 "형질전환된" 세포는 삽입된 DNA가 자가 복제 플라스미드로서 또는 숙주 염색체의 일부로서 복제할 수 있는 안정하게 형질전환된 세포를 포함한다. 이들은 또한 제된 시간동안 삽입된 DNA 또는 RNA를 일시적으로 발현하는 세포를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "재조합 숙주 세포"(또는 단순히 "숙주 세포")는 외인성 DNA가 도입된 세포를 언급하는 것으로 의도된다. 당해 용어가 특정 피검체 세포 뿐만 아니라 당해 세포의 자손을 언급하는 것으로 의도됨을 이해해야만 한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 후속 세대에서 특정 변형이 일어날 수 있기 때문에 당해 자손은 사실 모세포와 동일할 수는 없지만 여전히 본원에 사용된 바와 같은 용어의 범위내에 포함된다. 바람직하게 숙주 세포는 임의의 생명체로부터 선택되는 원핵 및 진핵 세포를 포함한다. 바람직한 진핵 세포는 원생생물, 진균류, 식물 및 동물 세포를 포함한다. 가장 바람직하게 숙주 세포는 원핵 세포주 이. 콜리; 포유동물 세포 주 CHO, HEK 293 및 COS; 곤충 세포주 Sf9; 및 진균 세포 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

표준 기술은 재조합 DNA, 올리고뉴클레오타이드 합성 및 조직 배양 및 형질전환(예를 들어, 전기천공, 지질감염)을 위해 사용될 수 있다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조업자의 지침에 따라 또는 당업계에서 일반적으로 수행되는 바와 같이 또는 본원에 기술된 바와 같이 수행할 수 있다. 이전의 기술 및 과정은 일반적으로 당업계에 널리 공지된 통상적인 방법에 따라 및 본원 명세서에 전반에 걸쳐 인용되고 논의된 다양한 일반적 보다 구체적인 참조문헌에 기재된 바와 같이 수행할 수 있다. 임의의 목적을 위해 본원에 참조로서 인용되는 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]을 참조한다.

당업계에 공지된 바와 같고 본원에 사용된 바와 같은 "유전자 전이 유기체"는 전이유전자를 포함하는 세포를 갖는 유기체를 언급하고, 여기서, 유기체(또는 유기체의 선조)에 도입된 전이유전자는 유기체에서 천연적으로 발현되지 않는 폴리펩타이드를 발현한다. "전이유전자"는 이로부터 유전자 전이 유기체가 생성되는 세포의 게놈으로 안정하게 및 작동적으로 통합되어 유전자 전이 유기체의 하나 이상의 세포 유형 또는 조직에서 암호화된 유전자 생성물의 발현을 지시하는 DNA 작제물이다.

본 발명의 항체를 제조하는 방법 및 몇몇 방법은 하기에 기재한다. 여기서, 생체내 방법, 시험관내 방법 또는 이 둘다의 병용은 구분된다.

생체내 방법

목적하는 항체의 유형에 따라, 다양한 숙주 동물이 생체내 면역화를 위해 사용될 수 있다. 그 자체가 내인성 버젼의 목적하는 항원을 발현하는 숙주가 사용될 수 있다. 또한, 내인성 버젼의 목적하는 항원이 결핍된 숙주를 사용할 수 있다. 예를 들어, 상응하는 내인성 유전자에서 상동성 재조합을 통해 특정 내인성 단백질이 결핍된 마우스(즉, 녹아웃 마우스)는 이들이 면역화된 단백질에 대해 체액성 반응을 생성하여 단백질에 대한 고친화성 모노클로날 항체를 생산하기 위해 사용될 수 있는 것으로 나타났다(문헌참조: 예를 들어, Roes, J. et al. (1995) J. Immunol. Methods 183:231-237; Lunn, MP. et al. (2000) J. Neurochem. 75:404-412).

다양한 비사람 포유동물은 본 발명의 비사람 항체를 제조하기 위한 항체 생산용으로 적합한 숙주이다. 이들은 마우스, 래트, 닭, 낙타, 토끼, 양 및 염소( 및 이의 녹아웃 버젼)을 포함하지만 하이브리도마 제조용으로는 마우스가 바람직하다. 추가로, 사람 항체 레퍼토리를 발현하는 비사람 숙주 동물은 사람 항원에 대해 이중 특이성을 갖는 필수적 사람 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 당해 종류의 비사람 동물은 하기에서 보다 상세히 기재된 사람 면역글로불린 전이유전자 및 사람/마우스 조사 키메라를 갖는 유전자 전이 동물(예를 들어, 마우스)(키메라 hu-PBMC SCID 마우스)를 포함한다.

하나의 양태에 따라, Aβ(20-42) 글로불로머 또는 이의 유도체로 면역화된 동물은, 비사람 포유동물, 바람직하게 마우스이고 이러한 포유동물은 사람 면역글로불린 유전자로 인해 유전자 전이성이어서 당해 비사람 포유동물은 항원 자극시 사람 항체를 생성한다. 전형적으로, 사람 배선 외형을 갖는 중쇄 및 경쇄에 대한 면역글로불린 전이유전자는 내인성 중쇄 및 경쇄 좌가 불활성이도록 변형된 당해 동물에 도입한다. 당해 동물이 항원(예를 들어, 사람 항원)으로 자극되는 경우, 사람 면역글로불린 서열로부터 유래하는 항체(사람 항체)가 생성된다. 표준 하이브리도마 기술을 수단으로 당해 동물의 림프구로부터 사람 모노클로날 항체를 제조할 수 있다. 사람 면역글로불린을 갖는 마우스에 대한 추가의 기재 및 사람 항체 생산에서의 이들의 용도에 대해서 문헌[예를 들어, US 5,939,598, WO 96/33735, WO 96/34096, WO 98/24893 and WO 99/53049 (Abgenix Inc.), and US 5,545,806, US 5,569,825, US 5,625,126, US 5,633,425, US 5,661 ,016, US 5,770,429, US 5,814,318, US 5,877,397 and WO 99/45962 (Genpharm Inc.); see also MacQuitty, J.J. and Kay, R.M. (1992) Science 257:1188; Taylor, L.D. et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:6287-6295; Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368:856- 859; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Int. Rev. Immunol. 13:65-93; Harding, F.A. and Lonberg, N. (1995) Ann. N Y. Acad. Sci. 764:536-546; Fishwild, D. M. et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851 ; Mendez, M. J. et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156; Green, L.L. and Jakobovits, A. ( 1998; J. Exp. Med. 188:483-495; Green, L.L. (1999) J. Immunol. Methods 231 :11-23; Yang, X.D. et al. (1999) J. Leukoc. Biol. 66:401-410; GaIIo, M.L. et al. (2000) Eur. J. Immunol. 30:534-540]을 참조한다.

또 다른 양태에 따라, Aβ(20-42) 글로불로머 또는 이의 유도체로 면역화된 동물은 사람 말초 단핵 혈액 세포 또는 림프 세포 또는 이의 전구세포로 재구성된 엄격히 조합된 면역결핍(SCID)을 갖는 마우스일 수 있다. 키메라 hu-PBMC SCID 마우스로서 언급되는 당해 마우스는 입증된 바와 같이 항원 자극시 사람 면역글로불린 반응을 생성한다. 이들 마우의 추가의 기재 및 항체를 생성하기 위한 이들의 용도에 대해서는 문헌[예를 들어, Leader, K.A. et al. (1992) Immunology 76:229-234; Bombil, F. et al. (1996) Immunobiol. 195:360-375; Murphy, W.J. et al. (1996) Semin. Immunol. 8:233-241 ; Herz, U. et al. (1997) Int. Arch. Allergy Immunol. 113:150-152; Albert, S.E. et al. (1997) J. Immunol. 159:1393-1403; Nguyen, H. et al. (1997) Microbiol. Immunol. 41 :901-907; Arai, K. et al. (1998) J. Immunol. Methods 217:79-85; Yoshinari, K. and Arai, K. (1998) Hybridoma 17:41-45; Hutchins, W.A. et al. (1999) Hybridoma 18:121-129; Murphy, W.J. et al. (1999) Clin. Immunol. 90:22-27; Smith- son, S. L. et al. (1999) MoI. Immunol. 36:113-124; Chamat, S. et al. (1999) J. Infect. Diseases 180:268-277; and Heard, C. et al. (1999) Molec. Med. 5:35-45]을 참조한다.

또 다른 양태에 따라, Aβ(20-42) 글로불로머 또는 이의 유도체로 면역화된 동물은 치사량의 전신 조사로 처리됨에 이어서 엄격히 조합된 면역결핍(SCID)를 갖는 마우스 기원의 골수 세포가 조사로부터 보호됨에 이어서 기능성 사람 림프구가 이식된 마우스이다. 티메라(Timera) 시스템으로 언급되는 이러한 유형의 키메라는 당해 마우스를 목적하는 항원으로 면역화시킴에 이어서 표준 하이브리도마 기술을 사용하여 모노클로날 항체를 생산함에 의해 사람 모노클로날 항체를 생산하기 위해 사용된다. 이들 마우스의 추가의 기재 및 항체를 생산하기 위한 이들의 용도에 대해서는 문헌[예를 들어, Eren, R. et al. (1998) Immunology 93:154-161 ; Reisner, Y and Dagan, S. (1998) Trends Biotechnol. 16:242- 246; Nan, E. et al. (1999) Hepatology 29:553-562; and Bocher, W.O. et al. (1999) Immunology 96:634-641]을 참조한다.

생체내 생성된 항체 생산 세포로부터 시작하여, 모노클로날 항체는 처음으로 문헌[Kohler and Milstein (1975, Nature 256:495-497) (Brown et al. (1981 ) J. Immunol 127:539-46; Brown et al. (1980) J Biol Chem 255:4980-83; Yeh et al. (1976) PNAS 76:2927-31; and Yeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29:269-75)]에 기재된 하이브리도마 기술과 같은 표준 기술에 의해 생성될 수 있다. 모노클로날 항체 하이브리도마 기술은 충분히 공지되어 있다[문헌참조: R. H. Kenneth, in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980); E. A. Lerner (1981 ) Yale J. Biol. Med., 54:387-402; M. L. Gefter et al. (1977) Somatic Cell Genet, 3:231-36)]. 간략하게, 불멸화된 세포주(전형적으로 골수종)은 본 발명의 Aβ 글로불로머 또는 이의 유도체로 면역화된 포유동물의 림프구(전형적으로 비장세포 또는 림프절 세포는 말초 혈액 림프세포)와 융합시키고 수득한 하이브리도마 세포의 배양 상등액은 본 발명의 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마를 동정하기 위해 스크리닝한다. 림프구와 불멸화 세포주를 융합하기 위한 임의의 많은 널리 공지된 프로토콜은 당해 목적을 위해 적용될 수 있다(문헌참조: G. Galfre et al. (1977) Nature 266:550-52; Gefter et al. Somatic Cell Genet, cited supra; Lerner, Yale J. Biol. Med., cited supra; Kenneth, Monoclonal Antibodies, cited supra)]. 더욱이, 당업자는 당해 방법의 다양한 변법이 또한 유용함을 인지할 것이다. 전형적으로, 불멸화된 세포주(예를 들어, 골수종 세포주)는 림프구와 동일한 포유동물 종으로부터 유래한다. 예를 들어, 쥐 하이브리도마는 본 발명의 면역원성 제제로 면역화된 마우스 기원의 림프구를 불멸화된 마우스 세포주와 융합시켜 확립될 수 있다. 바람직한 불멸화된 세포주는 하이포산틴, 아미노프테린 및 티미딘(HAT 배지)를 함유하는 배양 배지에 민감한 마우스 골수종 세포주이다. 임의의 다수의 골수종 세포주는 융합 파트너로서 사용될 수 있고 예를 들어 P3-NS1/1-Ag4-1 , P3- x63-Ag8.653 또는 Sp2/O-Ag14 골수종 세포주가 있다. 이들 골수종 세포주는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)(Rockville MD.)으로부터 입수할 수 있다. 전형적으로, HAT-민감성 마우스 골수종 세포는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 사용하여 마우스 비장세포와 융합시킨다. 융합으로부터 비롯된 하이브리도마 세포는 이어서 HAT 배지를 사용하여 융합되지 않고 비생산적으로 융합된 융합 골수종 세포(융합되지 않은 비장세포는 이들이 형질전환되지 않았기 때문에 몇일 후 죽는다)를 사멸시킴으로써 선택된다. 본 발명의 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포는 예를 들어, 상기된 바와 같고 실시예 8에 기재된 바와 같은 도트 블롯 분석을 사용하여 상기된 바와 같은 결합 친화성을 갖는 항체를 선별함으로써, 당해 항체에 대해 하이브리도마 배양 상등액을 스크리닝하여 동정된다.

모노클로날 항체 5F7, 10F11 , 7C6, 4B7, 6A2, 2F2, 4D10, 7E5, 10C1,및 3B10 모두는 상기된 생체내 방법을 사용하여 생성되고 본원에 정의된 바와 같은 하이브리도마로부터 수득가능하다.

또한, 당해 하이브리도마는 하기에서 추가로 상세히 기재되는 바와 같이, 본 발명의 항체를 재조합적으로 생산하기 위해, 경쇄 및/또는 중쇄를 암호화하는 핵산의 공급원으로서 사용될 수 있다.

시험관내 방법

면역화 및 선별에 의한 본 발명의 항체를 제조하는 또 다른 대안으로서, 본 발명의 항체는 요구되는 결합 친화성을 갖는 Aβ(20-42) 글로불로머 또는 이의 유도체를 사용하여 재조합 배합 면역글로불린 라이브러리를 스크리닝함에 의해 요구되는 결합 친화성을 갖는 면역글로불린 라이브러리 구성원을 분리하여 동정되고 분리될 수 있다. 디스플레이 라이브러리를 생성하고 스크리닝하기 위한 키트는 제조원(예를 들어, the Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, catalog No. 27-9400-01 ; 및 the Stratagene SurfZAP Phage Dis- play Kit, catalog No. 240612)으로부터 시판되고 있다. 많은 양태에서, 디스플레이 라이브러리는 scFv 라이브러리 또는 Fab 라이브러리이다. 재조합 항체 라이브러리를 스크리닝하기 위한 파아지 디스플레이 기술은 적절히 기재되었다. 특히 유리하게 항체 디스플레이 라이브러리를 생성하고 스크리닝하기 위해 사용될 수 있는 방법 및 화합물의 예는 예를 들어, 문헌[참조: McCafferty et al. WO 92/01047, US 5,969,108 및 EP 589 877 (특히 scFv 디스플레이를 기재하고 있음), Ladner et al. US 5,223,409, US 5,403,484, US 5,571 ,698, US 5,837,500 및 EP 436 597 (예를 들어, 필(pill) 융합을 기재하고 있음); Dower et al. WO 91/17271 , US 5,427,908, US 5,580,717 및 EP 527 839(특히 Fab 디스플레이를 기재하고 있음); Winter et al. International Publication WO 92/20791 및 EP 368,684 (특히 가변 면역글로불린 도메인에 대한 서열 클로닝을 기재하고 있음); Griffiths et al. US 5,885,793 및 EP 589 877 (특히, 재조합 라이브러리를 사용함에 의해 사람 항원에 대한 사람 항체의 분리를 기재하고 있음); Garrard et al. WO 92/09690 (특히 파아지 발현 기술을 기재하고 있음); Knappik et al. WO 97/08320 (사람 재조합 항체 라이브러리 HuCaI)를 기재하고 있음; Salfeld et al. WO 97/29131, (사람 항원(사람 종양 괴사 인자 알파)에 대한 재조합 사람 항체의 생산 및 또한 재조합 항체의 시험관내 친화성 성숙화법을 기재하고 있음) 및 Salfeld et al. U.S. 가출원 번호 60/126,603 및 이를 기초로 하는 특허원(또한 사람 항원(사람 인터류킨-12)에 대한 재조합 사람 항체의 생산 및 또한 재조합 항체의 시험관내 친화성 성숙화법을 기재하고 있음]에 기재되어 있다.

재조합 항체 라이브러리의 스크리닝에 대한 추가의 기재는 과학 간행물[Fuchs er a/. (1991 ) Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281 ; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J MoI Biol 226:889-896; Clarkson et al. (1991 ) Na- ture 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrard et al. (1991) Bio/Technology 9: 1373-1377; Hoogenboom et al. (1991 ) Nuc Acid Res 19:4133-4137; Barbas et al. (1991 ) PNAS 88:7978-7982; McCafferty et al. Nature (1990) 348:552-554; and Knappik et al. (2000) J. MoI. Biol. 296:57-86]에서 찾을 수 있다.

박테리오파아지 디스플레이 시스템을 사용하는 것에 대한 대안으로서, 재조합 항체 라이브러리가 효모 세포 또는 세균 세포 표면상에 발현될 수 있다. WO 99/36569는 효소 세포 표면상에 발현된 라이브러리를 제조하고 스크리닝하는 방법을 기재하고 있다. WO 98/49286 는 세균 세포 표면상에 발현된 라이브러리를 제조하고 스크리닝하는 방법을 보다 상세히 기재하고 있다.

모든 시험관내 방법에서, 목적하는 성질을 갖는 재조합 항체를 집적하기 위한 선별 방법은 일반적으로 "패닝"으로서 언급되고 흔히 표적 구조물이 매트릭스에 부착되어 있는 칼럼에 대한 친화성 크로마토그래피 형태를 취하는 과정의 통합 부분을 형성한다. 이어서 전망있는 후보 분자는 바람직하게 상기 및 실시예 8에 기재된 바와 같은 표준 도트 블롯 분석을 수단으로 이들의 절대 및/또는 상대적 친화성에 대한 개별 결정에 적용한다.

배합 라이브러리의 목적하는 항체가 동정되고 충분히 특성 규명되면, 당해 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 DNA 서열은 표준 분자생물학적 기술을 수단으로, 예를 들어, 라이브러리 스크리닝동안에 분리된 디스플레이 팩키지(예를 들어, 파아지) 기원 DNA의 PCR 증폭 기술을 수단으로 분리한다. PCR 프라이머를 제조하기 위해 사용될 수 있는 경쇄 및 중쇄 항체에 대한 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 당업자에게 공지되어 있다. 다양한 당해 서열이 예를 들어 문헌[Kabat, E. A., er a/. (1991 ) Sequences of Pro- teins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 및 사람 배선 VBASE의 서열 데이터베이스에 기재되어 있다.

본 발명의 항체 또는 항체 잔기는 숙주 세포에서 경쇄 및 중쇄 면역글로불린에 대한 유전자를 재조합적으로 발현시킴에 의해 제조될 수 있다. 항체를 재조합적으로 발현시키기 위해, 숙주 세포는 당해 항체의 경쇄 및 중쇄 면역글로불린을 암호화하는 DNA 단편을 함유하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터로 형질감염시키고 이에 의해 숙주 세포에서 경쇄 및 중쇄를 발현하고 숙주 세포가 배양되는 배지에 이들을 분비시킨다. 항체는 당해 배지로부터 분리될 수 있다. 표준 재조합 DNA 방법을 사용하여 중쇄 및 경쇄 항체에 대한 유전자를 수득하고 재조합 발현 벡터로 당해 유전자를 삽입하고 당해 벡터를 숙주 세포에 도입한다. 당해 종류의 방법은 예를 들어, 문헌[Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds.), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N. Y., (1989), Ausubel, F.M. et al. (eds.) Current Protocols in Mo- lecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) and in US 4,816,397 by Boss et al.]에 기재되어 있다.

목적하는 항체의 VH 및 VL 분절을 암호화하는 DNA 단편이 수득되면, 당해 DNA 단편은 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 추가로 조작하여 가변 영역에 대한 유전자를 전장 항체 쇄에 대한 유전자로 전환시키거나 Fab 단편에 대한 유전자자로 전환시키거나 scFv 유전자로 전환시킨다. 이들 조작은 VL- 또는 VH-암호화 DNA 단편을 또 다른 단백질, 예를 들어, 불변 항체 영역 또는 유연성 링커에 작동적으로 연결시킴을 포함한다. 용어 "작동적으로 연결된"은 본원에서 2개의 DNA 단편에 의해 암호화된 아미노산 서열이 프레임에 유지되도록 하는 방식으로 2개의 DNA 단편이 연결됨을 의미하는 것으로서 이해되어야만 한다.

VH 영역을 암호화하는 분리된 DNA는 VH-영역 암호화 DNA를 또 다른 중쇄 불변 영역(CH1 , CH2 및 CH3)을 암호호하는 DNA 분자에 작동적으로 연결시킴에 의해 전장 중쇄에 대한 유전자로 전환될 수 있다. 사람 중쇄 불변 영역의 서열은 널리 공지되어 있고[문헌참조: 예를 들어, Kabat, E. A., et al. (1991 ) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) 당해 영역에 걸쳐있는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭을 수단으로 수득될 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgM, IgA, IgE 또는 IgD 기원의 불변 영역일 수 있고, IgG, 특히, IgG1 또는 lgG4 기원의 불변 영역이 바람직하다. 중쇄 Fab 단편에 대한 유전자를 수득하기 위해, VH-암호화 DNA가 단지 중쇄 불변 영역 CH1을 암호화하는 또 다른 DNA 분자에 작동적으로 연결될 수 있다.

VL 영역을 암호화하는 분리된 DNA는 VL-암호화 DNA를 또 다른 경쇄 불변 영역 CL을 암호화하는 DNA 분자로 작동적으로 연결시킴에 의해 전장 경쇄( 및 Fab 경쇄에 대한 유전자)에 대한 유전자로 전환될 수 있다. 사람 경쇄의 불변 영역의 유전자에 대한 서열은 널리 공지되어 있고[문헌참조: Kabat, E.A., et al. (1991 ) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), 당해 영역에 걸쳐 있는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭 의해 수득될 수 있다. 경쇄 불변 영역은 불변 카파 또는 람다 영역일 수 있고 불변 카파 영역이 바람직하다.

scFv 유전자를 제조하기 위해, VH- 및 VL-암호화 DNA 단편이 유연성 링커, 예를 들어, 아미노산 서열(Gly₄-Ser)₃을 암호화하는 또 다른 단편에 VH 및 VL 서열이 연속 단일쇄 단백질로서 발현되도록 작동적으로 연결될 수 있고 이때, VL 및 VH 영역은 당해 유연성 링커를 통해 서로 연결된다(문헌참조: Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. ScL USA 85:5879-5883; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554).

상기된 바와 같은 결합 친화성을 갖는 단일 도메인 VH 및 VL은 상기된 방법에 의해 단일 도메인 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 목적하는 결합 친화성을 갖는, 2개의 VH 단일 도메인 쇄(CH1의 존재 또는 부재) 또는 2개의 VL 쇄 또는 한쌍의 하나의 VH 쇄 및 하나의 VL 쇄가 본원에 기재된 바와 같이 본 발명의 항체를 위해 유용할 수 있다.

본 발명의 재조합 항체 또는 항체 잔기를 발현하기 위해, 부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNA를 발현 벡터에 삽입하여 유전자를 적당한 전사 및 해독 조절 서열에 작동적으로 연결시킬 수 있다. 본원에서, 용어 "작동적으로 연결된"은 벡터내 전사 및 해독 조절 서열이 당해 항체 유전자의 전사 및 해독을 조절하는 의도된 기능을 수행하도록 하는 방식으로 벡터에 연결됨을 의미하는 것으로 이해되어야만 한다.

유리하게, 발현 벡터 및 발현 조절 서열은 사용되는 발현 숙주 세포와 양립가능한 것으로 선택된다. 항체 경쇄에 대한 유전자 및 항체 중쇄에 대한 유전자는 별도의 벡터에 삽입될 수 있거나 유전자 둘다는 동일한 발현 벡터에 삽입되며 이것이 일반적인 경우이다. 항체 유전자는 표준 방법(예를 들어, 항체 유전자 단편 및 벡터상의 상보적 제한 절단 부위의 연결 또는 어떠한 제한 절단 부위가 존재하지 않는 경우 평활 말단의 연결에 의해)에 의해 발현 벡터에 삽입된다. 발현 벡터는 경쇄 및 중쇄에 대한 서열의 삽입 전에 항체 불변 영역에 대한 서열을 이미 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나의 방법은 VH 및 VL 서열을 이미 중쇄 및 각각의 경쇄 불변 영역을 암호화하는 발현 벡터로 삽입하고 VH 분절을 벡터내 CH 분절에 작동적으로 연결시키고 또한 VL 분절을 벡터내의 CL 분절에 작동적으로 연결시킴에 의해 당해 VH 및 VL 서열을 전장의 항체 유전자로 전환시키는 것이다.

추가로 또는 대안적으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항체 쇄의 분비를 촉진시키는 시그날 펩타이드를 암호화할 수 있다. 당해 항체 쇄에 대한 유전자는 벡터에 클로닝함에 의해 프레임내 시그날 펩타이드를 항체 쇄에 대한 유전자의 N 말단으로 연결시킬 수 있다. 시그날 펩타이드는 면역글로불린 시그날 펩타이드 또는 이종성 시그날 펩타이드(즉, 비-면역글로불린 단백질 기원의 시그날 펩타이드)일 수 있다. 항체 쇄에 대한 유전자에 추가로, 본 발명의 발현 벡터는 숙주 세포에서 항체 쇄에 대한 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열을 가질 수 있다.

당해 용어 "조절 서열"은 항체 쇄에 대한 유전자의 전사 또는 해독을 조절하는 프로모터, 인핸서 및 추가의 발현 조절 요소들(예를 들어, 폴리아데닐화 시그날)을 포함하는 것으로 의도된다. 당해 종류의 조절 서열은 예를 들어 문헌[Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에 기재되어 있다. 당업자는 조절 서열의 선택을 포함하는 발현 벡터 디자인이 형질전환될 숙주 세포의 선택, 목적하는 강도의 단백질 발현등과 같은 요소들에 의존할 수 있음을 인지할 것이다. 포유동물 숙주 세포에서 발현을 위해 바람직한 조절 서열은 포유동물 세포에서 강하고 항상성 단백질 발현을 유도하는 바이러스 요소들, 예를 들어, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) (CMV)로부터 유래하는 프로모터 및/또는 인핸서(예를 들어, CMV 프로모터/인핸서), 시미안 바이러스(simian virus) 40 (SV40)으로부터 유래하는 프로모터 및/또는 인핸서(예를 들어, SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스로부터 유래하는 프로모터 및/또는 인핸서(예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(AdMLP)) 및 폴리오마(polyoma)로부터 유래하는 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 바이러스 조절 요소들 및 이의 서열의 추가의 기재에 대해 문헌[US 5,168,062 to Stinski, US 4,510,245 to Bell et al. 및 US 4,968,615 to Schaffner et al]을 참조한다.

항체 쇄 및 조절 서열에 대한 유전자 뿐만 아니라, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 것(예를 들어 복제 오리진) 및 선별 마커 유전자와 같은 추가의 서열을 가질 수 있다. 선별가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선별을 촉진시킨다(예를 들어, US patent Nos 4,399,216, 4,634,665 및 5,179,017, all to Axel et al.). 예를 들어, 선별가능한 마커 유전자는 벡터가 삽입된 숙주 세포에 G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트과 같은 세포 독성 약물에 내성을 부여하는 것이 일반적이다. 바람직한 선별가능한 마커 유전자는 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR)(메토트렉세이트 선별/증폭과 함께 dhfr 숙주 세포에 사용하기 위한)에 대한 유전자 및 neo 유전자(G418 선별을 위해)를 포함한다.

경쇄 및 중쇄 발현을 위해, 당해 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 발현 벡터는 표준 기술을 사용하여 숙주 세포에 형질감염시킨다. 용어 "형질감염"의 다양한 형태는 통상적으로 외인성 DNA를 원핵 또는 진핵 숙주 세포에 도입하기 위해 사용되는 다수의 기술, 예를 들어, 전기천공, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염등을 포함하는 것으로 의도된다. 이론적으로 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 본 발명의 항체를 발현시킬 수 있지만 올바르게 폴딩되고 면역학적 활성 항체가 어셈블리될 가능성이 원핵 세포 보다 진핵 세포 및 특히 포유동물 세포에서 높기 때문에 항체를 진핵 세포 및 특히 포유동물 숙주 세포에서 발현시키는 것이 바람직하다. 항체 유전자의 원핵 세포 발현은 고수율의 활성 항체의 제조를 위해서는 효과적이지 않은 것으로서 보고되었다(문헌참조: Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13).

본 발명의 재조합 항체를 발현하기 위해 바람직한 포유동물 숙주 세포는 CHO 세포[문헌(Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220)에 기재되고 예를 들어, 문헌(R.J. Kaufman and P.A. Sharp (1982) MoI. Biol. 159:601-621)에 기재된 바와 같은 DHFR-선별가능한 마커와 함께 사용되는 dhfr CHO 세포를 포함함], NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 항체 유전자를 암호화하는 재조합 발현 벡터를 포유동물 숙주 세포에 도입하는 경우, 당해 항체는 항체가 당해 숙주 세포에서 발현되거나 바람직하게 항체가 숙주 세포가 성장하는 배양 배지로 분비될때까지 숙주 세포를 배양함에 의해 생산된다. 이어서 항체는 표준 단배질 정제 방법을 사용함에 의해 배양 배지로부터 분리될 수 있다.

또한, 온전한 항체의 잔기, 예를 들어, Fab 단편 또는 scFv 분자를 생산하기 위해 숙주 세포를 사용할 수 있다. 상기된 과정의 변법이 물론 당해 발명에 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 항체의 경쇄 또는 중쇄(그러나 둘다는 아님)를 암호화하는 DNA로 숙주 세포를 형질감염시키는 것이 바람직할 수 있다. 어느 경우이든, 목적하는 항원 결합을 위해 요구되지 않는 경쇄 또는 중쇄가 존재하는 경우, 당해 경쇄 또는 중쇄 또는 둘다를 암호화하는 DNA는 재조합 DNA 기술에 의해 부분적으로 또는 완전히 제거될 수 있다. 당해 절단된 DNA 분자에 의해 발현되는 분자는 또한 본 발명의 항체에 포함된다. 추가로, 본 발명의 항체를 표준 화학적 방법을 사용하여 제2 항체에 가교결합시킴에 의해, 중쇄 및 경쇄가 본 발명의 항체이고 다른 중쇄 또는 다른 경쇄가 목적하는 항원과는 상이한 항원에 대해 특이성을 갖는 이기능성 항체를 생산할 수 있다.

본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 잔기의 재조합 발현을 위해 바람직한 시스템에서, 항체 중쇄 및 항체 경쇄 둘다를 암호화하는 재조합 발현 벡터는 인산칼슘 매개 형질감염을 수단으로 dhfr CHO 세포에 도입된다. 재조합 발현 벡터내에서, 중쇄 및 경쇄 항체에 대한 유전자 각각은 조절 CMV 인핸서/AdMLP-프로모터 요소에 작동적으로 연결되어 당해 유전자를 강하게 전사시킬 수 있다. 재조합 발현 벡터는 또한 메토트렉세이트 선별/증폭을 사용함에 의해 벡터로 형질감염된 dhfr CHO 세포를 선별하기 위해 사용될 수 있는 DHFR 유전자를 함유한다. 선별된 형질전화된 숙주 세포는 중쇄 및 경쇄 발현되고 온전한 항체가 배양 배지로부터 분리되도록 배양한다. 표준 분자생물학적 기술은 재조합 발현 벡터를 제조하고 숙주 세포를 형질감염시키고 형질전환체를 선별하고 숙주 세포를 배양하고 배양 배지로부터 항체를 수득하기 위해 사용된다. 따라서, 본 발명은 적합한 배양배지에서 본 발명의 재조합 항체가 합성될때까지 본 발명의 숙주 세포를 배양함에 의해 본 발명의 재조합 항체를 합성하는 방법에 관한 것이다. 당해 방법은 추가로 당해 배양 배지로부터 재조합 항체를 분리하는 방법을 포함한다.

파아지 디스플레이에 의해 재조합 항체 라이브러리를 스크리닝하는 대안으로서, 당업자에게 공지된 기타 방법을 대형 배합 라이브러리를 스크리닝하기 위해 사용하여 본 발명의 항체를 동정할 수 있다. 기본적으로, 핵산과 이에 의해 암호화된 항체간의 밀접한 물리적 연결이 확립되고 핵산이 암호화하는 항체의 성질에 의해 적합한 핵산 서열을 선별하는데 사용될 수 있는 임의의 발현 시스템이 사용될 수 있다.

또 다른 발현 시스템의 하나의 유형에서, 재조합 항체 라이브러리는 문헌[WO 98/31700 to Szostak and Roberts, and in Roberts, R.W. and Szostak, J.W. (1997) Proc. Natl. Acad. ScL USA 94:12297-12302]에 기재된 바와 같이 RNA-단백질 융합 형태로 발현된다. 본 시스템에서, 이들의 3' 말단에 푸로마이신, 펩티딜 수용체 항생제를 함유하는 합성 mRNA의 시험관내 해독은 mRNA와 이에 의해 암호화된 펩타이드 또는 단백질의 공유 융합체를 생성한다. 따라서, mRNA의 복합 혼합물(예를 들어, 배합 라이브러리)의 특이적 mRNA는 당해 항체 또는 이의 당해 잔기의 Aβ(20-42) 글로불로머 또는 이의 유도체로의 결합과 같은 암호화된 펩타이드 또는 단백질의 성질(예를 들어, 항체 또는 이의 잔기의 성질)을 기초로 농축될 수 있다. 항체 또는 이의 잔기를 암호화하고 당해 라이브러리의 스크리닝에 의해 수득되는 핵산 서열은 상기된 방식으로(예를 들어, 포유동물 숙주 세포에서) 재조합 수단에 의해 발현될 수 있고 추가로 추가 라운드에서 mRNA-펩타이드 융합체를 스크리닝하고 돌연변이를 본래 선택된 서열에 도입하거나 상기된 방식에서 재조합 항체의 시험관내 친화성 성숙화에 대한 기타 방법을 사용하여 추가의 친화성 성숙화에 적용될 수 있다.

생체내 및 시험관내 방법의 조합

본 발명의 항체는 또한 Aβ(20-42) 글로불로머 또는 이의 유도체가 먼저 생체 숙주 동물에서 항체 레퍼토리에 작용하도록 하여 Aβ(20-42) 글로불로머 또는 유도체 결합 항체의 생산 자극하고 추가로 항체 선별 및/또는 항체 성숙화(최적화)가 하나 이상의 시험관내 기술의 도움으로 성취되는 방법과 같은 생체내 및 시험관내 방법의 조합을 사용하여 제조될 수 있다. 하나의 양태에 따라, 당해 종류의 조합된 방법은 먼저 비사람 동물(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 닭, 낙타, 양 또는 염소 또는 이의 유전자 전이 버젼 또는 키메라 마우스)을 Aβ(20-42) 글로불로머 또는 이의 유도체로 면역화시켜 항원에 대한 항체 반응을 자극함에 이어서 당해 Aβ(20-42) 글로불로머 또는 유도체의 작용에 의해 생체내 자극된 림프구의 면역글로불린 서열을 사용함에 의해 파아지 디스플레이 항체 라이브러리를 제조하고 스크리닝함을 포함한다. 당해 조합된 과정의 제1 단계는 생체내 방법과 관련하여 상기된 방식으로 수행될 수 있고 당해 과정의 제2 단계는 시험관내 방법과 관련하여 상기된 방식으로 수행될 수 있다. 당해 자극된 림프구로부터 제조된 파아지 디스플레이의 후속 시험관내 스크리닝과 함께 초면역화 비사람 동물의 바람직한 방법은 문헌[참조: BioSite Inc., 예를 들어, WO 98/47343, WO 91/17271 , US 5,427,908 및 US 5,580,717]에 기재된 것들을 포함한다.

또 다른 양태에 따라, 조합된 방법은 먼저 비사람 동물(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 닭, 낙타, 양, 염소 또는 녹아웃 및/또는 이의 유전자 전이 버젼 또는 키메라 마우스)을 본 발명의 Aβ(20-42) 글로불로머 또는 이의 유도체로 면역화시켜 Aβ(20-42) 글로불로머 또는 이의 유도체에 대한 항체 응답을 자극하고 하이브리도마(면역화된 동물로부터 제조된)를 스크리닝함에 의해 목적하는 특이성을 갖는 항체를 생산하는 림프구를 선별함을 포함한다. 항체 또는 단일 도메인 항체에 대한 유전자는 선택된 클론으로부터(역전사 효소 폴리머라제 연쇄 반응과 같은 표준 클로닝 방법에 의해) 분리되고 시험관내 친화성 성숙화에 적용하여 선별된 항체 또는 선별된 항체들의 결합 성질을 개선시킨다. 당해 과정의 제1 단계는 시험관내 방법과 관련하여 상기된 방식으로 수행될 수 있고 당해 과정의 제2 단계는 시험관내 방법과 관련하여 상기된 방식, 특히 문헌[참조: WO 97/29131 및 WO 00/56772]에 기재된 것들과 같은 시험관내 친화성 성숙화 방법을 사용함에 의해 수행될 수 있다.

추가의 조합 방법에서, 재조합 항체는 선택된 림프구 항체 방법(SLAM)으로서 당업자에게 공지되고 문헌[참조: US 5,627,052, WO 92/02551 및 Babcock, J. S. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848]에 기재된 과정을 사용함에 의해 각각의 분리된 림프구로부터 생성된다. 당해 방법에서, 비사람 동물(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 닭, 낙타, 양, 염소 또는 이의 유전자 전이 버젼 또는 키메라 마우스)은 먼저 생체내에서 Aβ(20-42) 글로불로머 또는 이의 유도체로 면역화시켜 당해 올리고머 또는 유도체에 대한 면역 반응을 자극함에 이어서 목적하는 항체를 분비하는 각각의 세포를 항원 특이적 용혈 플라크 분석을 사용함에 의해 선별한다. 이러한 목적을 위해, 글로불로머 또는 이의 유도체 또는 구조적으로 관련된 목적하는 분자는 비오틴과 같은 링커를 사용하여 양 적혈구에 커플링시킴에 의해 용혈 플라크 분석을 사용함에 의해 항체를 분비하는 각각의 세포를 동정할 수 있다. 본 발명의 항체를 분비하는 세포의 동정 후, 경쇄 및 중쇄의 가변 영역에 대한 cDNA를 역전사 효소 PCR에 의해 세포로부터 수득함에 이어서 당해 가변 영역을 COS 또는 CHO 세포와 같은포유동물 숙주 세포에서 적합한 면역글로불린 불변 영역(예를 들어, 사람 불변 영역)과 연합하여 발현될 수 있다. 생체내 선택된 림프구로부터 유래하는 증폭된 면역글로불린 서열로 형질감염된 숙주 세포는 이어서 혈질감염된 세포를 분주함에 의해, 예를 들어, 결합 친화성을 갖는 항체를 발현하는 세포를 분리하기 위해 시험관내 분석 및 시험관내 선별에 적용될 수 있다. 증폭된 면역글로불린 서열은 추가로 시험관내 조작될 수 있다.

본원에서 한정된 요구되는 친화성을 갖는 항체는 상기된 바와 같이 필수적으로 도트 블롯을 수행함에 의해 선별될 수 있다. 간략하게, 당해 항원은 고형 매트릭스에 부착되고 바람직하게는 연속 희석물로서 니트로셀룰로스 막상에 점적한다. 이어서 고정화 항원은 본 발명의 항체와 접촉시킴에 이어서 효소 접합된 2차 항체 및 비색 반응을 수단으로 후자를 검출하고 한정된 항체 및 항원 농도에서, 결합된 항체의 양으로 친화성을 결정할 수 있다. 따라서, 하나의 표적에 대한 2개의 상이한 항체의 상대적 친화성 또는 2개의 상이한 표적에 대한 하나의 항체의 상대적 친화성은 본원에서 동일한 도트 블롯 조건하에서 관찰되는 표적 결합 항체의 각각의 양과 2개의 항체-표적 조합과의 관계로서 한정된다.

모노클로날 항체 5F7, 10F11 , 7C6, 4B7, 6A2, 2F2, 4D10, 7E5, 10C1 또는 3B10과 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 공지된 방법대로 수득될 수 있다.

동일한 방식으로 항체는 상기된 바와 같이 경쟁할 수 있음으로, 상이한 표적 구조물은 바람직하게 중첩 또는 동일 에피토프, 보다 바람직하게는 동일한 에피토프에 의해, 예를 들어, 본원에서 이들 구조물의 하나 이상이 구체적으로 다른 측정가능한 결합을 감소시킬 수 있는 경우 특정 항체에 대해 "경쟁"인 것으로 일컬어진다.

표적 실체 경쟁은 당해 표적 구조물에 대한 상대적 친화성에 의해 직접적으로 항체를 선별하는데 유용하다. 따라서, 상대적 친화성은 구분가능한 형태의 경쟁 실체, 예를 들어, 다르게 표지된 경쟁 구조물이 목적하는 항체와 접촉되고 이들 실체 각각에 대한 항체의 상대적 친화성이 항체에 의해 결합된 이들 실체의 상대적 양으로부터 추론되는 경쟁 분석을 사용함에 의해 직접적으로 측정될 수 있다.

당해 경쟁은 보다 큰 친화성이 요망되는 실체를 고형 매트릭스 지지체에 부착시키고 보다 작은 친화성이 요망되는 적합한 양 바람직하게는 몰 과량의 경쟁 실체를 배지에 첨가함에 의해 표적 실체에 대한 요망되는 상대적 친화성을 소유하는 항체를 직접 집적시키는데 사용될 수 있다. 따라서, 목적하는 상대적 친화성을 나타내는 항체는 무엇보다 강하게 매트릭스에 결합하는 경향이 있고 덜 요망되는 형태를, 예를 들어, 저염 농도에서 세척한 후 이어서 고염 농도를 사용하여 이를 이의 표적으로부터 가역적으로 탈착시킴에 의해 결합된 항체를 수거함으로써 수득될 수 있다. 경우에 따라, 수 라운드의 집적을 수행할 수 있다. 본 발명의 특정 양태에서, 항체에 대한 유전자 형이 예를 들어, 하이브리도마 또는 항원 디스플레이싱 파아지 또는 효소 세포 풀에서 당해 항체에 물리적으로 연결된 경우, 상응하는 표현형이 구제될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 변형된 도트 블롯은 고정화된 항원이 항체 결합을 위해 용해된 실체와 경쟁하는 경우 사용되고 항체의 상대적 친화성은 고정화된 항원에 결합된 %로부터 추론될 수 있다.

Fab 및 F(ab')₂ 단편과 같은 항체 잔기는 파파인 또는 펩신을 사용한 분해와 같은 통상적인 기술을 사용함에 의해 전체 항체로부터 제조될 수 있다. 또한, 항체, 항체 잔기 및 면역접착 분자는 표준 재조합 DNA 기술을 사용함에 의해 수득될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 항체 및 임의로 약제학적으로 적합한 담체를 포함하는 약제학적 제제(조성물)에 관한 것이다. 본 발명의 약제학적 조성물은 추가로 하나 이상의 추가의 치료제, 예를 들어, 본 발명의 항체가 구제를 위해 유용한 질환 치료용의 하나 이상의 추가의 치료제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체가 본 발명의 글로불로머에 결합하는 경우, 약제학적 조성물은 추가로 당해 글로불로머의 활성이 중요한 장애의 치료를 위해 유용한 하나 이상의 추가의 치료제를 포함할 수 있다.

약제학적으로 적합한 담체는 이들이 생리학적으로 혼화성인 한, 임의의 용매, 분산제, 피복제, 항세균제 및 항진균제, 등장성 제제 및 흡수 지연제등을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 담체는 예를 들어, 물, 식염수, 인산 완충 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 및 이의 배합물을 포함한다. 많은 경우에, 예를 들어 당, 폴리알콜(예를 들어, 만니톨 또는 소르비톨) 또는 염화나트륨을 추가로 사용하는 것이 바람직하다. 약제학적으로 적합한 담체는 추가로 항체의 반감기 또는 효능을 증가시키는 습윤제 또는 유화제, 방부제 또는 완충제와 같은 비교적 소량의 보조 물질을 함유할 수 있다.

약제학적 조성물은 예를 들어 경구 투여용으로 적합할 수 있다. 여기서, 항체는 바람직하게 항체 함량이 0.1 내지 250mg/ml인 주사용제로서 제조된다. 주사용제는 액체 또는 동결건조된 형태로 제조될 수 있고 투여 형태는 부싯돌 유리 또는 바이엘, 앰푸울 또는 충정된 주사기이다. 완충제는 L-히스티딘 (1 내지 50 mM, 바람직하게는 5 내지 10 mM)을 함유할 수 있고 5.0 내지 7.0의 pH, 바람직하게는 6.0의 pH를 가질 수 있다. 추가의 적합한 완충제는 나트륨 숙시네이트, 나트륨 시트레이트, 인산나트륨 또는 인산칼륨 완충액을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 염화 나트륨은 용액의 긴장성을 0 내지 300mM의 농도(바람직하게는 150mM의 액체 투여 형태)로 조정하기 위해 사용될 수 있다. 냉동보호제, 예를 들어, 슈크로스(예를 들어, 0 - 10%, 바람직하게는 0.5 - 1.0%)는 또한 동결건조된 투여 형태를 위해 포함될 수 있다. 충전제, 예를 들어, 만니톨(예를 들어, 1 내지 10%, 바람직하게는 2 내지 4%)은 또한 동결건조된 투여 형태를 위해 포함될 수 있다. 안정화제, 예를 들어, L-메티오닌(예를 들어, 51 내지 50mM, 바람직하게 5 내지 10mM)은 액체 및 동결건조된 투여 형태 둘다로 사용될 수 있다. 추가로 적합한 충전제는 글리이신 및 아르기닌이다. 계면활성제, 예를 들어, 폴리소르베이트 80 (예를 들어, 0 - 0.05%, 바람직하게 0.005 - 0.01%)이 또한 사용될 수 있다. 추가의 계면활성제는 폴리소르베이트 20 및 BRIJ 계면활성제이다.

본 발명의 조성물은 다중 형태를 가질 수 있다. 이들은 액체 용제(예를 들어, 주사용제 및 주입용제)와 같은 액체, 반고체 및 고체 용량 용제, 분산제 또는 현탁제, 정제, 환제, 산제, 리포좀 및 좌제를 포함한다. 바람직한 형태는 의도된 유형의 투여 및 치료학적 적용에 의존한다. 전형적으로, 주사용제 또는 주입용제 형태의 조성물이 바람직하고, 예를 들어, 사람의 수동 면역화를 위한 기타 항체와 유사한 조성물이 있다. 바람직한 투여 경로는 비경구용(예를 들어, 정맥내, 피하, 복강내 또는 근육내)이다. 바람직한 양태에 따라, 항체는 정맥내 주입 또느 주사에 의해 투여된다. 또 다른 바람직한 양태에 따라, 항체는 근육내 또는 피하 주사에 의해 투여된다.

치료학적 조성물은 전형적으로 멸균성이어야만 하고 제조 및 저장 조건하에 안정해야만 한다. 조성물은 용제, 미세유제, 분산제, 리포좀 또는 고농도의 활성 물질을 위해 안정한 기타 정렬 구조물로서 제형화될 수 있다. 멸균 주사가능한 용제는 요구되는 양의 활성 화합물(즉, 항체)을 경우에 따라 요구되는 바와 같은 상기 성분중 하나 또는 배합물과 함께 적합한 용매중에 도입함에 이어서 당해 용제를 멸균 여과함에 의해 제조될 수 있다. 분산제는 보통 염기성 분산 매질 및 경우에 따라 기타 요구되는 성분을 함유하는 멸균 비히클로 도입함에 의해 제조된다. 멸균 주사용제를 제조하기 위한 멸균 동결건조된 산제의 경우에, 진공 건조 및 분무 건조가 활성 성분의 산제 및 경우에 따라 이전에 멸균 여과된 용제로부터 추가의 목적하는 성분의 산제를 생성하는 바람직한 제조 방법이다. 용제의 올바른 유동성은 예를 들어, 렉시틴과 같은 피복을 사용하거나, 분산제의 경우에 요구되는 입자 크기를 유지하거나 계면활성제를 사용함에 의해 유지될 수 있다. 주사가능한 조성물의 연장 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물에 추가로 도입함에 의해 성취될 수 있다.

본 발명의 항체는 당업자에게 공지된 다수의 방법에 의해 투여될 수 있지만 임의의 치료학적 적용을 위해 바람직한 유형의 투여는 피하 주사, 정맥 주사 또는 주입이다. 당업자는 투여 경로 및/또는 유형이 목적하는 결과에 의존함을 인지할 것이다. 특정 양태에 따라, 활성 화합물은 급속 방출에 대해 화합물을 보호하는 담체, 예를 들어, 임플란트, 경피 플라스터 및 미세캅셀화된 방출 시스템을 포함하는 지연 또는 조절 방출되는 제형으로 제조될 수 있다. 생물학적으로 분해가능한 생적합성 중합체, 예를 들어, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 당해 제형을 제조하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있고 예를 들어, 문헌[Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다.

특정 양태에 따라, 본 발명의 항체는 예를 들어, 불활성 희석제 또는 대사가능한 식용 담체중에서 경구적으로 투여될 수 있다. 항체( 및 경우에 따라 추가의 성분)는 또한 경질 또는 연질 젤라틴 갑셀중에 포함되거나 정제로 압착되거나 직접 음식물에 첨가될 수 있다. 경구 치료학적 투여를 위해, 항체는 부형제와 혼합할 수 있고 경구 정제, 협측 정제, 캅셀제, 엘릭시르제, 현탁제등의 형태로 사용될 수 있다. 비경구 경로 이외의 경로를 통해 본 발명의 항체를 투여하고자 하는 경우, 불활성화를 방지하는 물질로부터의 피복물을 선택할 수 있다.

본 발명은 또한 아밀로이드 β 단백질이 관여하고 특히, 본 발명의 당해 글로불로머의 활성이 중요한 장애를 앓는 개체에서 본 발명의 글로불로머의 활성을 억제하는 방법에 관한 것이다. 당해 방법은 항체가 결합하는 글로불로머의 활성을 억제할 목적으로 개체에 본 발명의 하나 이상의 항체를 투여함을 포함한다. 당해 개체는 바람직하게 사람이다. 본 발명의 항체는 사람 개체에 치료 목적을 위해 투여될 수 있다. 추가로, 본 발명의 항체는 수의 목적을 위해 또는 특정 질환에 대한 동물 모델의 골격내에서 비사람 포유동물에게 투여될 수 있다. 당해 동물 모델은 본 발명의 항체의 치료학적 효능을 평가하기 위해(예를 들어, 투여 용량 및 시간 경과를 시험하기 위한) 유용할 수 있다.

본 발명의 글로불로머가 일부 역할을 하는 장애는 특히 이의 발병 및/또는 진행에서 본 발명의 글로불로머가 관여하는 장애를 포함한다. 이들은 특히 본 발명의 글로불로머가 명백하게 또는 가정적으로 당해 장애의 병리생리학에 관여하는 장애이거나 당해 장애의 발병 및/또는 진행에 기여하는 인자이다. 따라서, 여기에는 본 발명의 글로불로머의 활성 억제가 당해 장애의 증상 및/또는 진행을 경감시킬 수 있는 장애가 포함된다. 당해 장애는 특정 장애(예를 들어, 혈청, 혈장, CSF, 뇨등에서의 증가된 농도)를 앓는 개체의 생물학적 유체에서 발명의 글로불로머의 증가된 농도에 의해 입증될 수 있다. 이것은 예를 들어, 본 발명의 항체를 사용함에 의해 검출될 수 있다. 본 발명의 글로불로머는 신경퇴행성 요소, 인식 결핍, 신경독성 요소 및 염증 요소가 관여하는 다중 장애와 연관된 병리에서 중요한 역할을 한다.

본 발명의 다른 관점에서, 치료되거나 예방될 수 있는 장애는 아밀로이드증과 관련된 장애를 포함한다. "아밀로이드증"이란 용어는 체내의 다양한 조직에 존재하는 특정 단백질(아밀로이드, 섬유상 단백질 및 이들의 전구체)의 비정상적인 폴딩, 응괴(clumping), 응집 및/또는 축적을 특징으로 하는 다수의 장애를 의미한다. 알츠하이머 질환 및 다운증후군에서는 신경 조직이 영향을 받으며, 대뇌아밀로이드혈관병증(CAA)에서는 혈관이 영향을 받는다.

본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 항체 또는 항체 잔기(moiety)의 "치료학적 유효량" 또는 "예방학적 유효량"을 포함할 수 있다. "치료학적 유효량"은 원하는 치료 결과를 달성하는데 필요한 투여량에서 필요한 시간 기간 동안에 효과적인 양을 의미한다. 항체 또는 항체 잔기의 치료학적 유효량은 당업자에 의해 결정될 수 있고, 개인의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개인마다 원하는 반응을 유도해내는 항체 또는 항체 잔기의 능력과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 또한, 치료학적 유효량은 항체 또는 항체 부위의 임의의 독성 또는 유해 효과보다 치료학적 유익 효과가 능가하는 양이다. "예방학적 유효량"이란 원하는 예방학적 결과를 달성하는데 필요한 투여량과 시간 기간 동안 효과적인 양을 의미한다. 일반적으로, 예방학적 용량은 질병의 초기 단계나 그 이전에 검체에게 사용되는 바, 예방학적 유효량은 치료학적 유효량보다 양이 적을 것이다.

또한, 본 발명은 알츠하이머 질환의 예방이나 치료가 필요한 환자의 알츠하이머 질환을 예방하거나 치료하는 방법을 포함한다. 이 방법은 앞에서 언급한 백신을 예방이나 치료를 달성하기에 충분한 양으로 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명은 알츠하이머 질환과 같이 아밀로이드증의 발생이 예상되는 환자의 능동 면역화에 적합한 화합물을 동정하는 방법을 포함한다. 이 방법은 1) 1 이상의 화합물이 항체 또는 항체들에 결합하기에 충분한 조건과 시간 동안 전술한 1 이상의 항체에 당해의 1 이상의 화합물을 노출시키는 단계; 2) 항체 또는 항체들에 결합하는 화합물을, 알츠하이머 질환과 같은 아밀로이드증의 발생이 예상되는 환자의 능동 면역화에 사용할 동정된 화합물로서 동정하는 단계를 포함한다.

항체가 진단적으로 사용되는 골격에서, 특정 글로불로머(globulomer)의 정성적 또는 정량적 측정은 특히 질병 관련 아밀로이드 β 형태의 진단에 도움이 된다. 이러한 상황에서, 특이성은 충분한 민감도를 가진 특정 글로불로머 또는 이의 유도체, 또는 이의 혼합물이 검출될 수 있는 가능성을 의미한다. 본 발명의 항체는 검출 역치 농도가 샘플 1ml당 10ng 미만인 것이 유리하며, 샘플 1ml당 1ng 미만인 것이 바람직하며, 특히 샘플 1ml당 100pg 미만인 것이 더욱 바람직한데, 이는 각 예시마다 표시된, 샘플 1ml당 적어도 글로불로머의 그 농도, 유리하게는 그보다 적은 농도가 본 발명의 항체에 의해 검출될 수 있다는 것을 의미한다.

검출은 면역학적으로 수행된다. 이것은 원칙적으로 항체가 사용되는 임의의 분석적 또는 진단적 검정법, 예컨대 응집 및 침전 기술, 면역분석법, 면역조직화학법 및 면역블롯 기술, 예컨대 웨스턴 블롯팅, 또는 바람직하게는 도트 블롯법에 의해 수행될 수 있다. 생체내 방법, 예컨대 영상법도 여기에 포함된다.

면역분석법의 사용이 유리하다. 경쟁적 면역분석법, 즉 항원과 표지된 항원(추적자)이 항체 결합을 위해 경쟁하는 분석법, 및 샌드위치 면역분석법, 즉 항원과 특정 항체의 결합이 보통 표지된 제2의 항체에 의해 검출되는 분석법이 모두 적합하다. 이 분석법들은 균질성, 즉 고체 및 액체 상으로의 분리가 없거나, 또는 불균질성, 즉 결합된 표지가 결합되지 않은 것(예컨대 고형상 결합된 항체)으로부터 분리되기도 한다. 다양한 불균질성 및 균질성 면역분석법 형식은 표지화 및 측정 방법에 따라서 특정 그룹, 예컨대 RIA(방사선면역분석법), ELISA(효소 결합된 면역흡착 분석법), FIA(형광 면역분석법), LIA(발광 면역분석법), TRFIA(시간차 FIA), IMAC(면역활성화), EMIT(효소 배가 면역 시험법), TIA(혼탁도 면역분석법), I-PCR(면역-PCR)로 분류될 수 있다.

본 발명의 글로불로머를 정량하기 위해서는 추적자로서 소정량의 표지된 글로불로머 유도체를 사용하여 샘플(미지량의 미표지된 글로불로머를 함유)의 글로불로머와 경쟁시켜 사용된 항체와의 결합에 대해 정량분석하는, 경쟁적 면역분석법이 바람직하다. 샘플에 존재하는 항원, 즉 글로불로머의 양은 치환된 추적자의 양으로부터 표준 곡선을 통해 측정할 수 있다.

이러한 목적에 유용한 표지 중에서 효소가 유리한 것으로 입증되었다. 예를 들어, 퍼옥시다제, 특히 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제 및 β-D-갈락토시다제를 주성분으로 하는 효소계가 사용될 수 있다. 이러한 효소들에는 전환이 광도계법으로 모니터될 수 있는 특정 기질이 이용가능하다. 적당한 기질계에는 알칼리성 포스파타제를 위한 p-니트로페닐 포스페이트(p-NPP), 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트/니트로블루 테트라졸륨(BCIP/NPT), 패스트 레드/나프톨-AS-TS 포스페이트; 퍼옥시다제를 위한 2,2-아지노비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)(ABTS), o-페닐렌디아민(OPT), 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB), o-디아니시딘, 5-아미노살리실산, 3-디메틸아미노벤조산(DMAB) 및 3-메틸2-벤조티아졸린하이드라존(MBTH); β-D-갈락토시다제를 위한 o-니트로페닐-β-D-갈락토사이드(o-NPG), p-니트로페닐-β-D-갈락토사이드 및 4-메틸움벨리페닐-β-D-갈락토사이드(MUG)가 있다. 이러한 기질계는 대부분 바로 사용할 수 있는 형태로 시판되고 있고, 예를 들어 적당한 완충액 등과 같은 추가 시약을 포함하기도 하는 정제 형태로 이용할 수 있다.

사용된 추적자는 표지된 글로불로머일 수 있다. 이러한 의미에서 특정 글로불로머는 측정될 글로불로머를 표지한 뒤, 이를 추적자로서 사용하여 측정할 수 있다.

글로불로머에 표지의 커플링으로 인한 추적자의 제조는 공지된 방식대로 수행할 수 있다. 앞에서 언급한 본 발명의 글로불로머 유도체화는 유사하게 참조될 수 있다. 또한, 단백질에 접합시키기 위해 적당히 변형된 표지는 다수가 이용가능하고, 그 예로는 비오틴-, 아비딘-, 엑스트라비딘- 또는 스트렙타비딘-접합된 효소, 말레이미드 활성화된 효소 등이 있다. 이러한 표지는 올리고머와 직접 반응하거나, 또는 필요하다면 적당히 유도체화된 글로불로머와 반응하여 추적자를 제공할 수 있다. 예를 들어, 스트렙타비딘-퍼옥시다제 접합체가 사용된다면, 먼저 글로불로머를 비오틴화해야 한다. 이는 또한 역순이어도 된다. 이 목적에 적합한 방법은 역시 당업자에게 공지되어 있다.

불균질성 면역분석 형식을 선택한다면, 항원-항체 복합체는 지지체에 결합시켜, 예컨대 상기 지지체에 커플링된 항개체특이형 항체, 예컨대 토끼 IgG 에 대해 지시된인 항체를 통해 분리할 수 있다. 적당한 지지체, 특히 적당한 항체로 코팅된 미량역가 평판은 공지되어 있고, 부분적으로 시판되고 있다.

또한, 본 발명은 전술한 1 이상의 항체와 추가 성분을 보유하는 면역분석 세트에 관한 것이다. 이 세트는 보통 본 발명의 글로불로머 측정을 수행하기 위한 수단의 조합인 포장 단위 형태이다. 가능한 한 취급 용이성을 위해, 상기 수단은 본질적으로 즉시 사용 형태인 것이 바람직하다. 유리한 배열은 키트 형태의 면역분석법을 제공한다. 키트는 일반적으로 성분들을 분리 배치하기 위하여 복수의 용기를 포함한다. 모든 성분은 즉시 사용가능한 희석물로, 희석해야 하는 농축물로서, 또는 용해 또는 현탁시켜야 하는 건조 물질이나 동결물로서 제공될 수 있고; 각 성분 또는 모든 성분은 사용할 때까지 실온에서 보관하거나 동결될 수 있다. 혈청은 예를 들어 -20℃에서 쇼크 동결되는 것이 바람직하며, 이러한 경우에 면역분석은 바람직하게는 사용하기 전에 빙점 아래의 온도에서 유지되어야 한다.

면역분석에서 공급되는 추가 성분은 그 면역분석의 종류에 따라 달라진다. 보통, 표준 단백질, 필요할 수도, 필요하지 않을 수도 있는 추적자 및 대조용 혈청이 항혈청과 함께 공급된다. 더욱이, 미량역가 평판, 바람직하게는 항체 코팅된 평판, 완충액, 예를 들어 검사용, 세척용 또는 기질 전환용 완충액, 및 효소 기질이 그대로 포함될 수도 있다.

면역분석의 일반 원리와 실험실 및 병원용 보조제로서 항체의 생성 및 사용에 대해서는 예를 들어 서적[Antibodies, A Laboratory Manual, Harlow, E., and Lane, D., Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1988]에서 찾아볼 수 있다.

또한, 본 발명은 아밀로이드증, 예컨대 알츠하이머 질환이 의심되는 환자의 아밀로이드증, 예컨대 알츠하이머 질환을 진단하는 방법을 포함한다. 이 방법은 1) 환자로부터 생물학적 샘플을 분리하는 단계; 2) 이 생물학적 샘플과 전술한 적어도 하나의 항체를, 항원/항체 복합체의 형성에 충분한 시간과 조건 하에 접촉시키는 단계; 및 3) 상기 샘플에서 항원/항체 복합체의 존재, 즉 그 환자의 아밀로이드증, 예컨대 알츠하이머 질환의 진단을 시사하는 복합체의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 상기 항원은, 예컨대 글로불로머 또는 전체 글로불로머와 동일한 기능적 성질(예컨대, 결합 활성)을 보유하는 글로불로머의 부위 또는 단편일 수 있다.

또한, 본 발명은 아밀로이드증, 예컨대 알츠하이머 질환이 있을 것으로 의심되는 환자의 아밀로이드증, 예컨대 알츠하이머 질환을 진단하는 또 다른 방법을 포함한다. 이 방법은 1) 환자로부터 생물학적 샘플을 분리하는 단계; 2) 이 생물학적 샘플과 항원을, 항원/항체 복합체의 형성에 충분한 시간과 조건 하에 접촉시키는 단계; 3) 그 결과 수득되는 항체/항원 복합체에, 검출가능한 시그날을 발생시킬 수 있는 시그날 발생 화합물에 부착된, 전술한 항체 중 하나를 포함하는 접합체를, 이 접합체가 상기 결합된 항체에 결합하기에 충분한 시간과 조건 하에 첨가하는 단계; 및 4) 상기 생물학적 샘플에 존재할 수 있는 항체의 존재를, 상기 시그날 발생 화합물에 의해 발생된 시그날, 즉 상기 환자의 아밀로이드증, 예컨대 알츠하이머 질환의 진단을 시사하는 시그날을 검출하여 측정하는 단계를 포함한다. 상기 항원은, 예컨대 글로불로머 또는 전체 글로불로머와 동일한 기능적 성질(예컨대, 결합 활성)을 보유하는 글로불로머의 부위 또는 단편일 수 있다.

본 발명은 아밀로이드증, 예컨대 알츠하이머 질환이 있을 것으로 의심되는 환자의 아밀로이드증, 예컨대 알츠하이머 질환을 진단하는 또 다른 방법을 포함한다. 이 방법은 1) 환자로부터 생물학적 샘플을 분리하는 단계; 2) 이 생물학적 샘플과 전술한 하나의 항체에 특이적인 항항체(anti-antibody)를, 상기 생물학적 샘플에 존재하는 항체를 함유하는 복합체인, 항항체/항체 복합체를 형성시키기에 충분한 시간과 조건 하에 접촉시키는 단계; 3) 그 결과 수득되는 항항체/항체 복합체에, 검출가능한 시그날을 발생시킬 수 있는 시그날 발생 화합물에 결합하는 항원을 포함하는 접합체를, 이 접합체가 상기 결합된 항체에 결합하기에 충분한 시간과 조건 하에 첨가하는 단계; 및 4) 상기 시그날 발생 화합물에 의해 발생된 시그날, 즉 상기 환자의 아밀로이드증, 예컨대 알츠하이머 질환의 진단을 시사하는 시그날을 검출하는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명은 a) 전술한 1 이상의 항체, 및 b) 시그날 발생 화합물에 부착되는 항체를 포함하는 접합체를 포함하되, 상기 접합체의 항체는 분리된 항체와 상이한 것인 키트를 포함한다.

또한, 본 발명은 a) 전술한 항체 중 하나의 항체에 대한 항항체; 및 b) 시그날 발생 화합물에 부착되는 항원을 포함하는 접합체를 포함하는 키트를 제공한다. 상기 항원은 글로불로머 또는 이 글로불로머와 동일한 기능적 특성(예컨대, 결합 활성)을 보유하는 글로불로머의 단편 또는 부위일 수 있다.

본 발명의 진단적 일 양태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 부위는 고형상 위에 존재한다(또는 액상 내에 존재한다). 그 다음, 검사 또는 생물학적 샘플(예컨대, 전혈액, 뇌척수액, 혈청 등)이 상기 고형상과 접촉된다. 샘플에 항원(예, 글로불로머)이 존재하면, 이 항원은 고형상 위의 항체에 결합하고, 이후 직접 또는 간접 방법에 의해 검출된다. 직접 방법은 복합체 자체의 존재 및 이에 따른 항원의 존재를 간단히 검출하는 단계를 포함한다. 간접 방법에서는 결합된 항원에 접합체가 첨가된다. 접합체는 시그날 발생 화합물 또는 표지가 부착되어 있는, 결합된 항원에 결합하는 제2 항체를 포함한다. 결합된 항원에 제2 항체가 결합한다면, 시그날 발생 화합물은 측정가능한 시그날을 발생한다. 그 다음, 이러한 시그날이 검사 샘플 내에 항원의 존재를 시사한다.

진단적 면역분석에 사용되는 고형상의 예에는 다공재 및 비다공재, 라텍스 입자, 자성 입자, 마이크로입자(미국 특허 5,705,330 참조), 비드, 막, 미량역가 웰 및 플라스틱 튜브가 있다. 고형상 재료 및 필요한 경우 접합체에 존재하는 항원 또는 항체의 표지화 방법의 선택은 바람직한 분석 형식의 성능 특성에 따라 결정된다.

앞에서 언급한 바와 같이, 접합체(또는 지시인자 시약)는 시그날 발생 화합물 또는 표지에 부착된 항체(또는 때로는 분석법에 따라서 항항체)를 포함한다. 이러한 시그날 발생 화합물 또는 "표지"는 그 자체가 검출가능하거나, 1 이상의 추가 화합물과 반응하여 검출가능한 산물을 생성하기도 한다. 시그날 발생 화합물의 예에는 발색원, 방사성동위원소(예, ¹²⁵I, ¹³¹I, ³²P, ³H, ³⁵S 및 ¹⁴C), 화학발광 화합물(예, 아크리디늄), 입자(가시성 또는 형광성), 핵산, 착물화제 또는 촉매, 예컨대 효소(예, 알칼리성 포스파타제, 산 포스파타제, 양고추냉이 퍼옥시다제, 베타-갈락토시다제 및 리보뉴클레아제)가 있다. 효소(예, 알칼리성 포스파타제 또는 양고추냉이 퍼옥시다제)를 사용하는 경우에는, 발색성, 형광성, 발광성 기질의 첨가가 검출가능한 시그날을 발생시킨다. 다른 검출계, 예컨대 시간차 형광, 내부 전반사 형광, 증폭(예, 폴리머라제 연쇄 반응) 및 라만 분광법도 유용하다.

상기 면역분석법에 의해 검사될 수 있는 생물학적 유체의 예에는 혈장, 전혈액, 건조된 전혈액, 혈청, 뇌척수액 또는 조직과 세포의 수성 또는 유기수성 추출물이 있다.

본 발명은 또한 검사 샘플에 항체의 존재를 검출하는 방법을 포함한다. 이 방법은 (a) 항체를 함유할 것으로 의심되는 검사 샘플을 이 환자 샘플에 존재하는 항체에 특이적인 항항체와, 항항체/항체 복합체의 형성을 허용하기에 충분한 시간과 조건 하에서 접촉시키는 단계로서, 여기서 항항체는 환자 샘플에 존재하는 항체에 결합하는 본 발명의 항체인 단계; (b) 수득되는 항항체/항체 복합체에, 검출가능한 시그날을 검출할 수 있는 시그날 발생 화합물에 부착된 항원(항항체에 결합하는 항원)을 포함하는 접합체를 첨가하는 단계; 및 (c) 상기 시그날 발생 화합물에 의해 발생된 시그날을 검출하여, 검사 샘플에 존재할 수 있는 항체의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 항항체에 대한 항체를 포함하는 대조군 또는 보정자(calibrator)도 사용될 수 있다.

키트도 본 발명의 범주에 포함된다. 더 상세하게는, 본 발명은 알츠하이머 질환 또는 인지장애를 특징으로 하는 다른 증상이 있는 것으로 의심되는 환자에서 항원(예, 글로불로머)의 존재를 측정하기 위한 키트를 포함한다. 구체적으로, 검사 샘플에서 항원의 존재를 측정하는 키트는 a) 본 명세서에 정의된 바와 같은 항체 또는 이의 잔기; b) 검출가능한 시그날을 발생시킬 수 있는 시그날 발생 화합물에 부착된 제2 항체(상기 항원에 대한 특이성이 있는 항체)를 포함하는 접합체를 포함한다. 또한, 이 키트는 항원에 결합하는 시약을 포함하는 대조군 또는 보정자도 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 검사 샘플 중의 항체를 검출하는 키트도 포함한다. 이 키트는 a) 당해의 항체에 특이적인 항항체(예컨대, 본 발명 중 하나), 및 b) 앞에서 정의한 바와 같은 항체 또는 이의 잔기를 포함한다. 항원에 결합하는 시약을 포함하는 대조군이나 보정자도 포함될 수 있다. 더 상세하게는, 본 키트는 a) 항체에 특이적인 항항체(예컨대, 본 발명 중 하나) 및 b) 검출가능한 시그날을 발생시킬 수 있는 시그날 발생 화합물에 부착된 항원(예, 글로불로머)을 포함하는 접합체를 포함할 수 있다. 또한, 이 키트는 항원에 결합하는 시약을 포함하는 대조군 또는 보정자도 포함할 수 있다.

또한, 키트는 바이엘, 병 또는 스트립과 같이 예정된 고형상을 보유하는 하나의 용기, 및 각각의 접합체를 포함하는 다른 용기들을 포함할 수도 있다. 이러한 키트는 또한 분석을 수행하는데 필요한 다른 시약, 예컨대 세척용, 처리용 및 지시인자 시약 등이 담긴 바이엘 또는 용기를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 전술한 전장의 항체뿐만 아니라 이의 잔기나 단편, 예컨대 Fab 부분도 포함한다는 것을 유의해야 한다. 또한, 본 발명은 결합 특이성, 구조 등의 면에서 본 발명의 항체와 성질이 동일한 임의의 항체를 포함한다.

본 발명의 장점:

Aβ(20-42) 글로불로머로의 면역화에 의해, 전술한 바와 같은 비교용 도트 블롯팅에 의해 측정되듯이 다른 Aβ(1-42) 올리고머 및 Aβ(X-42) 올리고머와 인지나 내성이 상이한 여러 모노클로날 항체가 수득될 수 있다. 이로써, 인지 향상 효과, 다른 Aβ 형태보다 바람직한 특이성 및 최소 부작용 프로필 사이에 최적 관계를 보유하는 N 말단 절단형 Aβ 올리고머 에 대해 지시된 항체가 수득된다. 놀랍게도, Aβ(1-42) 및 Aβ(12-42) 글로불로머는 구조 요소를 함유함에도 불구하고, 항원으로서 추가 절단된 Aβ(20-42) 글로불로머를 사용하여 수득한 항체에 의해 부분적으로만 인식된다.

특정 올리고머성 Aβ 형태를 기본 구조 원칙으로 제한함으로써(즉, N 말단 절단된 Aβ 글로불로머의 사용), 능동 면역화에서 올리고머 Aβ 형태에 특이성이 높은 항체 프로필이 수득된다. 수동 면역용으로 사용 시에도 동일한 모노클로날 항체의 성질이 유지된다. 이러한 특이적인 면역화(능동 및 수동) 전략의 장점은 이 면역화가 Aβ 단량체, 피브릴의 응집 상태인 Aβ 펩타이드 또는 sAPPα에 대한 면역반응을 유도하지 않을 것이라는 점이다. 이것은 여러 가지 방면에서 유리하다:

1) 불용성 Aβ 플라크의 형태에서, 응집된 피브릴 상태인 Aβ 펩타이드는 AD 뇌에 존재하는 전체 Aβ 펩타이드 풀의 대부분에 해당한다. 이러한 플라크와 항Aβ 항체와의 반응에 의해 유도된 Aβ 플라크의 용해로 인한 Aβ의 대량 방출은 해로운 것으로 간주되어야 한다. 이와 같이 대량 방출된 Aβ는 그 다음 혈액-뇌 장벽을 가로질러, 혈류로 들어가서 미세출혈의 위험을 잠재적으로 증가시킨다. 또한, ELAN 시험에서는 이러한 피브릴 Aβ 펩타이드 형태를 이용한 바로 이 면역화 전략으로 6%의 수막뇌염 개시 증상이 나타남으로 인해 실험을 취소해야만 했다.

2) 단량체 Aβ 펩타이드 형태에 대해 지시된 면역 반응은, 이 단량체 형태가 인지 증강 효과를 발휘할 수 있음을 보여줄 가능성이 있기 때문에 바람직하지 않다.

3) sAPPα 지향성인 면역반응 역시, 이것이 생리학적으로 발생하는 전구체 단백질 APP와의 반응을 유도하여 자가면역 반응을 유도할 수 있기 때문에 바람직하지 않다. 더욱이, sAPPα도 역시 인지 증강 효과를 발휘하는 것으로 관찰되었다.

4) CAA 형태의 혈관 Aβ 펩타이드에 대해 지시된 반응은 미세출혈의 바람직하지 않은 부작용이 일어나지 않도록 하기 위해 피해야 한다(CAA 형태로 응집된 Aβ 펩타이드에 결합하지 않고 Aβ의 중심 부위에 대한 항체는 N 말단에 대한 항체에 비해 미세출혈을 더 적게 유도한다, 상기 참조).

5) Aβ 올리고머와 특이적으로 반응하는 항체는 병태생리학적으로 관련된 Aβ 종에 비해 더 높은 생체이용율을 나타내는데, 그 이유는 이 항체가 예컨대 피브릴 Aβ에 결합하지 않아서 치료 효과에 이용할 수 없게 되지 않기 때문이다.

기탁물 정보: 모노클로날 항체 5F7을 생산하는 하이브리도마는 부다페스트 조약 하에 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(미국 버지니아 20110 마나사스 유니버시티 불러바드 10801 소재)에 2005년 12월 1일에 기탁했고, 수탁번호 PTA-7241을 받았다. 또한, 모노클로날 항체 10F11을 생산하는 하이브리도마는 부다페스트 조약 하에 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(미국 버지니아 20110 마나사스 유니버시티 불러바드 10801 소재)에 2005년 12월 1일에 기탁했고, 수탁번호 PTA-7239를 받았다. 또한, 모노클로날 항체 4B7을 생산하는 하이브리도마는 부다페스트 조약 하에 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(미국 버지니아 20110 마나사스 유니버시티 불러바드 10801 소재)에 2005년 12월 1일에 기탁했고, 수탁번호 PTA-7242를 받았고, 모노클로날 항체 7C6을 생산하는 하이브리도마는 부다페스트 조약 하에 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(미국 버지니아 20110 마나사스 유니버시티 불러바드 10801 소재)에 2005년 12월 1일에 기탁했고, 수탁번호 PTA-7240를 받았다. 또한, 모노클로날 항체 6A2를 생산하는 하이브리도마는 부다페스트 조약 하에 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(미국 버지니아 20110 마나사스 유니버시티 불러바드 10801 소재)에 2006년 2월 28일에 기탁했고, 수탁번호 PTA-7409를 받았고, 모노클로날 항체 2F2를 생산하는 하이브리도마는 부다페스트 조약 하에 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(미국 버지니아 20110 마나사스 유니버시티 불러바드 10801 소재)에 2006년 2월 28일에 기탁했고, 수탁번호 PTA-7408을 받았다. 모노클로날 항체 4D10을 생산하는 하이브리도마는 부다페스트 조약 하에 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(미국 버지니아 20110 마나사스 유니버시티 불러바드 10801 소재)에 2006년 2월 28일에 기탁했고, 수탁번호 PTA-7405를 받았다. 또한, 모노클로날 항체 7E5를 생산하는 하이브리도마는 부다페스트 조약 하에 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(미국 버지니아 20110 마나사스 유니버시티 불러바드 10801 소재)에 2006년 6월 16일에 기탁했고, 수탁번호 PTA-7809를 받았다. 모노클로날 항체 10C1을 생산하는 하이브리도마는 부다페스트 조약 하에 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(미국 버지니아 20110 마나사스 유니버시티 불러바드 10801 소재)에 2006년 8월 16일에 기탁했고, 수탁번호 PTA-7810을 받았다. 또한, 모노클로날 항체 3B10을 생산하는 하이브리도마는 부다페스트 조약 하에 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(미국 버지니아 20110 마나사스 유니버시티 불러바드 10801 소재)에 2006년 9월 1일에 기탁했고, 수탁번호 PTA-7851을 받았다. 모든 기탁물은 아보트 러보러터리즈(미국 일리노이 60064 아보트 파크 아보트 파크 로드 100 소재)에 의해 제조되었다.

도 1은 Aβ(1-42) 및 Aβ(1-40)의 크기 배제 크로마토그램을 도시한 것이다. Aβ(1-42) 단량체는 A) 0.1% NH₄OH, B) 70% 포름산, C) 0.1% NaOH에 용해했고, D) A β(1-40)은 0.1% NaOH에 용해했다. 이어서, 샘플을 다시 20mM NaH₂PO₄, 140mM NaCl, pH 7.4에 1:10의 비율로 희석했다. 이 샘플들을 상온에서 용해한 후 5분(왼쪽 컬럼) 또는 1시간(오른쪽 컬럼) 동안 항온처리한 뒤, 크기 배제 컬럼에 적용했다.

도 2의 A)는 표준 단백질(분자 마커 단백질, 레인 1); Aβ(1-42) 피브릴 제조물, 대조군(레인 2); Aβ(1-42) 피브릴 제조물 + mAb 5F7, 20h, 37℃, 상청액(레인 3); Aβ(1-42) 피브릴 제조물 + mAb 5F7, 20h, 37℃, 펠릿(레인 4); Aβ(1-42) 피브릴 제조물 + mAb 6E10, 20h, 37℃, 상청액(레인 5); Aβ(1-42) 피브릴 제조물 + mAb 6E10, 20h, 37℃, 펠릿(레인 6)의 SDS PAGE를 도시한 것이고;

B)는 Aβ 피브릴에 결합된 mAb를 총 항체의 백분율로 정량 분석한 결과를 도시한 것이다.

도 3은 APP/L 유전자 전이 마우스를 0.1% NH₄OH 중의 Aβ(1-42) 단량체, Aβ(1-42) 글로불로머 및 Aβ(20-42) 글로불로머로 능동 면역화한 후, 야생형 마우스(양성 대조군) 및 PBS 처리된 APP/L 마우스(음성 대조군)과 비교하여 대상체 인식 검사를 수행한 결과를 보여주는 막대 다이아그램이며, 여기서 원은 PBS 처리된 APP/L 마우스와의 유의적인 차이를 나타내는 별표는 그룹간 차이를 위해 ANOVA에서 P<0.05 이후, 후속 t검정에 따라 변화율(50%)에 대한 매우 유의적인 차이를 나타낸다.

도 4는 100pmol/㎕(A줄); 10pmol/㎕(B줄); 1pmol/㎕(C줄); 0.1pmol/㎕(D줄) 및 0.01pmol/㎕(E줄)의 Aβ(1-42) 글로불로머(컬럼 1); HFIP 예비처리된, Pluronic F68 중의 Aβ(1-42) 단량체(컬럼 2); Aβ(20-42) 글로불로머(컬럼 3); Aβ(12-42) 글로불로머(컬럼 4); HFIP 예비처리된 DMSO 중의 Aβ(1-40) 단량체(컬럼 5); Aβ(1-42) 단량체, NH₄OH(컬럼 6); Aβ(1-42) 피브릴 제조물(컬럼 7); 및 시그마 제품인 sAPPα(컬럼 8)와, APP/L Tg 마우스를 Aβ(20-42) 글로불로머로 능동 면역화한 후 수득된 다양한 항혈청과의 반응성을 나타내는 도트 블롯이다.

도 5는 Aβ(1-42)단량체(0.1% NH₄OH), Aβ(1-42) 글로불로머, Aβ(20-42) 글로불로머 또는 대조군으로서 비히클로 능동 면역화된 APP/PS1 Tg 마우스의 뇌 추출물에 존재하는 용해성 및 불용성 Aβ(1-42) 및 Aβ(1-40) 펩타이드의 농도를 도시한 막대 다이아그램이다.

도 6은 A) 각 항체를 별도로 사용한 경우, 및 B) 항체를 모두 함께 사용한 경우에, 항Aβ(20-42) 글로불로머 항체 5F7, 10F11 및 7C6로 수동 면역화한 후의 APP/L 유전자 전이 마우스와 대조용 마우스를 비교하여 대상체 인식 검사한 결과를 도시한 막대 다이아그램이다.

도 7은 A) 여러 항Aβ 항체(-6E10, -5F7, -4B7, -10F11, -6A2, -4D10, -3B10, -2F2, -7C6, -7E5, -10C1)의 특이성에 대한 도트 블롯 분석 결과를 도시한 것이다. 여기서 검사된 모노클로날 항체는 Aβ(20-42) 글로불로머로 마우스를 능동 면역화한 후, 융합된 하이브리도마 세포를 선택하여 수득했다(시판품인 6E10, Signet No 9320은 제외). 각 Aβ 형태를 연속 희석물로 적용하고 면역 반응을 위해 각 모노클로날 항체와 항온배양했다:

1. Aβ(1-42) 단량체, 0.1% NH₄OH

2. Aβ(1-40) 단량체, 0.1% NH₄OH

3. Aβ(1-42) 단량체, 0.1% NaOH

4. Aβ(1-40) 단량체, 0.1% NaOH

5. Aβ(1-42) 글로불로머

6. Aβ(12-42) 글로불로머

7. Aβ(20-42) 글로불로머

8. Aβ(1-42) 피브릴 제조물

9. sAPPα(시그마)(최초 점: 1pmol)

B) 정량 평가는 강도를 농도계측법으로 분석하여 수행했다. 각 Aβ 형태마다. 시각적으로 분명히 확인되는 Aβ(20-42) 글로불로머(역치)의 마지막 점의 상대 밀도보다 20% 더 큰 상대밀도를 보유한다면, 가장 낮은 항원 농도에 해당하는 점만을 평가했다. 이 역치 값은 모든 도트 블롯마다 독립적으로 측정했다. 이 값은 주어진 항체마다 Aβ(20-42) 글로불로머 및 각 Aβ 형태의 인식 사이의 관계를 나타낸다.

도 8은 알츠하이머 질환 환자 또는 노령 APP 유전자 전이 마우스의 신피질 횡단면에 대한 여러 농도의 항체들의 결합성을 도시한 것이다:

A) APP 유전자 전이 마우스주 Tg2576 및 AD 환자(RZ55) 중에서 뇌조직에 플라크로서, 그리고 뇌혈관에 대뇌 아밀로이드 혈관병증(CAA)으로서 나타나는 아밀로 이드 침적물의 콩고레드 염색 검사;

B) AD 환자(RZ16)에서 Aβ(아밀로이드 플라크)의 실질조직 침적물의 강한 염색은 6G1 및 시판용 항체 6E10(왼쪽 컬럼)에서만 나타나는 반면, 항체 5F7, 2F2 및 6A2(2번째 컬럼), 4D10, 10F11 및 3B10(3번째 컬럼) 및 7C6, 7E5 및 10C1(오른쪽 컬럼)에서는 전혀 나타나지 않았다. 항체는 모두 0.7㎍/ml 농도로 사용했다;

C) 19개월령 Tg2576에서 Aβ(아밀로이드 플라크)의 실질조직 침적물의 강한 염색은 6G1 및 시판용 항체 6E10(왼쪽 컬럼)에서만 나타나는 반면, 항체 5F7, 2F2 및 6A2(2번째 컬럼), 4D10, 10F11 및 3B10(3번째 컬럼) 및 7C6, 7E5 및 10C1(오른쪽 컬럼)에서는 전혀 나타나지 않았다. 항체는 모두 0.7㎍/ml 농도로 사용했다;

D)-G) 영상 분석을 이용한 조직 영상에서 Aβ 플라크 염색 분석의 정량. 광학밀도 값(0% = 염색 안됨)은 플라크의 회색조 값에서 배경 조직의 회색조 값을 감하여 계산했다: D) 노령의 Tg2565 마우스에서 0.7㎍/ml 항체로 염색, E) APP/L 마우스에서 3가지 다른 농도의 항체로 염색, F) AD 환자(RZ55)에서 0.7㎍/ml 항체로 염색, 및 G) AD 환자(RZ16)에서 3가지 다른 농도의 항체로 염색. 시판 항체 6E10(별표) 및 4G8(원) 및 다른 모든 항체(3개 별표/원: p<0.001 vs. 대조군; p<0.001인 ANOVA이후, 후속 본페로니본페로니 염색 간의 차이를 통계적으로 평가했다(D, F). E) 및 G)에서는 6G1을 제외한 모든 항체가 항상 시판 항체 6E10 및 4G8보다 훨씬 적게 염색된 것으로 나타났다.

H) Aβ 혈관 침적물의 강한 염색(화살본페로니)은 6G1 및 시판 항체 6E10(왼쪽 컬럼)에서만 나타나는 반면, 항체 5F7, 2F2 및 6A2(왼쪽 컬럼), 4D10, 10F11 및 3B10(세번째 컬럼) 및 7C6, 7E5 및 10C1(오른쪽 컬럼)에서는 나타나지 않았다. 모든 항체는 0.7㎍/ml 농도로 사용했다. Tg2576 마우스에서도 정량적으로 유사한 상황이 관찰되었다(여기에는 제시하지 않음);

도 9는 능동 면역화 후 약 1년 후에 TG2576 마우스의 혈장 내의 항Aβ 항체 역가 및 도트 블롯 선택성 프로필. Tg2576 마우스의 혈장 샘플은 A) Aβ(20-42) 글로불로머, B) Aβ(12-42) 글로불로머, C) Aβ(1-42) 단량체 및 D) 비히클로 최종 면역화 후 약 1년 후의 Tg2576 마우스의 혈장 샘플을, 생산된 항Aβ 항체에 대해 평가하고, 도트 블롯으로 나타냈다.

1. Aβ(1-42) 글로불로머

2. HFIP 예비처리된, 0.1% Pluronic F68 중의 Aβ(1-42) 단량체

3. Aβ(20-42) 글로불로머

4. Aβ(12-42) 글로불로머

5. HFIP 예비처리된, DMSO 중에 5mM Aβ(1-40) 단량체,

6. Aβ(1-42) 단량체, 0.1% NH₄OH

7. Aβ(1-42) 피브릴 제조물

8. sAPPα(시그마); (최초 점: 1pmol).

도 10은 알츠하이머 질환이 있는 사람 및 치매없는 대조군의 뇌 조직에 존재하는 Aβ(20-42) 글로불로머 수준을 정리한 표를 보여준다.

도 11은 다음과 같은 모노클로날 항체(mAb)의 가변 중쇄 및 경쇄의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 도시한 것이다(각 아미노산 서열에 밑줄친 부위는 상보 성결정영역(CDR)이다):

다음 실시예는 본 발명을 예증하기 위한 것이지, 본 발명의 범주를 제한하려는 것이 아니다.

실시예 1: 글로불로머의 제조

a) Aβ(1-42) 글로불로머

Aβ(1-42) 합성 펩타이드(H-1368, Bachem, 스위스 부벤도르프)는 6mg/ml으로 100% 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올(HFIP)에 현탁시키고, 완전히 용해하기 위해 37℃에서 1.5시간 동안 진탕 하에 항온처리했다. HFIP는 수소결합 붕괴제로서 작용하며 Aβ 펩타이드에 이미 존재하는 구조적 비균질부를 제거하는데 사용된다. HFIP는 SpeedVac에서 증발 제거하며, Aβ(1-42)는 디메틸설폭사이드에 5mM 농도로 재현탁시키고 20s 동안 초음파처리했다. HFIP 전처리된 Aβ(1-42)는 인산염 완충 식염수(PBS)(20mM NaH₂PO₄, 140mM NaCl, pH 7.4)에 400μM로 희석하고, 1/10 부피의 2% 소듐 도데실 설페이트(SDS)(수용액)를 첨가했다(SDS 최종 농도 0.2%). 37℃에서 6시간 동안 항온처리한 결과, 16/20kDa Aβ(1-42) 글로불로머(구형 올리고머의 짧은 형태) 중간체가 수득되었다. 3부피량의 H₂O로 추가 희석하고 37℃에서 18시간 동안 항온처리한 결과, 38/48kDa Aβ(1-42) 글로불로머가 수득되었다. 이 샘플을 3000g에서 20분 동안 항온처리한 후, 한외여과(30kDa 컷오프)로 농축하고, 5mM NaH₂PO₄, 35mM NaCl, pH 7.4에 대해 투석한 다음, 10000g에서 10분 동안 원심분리한 후, 38/48 kDa Aβ(1-42) 글로불로머를 함유하는 상청액을 회수했다. 38/48kDa Aβ(1-42) 글로불로머를 투석하기 위한 대안으로서, 9배 과량(v/v)의 빙냉 메탄올/아세트산 용액(33% 메탄올, 4% 아세트산)에서 4℃ 하에 1시간 동안 침전시킬 수도 있다. 38/48kDa Aβ(1-42) 글로불로머는 그 다음 펠릿화하고(16200g, 10min), 5mM NaH₂PO₄, 35mM NaCl, pH 7.4에 재현탁시킨 다음, pH를 7.4로 조정했다.

b) 가교 결합된 Aβ(1-42) 글로불로머

Aβ(1-42) 합성 펩타이드(H-1368, Bachem, 스위스 부벤도르프)는 6mg/ml으로 100% 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올(HFIP)에 현탁시키고, 완전히 용해하기 위해 37℃에서 1.5시간 동안 진탕 하에 항온처리했다. HFIP는 수소결합 붕괴제로서 작용하며 Aβ 펩타이드에 이미 존재하는 구조적 비균질부를 제거하기 위해 사용했 다. HFIP는 SpeedVac에서 증발 제거하며, Aβ(1-42)는 디메틸설폭사이드에 5mM 농도로 재현탁시키고 20s 동안 초음파처리했다. HFIP 전처리된 Aβ(1-42)는 인산염 완충 식염수(PBS)(20mM NaH₂PO₄, 140mM NaCl, pH 7.4)에 400μM로 희석하고, 1/10 부피의 2% 소듐 도데실 설페이트(SDS)(수용액)를 첨가했다(SDS 최종 농도 0.2%). 37℃에서 6시간 동안 항온처리한 결과, 16/20kDa Aβ(1-42) 글로불로머(구상 올리고머의 짧은 형태) 중간체가 수득되었다. 3부피량의 H₂O로 추가 희석하고 37℃에서 18시간 동안 항온처리한 결과, 38/48kDa Aβ(1-42) 글로불로머가 수득되었다. 그 다음, 38/48kDa Aβ(1-42) 글로불로머의 가교는 1mM 글루타르알데하이드와 21℃ 실온(RT)에서 2시간 동안 항온처리한 다음, RT에서 30분 동안 에탄올아민(5mM) 처리하여 수행했다.

c) Aβ(20-42) 글로불로머

실시예 1a)에 따라 제조된 Aβ(1-42) 글로불로머 제조물 1.59ml를 완충액(50mM MES/NaOH, pH 7.4) 및 1mg/ml 써모라이신 수용액(로슈) 200㎕와 혼합했다. 반응 혼합물을 RT에서 20시간 동안 교반했다. 그 다음, 100mM EDTA 수용액 pH 7.4를 80㎕ 첨가하고, 이 혼합물을 SDS 함량이 0.01%가 되도록 1% 강도의 SDS 용액 400㎕로 추가 조정했다. 이 반응 혼합물을 15ml 30kDa Centriprep 튜브를 통해 약 1ml로 농축시켰다. 이 농축물을 완충액(50mM MES/NaOH, 0.02% SDS, pH 7.4) 9ml와 혼합하고, 다시 1ml로 농축했다. 이 농축물을 투석 튜브에서 1L 완충액(5mM 인산나트륨, 35mM NaCl)에 대하여 6℃에서 16시간 동안 투석했다. 투석물의 SDS 함량은 2% 강도의 SDS 수용액으로 0.1%가 되도록 조정했다. 샘플을 10000g에서 10분 동안 원심분리하고, Aβ(20-42) 글로불로머 상청액을 회수했다.

d) Aβ(12-42) 글로불로머

실시예 1a에 따라 제조한 Aβ(1-42) 글로불로머 제조물 2ml를 완충액(5mM 인산나트륨, 35mM 염화나트륨, pH 7.4) 38ml 및 1mg/ml GluC 엔도프로테이나제(로슈) 수용액 150㎕와 혼합했다. 이 반응 혼합물을 RT에서 6시간 동안 교반하고, 이어서 1mg/ml GluC 엔도프로테이나제(로슈) 수용액 150㎕를 추가로 첨가했다. 이 반응 혼합물을 다시 16시간 동안 RT에서 교반한 다음, 5M DIFP 용액 8㎕를 첨가했다. 이 반응 혼합물을 15ml 30kDa Centriprep 튜브를 통해 약 1ml로 농축시켰다. 이 농축물을 완충액(5mM 인산나트륨, 35mM 염화나트륨, pH 7.4) 9ml와 혼합하고, 다시 1ml로 농축했다. 이 농축물을 투석 튜브에서 1L 완충액(5mM 인산나트륨, 35mM NaCl)에 대하여 6℃에서 16시간 동안 투석했다. 투석물의 SDS 함량은 1% 강도의 SDS 수용액으로 0.1%가 되도록 조정했다. 샘플을 10000g에서 10분 동안 원심분리하고, Aβ(12-42) 글로불로머 상청액을 회수했다.

실시예 2: 여러 Aβ(1-42) 단량체와 Aβ(1-40) 단량체 제조물의 크기 배제 크로마토그래피

Aβ(1-42), 0.1% NH₄OH:

Aβ(1-42)(Bachem, 카탈로그 번호 H-1368) 1mg을 0.1% NH₄OH 수용액 500㎕에 용해하고, 상온에서 1분 동안 진탕시켰다. 이 샘플을 10,000g에서 5분 동안 원심분 리했다. 상청액을 수집했다. 상청액 중의 Aβ(1-42) 농도는 브래드포드법(BIO-RAD)에 따라 측정했다.

5분 샘플:

0.1% NH₄OH 중의 Aβ(1-42) 20㎕를 함유하는 상청액을, Aβ(1-42) 농도가 0.2mg/ml가 되도록 20mM NaH₂PO₄, 140mM NaCl, pH 7.4로 희석했다. 이 샘플을 상온에서 5분 동안 항온배양했다. 그 다음, 100㎕를 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 분석했다.

1시간 샘플:

0.1% NH₄OH 중의 Aβ(1-42) 20㎕를 함유하는 상청액을, Aβ(1-42) 농도가 0.2mg/ml가 되도록 20mM NaH₂PO₄, 140mM NaCl, pH 7.4로 희석했다. 이 샘플을 상온에서 1시간 동안 항온배양했다. 그 다음, 100㎕를 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 분석했다.

Aβ(1-42), 70% HCOOH:

Aβ(1-42) 1mg을 70% HCOOH 수용액 50㎕에 용해하고, 상온에서 1분 동안 진탕했다. 샘플을 10,000g에서 5분 동안 원심분리했다. 상청액을 수집했다. 상청액 중의 Aβ(1-42) 농도는 브래드포드법(BIO-RAD)에 따라 측정했다.

5분 샘플:

70% HCOOH 중의 Aβ(1-42) 2㎕를, Aβ(1-42) 농도가 0.2mg/ml가 되도록 20mM NaH₂PO₄, 140mM NaCl, pH 7.4로 희석하고, 1M NaOH로 pH를 7.4로 조정했다. 이 샘플 을 상온에서 5분 동안 항온처리했다. 그 다음, 100㎕를 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 분석했다.

1시간 샘플:

70% HCOOH 중의 Aβ(1-42) 2㎕를, Aβ(1-42) 농도가 0.2mg/ml가 되도록 20mM NaH₂PO₄, 140mM NaCl, pH 7.4로 희석하고, 1M NaOH로 pH를 7.4로 조정했다. 이 샘플을 상온에서 1시간 동안 항온처리했다. 그 다음, 100㎕를 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 분석했다.

Aβ(1-42), 0.1% NaOH:

Aβ(1-42)(Bachem, 카탈로그 번호 H-1368) 1mg을 0.1% NaOH 수용액 500㎕에 용해하고 상온에서 1분 동안 진탕했다. 샘플을 10,000g에서 5분 동안 원심분리했다. 상청액을 수집했다. 상청액 중의 Aβ(1-42) 농도는 브래드포드법(BIO-RAD)에 따라 측정했다.

5분 샘플:

0.1% NaOH 중의 Aβ(1-42) 20㎕를, Aβ(1-42) 농도가 0.2mg/ml가 되도록 20mM NaH₂PO₄, 140mM NaCl, pH 7.4로 희석했다. 이 샘플을 상온에서 5분 동안 항온처리했다. 그 다음, 100㎕를 크기 배제 크로마토그래피로 분석했다.

1시간 샘플:

0.1% NaOH 중의 Aβ(1-42) 20㎕를, Aβ(1-42) 농도가 0.2mg/ml가 되도록 20mM NaH₂PO₄, 140mM NaCl, pH 7.4로 희석했다. 이 샘플을 상온에서 1시간 동안 항 온처리했다. 그 다음, 100㎕를 크기 배제 크로마토그래피로 분석했다.

Aβ(1-40), 0.1% NaOH:

Aβ(1-40)(Bachem, 카탈로그 번호 H-1368) 1mg을 0.1% NaOH 수용액 500㎕에 용해하고 상온에서 1분 동안 진탕했다. 샘플을 10,000g에서 5분 동안 원심분리했다. 상청액을 수집했다. 상청액 중의 Aβ(1-40) 농도는 브래드포드법(BIO-RAD)에 따라 측정했다.

5분 샘플:

0.1% NaOH 중의 Aβ(1-40) 20㎕를, Aβ(1-40) 농도가 0.2mg/ml가 되도록 20mM NaH₂PO₄, 140mM NaCl, pH 7.4로 희석했다. 이 샘플을 상온에서 5분 동안 항온처리했다. 그 다음, 100㎕를 크기 배제 크로마토그래피로 분석했다.

1시간 샘플:

0.1% NaOH 중의 Aβ(1-40) 20㎕를, Aβ(1-40) 농도가 0.2mg/ml가 되도록 20mM NaH₂PO₄, 140mM NaCl, pH 7.4로 희석했다. 이 샘플을 상온에서 1시간 동안 항온처리했다. 그 다음, 100㎕를 크기 배제 크로마토그래피로 분석했다.

크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 위한 조건:

SEC 컬럼: Superose 12 HR 10/300 GL(아머샴, 카탈로그 번호 17-5173-01)

유속: 0.5ml/min

종이 공급: 0.2cm/min

214nm에서 흡광: 0 내지 0.2 흡수 단위

이동상: 20mM NaH₂PO₄, 140mM NaCl, pH7.4

결과는 도 1에 도시했다.

순수 단량체 Aβ 용액의 제조는 Aβ 펩타이드, 특히 Aβ(1-42) 단량체가 피브릴로 응집하려는 경향이 강하여 큰 문제다. 하지만, Aβ(1-42) 단량체와 Aβ(1-40) 단량체를 구별하는 항Aβ(20-42) 글로불로머의 선별과 특성분석을 위해 기술적으로 달성하기가 가장 쉬운 Aβ 단량체 제조물이 사용되어야 한다. 여기서, 응집 효과에 미치는 Aβ 펩타이드의 초기 용매의 효과는 20mM NaH₂PO₄, 140mM NaCl, pH 7.4로 추가 희석한 후 검사했다. Aβ 펩타이드 공급업자(Bachem)가 제시하는 기술적 정보에 따르면, Aβ(1-42)는 0.1% NH₄OH에 용해되어야 한다. Aβ(1-42)를 NH₄OH에 용해한 후 실온(RT)에서 5분간 항온처리한 다음, 즉시 20mM NaH₂PO₄, 140mM NaCl, pH 7.4에 1:10 희석한 후, 크기 배제 크로마토그래피에서는 최소 피크가 74kD에서 나타나는, Aβ(1-42)가 피브릴 전구체로 응집된 첫번째 징후를 나타낸다. 단량체 Aβ(1-42)는 11kD에서 주피크, 6kD에서 숄더 피크를 나타낸다. 실온(RT)에서 1시간 동안 항온처리한 후, NH₄OH 중의 Aβ(1-42) 펩타이드는 이미 상당히 Aβ(1-42) 피브릴로 응집되어, 크기 배제 크로마토그래피 컬럼으로 유입되지 않는, 검출할 수 있을 정도의 물질의 상실을 초래했다. Aβ(1-42) 펩타이드의 초기 용매로서 70% 포름산을 사용한 경우에는, RT에서 1시간 후 높은 응집 정도가 일어나고, Aβ(1-42) 단량체는 소량만이 남아 있었다(포름산 자체가 단백질 검출 파장에서 높은 배경 흡광도를 유도한다는 점을 유념한다). 응집 방지에 최상인 Aβ(1-42)의 초 기 용매는, 용해 후 1h 항온처리하고 추가 희석 후에도 응집된 Aβ(1-42)는 소량뿐이고, 대부분의 Aβ(1-42)가 단량체 상태에 있는 0.1% NaOH이다. 처음에 0.1% NaOH에 용해된 Aβ(1-40)은 RT 항온배양 1시간 후에도 어떠한 응집의 증거도 나타내지 않았다.

실시예 3: Aβ(20-42) 글로불로머 선택적 항체가 Aβ(1-42) 피브릴을 식별하는지를 SDS-PAGE로 가시화한 반정량적 분석

Aβ(1-42) 피브릴 제조:

Aβ(1-42)(Bachem, 카탈로그 번호: H-1368) 1mg을 0.1% NH₄OH 수용액 500㎕에 용해하고, 상온에서 1분 동안 진탕시켰다. 샘플을 10000g에서 5분 동안 원심분리했다. 상청액을 수집했다. 상청액 중의 Aβ(1-42) 농도는 브래드포드법(BIO-RAD)에 따라 측정했다.

0.1% NH₄OH 중의 Aβ(1-42) 100㎕를 20mM NaH₂PO₄, 140mM NaCl, pH 7.4 300㎕와 혼합하고, 2% HCl로 pH를 7.4로 조정했다. 그 다음, 샘플을 37℃에서 20시간 동안 항온처리했다. 그 다음, 샘플을 10,000g에서 10분 동안 원심분리했다. 상청액은 버리고, 잔류물을 20mM NaH₂PO₄, 140mM NaCl, pH 7.4 400㎕와 혼합하고, 1분 동안 강력한 진탕("볼텍싱")으로 재현탁시킨 뒤, 10,000g에서 10분 동안 원심분리했다. 상청액은 버리고 잔류물은 20mM NaH₂PO₄, 140mM NaCl, pH 7.4 400㎕와 혼합하고, 1분 동안 강력한 진탕("볼텍싱")으로 재현탁시킨 뒤, 10,000g에서 10분 동안 한번 더 원심분리했다. 상청액은 제거했다. 잔류물은 20mM NaH₂PO₄, 140mM NaCl, pH 7.4 380㎕에 재현탁시키고, 강력한 진탕("볼텍싱")으로 촉진시켰다.

Aβ(1-42) 피브릴에 대한 항Aβ 항체의 결합:

Aβ(1-42) 피브릴 제조물 40㎕를 20mM NaH₂PO₄, 140mM NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4 160㎕로 희석하고, 상온에서 5분 동안 진탕시킨 뒤, 샘플을 10,000g에서 10분 동안 원심분리했다. 상청액은 버리고, 잔류물은 20mM NaH₂PO₄, 140mM NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4 95㎕에 재현탁시켰다. 재현탁은 강력한 진탕("볼텍싱")으로 촉진시켰다.

피브릴 제조물 10㎕씩을 각각 다음과 함께 혼합했다:

a) 20mM NaH₂PO₄, 140mM NaCl, pH 7.4, 10㎕

b) 20mM NaH₂PO₄, 140mM NaCl, pH 7.4 중의 0.5㎍/㎕ 5F7 10㎕

c) 20mM NaH₂PO₄, 140mM NaCl, pH 7.4 중의 0.5㎍/㎕ 6E10(Signet Nr.: 9320) 10㎕

샘플을 37℃에서 20시간 동안 항온처리한 후, 10,000g에서 10분 동안 원심분리했다. 상청액을 수집하여 SDS-PAGE 샘플 완충액 20㎕와 혼합했다. 잔류물은 20mM NaH₂PO₄, 140mM NaCl, 0.025% Tween 20, pH 7.4 50㎕와 혼합하고, "볼텍싱"하여 재현탁시킨 다음, 이 샘플을 10,000g에서 10분 동안 원심분리했다. 상청액은 버리고, 잔류물은 20mM NaH₂PO₄, 140mM NaCl, 0.025% Tween 20, pH 7.4 20㎕와 혼합한 다음, SDS-PAGE 샘플 완충액 20㎕와 혼합했다. 샘플은 전기영동을 위해 4 내지 20% Tris/ 글리신 겔에 적용했다.

SDS-PAGE의 파라미터:

SDS 샘플 완충액: 0.3g SDS

4ml 1M Tris/HCl pH 6.8

8ml 글리세린

1ml 에탄올 중의 1% 브로모페놀 블루

H₂O로 약 50ml로 채움.

4-20% Tris/글리신 겔:(Invitrogen, Cat.no.: EC6025BOX)

전기영동 완충액: 7.5g Tris

36g 글리신

2.5g SDS

H₂O로 2.5L로 채움

이 겔에 20mA의 일정 전류를 통과시켰다.

겔의 염색: 쿠마시 블루 R250

결과는 도 2에 제시했다.

여러 항Aβ 항체의 반정성 분석 및 이들의 Aβ(1-42) 피브릴의 판별:

항체, Aβ(1-42) 피브릴 및 Aβ(1-42) 단량체의 위치는 겔의 가장자리에 표시했다. Aβ(1-42) 피브릴은 크기 때문에 SDS-PAGE 겔로 유입될 수 없어, 겔 슬롯에서 관찰할 수 있다.

1. 마커

2. Aβ(1-42) 피브릴 제조물: 대조군

3. Aβ(1-42) 피브릴 제조물 + mAb 5F7; 20h, 37℃; 상청액

4. Aβ(1-42) 피브릴 제조물 + mAb 5F7; 20h, 37℃; 펠릿

5. Aβ(1-42) 피브릴 제조물 + mAb 6E10; 20h, 37℃; 상청액

6. Aβ(1-42) 피브릴 제조물 + mAb 6E10; 20h, 37℃; 펠릿

피브릴 타입 Aβ에 대한 상대적 결합은 SDS-PAGE 분석으로부터, 원심분리 후 상청액 분획 및 결합된 피브릴(펠릿 분획)에 존재하는 항체의 중쇄 유래의 광학밀도(OD) 값을 측정하여 평가했다. Aβ 피브릴에 결합된 항체는 Aβ 피브릴과 공침전되어야 하고, 이에 따라 펠릿 분획에서 발견되는 반면, Aβ 피브릴에 결합되지 않은(유리) 항체는 상청액에서 발견된다. Aβ 피브릴에 결합된 항체의 백분율은 다음과 같은 식에 따라 계산했다:

Aβ 피브릴에 결합된 항체 백분율 =

OD_{피브릴 분획} x 100%/(OD_{피브릴 분획} + OD_{상청액 분획})

이 절차는 mAb 6E10(Signet, Cat.no.: 9320), 5F7, 2F2, 6A2, 4D10, 10F11, 3B10, 7C6, 7E5 및 10C1에 대해서도 수행했다.

알츠하이머 질환 뇌에서, Aβ 피브릴은 총 Aβ 펩타이드 풀의 주요 성분이다. 이 피브릴을 항Aβ 항체로 공격하면, 다량의 Aβ의 방출과, 이어서 미세출혈의 위험 증가로 인해 좋지 않은 부작용의 위험이 증가한다. 미세출혈의 위험 증가는 Aβ 펩타이드의 피브릴 응집물을 이용한 능동 면역화 시도에서 관찰되었다(Bennett and Holtzman, 2005, Neurology, 64, 10-12; Orgogozo J, Neurology, 2003, 61, 46-54; Schenk et al., 2004, Curr Opin Immunol, 16, 599-606).

AA1-17 사이에 선형 Aβ 에피토프를 인식하는 시판 항체 6E10(Signet 9320)와 달리, Aβ(20-42) 글로불로머 선택적 항체 5F7(실제로는 다른 Aβ 형태보다 Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 선택성이 가장 낮다)은 공펠릿화 실험에서 Aβ(1-42) 피브릴에 결합하지 않는다. 이것은 Aβ(1-42) 피브릴과 항온처리 후 5F7 항체가 펠릿화 단계 후 상청액에 남아 있고, Aβ(1-42) 피브릴에 결합됨으로 인한 공펠릿화가 이루어지지 않는다는 사실에 의해 입증되었다.

실시예 4: 대상체 인식 검사를 이용한, Aβ(1-42) 단량체(0.1% NH ₄ OH), Aβ(1-42) 글로불로머 또는 Aβ(20-42) 글로불로머로의 능동 면역화 후의 마우스와 비교군인 야생형의 인지 성능 분석

이 실험에서는 점돌연변이를 보유한 사람 APP를 과잉발현하는 마우스를 사용했다. 점돌연변이는 아미노산 717(발린 대신 이소류신)을 의미하며, 이는 60대가 되기 전에 AD 개시를 나타내는 런던 패밀리(London family)에서 발견되었다(Mullan et al., Nature Genetics 2(1992) 340-342). 본 명세서에서 APP/L이라고도 지칭한 유전자 전이 마우스는 류벤에 의해 창조되었고 처음 소개되었다(Moechars et al., J. Biol. Chem. 274(1999) 6483-6492). 6주령의 APP/L 마우스 암컷에게 능동 면역화를 처치했다.

이 마우스에게 동량의 완전 프로인트 보강제와 혼합된 인산염 완충 식염 수(PBS) 중의 Aβ(1-42) 단량체(0.1% NH₄OH), Aβ(1-42) 글로불로머 또는 Aβ(20-42) 글로불로머 100㎍를 복강내로 투여한 다음, 이후 3개월 동안 3주마다 불완전 프로인트 보강제 중의 동량의 항원을 추가 접종했다. 이 실험 동안 동물은 역 주야 사이클(7pm에 주간 사이클 개시 14시간/야간 10시간)에서 표준 조건 하에 유지시켰다. 실험 시간 동안의 체중 증가는 예상한 바와 같았고, PBS/보강제만이 접종된 대조군과 다르지 않은 바, 항원 처치를 잘 견뎌냈음을 암시했다.

4.5월령에, 마우스의 인지 능력을 문헌(Dewachter et al., Journal of Neuroscience 22(2002) 3445-3453)에 기술된 바와 같이 대상체 인식 검사로 검사했다. 이 목적을 위해, 마우스를 실험장에 익숙해지게 한 뒤, 10분 동안 획득 단계에 노출시켰고, 이 단계 동안 마우스는 이제 2개의 동일한 요소(크기가 유사한 청색 피라미드, 녹색 입방체, 황색 원기둥, 약 4cm)이 포함되어 있는 실험장에 각각 방치되었다. 마우스가 대상체를 조사하는 기간과 빈도를 기록했다. 유치 단계 동안, 2.5시간 후 마우스는 알고 있는 대상체 외에, 이제 다른 대상체들 중에서 무작위로 선택된 미지의 대상체가 포함되어 있는 실험장으로 복귀시켰다. 새 대상체의 인식은 총 시간(구 대상체 및 신 대상체의 조사 시간) 대비 마우스가 구 대상체를 조사하는 시간으로 기록했다. "인식 지수"는 이 관계(새 대상체에 대한 시간/총 시간)를 나타낸다. 알고 있는 대상체를 기억하지 못하는 마우스는 그 대상체도 새 대상체와 동등한 흥미를 나타내며 그 대상체를 조사하는데 동일한 시간을 소비하는 것으로 간주될 수 있고, 즉 50%의 인식 지수를 나타낸다. 알고 있는 대상체를 기억하는 마우스는 흥미가 없는 것으로 판단할 수 있으며, 따라서 훨씬 높은 인식 지수를 나타낸다. APP/L 마우스는 4.5월령에 인지 결손이 있는 것으로 알려져 있고, 무작위 수준의 차원, 즉 50%의 인식 지수를 나타낸다.

결과는 도 3에 도시했다.

마우스의 대상체 인식 검사. 본 검사는 미지의 대상체 대비 공지 대상체의 인식을 기록하는 것으로서, 10분 검사 단계 동안의 조사 행동에 의거하여 측정되었다. 인식 지수는 공지 및 미지의 대상체를 조사하는데 소비한 시간 대비, 미지 대상체를 조사하는데 소비하는 시간의 백분율로서 정의된다. 공지의 대상체는 본 검사 단계 3시간 전에 10분 획득 단계 동안 상기 마우스가 조사했다. 5그룹의 마우스(컬럼 아래에 제시된 수 n)를 비교했다. 정상 C57BI/6 마우스(야생형)는 무작위 수준(50%, 즉 공지 대상체 및 미지 대상체에 소비하는 조사 시간이 동일한 것)과 크게 다른 높은 RI를 보여준다(^*** = p<0.001; 스투던트 t검정). 나머지 APP 유전자 전이 마우스 4 그룹은 3개월 전에 능동 면역화로 처치했다. 면역원으로는 Aβ(1-42) 단량체, Aβ(1-42) 글로불로머 및 Aβ(20-42) 글로불로머를 사용했다. 인산염 완충 식염수(PBS)는 대조군으로 사용했다. PBS와 다른 그룹 간의 유의적인 차이는 원으로 표시했다: °= p<0.05; °°=p<0.01 (ANOVA에서 p<0.05 이후, 사후 t검정).

APP/L 마우스는 비유전자 전이 마우스와 대조적으로, 무작위 수준에 가까운 결과(즉, 50% 인식 지수)를 나타내면서 4.5월령에 인지 결손을 보이는 것으로 알려졌다. 실제로, PBS 처리된 마우스는 비유전자 전이 마우스(야생형)와 대조적으로 무작위 행동을 보였다. 천연 Aβ(1-42) 글로불로머 및 Aβ(20-42) 글로불로머를 이용한 면역화는 APP/L 마우스의 대상체 인식 능력을 크게 개선시켰다.

두 글로불로머 제조물(천연 및 절단형)은 APP 돌연변이 동물에서 기억을 개선시키며 Aβ(20-42) 글로불로머가 처치된 동물에서도 우수한 인식 능력을 나타내는 바, 절단형 Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 항체의 유도가 최상의 결과를 제공하며, 이 종과 특이적으로 반응하는 항체를 이용한 수동 면역화가 최적의 치료 전략인 것으로 생각하는 것이 합리적이다.

실시예 5: Aβ(20-42) 글로불로머를 이용한 APP/L Tg 마우스의 능동 면역화 후 다른 Aβ 형태에 대한 항체 프로필의 도트 블롯 분석

APP/L 마우스(Moechars et al., 1999, J.Biol.Chem. 274, 6483-6492)의 마우스(비교예 4)를 다른 Aβ 형태로 면역화한 후, 혈장 샘플을 항Aβ 항체에 대해 평가했다. 이 실험을 위해, 각 Aβ(1042) 형태를 0.2mg/ml BSA가 보충된 PBS로 100pmol/㎕에서 0.01pmol/㎕까지 연속 희석한 희석물로 제조했다. 각 샘플 1㎕를 니트로셀룰로스 막 위에 블롯팅했다. 검출을 위해 해당 마우스 혈장 샘플을 사용했다(1:400 희석물). 면역염색은 알칼리 포스포타제 접합된 항마우스 IgG 및 염색 시약 NBT/BCIP로 실시했다.

도트 블롯을 위한 Aβ 표준물:

1. Aβ(1-42) 글로불로머

Aβ(1-42) 글로불로머의 제조는 실시예 1a에서 기술한 바와 같다.

2. 플루로닉 F68 중의 HFIP 예비처리된 Aβ(1-42) 단량체

Aβ(1-42)(Bachem Inc.; cat.no H-1368) 3mg을 1.7ml 에펜도르프 튜브에서 0.5ml HFIP(6mg/ml 현탁액) 중에 용해하고, 투명한 용액이 수득될 때까지 37℃에서 1.5시간 동안 진탕시켰다(에펜도르프 써모 혼합기, 1400rpm). 샘플을 SpeenVac 농축기(1.5h)에서 건조한 다음, 13.2㎕ DMSO에 재현탁하고, 10초 동안 진탕한 뒤, 초음파처리(20sec) 및 10분 동안 진탕(예, 에펜도르프 써모 혼합기에서, 1400rpm)했다. 6ml의 20mM NaH₂PO₄; 140mM NaCl; 0.1% Pluronic F68; pH 7.4를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반했다. 샘플을 3000g에서 20분 동안 원심분리했다. 상청액은 버리고, 침전물은 0.6ml의 20mM NaH₂PO₄; 140mM NaCl; 1% Pluronic F68, pH 7.4에 용해했다. H₂O 3.4ml를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반한 다음, 3000g에서 20분 동안 원심분리했다. 상청액을 각각 0.5ml씩 8개 분취량을 이후 사용할 때까지 -20℃에 보관했다.

3. Aβ(20-42) 글로불로머

Aβ(20-42) 글로불로머의 제조는 실시예 1c에 기술한 바와 같다.

4. Aβ(12-42) 글로불로머

Aβ(12-42) 글로불로머의 제조는 실시예 1d에 기술한 바와 같다.

5. DMSO 중의 HFIP 예비처리된 Aβ(1-40) 단량체 5mM

Aβ(1-40)(Bachem Inc.; cat.no H-1194) 1mg을 에펜도르프 튜브에서 0.25ml HFIP(4mg/ml 현탁액) 중에 현탁시켰다. 투명한 용액이 수득될 때까지 튜브를 37℃에서 1.5시간 동안 진탕하고(예, 에펜도르프 써모 혼합기에서, 1400rpm), 그 다음 SpeenVac 농축기(1.5h)에서 건조했다. 샘플을 46㎕ DMSO에 재용해하고(21.7mg/ml 용액 = 5mM), 10초 동안 진탕한 뒤, 20초 동안 초음파처리했다. 10분 동안 진탕 (예, 에펜도르프 써모 혼합기에서, 1400rpm)한 후, 샘플을 이후 사용할 때까지 -20℃에서 보관했다.

6. Aβ(1-42) 단량체, 0.1% NH₄OH

1mg Aβ(1-42)(Bachem Inc., cat.no. H-1368)를 0.1% NH₄OH 수용액(새로 제조한 것) 0.5ml에 용해하고( = 2mg/ml), 즉시 실온에서 30초 동안 진탕시켜 투명한 용액을 수득했다. 샘플은 이후 사용할 때까지 -20℃에서 보관했다.

7. Aβ(1-42) 피브릴

Aβ(1-42)(Bachem Inc.; cat.no H-1368) 1mg을 500㎕의 0.1% NH₄OH 수용액(에펜도르프 튜브)에서 용해하고, 샘플을 실온에서 1분 동안 교반했다. 이와 같이 새로 제조한 Aβ(1-42) 용액 100㎕를 300㎕의 20mM NaH₂PO₄; 140mM NaCl, pH 7.4로 중화시켰다. 이 pH를 1% HCl로 pH 7.4로 조정했다. 샘플을 37℃에서 24시간 동안 항온처리하고 원심분리했다(10000g에서 10분). 상청액은 버리고, 피브릴 펠릿은 400㎕의 20mM NaH₂PO₄; 140mM NaCl, pH 7.4에 1분 동안 볼텍싱하여 재현탁시켰다.

8. sAPPα

시그마에서 입수했다(cat.no. S9564; 20mM NaH₂PO₄; 140mM NaCl; pH 7.4 중에 25㎍). sAPPα는 20mM NaH₂PO₄, 140mM NaCl, pH 7.4, 0.2mg/ml BSA로 0.1mg/ml(= 1pmol/㎕)로 희석시켰다.

도트 블롯 재료:

Aβ 표준물질:

20mM NaH₂PO₄, 140mM NaCl, pH 7.4 + 0.2mg/ml BSA 중에 Aβ 항원의 연속 희석물

1) 100pmol/㎕

2) 10pmol/㎕

3) 1pmol/㎕

4) 0.1pmol/㎕

5) 0.01pmol/㎕

니트로셀룰로스: 트란스 블롯 전이 배지, 순수 니트로셀룰로스 막(0.45㎛); 바이오래드

항마우스-AP: AQ330A(케미콘)

검출 시약: NBT/BCIP 정제(로슈)

소혈청 알부민(BSA): A-7888(SIGMA)

차단 시약: TBS 중에 5% 저지방유

완충 용액:

TBS : 25mM Tris/HCl - 완충액 pH7.5 + 150mM NaCl

TTBS: 25mM Tris/HCl - 완충액 pH 7.5 + 150mM NaCl + 0.05% Tween 20

PBS + 0.2mg/ml BSA

20mM NaH₂PO₄ 완충액 pH 7.4 + 140mM NaCl + 0.2mg/ml BSA

항체 용액 I:

Aβ(20-42) 글로불로머(TBS 중의 1% 저지방유 20ml로의 1:400 희석물)로 능동 면역화 연구에서 수득한 마우스 혈장 샘플

항체 용액 II:

1:5000 희석물

TBS 중의 1% 저지방유 중에 항마우스 AP

도트 블롯 절차:

1) 여러 Aβ 표준물(5개의 연속 희석물)을 각각 1㎕씩 니트로셀룰로스 막 위에 서로 약 1cm의 간격을 두고 점적했다.

2) 니트로셀룰로스 막 위의 Aβ 표준물 도트는 실온(RT)에서 적어도 10분 동안 공기 건조했다(도트 블롯).

3) 차단:

도트 블롯을 TBS 중의 5% 저지방유 30ml와 RT에서 1.5시간 동안 항온배양했다.

4) 세척:

차단 용액을 버리고, 도트 블롯을 20ml TTBS와 진탕 하에 RT에서 10분 동안 항온배양했다.

5) 항체 용액 I:

세척 완충액은 버리고, 도트 블롯은 항체 용액 I과 RT에서 하룻밤 동안 항온배양했다.

6) 세척:

항체 용액 I은 버리고 도트 블롯은 20ml TTBS와 진탕 하에 RT에서 10분 동안 항온배양했다. 세척 용액은 버리고 도트 블롯은 20ml TTBS와 RT에서 10분 동안 진탕 배양했다. 세척 용액은 버리고, 도트 블롯은 20ml TBS와 RT에서 10분 동안 진탕 배양했다.

7) 항체 용액 II:

세척 완충액은 버리고 도트 블롯은 항체 용액 II와 RT에서 1시간 동안 배양했다.

8) 세척:

항체 용액 II는 버리고 도트 블롯은 20ml TTBS와 RT에서 10분 동안 진탕 배양했다. 세척 용액은 버리고 도트 블롯은 20ml TTBS와 RT에서 10분 동안 진탕 배양했다. 세척 용액은 버리고 도트 블롯은 20ml TBS와 RT에서 10분 동안 배양했다.

9) 발색:

세척 용액은 버렸다. NBT/BCIP 1정제를 20ml H₂O에 용해하고, 이 용액에서 도트 블롯을 5분 동안 배양했다. 발색 정지는 H₂O로 집중 세척하여 실시했다.

결과는 도 4에 제시했다.

Aβ(20-42) 글로불로머로 마우스를 능동 면역화한 후 수득된 항Aβ 항체를 다른 Aβ형태에 대한 특이성을 평가하는 도트 블롯 분석. 각 Aβ 형태를 연속 희석물로서 블롯팅한 뒤, 면역 반응 동안 생산된 항Aβ 항체를 함유하는 해당 마우스 혈장과 항온배양했다. 각 도트 블롯은 면역화된 마우스의 다른 개체에 해당한다.

1. Aβ(1-42) 글로불로머

2. 0.1% Pluronic F68에 용해된, HFIP 예비처리된 Aβ(1-42) 단량체

3. Aβ(20-42) 글로불로머

4. Aβ(12-42) 글로불로머

5. DMSO 중에 용해된, HFIP 예비처리된 5mM Aβ(1-40) 단량체

6. Aβ(1-42) 단량체, 0.1% NH₄OH

7. Aβ(1-42) 피브릴 제조물

8. sAPPα(시그마); (1차 도트: 1pmol)

APP/L Tg 마우스의 능동 면역화 연구에서는 Aβ(20-42) 글로불로머로의 면역화가 이들 마우스에서 인지 장애를 경감시키는 데 있어서 PBS 처리군에 비해 최상의 결과를 제공하는 것으로 관찰되었다. Aβ(20-42) 글로불로머로 능동 면역화된 후 APP/L Tg 마우스 유래의 혈장 샘플은 본 발명에서 청구하는 Aβ(20-42) 글로불로머 mAb와 유사한 항체 프로필(Aβ(20-42) 글로불로머 및 Aβ(12-42) 글로불로머를 주로 인식)을 나타낸다.

실시예 6: Aβ(1-42) 단량체, Aβ(1-42) 글로불로머, Aβ(20-42) 글로불로머 및 대조군으로서 비히클로 능동 면역화된 APP/PS1 Tg 마우스의 뇌 추출물에 존재하는 용해성 및 불용성 Aβ(1-42) 및 Aβ(1-40) 펩타이드의 농도

4월령이고 FVBxC57BI/6J 배경에 알츠하이머 질환의 이중 유전자 전이 마우스 모델(APP/PS1 Tg 마우스)인 암컷 마우스 40마리를 본 연구에 사용했다. APP/PS1 Tg 마우스는 V717I 돌연변이(가장 긴 APP 이소폼을 의미하는 위치)를 보유한 사람 APP의 695 아미노산 형태 및 A264E 돌연변이를 보유하는 사람 Presenilin 1 유전자를 포함한다. 두 유전자는 모두 Thy1 프로모터의 조절을 받는다. 이 마우스는 reMYND 기초 실험실 중 하나(the Experimental Genetics Group, Campus Gasthuisberg, Catholic University Leuven)에서 프레드 반 류벤 박사 등에 의해 개발되고 특성이 분석되었다.

마우스는 모두 3주령째 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)으로 유전자형별화하고 PCR 결과가 수득되면 고유의 식별번호를 부여받았다.

마우스는 예비여과 및 살균된 물(UV 램프)과 표준 마우스 식이를 자유롭게 이용할 수 있었다. 음식은 환기가 잘 되는 저장실에서 저온의 건조 조건 하에 보관했다. 물과 음식의 양은 매일 점검하고, 필요할 때 공급했으며, 부족 시에는 1주에 2회 보충했다.

마우스는 역주야 리듬 하에 사육했다: 표준 금속 우리 RVS T2(면적 540㎠)에서 p.m. 7시부터 14시간 주간/10시간 야간. 우리에는 딱딱한 바닥과 침대용 지푸라기 층을 설치했다. 우리당 마우스의 수는 동물 복지법에 따라 제한했다. 행동 검사를 시작하기 5일 전에, 마우스를 다시 마크롤론 타입 2 우리에 가두고 행동 검사를 위한 준비로 실험실 환경에 적응하도록 실험실로 이송했다.

이 마우스에게 동량의 완전 프로인트 보강제와 혼합된 인산염 완충 식염수(PBS) 중의 Aβ(1-42) 단량체(0.1% NH₄OH), Aβ(1-42) 글로불로머 또는 Aβ(20- 42) 글로불로머 100㎍를 복강내로 투여한 다음, 불완전 프로인트 보강제 중의 동량의 항원을 4개월 동안 3주마다 추가 접종했다.

생화학

1 대뇌반구의 용해성 분획 중에 존재하는 Aβ(1-40) 및 Aβ(1-42)를 ELISA로 측정했다. 또한, 1 대뇌반구의 불용성 막 분획에 존재하는 Aβ(1-40) 및 Aβ(1-42)도 ELISA로 측정했다.

마우스는 Ketalar(케타민), Rompun(자일라진 2%) 및 아트로핀 2:1:1 혼합물로 마취하고, 4℃에서 생리적 혈청으로 심장내를 세척했다. 이것은 기관 자체에 어떠한 영향도 미치지 않는 절차인, 뇌 혈관으로부터 혈액을 제거하기 위한 것이다.

뇌척수액(CSF)은 두개골과 제1 경추골 사이인 경부 근육의 절개를 통해 수집했다. 26게이지 바늘로 대수조 천자를 수행하고, 미세 유리 피펫으로 CSF 10 내지 20㎕를 수집했다.

심장 천자와 1ml 주사기를 통해 혈액을 헤파린 코팅된 에펜도르프 튜브에 수집했다. 혈액은 4℃, 14,000rpm으로 5분 동안 원심분리했다. 혈청은 -70℃에 보관했다.

마우스는 생리적 혈청으로 4℃에서 심장내 세척을 실시했다.

뇌는 두개골과 후뇌로부터 꺼내고, 관상/이마면의 절단으로 전뇌를 분리했다. 소뇌는 제거했다. 전뇌는 정중면 절단을 사용하여 좌우 반구로 균등 분할했다.

하나의 반구는 액체 질소에 즉시 침지시켜, 생화학 분석을 할 때까지 -70℃에 보관했다.

한쪽 뇌 반구의 균질화 및 분할

뇌는 포터, 유리 튜브(계면활성제 제거된 튜브, 2㎤) 및 기계적 조직분쇄기(650rpm)를 사용하여 균질화했다. 프로테이나제 억제제(50ml Tris/HCl 완충액 50ml 당 1정제, Complete™, 로슈 제품, 독일 맨하임 소재)가 첨가된, 새로 제조된 20mM Tris/HCl 완충액(pH8.5)의 6.5 x ½뇌 중량의 부피 균질화 완충액으로서 사용했다.

샘플을 -70℃에서 액체 질소 하의 샘플 홀더로 옮기고, 각각의 샘플을 균질화 하기전에 수 초 동안 벤치에서 항온처리하여 예비 가온 처리했다. 균질액은 베크만 원심분리기 튜브 TLX에 수집하고, 원심분리하기 전까지 얼음 위에 방치했다. 두 샘플 사이의 포터와 유리 튜브는 계면활성제가 없는 증류수(AD)로 조심스럽게 세정하고 흡수지로 건조시켰다.

샘플을 예냉된 초원심분리기(베크만, 독일 맨하임 소재)에서 48000rpm(135,000xg)으로 4℃에서 1시간 30분 동안 원심분리했다. 원심분리기 홀더의 제한된 수(N=8)로 인해, 샘플은 뇌 중량별로(원심분리기의 평형 유지를 위해) 분할하고, 무작위로 선발하여 다른 원심분리 기간 동안 다른 처리 그룹을 분리했다.

상청액(분비된 APP 및 아밀로이드 펩타이드를 함유하는 용해성 분획)을 펠릿(노령의 마우스에서 플라크 결합된 아밀로이드 펩타이드 및 막 결합된 APP 단편을 함유하는 막 분획)과 분리시켰다. 이 상청액을 2개의 튜브에 나누고, 그 하나는 예비물로서 -20℃에 보관하고, 다른 것을 아밀로이드 펩타이드의 농축을 위해 컬럼 크로마토그래피로 처리했다.

뇌 중량, 사용된 Tris/HCl 완충액 용량, 원심분리 기간(색으로 표시) 및 컬럼 크로마토그래피에 사용된 용해성 분획 용량은 다음 표에 예시용으로 제공했다:

샘플 N°	처리	마우스 ID N°	뇌중량(W)(mg)	Tris 용량 (=W x 6.5) (㎕)	50% Tris 용량 (㎕)
19	X	TAB.TPF 1305	157.8	1026	513
21	X	TAB.TPF 1335	160.2	1041	521

소형 역상 컬럼(C18-Sep-Pack Vac 3cc 카트리지, 워터스 제품, MA, 매사츄세츠 소재)에 진공 시스템을 장착하고, 0.1% 트리플루오로아세트산(A-TFA) 중의 80% 아세토니트릴로 세척한 뒤, 이어서 0.1% TFA로 2회 세척했다. 그 다음, 샘플을 적용하고, 컬럼을 5% 내지 25% A-TFA로 연속 세척했다. 아밀로이드 펩타이드는 75% A-TFA로 용출시키고, 용출물은 얼음 상의 2ml 튜브에 수집했다. 용출물은 SpeedVac 농축기(사반트, NY 파밍데일 소재)에서 하룻밤 동안 동결건조하고, ELISA 키트에 구비된 샘플 희석제 330㎕에 용해시켰다.

펠릿은 여러 막 분획으로 다시 분할했다: 막 분획 A(MFA), 전장 APP를 함유하는 막 분획 B(MFB) 및 플라크 결합된 아밀로이드를 함유하는 막 분획 C(MFC). 따라서, 펠릿은 TBS 완충액 + 프로테이나제 억제제(50ml TBS 완충액당 1정제, Complete™, 로슈 제품, 독일 만하임 소재)에 용해하고, MFA는 2개의 튜브에 나누고, 그 하나는 예비용으로 -20℃에 보관했다. MFA 60%는 프로테이나제 억제제와 TBS 중의 NP40(최종 용량의 2%) 및 Triton X-100(최종 용량의 2%)을 첨가하고 추가 처리하고, 스윙아웃 로터(SW60)를 이용하여 베크만 초원심분리기로 4℃에서 27,000rpm(98,000xg) 하에 1시간 동안 원심분리했다. 상청액(MFB)은 펠릿(MFC)과 분리하고, 그 둘 모두를 -20℃에 보관했다.

뇌중량, 뇌중량의 60%, 사용된 TBS+PI+NP40+Triton X-100 완충액의 용량 및 원심분리 기간(색으로 표시)은 다음 표에 예시적으로 제공했다.

샘플 N°	처리	마우스 ID N°	뇌중량(W) (mg)	3/5 x 뇌중량 (mg)	완충액 용량 = 3/5W x 15 (㎕)
19	X	TAB.TPF 1305	157.8	95	1420
21	X	TAB.TPF 1335	160.2	96	1442

한쪽 대뇌반구의 용해성 분획 중의 사람 Aβ의 ELISA

뇌 균질액의 용해성 분획 및/또는 뇌척수액(CSF) 중의 사람 Aβ(1-40) 및 사람 Aβ(1-42)의 양을 정량하기 위해, 시판 ELISA(Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay) 키트를 사용했다(h 아밀로이드 β40 또는 β42 ELISA 고 민감성, 더 제네틱스 컴패니 제품, 스위스 취리히 소재). ELISA는 제조자의 프로토콜에 따라 수행했다. 간략히 설명하면, 표준물(합성 Aβ(1-40) 또는 Aβ(1-42)의 희석물) 및 샘플을 단백질 결합능이 없는 96웰 폴리프로필렌 평판(그라이너 바이오원, 독일 프릭켄하우젠 소재)에 준비했다. 최종 농도가 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.3 및 15.6pg/ml인 표준 희석물과 샘플을, ELISA 키트에 구비된 샘플 희석제로 최종 용량이 60㎕가 되도록 제조했다. 아밀로이드 수준은 마우스의 연령에 따라 증가하고 실제 평가 시에는 샘플의 판독값이 표준 곡선의 선형 부분 내에 있어야 하기 때문에, Aβ(1-40) 분석용 샘플은 1:3으로 희석하고, Aβ(1-42) 분석용 샘플은 1:6으로 희석했다.

샘플, 표준물 및 블랭크(50㎕)를 선택적 항Aβ 항체 접합체(비오틴화된 검출 항체)와 함께 항Aβ 코팅된 폴리스티롤 평판(포획 항체가 항원의 C 말단 단부를 선 택적으로 인식한다)에 첨가하고 4℃에서 하룻밤 동안 항온배양하여, 항체-아밀로이드-항체-복합체를 형성시켰다. 다음날, 스트렙타비딘-퍼옥시다제-접합체를 첨가하고, 30분 후 TMB/퍼옥사이드 혼합물을 첨가하여, 기질을 유색 산물로 전환시켰다. 이 반응은 황산(1M) 첨가로 정지시키고, 색 강도는 450nm 필터를 구비한 ELISA 판독기로 광도측정법으로 측정했다. 샘플의 Aβ 함량의 정량은, 합성 Aβ(1-40) 또는 Aβ(1-42)로 작도된 표준 곡선과 흡광도를 비교하여 수득했다.

한쪽 대뇌반구 중의 불용성 분획에 존재하는 ELISA 사람 Aβ

뇌 균질액의 불용성 막 분획에 존재하는 사람 Aβ(1-40) 및 사람 Aβ(1-42)의 양을 정량하기 위해, MFC 샘플을 추가 처리하고 80mM Tris/HCl 중의 8M 구아니딘에 용해했다. 이어서, 샘플을 25℃의 써모혼합기에서 3시간 동안 항온배양하고, 시간마다 100㎕ 피펫으로 위아래로 피펫팅하여 MFC 펠릿을 구아니딘 완충액에 용해시켰다. 최종 샘플은 4000rpm으로 1분만 원심분리하여 파편을 제거했다.

뇌중량, MFC 펠릿의 중량 및 8M 구아니딘 완충액의 용량은 다음 표에 예시적으로 제공했다.

샘플 N°	처리	마우스 ID N°	뇌 중량(W) (mg)	MCF 펠릿 중량 (WMFC) (40% 뇌)	8M 구아니딘 용량 (WMFC x 1.6) (㎕)
19	X	TAB.TPF 1305	157.8	63	101
21	X	TAB.TPF 1335	160.2	64	103

최종 샘플 중에 사람 Aβ(1-40) 및 사람 Aβ(1-42)의 양을 정량하기 위해, 시판 ELISA(Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay) 키트를 사용했다(h 아밀로이드 β40 또는 β42 ELISA 고 민감성, 더 제네틱스 컴패니 제품, 스위스 취리히 소재). ELISA는 표준물의 제조(합성 Aβ(1-40) 또는 Aβ(1-42)의 희석)를 제외하고는, 제조자의 프로토콜에 따라 수행했다. 샘플은 ELISA 키트에 구비된 샘플 희석제로 최종 용량이 60㎕가 되도록 제조했다. 구아니딘은 표준 곡선의 OD 값에 영향을 미치기 때문에, 샘플마다 동일한 농도의 구아닌딘과 샘플 희석제로, 최종 농도가 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.3 및 15.6pg/ml인 표준 희석물을 제조했다. 이것은 단백질 결합능이 없는 96웰 폴리프로필렌 평판(그라이너 바이오원, 독일 프릭켄하우젠 소재)에서 수행했다.

아밀로이드 수준은 마우스의 연령에 따라 증가하고 실제 평가 시에는 샘플의 판독값이 표준 곡선의 선형 부분 내에 있어야 하기 때문에, 불용성 Aβ(1-40) 및 불용성 Aβ(1-42) 분석용 샘플은 1:500으로 희석했다.

샘플, 표준물 및 블랭크(50㎕)를 선택적 항Aβ 항체 접합체(비오틴화된 검출 항체)와 함께 항Aβ 코팅된 폴리스티롤 평판(포획 항체가 항원의 C 말단 단부를 선택적으로 인식한다)에 첨가하고 4℃에서 하룻밤 동안 항온배양하여, 항체-아밀로이드-항체-복합체를 형성시켰다. 다음날, 스트렙타비딘-퍼옥시다제-접합체를 첨가하고, 30분 후 TMB/퍼옥사이드 혼합물을 첨가하여, 기질을 유색 산물로 전환시켰다. 이 반응은 황산(1M) 첨가로 정지시키고, 색 강도는 450nm 필터를 구비한 ELISA 판독기로 광도측정법으로 측정했다. 샘플의 Aβ 함량의 정량은, 합성 Aβ(1-40) 또는 Aβ(1-42)로 작도된 표준 곡선과 흡광도를 비교하여 수득했다.

결과는 도 5에 제시했다.

Aβ(1-42) 단량체(0.1% NH₄OH), Aβ(1-42) 글로불로머, Aβ(20-42) 글로불로 머 또는 대조군으로서 비히클로 능동 면역화된 APP/PS1 Tg 마우스의 뇌 추출물에 존재하는 용해성 및 불용성 Aβ(1-42) 및 Aβ(1-40) 펩타이드의 농도.

Aβ(20-42) 글로불로머로 능동 면역화된 APP/PS1 Tg 마우스의 뇌 추출물의 용해성 및 불용성 분획에서 Aβ(1-40) 및 Aβ(1-42) 펩타이드의 수준은 비히클 대조군과 크게 다르지 않았다. 이에 반해, Aβ(1-42) 글로불로머 및 Aβ(1-42) 단량체로의 면역화는 뇌 Aβ(1-40) 및 Aβ(1-42) 수준을 감소시킨다. 이것은 Aβ(20-42) 글로불로머 유도된 면역화 시도가 전체 Aβ 뇌 수준을 크게 변화시키지 않지만, Aβ 펩타이드 관련 인지 장애를 경감시키는데 효과적이라는 것을 입증한다(실시예 4 참조).

실시예 7: 항Aβ(20-42) 글로불로머 항체로의 수동 면역화 후에 APP/L 유전자 전이 마우스에서 대상체 인식 검사를 통한 인지능 분석

본 실험에는 점 돌연변이를 보유한 사람 APP를 과잉발현하는 마우스를 사용했다. 점 돌연변이는 아미노산 717(발린 대신 이소류신)을 의미하며, 이는 생애 60대가 되기 전에 AD 개시를 나타내는 런던 패밀리(London family)에서 발견되었다(Mullan et al., Nature Genetics 2(1992) 340-342). 본 명세서에서 APP/L이라고도 지칭한 유전자 전이 마우스는 류벤에 의해 창조되었고 처음 소개되었다(Moechars et al., J. Biol. Chem. 274(1999) 6483-6492). 3개월령의 APP/L 마우스 암컷에게 수동 면역을 처치했다. 이 마우스에게 100㎕ 인산염 완충 식염수(PBS) 중의 임의의 모노클로날 마우스 항체 5F7, 10F11 또는 7C6 250㎍을 투여했다. 이 실험 동안 동물은 역 주야 사이클(7pm에 주간 사이클 개시 14시간/야간 10시간)에 서 표준 조건 하에 유지시켰다. 어떠한 부작용의 징후 없이 수동 면역화를 잘 견뎌냈다.

세 번째 주사(실험 15일) 후에, 마우스의 인지 능력을 문헌(Dewachter et al., Journal of Neuroscience 22(2002) 3445-3453)에 기술된 바와 같이 대상체 인식 검사로 검사했다. 이 목적을 위해, 마우스를 실험장에 익숙해지게 한 뒤, 10분 동안 획득 단계에 노출시켰고, 이 단계 동안 마우스는 이제 2개의 동일한 요소(크기가 유사한 녹색 입방체 또는 오렌지색 원기둥, 약 4cm)이 포함되어 있는 실험장에 각각 방치되었다. 마우스가 대상체를 조사하는 기간과 빈도를 기록했다. 유치 단계 동안, 2.5시간 후 마우스는 알고 있는 대상체 외에, 이제 다른 대상체가 포함되어 있는 실험장으로 복귀시켰다. 새 대상체의 인식은 총 시간(구 대상체 및 신 대상체의 조사 시간) 대비 마우스가 구 대상체를 조사하는 시간으로 기록했다. "인식 지수"는 이 관계(새 대상체에 대한 시간/총 시간)를 나타낸다. 알고 있는 대상체를 기억하지 못하는 마우스는 그 대상체도 새 대상체와 동등한 흥미를 나타내며 그 대상체를 조사하는데 동일한 시간을 소비하는 것으로 간주될 수 있고, 즉 50%의 인식 지수를 나타낸다. 알고 있는 대상체를 기억하는 마우스는 흥미가 없는 것으로 판단할 수 있으며, 따라서 훨씬 높은 인식 지수를 나타낸다. APP/L 마우스는 4.5월령에 인지 결손이 있는 것으로 알려져 있고, 무작위 수준의 차원, 즉 50%의 인식 지수를 나타낸다.

결과는 도 6에 도시했다.

마우스의 대상체 인식 검사. 본 검사는 미지의 대상체 대비 공지 대상체의 인식을 기록하는 것으로서, 10분 검사 단계 동안의 조사 행동에 의거하여 측정되었다. 인식 지수는 공지 및 미지의 대상체를 조사하는데 소비한 시간 대비, 미지 대상체를 조사하는데 소비하는 시간의 백분율로서 정의된다. 공지의 대상체는 본 검사 단계 2.5시간 전에 10분 획득 단계 동안 상기 마우스가 조사했다.

a) APP 유전자 전이 마우스는 매우 1회씩 3주 동안 항체 5F7(n=9), 항체 10F11(n=11) 또는 항체 7C6(n=11) 250㎍을 복강내 주사하여 면역화하고; 대조용 마우스에게는 PBS를 투여했다(n=6). 무작위 수준(50%, 즉 공지 및 미지 대상체에 소비된 동등한 조사 시간)과의 유의적인 차이는 별표로 표시했다. ^* = p<0.05 (t검정).

b) 항체(5F7, 10F11 및 7C6; (n=31)) 처리된 전체 마우스 및 인산염 완충 식염수(PBS)로 처리된 마우스(PBS; n=6)의 비교. 항체 처리된 마우스의 RI는 무작위 수준과 유의적으로 다르다(^**=P<0.01; t검정).

APP/L 마우스는 4.5월령에서 인지 결손성인 것으로 알려져 있으며, 무작위 수준의 차원의 인식 지수, 즉 50%를 나타낸다.

실제, PBS 처리된 마우스는 무작위 행동을 보였다. 3 항체(5F7, 10F11 및 7C6) 전체로의 수동 면역화는 인식 지수의 유의적 증가를 나타냈다. 대조군에 대해 수집된 그룹과 비교했을 때, 인식 지수는 유의적으로 증가했다. 3가지 항체 전체를 투여한 후 APP/L 마우스의 기억능에 미치는 유익한 효과는 절단형 Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 항체가 인지능 개선에 충분하다는 것을 암시한다.

실시예 8: 항Aβ(20-42) 글로불로머 항체의 선택성에 관한 도트 블롯 프로필

모노클로날 항체Aβ(20-42) 글로불로머 항체의 선택성을 특성 분석하기 위해, 여러 Aβ 형태를 가지고 인식에 대해 조사했다. 이를 위해, 0.2mg/ml BSA가 보충된 PBS에 100pmol/㎕부터 0.01pmol/㎕ 범위로 연속 희석된 각 Aβ(1-42) 형태를 제조했다. 각 샘플 1㎕를 니트로셀룰로스 막 위에 점적했다. 검출을 위해 대응 항체를 사용했다(0.2㎍/ml). 면역염색은 퍼옥시다제 접합된 항마우스 IgG 및 염색 시약 BM Blue POD 기질(로슈)을 사용하여 수행했다.

도트 블롯을 위한 Aβ 표준물:

1. Aβ(1-42) 단량체, 0.1% NH₄OH

Aβ(1-42)(Bachem, 카탈로그 번호 H-1368) 1mg을 0.1% NH₄OH 수용액(새로 제조한 것)(=2mg/ml) 0.5ml에 용해하고, 그 즉시 실온에서 30초 동안 진탕하여 투명 용액을 수득했다. 이 샘플을 이후 사용할 때까지 -20℃에 보관했다.

2. Aβ(1-40) 단량체, 0.1% NH₄OH

Aβ(1-40)(Bachem, 카탈로그 번호 H-1368) 1mg을 0.1% NH₄OH 수용액(새로 제조한 것)(=2mg/ml) 0.5ml에 용해하고, 그 즉시 실온에서 30초 동안 진탕하여 투명 용액을 수득했다. 이 샘플을 이후 사용할 때까지 -20℃에 보관했다.

3. Aβ(1-42) 단량체, 0.1% NaOH

Aβ(1-42)(Bachem, 카탈로그 번호 H-1368) 2.5mg을 0.1% NaOH 수용액(새로 제조한 것)(=5mg/ml) 0.5ml에 용해하고, 그 즉시 실온에서 30초 동안 진탕하여 투명 용액을 수득했다. 이 샘플을 이후 사용할 때까지 -20℃에 보관했다.

4. Aβ(1-40) 단량체, 0.1% NaOH

Aβ(1-40)(Bachem, 카탈로그 번호 H-1368) 2.5mg을 0.1% NaOH 수용액(새로 제조한 것)(=5mg/ml) 0.5ml에 용해하고, 그 즉시 실온에서 30초 동안 진탕하여 투명 용액을 수득했다. 이 샘플을 이후 사용할 때까지 -20℃에 보관했다.

5. Aβ(1-42) 글로불로머

Aβ(1-42) 글로불로머의 제조는 실시예 1a에 기술되어 있다.

6. Aβ(12-42) 글로불로머

Aβ(12-42) 글로불로머의 제조는 실시예 1d에 기술되어 있다.

7. Aβ(20-42) 글로불로머

Aβ(20-42) 글로불로머의 제조는 실시예 1c에 기술되어 있다.

8. Aβ(1-42) 피브릴

Aβ(1-42)(Bachem, 카탈로그 번호: H-1368) 1mg을 0.1% NH₄OH 수용액 500㎕(에펜도르프 튜브)에 용해하고, 샘플을 실온에서 1분 동안 교반했다. 이와 같이 새로 제조한 Aβ(1-42) 용액 100㎕를 20mM NaH₂PO₄, 140mM NaCl, pH 7.4 300㎕로 중화시켰다. pH는 1% HCl로 7.4로 조정했다. 그 다음, 샘플을 37℃에서 24시간 동안 항온처리하고, 원심분리(10,000g에서 10분)했다. 상청액은 버리고, 피브릴 펠릿은 20mM NaH₂PO₄, 140mM NaCl, pH 7.4 400㎕와 1분 동안 볼텍싱하여 재현탁시켰다.

9. sAPPα

시그마 제품(cat no. S9564; 20mM NaH₂PO₄, 140mM NaCl, pH 7.4 중에 25㎍). sAPPα는 20mM NaH₂PO₄, 140mM NaCl, pH 7.4, 0.2mg/ml BSA로 0.1mg/ml(=1pmol/㎕)로 희석했다.

도트 블롯을 위한 재료:

Aβ 표준물질:

20mM NaH₂PO₄, 140mM NaCl, pH 7.4 + 0.2mg/ml BSA 중에 Aβ 항원의 연속 희석물

1) 100pmol/㎕

2) 10pmol/㎕

3) 1pmol/㎕

4) 0.1pmol/㎕

5) 0.01pmol/㎕

니트로셀룰로스: 트란스 블롯 전이 배지, 순수 니트로셀룰로스 막(0.45㎛); 바이오래드

항마우스-POD: cat no. 715-035-150(잭슨 임뮤노 리서치)

검출 시약: BM Blue POD 기질, 침전형(로슈)

소혈청 알부민(BSA): cat no; A-7888(SIGMA)

차단 시약: TBS 중에 5% 저지방유

완충 용액:

TBS : 25mM Tris/HCl - 완충액 pH7.5 + 150mM NaCl

TTBS: 25mM Tris/HCl - 완충액 pH 7.5 + 150mM NaCl + 0.05% Tween 20

PBS + 0.2mg/ml BSA

20mM NaH₂PO₄ 완충액 pH 7.4 + 140mM NaCl + 0.2mg/ml BSA

항체 용액 I:

TBS 중의 1% 저지방유 20ml로 희석된 0.2㎍/ml 항체

항체 용액 II:

1:5000 희석물

TBS 중의 1% 저지방유 중에 항마우스 POD

도트 블롯 절차:

1) 여러 Aβ 표준물(5개의 연속 희석물)을 각각 1㎕씩 니트로셀룰로스 막 위에 서로 약 1cm의 간격을 두고 점적했다.

2) 니트로셀룰로스 막 위의 Aβ 표준물 점은 실온(RT)에서 적어도 10분 동안 공기 건조했다(도트 블롯).

3) 차단:

도트 블롯을 TBS 중의 5% 저지방유 30ml와 RT에서 1.5시간 동안 항온배양했다.

4) 세척:

차단 용액을 버리고, 도트 블롯을 20ml TTBS와 진탕 하에 RT에서 10분 동안 항온배양했다.

5) 항체 용액 I:

세척 완충액은 버리고, 도트 블롯은 항체 용액 I과 RT에서 2시간 동안 항온배양했다.

6) 세척:

항체 용액 I은 버리고 도트 블롯은 20ml TTBS와 진탕 하에 RT에서 10분 동안 항온배양했다. 세척 용액은 버리고 도트 블롯은 20ml TTBS와 RT에서 10분 동안 진탕 배양했다. 세척 용액은 버리고, 도트 블롯은 20ml TBS와 RT에서 10분 동안 진탕 배양했다.

7) 항체 용액 II:

세척 완충액은 버리고 도트 블롯은 항체 용액 II와 RT에서 하룻밤 동안 배양했다.

8) 세척:

항체 용액 II는 버리고 도트 블롯은 20ml TTBS와 RT에서 10분 동안 진탕 배양했다. 세척 용액은 버리고 도트 블롯은 20ml TTBS와 RT에서 10분 동안 진탕 배양했다. 세척 용액은 버리고 도트 블롯은 20ml TBS와 RT에서 10분 동안 배양했다.

9) 발색:

세척 용액은 버렸다. 도트 블롯은 10ml BM Blue POD 기질로 10분 동안 발색시켰다. 발색 정지는 H₂O로 도트 블롯을 집중 세척하여 실시했다. 정량 평가는 농도측정 분석(GS800) 농도계(바이오래드)와 소프트웨어 패키지 Quantity one, Version 4.5.0(바이오래드)로 점 강도를 분석하여 실시했다. 시각적으로 분명히 확인되는 Aβ(20-42) 글로불로머의 마지막 점의 상대 밀도보다 20% 더 큰 상대밀도를 보유한 점만을 평가했다. 이 역치 값은 모든 도트 블롯마다 독립적으로 측정했다. 이와 같이 계산된 값은 주어진 항체마다 Aβ(20-42) 글로불로머 및 각 Aβ 형태의 인식 사이의 관계를 나타낸다.

결과는 도 7에 제시했다.

여러 Aβ 형태에 대한 여러 항Aβ 항체(6E10, 5F7, 4B7, 10F11, 6A2, 4D10, 2F2; 3B10, 7C6, 7E5, 10C1)의 특이성에 관한 도트 블롯 분석. 검사된 모노클로날 항체는 Aβ(20-42) 글로불로머로 마우스를 능동 면역화한 후 융합된 하이브리도마 세포를 선택하여 수득했다(6E10은 제외). 각 Aβ 형태는 연속 희석물로 사용했고, 면역 반응을 위해 각 항체와 항온배양했다.

1. Aβ(1-42) 단량체, 0.1% NH₄OH

2. Aβ(1-40) 단량체, 0.1% NH₄OH

3. Aβ(1-42) 단량체, 0.1% NaOH

4. Aβ(1-40) 단량체, 0.1% NaOH

5. Aβ(1-42) 글로불로머

6. Aβ(12-42) 글로불로머

7. Aβ(20-42) 글로불로머

8. Aβ(1-42) 피브릴 제조물

9. sAPPα(시그마); (1차 도트: 1pmol)

항 Aβ(20-42) 글로불로머 선택성 mAb는 Aβ(1-42) 글로불로머 및 Aβ(12-42) 글로불로머를 판별하는 측면에서 3가지 클래스로 분류할 수 있다. 항체 6A2, 5F7 및 2F2를 포함하는 제1 클래스는 우선적으로 Aβ(20-42) 글로불로머를 인식하고, Aβ(1-42) 글로불로머( 및 Aβ(12-42) 글로불로머)를 어느 정도 인식한다. 항체 10F11, 4D10 및 3B10을 포함하는 제2 클래스는 우선적으로 Aβ(20-42) 글로불로머를 인식하고, Aβ(12-42) 글로불로머도 인식하니 그 정도는 적고, Aβ(1-42) 글로불로머는 크게 인식하지 못한다. 항체 7C6, 4B7, 7E5 및 10C1을 포함하는 제3 클래스는 Aβ(20-42) 글로불로머를 인식하나, 다른 것들은 거의 인식하지 못한다. 3 클래스 모두 단량체 Aβ(1-42), 단량체 Aβ(1-40), Aβ(1-42) 피브릴 또는 sAPPα는 유의적으로 인식하지 못한다.

이와 같은 항Aβ(20-42) 글로불로머 항체의 선택성 프로필은 수동 면역화에서 유의적으로 상승된 인식 지수(도 6)가 주로 절단형 Aβ(20-42) 글로불로머 및 Aβ(12-42) 글로불로머의 선택적 인식 및 훨씬 적은 정도지만 Aβ(1-42) 글로불로머에 대한 인식과 단량체 Aβ(1-42), 단량체 Aβ(1-40), Aβ(1-42) 피브릴 또는 sAPPα의 인식 불능으로 인한 것임을 입증한다.

실시예 9: 노령 TG2576 마우스에 존재하는 Aβ 플라크 형태의 원섬유성 Aβ 펩타이드와 뇌막 혈관에 존재하는 Aβ 아밀로이드에 대한 Aβ(20-42) 선택적 항체의 특이적 반응에 관한 동일계내 분석

본 실험을 위해, 19월령 TG2576 마우스(Hsiao et al., 1996, Science; 274(5284), 99-102) 또는 9월령 APP/LxPS1 마우스(앞의 설명 참조; ReMYND, 류벤, 벨기에)의 뇌 물질, 또는 2명의 알츠하이머 질환 환자(RZ16 및 RZ55; 브레인넷에서 입수, 뮌헨)의 부검 물질을 사용했다. 상기 마우스는 소위 스웨덴 돌연변이(K670N/M671L; Tg2576) 또는 소위 런던 돌연변이(V717I)를 보유하는 사람 APP와 함께 A264E 돌연변이를 보유하는 사람 프레세닐린 1 유전자(APP/LxPS1)를 과잉발현하고, 약 7 내지 11월령에는 뇌 실질조직에 β 아밀로이드 침작물을 형성하고, 약 18월령에는 더 큰 뇌 혈관에 β 아밀로이드 침적물을 형성했다. 이 동물을 깊이 마취하고, 혈액을 제거하기 위해 0.1M 인산염 완충 식염수(PBS)를 심장내로 관류시켰다. 그 다음, 뇌를 두개골에서 꺼내어 길이방향으로 분할했다. 뇌의 한쪽 반구는 쇼크 동결시키고, 다른 반쪽은 40% 포름알데하이드에 침지시켜 고정시켰다. 침지 고정된 반구는 PBS 중의 30% 슈크로스에 침지시켜 동결방지하고, 냉동 마이크로톰 위에 탑재했다. 전뇌 전체는 30㎛ 절편으로 절단하여 PBS에 모아서, 이후 염색 절차에 사용했다. 사람 뇌 물질은 신피질의 약 1㎤ 급속 동결된 블록이었다. 이 블록의 작은 일부는 4% 파라포름알데하이드에 침지 고정시키고, 상기 마우스 뇌 물질처럼 추가 처리했다.

각 절편은 다음과 같은 절차를 사용하여 콩고레드로 염색했다:

재료:

NaCl 알콜 용액, NaOH 용액 및 콩고레드 용액으로 이루어진 아밀로이드 염료 콩고레드 키트(Sigma-Aldrich; HT-60)

- 염색 큐벳

- 현미경 슬라이드 SuperfrostPlus 및 커버슬립

- 에탄올, 자일롤, 매립액

시약:

- NaOH를 NaCl 용액으로 1:100으로 희석하여 알칼리성 식염수를 제공한다.

- 알칼리성 식염수를 콩고레드 용액으로 1:100으로 희석하여 알칼리성 콩고레드 용액을 제공한다(사용하기 전 15분 이내에 준비하여 여과한다).

- 절편을 슬라이드 위에 탑재하고 건조한다.

- 염색 큐벳 내의 슬라이드를 처음에는 알칼리성 식염수에서 30 내지 40분 동안 항온배양한 다음, 알칼리성 콩고레드 용액에서 30 내지 40분 동안 항온배양한다.

- 새 에탄올로 3회 세정하고 자일롤로 매립한다.

염색은 먼저 Zeiss Axioplan 현미경을 사용하여 사진촬영하고 정량적으로 평가했다. 적색은 플라크 형태는 물론 더 큰 뇌막 혈관에서도 아밀로이드 침적물을 나타냈다. 이러한 결과는 도 8A에 제시했다. 이후, 항체 염색 평가도 이러한 구조에 초점을 맞추었다.

항체 염색은 다음과 같은 프로토콜에 따라 각 항체 0.07 내지 7.0㎍/ml을 함유하는 용액과 절편을 항온배양하여 수행했다:

재료:

- TBST 세척 용액(Tris 완충 식염수 + Tween 20; 10x 농축물; DakoCytomation; 초순수 물에 S3306 1:10 희석)

- 0.3% H₂O₂ 메탄올 용액

- TBST 중에 당나귀 혈청(Serotec) 5%

- TBST에 희석된 모노클로날 마우스-항글로불로머 항체

- 2차 항체: 비오틴화된 당나귀-항마우스 항체(Jackson Immuno: 715-065-150; TBST에 1:500으로 희석)

- StreptABComplex(DakoCytomation: K 0377)

- 퍼옥시다제 기질 키트 디아미노벤지딘(=DAB; Vector Laboratories; SK-4100)

- SuperFrost Plus 현미경 슬라이드 및 커버슬립

- 자일롤 없는 매립액(Medite; X-tra Kit)

절차:

- 부유성 절편을 빙냉 0.3% H₂O₂로 옮긴 뒤, 30분 동안 항온처리.

- TBST 완충액으로 5분 동안 세척

- 당나귀 혈청/TBST와 20분 동안 항온처리

- 실온에서 24시간 동안 1차 항체와 항온처리

- TBST 완충액으로 5분 동안 세척

- Vectastain Elite ABC 퍼옥시다제 키트 유래의 차단 혈청과 20분 동안 항온처리

- TBST 완충액으로 5분 동안 세척

- 2차 항체와 상온에서 60분 동안 항온처리

- TBST 완충액으로 5분 동안 세척

- StreptABComplex와 상온에서 60분 동안 항온처리

- TBST 완충액으로 5분 동안 세척

- Vectastain Elite ABC 퍼옥시다제 키트 유래의 DAB와 20분 동안 항온처리

- 슬라이드 위에 절편을 탑재하고, 공기 건조한 뒤, 알콜로 탈수시키고 매립

염색을 육안으로 조사하는 것 외에, 추가로 조직의 영상으로부터 무작위 선발한 10개의 플라크를 ImagePro 5.0 영상 분석 시스템으로 그래픽 절제한 뒤, 이들의 평균 회색도 값을 측정하여 플라크 염색을 정량분석했다. 광학밀도 값은, 염색된 물질의 평균 배경 밀도를 아밀로이드 플라크 밀도로부터 감하여 상기 회색조 값으로부터 계산하며(0% - 주위 배경 이상의 플라크 염색이 없는 경우, 100% - 전달 0/최대 염색), 대조군과 항체 사이의 차이 및 Aβ(20-42)에 선택적인 항체와 6G1 사이의 차이를 각각 ANOVA로 통계적 유의성에 대해 검사했다.

Tg2576 및 APP/LxPS1 마우스의 염색 결과는 도 8 B-D 및 H에 제시했다.

19월령의 돌연변이 TG 2576 마우스에 신피질의 횡단면에서 0.7㎍/ml 농도의 여러 항체의 결합:

C) 실질조직의 Aβ 침적물(아밀로이드 플라크)은 6G1 및 6E10으로만 염색되고, 글로불로머 선택성 항체(즉, 5F7, 2F2, 6A2, 4D10, 10F11, 3B10, 7C6, 7E5 및 10C1)로는 염색되지 않았다.

D) 모든 글로불로머 선택성 항체(즉, 5F7, 2F2, 6A2, 4D10, 10F11, 3B10, 7C6, 7E5 및 10C1)는 시판 항체인 6E10 및 4G8에 비해 실질조직의 플라크 염색율이 훨씬 적었다.

11월령의 돌연변이 APP/LxPS1 마우스의 신피질 횡단면에서 0.07 내지 7.0㎍/ml 농도의 여러 항체의 결합:

G) 실질조직의 Aβ 침적물(아밀로이드 플라크)은 글로불로머 선택성 항체(즉, 5F7, 2F2, 6A2, 4D10, 10F11, 3B10, 7C6, 7E5 및 10C1)보다 6G1, 6E10 및 4G8에 의해 낮은 농도에서 훨씬 많이 염색되었다.

모든 아밀로이드 침적물은 사전에 콩고친화성 염색으로 확인했다(콩고레드; 도 8A 참조). 막대 = 100㎛.

갈색 DAB 침적물의 평가에서는, Aβ 비선택성인 6G1 및 6E10 항체가 플라크와 뇌막 혈관을 염색하는 반면, Aβ(20-42) 글로불로머 선택성 항체인 5F7, 2F2, 6A2, 4D10, 10F11, 3B10, 7C6, 7E5 및 10C1은 염색하지 못한다는 것을 보여주었다. 이러한 발견은 이 항체들이 생체내 아밀로이드 구조 내에 존재하는 Aβ 피브릴 또는 다른 Aβ 종에 전혀 결합하지 않거나 대단히 적게 결합한다는 것을 증명한다. 이러한 결합 저하는 플라크의 지나치게 급속한 용해와 이어서 플라크-결합 항체와 미세아교세포의 상호작용으로 인한 용해성 Aβ 또는 신경염증의 증가에 의해 유도되는 부작용의 위험을 줄이는 것으로 생각된다.

사람 알츠하이머 질환 뇌의 염색 결과는 도 8B, F-H에 제시했다.

환자 RZ55의 신피질의 횡단면에서 0.7㎍/ml 농도의 여러 항체의 결합:

B) 실질조직의 Aβ 침적물(아밀로이드 플라크)은 6G1 및 6E10에 의해서만 염 색되고, 글로불로머 선택성 항체(즉, 5F7, 2F2, 6A2, 4D10, 10F11, 3B10, 7C6, 7E5 및 10C1)로는 염색되지 않았다.

F) 모든 글로불로머 선택성 항체(즉, 5F7, 2F2, 6A2, 4D10, 10F11, 3B10, 7C6, 7E5 및 10C1)는 시판 항체인 6E10 및 4G8에 비해 염색율이 훨씬 적었다.

H) 혈관의 Aβ 침적물(화살표)은 6G1 및 6E10에 의해서만 염색되고 글로불로머 선택성 항체(즉, 5F7, 2F2, 6A2, 4D10, 10F11, 3B10, 7C6, 7E5 및 10C1)에 의해서는 염색되지 않았다.

11월령의 돌연변이 APP/LxPS1 마우스의 신피질 횡단면에서 0.07 내지 7.0㎍/ml 농도의 여러 항체의 결합성:

G) 실질조직의 Aβ 침적물(아밀로이드 플라크)은 글로불로머 선택성 항체(즉, 5F7, 2F2, 6A2, 4D10, 10F11, 3B10, 7C6, 7E5 및 10C1)보다 6G1, 6E10 및 4G8에 의해 낮은 농도에서 훨씬 많이 염색되었다.

모든 아밀로이드 침적물은 사전에 콩고친화성 염색에 의해 확인되었다(콩고레드; 도 8A 참조).

갈색 DAB 침적물의 평가에서는, Aβ 비선택성인 6G1 및 6E10 항체가 플라크와 뇌막 혈관을 염색하는 반면, Aβ(20-42) 글로불로머 선택성 항체인 5F7, 2F2, 6A2, 4D10, 10F11, 3B10, 7C6, 7E5 및 10C1은 염색하지 못한다는 것을 보여주었다. 또한, 시판용 항체 6E10 및 4G8은 글로불로머 선택성 항체에 비해 더 강한 염색성을 나타냈지만, 6G1보다는 적었다. 이러한 발견은 생체내 아밀로이드 구조 내에 존재하는 Aβ 피브릴 또는 다른 Aβ 종에 대하여 글로불로머 선택성 항체가 전혀 결 합하지 않거나 거의 결합하지 않는 APP 유전자 전이 마우스에서의 염색 패턴을 증명해 준다. 사람 아밀로이드에 대한 이와 같은 결합 저하는 플라크의 지나치게 급속한 용해와 이어서 플라크-결합 항체와 미세아교세포의 상호작용으로 인한 용해성 Aβ 또는 신경염증의 증가에 의해 유도되는 부작용의 위험을 줄이는 것으로 생각된다.

실시예 10: 능동 면역화 후 약 1년째 TG2576 마우스 혈장에 존재하는 항Aβ 항체 역가 및 도트 블롯 선택성 프로필

Tg 2576(실시예 9)의 최종 면역(Aβ(20-42) 글로불로머, Aβ(12-42) 글로불로머, Aβ(1-42) 단량체 및 비히클) 후 약 1년째, 혈장 샘플을 가지고 항Aβ 항체가 생성되고 그대로 존재하는지를 평가했다. 이를 위해, 여러 형태의 Aβ(1-42)를 PBS + 0.2mg/ml BSA에 100pmol/㎕ 내지 0.01pmol/㎕ 농도 범위로 연속 희석한 희석물을 제조했다. 각 샘플마다 1㎕를 니트로셀룰로스 막에 적용했다. 검출은 적당한 마우스 혈장 샘플(1:400 희석)을 가지고 실시했다. 염색은 항마우스 IgG 접합된 알칼리성 포스파타제로, 염색 시약 NBT/BICP를 첨가하여 수행했다.

도트 블롯을 위한 Aβ 표준물질:

1. Aβ(1-42) 글로불로머

Aβ(1-42) 글로불로머의 제조는 실시예 1a에서 기술한 바와 같다.

2. 플루로닉 F68 중의 HFIP 예비처리된 Aβ(1-42) 단량체

Aβ(1-42)(Bachem Inc.; cat.no H-1368) 3mg을 1.7ml 에펜도르프 튜브에서 0.5ml HFIP(6mg/ml 현탁액) 중에 용해하고, 투명한 용액이 수득될 때까지 37℃에서 1.5시간 동안 진탕시켰다(에펜도르프 써모 혼합기, 1400rpm). 샘플을 SpeenVac 농축기(1.5h)에서 건조한 다음, 13.2㎕ DMSO에 재현탁하고, 10초 동안 진탕한 뒤, 초음파처리(20sec) 및 10분 동안 진탕(예, 에펜도르프 써모 혼합기에서, 1400rpm)했다. 6ml의 20mM NaH₂PO₄; 140mM NaCl; 0.1% Pluronic F68; pH 7.4를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반했다. 샘플을 3000g에서 20분 동안 원심분리했다. 상청액은 버리고, 침전물은 0.6ml의 20mM NaH₂PO₄; 140mM NaCl; 1% Pluronic F68, pH 7.4에 용해했다. H₂O 3.4ml를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반한 다음, 3000g에서 20분 동안 원심분리했다. 상청액을 각각 0.5ml씩 8개 분취량으로 하여, 이후 사용할 때까지 -20℃에 보관했다.

3. Aβ(20-42) 글로불로머

Aβ(20-42) 글로불로머의 제조는 실시예 1c에 기술한 바와 같다.

4. Aβ(12-42) 글로불로머

Aβ(12-42) 글로불로머의 제조는 실시예 1d에 기술한 바와 같다.

5. DMSO 중의 HFIP 예비처리된 Aβ(1-40) 단량체 5mM

Aβ(1-40)(Bachem Inc.; cat.no H-1194) 1mg을 에펜도르프 튜브에서 0.25ml HFIP(4mg/ml 현탁액) 중에 현탁시켰다. 투명한 용액이 수득될 때까지 튜브를 37℃에서 1.5시간 동안 진탕하고(예, 에펜도르프 써모 혼합기에서, 1400rpm), 그 다음 SpeenVac 농축기(1.5h)에서 건조했다. 샘플을 46㎕ DMSO에 재용해하고(21.7mg/ml 용액 = 5mM), 10초 동안 진탕한 뒤, 20초 동안 초음파처리했다. 10분 동안 진탕 (예, 에펜도르프 써모 혼합기에서, 1400rpm)한 후, 샘플을 이후 사용할 때까지 -20℃에서 보관했다.

6. Aβ(1-42) 단량체, 0.1% NH₄OH

1mg Aβ(1-42)(Bachem Inc., cat.no. H-1368)를 0.1% NH₄OH 수용액(새로 제조한 것) 0.5ml에 용해하고( = 2mg/ml), 즉시 실온에서 30초 동안 진탕시켜 투명한 용액을 수득했다. 샘플은 이후 사용할 때까지 -20℃에서 보관했다.

7. Aβ(1-42) 피브릴

Aβ(1-42)(Bachem Inc.; cat.no H-1368) 1mg을 500㎕의 0.1% NH₄OH 수용액(에펜도르프 튜브)에서 용해하고, 샘플을 실온에서 1분 동안 교반했다. 이와 같이 새로 제조한 Aβ(1-42) 용액 100㎕를 300㎕의 20mM NaH₂PO₄; 140mM NaCl, pH 7.4로 중화시켰다. 이 pH를 1% HCl로 pH 7.4로 조정했다. 샘플을 37℃에서 24시간 동안 항온처리하고 원심분리했다(10000g에서 10분). 상청액은 버리고, 피브릴 펠릿은 400㎕의 20mM NaH₂PO₄; 140mM NaCl, pH 7.4에 1분 동안 볼텍싱하여 재현탁시켰다.

8. sAPPα

시그마에서 입수했다(cat.no. S9564; 20mM NaH₂PO₄; 140mM NaCl; pH 7.4 중에 25㎍). sAPPα는 20mM NaH₂PO₄, 140mM NaCl, pH 7.4, 0.2mg/ml BSA로 0.1mg/ml(= 1pmol/㎕)로 희석시켰다.

도트 블롯 재료:

Aβ 표준물질:

20mM NaH₂PO₄, 140mM NaCl, pH 7.4 + 0.2mg/ml BSA 중에 Aβ 항원의 연속 희석물

1) 100pmol/㎕

2) 10pmol/㎕

3) 1pmol/㎕

4) 0.1pmol/㎕

5) 0.01pmol/㎕

니트로셀룰로스: 트란스 블롯 전이 배지, 순수 니트로셀룰로스 막(0.45㎛); 바이오래드

항마우스-AP: AQ330A(케미콘)

검출 시약: NBT/BCIP 정제(로슈)

소혈청 알부민(BSA): A-7888(SIGMA)

차단 시약: TBS 중에 5% 저지방유

완충 용액:

TBS : 25mM Tris/HCl - 완충액 pH7.5 + 150mM NaCl

TTBS: 25mM Tris/HCl - 완충액 pH 7.5 + 150mM NaCl + 0.05% Tween 20

PBS + 0.2mg/ml BSA

20mM NaH₂PO₄ 완충액 pH 7.4 + 140mM NaCl + 0.2mg/ml BSA

항체 용액 I:

TBS 중의 1% 저지방유 20ml로 1/400 희석된, 능동 면역화된 TG2576 마우스의 혈장

항체 용액 II:

1:5000 희석물

TBS 중의 1% 저지방유 중에 항마우스 AP

도트 블롯 절차:

1) 여러 Aβ 표준물(5개의 연속 희석물)을 각각 1㎕씩 니트로셀룰로스 막 위에 서로 약 1cm의 간격을 두고 점적했다.

2) 니트로셀룰로스 막 위의 Aβ 표준물 점은 실온(RT)에서 적어도 10분 동안 공기 건조했다(도트 블롯).

3) 차단:

도트 블롯을 TBS 중의 5% 저지방유 30ml와 RT에서 1.5시간 동안 항온배양했다.

4) 세척:

차단 용액을 버리고, 도트 블롯을 20ml TTBS와 진탕 하에 RT에서 10분 동안 항온배양했다.

5) 항체 용액 I:

세척 완충액은 버리고, 도트 블롯은 항체 용액 I과 RT에서 하룻밤 동안 항온배양했다.

6) 세척:

항체 용액 I은 버리고 도트 블롯은 20ml TTBS와 진탕 하에 RT에서 10분 동안 항온배양했다. 세척 용액은 버리고 도트 블롯은 20ml TTBS와 RT에서 10분 동안 진탕 배양했다. 세척 용액은 버리고, 도트 블롯은 20ml TBS와 RT에서 10분 동안 진탕 배양했다.

7) 항체 용액 II:

세척 완충액은 버리고 도트 블롯은 항체 용액 II와 RT에서 1시간 동안 배양했다.

8) 세척:

항체 용액 II는 버리고 도트 블롯은 20ml TTBS와 RT에서 10분 동안 진탕 배양했다. 세척 용액은 버리고 도트 블롯은 20ml TTBS와 RT에서 10분 동안 진탕 배양했다. 세척 용액은 버리고 도트 블롯은 20ml TBS와 RT에서 10분 동안 배양했다.

9) 발색:

세척 용액은 버렸다. NBT/BCIP 1정제를 20ml H₂O에 용해하고, 이 용액에서 도트 블롯을 5분 동안 배양했다. 발색 정지는 H₂O로 집중 세척하여 실시했다.

결과는 도 9에 제시했다.

여러 면역화 그룹의 혈청: a) Aβ(20-42) 글로불로머; b) Aβ(12-42) 글로불로머; c) Aβ(1-42) 단량체, 0.1% NH₄OH; d) 비히클 대조군을 여러 항체 프로필의 도트 블롯에서 여러 Aβ 형태에 대하여 검사했다.

1. Aβ(1-42) 글로불로머

2. 0.1% Pluronic F68에 용해된, HFIP 예비처리된 Aβ(1-42) 단량체

3. Aβ(20-42) 글로불로머

4. Aβ(12-42) 글로불로머

5. DMSO 중에 용해된, HFIP 예비처리된 5mM Aβ(1-40) 단량체

6. Aβ(1-42) 단량체, 0.1% NH₄OH 중에 용해

7. Aβ(1-42) 피브릴 제조물

8. sAPPα(시그마); (1차 도트: 1pmol)

대조군으로서 비히클 또는 Aβ(1-42) 단량체로 능동 면역화한 경우와 대조적으로, Aβ(20-42) 글로불로머 또는 Aβ(12-42) 글로불로머로의 면역은 최종 면역 후 약 1년 후에도 고역가 항체를 나타낸다. 이러한 항체는 Aβ(20-42) 글로불로머 면역화 한 경우에는 Aβ(20-42) 글로불로머 선택성이고, Aβ(12-42) 글로불로머 면역화한 경우에는 Aβ(20-42) 글로불로머 및 Aβ(12-42) 글로불로머 선택성이었다. 이것은, 절단형 Aβ(20-42) 글로불로머 및 Aβ(12-42) 글로불로머가 매우 양호한 항원이며, 이에 대해 지향성인 항체를 생체 내에서 매우 장기간 동안 지속시킨다는 것을 보여준다.

(주: 일부 도트 블롯에서 비특이적 염색 시그날이 관찰되었는데, 이는 Aβ 펩타이드의 일련의 희석물에 사용된 BSA에 대한 뮤린 항체의 교차 반응일 가능성이 크다)

실시예 11: 알츠하이머 질환 환자에 존재하는 Aβ(20-42) 글로불로 머 에피토프의 뇌 수준

SDS-DTT 뇌 추출물:

AD 뇌 샘플: RZ16; RZ52 및 RZ55(브레인 넷(뮌헨)에서 입수).

대조군 샘플: RZ92(브레인 넷(뮌헨)에서 입수).

완전 프로테아제 억제제(로슈, Cat.No. 1697 498) 1정제를 H₂O 1ml에 용해했다(= 프로테아제 억제제 용액). AD 뇌 샘플 100mg은 유리 포터에서 20회 스트로크로 2.5ml NaH₂PO₄, 140mM NaCl, 0.05% Tween 20, 0.5% BSA(25㎕ 프로테아제 억제제 용액 보충)에서 균질화시켰다. 현탁액은 얼음 상에서 30초 동안 초음파 처리한 다음, 37℃에서 16시간 동안 항온배양했다. 이 현탁액을 100,000g, 8℃에서 1시간 동안 원심분리하고, 상청액을 수거했다. 잔류물은 5mM NaH₂PO₄, 35mM NaCl, pH 7.4에 용해하고, 유리 포터에서 10회 스트로크로 균질화시켰다. 10% SDS 75㎕ 및 0.16mg/ml DTT 125㎕를 첨가하고, 상온에서 20분 동안 교반했다. 샘플을 10,000g에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 -20℃에서 하룻밤 동안 보관했다. 사용하기 전에 상청액은 해동시키고, 다시 10,000g에서 10분 동안 원심분리했다. 상청액(= SDS/DTT 뇌 추출물)은 ELISA에 사용했다.

a) Aβ(20-42) 글로불로머 에피토프의 샌드위치-ELISA

시약 목록:

1. F96 Cert.Maxisorp NUNC-immuno 평판(Cat.No.: 439454)

2. 결합 항체: 5F7, 7C6, 10F11

3. 커플링 완충액: 100mM 탄산수소나트륨, pH 9.6

4. ELISA용 차단 시약(로슈 다이애그노스틱스 게엠베하 Cat.No.: 1112589)

5. PBST 완충액: 20mM NaH₂PO₄, 140mM NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4

6. Aβ(20-42) 보정 표준물질

7. 1차 항체: 항Aβ pRAb BA199; 친화성 정제된(Aβ(1-42) 글로불로머-세파로스에 의해) IgG의 PBS 용액; 농도: 0.22mg/ml

8. 2차 항체: 항토끼-POD 접합체;(잭슨 임뮤노리서치, Cat.No.: 111-036-045)

9. 발색:

- TMB; (로슈 다이애그노스틱스 게엠베하 Cat.No.: 92817060), DMSO 중에 42mM

- 3% H₂O₂ 수용액

- 100mM 아세트산나트륨, pH4.9

- 정지 용액: 2M 황산

시약 제조:

1. 결합 항체:

각 결합 항체 5F7, 7C6 및 10F11은 커플링 완충액으로 0.7㎍/ml의 최종 농도로 희석했다.

2. 차단 시약:

차단용 스톡 용액을 제조하기 위해, 차단 시약을 100ml H₂O에 용해하고, 각각 10ml의 분취량을 -20℃에서 보관했다.

차단용 스톡 용액 3ml를 하나의 ELISA 평판을 차단하기 위해 27ml H₂O로 희석했다.

3. Aβ(20-42) 보정 표준물질(CS1)

Aβ(1-42) 글로불로머의 제조는 실시예 1a에 기술되어 있다.

Aβ(20-42) 글로불로머 단백질 농도는 브래드포드법(바이오래드)으로 측정했다(6.81mg/ml). Aβ(20-42) 글로불로머(6.81mg/ml) 14.68㎕를 20mM NaH₂PO₄, 140mM NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4, 0.5% BSA 10ml로 희석했다(=10㎍/ml). 이러한 10㎍/ml 용액 10㎕를 다시 20mM NaH₂PO₄, 140mM NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4, 0.5% BSA 10ml로 희석했다(= 10ng/ml = CS1).

SDS/DTT-뇌 추출물:

SDS/DTT-뇌 추출물 = E#

(#는 4가지 사람 뇌 샘플 (1) RZ16; (2) RZ52; (3) RZ55; (4) RZ92를 나타낸다)

4. 1차 항체:

항Aβ pRAb 스톡 용액은 PBST + 0.5% BSA로 0.05㎍/ml로 희석했다. 항체 용액은 즉시 사용한다.

5. 2차 항체:

동결건조된 항토끼 POD 접합체는 0.5ml H₂O에 용해하고, 글리세롤 500㎕와 혼합한다. 그 다음, 항체 농축물을 100㎕씩 -20℃에 보관한다. 이 농축물은 PBST 완충액으로 1:10000으로 희석한다. 이 항체 용액은 즉시 사용한다.

6. TMB 용액:

100mM 아세트산나트륨 pH 4.9 20ml를 TMB 용액 20㎕ 및 3% 과산화수소 29.5㎕와 혼합한다. 이 용액은 즉시 사용한다.

Aβ(20-42)의 ELISA 평판:

조정용 표준물질(CS1.1-CS1.8) 및 4가지 사람 뇌 샘플 (1)RZ16; (2) RZ52; (3) RZ55; (4) RZ92의 SDS/DTT-뇌 추출물( = E1-E4의 4가지 일련의 희석물 E#.1- E#.4)을 2중으로 측정했다:

이 ELISA는 결합성 모노클로날 항체 5F7, 7C6, 10F11과 각각 수행했다.

절차

1. 웰당 mAb 용액 100㎕를 첨가한다. 이 ELISA 평판을 +6℃(냉장고)에서 하룻밤 동안 항온처리한다.

2. 항체 용액을 버리고, 웰을 각각 250㎕ PBST 완충액으로 3회 세척한다.

3. 차단 용액 250㎕/웰을 첨가한다. 상온에서 2시간 동안 항온처리한다.

4. 차단 용액을 버리고, 웰을 각각 250㎕ PBST 완충액으로 3회 세척한다.

5. 조정용 표준물질과 SDS/DTT 뇌 추출물을 각각 100㎕/웰씩 첨가한다. 평판을 상온에서 2시간 동안, 그 다음 6℃에서 하룻밤 동안 항온처리한다.

6. 조정용 표준물질과 SDS/DTT 뇌 추출 용액을 버리고, 각각 250㎕ PBST 완 충액으로 3회 잘 세척한다.

7. 1차 항체 용액 200㎕/ml를 첨가하고, 상온에서 1시간 동안 항온처리한다.

8. 1차 항체 용액을 버리고 250㎕ PBST 완충액으로 각각 3회 잘 세척한다.

9. 2차 항체 용액 200㎕/웰를 첨가하고, 상온에서 1시간 동안 항온처리한다.

10. 2차 항체 용액을 버리고 250㎕ PBST 완충액으로 각각 3회 잘 세척한다.

11. TMB 용액 100㎕/웰을 첨가한다.

12. 발색 동안(상온에서 5 내지 15분) 평판 색을 모니터하고, 적당한 색이 발색되면 정지 용액 50㎕/웰를 첨가하여 반응을 종결시킨다.

13. 450nm에서 흡광도를 측정한다.

14. 조정 곡선을 사용하여 결과를 계산한다.

15. 평가: 샘플의 흡광도가 선형 조정 범위 이상이면 다시 희석하여 반복한다.

결과는 도 10에 제시했다.

AD 환자 및 대조용 검체 유래의 뇌 추출물에 존재하는 Aβ(20-42) 글로불로머 에피토프의 뇌 수준

샌드위치 ELISA를 사용하여 뇌 추출물의 절단형 Aβ(20-42) 글로불로머 에피토프 함량을 평가했다. Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 각 항체를 이용한 ELISA를 조정을 위해 사용했다.

알츠하이머 질환 뇌 조직의 추출물은 Aβ(20-42) 글로불로머 에피토프 함량이 대조용 환자에 비해 유의적으로 상승되어 있음을 보여준다. 이것은, Aβ(20-42) 글로불로머 에피토프가 알츠하이머 질환 동물 모델에서만 관련이 있는 것이 아니고, 사람 알츠하이머 질환 뇌에 관련이 있는 Aβ 종이라는 것을 입증한다. 따라서, Aβ(20-42) 글로불로머 에피토프에 대해 지향성인 항체는 알츠하이머 질환의 치료에 매우 바람직하다.

실시예 12: 항Aβ(20-42) 글로불로머 하이브리도마 세포주의 발생

모노클로날 항체는 하이브리도마, 재조합, 및 파지 디스플레이 기술, 또는 이의 조합 사용을 비롯한 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 당업계에 공지되고, 예컨대 문헌[Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988; Hammerling, et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 536-681(Elsevier, N.Y., 1981)(이 문헌들은 그 전문이 본 발명에 참고인용된다)]에 교시된 것을 비롯한 하이브리도마 기술을 사용하여 생산할 수 있다. 본 명세서에 사용된 "모노클로날 항체"란 용어는 하이브리도마 기술을 통해 생산된 항체에만 국한되지 않는다. "모노클로날 항체"란 용어는 이것이 생산되는 방법이 아니라, 임의의 진핵생물, 원핵생물 또는 파지 클론을 비롯한 단일 클론에서 유래되는 항체를 의미한다.

본 명세서에 기술된 항체를 생산하는데 사용되는 구체적인 프로토콜은 다음과 같다:

마우스의 면역화: Balb/c 및 A/J 마우스(6 내지 8주령)는 CFA 중의 항원 50㎍을 피하 주사로 면역화시켰다. 동물에게 총 3회 추가접종을 위해 Immuneasy™(퀴 아겐) 중의 항원 50㎍을 3주마다 추가 접종했다. 융합 4일전에 마우스에게 항원 10㎍을 정맥내 추가접종했다.

세포 융합 및 하이브리도마 선별: 면역화된 동물 유래의 비장 세포를 표준 기술에 따라 5:1의 비율로 SP2/0-Ag14 골수종 세포와 융합시켰다. 융합 후 7 내지 10일이 경과한 다음, 육안으로 콜로니가 관찰될 때, SN을 Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 항체 검사를 위해 ELISA로 분석했다. ELISA 양성 웰 유래의 세포를 대량배양하고 한계희석법으로 클론화했다.

항체 이소타입 측정: 항Aβ(20-42) 글로불로머 mAb의 이소타입은 Zymed EIA 이소타입 측정용 키트를 사용하여 측정했다.

대량배양 및 모노클로날 항체의 정제: 하이브리도마는 5% 저 IgG 태내송아지 혈청를 함유하는 배지(하이클론)로 증량시켰다. 상청액을 수거하여 농축시켰다. mAb는 프로테인 A 크로마토그래피로 정제하고 PBS 내로 투석했다.

혈청 역가: 마우스 10마리를 Aβ(20-42) 글로불로머로 면역화시켰다. 모든 마우스는 1:5000 내지 10,000의 ELISA 역가(1/2 최대값 OD 450nm)로 혈청전환되었다.

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모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 명칭

기탁물의 아보트 러보러터리즈 내부 명칭.

기탁된 세포주:

1) ML13-7C6.1 D4.4A9.5G8 ("7C6"이라고도 지칭함)

2) ML15-5F7.5B10 ("5F7"이라고도 지칭함)

3) ML15-10F11.3D9 ("10F11"이라고도 지칭함)

4) ML15-4B7.3A6 ("4B7"이라고도 지칭함)

5) ML15-2F2.3E12 ("2F2"라고도 지칭함)

6) ML15-6A2.4B10 ("6A2"라고도 지칭함)

7) ML13-4D10.3F3 ("4D10"이라고도 지칭함)

8) ML15-7E5.5E12 ("7E5"라고도 지칭함)

9) ML15-10C1.5C6.3H4 ("10C1"이라고도 지칭함)

10) ML15-3B10.2D5.3F1 ("3B10"이라고도 지칭함)

<110> Abbott Laboratories Abbott GmbH & Co.KG <120> Anti-Aß Globulomer Antibodies, Antigen-Binding Moieties Thereof, Corresponding Hy-bridomas, Nucleic Acids, Vectors, Host Cells, Methods Of Producing Said Antibodies, Compositions Comprising Said Antibodies, Uses Of Said Antibodies And Methods Of Using Said Antibodies <130> M/46385 <150> US 60/740,866 <151> 2005-11-30 <150> US 60/779,171 <151> 2006-03-03 <150> US 60/787,361 <151> 2006-03-30 <150> US 60/842,400 <151> 2006-09-05 <160> 42 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> VH ML15-5F7 <400> 1 caggtccagc tgaagcagtc tggagctgag ctggtgaggc ctgggacttc agtgaagatg 60 tcctgcaagg cttctggcta caccttcact accttctata tacactgggt gaagcagagg 120 cctggacagg gccttgagtg gattggaatg attggtcctg gaagtggtaa tacttactac 180 aatgagatgt tcaaggacaa ggccacattg actgtagaca catcctccag cacagcctac 240 atgcagctca gcagcctcac atctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aagagcaaag 300 tcagctcggg cggcctggtt tgcttactgg ggccaaggga ctctggtcac 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Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Val Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Thr Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Val Glu Gly Gly Thr Trp Asp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 39 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ig gamma-1 constant region <400> 39 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Phe Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 40 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ig gamma-1 constant region mutant <400> 40 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 41 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ig Kappa constant region <400> 41 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 1 5 10 15 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 35 40 45 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 85 90 95 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 42 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ig Lambda constant region <400> 42 Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 35 40 45 Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 50 55 60 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser 65 70 75 80 His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 85 90 95 Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105

Claims (116)

1. Aβ(1-42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성 보다 큰 Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 결합 친화성을 갖는 항체.
2. 제1항에 있어서, Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성이 Aβ(1 -42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성 보다 10배 이상 큰 항체.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성이 Aβ(1 -42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성 보다 100배 이상 큰 항체.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성이 Aβ(1-42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성 보다 1000배 이상 큰 항체.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성이 Aβ(1-42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성 보다 10000배 이상 큰 항체.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성이 Aβ(1-42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성 보다 100000배 이상 큰 항체.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 1x10^-6 M 내지 1x10^-12 M 범위의 K_D로 Aβ(20-42) 글로불로머와 결합하는 항체.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 1x10^-7 M 또는 이를 초과하는 K_D 친화성으로 Aβ(20-42) 글로불로머와 결합하는 항체.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 1x10^-8 M 또는 이를 초과하는 K_D 친화성으로 Aβ(20-42) 글로불로머와 결합하는 항체.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 1x10^-9 M 또는 이를 초과하는 K_D 친화성으로 Aβ(20-42) 글로불로머와 결합하는 항체.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 1x10^-10 M 또는 이를 초과하는 K_D 친화성으로 Aβ(20-42) 글로불로머와 결합하는 항체.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 1x10^-11 M 또는 이를 초과하는 K_D 친화성으로 Aβ(20-42) 글로불로머와 결합하는 항체.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성이 Aβ(12-42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성 보다 큰 항체.
14. 제13항에 있어서, Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성이 Aβ(12-42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성 보다 10배 이상 큰 항체.
15. 제13항 또는 제14항에 있어서, Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성이 Aβ(12 -42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성 보다 100배 이상 큰 항체.
16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성이 Aβ(12-42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성 보다 1000배 이상 큰 항체.
17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성이 Aβ(12-42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성 보다 10000배 이상 큰 항체.
18. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성이 Aβ(12-42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성 보다 100000배 이상 큰 항체.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 1xIO^-6 M 내지 1x10^-12 M 범위의 K_D로 Aβ(20-42) 글로불로머에 결합하고 , 10^-12 M 또는 그보다 작은 K_D 친화성으로 Aβ(1-42) 글로불로머에 결합하며, Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 결합 친화성이 Aβ(1-42) 글로불로머에 대한 결합 친화성 보다 큰 항체.
20. 제19항에 있어서, 10^-12 M 또는 그보다 작은 K_D 친화성으로 Aβ(12-42) 글로불로머에 결합하고, Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 결합 친화성이 Aβ(12-42) 글로불로머에 대한 결합 친화성 보다 큰 항체.
21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성이 Aβ(1 -42) 단량체에 대한 항체의 결합 친화성 보다 10배 이상 큰 항체.
22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성이 Aβ(1 -42) 단량체에 대한 항체의 결합 친화성 보다 100배 이상 큰 항체.
23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성이 Aβ(1-42) 단량체에 대한 항체의 결합 친화성 보다 1000배 이상 큰 항체.
24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성이 Aβ(1-42) 단량체에 대한 항체의 결합 친화성 보다 10000배 이상 큰 항체.
25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성이 Aβ(1-42) 단량체에 대한 항체의 결합 친화성 보다 100000배 이상 큰 항체.
26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 1x10^-8 M 또는 그보다 작은 K_D 친화성으로 Aβ(1-42) 단량체와 결합하는 항체.
27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 1x10^-7 M 또는 그보다 작은 K_D 친화성으로 Aβ(1-42) 단량체와 결합하는 항체.
28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 1x10^-6 M 또는 그보다 작은 K_D 친화성으로 Aβ(1-42) 단량체와 결합하는 항체.
29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 1x10^-5 M 또는 그보다 작은 K_D 친화성으로 Aβ(1-42) 단량체와 결합하는 항체.
30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성이 Aβ(1-40) 단량체에 대한 항체의 결합 친화성 보다 10배 이상 큰 항체.
31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성이 Aβ(1-40) 단량체에 대한 항체의 결합 친화성 보다 100배 이상 큰 항체.
32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성이 Aβ(1-40) 단량체에 대한 항체의 결합 친화성 보다 1000배 이상 큰 항체.
33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성이 Aβ(1-40) 단량체에 대한 항체의 결합 친화성 보다 10000배 이상 큰 항체.
34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성이 Aβ(1-40) 단량체에 대한 항체의 결합 친화성 보다 100000배 이상 큰 항체.
35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 1x10^-8 M 또는 그보다 작은 K_D 친화성으로 Aβ(1-40) 단량체와 결합하는 항체.
36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 1x10^-7 M 또는 그보다 작은 K_D 친화성으로 Aβ(1-40) 단량체와 결합하는 항체.
37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 1x10^-6 M 또는 그보다 작은 K_D 친화성으로 Aβ(1-40) 단량체와 결합하는 항체.
38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 1x10^-5 M 또는 그보다 작은 K_D 친화성으로 Aβ(1-40) 단량체와 결합하는 항체.
39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성이 Aβ(1-42) 피브릴(fibril)에 대한 항체의 결합 친화성 보다 10배 이상 큰 항체.
40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성이 Aβ(1-42) 피브릴에 대한 항체의 결합 친화성 보다 100배 이상 큰 항체.
41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성이 Aβ(1-42) 피브릴에 대한 항체의 결합 친화성 보다 1000배 이상 큰 항체.
42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성이 Aβ(1-42) 피브릴에 대한 항체의 결합 친화성 보다 10000배 이상 큰 항체.
43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성이 Aβ(1-42) 피브릴에 대한 항체의 결합 친화성 보다 100000배 이상 큰 항체.
44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 1x10^-8 M 또는 그보다 작은 K_D 친화성으로 Aβ(1-42) 피브릴과 결합하는 항체.
45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 1x10^-7 M 또는 그보다 작은 K_D 친화성으로 Aβ(1-42) 피브릴과 결합하는 항체.
46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 1x10^-6 M 또는 그보다 작은 K_D 친화성으로 Aβ(1-42) 피브릴과 결합하는 항체.
47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 1x10^-5 M 또는 그보다 작은 K_D 친화성으로 Aβ(1-42) 피브릴과 결합하는 항체.
48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성이 Aβ(1-40) 피브릴에 대한 항체의 결합 친화성 보다 10배 이상 큰 항체.
49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성이 Aβ(1-40) 피브릴에 대한 항체의 결합 친화성 보다 100배 이상 큰 항체.
50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성이 Aβ(1-40) 피브릴에 대한 항체의 결합 친화성 보다 1000배 이상 큰 항체.
51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성이 Aβ(1-40) 피브릴에 대한 항체의 결합 친화성 보다 10000배 이상 큰 항체.
52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, Aβ(20-42) 글로불로머에 대한 항체의 결합 친화성이 Aβ(1-40) 피브릴에 대한 항체의 결합 친화성 보다 100000배 이상 큰 항체.
53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 1x10^-8 M 또는 그보다 작은 K_D 친화성으로 Aβ(1-40) 피브릴과 결합하는 항체.
54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 1x10^-7 M 또는 그보다 작은 K_D 친화성으로 Aβ(1-40) 피브릴과 결합하는 항체.
55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 1x10^-6 M 또는 그보다 작은 K_D 친화성으로 Aβ(1-40) 피브릴과 결합하는 항체.
56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 1x10^-5 M 또는 그보다 작은 K_D 친화성으로 Aβ(1-40) 피브릴과 결합하는 항체.
57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 분리된 항체.
58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체.
59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 항체.
60. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 항체 또는 사람화된 항체.
61. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7241로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체 5F7, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7239로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체 10F11, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7240으로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체 7C6, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7242로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체 4B7, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7408로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체 2F2, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7409로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체 6A2, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7405로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체 4D10, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7809로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체 7E5, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7810로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체 10C1, 및 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7851로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체 3B10으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 모노클로날 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체.
62. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7241로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체 5F7, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7239로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체 10F11, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7240으로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체 7C6, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7242로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체 4B7, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7408로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체 2F2, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7409로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체 6A2, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7405로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체 4D10, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7809로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체 7E5, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7810로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체 10C1, 및 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7851로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체 3B10으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 모노클로날 항체의 중쇄 CDR3의 아미노산 서열 및/또는 경쇄 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
63. 제62항에 있어서, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7241로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체 5F7, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7239로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체 10F11, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7240으로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체 7C6, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7242로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체 4B7, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7408로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체 2F2, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7409로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체 6A2, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7405로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체 4D10, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7809로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체 7E5, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7810로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체 10C1, 및 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7851로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체 3B10으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 모노클로날 항체의 중쇄 CDR2의 아미노산 서열 및/또는 경쇄 CDR2의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
64. 제62항 또는 제63항에 있어서, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA- 7241로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체 5F7, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7239로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체 10F11, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7240으로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체 7C6, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7242로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체 4B7, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7408로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체 2F2, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7409로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체 6A2, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7405로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체 4D10, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7809로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체 7E5, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7810로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체 10C1, 및 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7851로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체 3B10으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 모노클로날 항체의 중쇄 CDR1의 아미노산 서열 및/또는 경쇄 CDR1의 아미노산 서열을 포함하는 항체.
65. 제1항에 있어서, 서열번호 3의 아미노산 잔기 31번 내지 35번, 서열번호 3의 아미노산 잔기 50번 내지 66번, 서열번호 3의 아미노산 잔기 99번 내지 109번, 서열번호 4의 아미노산 잔기 24번 내지 39번, 서열번호 4의 아미노산 잔기 55번 내지 61번, 서열번호 4의 아미노산 잔기 94번 내지 102번, 서열번호 7의 아미노산 잔기 31번 내지 35번, 서열번호 7의 아미노산 잔기 50번 내지 66번, 서열번호 7의 아미노산 잔기 97번 내지 109번, 서열번호 8의 아미노산 잔기 24번 내지 39번, 서열번호 8의 아미노산 잔기 55번 내지 61번, 서열번호 8의 아미노산 잔기 94번 내지 102번, 서열번호 11의 아미노산 잔기 31번 내지 35번, 서열번호 11의 아미노산 잔기 50번 내지 65번, 서열번호 11의 아미노산 잔기 98번 내지 107번, 서열번호 12의 아미노산 잔기 24번 내지 39번, 서열번호 12의 아미노산 잔기 55번 내지 61번, 서열번호 12의 아미노산 잔기 94번 내지 102번, 서열번호 15의 아미노산 잔기 31번 내지 35번, 서열번호 15의 아미노산 잔기 50번 내지 66번, 서열번호 15의 아미노산 잔기 99번 내지 107번, 서열번호 16의 아미노산 잔기 24번 내지 40번, 서열번호 16의 아미노산 잔기 56번 내지 62번, 서열번호 16의 아미노산 잔기 95번 내지 103번, 서열번호 19의 아미노산 잔기 31번 내지 35번, 서열번호 19의 아미노산 잔기 50번 내지 66번, 서열번호 19의 아미노산 잔기 99번 내지 109번, 서열번호 20의 아미노산 잔기 24번 내지 39번, 서열번호 20의 아미노산 잔기 55번 내지 61번, 서열번호 20의 아미노산 잔기 94번 내지 102번, 서열번호 23의 아미노산 잔기 31번 내지 35번, 서열번호 23의 아미노산 잔기 50번 내지 66번, 서열번호 23의 아미노산 잔기 99번 내지 109번, 서열번호 24의 아미노산 잔기 24번 내지 39번, 서열번호 24의 아미노산 잔기 55번 내지 61번, 서열번호 24의 아미노산 잔기 94번 내지 102번, 서열번호 27의 아미노산 잔기 31번 내지 35번, 서열번호 27의 아미노산 잔기 50번 내지 65번, 서열번호 27의 아미노산 잔기 98번 내지 101번, 서열번호 28의 아미노산 잔기 24번 내지 39번, 서열번호 28의 아미노산 잔기 55번 내지 61번, 서열번호 28의 아미노산 잔기 94번 내지 102번, 서열번호 31의 아미노산 잔기 31번 내지 35번, 서열번호 31의 아미노산 잔기 50번 내지 66번, 서열번호 31의 아미노산 잔기 99번 내지 107번, 서열번호 32의 아미노산 잔기 24번 내지 40번, 서열번호 32의 아미노산 잔기 56번 내지 62번, 서열번호 32의 아미노산 잔기 95번 내지 103번, 서열번호 35의 아미노산 잔기 31번 내지 35번, 서열번호 35의 아미노산 잔기 50번 내지 66번, 서열번호 35의 아미노산 잔기 99번 내지 107번, 서열번호 36의 아미노산 잔기 24번 내지 40번, 서열번호 36의 아미노산 잔기 56번 내지 62번, 서열번호 36의 아미노산 잔기 95번 내지 103번, 서열번호 38의 아미노산 잔기 31번 내지 35번, 서열번호 38의 아미노산 잔기 50번 내지 66번, 및 서열번호 38의 아미노산 잔기 98번 내지 109번으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체.
66. 제65항에 있어서, 3개 이상의 CDR을 포함하는 항체.
67. 제66항에 있어서, 3개 이상의 CDR이 하기로 이루어진 가변 도메인 CDR 세트로부터 선택되는 항체.

    

    

    
68. 제67항에 있어서, 2개 이상의 가변 도메인 CDR 세트를 포함하는 항체.
69. 제68항에 있어서, 2개 이상의 가변 도메인 CDR 세트가 VH 5F7 CDR 세트 및 VL 5F7 CDR 세트; VH 10F11 CDR 세트 및 VL 10F11 CDR 세트; VH 7C6 CDR 세트 및 VL 7C6 CDR 세트; VH 4B7 CDR 세트 및 VL 4B7 CDR 세트; VH 2F2 CDR 세트 및 VL 2F2 CDR 세트; VH 6A2 CDR 세트 및 VL 6A2 CDR 세트; VH 4D10 CDR 세트 및 VL 4D10 CDR 세트; VH 7E5 CDR 세트 및 VL 7E5 CDR 세트; 및 VH 10C1 CDR 세트 및 VL 10C1 CDR 세트로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 항체.
70. 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 11 , 서열번호 12, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 31 , 서열번호 32, 서열번호 35, 서열번호 36, 및 서열번호 38로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 가변 도메인을 포함하는 항체.
71. 제70항에 있어서, 2개의 가변 도메인이 서열번호 3 및 서열번호 4, 서열번호 7 및 서열번호 8, 서열번호 11 및 서열번호 12, 서열번호 15 및 서열번호 16, 서열번호 19 및 서열번호 20, 서열번호 23 및 서열번호 24, 서열번호 27 및 서열번호 28, 서열번호 31 및 서열번호 32, 및 서열번호 35 및 서열번호 36으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 항체.
72. 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 불변 영역을 포함하는 항체.
73. 제72항에 있어서, IgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgM, IgA, IgD 및 IgE 불변 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체.
74. 제73항에 있어서, IgG1 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체.
75. 제72항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 불변 영역이 사람 불변 영역인 항체.
76. 제72항에 있어서, 불변 영역이 서열번호 39 내지 42로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체.
77. 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 당화 패턴을 갖는 항체.
78. 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7241로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체(5F7).
79. 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7239로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체(10F11).
80. 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7240으로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체(7C6).
81. 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7242로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체(4B7).
82. 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7408로 지정된 하이브리도마로부 터 수득가능한 모노클로날 항체(2F2).
83. 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7409로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체(6A2).
84. 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7405로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체(4D10).
85. 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7809로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체(7E5).
86. 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7810로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체(10C1).
87. 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호 PTA-7851로 지정된 하이브리도마로부터 수득가능한 모노클로날 항체(3B10).
88. 제1항 내지 제87항 중 어느 한 항에 따른 항체의 항원 결합 잔기.
89. 제88항에 있어서, 잔기가 항체의 Fab 단편, F(ab')₂ 단편 또는 단일쇄 Fv 단 편인 항원 결합 잔기.
90. PTA-7241 , PTA-7239, PTA-7240, PTA-7242, PTA-7408, PTA-7409, PTA-7405, PTA-7809, PTA-7810 및 PTA-7851로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 기탁 번호에 의해 지정된 하이브리도마.
91. 제1항 내지 제89항 중 어느 한 항에 따른 항체 아미노산 서열을 암호화하는 분리된 핵산.
92. 제91항에 따른 분리된 핵산을 포함하는 벡터.
93. 제92항에 있어서, pcDNA, pTT, pTT3, pEFBOS, pBV, pJV, 및 pBJ로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 벡터.
94. 제92항 또는 제93항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
95. 제94항에 있어서, 원핵 세포인 숙주 세포.
96. 제95항에 있어서, 원핵 세포가 이. 콜리(E. coli)인 숙주 세포.
97. 제94항에 있어서, 진핵 세포인 숙주 세포.
98. 제97항에 있어서, 진핵 세포가 원생생물 세포, 동물 세포, 식물 세포 및 진균 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 숙주 세포.
99. 제98항에 있어서, 동물 세포가 포유동물 세포, 조류 세포 및 곤충 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 숙주 세포.
100. 제97항에 있어서, 진핵 세포가 CHO 세포, COS 세포 또는 효모 세포인 숙주 세포.
101. 제100항에 있어서, 효모 세포가 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)인 숙주 세포.
102. 제99항에 있어서, 곤충 세포가 곤충 Sf9 세포인 숙주 세포.
103. 항체를 생산하기에 적합한 조건하에서, 제94항 내지 제102항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포 또는 제90항에 따른 하이브리도마를 배양 배지에서 배양함을 포함하는, 항체의 제조 방법.
104. 제103항에 따른 방법에 의해 수득가능한 항체.
105. 제1항 내지 제89항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원 결합 잔기를 포함하는 조성물.
106. 제105항에 있어서, 약제학적 조성물이고 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 조성물.
107. 아밀로이드증의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제조하기 위한, 제1항 내지 제89항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원 결합 잔기의 용도.
108. 제107항에 있어서, 약제학적 조성물이 수동 면역화를 위한 것인 용도.
109. 아밀로이드증의 진단용 조성물을 제조하기 위한 제1항 내지 제89항 중 어느 한 항에 정의된 항체 또는 항원 결합 잔기의 용도.
110. 제107항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 아밀로이드증이 알츠하이머 질환인 용도.
111. 제107항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 아밀로이드증이 다운 증후군 의 아밀로이드증인 용도.
112. 제1항 내지 제89항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원 결합 잔기를 피검체에 투여함을 포함하는, 이를 필요로 하는 피검체에서 아밀로이드증을 치료하거나 예방하는 방법.
113. 제112항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 잔기의 투여가 수동 면역화를 위한 것인 방법.
114. 아밀로이드증을 가질 것으로 의심되는 피검체 기원의 샘플을 제공하고, 당해 샘플을 제1항 내지 제89항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원 결합 잔기와 접촉시키고, 항원과 항체 또는 항원 결합 잔기를 포함하는 복합체의 형성을 검출함을 포함하고, 이때 복합체의 존재가 피검체에서 아밀로이드증을 지적하는 것인, 아밀로이드증을 진단하는 방법.
115. 제112항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 아밀로이드증이 알츠하이머 질환인 방법.
116. 제112항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 아밀로이드증이 다운 증후군의 아밀로이드증인 방법.

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