CN1329413C

CN1329413C - 一种治疗或预防老年性痴呆的抗体及其表达载体和在制药中的应用

Info

Publication number: CN1329413C
Application number: CNB200610037930XA
Authority: CN
Inventors: 陈琪; 乐珅; 李玥; 夏骏
Original assignee: Nanjing Medical University
Current assignee: Nanjing University; Nanjing Medical University
Priority date: 2006-01-23
Filing date: 2006-01-23
Publication date: 2007-08-01
Anticipated expiration: 2026-01-23
Also published as: CN1803842A

Abstract

本发明公开了一种治疗或预防老年性痴呆的抗体及其表达载体和在制药中的应用。该抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.2所述，编码该抗体的核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，该抗体是β-淀粉样多肽的特异性抗体。该抗体、其核苷酸及表达载体可用于制备免疫治疗或预防老年性痴呆的药物。

Description

一种治疗或预防老年性痴呆的抗体及其表达载体和在制药中的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种治疗或预防老年性痴呆的抗体，本发明还涉及该抗体的表达载体和它们在制药中的应用。

背景技术

老年性痴呆，又称阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种严重危害人类健康的神经退行性疾患，是老年期痴呆最常见的形式之一。AD患者主要表现为记忆减退、认知障碍和空间辨别能力缺失，在疾病晚期甚至出现运动和感觉功能障碍、癫痫发作等症状。目前全世界AD发病人数高达1200万，并呈现逐年增长的态势。目前在临床上治疗AD的方法主要有五种：一是保护神经使之免受损伤，二是应用胆碱酯酶抑制剂防止因脑内核团细胞障碍所引起的乙酰胆碱的缺失，三是非药物干预和精神药物的应用以改善行为障碍，四是保健活动，五是对病人的关怀。然而所有这些方法均为改善病人症状，并非对因治疗。

典型的AD病理标志为大量的老年斑沉积于脑内。这种老年斑的主要成分是β-淀粉样多肽(Aβ)，由40～42个氨基酸组成，系β淀粉样前体蛋白(APP)的酶解产物，其中以Aβ₄₂更具细胞毒性。当前认为，Aβ的形成和积聚在AD发病过程中起关键作用。Aβ生成和沉积后，可继发性引起神经纤维缠结的生成、氧化和脂质过氧化反应、谷氨酸源性兴奋毒性、炎症反应以及激活凋亡性细胞死亡的级联反应。所有这些继发性反应，进一步放大了Aβ的毒性作用，因此也成为抗AD病因学疗法的潜在靶点。但是显而易见，治疗AD真正有效的靶标应为降低脑内的Aβ。

1999年，美国Elan公司的Schenk等人率先报告，向AD模型小鼠体内直接注入Aβ_1-42，可减少血浆β淀粉样蛋白水平，抑制Aβ沉积在已有的斑块上，清除脑内的老年斑块。以后又陆续有报告证实，用可溶性Aβ免疫小鼠后不仅能减轻中枢淀粉样蛋白负荷，同时还有改善认知的作用。Elan公司迅速开发了新型疫苗AN-1792，应用于AD造型动物，效果显著，并开始临床实验。但在II期临床实验中，6％的患者出现了严重中枢神经***无菌性炎症，AD疫苗治疗试验被迫终止。尸检证实疫苗治疗所致的无菌性脑膜脑炎主是由T细胞介导自身免疫反应结果。

一般认为Aβ接种机体后的治疗作用主要通过抗体的桥梁作用予以实现：外源性Aβ可刺激机体产生特异性抗体，后者与Aβ结合形成抗原抗体复合物，并通过单核-巨噬细胞Fc受体进入细胞，使Aβ得到降解。既然如此，能否不注射Aβ、而向机体输入Aβ抗体以达到同样的治疗效果？自2000年以来，先后有数个研究小组用抗Aβ抗体注射过度表达APP的转基因小鼠，结果均发现能明显减轻Aβ负荷，使脑内的淀粉样蛋白斑块得到清除，而且无论是外周静脉注射或者腹膜内注射都能收到明显效果。

然而已有的报告多用鼠源性单抗，对人体来说是一种异种蛋白，能够引起人的机体免疫***产生人抗鼠抗体(HAMA)，这在很大程度上限制了其在人体中的应用。因为HAMA不仅可以使抗体的效价降低，增加鼠源性单抗的清除率，影响其治疗效果，更严重的是可以引起***反应，威胁患者的生命安全。

近年来，随着分子生物学技术的发展，基因工程方法为抗体的制备研究开辟了一个全新的领域，这就是基因工程抗体。建立在PCR技术和噬菌体表面呈现(phage display)技术基础上的噬菌体抗体库技术的出现则可称基因工程抗体领域的革命性进展，该技术用细菌克隆取代B细胞克隆表达抗体，不经细胞融合，甚至不经免疫，就能较为方便地制备针对任何抗原的人源性抗体分子。它使得高特异性、高亲和性的人源性抗体的获得成为可能。用这种方法获得的抗体分子为人源性的抗体，可直接用于人体治疗，减少可能产生的毒副作用；同时又因其分子量较小，易于穿透各种生物屏障(如血脑屏障)，能够到达病变部位直接发挥作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种治疗或预防老年性痴呆的抗体。

本发明的另一个目的是提供上述抗体的表达载体。

本发明的另一个目的是提供该抗体、编码该抗体的核苷酸及它们的表达载体在制药中的应用。

本发明选择Aβ作为靶标，应用噬菌体抗体库技术，筛选得到抗Aβ的特异性噬菌体抗体，并表达获得可溶性scFv抗体片断，并用Western blot的方法鉴定其抗体活性，体外鉴定其生物活性和细胞保护作用。筛选获得的抗Aβ抗体及其基因片段和表达载体，可用于制备免疫治疗或预防老年性痴呆的新药物。

本发明的目的是通过下列措施实现的：

一种治疗或预防老年性痴呆的抗体，该抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.2所述。

所述的抗体为单克隆抗体。

所述的抗体为可溶性scFv抗体片断。

所述的抗体的表达载体，包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体、大肠杆菌。

编码上述所述抗体的核苷酸，其序列如SEQ ID No.1所述。

所述的核苷酸的表达载体，包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体、大肠杆菌。

所述的抗体在制备治疗或预防老年性痴呆药物中的应用。

所述的核苷酸在制备治疗或预防老年性痴呆药物中的应用。

所述的表达载体在制备治疗或预防老年性痴呆药物中的应用。

本发明的有益效果：

本发明通过噬菌体抗体库技术，筛选得到一个新型的抗β-淀粉样多肽(Aβ)的人源性单链抗体(氨基酸序列如SEQ ID NO.2)。该抗体可以抑制和解除β-淀粉样多肽的聚集，发挥细胞保护作用。该抗体可作为老年性痴呆的一种治疗性抗体，用于制备治疗老年性痴呆的药物。编码该抗体的核苷酸以及它们的表达载体也可用于制备治疗老年性痴呆的药物。

附图说明

图1是单克隆噬菌体展示抗体的ELISA检测结果。

图2是本发明抗Aβ可溶性单链抗体SDS-PAGE结果。

其中：M：蛋白分子量标准；1：诱导表达后的培养液上清和周质腔提取物；2：经His-Trap亲和层析的纯化蛋白成分。

图3是本发明抗Aβ可溶性单链抗体Western blot结果。

图4是本发明抗Aβ可溶性单链抗体对Aβ聚集影响的电镜照片。

其中：A，B：20μM的Aβ40在37℃孵育2周；C，D：20μM E3单链抗体与20μMAβ40共同在37℃孵育2周；E，F：20μM BSA与20μM Aβ40共同在37℃孵育2周。Bar(A，C，E)＝500nm，Bar(B，D，F)＝100nm。

图5是ThT荧光定量测定本发明抗Aβ可溶性单链抗体对Aβ聚集影响。

其中：*：P＜0.05，与各时间点的对照组荧光值比较；^**：P＜0.01，与各时间点的对照组荧光值比较。

图6是本发明抗Aβ可溶性单链抗体解聚Aβ纤维的电镜照片。

其中：A：成熟的Aβ40聚集纤维；B，C：20μM Aβ40纤维单独继续37℃孵育10天；D：20μMBSA与20μM Aβ40纤维共同在37℃孵育10天；E，F：20μM E3单链抗体与20μMAβ40纤维共同在37℃孵育10天。Bar(A，B，D，E)＝500nm，Bar(C，F)＝1μm。

图7是MTT测定不同浓度抗Aβ可溶性单链抗体条件下Aβ的细胞毒性作用

其中：*：P＜0.05，与对照组相比；Δ：P＜0.05，与Aβ 20μM处理组相比。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。

实施例1

制备方法及鉴定实验：

(一)、人噬菌体抗体库的扩增：

1、将Griffin.1噬菌体展示人源性单链抗体库(约1×10¹⁰克隆)接种到500ml2×TY-AMP-GLU培养基，37℃，220rpm振荡培养至OD₆₀₀为0.5(约1.5-2h)。

2、从中取25ml培养液(约1×10¹⁰个细菌)，用M13K07辅助噬菌体超感染。感染比例为1∶20(细菌数：辅助噬菌体数)。于37℃水浴中，静置30min。

3、3300g，4℃离心10min，用30ml 2×TY-AMP-KAN培养基重悬沉淀。

4、将菌液添加到470 ml预温的2×TY-AMP-KAN培养基中，30℃，220rpm振荡培养过夜。

5、10800g，4℃离心10min，弃沉淀。

6、收集上清，加入1/5上清体积的PEG/NaCl(20％聚乙二醇-2.5M NaCl，下同)溶液，彻底混合后4℃静置1h或更长时间以沉淀噬菌体。

7、3300g，4℃离心30min，沉淀物重悬于40ml ddH20和8ml PEG/NaCl溶液中。彻底混合后4℃静置20min或更长时间。

8、3300g，4℃离心10min，吸弃上清。

9、简单离心，吸除剩余的PEG/NaCl。

10、沉淀物用5ml PBS重悬，分装到Eppendorf管(简称Ep管)中。

11、11600g，4℃离心10min，弃细菌碎片及杂质，上清转移至新的Eppendorf管中。

12、噬菌体上清短期可保存于4℃。如需长期贮存，则加甘油至终浓度为15％，存于-70℃。

噬菌体滴度测定：

1、取1μl噬菌体上清加入1ml的PBS中(1∶10³)

2、取1μl转化1ml指数生长期^*(OD₆₀₀约0.4-0.6)的E.coli TG1，37℃水浴30min(1∶10⁶)

3、取10μl加入990μl的2×TY培养基中(1∶10⁸)

4、取10μl加入990μl的2×TY培养基中(1∶10¹⁰)

5、取10μl加入990μl的2×TY培养基中(1∶10¹²)

6、从1∶10⁶、1∶10⁸、1∶10¹⁰、1∶10¹²倍比稀释的菌液中各取50μl，涂TYE-AMP-GLU平板，37℃培养过夜。次日记数细菌克隆数以计算噬菌体滴度。

^*：噬菌体/噬菌粒(phage/phagemid)能够感染性菌毛阳性(F⁺)的大肠杆菌，大肠杆菌必须在37℃培养至指数生长期(OD₆₀₀约0.4-0.6)，这时细菌会产生性菌毛，从而具备较高的感染效率。在整个筛选以及鉴定的过程中，都需要制备这种状态的大肠杆菌。

准备步骤如下：

1、大肠杆菌划M9平板，37℃培养至菌落可见。

2、从M9平板上挑单克隆，接种于5ml 2×TY培养基，37℃，220rpm振荡培养过夜。

3、次日，吸取过夜培养的菌液，以1∶100比例加入到新鲜的2×TY培养基中，37℃振荡培养至指数生长期(OD₆₀₀约0.4-0.6)，可用于噬菌体的转化。

4、感染前将菌液短时间置于冰上能够增强感染效果，但如果超过30min，大肠杆菌的性菌毛就会丢失而不能被感染。

(二)、制备次级噬菌体抗体库：

1、接(一)2步骤，剩余的475ml培养液继续37℃振荡培养2h。

2、3300g，4℃离心30min，将细菌沉淀重悬于10ml 2×TY培养基中(含有15％的甘油)，分装成10个Eppendorf管，每管1ml。

3、将次级噬菌体抗体库保存于-70℃。再次使用前，用PCR的方法鉴定阳性克隆率及检测噬菌体滴度。

(三)、筛选Aβ1-40(即由1-40位氨基酸组成的Aβ，简称Aβ40)特异性人源化抗体：

1、用戊二醛法包被抗原Aβ1-40：

(1)、用含有0.2％戊二醛(V/V)的100mmol/L磷酸钠缓冲液(pH5.0)处理Nunc免疫管4h。

(2)、用上述缓冲液洗涤Nunc管2次。

(3)、加入4ml用100mmol/L磷酸钠缓冲液(pH 8.0)溶解的Aβ1-40(20μg/ml)，37℃反应3h。

(4)、用0.9％NaCl溶液洗涤2次。

(5)、在Nunc管中加满含2％脱脂奶粉的PBS(MPBS)，37℃封闭2h。

(6)、PBS洗涤3次。

2、筛选特异性人源性单克隆抗体：

(1)、每轮筛选在Nunc管中加入约10¹² t.u.(转染后菌落形成单位)的噬菌体到4ml2％MPBS中。

(2)、将Nunc管置于旋转转盘上，室温下持续翻转30min，再竖直放置，室温下至少90min。弃上清中未结合的噬菌体。

(3)、第1轮筛选用PBS-T(含0.1％Tween-20)洗涤Nunc管10次，再用PBS洗涤10次。第2轮及以后每轮筛选均用PBS-T洗涤Nunc管20次，再用PBS洗涤20次。

(4)、加入1ml 100mmol/L的三乙胺，将Nunc管置于旋转转盘上持续翻转30min以洗脱特异性结合的噬菌体。第2轮及以后每轮筛选中，先加入1ml 100mmol/L的三乙胺预洗脱10min，弃预洗脱液，加入新的1ml 100mmol/L的三乙胺洗脱特异性结合的噬菌体。

(5)、洗脱过程中，在Ep管中预先准备0.5ml 1.0mol/L的Tris-HCl(pH7.4)，用以快速中和洗脱的特异噬菌体。中和后的噬菌体短期可保存于4℃或用于转染E.coli TGl。

(6)、取0.75ml洗脱的噬菌体转染4.25ml指数生长期的E.coli TG1，37℃水浴静置30min。

(7)、取100μl倍比稀释测定噬菌体的滴度：

取100μl加入900μl的2×TY培养基中(1∶10)

取100μl加入900μl的2×TY培养基中(1∶10²)

取100μl加入900μl的2×TY培养基中(1∶10³)

取100μl加入900μl的2×TY培养基中(1∶10⁴)

从1∶10、1∶10²、1∶10³、1∶10⁴倍比稀释的菌液中各取50μl，涂TYE-AMP-GLU平板，37℃培养过夜。次日记数细菌克隆数以计算噬菌体滴度。

(8)、剩余感染的细菌3300g，4℃离心10min，用500μl 2×TY培养基重悬细菌沉淀。

(9)、将500μl菌液全部涂TYE-AMP-GLU平板数块，30℃培养过夜或至菌落可见。

(10)、平板上加5-6ml 2×TY(含15％甘油)，用玻璃分选器轻刮下所有菌落，混匀。

(11)、从中取100μl加入100ml 2×TY-AMP-GLU，检测其OD₆₀₀≤0.1。剩余菌液可存于-70℃。

(12)37℃，220rpm振荡培养至OD₆₀₀为0.5(约2h)。

(13)、从中取10ml，用M13K07辅助噬菌体超感染。感染比例为1∶20(细菌数：辅助噬菌体数)。37℃水浴30min。

(14)、3300g，4℃离心10min，沉淀用50ml 2×TY-AMP-KAN培养基重悬。30℃，220rpm振荡培养过夜。

(15)、10800g，4℃离心菌液10min，弃沉淀。

(16)、收集上清，加入1/5体积的PEG/NaCl，冰彻底混合后4℃静置1h以上。

(17)10800g，4℃离心30min，沉淀重悬于40ml ddH₂0和8ml PEG/NaCl溶液中。彻底混合后4℃静置20min或更长时间。

(18)、10800g，4℃离心10min，吸弃上清，简单离心，吸除剩余的PEG/NaCl。

(19)、沉淀用2ml PBS重悬，分装到2个Ep管中。11600g离心10min，弃细菌碎片及杂质，上清转移至新的Ep管中。其中1ml可保存于4℃。另1ml可用于下一轮筛选。

(20)、重复以上筛选步骤，共进行五轮“吸附—洗脱—扩增”富集筛选。

(四)、单克隆噬菌体展示抗体的ELISA鉴定：

1、单克隆噬菌体抗体的制备：

(1)、用第5轮筛选中洗脱的噬菌体转染指数生长期的E.coli TG1，涂TYE-AMP-GLU平板，37℃培养过夜。

(2)、取96孔细胞培养板，每孔加入100μl 2×TY-AMP-GLU。从过夜培养的平板上随机挑选58个菌落接种到96孔板中，37℃，250rpm振荡培养过夜。

(3)、取另一96孔细胞培养板，每孔加入200μl 2×TY-AMP-GLU，从第1块板各孔中分别转移5μl至第2块板。37℃，250rpm振荡培养1h。板1可在每孔中加甘油至终浓度15％，-70℃冻存。

(4)、再在每孔中加入25μl 2×TY-AMP-GLU，其中含有1×10⁹pfu的M13K07辅助噬菌体进行超感染。

(5)、37℃静置30min，继续37℃，250rpm振荡培养1h。

(6)、1800g离心10min，吸除上清。

(7)、每孔中的沉淀分别用200μl 2×TY-AMP-KAN重悬，30℃，250rpm振荡培养过夜。

(8)、1800g离心10min，取上清用于ELISA检测。

ELISA检测：

(1)、用含0.2％戊二醛(V/V)的100mmol/L磷酸钠缓冲液(pH5.0)处理ELISA反应板4h。

(2)、用上述缓冲液洗涤ELISA反应板2次。

(3)、每孔中加入100μl 20μg/ml的用100mmol/L磷酸钠缓冲液(pH8.0)溶解的Aβ1-40，对照组每孔中加入相同缓冲液溶解的，等浓度的BSA，37℃反应3h。

(4)、用0.9％NaCl溶液洗涤2次。

(5)、每孔中加满含2％MPBS，37℃封闭2h。

(6)、PBS洗涤3次。

(7)、每孔中分别加入20μl单克隆噬菌体上清，室温下反应3小时。

(8)、用含0.05％Tween-20的PBS-T清洗3次。

(9)、每孔中加入1∶4000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的抗M13抗体100μl，室温下反应3小时。

(10)PBS-T清洗3次。

(11)、每孔中加入100μl的TMB底物液，室温下反应10min。

(12)、显色清晰后每孔加入50μl 1mol/L的硫酸终止反应。

(13)测定每孔450nm的吸光值(A₄₅₀)，阴性对照组用M13K07辅助噬菌体代替噬菌体抗体克隆。

(五)、噬菌体抗体DNA序列鉴定

1、pHEN2噬菌粒的提取和纯化：参照大连宝生物公司质粒DNA小量纯化试剂盒说明书操作。

2、1％琼脂糖凝胶电泳，鉴定质粒抽提效果。

3、PCR反应。

引物：

上游：LMB3：5’-CAG GAA ABA GCT ATG AC-3’(SEQ ID No.3)

下游：Fd seq1：5’-GAA TTT TCT GTA TGA ACC-3’(SEQ ID No.4)

反应体系：

10×PCR反应缓冲液 2μl

25mmol/L MgCl₂ 1.5μl

2mmol/L dNTPs 1.5μl

上游引物(10μM) 0.5μl

下游引物(10μM) 0.5μl

模板DNA 1μl

Taq酶 0.2μl

ddH2O 13μl

总体积 20μl

反应条件：

95℃ 5min

72℃ 7min

4、1％琼脂糖凝胶电泳。

5、出现750bp左右条带的阳性克隆，噬菌粒送上海英骏生物技术有限公司测定序列。

(六)、抗Aβ可溶性ScFv的诱导表达与纯化

1、单克隆噬菌体转化E.coli HB2151

(1)、根据以上的鉴定结果，选择阳性克隆，用前述的方法对单克隆噬菌体进行扩增，PEG/NaCl聚集。

(2)、用聚集的单克隆噬菌粒转化指数增长期的E.coli HB2151后涂TYE-AMP-GLU平板，37℃培养过夜。

2、IPTG诱导表达抗Aβ可溶性scFv

(1)、单克隆细菌(即步骤1制备的单克隆噬菌体转化E.coli HB2151)接种于5ml2×TY-AMP-GLU培养基，37℃，220rpm振荡培养过夜。

(2)、从中吸取200μl接种于20ml 2×TY-AMP-GLU培养基，37℃，220rpm振荡培养至OD₆₀₀为0.5(约2h)。

(3)、从中吸取10ml接种于1000ml 2×TY-AMP-GLU培养基，37℃，220rpm振荡培养至OD₆₀₀为0.9(约3h)。

(4)、达到需要的OD值时，4℃，4500rpm，离心15min，弃培养液，细菌沉淀用等体积的新鲜2×TY-AMP培养液重悬。并加入IPTG至终浓度0.1mmol/L，进行诱导表达。

(5)、20℃，220rpm继续振荡培养16-24h。

(6)、4500rpm，4℃离心30min，分别收集上清和细菌沉淀。

3、培养液组分蛋白浓缩

(1)、将盛有1000ml培养液上清的烧杯置于冰上。边规则温和搅拌，边徐徐加入561g硫酸铵，该步骤应在5～10min内完成；

(2)、冰上继续搅拌30min。

(3)、4500rpm，4℃离心30min。

(4)、弃上清，沉淀悬浮于1-2倍沉淀物体积的PBS中，残留的不溶性物质可能是变性蛋白，通过离心除去，得培养液上清组分。

4、细菌周质组分提取

(1)、重溶细菌沉淀(由步骤2(6)产生)于50ml 30mM Tris-HCl pH8.0 20％的蔗糖中。加入100μl 0.5M EDTApH8.0(终浓度为1mM)。加入磁力搅拌棒，室温下缓慢搅拌10min。

(2)、10000g 4℃离心10min收集细胞，去除上清液。

(3)、再50ml的冰冻的5mM的MgSO₄彻底重溶沉淀，在冰上缓慢搅拌悬液10min。此时周质蛋白被释放入缓冲液中。

(4)、10000g 4℃离心10min，收集上清液(周质部分)。

5、His-Trap亲和层析柱纯化抗Aβ scFv可溶性抗体(为表述方便，命名为E3 scFv或E3单链抗体)

参照His-Trap亲和层析柱说明书操作。

(1)、将提取浓缩后的培养液上清组分和细胞周质组分用结合缓冲液透析过夜。用0.45μm滤膜除菌，防止堵塞亲和层析柱。

(2)、5ml去离子水加入亲和层析柱。

(3)、0.5ml 0.1mol/L硫酸镍注入柱中。

(4)、5ml去离子水洗亲和层析柱。

(5)、10ml结合缓冲液平衡层析柱。

(6)、步骤(1)中的过滤样品加入亲和层析柱。流速为1ml/min。

(7)、10ml结合缓冲液加入亲和层析柱，洗去非特异性结合蛋白。

(8)、含100mM、200mM、300mM、400mM、500mM咪唑的洗脱液各1ml，依次加入亲和层析柱，洗去特异性结合的蛋白，500μl/管分段收集洗脱液。

(9)、10ml结合缓冲液加入亲和层析柱。

(10)5ml含0.05M EDTA的结合缓冲液加入层析柱，去除镍离子。

(11)、10ml去离子水洗亲和层析柱。

(12)5ml 20％乙醇加入亲和层析柱，密封层析柱，4度保存。

6、SDS-PAGE初步鉴定抗Aβ可溶性抗体。

(1)凝胶配制：

12％分离胶：		5％浓缩胶：
12％分离胶：		5％浓缩胶：		ddH₂O	1.6ml		1.5ml
30％丙烯酰胺	2.0ml		300μl	ddH₂O	1.6ml		1.5ml
30％丙烯酰胺	2.0ml		300μl	1.5M Tris(pH8.8)	1.3ml	1M Tris(pH6.8)	750μl
10％SDS	50μl		30μl	1.5M Tris(pH8.8)	1.3ml	1M Tris(pH6.8)	750μl
10％SDS	50μl		30μl	10％过硫酸铵(APS)	50μl		50μl
四甲基乙二胺(TEMED)	5μl		5μl	10％过硫酸铵(APS)	50μl		50μl

(2)、取方法5(8)各管洗脱液10μl+2×上样缓冲液10μl混匀，沸水浴5min。

(3)、上样，75V恒压电泳至溴酚蓝指示剂进入分离胶，110V恒压电泳至溴酚蓝完全消失。

(4)、考马斯亮蓝R250染色30min。

(5)、脱色液脱色至底色透明，观察纯化效果。

7、透析脱盐。

(七)、可溶性ScFv抗体的Western blot鉴定

1、Tricine SDS-PAGE电泳

(1)、凝胶配方：

分离胶(15％)		浓缩胶
分离胶(15％)		浓缩胶		ddH₂O	1.1ml		1.5ml
30％丙烯酰胺	2.5ml		300μl	ddH₂O	1.1ml		1.5ml
30％丙烯酰胺	2.5ml		300μl	1.5M Tris(pH 8.8)	1.3ml	1M Tris(pH6.8)	750μl
10％SDS	50μl		30μl	1.5M Tris(pH 8.8)	1.3ml	1M Tris(pH6.8)	750μl
10％SDS	50μl		30μl	10％过硫酸铵	50μl		50μl
四甲基乙二胺	5μl		5μl	10％过硫酸铵	50μl		50μl

(2)、取10μl样品液和10μl 2×加样缓冲液混匀，煮沸变性，1000rpm离心1min。每加样孔中加入样品蛋白(Aβ 1-42或BSA)的量均为20μg。

(3)、拔去梳子，将板置于电泳槽中，加满Tricine电泳缓冲液，依次上样。100V恒压电泳90min。

2、转膜

(1)、电泳完毕后，切去浓缩胶，将胶浸于蛋白转移缓冲液中平衡10-20min，同时准备一块合适大小的PVDF膜。

(2)正确安放电转盒，加入适量的蛋白转移缓冲液，用湿转法将蛋白条带转移电转移至PVDF膜上，0.3A，55min。

(3)电转结束后，将膜从电转盒中取出，标记方向，用PBS简单洗涤。

3、封闭

将膜浸于封闭液(MPBS)中，室温孵育2小时，阻断PVDF膜上的非特异性蛋白结合位点。

4、抗体孵育

(1)、加1∶5稀释的纯化后的抗体上清，4℃摇动下过夜。

(2)、PBS-T洗膜5min×3次。

(3)、加抗c-myc抗体(1∶200稀释)37℃孵育2h。

(4)、PBS-T洗膜5min×3次。去除多余的一抗反应液和非特异性吸附的抗体。

(5)、加入辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG(1∶200稀释)，37℃孵育2h。

(6)、PBS-T洗膜5min×3次。

5、ECL显色：临用前将ECL显色液A与B混合，均匀滴加在膜表面，避光曝片，显影液、定影液中冲洗照片，观察结果。

(八)、透射电子显微镜(TEM)观测

1、Aβ应用液的准备

(1)、将Aβ多肽溶于1％的氢氧化钠溶液中，配成浓度大于5mg/ml的Aβ储存液。

(2)、BCA法蛋白定量

工作液的配制：取BCA蛋白定量检测试剂盒(PIERCE公司)中的A液及B液，按1∶50(V/V)配制工作液。

将10μl稀释的Aβ储存液及0、0.5、1.0、1.5、2.0mg/ml几个不同浓度的标准蛋白溶液分别加入酶标板中，每孔加入工作液200μl，混匀，37℃温育30min，CliniBio-128酶标仪读取波长562nm处吸光值，绘制标准曲线，计算Aβ储存液浓度。

(3)、临用前用包含0.02％NaN₃的50mmol/LPBS稀释，pH 7.5。Aβ0.5mg/ml，37℃连续孵育3天，可使其形成纤维聚集。

2、TEM观测Aβ纤维

(1)、实验分组：

对照组：Aβ 20μM；

scFv处理组：Aβ 20μM，E3 scFv 20μM；

BSA对照组：Aβ 20μM，BSA 20μM。

(2)、37℃静置孵育2周。

(3)、孵育结束后，取10μl蛋白质溶液滴到铜网的碳膜上，自然干燥。

(4)、2％(W/V)的醋酸铀染色。

(5)、JEM-1010透射电子显微镜观察，电镜的工作电压为100kV，放大率为15,000-50,000。

(九)、硫黄素T(ThT)荧光定量检测

1、实验分组：

对照组：Aβ 20μM；

E3(1∶1)组：Aβ 20μM，E3 scFv 20μM；

E3(1∶10)组：Aβ 20μM，E3 scFv 2μM。

2、37℃孵育0、1、2周。

3、取25μl孵育后的样品，与75μl 10μM ThT的稀释液(溶于50mM PBS，pH6.5)混匀。(每组设5个复孔，并设立空白对照，即不含样品的10μM ThT的稀释液)。

4、37℃孵育10min，利用Spectra MAXGEMINI EM微板荧光定量仪测定荧光读数。(激发波长：450nm，发射波长：482nm)

(十)、E3 scFv(E3可溶性抗体)对SK-N-SH细胞Aβ毒性损伤的保护作用

1、神经母细胞瘤(SK-N-SH Neuroblastoma cell)的培养：SK-N-SH细胞接种于含10％小牛血清、100IU/ml庆大霉素的DMEM高糖培养液，置于饱和湿度、5％CO₂、37℃的培养箱中培养。

2、细胞传代和种板：弃去培养液，以D-Hank’s液洗涤细胞2次，加0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA混合液覆盖细胞表面，室温作用2～3min，用倒置显微镜观察见细胞收缩、边缘清晰时，加入含10％小牛血清的DMEM高糖培养液中止胰酶活性，吹打瓶壁上的细胞制成单细胞悬液，调整细胞密度为1×10⁵/ml。100μl/孔种于96孔板中。置于饱和湿度、5％CO₂、37℃的培养箱中培养。

3、细胞线粒体琥珀酸脱氢酶活性测定：在细胞接种24h后，换以含有15-30μM Aβ的培养液，继续培养72h，然后加入5mg/ml MTT溶液10μl，37℃继续培养4h，吸弃上清，加入DMSO 150μl/孔，轻轻震荡10分钟，溶解紫色结晶，在酶联免疫测定仪上读取波长490nm处吸光度，以此反映线粒体的呼吸功能。

4、E3可溶性抗体对SK-N-SH细胞Aβ毒性损伤的保护作用：

(1)、实验分组及处理：

对照组：DMEM正常培养液；

Aβ组：含20μM Aβ的DMEM培养液；

E3处理组：含2-20μM E3 scFv和20μM Aβ的DMEM培养液。

(2)、细胞接种24h后，根据上述分组换以不同的条件培养液，继续培养72h。

(3)、更换新鲜的DMEM高糖培养液，加入5mg/ml MTT溶液10μl，37℃继续培养4h，吸弃上清，加入DMSO 150μl/孔，轻轻震荡10分钟，溶解紫色结晶，在酶联免疫测定仪上读取波长490nm处吸光度，以此反映线粒体的呼吸功能。

结果：

(一)、筛选Aβ40特异性人源性抗体结果：

经过五轮的亲和筛选，随机挑选58个克隆，扩增培养并收集噬菌体抗体，进行ELISA检测。检测中，以M13K07辅助噬菌体代替噬菌体抗体作为阴性对照，消除噬菌体与Aβ多肽的非特异性结合。ELISA检测结果见图1。

(二)、噬菌体抗体的基因与蛋白质序列：

E3单克隆噬菌体抗体经基因测序仪测序获得其具体的抗体基因片段，其中不含终止密码子TAG、TAA、TGA。据此翻译得知抗体重链可变区和轻链可变区基因，利用NCBI (National Center for Biotechnology Information，www.ncbi.nlm.nih.gov)的免疫球蛋白BLAST数据库比对得知该抗体的超变区和支架区氨基酸序列。如表1所示。

(三)、Western blot鉴定可溶性scFv抗体：

1、His-Trap亲和层析柱纯化抗Aβ可溶性单链抗体

IPTG诱导2L E.coli HB2151表达可溶性抗体，取浓缩的培养液上清和周质腔提取液，His-Trap亲和层析，12％SDS-PAGE电泳，可见分子量约31kD的纯化蛋白条带，如图2所示。

2、Western blot鉴定抗Aβ可溶性单链抗体

Western blot检测结果显示，抗Aβ可溶性抗体可与合成的Aβ多肽结合，与BSA无交叉反应。如图3所示。

表1 E3单链抗体(E3 scFv)CDRs和FRs的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)与氨基酸序列(SEQ ID NO.2)。

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTCTGGT

Q V Q L Q E S G P G L V K P S E T L S L T C A V S G

H-CDR1

TACTCCATCAGC AGTGGTTACTACTGGGGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGG AGTATC

Y S I S S G Y Y W G W I R Q P P G K G L E W I G S I

H-CDR2

TATCATAGTGGGAGCACCTACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAG

Y H S G S T Y Y N P S L K S R V T I S V D T S K N Q

H-CDR3

TTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGA GATCTTGGTAGTTCTGTG

F S L K L S S V T A A D T A V Y Y C A R D L G S S V

Linker

AGTTGGGGCCAAGGTACCCTGGTCACCGTCTCGAGT GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTAGTGCA

S W G Q G T L V T V S S G G G G S G G G G S G G S A

CTTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGT CGGATG

L D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I S C R M

L-CDR1

AGTCAGGGCATTAGCAATTATTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCTCCTGATCTAT GCTGCA

S Q G I S N Y L A W Y Q Q K P G K V P K L L I Y A A

L-CDR2

TCCACTTTGCAATCAGGGGTCCCATCTCGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGC

S T L Q S G V P S R F S G S G S G T D F T L T I S S

L-CDR3

CTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGT CAAAAGTATAACAGTGCCCTCGTTACGTTCGGCCAAGGGACCAAG

L Q P E D V A T Y Y C Q K Y N S A L V T F G Q G T K

CTGGAAATCAAACGT

L E I K R

(四)抗Aβ可溶性单链抗体对Aβ体外聚集的影响

1、抗Aβ可溶性单链抗体抑制Aβ的聚集

TEM观测发现，20μM的Aβ40在37℃孵育2周，可聚集形成成熟的纤维。如图4A，B所示，成熟的纤维可形成网状。加入等摩尔浓度的E3单链抗体，与Aβ40共同在37℃孵育2周，可以明显抑制Aβ40聚集形成纤维，Aβ40主要呈现无定形结构，如图4C，D。而加入等摩尔浓度BSA的对照组中，Aβ40依旧聚集形成成熟纤维，如图4E，F。

ThT是一种荧光染料，它可以与淀粉样物质中交互的β-片层结构特异性结合，可作为Aβ聚集的一个定量分析指标。20μM的Aβ40经过7-14天的37℃持续孵育，样品的ThT荧光读值明显增高，如图5所示。但与不同摩尔浓度的抗Aβ可溶性单链抗体共同孵育后，试验组ThT荧光读值明显低于同时间点的对照组荧光值。如图5所示。

2、抗Aβ可溶性单链抗体促Aβ成熟纤维解聚集

20μM Aβ40聚集纤维与等摩尔浓度的抗Aβ可溶性单链抗体共同孵育1天后，Aβ纤维明显减少。如图6所示，相对于Aβ对照组和BSA处理组，E3单链抗体处理组的Aβ结构发生明显改变，视野中蛋白主要呈现无定形结构，未见明显的Aβ40聚集纤维。

(五)抗Aβ可溶性单链抗体抑制Aβ的细胞毒性作用

MTT结果显示，20μM聚集的Aβ蛋白可抑制SK-N-SH细胞的琥珀酸脱氢酶的活性，对细胞有明显的毒性作用。而与抗Aβ可溶性单链抗体共同加入细胞培养液中，Aβ蛋白对琥珀酸脱氢酶的活性抑制明显减少。如图7所示，抗Aβ可溶性单链抗体的毒性抑制作用呈明显的浓度依赖性。

实施例2：药物组合物的制备

将治疗有效量的本发明抗体(SEQ ID No.2)或其表达载体(包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体、大肠杆菌，下同)，或者编码该抗体的核苷酸(SEQ ID No.1)或者其表达载体单独或者相互混合后与药学上允许的辅料组成药物组合物，该药物组合物可单独使用，亦可与其他不影响该药物组合物功能的药物混合使用。这些药物组合物的制剂可以是药学上允许的任意剂型，包括但不限于片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂、口服液或脂质体。这些制剂的制备方法是本领域普通技术人员公知的技术。这些药物组合物可以用于治疗或预防老年性痴呆。

<110>南京医科大学

<120>一种治疗或预防老年性痴呆的抗体及其表达载体和在制药中的应用

<160>4

<210>1

<211>720

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

cag gtg cag ctg cag gag tcg ggc cca gga ctg gtg aag cct tcg gag 48

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

acc ctg tcc ctc acc tgc gct gtc tct ggt tac tcc atc agc agt ggt 96

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Gly

20 25 30

tac tac tgg ggc tgg atc cgg cag ccc cca ggg aag ggg ctg gag tgg 144

Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

att ggg agt atc tat cat agt ggg agc acc tac tac aac ccg tcc ctc 192

Ile Gly Ser Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

aag agt cga gtc acc ata tca gta gac acg tcc aag aac cag ttc tcc 240

Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

ctg aag ctg agc tct gtg acc gcc gca gac acg gcc gtg tat tac tgt 288

Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

gca aga gat ctt ggt agt tct gtg agt tgg ggc caa ggt acc ctg gtc 336

Ala Arg Asp Leu Gly Ser Ser Val Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

acc gtc tcg agt ggt gga ggc ggt tca ggc gga ggt ggc tct ggc ggt 384

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

agt gca ctt gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca 432

Ser Ala Leu Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala

130 135 140

tct gta gga gac aga gtc acc atc agt tgt cgg atg agt cag ggc att 480

Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Met Ser Gln Gly Ile

145 150 155 160

agc aat tat tta gcc tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gtt cct aag 528

Ser Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys

165 170 175

ctc ctg atc tat gct gca tcc act ttg caa tca ggg gtc cca tct cgg 576

Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg

180 185 190

ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agc 624

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

195 200 205

ctg cag cct gaa gat gtt gca act tat tac tgt caa aag tat aac agt 672

Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Asn Ser

210 215 220

gcc ctc gtt acg ttc ggc caa ggg acc aag ctg gaa atc aaa cgt 720

Ala Leu Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

225 230 235

<210>2

<211>239

<212>PRT

<213>人工序列

<400>

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Gly

20 25 30

Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Ser Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Leu Gly Ser Ser Val Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Ser Ala Leu Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala

130 135 140

Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Met Ser Gln Gly Ile

145 150 155 160

Ser Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys

165 170 175

Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg

180 185 190

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

195 200 205

Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Asn Ser

210 215 220

Ala Leu Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

225 230 235

<210>3

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

caggaaabag ctatgac 17

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>

gaattttctg tatgaacc 18

Claims

1、一种治疗或预防老年性痴呆的抗体，该抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.2所述。

2、根据权利要求1所述的抗体，其特征在于所述的抗体为可溶性scFv抗体片断。

3、权利要求1所述的抗体的表达载体。

4、根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于所述表达载体是质粒、噬菌粒、噬菌体或大肠杆菌。

5、编码权利要求1所述抗体的核苷酸，其序列如SEQ ID No.1所述。

6、权利要求5所述核苷酸的表达载体。

7、根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于所述表达载体是质粒、噬菌粒、噬菌体或大肠杆菌。

8、权利要求1所述的抗体在制备治疗或预防老年性痴呆药物中的应用。

9、权利要求5所述的核苷酸在制备治疗或预防老年性痴呆药物中的应用。

10、权利要求4或6所述的表达载体在制备治疗或预防老年性痴呆药物中的应用。