DE69233482T2

DE69233482T2 - Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen

Info

Publication number: DE69233482T2
Application number: DE1992633482
Authority: DE
Inventors: Eduardo A. Kensington Padlan; Iii George E. Mark; Bruce L. Daugherty
Original assignee: Merck and Co Inc; National Institutes of Health NIH
Current assignee: National Institutes of Health NIH; Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 1991-05-17
Filing date: 1992-05-12
Publication date: 2006-01-12
Anticipated expiration: 2012-05-13
Also published as: EP0519596A1; EP0519596B1; CA2068593A1; CA2068593C; JPH09191900A; JP3426615B2; DE69233482D1

Description

Hintergrund der Erfindung
Die Identifizierung und Herstellung monoklonaler Mausantikörper führte zu zahlreichen therapeutischen Anwendungen dieser außerordentlich spezifischen Moleküle bei menschlichen Erkrankungen. Die Techniken der Molekularbiologie haben die Einsetzbarkeit vieler Antikörper zusätzlich erweitert, indem sie die Erzeugung von Molekülen mit geänderter Klasse erlaubten, deren Funktionalität durch den Erwerb oder den Verlust der Komplement-Fixierung verbessert wurde. Die Größe des bioaktiven Moleküls kann ebenfalls verringert werden, um die Zielgewebe-Zugänglichkeit des Antikörpers zu erhöhen, indem entweder die Klasse von einem IgM in ein IgG geändert wird, wobei der größte Teil der konstanten Region der schweren Kette bei der Erzeugung eines F(ab)₂ entfernt wird oder die konstanten Regionen von sowohl schwerer als auch leichter Kette bei der Bildung eines Fv-Antikörpers entbehrlich sein können. Gemeinsam sind allen diesen potentiell therapeutischen Formen eines Antikörpers die erforderlichen CDRs (komplementaritätsbestimmende Regionen), welche das Molekül zu seinem Liganden lenken, und die Gerüst-Reste („framework residues"; FRs), welche die letzteren Strukturen tragen und die Anordnung der CDRs relativ zueinander bestimmen; Winter, europäische Patentanmeldung, Veröffentlichungs-Nr. 239,400; Riechmann et al., Nature 332: 323–327 (1988). Kristallographische Analysen zahlreicher Antikörperstrukturen offenbaren, dass die Kombinationsstelle fast vollständig aus den CDR-Resten besteht, welche in einer begrenzten Anzahl von Schleifenmotiven angeordnet sind, Padlan und Sheriff, 1990. Das Erfordernis der CDRs zur Bildung dieser Strukturen, zusammen mit der festgestellten Hypervariabilität ihrer Primärsequenz, führt zu einer großen Vielfalt der Antigen-Kombinationsstelle, welche jedoch eine begrenzte Anzahl von Möglichkeiten aufweist. Somit würden Hypermutabilität und ein begrenztes Primärsequenzrepertoire für jede CDR nahelegen, dass die CDRs, die für ein gegebenes Antigen von einer Tierspezies abgeleitet sind, identisch sein würden mit den von einer anderen Spezies abgeleiteten. Somit sollten sie nur geringfügig immunogen sein, falls überhaupt, wenn sie einem Empfängerorganismus in einem nicht-fremden Kontext präsentiert werden.
Hybridome, die monoklonale Antikörper produzieren, wurden am leichtesten von immunisierten Nagern erhalten. Die Entwicklung ähnlicher Reagenzien aus humanen Quellen wurde behindert durch das gegenwärtige Unvermögen, Langzeitkulturen von Zellen aufrechtzuerhalten, welche ausreichende Mengen an Antikörper produzieren. Zusätzliche Probleme ergeben sich unter einem ordnungspolitischen Gesichtspunkt, wenn Zellen humanen Ursprungs für die Herstellung von Agenzien zur Verwendung beim Menschen eingesetzt werden. Diese Gesichtspunkte führten zu der weit verbreiteten Verwendung von monoklonalen Nagerantikörpern für die Bildgebung und Behandlung von Tumoren, prophylaktische Verabreichung zum Schutz gegen einen toxischen Schock, Modifizierung von Transplantatabstoßungsepisoden und zur Linderung akuter Entzündungsreaktionen. In allen Szenarien, bei denen vollständige Nagerantikörper oder partielle Nagerantikörper (d.h. Nager-Human-Chimären) zur Therapie verwendet wurden, haben die Empfänger oft eine Immunreaktion entwickelt, welche gegen den Antikörper gerichtet war. Diese Reaktionen beschränkten die Dauer und Wirksamkeit der Therapie.
Es wurden verschiedene Versuche unternommen, um die Immunogenizität von nicht-humanen Antikörpern zu minimieren oder zu eliminieren, während deren antigenbindende Eigenschaften erhalten wurden. Zuerst wurden chimäre Antikörper konstruiert, welche die variablen Regionen von Nagern und deren assoziierte CDRs mit humanen konstanten Domänen fusioniert enthielten. Die folgenden Referenzen beschreiben allgemein die Technik chimärer Antikörper: Lobuglio et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 4220–4224 (1989); US- Patent 4,816,567; internationale PCT-Veröffentlichung Nr. WO 87/02671, veröffentlicht am 7. Mai 1987; europäische Patentveröffentlichung Nr. 255,694, veröffentlicht am 10. Februar 1988; europäische Patentveröffentlichung Nr. 274,394, veröffentlicht am 13. Juli 1988; europäische Patentveröffentlichung Nr. 323,806, veröffentlicht am 12. Juli 1989; internationale PCT-Veröffentlichung Nr. WO/89/00999, veröffentlicht am 9. Februar 1989; europäische Patentveröffentlichung Nr. 327,000, veröffentlicht am 9. August 1989; europäische Patentveröffentlichung Nr. 328,404, veröffentlicht am 16. August 1989; und europäische Patentveröffentlichung Nr. 332,424, veröffentlicht am 13. September 1989. Diese erwiesen sich als weniger immunogen, jedoch entwickelten immer noch etwa die Hälfte der Empfänger eine Immunreaktion gegen die Gerüst-Reste der variablen Nagerregion. Eine weitere Verringerung der „Fremd"natur der chimären Antikörper wurde erzielt durch Pfropfen lediglich der CDRs von dem monoklonalen Nagerantikörper in ein humanes Trägergerüst vor seiner anschließenden Fusion mit einer entsprechenden konstanten Domäne; Winter, europäische Patentanmeldung, Veröffentlichungs-Nr. 239,400; Riechmann et al., Nature 332: 323–327 (1988). Die Prozeduren, welche zur Durchführung des CDR-Pfropfens angewandt werden, führen oft zu unperfekt „humanisierten" Antikörpern. Das heißt, der resultierende Antikörper hat entweder seine Avidität verloren (gewöhnlich bestenfalls 2-3-fach) oder in einem Versuch, seine ursprüngliche Avidität zu erhalten, sind eine signifikante Anzahl der murinen Gerüst-Reste durch die entsprechenden Reste des gewählten humanen Gerüsts ersetzt worden. In diesem letzteren Fall ist die Immunogenizität des modifizierten „humanisierten" Antikörpers schwer a priori vorauszusagen.
Die Ligandenbindungseigenschaften einer Antikörper-Kombinationsstelle werden hauptsächlich durch die Struktur und relative Anordnung der CDRs bestimmt, obwohl festgestellt wurde, dass auch einige benachbarte Reste an der Antigenbindung beteiligt sind (Davies et al., Ann. Rev. Biochem. 59: 439–473 [1990]). Eine Feinspezifität kann in einem „humanisierten" Antikörper nur erhalten werden, wenn die CDR-Strukturen, deren Wechselwirkung miteinander und deren Wechselwirkung mit dem Rest der variablen Domänen strikt aufrechterhalten werden. Man kann erwarten, dass die Schlüsselreste „innere" und Interdomänen-Kontaktreste repräsentieren, somit sollten die an der Oberfläche exponierten Reste, welche unmittelbar für eine Immunüberwachung zur Verfügung stehen, die strukturellen Reste nicht einschließen.
EP-A-438312 offenbart die Inkorporation eines CDR von einer ersten Spezies in eine zweite Spezies, welche ähnliche variable Gerüste der schweren und leichten Ketten aufweist wie die erste Spezies.
Tempest et al., Bio/Technology 9, 266–271 (1991), offenbaren die Übertragung von CDRs von einem monoklonalen Mausantikörper auf einen monoklonalen humanen Antikörper und die anschließende Vornahme zusätzlicher Änderungen bei einer der Gerüst-Regionen, um die Bindungsaffinität und Spezifität wiederherzustellen.
WO-A-9007861 offenbart ein humanisiertes Immunglobulin mit einem humanen Gerüst und CDRs von einer zweiten Spezies. Mindestens eine Gerüst-Aminosäure ist durch die entsprechende Aminosäure von dem Donor-Ig ersetzt, wenn die humane Aminosäure an dieser Position selten ist, jedoch die Donor-Aminosäure an dieser Position bei Menschen üblich ist.
Aufgaben der Erfindung
Demgemäß ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines Immunglobulins nach Anspruch 1.
Zusammenfassung der Erfindung
Es wird ein einzigartiges Verfahren für die Identifizierung und den Ersatz von Immunglobulin-Oberflächenaminosäureresten offenbart, welches die Antigenizität einer ersten Säugerspezies in diejenige einer zweiten Säugerspezies überführt. Das Verfahren wird die Immunogenizität verändern und gleichzeitig die Ligandenbindungseigenschaften strikt erhalten. Der gezielte Ersatz äußerer Aminosäurereste hat keine Auswirkung auf die Ligandenbindungseigenschaften, ändert jedoch stark die Immunogenizität.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein „Humanisierungs"-Verfahren, welches die Immunogenizität des monoklonalen Nagerantikörpers verringert, während es gleichzeitig dessen Ligandenbindungseigenschaften vollständig erhält. Nachdem die Antigenizität eines Proteins hauptsächlich von der Natur seiner Oberfläche abhängig ist, könnte die Immunogenizität eines xenogenen oder allogenen Antikörpers verringert werden durch Ersatz der exponierten Reste, welche sich von denjenigen unterscheiden, die gewöhnlich bei Antikörpern einer anderen Säugerspezies gefunden werden. Dieser gezielte Ersatz von äußeren Resten sollte wenig oder keine Auswirkungen auf die inneren Domänen oder auf die Interdomänen-Kontakte haben. Somit sollten die Ligandenbindungseigenschaften als Folge von Veränderungen, welche auf die Gerüst-Reste der variablen Region begrenzt sind, nicht beeinflusst werden.
Das Verfahren wird als „Furnierung" bezeichnet, da nur die äußere Oberfläche oder Haut des Antikörpers verändert wird und die tragenden Reste unbeeinträchtigt bleiben.
Das Verfahren für die „Furnierung" macht Gebrauch von den verfügbaren Sequenzdaten für variable Domänen humaner Antikörper, zusammengestellt von Kabat et al., „Sequences of Proteins of Immunological Interest", 4. Aufl., Bethesda, Maryland, National Institutes of Health, 1987, Updates dieser Datenbank, und andere zugängliche US- und ausländische Datenbanken (sowohl Nukleinsäure als auch Protein). Die Subgruppen, in welche die verschiedenen Sequenzen kombiniert wurden, werden in den 1–3 präsentiert, welche die am häufigsten auftretende Aminosäure an jeder Gerüst-Position anzeigen. Ebenfalls präsentiert werden die Sequenzen der verschiedenen J-Minigene. Die Lösungsmittel-Zugänglichkeiten der Aminosäuren, wie abgeleitet aus der bekannten dreidimensionalen Struktur für humane und murine Antikörperfragmente, sind in diesen Figuren eingeschlossen.
Die hochauflösende Röntgenkristallographie der variablen Domänen der Antikörper KOL und J539 wurde einer umfangreichen Verfeinerung unterworfen, beginnend mit den Strukturen, welche aus der Protein Data Bank erhältlich sind (Bernstein et al., J. Mol. Biol. 112: 535–542, 1977; File 2FB4 für KOL und File 2FBJ für J529). Die Lösungsmittel-Zugänglichkeiten wurden berechnet wie beschrieben von Padlan, Proteins: Struct. Funct. Genet. 7: 112–124 (1990).
Es gibt zwei Schritte bei dem Verfahren der „Furnierung". Zuerst werden die variablen Domänen des Gerüsts einer ersten Tierspezies, z.B. der Maus, mit denjenigen entsprechender Gerüste einer zweiten Tierspezies, z.B. Mensch, verglichen. Diese Erfindung soll die antigene Änderung eines Antikörpers einer beliebigen Tierspezies erlauben. Die vorliegende Erfindung erläutert die Überführung eines Mausantikörpers in einen humanen Antikörper, dies dient jedoch lediglich zu illustrativen Zwecken. Die am meisten homologen humanen variablen Regionen werden dann Rest für Rest mit den entsprechenden Mausregionen verglichen. Dies wird auch die humane Subgruppe festlegen, der jede Maussequenz am meisten ähnelt. Zweitens werden diejenigen Reste in dem Mausgerüst, welche sich von ihrem menschlichen Gegenstück unterscheiden, durch die Reste ersetzt, die in dem humanen Gegenstück vorliegen. Dieser Wechsel geschieht nur bei denjenigen Resten, welche mindestens teilweise exponiert sind (mE und Ex; 1–3), (d.h., denjenigen mit einer relativen Zugänglichkeit („fractional accessibility") von mindestens 0,6). Behalten werden in dem „furnierten" Mausantikörper: seine CDRs, die Reste in der Nachbarschaft der CDRs, diejenigen Reste, welche als verborgen oder überwiegend verborgen definiert sind (mB und Bu; 1–3), und diejenigen Reste, von denen man annimmt, dass sie an Interdomänen-Kontakten beteiligt sind (Fettdruck, 1–3).
Humane und murine Sequenzen unterscheiden sich häufig am N-Terminus von sowohl schweren als auch leichten Ketten. Die N-Termini hängen mit der CDR-Oberfläche zusammen und befinden sich in einer Position, dass sie an der Ligandenbindung beteiligt sein können. Somit würde die Klugheit gebieten, diese murinen Termini in der „furnierten" Version zu erhalten.
Schließlich könnte ein Ersatz einiger Aminosäuretypen eine signifikante Auswirkung auf die Tertiärstruktur oder elektrostatischen Wechselwirkungen der Domänen der variablen Region haben. Somit sollte man beim Ersatz von Prolin, Glycin und geladenen Aminosäuren Sorgfalt walten lassen.
Diese Kriterien und die folgenden Verfahren werden verwendet zur Herstellung rekombinanter DNA-Sequenzen, welche die CDRs sowohl leichter als auch schwerer Ketten eines mMAb einer ersten Säugerspezies, einem Tier, in eine zweite Säugerspezies, Mensch, inkorporiert haben, wobei Gerüste auftreten, welche zur Transfektion von Säugerzellen für die Expression eines rekombinanten humanen Antikörpers mit der Antigenspezifität des monoklonalen tierischen Antikörpers verwendet werden können. Vorzugsweise werden die rekombinanten Immunglobuline als eigene Proteine erkannt werden, wenn sie für therapeutische Zwecke verabreicht werden. Dieses Verfahren der „Furnierung" wird die rekombinanten Antikörper als therapeutische Mittel geeignet machen, da sie entweder schwach immunogen oder nicht immunogen sein werden, wenn sie Menschen verabreicht werden. Die Erfindung soll ferner die rekombinante Überführung irgendeines tierischen monoklonalen Antikörpers in einen rekombinanten „human-erscheinenden" monoklonalen Antikörper einschließen, vorausgesetzt, dass eine geeignete Gerüst-Region identifiziert werden kann (wie unten beschrieben). Die tierischen monoklonalen Antikörper können einschließen, sind jedoch nicht beschränkt auf, die monoklonalen Mausantikörper, die von VanVoorhis et al., J. Exp. Med. 158: 126–145 (1983), beschrieben wurden, welche an humane Leukozyten binden, und die entsprechenden mMAbs, gebildet von Hybridomen, die in der Hybridoma Cell Bank hinterlegt sind, welche von der American Type Culture Collection (ATCC) erhalten wird, und im ATCC Catalog of Cell Lines 8 Hybridomas, No. 6, 1988, beschrieben sind.
Die CDR-Sequenzen aus dem monoklonalen tierischen Antikörper werden wie folgt erhalten. Gesamt-RNA wird aus den Maushybridomen, beispielsweise den von Wright et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 5699–5703 (1983), beschriebenen 1B4-Myelomzellen, den von Beatty et al., J. Immunol. 131: 2913–2918 (1983), beschriebenen 60.3-Zellen, den von Sanchez-Madrid et al., J. Exp. Med. 158: 1785–1803 (1983), beschriebenen TS1/18-Zellen und anderen monoklonalen Anti-CD18- oder -CD11-Antikörpern und Hybridomen wie beschrieben in Leukocyte Typing III, Springer-Verlag, New York (1988), unter Anwendung von Standardverfahren, die eine Zellsolubilisierung mit Guanidiniumisothiocyanat beinhalten (Chirgwin et al., Biochem. 18: 5294–5299 [1979]), extrahiert. Der Maus-1B4-mMAb wird als Hauptbeispiel eines tierischen MAb verwendet, welche mit dem offenbarten einzigartigen Verfahren „furniert" werden kann. Die Erfindung soll die Überführung eines beliebigen tierischen Immunglobulins in ein „human-erscheinendes" Immunglobulin einschließen. Es ist ferner vorgesehen, dass das „human-erscheinende" Immunglobulin (Ig) entweder leichte Kappa- oder Lambda-Ketten enthalten kann oder eine der folgenden Isotypen der schweren Kette (Alpha, Delta, Epsilon, Gamma und My).
Paare von degenerierten Oligodesoxynukleotid-Primern (4), welche Sequenzen innerhalb des Gerüsts 1 der variablen Region der leichten Kappa-Kette der Maus und der konstanten Domäne der leichten Kette oder diejenigen innerhalb des Gerüsts 1 der variablen Region der schweren IgG2a-Maus-Kette und der konstanten CH1-Domäne der schweren Kette repräsentieren, werden auf einem Applied Biosystem 381A-DNA-Synthesizer synthetisiert, von dem Harz durch Behandlung mit konzentriertem NH₄OH entfernt und auf einer NAP-5-Säule, die mit H₂O eluiert wird, entsalzt. Gesamt-RNA, etwa 2 μg, wird 30 Minuten lang bei 42°C unter Verwendung von reverser Moloney-MLV-Transkriptase, etwa 200 Einheiten (BRL), und etwa 10 pmol der Primer des komplementären Strangs der konstanten Region für entweder die schwere oder leichte Kette revers transkribiert. Die reverse Transkriptase wird hitzeinaktiviert, bei etwa 95°C für etwa 5 Minuten, und die Reaktionen werden so angesetzt, dass sie in etwa 100 μl PCR-Puffer etwa 50 pmol eines jeden der gepaarten Primer und 2,5 Einheiten Taq-Polymerase enthalten. Etwa 45 Amplifizierungszyklen (2', 94°C; 2', 55°C; 2', 72°C) folgt eine Gelreinigung der erwarteten DNA-Fragmente von 400+ Basenpaaren (bp). Vor der Subklonierung jener DNAs in ein glattendiges Zwischenplasmid wie pSP72 (Promega) werden sie mit Hilfe von T4-Polynukleotidkinase terminal phosphoryliert. Mehrere Klone, welche diese PCR-amplifizierten Sequenzen repräsentieren, werden kultiviert und DNA-Sequenzbestimmungen unter Verwendung von Sequenase^® und T7- und SP6-spezifischen Sequenzierungsprimern unterworfen. Eine einmalige DNA-Sequenz, welche eine variable Region der schweren Maus-IgG2a-Kette repräsentiert, wird durch Analyse der abgeleiteten Aminosäuresequenzen erhalten. Ein Ersatz der „murin erscheinenden" Gerüst-Reste durch diejenigen Reste, welche mit einer humanen variablen Region kompatibel sind, wird unter Anwendung der folgenden einmaligen Verfahren erreicht. Ein geeignetes humanes Gerüst wird unter Anwendung der nachstehend erörterten Kriterien bestimmt. Das Gerüst der variablen Region der leichten Kette mit ausreichender Homologie zu dem m1B4-Gerüst wurde als das humane LEN-Gerüst (FR) bestimmt. Das LEN-FR zeigt eine Ähnlichkeit von 90% und eine Identität von 81% im Vergleich zu murinem 1B4. Diese Sequenz mit ihrem Leader, ihren 3'-Intronsequenzen und gepfropften m1B4-CDRs wurde in den Zwischenvektor pGEM3Z (Promega) subkloniert wie beschrieben in Daugherty et al., Nucleic Acids Res. 19: (1991). Etwa acht Oligodesoxynukleotid-Primer (5) werden synthetisiert und repräsentieren die Primer, welche erforderlich sind, um mittels Polymerasekettenreaktion (PCR)-Amplifizierung vier DNA-Fragmente zu erzeugen. Inkorporiert in alle mit Ausnahme der terminalen Oligodesoxynukleotid-Primer waren diejenigen Sequenzen, welche der furnierten leichten MAb-1B4-Kette entsprechen, mit ihren unveränderten CDRs, und mindestens 15 Basen von 5'-terminaler Komplementarität, um die nachfolgende PCR-gesteuerte Rekombination dieser vier Fragmente zu erlauben. Zum Zwecke der Erläuterung des „Furnierungs"-Verfahrens wurde die variable Region der leichten LEN-Kette, die bereits einen gepfropften Satz von CDRs, welche diejenigen innerhalb der leichten Kette von Maus-1B4 repräsentieren, enthält, als Matrize verwendet, in welche Mutationen so eingeführt wurden, um leicht die „furnierte" Gerüst-Sequenz zu erzeugen. Das geeignete Primerpaar (S1 & V9, V10 & V11 etc.), etwa jeweils 50 pmol, wurde mit etwa 10 ng Plasmid-DNA, repräsentierend das CDR-gepfropfte LEN-Gerüst, etwa 2,5 Einheiten Taq-DNA-Polymerase kombiniert und etwa fünfundzwanzig (25) Zyklen von PCR-Amplifizierung (Zyklusperioden: 1', 94°C; 1', 55°C; 2', 72°C) folgten. Die Produkte der vier Reaktionen, durch Agarosegelelektrophorese gereinigt, werden kombiniert, etwa 10 ng eines jeden DNA-Fragments, mit terminalen Oligodesoxynukleotid-Primern (A1 & A2, 6) und Taq-DNA-Polymerase. Die kombinierten Fragmente wurden PCR-amplifiziert (25 Zyklen von: 2', 94°C; 2', 55°C; 2', 72°C). Nach Restriktionsendonukleaseverdauung mit Hind III und Xba I wird die amplifizierte DNA mittels Agarosegelelektrophorese gereinigt und in kompatible Stellen eines Zwischenvektors pSP72 (Promega) subkloniert, welcher die konstante Region der humanen leichten Kappa-Kette enthält (siehe 7). Genomische DNA, etwa 1 μg, gereinigt aus einer humanen B-Zellinie (GM0108A: NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository, Institute for Medical Research, Camden, NJ), wird als Matrize für die PCR-Amplifizierung (4) von einem etwa 920-Basenpaar-Fragment, enthaltend den Splice-Akzeptor für die konstante Domäne der leichten Kappa-Kette, das Exon und einen Teil seiner 3'-untranslatierten Region, verwendet. Das PCR-Produkt wird mittels Agarosegelelektrophorese gereinigt, mit Bam H1-Endonuklease verdaut und in pSP72 subkloniert, der zuvor mit Bam H1 linearisiert worden war. Die individuellen Klone, repräsentierend den pSP72-Zwischenvektor, der sowohl die „furnierte" variable Region der leichten 1B4-Kette als auch die konstante Region von humanem Kappa, erhalten mittels PCR-Amplifizierung von humaner DNA, enthält, werden zur Bestimmung der DNA-Sequenz der „furnierten" variablen Region der leichten Kette verwendet.
Der „furnierte" Anteil der schweren Kette des rekombinanten Antikörpers leitet sich ab von der mutierten Version der variablen Region der schweren Kette von Maus-1B4, fusioniert mit der humanen konstanten Region eines Gamma 4-Subtyps, erhalten aus einer Lambdabank, die von Flanagan und Rabbits erstellt wurde, Nature 300: 709–713 (1982). Die variable Region der „furnierten" schweren Kette wird aus fünf DNA-Fragmenten konstruiert, die eine Signalsequenz, Abschnitte der mutierten variablen Region der murinen schweren Kette und eine Intronsequenz repräsentieren (8). Es werden Oligodesoxynukleotid-Primerpaare (5) synthetisiert, welche die Primer repräsentieren, die erforderlich sind, um mittels PCR-Amplifizierung diese fünf DNA-Fragmente von etwa 10 ng Plasmid-DNA-Matrize, erhalten von einem pSP72-Zwischenvektor, welche die zuvor zur Bestimmung der murinen 1B4-CDR-Sequenz verwendete variable Region der schweren Kette enthält, zu erzeugen. Die Amplifizierung des Signalfragments, der Fragmente der variablen Region und des intron-enthaltenden Fragments erfolgte wie oben beschrieben. Die agarosegel-gereinigten Produkte, etwa 10 ng eines jeden Produkts, werden mit terminalen Oligodesoxynukleotid-Primerpaaren (8) kombiniert und die mittels PCR generierte, in vitro rekombinierte Matrize wird mit Hilfe der oben beschriebenen Standardverfahren amplifiziert. Vor der Subklonierung in einem mit Hind III und Bam H1 verdauten Expressionsvektor, welche die konstante Region der humanen schweren Kette Gamma 4 enthält (9), wird dieses rekombinierte Produkt gleichermaßen verdaut und mit agarosegel-gereinigt. Individuelle Klone werden einer DNA-Sequenzbestimmung mit Hilfe von Sequenase^® und T7- und SP6-spezifischen Sequenzierungsprimern unterworfen und einer wird für die nachfolgende Expression ausgewählt. Die konstante Region der schweren Kette Gamma 4 wird als ein Hind III-Fragment von etwa 6,7 Kb, das aus dem Plasmid pAT84 stammt, in die Hind III-Stelle des Zwischenvektors pSP72 subkloniert. Dieses Plasmid wird dann als die Matrizen-DNA verwendet, von der eine verkürzte Version der konstanten Gamma 4-Region mit Hilfe von PCR-Amplifizierung und den in 4 angegebenen Primerpaaren subkloniert wird. Eukaryotische Expressionsvektoren werden wie nachstehend beschrieben konstruiert.
Expressionsvektoren sind hier definiert als DNA-Sequenzen, welche für die Transkription klonierter Kopien von Genen und die Translation ihrer mRNAs in einem geeigneten Wirt erforderlich sind. Solche Vektoren können zur Expression eukaryotischer Gene in einer Vielfalt von Wirten, wie z.B. Bakterien, blau-grünen Algen, Pflanzenzellen, Hefezellen, Insektenzellen und Tierzellen, verwendet werden. Die Immunglobuline können auch in einer Anzahl von Virussystemen exprimiert werden. Speziell konstruierte Vektoren erlauben das Shuttling von DNA zwischen Wirten wie Bakterien-Hefe oder Bakterien-Tierzellen. Ein geeignet konstruierter Expressionsvektor sollte enthalten: einen Replikationsursprung für autonome Replikation in Wirtszellen, selektierbare Marker, eine begrenzte Anzahl geeigneter Restriktionsenzymstellen, ein Potential für eine hohe Kopienzahl und starke Promotoren. Ein Promotor ist definiert als eine DNA-Sequenz, welche RNA-Polymerase veranlasst, an DNA zu binden und RNA-Synthese zu initiieren. Ein starker Promotor ist einer, welcher die Initiierung von mRNAs mit hoher Frequenz veranlasst. Expressionsvektoren können einschließen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Klonierungsvektoren, modifizierte Klonierungsvektoren, speziell konstruierte Plasmide oder Viren. Das Immunglobulin-Molekül der schweren Kette wird von einem Plasmid transkribiert, welches den Neomycin (G418)-Resistenzmarker trägt, während das Immunglobulin der leichten Kette von einem Plasmid transkribiert wird, welches den Hygromycin B-Resistenzmarker trägt. Mit Ausnahme des Wirkstoffresistenz-Anteils dieser Plasmide sind sie identisch. Der bevorzugte Vorläufer der Immunglobulin-Expressionsvektoren ist der eukaryotische Expressionsvektor pD5 (Berkner und Sharp, Nucl. Acids Res. 13: 841–857 [1985]), welcher den Ursprung der Adenovirus-Replikation, die SV40-Enhancerdomäne, den hauptsächlichen späten Adenovirus-Promotor, den dreiteiligen Adenovirus 2-Leader, einen 5'-Splice-Donor von dem dritten Adenovirus-Leader und einen 3'-Splice-Akzeptor, abgeleitet von einem Immunglobulin-Locus, eine Mehrfachklonierungsstelle, plaziert in der Bam H1-Stelle nach der Aufnahme des Vektors, und das späte SV40-Polyadenylierungssignal enthält (10). Der Replikationsursprung wird durch Verdauung mit Eco R1 und Kpn I entfernt und durch zwei Fragmente ersetzt, welche das neo-selektierbare Markergen (erhalten aus dem Plasmid pCMVIE-AK1-DHFR als ein Eco R1/Bam H1-Fragment von etwa 1,8 Kb) und den Enhancer der schweren Ig-Kette (erhalten als ein PCR-amplifiziertes Fragment unter Verwendung von humaner DNA als Matrize und den in 4 aufgelisteten Oligodesoxynukleotiden als Primerpaar, nach dessen Verdauung mit Bgl II und Kpn 1) repräsentieren. Der resultierende Expressionsvektor wird befunden, einen kleinen Anteil des TK-Promotors, welcher für die Transkription des Neomycingens verantwortlich ist, nicht aufzuweisen. Dieser wird durch Insertion eines etwa 0,14 Kb langen, PCR-amplifizierten Fragments, erhalten von der CMVIE-AK1-DHFR-DNA unter Verwendung des in 4 aufgelisteten Primerpaares, in die Eco R1-Stelle ersetzt. Der resultierende Expressionsvektor der schweren Kette (p8941) wird durch Entfernung der angegebenen Hind III- und Xba I-Stellen unter Anwendung von Standardverfahren modifiziert. Zur Überführung dieses Vektors in einen Vektor, der den mit Hygromycin B selektierbaren Marker exprimiert, wird die Neomycinresistenzkassette durch Verdauung mit zuerst Eco R1, gefolgt von einer DNA-Polymerase-gesteuerten Auffüllung des 5'-Überhangs und anschließender Sal I-Verdauung, entfernt. Die Hygromycin B-Expressionskassette von etwa 1,9 kb, der TK-Promotor und das TK-Polyadenylierungssignal, welche das Hygromycin B-Gen flankieren (erhalten als ein 1,8-kb-Bam H1-Fragment in dem Plasmid pL690, Gritz und Davies, Gene 25: 179–188 (1981]), werden aus dem Plasmid pAL-2 durch Bam H1-Verdauung entfernt und in die Bam H1-Stelle des Zwischenvektors pSP72 subkloniert. Die Hygromycin B-Kassette wird aus diesem Vektor durch Verdauung mit Sma I und Sal I entfernt und in den Expressionsvektor kloniert, der wie oben beschrieben linearisiert wurde, um ein DNA-Fragment mit einem glatten Ende und einem Sal I-Ende zu erzeugen (11).
Die Expression der „furnierten" leichten Kappa-Kette von 1B4 wird erreicht durch Überführung dieses Cistrons von dem Zwischenklonierungsvektor auf pSP72-Basis (p8952), enthaltend die humane konstante Kappa-Region, in den mit Hygromycin B selektierbaren eukaryotischen Expressionsvektor (7). Ein DNA-Fragment von etwa 1,5 kb, resultierend aus der Endonukleaseverdauung von p8952 mit Spe I und Cla I, wird mittels Agarosegelelektrophorese gereinigt und in den Expressionsvektor ligiert, der zuvor linearisiert worden war, nach Verdauung mit denselben beiden Restriktionsenzymen, und agarosegel-gereinigt. Der eukaryotische Expressionsvektor der schweren Kette wird in zwei Schritten konstruiert. Zunächst wird der p8950-Vektor, enthaltend die modifizierte variable Region der schweren Kette des Maus-1B4-Fragments, mit Bgl II und Bam H1 verdaut. Das agarosegel-gereinigte 0,75-kb-Fragment wird in die Bam H1-Stelle des Vektors p8941 ligiert und rekombinante Klone, welche dieses Fragment in der richtigen Orientierung enthalten, werden identifiziert. Plasmid-DNA aus einem solchen Klon wird durch Bam H1-Verdauung linearisiert und mit einem 1,78-kb-Bam H1-Fragment ligiert, welches eine kurze Version der konstanten Region von humanem Gamma 4 repräsentiert, erhalten aus dem Plasmid pAT94 mittels PCR-Amplifizierung. Nach der Identifizierung von Klonen, welche diese Inserts in der richtigen Orientierung enthalten, werden Plasmid-DNAs (von denen eine als p8953 bezeichnet wird) kultiviert und für die Transfektion in Säuger-Empfängerzellen gereinigt. Gleiche Mengen, etwa 10 μg, der Plasmide, welche für die „furnierte" schwere IgG4-Kette von 1B4 und die „furnierte" leichte Kappa-Kette von 1B4 kodieren, werden mittels Standard-Calciumphosphatpräzipitationsverfahren in die Affennieren-Zellinie CV-1P oder die Humanembryonen-Nierenzellinie 293 transfiziert. Die Kulturüber stände, getestet mit einem Trapping-ELISA (im Folgenden beschrieben), wurden befunden, ein Human-Kappa-Leichtketten/Human IgG4-Immunglobulin zu enthalten. Immulon-2-Platten mit 96 Mulden (Dynatech Labs.) wurden über Nacht mit einer Lösung von etwa 5 μg/ml eines monoklonalen Mausantikörpers gegen die konstante Domäne einer humanen Kappa-Kette (Kat. Nr. MC009, The Binding Site, Inc., San Diego, CA) in etwa 0,1 M NaHCO₃-Puffer (pH 8,2) bei etwa 4°C überschichtet und mit etwa 1%igem Rinderserum (BSA) in etwa 0,1 M NaHCO₃ für etwa 1 Stunde bei etwa 25°C inkubiert. Nach diesem und allen nachfolgenden Schritten wurde eine Waschung mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) vorgenommen. Die Mulden werden dann herausgefordert mit konditioniertem Medium, welches rekombinanten Anti-CD18-Antikörper enthält, oder mit vorbestimmten Mengen von Human-IgG4/Kappa, gereinigt durch Protein A Sepharose^® (Pharmacia Fine Chemicals)-Chromatographie aus humanem IgG4-Myelomserum (Kat. Nr. BP026, The Binding Site, Inc.). Alle Proben werden in PBS mit etwa 0.05% Tween^®-20 verdünnt. Aliquots von etwa 100 μl werden etwa 1 Stunde lang bei etwa 37°C in dreifacher Ausführung inkubiert und Standardkalibrierungskurven werden unter Verwendung von IgG4-Konzentrationen im Bereich von etwa 10 ng/ml bis etwa 100 ng/ml erstellt. Gebundene und voll assemblierte Human-IgG4 (entweder nativ oder die rekombinanten humanen „furnierten" 1B4-IgG4-Konstrukte) werden mit etwa 100-μl-Aliquots einer 1:500-Verdünnung von monoklonalem Mausantikörper gegen humanes IgG4-Fc, konjugiert mit alkalischer Phosphatase (Kat. Nr. 05-3822, Zymed Laboratories, Inc.), in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) mit etwa 1% BSA nachgewiesen. Nach Inkubation für etwa 1 Stunde bei etwa 37°C und anschließendem Waschen werden die Mengen an gebundenem Konjugat nachgewiesen durch Inkubation aller Proben mit einer Lösung von 1 mg/ml p-Nitrophenylphosphat in 0,1 M 2,2'-Aminomethylpropandiol-Puffer, pH 10,3, für etwa 30 Minuten bei etwa 25°C. Die Extinktion der Mulden wird bestimmt mit einem UV Max ELISA-Plattenleser (Molecular Devices), der auf 405 nm eingestellt ist. Der Antikörper, der von den transfizierten humanen 293-Zellen oder Affennieren-CV1P-Zellen sekretiert wird, entweder nach transienter Expression oder nach Isolierung eines stabilen Klons, wird durch Protein A-Chromatographie isoliert, wobei die Konzentration an rekombinanten humanen Anti-CD18-Antikörpern mit dem oben beschriebenen Trapping-ELISA bestimmt wird, und dazu verwendet, mit der Bindung von radioaktiv markiertem Maus-1B4 an den CD18-Liganden auf der Oberfläche von aktivierten humanen PMN zu konkurrieren. Affinitäten von r-Anti-CD18-Antikörper-Konstrukten werden bestimmt mit Hilfe eines kompetitiven ¹²⁵I-1B4-Lösungs-Bindungsassays mit stimuliertem humanen polymorphkernigen Leukozyten (PMNs). Gereinigter monoklonaler Anti-CD18-Mausantikörper (50 μg) wird mittels Chloramin-T iodiert (Hunter, W. M., und Greenwood, F. C., Nature 194: 495–496, 1962) und der radioaktiv markierte Antikörper mit Hilfe einer Bio-Sil^®-TSK250-Gelfiltrations-HPLC-Säule (Biorad, Richmond, CA) (welche Proteine im Bereich von 1–300 × 10³ Dalton fraktioniert), äquilibriert in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0, gereinigt. Die Radioaktivität des Ausflusses wird mit einem eingebauten Detektor (Beckman Model 170; Beckman, Fullerton, CA) überwacht und das Gesamtprotein bei OD₂₈₀ mit einem Kratos Spectroflow 757 Detektor (Kratos, Mawah, N.J.) gemessen. Ein einzelner ¹²⁵I-1B4-Peak, zusammengesetzt aus der zusammenfallenden OD₂₈₀ und Radioaktivitätsmarkierung, eluiert charakteristischerweise bei etwa 6 Minuten, 30 Sekunden nach der Probeninjektion. Die spezifische Aktivität des Produkts beträgt gewöhnlich etwa 10 μCi/μg Protein und 97–99% der Zählimpulse sind mit 10%iger Trichloressigsäure fällbar. Die Bindung dieses radioaktiv markierten Antikörpers wird mit humanem PMNs festgestellt, die mit einem diskontinuierlichen Ficoll/Hypaque-Gradienten gereinigt (English, D., und Anderson, B. R., J. Immunol. Methods 5: 249–255, 1974) und mit etwa 100 ng/ml Phorbolmyristatacetat für etwa 20 Minuten bei etwa 37°C (Lo et al., J. Exp. Med. 169: 1779–1793, 1989) aktiviert wurden. Zur Feststellung der Avidität von Antikörpern für CD18-Moleküle auf der PMN-Oberfläche werden etwa 1 × 10⁵ aktivierte PMNs in einem Puffer wie Hanks ausgewogener Salzlösung, die etwa 20 mM Hepes (pH 7,2), etwa 0,14 Einheiten Aprotinin (Sigma Chemical Co.) und etwa 2% Humanserumalbumin enthält, (Bindungspuffer), enthaltend etwa 1,3 ng ¹²⁵I-1B4 (2,8 × 10^–11 M), in Gegenwart von zunehmenden Konzentrationen an unmarkiertem 1B4-Antikörper (etwa 10^–7 bis 10^–5 M) in einem Reaktionsvolumen von etwa 300 μl für etwa 1 Stunde bei etwa 4°C mit konstanter mechanischer Bewegung inkubiert. Zellgebundenes 1B4 wird von dem ungebundenem Antikörper separiert mittels Zentrifugation durch ein Kissen von 0,5 M Sucrose (4.800 × g, 3 Minuten); die Röhrchen werden auf Trockeneis eingefroren und die Spitzen abgeschnitten und mit einem LKB-Gammazähler gezählt. Der IC₅₀-Wert des Anti-CD18-Antikörpers für die Inhibierung von ¹²⁵I-1B4-Antikörperbindung wird berechnet unter Verwendung eines Vier-Parameter-Anpassungsprogramms (Rodbard et al. in „Radioimmunoassay and Related Procedures in Medicine", International Atomic Energy Agency, Wien, Bd. 1, 469–504, 1978). Die Affinität des „furnierten" r-Anti-CD18-Antikörpers für den CD18-Liganden wird auf ähnliche Weise bestimmt unter Verwendung von murinem ¹²⁵I-1B4-Antikörper und zunehmenden Mengen, wie mit dem Trapping-ELISA bestimmt, von unmarkiertem r-Anti-CD18. Die Ergebnisse der Bindungsassays sind in 13 gezeigt und zeigen an, dass die Avidität des „furnierten" rekombinanten 1B4-Antikörpers gleich derjenigen des monoklonalen Maus-1B4-Antikörpers ist. Dieses Ergebnis zeigt, dass ein Antikörper mit einem angenommenen humanen Isotyp rekombinant aus dem murinen Ausgangsantikörper durch die Einführung zahlreicher Punktmutationen in seinen Gerüst-Resten konstruiert und fusioniert mit humanen konstanten Domänen von Kappa und Gamma 4 exprimiert werden kann, ohne Verlust an Avidität für das Antigen. Aus diesem Ergebnis kann geschlossen werden, dass die Punktmutationen innerhalb der Gerüst-Regionen die Präsentation der CDRs der leichten und schweren Kette des Maus-1B4 nicht verändern. Viele der Konstruktionsbeispiele von rekombinanten humanen Antikörpern mit Komplementärregionen, welche durch diejenigen ersetzt wurden, welche innerhalb monoklonaler Mausantikörper gefunden werden, führten zu einem Verlust der Avidität für den Liganden oder das Antigen. Obwohl die letzteren Transmutationen möglich sind, ist somit die erfolgreiche Erhaltung der Avidität nicht sichergestellt. Diese oben beschriebene Prozedur demonstriert, dass, wenn den Gerüst-Regionen und der Art der Aminosäuren innerhalb eines jeden Gerüsts hohe Aufmerksamkeit geschenkt wird, eine „Humanisierung" potentiell ohne den Verlust der Avidität erreicht werden kann, welcher den Transfer von CDRs zu den „generischen" humanen Gerüsten begleitet („Humanisierung"), wie er von Winter, europäische Patentveröffentlichung Nr. 239, 400, veröffentlicht am 30. Dezember 1987, angewandt wird.
Zur Identifizierung von humanen Gerüst-Sequenzen, welche mit den CDRs von beispielsweise Maus-1B4 kompatibel sind, werden humane Gerüste mit einem hohen Grad an Sequenzähnlichkeit mit denjenigen von Maus-1B4 identifiziert. Die Sequenzähnlichkeit wird anhand identischer Reste sowie evolutionärer konservativer Aminosäuresubstitutionen gemessen. Ähnlichkeitssuchen werden durchgeführt unter Verwendung der murinen 1B4-Gerüst-Sequenz, aus der die CDR-Sequenzen entfernt wurden. Diese Sequenz wird dazu verwendet, um eine Datenbank von humanen Immunglobulinsequenzen abzufragen, die von verschiedenen Quellen erhalten wurden. Sequenzen mit einem hohen Grad an Sequenzähnlichkeit werden individuell hinsichtlich ihres Potentials als humanisierende Gerüst-Sequenzen untersucht. Auf diese Weise wird das humane Homologe, welches den murinen CDRs die Struktur liefert, die ihrem nativen murinen Gerüst am ähnlichsten ist, als Matrize zur Konstruktion der „furnierten" variablen Regionen ausgewählt (12). Sollten humane Gerüste mit ausreichender Ähnlichkeit aus zusammengestellten Sequenzen nicht identifizierbar sein, ist es möglich, aus humaner genomischer DNA eine Gruppe von eng verwandten variablen Regionen mittels rekombinanter Technik zu isolieren. So kann ein degenerierter 5'-Stromaufwärts-Oligodesoxynukleotid-Primer anhand der konservierten Sequenzen innerhalb des Aminoterminus einer jeden der verschiedenen humanen FR1-Regionen erstellt und mit einem degenerierten 3'-Stromabwärts-Oligonukleotid-Primer, hergestellt aus der FR-Sequenz, welche für den monoklonalen Mausantikörper bestimmt wurde, dessen CDRs man in einem humanen Kontext überführen möchte, gepaart werden. Diese Primerpaare werden dann verwendet zur PCR-Amplifizierung von einer humanen genomischen Matrize derjenigen DNA-Sequenzen, welche von dem Primerpaar flankiert werden. Die resultierenden DNAs können dann kloniert werden und die von individuellen Mitgliedern abgeleitete DNA-Sequenz wird verschiedene mausverwandte humane variable Regionen beschreiben. Die Seltenheit somatischer Mutationen in Gerüst-Resten und die Konservierung der Aminosäuresequenz zwischen Maus und Mensch macht diesen Ansatz möglich.
Es wird die Konstruktion eines vollständigen rekombinanten humanen IgG4-Antikörpers offenbart, dessen variable Domänen der schweren und leichten Kette die CDR-Reste des monoklonalen Mausantikörpers enthalten, unter vollständiger Erhaltung der Spezifität und Avidität des monoklonalen Maus-Ausgangsantikörpers. Die Konstruktion des „furnierten" Gerüsts einer leichten Kette, abgeleitet von der humanen LEN-Sequenz, die mit der konstanten Region einer humanen leichten Kappa-Kette fusioniert wurde, wird oben beschrieben. Die Gerüst-Sequenz der variablen Mausregion, ohne CDR-Sequenzen, wird zur Abfragung einer Datenbank vollständiger Sequenzen humaner variabler Regionen verwendet. Die humanen Sequenzen, welche der murinen Gerüst-Region am ähnlichsten sind, werden dann individuell analysiert, um sowohl deren Sequenzidentität als auch Ähnlichkeit mit der murinen Gerüst-Region festzustellen. Im Fall von Maus-1B4 schließen diese Sequenzen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, „Gal", gewählt aufgrund seines hohen Grades von sowohl Ähnlichkeit als auch Identität mit der Sequenz der schweren Kette von 1B4. Das Gal-Gerüst wurde als zu 85% ähnlich und zu 79% identisch mit Maus-1B4 befunden. Diese Werte basieren auf der Dayhoff-Ähnlichkeitsmatrix evolutionär konservierter Aminosäuresubstitutionen (R. M. Schwartz, M. O. Dayhoff, in Atlas of Protein sequence and structure, M. O. Dayhoff, Hrsg. (National Biomedical Research Foundation, Washington, DC [1979]) (12). Zur Herstellung einer rekombinanten DNA, welche für die murinen CDRs der schweren Kette im Kontext eines human-erscheinenden Gerüsts kodiert, werden die folgenden Prozeduren durchgeführt. Ein Satz von 10 kurzen Oligodesoxynukleotiden wird synthetisiert. Jedes Paar wird in einer separaten PCR-Reaktion mit der DNA-Matrize kombiniert, welche die variable Region der schweren Kette von Maus-1B4 repräsentiert, amplifiziert und isoliert nach PCR der RNA des murinen Hybridoms 1B4 wie oben beschrieben.
So wurden etwa 50 pmol eines jeden Primerpaares mit etwa 10 ng Plasmid-DNA, repräsentierend die variable Region der schweren Kette von Maus-1B4, etwa 2,5 Einheiten Taq-DNA-Polymerase kombiniert und etwa fünfundzwanzig (25) PCR-Amplifizierungszyklen folgten (Zyklusperioden: 1', 94°C; 1', 55°C; 2', 72°C). Die Produkte der fünf Reaktionen (8) kodierten für Teile der variablen Region der schweren Kette von 1B4, beginnend mit der für das Signalpeptid kodierenden Region und endend mit der 3'-Intronsequenz, welche sich zwischen der kodierenden Domäne der variablen Region und der Sequenz der konstanten Region von IgG4 befindet, mit den gewünschten Punktmutationen, um ein „furniertes" Gerüst der variablen Region zu erzeugen. Diese fünf Fragmente werden mittels Agarosegelelektrophorese gereinigt, etwa 10 ng eines jeden DNA-Fragments werden mit terminalen Oligodesoxynukleotid-Primern (A1 & A2, 5) und Taq-DNA-Polymerase kombiniert. Die kombinierten Fragmente wurden PCR-amplifiziert (25 Zyklen von 2', 94°C; 2', 55°C; 2', 72°C). Aufgrund der komplementären Enden der fünf Fragmente resultieren die Polymerisierungs/Denaturierungs/Polymerisierungs-Zyklen der Polymerasekettenreaktion in der Bildung und anschließenden Amplifizierung der kombinierten Sequenzen. Nach 25 Amplifizierungszyklen wird das kombinierte 0,8-kb-Fragment elektrophoretisch aus einem Agarosegel gereinigt und mit den Restriktionsenzymen Spe I und Bam H1 verdaut. Nach Agarosegelelektrophorese wird das gereinigte DNA-Fragment in den Expressionsvektor der schweren Kette, p8958 (siehe 9), anstelle der chimären variablen Region, die in diesem Vektor vorliegt, ligiert. Jede „furnierte" variable Region mit ihrer assoziierten humanen konstanten Region, die sich innerhalb eines Expressionsvektorplasmids auf pD5-Basis befand, wurde in 293-Zellen und CV1-P-Zellen cotransfiziert und es wurde festgestellt, dass rekombinanter humaner Antikörper in dem konditionierten Medium 48 Stunden nach der Transfektion vorhanden war. Der „furnierte" rekombinante Antikörper wird mittels Protein A-Chromatographie isoliert. Die Avidität dieses Antikörpers für den CD18-Liganden, der auf der Oberfläche von aktivierten humanen PMNs präsentiert wird, wird mit derjenigen des monoklonalen Maus-Ausgangsantikörpers 1B4 verglichen. 13 zeigt dass, obwohl jeder Antikörper denselben Satz von sechs CDRs innerhalb verschiedener Gerüst-Domänen enthält, diese eine identische Avidität für den Liganden aufweisen. Somit beruht die Avidität eines Antikörpermoleküls nicht auf den Gerüst-Resten der variablen Region, welche an der Oberfläche exponiert sind, sondern die richtige Struktur, in der die CDRs präsentiert werden, muss durch die verborgenen und inter/intra-aktiven Reste signifikant beeinflusst werden. Der monoklonale Maus-Ausgangsantikörper demonstriert einen IC₅₀-Wert von etwa 1,0 bis etwa 0,7 nM, das „furnierte" Molekül hat einen ähnlichen IC₅₀-Wert.
Ferner wird offenbart ein Verfahren zur Inhibierung des Einstroms oder der Wanderung von Leukozyten, welche zur Expression von CD18-Antigen (Leukozyten-Integrin, Beta-Untereinheit) auf ihrer Oberfläche in der Lage sind, in eine Entzündungsstelle oder einen Gewebebereich oder ein Organ, welches nach einem Einstrom der Zellen entzündet sein wird. Die Entzündung kann das Ergebnis einer Infektion mit pathogenen Mikroorganismen, wie z.B. gram-positiven und gram-negativen Bakterien, Parasiten und Pilzen, sein. Die Reaktion kann auch durch Viren und auf nicht-infektiöse Weise, wie z.B. Trauma oder Reperfusion nach einem Myokard-Infarkt oder Schlaganfall, Immunreaktionen auf ein fremdes Antigen und Autoimmunreaktionen, induziert werden. Die rekombinanten humanen Anti-CD18-Antikörper sind von Nutzen bei der Behandlung einer Entzündung in der Lunge, dem Zentralnervensystem, der Niere, den Gelenken, dem Endokard, den Augen, Ohren, der Haut, dem gastrointestinalen Trakt und Urogenitalsystem. Krankheitszustände, bei denen die rekombinanten humanen Anti-CD18-Antikörper als therapeutische Mittel von Nutzen sind, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Infektionskrankheiten, bei denen eine aktive Infektion an irgendeiner Körperstelle vorliegt, wie z.B. Meningitis, Zustände wie chronische oder akute sekundäre Entzündungen, verursacht durch Antigenablagerung, und andere Zustände, wie z.B. Enzephalitis, Arthritis, Uveitis, Colitis, Glomerulonephritis, Dermatitis, Psoriasis und mit Sepsis und/oder Trauma assoziiertes Atemnotsyndrom. Andere Entzündungskrankheiten, welche auf einen rekombinanten humanen Anti-CD18-Antikörper ansprechen könnten, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Immunstörungen und Zustände, bei denen T-Zell- und/oder Makrophagen-Anhaftung/Erkennung eine Rolle spielt, wie z.B. akute und verzögerte Überempfindlichkeit, Transplantat-Wirt-Reaktion, primäre Autoimmunerkrankungen wie perniziöse Anämie, infektionsbedingte Autoimmunerkrankungen wie Typ I-Diabetes mellitis, Flares während rheumatoider Arthritis, Erkrankungen, die Leukozytendiapedese beinhalten, wie z.B. Multiple Sklerose, durch einen Antigen-Antikörper-Komplex vermittelte Erkrankungen, einschließlich bestimmter der oben aufgeführten sekundären Infektionszustände, Immunsuppression und Transplantat-Abstoßung. Entzündungszustände aufgrund von toxischem Schock oder Trauma, wie z.B. adultes Atemnotsyndrom und Reperfusions-Schädigung, und Krankheitszustände aufgrund von Leukozytendyskrasien und Metastase werden in Betracht gezogen. Die Inhibierung der Leukozyten-Endothel-Anhaftung für diagnostische und therapeutische Zwecke, wie z.B. die iatrogene Öffnung des Endothels, um die Einwanderung von Leukozyten während des Einbringens eines Therapeutikums im Falle einer Chemotherapie zu verhindern, oder zur Erhöhung der Ernte von Leukozyten von Patienten wird ebenfalls erwartet.
Rekombinante humane Anti-CD-18-Antikörper oder ein aktives Fragment davon können zur Behandlung der oben genannten Erkrankungen verwendet werden. Ein aktives Fragment wird das F(ab')₂-, das Fab- und irgendein anderes Fragment, welches an das CD18-Antigen binden kann, einschließen. Rekombinante humane Anti-CD18-Antikörper können allein für nicht infektiöse Krankheitszustände verabreicht werden oder mit Antibiotika oder anderen infektionsbekämpfenden Mitteln zur Behandlung von Infektionskrankheiten aus den oben erörterten Gründen kombiniert werden.
Die Verabreichung wird gewöhnlich die Antikörper einschließen und möglicherweise andere Substanzen in einem physiologisch annehmbaren Medium oder pharmazeutischen Träger. Solche physiologisch annehmbaren Medien oder pharmazeutischen Träger umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, physiologische Salzlösung, phosphatgepufferte Salzlösung, phosphatgepufferte Salzlösung mit Glucose, gepufferte Salzlösung dgl. Die Antikörper und irgendein infektionsbekämpfendes Mittel werden auf parenteralen Routen verabreicht werden, welche intravenöse, intramuskuläre, subkutane und intraperitoneale Injektion oder Abgabe einschließen. Die Menge der Antikörper und der Mischung in der Dosierungsform hängt von dem speziellen Krankheitszustand ab, der behandelt wird. Die Menge des rekombinanten humanen Anti-CD18-Antikörpers, der in einer Dosierungsform verwendet wird, kann von etwa 1 bis etwa 1000 mg reichen, wobei ein Bereich von etwa 10 mg bis etwa 100 mg bevorzugt ist. Die Antikörper können täglich verabreicht werden oder weniger als täglich, wie vom behandelnden Arzt festgelegt. Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung, ohne dieselbe jedoch darauf zu beschränken.
BEISPIEL
Herstellung eines „furnierten" rekombinanten Antikörpers
Ein Antikörper wurde hergestellt, bei dem die variable Domäne der leichten Kette die Gerüst-Region einer murinen leichten Kette umfasst, modifiziert, um oberflächenexponierte Aminosäuren humaner Abstammung zu enthalten. Die variable Domäne der schweren Kette ist gleichermaßen von der murinen schweren Kette abgeleitet durch Punktmutationen, welche exponierte murine Reste durch human-erscheinende Reste ersetzen. Die humane Gerüst-Region der leichten Kette stammte von dem Human-Myelom-Protein LEN. Die CDR- und Gerüst-Sequenzen des monoklonalen Mausantikörpers 1B4, welcher an CD18 (die Beta-Untereinheit der Leukozyten-Integrin B-2-Familie, welche einschließt: LFA-1, Mac-1 und p150.95) bindet, wurden wie folgt erhalten: Das Hybridom mit der Bezeichnung 1B4, welches den monoklonalen Antikörper 1B4 produziert, wurde gemäß dem Budapester Vertrag bei der internationalen Hinterlegungsbehörde: American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852 hinterlegt. Die Lebensfähigkeit wurde am 6. Juni 1989 bestimmt und das Hybridom als HB 10164 bezeichnet. Frühere Experimente hatten diesen Antikörper als einen IgG2a mit einer leichten Kappa-Kette bestimmt (Wright et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 5699–5703 [1983]).
Gesamt-RNA wurde aus den 1B4-Myelomzellen extrahiert unter Anwendung von Standardverfahren, welche eine Zellsolubilisierung mit Guanidiumisothiocyanat einschließen (Chirgwin et al., Biochem. 18: 5294–5299 [1979]). Sätze von degenerierten Oligodesoxynukleotid-Primern (4), welche Sequenzen innerhalb des Gerüsts 1 der variablen Region der leichten Kappa-Kette der Maus und der konstanten Domäne der leichten Kappa-Kette oder diejenigen innerhalb des Gerüsts 1 der variablen Region der schweren Kette von Maus-IgG2a und der konstanten CH1-Domäne der schweren Kette repräsentierten, wurden mittels Standardphosphoramidit-Verfahren mit einem Applied Biosystem 381A-DNA-Synthesizer synthetisiert. Die Entfernung der Oligodesoxynukleotide (Oligos) von dem Harz erfolgte durch Behandlung mit konzentriertem NH₄OH, gefolgt von Entsalzen auf einer NAP-5-Säule (Pharmacia) unter H₂O-Elution (wenn die Oligos eine Länge < 45 Basen hatten) oder unter Verwendung einer OPC-Säule (Applied Biosystems Inc) und Elution mit 20% Acetonitril (wenn die Oligos eine Länge > 45 Basen hatten), wie von den Herstellern empfohlen. Gesamt-RNA (2 μg) wurde 30 Minuten lang bei 42°C unter Verwendung von reverser Moloney-MLV-Transkriptase (200 Einheiten, BRL) und 10 pmol der Primer des komplementären Stranges der konstanten Region, repräsentierend entweder schwere oder leichte Kette, in einem Puffer (Endvolumen von 20 μl), enthaltend 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 10 mM DTT und 20 Einheiten RNAsin (Pharmacia), revers transkribiert. Die reverse Transkriptase wurde hitzeinaktiviert (95°C, 5') und die Reaktionen wurden so angesetzt, dass sie in 100 μl PCR-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,01% Gelatine, 200 μM eines jeden dNTP) 50 pmol eines jeden der gepaarten Primer und 2,5 Einheiten Taq-Polymerase (Perkin Elmer/Cetus) enthielten. Eine Polymerasekettenreaktion (PCR)-Amplifizierung wurde im wesentlichen durchgeführt wie beschrieben von Saiki et al., Science 230: 1350–1354 (1985), und anderen (Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263–273 [1986], Dawasaki und Wang, PCR Technology, Principles and Applications for DNA Amplification, Ehrlich, Hrsg., Stockton Press, NY, S. 89–97 [1989], Tung et al., ibid., S. 99–104 [1989]). 45 Amplifizierungszyklen mit einem DNA Thermal Cycler (Perkin Elmer Cetus Instruments)(2', 94°C; 2', 55°C; 2', 72°C) folgte eine Gelreinigung der erwarteten DNA-Fragmente von 400+ Basenpaaren (bp). Vor der Subklonierung der DNAs in ein glattendiges Zwischenplasmid (pSP72, Promega) wurden sie mittels T4-Polynukleotidkinase (Boehringer Mannheim) terminal phosphoryliert. Mehrere Klone, welche diese PCR-amplifizierten Sequenzen repräsentierten, wurden aus transformierten DH5-E.coli, ausplattiert auf LB-Agarplatten mit 50 μg/ml Ampicilin, die gemäß beschriebenen Verfahren gezüchtet worden waren (Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982), isoliert, Plasmid-DNAs wurden aus den Bakterien unter Anwendung der DNA-Präparationsverfahren von Birnboim und Doly, Nucleic Acid Res. 7: 1515 (1979), extrahiert und die doppelsträngigen Plasmid-DNAs wurden DNA-Sequenzbestimmungen unterworfen unter Verwendung von Sequenase^® (United States Biochemicals) und T7- und SP6-spezifischen Sequenzierungsprimern (Boehringer Mannheim) und unter Anwendung der vom Hersteller empfohlenen Protokollen. Eine einmalige DNA-Sequenz, repräsentierend eine variable Region der schweren Kette von Maus-Ig2a, wurde erhalten, ebenso eine Sequenz der variablen Region einer leichten Kappa-Kette.
Um das endgültige Erscheinungsbild einer „furnierten" leichten Mauskette zu ergeben, wurden mehrere Reste innerhalb einer Matrize, bestehend aus dem humanen LEN-Gerüst, in welches die für 1B4 beschriebenen CDRs gepfropft worden waren, durch die entsprechenen Reste ersetzt, die in dem Gerüst der leichten Kette von Maus-1B4 gefunden worden waren. Der Ersatz der Reste der variablen Region von humanem LEN durch diejenigen, welche nur in dem MAb 1B4 vorkommen, geschah wie folgt. Acht Oligodesoxynukleotide (5) wurden synthetisiert, welche die Primer repräsentierten, die zur Erzeugung von vier DNA-Fragmenten mittels PCR-Amplifizierung erforderlich waren. Inkorporiert in alle mit Ausnahme der terminalen Oligodesoxynukleotide wurden diejenigen Sequenzen, welche den zu punktmutierenden Gerüst-Resten der variablen Region der leichten Kette des MAb 1B4 entsprachen, und mindestens 15 Basen 5'-terminaler Komplementarität (siehe 6). Das entsprechende Primerpaar (jeweils 50 pmol) wurde kombiniert mit 10 ng Plasmid-DNA, enthaltend ein 1B4-CDR-gepfropftes LEN-Gerüst, 2,5 Einheiten Taq DNA-Polymerase, PCR-Reaktionskomponenten und Puffer, und fünfundzwanzig (25) PCR-Amplifizierungszyklen folgten (Zyklusperioden: 1', 94°C; 1', 55°C; 2', 72°C). Die Produkte der vier Reaktionen, gereinigt durch Agarosegelelektrophorese, wurden kombiniert (10 ng eines jeden DNA-Fragments) mit einem terminalen Oligodesoxynukleotid-Primerpaar (Amplifizierer)(5 und 6), Taq-DNA-Polymerase, PCR-Reaktionskomponenten und Puffer, und die anschließenden rekombinierten Fragmente wurden wie oben beschrieben für 25 Zyklen (siehe 6) amplifiziert. Nach Restriktionsendonukleaseverdauung mit Hind III und Xba I wurde die amplifizierte DNA aus einem Agarosegel gereinigt und in die gleichen Stellen eines Zwischenvektors pSP72 (Promega) subkloniert, welcher die konstante Region der humanen leichten Kappa-Kette enthielt, erhalten wie folgt. DNA (1 μg), gereinigt aus einer humanen B-Zellinie (GM01018A; NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository, Institute for Medical Research, Camden, N.J. 08103), wurde als Matrize für die in 4 beschriebenen Oligodesoxynukleotid-Primer verwendet, um ein 920-Basenpaar-Fragment, enthaltend den Splice-Akzeptor für die konstante Domäne der humanen leichten Kappa-Kette, das Exon und einen Teil seiner 3'-untranslatierten Region, zu amplifizieren (die Wahl des PCR-Primerpaars basierte auf der von Hieter et al., Cell 22: 197–207 (1980), beschriebenen Sequenz der konstanten Region von Kappa. Das PCR-Produkt wurde mittels Agarosegelelektrophorese gereinigt, mit Bam H1-Endonuklease verdaut und in pSP72 (Promega) subkloniert, der zuvor mit Bam H1 linearisiert worden war.
Die individuellen Klone, repräsentierend den pSP72-Zwischenvektor, der sowohl die „furnierte" variable Region der leichten Kette von 1B4, erhalten wie oben beschrieben, als auch die konstante Region von humanem Kappa, erhalten durch PCR-Amplifizierung humaner DNA, enthielt, wurden verwendet, um die DNA-Sequenz der „furnierten" variablen Region der leichten Kette zu verifizieren. Der „furnierte" Anteil der schweren Kette des rekombinanten Antikörpers stammte von einer punktmutierten variablen Region der schweren Kette von Maus-1B4, fusioniert mit der humanen konstanten Region des Gamma-4-Subtyps, erhalten von einer Lambda-Bank, die von Flanagan und Rabbitts erstellt worden war, Nature 300: 709–713 (1982).
Die variable Region der „furnierten" schweren Kette wurde konstruiert aus 5 DNA-Fragmenten, repräsentierend eine Signalsequenz, mutierte Abschnitte der variablen Region der schweren Kette von Maus-1B4 und eine Intronsequenz (8). Oligodesoxynukleotid-Primerpaare (5) wurden synthetisiert, welche die zur Erzeugung dieser 5 DNA-Fragmente mittels PCR-Amplifizierung von 10 ng Plasmid-DNA-Matrize, enthaltend die variable Region der schweren Kette von Maus-1B4, die zuvor verwendet worden war, um die CDR- und Gerüst-Sequenzen von Maus-1B4 zu bestimmen, erforderlichen Primer darstellten. Die Amplifizierung der fünf Fragmente erfolgte wie oben für die vier Fragmente der variablen Region der leichten Kette beschrieben. Die agarosegel-gereinigten Produkte wurden kombiniert (10 ng eines jeden Produkts) mit terminalen Primerpaaren (5) und die PCR-erzeugte, in vitro rekombinierte Matrize wurde mit Hilfe des Standardverfahrens amplifiziert, welches ebenfalls oben zur Rekombination der Fragmente, welche die „furnierte" variable Region der leichten Kette umfassen, beschrieben wurde. Vor der Subklonierung in einen mit Hind III und Bam H1 verdauten Expressionsvektor wurde dieses rekombinierte Produkt gleichermaßen verdaut und agarosegel-gereinigt. DNA wurde nach der Kultiverung individueller Bakterienklone erhalten und einer DNA-Sequenzbestimmung unter Verwendung von Sequenase^® und T7- und SP6-spezifischen Sequenzierungsprimern unterworfen, um die Sequenz der rekonstruierten variablen Region und ihrer flankierenden Domänen zu verifizieren.
Die konstante Region der schweren Kette Gamma 4 wurde als ein 6,7-Kb-Hind III-Fragment, erhalten aus dem Plasmid pAT84 (Flanagan und Rabbitts, supra), in die Hind III-Stelle des Zwischenvektors pSP72 (Promega) subkloniert. Dieses Plasmid wurde dann als die Matrizen-DNA verwendet, von der eine verkürzte Version der konstanten Region von Gamma 4 unter Verwendung der oben beschriebenen Standard-PCR-Amplifizierungsverfahren und der in 4 angegebenen Primerpaare erhalten wurde. Eukaryotische Expressionsvektoren wurden konstruiert wie unten beschrieben, so dass das Immunglobulinmolekül der schweren Kette von einem Plasmid transkribiert wurde, welches den Neomycin (G418)-Resistenzmarker trug (Rothstein und Reznikoff, Cell 23: 191–199 [1981]), während das Immunglobulin der leichten Kette von einem Plasmid transkribiert wurde, welches den Hygromycin B-Resistenzmarker trug (Gritz und Davies, Gene 25: 179–188 [1983]). Mit Ausnahme des Arzneiwirkstoffresistenz-Anteils dieser Plasmide sind sie identisch.
Der Vorläufer der Immunglobulin-Expressionsvektoren war der eukaryotische Expressionsvektor pD5 (Berkner und Sharp, Nucl. Acids Res. 13: 841–857 [1985]), welcher den Adenovirus-Replikationsursprung, die SV40-Enhancerdomäne, den späten Adenovirus-Hauptpromotor, den dreiteiligen Adenovirus 2-Leader, einen 5'-Splice-Donor von dem dritten Adenovirus-Leader und einen 3'-Splice-Akzeptor von einem Immunglobulin-Locus, eine Mehrfachklonierungsstelle und das späte SV40-Polyadenylierungssignal enthielt (10). Der Replikationsursprung wurde mittels Verdauung mit Eco R1 und Kpn I entfernt und durch zwei Fragmente ersetzt, welche das mit Neomycin selektierbare Markergen (erhalten aus dem Plasmid pCMVIE-AK1-DHFR (Silberklang et al., Modern Approaches to Animal Cell Technology, Hrsg. Spier et al., Butterworth, U.K., [1987]) als ein Eco R1/Bam H1-Fragment von 1,8 Kb) und den Enhancer der schweren Ig-Kette (erhalten als PCR-amplifiziertes Fragment unter Verwendung von oben beschriebenen Standardverfahren und humaner DNA als Matrize; das Oligodesoxynukleotid-Primerpaar ist in 4 aufgelistet) nach seiner Verdauung mit Bgl II und Kpn I repräsentieren. Es wurde festgestellt, dass dem resultierenden Expressionsvektor ein kleiner Teil des TK-Promotors, verantwortlich für die Transkription des Neomycingens, fehlte. Dieser wurde ersetzt durch Insertion eines PCR-amplifizierten Fragments von 0,14 kb, erhalten aus der CMVIE-AK1-DHFR-DNA unter Verwendung des ebenfalls in 4 aufgeführten Primerpaares, in die Eco R1-Stelle. Der resultierende Expressionsvektor der schweren Kette wurde anschließend modifiziert durch Entfernung der angezeigten Hind III- und Xba I-Stellen.
Zur Überführung dieses mit Neomycin selektierbaren Vektors in einen Vektor, welcher den mit Hygromycin B selektierbaren Marker exprimiert (11), wurde die Neomycinresistenzkassette durch zunächst Verdauung mit Eco R1, gefolgt von einer DNA-Polymerase-gesteuerten Auffüllung des 5'-Überhangs und anschließender Sal I-Verdauung, entfernt. Die Hygromycin B-Expressionskassette von 1,9 kb [TK-Promotor und TK-Polyadenylierungssignal, welche das Hygromycin B-Gen flankieren, erhalten von Gritz und Davies, Gene 25: 179–188 (1983), als 1,9-kb-Bam H1-Fragment in einem Plasmid (pLG90)] wurde aus dem Plasmid pAL-2 durch Bam H1-Verdauung entfernt und in die Bam H1-Stelle des Zwischenvektors pSp72 (Promega) subkloniert. Die Hygromycin B-Kassette wurde aus diesem Vektor durch Verdauung mit Sma I und Sal I entfernt und in den Expressionsvektor kloniert, der wie oben beschrieben linearisiert worden war, um ein DNA-Fragment mit einem glatten Ende und einem Sal I-Ende zu erzeugen.
Die Expression der „furnierten" leichten Kappa-Kette von 1B4 wurde erzielt durch Überführung dieses Cistrons aus seiner Position in dem Zwischenvektor pSP72 in den mit Hygromycin B selektierbaren eukaryotischen Expressionsvektor (7). Ein 1,5-kb-DNA-Fragment, resultierend aus dem Endonukleaseverdau des Zwischenvektors v1B4VK/pSP72 mit Spe I und Cla I, wurde mittels Agarosegelelektrophorese gereinigt und in den Expressionsvektor ligiert, welcher zuvor durch Verdauung mit denselben beiden Restriktionsenzymen linearisiert und agarosegel-gereinigt worden war.
Der eukaryotische Expressionsvektor der „furnierten" schweren Kette von 1B4 wurde in einem Schritt (9) aus einem existierenden Vektor konstruiert, der zuvor konstruiert worden war, um eine chimäre Form der schweren Kette von 1B4 zu exprimieren. Die durch PCR-Amplifizierung erzeugte „furnierte" variable Region der schweren Kette (8) wurde mit Hind III und Bam H1 verdaut. Das agarosegel-gereinigte 0,8-kb-Fragment wurde in die Hind III- und Bam H1-Stellen des Expressionsvektors pD5/IgH-Enhancer/Neo/1B4-VH Short Human C-Gamma 4 nach dessen Endonukleaseverdauung mit diesen beiden Enzymen und anschließender Reinigung durch Agarosegelelektrophorese (9) ligiert. Transformanten, welche sowohl variable als auch konstante Regionen enthielten, wurden identifiziert. Plasmid-DNAs wurden kultiviert (Maniatis et al., oben) und für die Transfektion in Säuger-Empfängerzellen gereinigt (Maniatis et al., oben; Birnboim und Doly, oben).
Gleiche Mengen (10 μg) der Plasmide, welche für die „furnierte" schwere Kette von IgG4 und die „furnierte" leichte-Kappa-Kette kodierten, wurden mit Standard-Calciumphosphatpräzipi tationsverfahren in humane 293-Zellen und CV-1P-Nierenzellen der afrikanischen Grünen Meerkatze transfiziert. Die Kulturüberstandsflüssigkeiten wurden einem Assay mit einem Trapping-ELISA (unten beschrieben) hinsichtlich der Sekretion eines IgG4-Immunglobulins, das eine humane leichte Kappa-Kette enthält, unterworfen.
Ein ELISA wurde entwickelt zur quantitativen Bestimmung der Menge eines rekombinanten 1B4-Antikörpers, der in konditioniertem Säugerzell-Wachstumsmedium exprimiert wurde. Immulon-2-Platten mit 96 Mulden (Dynatech Labs.) werden über Nacht mit einer Lösung von 5 μg/ml eines monoklonalen Mausantikörpers gegen die humane konstante Domäne einer Kappa-Kette (Katalog Nr. M0009, The Binding Site, Inc., San Diego, Ca) in 0,1 M NaHCO₃-Puffer (pH 8,2) bei 4°C überschichtet und mit 1% Rinderserum (BSA) in 0,1 M NaHCO₃ für eine Stunde bei 25°C blockiert. Nach diesem und allen nachfolgenden Schritten wurde ein Waschschritt mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) durchgeführt. Die Mulden werden dann mit konditioniertem Medium herausgefordert, das rekombinanten Anti-CD18-Antikörper enthält, oder mit vorbestimmten Mengen an humanem IgG4, gereinigt mittels Protein A-Sepharose^®-Chromatographie (Pharmacia Fine Chemicals) aus humanem IgG4-Myelom-Serum (Katalog Nr. BP026, The Binding Site, Inc.). Alle Proben werden in PBS mit 0,05% Tween^®-20 verdünnt. 100-μl-Aliquots werden in dreifacher Ausführung eine Stunde lang bei 37°C inkubiert und Standardkalibrierungskurven werden unter Verwendung von IgG4-Konzentrationen im Bereich von 10 ng/ml bis 100 ng/ml erstellt. Gebundene und voll assemblierte humane IgG4 (entweder nativ oder rekombinante „furnierte" humane IgG4-Konstrukte von 1B4) werden mit 100-μl-Aliquots einer 1:500-Verdünnung von monoklonalem Mausantikörper gegen humanes IgG4-Fc, konjugiert mit alkalischer Phosphatase (Katalog Nr. 05-3822, Zymed Laboratories, Inc.), in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), enthaltend 1% BSA, nachgewiesen. Nach Inkubation für 1 Stunde bei 37°C und anschließendem Waschen wurden die Mengen an gebundenem Konjugat nachgewiesen durch Inkubation aller Proben mit einer Lösung von 1 mg/ml p-Nitrophenylphosphat in 0,1 M 2,2'-Aminomethylpropandiol-Puffer, pH 10,3, für 30 Minuten bei 25°C. Die Extinktion der Mulden wird mit einem UV Max ELISA-Plattenleser (Molecular Devices), auf 405 nm eingestellt, bestimmt. Alle Überstandsflüssigkeiten enthalten dieses Immunglobulin, allerdings in verschiedenen Mengen. Der von den transfizierten 293-Zellen sekretierte Antikörper wird mittels Protein A-Chromatographie konzentriert, wobei die Konzentrationen des rekombinanten humanen „furnierten" Anti-CD18-Antikörpers durch den oben beschriebenen Trapping-ELISA bestimmt werden, und dazu verwendet, mit der Bindung von radioaktiv markiertem Maus-1B4 an den CD18-Liganden auf der Oberfläche von aktivierten humanen PMNs zu konkurrieren. Die Affinitäten verschiedener Anti-CD18-Antikörper-Konstrukte werden mit Hilfe eines kompetitiven ¹²⁵I-m1B4-Lösungs-Bindungsassays mit stimulierten humanen polymorphkernigen Leukozyten (PMNs) bestimmt. Gereinigter monoklonaler Anti-CD18-Mausantikörper (50 μg; m1B4) wird mittels Chloramin-T iodiert (Hunter, W. M., und Greenwood, F. C., Nature 194: 495–496, 1962) und der radioaktiv markierte Antikörper mit Hilfe einer Bio-Sil^®-TSK250-Gelfiltrations-HPLC-Säule (Biorad, Richmond, CA) (welche Proteine im Bereich von 1–300 × 10³ Dalton fraktioniert), äquilibriert in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0, gereinigt. Die Radioaktivität des Ausflusses wird mit einem eingebauten Detektor (Beckman Model 170; Beckman, Fullerton, CA) überwacht und das Gesamtprotein bei OD₂₈₀ mit einem Kratos Spectroflow 757 Detektor (Kratos, Mawah, N.J.) gemessen. Ein einzelner ¹²⁵I-m1B4-Peak, bestehend aus der zusammenfallenden OD₂₈₀ und Radioaktivitätsmarkierung, eluiert charakteristischerweise 6 Minuten, 30 Sekunden nach der Probeninjektion. Die spezifische Aktivität des Produkts beträgt gewöhnlich etwa 10 μCi/μg Protein und 97–99% der Zählimpulse sind mit 10 %iger Trichloressigsäure fällbar. Die Bindung dieses radioaktiv markierten Antikörpers wird mit humanen PMNs festgestellt, die mit einem diskontinuierlichen Ficoll/Hypaque-Gradienten gereinigt (English, D., und Anderson, B. R., J. Immunol. Methods 5: 249–255, 1974) und mit 100 ng/ml Phorbolmyristatacetat für 20 Minuten bei 37°C (Lo et al., J. Exp. Med. 169: 1779–1793, 1989) aktiviert wurden. Zur Feststellung der Avidität von Antikörpern für CD18-Moleküle auf der PMN-Oberfläche werden etwa 1 × 10⁵ aktivierte PMNs in einem Puffer wie Hanks ausgewogener Salzlösung, die 20 mM Hepes (pH 7,2), etwa 0,14 Einheiten Aprotinin (Sigma Chemical Co.) und 2% Humanserumalbumin enthält, (Bindungspuffer), enthaltend 1,3 ng ¹²⁵I-m1B4 (2,8 × 10^–11 M), in Gegenwart von zunehmenden Konzentrationen an unmarkiertem m1B4-Antikörper (10^–7 bis 10^–5 M) in einem Reaktionsvolumen von 300 μl für etwa 1 Stunde bei etwa 4°C mit konstanter mechanischer Bewegung inkubiert. Zellgebundenes 1B4 wird von dem ungebundenen Antikörper separiert mittels Zentrifugation durch ein Kissen von 0,5 M Sucrose (4.800 × g, 3 Minuten); die Röhrchen werden auf Trockeneis eingefroren und die Spitzen abgeschnitten und mit einem LKB-Gammazähler gezählt. Der IC₅₀-Wert des Anti-CD18-Antikörpers für die Inhibierung von ¹²⁵I-m1B4-Antikörperbindung wird berechnet unter Verwendung eines Vier-Parameter-Anpassungsprogramms (Rodbard, D., Munson, P. J., und DeLean in „Radioimmunoassay and Related Procedures in Medicine", International Atomic Energy Agency, Wien, Bd. 1, 469–504, 1978). Die Affinität des „furnierten" Anti-CD18-Antikörpers für den CD18-Liganden wird auf ähnliche Weise bestimmt unter Verwendung von murinem ¹²⁵I-m1B4-Antikörper und zunehmenden Mengen, wie mit dem Trapping-ELISA bestimmt, von unmarkiertem „furnierten" Anti-CD18. Die Ergebnisse der Bindungsassays sind in 13 gezeigt und zeigen an, dass die Avidität des rekombinanten 1B4-Antikörpers mit „furnierten" schweren und leichten Ketten gleich derjenigen des monoklonalen Maus-1B4-Antikörpers ist.
Die Expressionsvektoren für die „furnierten" schweren und leichten Ketten wurden in CV1P-Affennierenzellen cotransfiziert, wobei 20 μg eines jeden Plasmids verwendet wurden, um 2 ml der Calciumphosphatpräzipitat-Lösung herzustellen. 1 ml wurde in das Medium eingebracht, das jede 100-mm-Schale von CV1P-Zellen überschichtete. Nach 4 h bei 37°C wurde das Medium durch 1 ml 15%iges Glycerin in 1 × HBS (hepes-gepufferte Salzlösung) ersetzt. Nach dem dreiminütigen Glycerinschock wurden 10 ml PBs zugegegeben, die Zellmonoschichten wurden abgesaugt, einmal mit 10 ml PBs gewaschen und erneut mit frischem Medium (DMEM + 10% hitzeinaktiviertes Serum neugeborener Kälber), enthaltend 200 μg Hygromycin B und 800 μg G418 pro ml, versorgt. Klonierungszylinder (Fishney, in Culture of Animal Cells, Alan R. Liss, Inc., New York, 1983) wurden zur Isolierung individueller Kolonien vor ihrer Expansion und dem nachfolgenden Assay hinsichtlich Produktivität verwendet. Zwei Klone, #11 und #48, wurden befunden, ausreichende Mengen von v1B4 zu exprimieren, um deren Expansion und schließliche Hinterlegung zu rechtfertigen.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1. Lösungsmittelexposition von Seitenketten von Gerüst-Resten in KOL- und J539-Fvs und die Reste, welche am häufigsten an diesen Positionen in den verschiedenen humanen VH-Subgruppen auftreten
2. Lösungsmittelexposition von Seitenketten von Gerüst-Resten in KOL-VL und die Reste, welche am häufigsten an diesen Positionen in den verschiedenen humanen V-Lambda-Subgruppen auftreten
3. Lösungsmittelexposition von Seitenketten von Gerüst-Resten in J539-VL und die Reste, welche am häufigsten an diesen Positionen in den verschiedenen humanen-V-Kappa-Subgruppen auftreten
4. Primer, welche zur Isolierung von DNA, kodierend für die variable Region der leichten Kappa-Kette der Maus und die variable Region der schweren IgG2a-Kette der Maus, unter Anwendung von PCR verwendet wurden; Oligodesoxynukleotide, welche als PCR-Primer verwendet wurden, um eine verkürzte schwere IgG4-Kette zu erzeugen; Oligodesoxynukleotide, welche bei einer PCR zur Umgestaltung des Thymidinkinase (TK)-Promotors verwendet wurden, um die Expression des Neomycinresistenz-Gens zu erleichtern; Oligodesoxynukleotid-Primer, welche bei einer PCR verwendet wurden, um die IgH-Enhancer-Sequenz zu klonieren; Oligodesoxynukleotide, welche als PCR-Primer verwendet wurden, um eine konstante Region der humanen leichten Kappa-Kette zu erzeugen
5. Oligonukleotide, welche bei der Konstruktion der „furnierten" variablen Regionen der schweren und leichten Ketten von 1B4 verwendet wurden, und diejenigen, welche zur Verschmelzung der humanen Signalsequenzen und Intronsequenzen mit diesen variablen Regionen erforderlich sind
6. PCR-Rekombinationsstrategie, welche beim „Furnieren" der variablen Region der leichten 1B4-Kappa-Kette verwendet wurde
7. Darstellung der Insertion der „furnierten" variablen Region der leichten Kappa-Kette und der konstanten Kappa-Region in den Expressionsvektor für die leichte Kette
8. PCR-Rekombinationsstrategie, welche beim Furnieren der variablen Region der schweren 1B4-Kette verwendet wurde
9. Darstellung der Insertion der „furnierten" variablen Region der schweren Kette in den Expressionsvektor für die schwere Kette
10. Darstellung der Konstruktion des neomycin-selektierbaren Expressionsvektors
11. Darstellung der Konstruktion des hygromycin-selektierbaren Expressionsvektors
12. Aminosäuresequenzvervollständigung der variablen Regionen der schweren Kette von „furniertem" 1B4, Maus-1B4 und Human-Gal und der variablen Regionen der leichten Kappa-Kette von „furniertem" 1B4, Maus-1B4 und Human-Len. Die Prüfzeichen geben die individuellen Aminosäurereste an, welche überführt wurden.
13. Kompetitiver Bindungsassay von nativem Maus-1B4 (offene Rauten) und rekombinantem „furnierten" 1B4 (ausgefüllte Rauten).

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Immunglobulins mit den Ligandenbindungseigenschaften eines Immunglobulins von einer ersten Säugerspezies und der Immunogenizität eines Immunglobulins von einer zweiten Säugerspezies, umfassend: a) Vergleichen einer variablen Domäne eines Immunglobulins der ersten Säugerspezies mit den variablen Domänen von Immunglobulinen der zweiten Säugerspezies bei korrespondierenden Gerüst-Aminosäuresequenzen; b) Auswählen derjenigen variablen Domäne aus den variablen Domänen der zweiten Säugerspezies, welche der variablen Domäne der ersten Säugerspezies bei korrespondierenden Gerüst-Aminosäuresequenzen am ähnlichsten ist; c) Identifizieren von Gerüst-Aminosäureresten der variablen Domäne der ersten Säugerspezies, welche sich von den Aminosäureresten an der korrespondierenden Position der in Abschnitt b) ausgewählten variablen Domäne unterscheiden, wobei die unterschiedlichen Aminosäurereste auf diejenigen mit einer relativen Zugänglichkeit (fractional accessibility) von mindestens 0,61, welche nicht neben einer komplementaritäts-bestimmenden Region liegen, beschränkt sind; d) Ersetzen nur derjenigen Aminosäurereste, welche in Abschnitt c) identifiziert wurden, durch die korrespondierenden Reste, welche in der in Abschnitt b) ausgewählten Sequenz vorliegen; e) Herstellen einer DNA-Sequenz, welche für das gemäß Abschnitt d) hergestellte Immunglobulin kodiert; f) Einfügen der DNA-Sequenz in einen replizierbaren Expressionsvektor, welcher funktionsfähig mit einem geeigneten Promoter, der mit einer Wirtszelle kompatibel ist, verknüpft ist; g) Transformieren einer Wirtszelle mit dem Vektor von Abschnitt f); h) Kultivieren der Wirtszelle, und i) Gewinnen des Immunglobulins aus der Wirtszellkultur.