KR100806914B1 - 퇴행성 신경질환의 예방 및 치료를 위한 리포칼린 2의 신규한 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 퇴행성 신경질환의 치료 및 진단을 위한 리포칼린 2의 신규한 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 리포칼린 2를 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물, 리포칼린 2에 특이적인 항체 또는 프라이머를 포함하는 퇴행성 신경질환 진단용 조성물 및 상기 리포칼린 2의 발현을 조절하는 제제를 선별하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

본 발명의 약학적 조성물은 활성화된 소교세포의 세포독성약제에 대한 감수성을 증가시킴으로써 아폽토시스를 촉진하여 과도한 소교세포의 활성화로 인해 유발되는 퇴행성 신경질환을 예방 및 치료할 수 있다. 또한, 리포칼린 2는 퇴행성 신경질환의 진단, 병의 진행 상태 및 치료전후의 예후를 평가하기 위한 진단 마커로서 사용할 수 있으며, 퇴행성 신경질환 치료제의 스크리닝을 위한 타겟으로도 이용될 수 있다.

퇴행성 신경질환, 리포칼린 2, 진단

Description

퇴행성 신경질환의 예방 및 치료를 위한 리포칼린 2의 신규한 용도{Novel use of lipocalin 2 for preventing and treating neurodegenerative disease}

도 1은 아폽토시스-저항성 BV-LS13 세포에 SNP를 처리한 후 세포 생존율을 MTT 분석으로 분석한 결과이다.

도 2는 모세포(BV-2) 및 변이세포(BV-LS13)의 전체 유전자 발현 프로파일을 cDNA 마이크로어레이 분석한 결과이다.

도 3은 아폽토시스-저항성 BV-LS13 세포에서 리포칼린-2 및 ATFx mRNA의 발현을 RT-PCR로 분석한 결과이다.

도 4는 아폽토시스-저항성 BV-LS13 세포에서 리포칼린-2 단백질의 발현을 웨스턴 블롯으로 분석한 결과이다.

도 5는 리포칼린 2 과발현 형질전환 세포주(S1 및 S3)에서 리포칼린-2의 mRNA 및 단백질의 발현을 RT-PCR 및 웨스턴 블롯으로 분석한 결과이다.

E1: 빈 벡터로 형질전환시킨 형질전환 세포주

도 6은 리포칼린 2 과발현 형질전환 세포주(S1 및 S3)에 SNP 또는 SNAP를 처리한 다음 세포 생존율을 MTT 분석으로 분석한 결과이다.

도 7은 리포칼린 2 과발현 형질전환 세포주(S1 및 S3)에 SNP를 처리한 다음 세포 생존율을 유세포 분석으로 분석한 결과이다.

*: p<0.05에서 유의적인 차이가 있음을 나타냄.

도 8은 리포칼린 2 과발현 형질전환 세포주(S1 및 S3)에 세포독성 약제를 처리한 다음 세포의 생존율을 MTT 분석으로 분석한 결과이다.

도 9는 리포칼린 2 녹다운 형질전환 세포주에서 리포칼린 2 단백질의 발현을 웨스턴 블롯으로 분석한 결과이다.

도 10은 리포칼린 2 녹다운 형질전환 세포주에 SNP 또는 SNAP를 처리한 다음 세포의 생존율을 MTT 분석으로 분석한 결과이다.

도 11은 재조합 리포칼린 2 단백질의 전기영동 결과이다.

도 12는 소교세포에 재조합 리포칼린 2 단백질을 처리한 다음 세포의 생존율을 MTT 분석에 의해 분석한 결과이다.

*: p<0.05에서 유의적인 차이가 있음.

**:p<0.01에서 유의적인 차이가 있음.

도 13은 소교세포에 재조합 리포칼린 2 단백질 및 철 킬레이트제를 처리하고 세포의 생존율을 MTT 분석에 의해 분석한 결과이다.

*: p<0.05에서 유의적인 차이가 있음.

도 14는 소교세포에 염증 또는 자극인자를 처리한 다음 리포칼린 2 단백질의 발현을 웨스턴 블롯으로 분석한 결과이다.

도 15는 소교세포에서 리포칼린 2 수용체의 발현을 RT-PCR로 확인한 결과이다.

도 16은 BV-2 세포, 리포칼린 2 과발현 세포(S1 및 S3)에 SNP를 처리한 다음 Bcl-2 패밀리 단백질의 발현을 웨스턴 블롯으로 분석한 결과이다.

도 17은 리포칼린 2 과발현 형질전환 세포주의 형태변화를 위상차현미경으로 관찰한 사진이다(배율 × 200).

도 18은 일차 배양된 소교세포에 재조합 리포칼린 2 단백질 또는 LPS를 처리하고 소교세포의 형태변화를 위상차현미경으로 관찰한 사진이다(배율 × 100).

도 19는 일차 배양된 소교세포에 재조합 리포칼린 2 단백질 또는 LPS를 처리하고 소교세포의 분지화 감소 정도를 백분율로 나타낸 그래프이다.

도 20은 일차 배양된 소교세포에 재조합 리포칼린 2 단백질, ATP, 포스콜린, A23187을 각각 처리하고 소교세포의 형태변화를 위상차현미경으로 관찰한 사진이다(배율 × 100).

도 21은 일차 배양된 소교세포에 재조합 리포칼린 2 단백질, ATP, 포스콜린, A23187을 처리하고 소교세포의 분지화 감소 정도를 백분율로 나타낸 그래프이다.

도 22는 BV-2 세포 또는 일차 배양된 소교세포에 소교세포의 탈분지화를 유도하는 인자를 처리하고 세포의 생존율을 MTT 분석(A) 및 유세포 분석(B)에 의해 조사한 결과이다.

-: 처리하지 않음.

+: 처리함.

*: p<0.05에서 유의적인 차이가 있음.

도 23은 리포칼린 2의 소교세포의 아폽토시스 및 형태 조절 기작을 나타낸 모식도이다.

본 발명은 퇴행성 신경질환의 치료 및 진단을 위한 리포칼린 2의 신규한 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 리포칼린 2를 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물, 리포칼린 2에 특이적인 항체 또는 프라이머를 포함하는 퇴행성 신경질환 진단용 조성물 및 상기 리포칼린 2의 발현을 조절하는 제제를 선별하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

퇴행성 신경질환은 중추신경계의 신경세포에 퇴행성 변화가 나타나면서 운동 및 감각기능의 손상, 기억, 학습, 연산 추리 등의 고차적원인 기능의 저해와 같은 여러 가지 증상을 유발하는 질환이다. 대표적인 질환으로는 파킨슨 질환(Parkinson's disease), 알츠하이머 질환(Alzheimer's disease) 및 기억장해 등이 있다. 퇴행성 신경질환은 급격히 혹은 천천히 진행되는 괴사(necrosis)나 아폽토시스(apoptosis)에 의한 신경세포의 사멸로 특징지어 진다. 따라서 신경세포의 사멸기전에 대한 이해는 중추신경계 질환의 예방, 조절 및 치료법 개발을 위하여 반드시 이루어져야 한다.

중추신경계는 신경세포와 신경교세포로 이루어져 있다. 신경교세포는 전체 뇌세포의 90%, 부피로는 뇌 전체의 50%를 차지하고 있다. 상기 신경교세포는 다시 성상세포(astrocytes), 소교세포(microglia) 및 희소돌기아교세포(oligodendro cytes)의 세 종류로 구성되어 있다.

이들 중에서 소교세포(microglia)는 중추신경계(central nervous system, CNS)에 상재하는 면역세포로서(Stoll and Jander, Prog Neurobiol 58:233-247, 1999; Kim and de Vellis, J Neurosci Res 81:302-313, 2005) 전체 뇌 세포의 5-10%를 차지한다. 상기 소교세포는 CNS에서 일차 방어라인으로서 기능한다. 자극을 받는 경우, 휴지기의 분지 형태 소교세포는 아메바 형태로 전환되어(Giulian et al., J Neurosci 15:7712-7726, 1995), CNS 내의 면역 및 염증 반응에 적극적으로 관여한다(Aloisi, Glia 36:165-179, 2001). 이러한 소교세포의 형태 변화는 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo)에서 관찰된 바 있으나(Perry and Gordon, Trends Neurosci 11:273-277, 1998; Suzumura et al., Brain Res 545:301-306, 1991;Raivich et al., Brain Res Rev 30:77-105, 1999), 이에 대한 정확한 기작은 아직 규명되어 있지 않는다. 활성화된 소교세포는 손상된 신경 조직 영역으로 이동하여 미생물 및 세포 파편(cell debris)을 포식하고 파괴한다(Gehrmann et al., Brain Res Rev 20:269-287, 1995). 염증세포로서의 소교세포의 역할은 항상 유익한 것만은 아니다. 현재, 조절되지 않은 소교세포의 활성화와 지속적인 과도한 신경염증은 퇴행성 신경질환(neurodegenerative diseases)을 포함하는 다양한 CNS 병 리의 원인으로 여겨지고 있다(Gonzalez-Scarano and Baltuch, Annu Rev Neurosci 22:219-240, 1999). 즉, 기능적으로 활성화된 소교세포는 염증매개물질을 생성 및 분비하여 신경세포 사멸을 초래하는 것으로 알려져 있다. 따라서 소교세포의 활성화는 다양한 종류의 퇴행성 신경질환과 관련이 있다. 예를 들어, 알츠하이머 질환의 경우에도 노용균반점(senile plague)의 형성에 소교세포가 중요한 역할을 한다는 것은 매우 잘 알려져 있다 (Wegiel, J. et al., Acta Neuropathol (Berl), 100(4):356-64, 2000). 이브프로펜 등과 같은 소염제가 노용균반점의 형성을 억제하며 치매 발병을 예방할 수 있다는 것이 중요한 예이다(Weggen, S. et al., Nature, 414:212-216, 2001; Wyss-Coray, T. and Mucke, L., Nat. Med., 6:973-974, 2000; Lim, G. P. et al., J. Neurosci 20:5709-5714, 2000). 그러므로 소교세포의 염증성 활성화는 엄격하게 조절되어야하며 자가-조절 기작을 통해 활성화된 소교세포의 아폽토시스에 의한 제거가 이루어져야 한다(Jones et al., J Neurocytol 26:755-770, 1997; Kingham et al., J Neurochem 73:538-547, 1999; Lee et al., J Biol Chem 276:32956-32965, 2001a; Lee et al., Brain Res 892:380-385, 2001b; Liu et al., J Neurochem 77:182-189, 2001). 림프구의 활성화에 의해 유도되는 세포사멸(activation-induced cell death, AICD)과 유사한 방식으로 CNS에서 염증성 세포가 아폽토시스될 수 있다고 보고 된 바 있다(Lee et al., Brain Res 892:380-385, 2001b; Suk et al., Brain Res 900:342-347, 2001; Suk, Curr Enzyme Inhibition 1:43-50, 2005).

그러나 현재까지 신경염증 반응의 종결 및 소교세포의 자가-조절 아폽토시스 의 분자학적 기작에 대해서는 알려진 바가 없다.

리포칼린 2(Lipocalin 2)는 리포칼린 패밀리의 일원으로 지질 및 다른 종류의 소수성 분자에 결합하거나 이들을 운반하는 것으로 알려져 있다(Flower et al., Biochem Biophys Acta 1482:9-24, 2000; Kjeldsen et al., Biochem Biophys Acta 1482:272-283, 2000). 또한, 리포칼린 2는 24p3(Flower et al., Biochem Biophys Res Commun 180:69-74, 1991), 24kDa 수퍼인듀서블 단백질(SIP24)(Hamilton et al., J Cell Physiol 123:201-208, 1985) 및 호중구 젤라티나아제-관련 리포칼린(NGAL; a human homologue of lcn2)(Kjeldsen et al., J Biol Chem 268:10425-10432, 1993; Borregaard and Cowland, Biometals 19:211-215, 2006)으로 알려져 있다.

리포칼린 2는 다양한 기능을 가지고 있다. 시험관내 연구에서 리포칼린 2는 세포의 아폽토시스 및 생존에 중요한 역할을 한다고 보고 된 바 있다(Devireddy et al., Science 293:829-834, 2001; Yousefi and Simon, Cell Death Differ 9:595-597, 2002; Tong et al., Biochem J 372:203-210, 2003; Devireddy et al., Cell 123:1293-1305, 2005; Tong et al., Biochem J 391:441-448, 2005). 또한, 리포칼린 2는 배발생(embryogenesis) 동안 신장에서 세포 분화를 유도하는 역할을 수행하고(Yang et al., Mol Cell 10:1045-1056, 2002) 허혈 손상으로부터 신장을 보호하는 것으로 알려져 있다(Mishra et al., J Am Soc Nephrol 15:3073-3082, 2004; Mori et al., J Clin Invest 115:610-621, 2005). 다양한 형태의 위장 손상에 있 어서, 리포칼린 2는 세포 이동을 촉진하여 점막 재생을 용이하게 한다(Playford et al., Gastroenterology 131:809-817, 2006).

한편, 리포칼린 2-결손 마우스를 이용한 생체 내 연구에서 리포칼린 2가 신장 보호에 있어서 반대의 작용을 하는 것으로 주장된 바 있다(Berger et al., Proc Natl Acad Sci USA 103:1834-1839, 2006). 또한, 리포칼린 2-결손 마우스는 철을 제거하지 못하므로 박테리아 감염에 대한 감수성이 증가되는 것으로 나타났다. 이는 리포칼린 2가 박테리아 감염에 대한 보호 작용을 수행함을 보여준다(Flo et al., Nature 432:917-921, 2004). 이밖에도 리포칼린 2가 분해로부터 호중구 젤라티나아제를 보호하고(Yan et al., J Biol Chem 276:37258-37265, 2001), 급성 면역 단백질로서 작용함이 알려져 있다(Liu and Nilsen-Hamilton, J Biol Chem 270:22565-22570, 1995). 최근에 리포칼린 2에 대한 2개의 세포 수용체가 규명되었다. 저밀도 지단백 수용체 패밀리의 일원인 메갈린(Megalin)이 인간 리포칼린 2에 결합하고 이의 세포 업테이크(uptake)를 매개하는 것으로 나타났다(Hvidberg et al., FEBS Lett 579:773-777, 2005). 리포칼린 2의 또 다른 세포 표면 수용체로는 뇌 타입 유기 양이온 트랜스포터가 있으며며, 이는 선택적으로 아폽토시스를 매개하는 것으로 나타났다(Devireddy et al., Cell 123:1293-1305, 2005). 수용체가 동정되었음에도 불구하고, 세포 생존 및 사멸에 있어서 리포칼린 2의 정확한 역할은 아직 규명되지 않았다.

이에 본 발명자들은 소교세포의 자가-조절 아폽토시스 기작을 규명하기 위해 아폽토시스-저항성 소교세포를 제조하고 이의 특징을 연구하던 중 아폽토시스-저항성 소교세포에서 리포칼린 2의 발현이 유의적으로 하향조절되므로 소교세포의 아폽토시스에 있어서 리포칼린 2가 중요한 역할을 수행할 것임을 추정하고 이러한 추정을 다양한 실험을 통해 확증한 후 리포칼린 2를 퇴행성 신경질환의 예측 및 진단을 위한 바이오마커로 사용하거나 퇴행성 신경질환 치료제의 스크리닝을 위한 타겟으로 사용할 수 있으며 나아가, 퇴행성 신경질환을 예방 및 치료하는데 있어서 리포칼린 2를 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 퇴행성 신경질환의 진단 및 치료를 위한 리포칼린 2의 신규한 용도를 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 리포칼린 2를 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 리포칼린 2에 특이적인 항체 또는 프라이머를 포함하는 퇴행성 신경질환의 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 리포칼린 2를 발현하는 세포 또는 실험동물에 시험물질을접촉시키거나 투여하여 리포칼린 2의 발현에 영향을 주는 약제를 선별하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 활성화된 소교세포의 자가-조절 아폽토시스 기작을 처음으로 규명하였다는 데에 큰 의의가 있다. 보다 구체적으로 본 발명에서 규명한 소교세포의 자가-조절 아폽토시스 기작은 다음과 같다. 활성화된 소교세포는 리포칼린 2 단백질을 분비하고 분비된 단백질이 소교세포의 형태 변화를 유도하며 소교세포를 아폽토시스 신호에 대해 감작시켜 활성화된 소교세포가 자가-조절 아폽토시스에 의해 제거되도록 한다(도 23 참조).

본 발명자들은 이와 같은 소교세포의 자가-조절 아폽토시스의 분자학적 기작을 규명하기 위해 먼저, 아폽토시스-저항성 소교세포를 확립하고 이의 특성을 규명하였다.

즉, 본 발명의 일 실시예에서는 아폽토시스를 유발하는 주요 세포독성 매개체인 일산화질소의 독성에 대해 저항성을 가지는 BV-2 마우스 소교세포 변이주 클론을 선별함으로써 아폽토시스-저항성 소교세포 변이주를 확립하였다(실시예 1 참조). 본 발명의 다른 실시예에서는 상기에서 선별된 변이주의 특성을 조사하고자 모세포와 변이세포의 전체 유전자 발현 프로파일을 cDNA 마이크로어레이 분석에 의해 비교한 결과(실시예 <2-1> 참조), 본 발명의 아폽토시스-저항성 변이주의 경우 리포칼린 2 mRNA의 발현이 모세포에 비해 5배 이상 감소한 것으로 나타났다(도 2 참조). 이러한 리포칼린 2의 발현 감소는 mRNA 수준 및 단백질 수준에서 RT-PCR(실시예 <2-2> 참조) 및 웨스턴 블롯(실시예 <2-3> 참조)에 의해 확인되었다(도 3 및 도 4 참조).

이에 본 발명자들은 리포칼린 2와 소교세포의 아폽토시스와의 관련성을 보다 구체적으로 규명하기 위해, 리포칼린 2 과발현 소교세포 및 리포칼린 2 녹아웃 소교세포를 각각 제조하고 이들의 특성을 확인하였다.

즉, 본 발명의 일 실시예에서는 리포칼린 2 과발현 소교세포를 제조하고(실시예 <3-1> 참조) 상기 세포에 NO 공여자를 처리한 후 이들의 세포 생존율을 MTT 분석(실시예 <3-3> 참조) 및 유세포 분석(실시예 <3-4> 참조)에 의해 조사하였다. 그 결과, 리포칼린 2는 NO 공여자에 대한 소교세포의 감수성을 증가시킴을 확인할 수 있었다(도 6 및 도 7 참조). 또한, NO 공여자 이외에 다른 종류의 세포독성 약제에 대한 소교세포의 감수성에 미치는 리포칼린 2의 영향을 조사한 결과(실시예 <3-5> 참조), 리포칼린 2의 과발현에 의해 소교세포가 다양한 종류의 세포독성 약제에 대해서도 감수성이 증가함을 확인할 수 있었다(도 8 참조).

반대로, 리포칼린 2 녹다운 소교세포의 경우 리포칼린 2의 녹다운에 의해 NO 공여자에 대한 세포의 감수성이 감소함을 확인할 수 있었다(도 10 참조).

나아가, 본 발명자들은 재조합 리포칼린 2 단백질을 제조하고(실시예 <5-1> 참조) 상기 단백질의 처리가 소교세포의 아폽토시스에 미치는 영향을 조사하였다(실시예 <5-2> 참조). 그 결과, 재조합 리포칼린 2 단백질 단독으로는 소교세포의 생존에 영향을 주지 않으나 NO의 세포독성에 대한 소교세포의 감수성은 증가시킴을 알 수 있었다(도 12 참조). 한편, 이러한 재조합 리포칼린 2 단백질의 활성은 철 킬레이트제의 첨가에 의해 제거되었다(도 13 참조).

상기 실험 결과로부터 리포칼린 2가 소교세포의 프로아폽토시스 활성을 가지고 있음을 알 수 있었으며 이러한 프로아폽토시스 활성은 철 트랜스포트 및 대사와 관련이 있음을 알 수 있었다.

한편, 리포칼린 2는 급성 면역 단백질(acute phase protein)로 보고 된 바 있으며(Liu and Nilsen-Hamilton, J Biol Chem 270:22565-22570, 1995), 마크로파지에서 리포칼린 2의 발현은 염증 자극에 의해 조절되는 것으로 알려져 있다(Meheus et al., J Immunol 151:1535-1547, 1993; Liu and Nilsen-Hamilton, J Biol Chem 270:22565-22570, 1995; Cowland et al., J Immunol 171:6630-6639, 2003). 이에 따라 본 발명자들은 소교세포에서 리포칼린 2의 발현이 염증 또는 독성 자극에 의해 조절되는지를 조사하였다(실시예 6 참조). 그 결과, 리포칼린 2의 발현은 염증 또는 독성 자극인자에 의해 증가되는 것으로 나타났다(도 14 참조).

한편, 본 발명의 다른 실시예에서는 소교세포에서 리포칼린 2 수용체가 발현됨을 확인하였다(도 15 참조). 이로부터 본 발명자들은 소교세포에서 리포칼린 2의 프로아폽토시스 효과는 리포칼린 2 수용체에 의해 매개됨을 알 수 있었다.

이전에 Bcl-2 패밀리 단백질들은 리포칼린 2의 세포사멸 기작과 관련이 있다고 보고 된 바 있다(Yousefi and Simon, Cell Death Differ 9:595-597, 2002; Tong et al., Biochem J 372:203-210, 2003; Devireddy et al., Cell 123:1293-1305, 2005). 이에 본 발명자들은 소교세포에서 Bcl-2 패밀리 단백질의 발현을 조사한 결과 Bcl-2 패밀리 단백질들의 발현은 리포칼린 2의 상향조절이나 NO 공여자의 처리에 의해 유의적으로 영향을 받지 않는 것으로 나타났다(도 16 참조). 이로부터 Bcl-2 패밀리 단백질은 소교세포에서 리포칼린 2의 아폽토시스-감작 효과와 직접적인 관련성이 없음을 알 수 있었다.

한편, 건강한 뇌의 소교세포는 소세포체와 2차분지를 가지는 긴 돌기로 이루어진 전형적인 분지 형태를 가진다. 소교세포의 형태 변화는 뇌손상, 감염, 자가면역 및 신경질환과 같은 넓은 범위의 중추신경계 질환에서 관찰되었다(Perry and Gordon, Trends Neurosci 11:273-277, 1998; Suzumura et al., Brain Res 545:30-306, 1991; Raivich et al., Brain Res Rev 30:77-105, 1999). 이러한 병리 조건하에서, 분지형 소교세포는 그들의 돌기가 수축되고 세포체가 확장되어 아메바 형태로 전환된다. 이와 같은 형태 변화는 소교세포의 활성화와 관련이 있으며 LPS, IFNγ, 라미닌, APT 등을 포함하는 다양한 자극인자에 의해 실험관 내에서 유도된다(Chamak and Mallat, Neuroscience 45:513-527, 1991; Giulian et al., J Neurosci 15:7712-7726, 1995; Bohatschek et al., J Neurosci Res 64:508-522, 2001; Kloss et al., Exp Neurol 168:32-46, 2001; Kalla et al., Glia 41:50-63, 2003; Xiang et al, J Neurosci Res 83:91-101, 2006). 그러나 현재까지 분지형 소교세포에서 아메바 형 소교세포 형태적 변화가 일어나는 기작은 규명되어 있지 않다.

이에 본 발명자들은 리포칼린 2가 소교세포의 형태변화에 미치는 영향을 조사하였다(실시예 9 내지 10 참조). 그 결과, 리포칼린 2의 과발현 또는 재조합 리포칼린 2 단백질의 처리는 소교세포의 탈분지화를 유도함을 확인할 수 있었다(도 17 내지 도 19 참조).

본 발명자들은 리포칼린 2가 소교세포의 아폽토시스 및 탈분지화에 작용함을 확인한 후 마지막으로, 소교세포의 형태변화와 아폽토시스와의 관련성을 조사하였다. 이를 위해 소교세포의 형태변화를 유도하는 것으로 알려진 다른 자극인자(칼슘 이오노포어, ATP, 포스콜린)를 소교세포에 처리하고 생존율을 측정한 결과 이들 모두는 소교세포의 NO에 의해 유도되는 아폽토시스에 대한 감수성을 증가시킴을 확인할 수 있었다(도 22 참조). 이러한 결과는 소교세포의 탈분지화가 아폽토시스 감수성과 밀접한 관련성이 있음을 나타낸다.

상기 실험결과를 종합해 보면, 다음과 같다.

1) 아폽토시스-저항성 소교세포에서 리포칼린 2 발현이 하향조절된다.

2) 리포칼린 2 cDNA 형질감염(과발현)은 아폽토시스 감수성을 증가시킨다.

3) 리포칼린 2 발현의 녹아웃은 아폽토시스 감수성을 감소시킨다.

4) 재조합 리포칼린 2 단백질은 리포칼린 cDNA 형질감염의 프로아폽토시스 효과를 모방한다.

5) 리포칼린 2 cDNA 형질감염 및 재조합 리포칼린 2 단백질은 소교세포의 탈분지화를 유도한다.

상술한 바와 같이 본 발명자들은 소교세포 분비 단백질인 리포칼린 2가 활성화된 소교세포의 탈분지화를 유도하며 아폽토시스에 대한 감수성을 증가시키는 작용을 수행함을 규명하였다.

한편, 소교세포의 과도한 활성화는 퇴행성 신경질환과 관련이 있다. 따라서 이러한 소교세포의 활성화를 억제하거나 활성화된 소교세포가 분비하는 염증유발 물질의 작용을 억제하는 약제들이 퇴행성 신경질환의 치료제로 사용되고 있다. 일단 활성화되거나 증식된 면역세포들은 아폽토시스라는 과정을 거쳐 사멸하게 되는데 소교세포 역시 이러한 과정을 거쳐 그 활성 정도가 조절될 것으로 사료된다.

따라서 소교세포의 아폽토시스에 대한 감수성을 증가시키는 것으로 규명된 리포칼린 2를 이용하면 소교세포의 과도한 활성화로 인해 유발된 퇴행성 신경질환을 예방 및 치료할 수 있다.

그러므로 본 발명은 리포칼린 2 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산을 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 "리포칼린 2 단백질"은 바람직하게는 인간을 포함하는 포유동물로부터 유래된 것을 말한다. 바람직하게는, 상기 리포칼린 2 단백질은 인간 또는 마우스로부터 유래된 것일 수 있으며 각각의 아미노산 서열은 서열번호 1 또는 서열번호 3에 나타낸 바와 같다. 또한, 본 발명에서 상기 리포칼린 2 단백질의 범주로 이의 기능적 동등물 및 전구체도 포함한다. 상기에서 기능적 동등물이란 리포칼린 2 단백질과 실질적으로 동등한 생리활성을 나타내며 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 단백질을 말한다. 상기 기능적 동등물은 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열 중 일부가 부가, 치환 또는 결실의 결과 생성된 것일 수 있다. 상기에서 아미노산의 치환은 보존적 치환인 것이 바람직하다.

본 발명에서 "리포칼린 2 핵산"은 상기 리포칼린 2 단백질을 암호화하는 DNA 또는 RNA를 말한다. 바람직하게는 상기 리포칼린 2 핵산은 서열번호 2(인간 유래) 또는 서열번호 4(마우스 유래)의 폴리뉴클레오타이드를 갖는다. 상기 핵산은 이중쇄 또는 단쇄일 수 있다.

상기 핵산은 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 발현 벡터 내로 공지의 방법에 의해 도입시킨 후 상기 발현 벡터를 당업계에 공지된 다양한 방법으로 감 염(infection) 또는 형질도입(transduction)에 의해 발현형으로 표적 세포 내에 도입시킬 수 있다.

플라스미드 발현 벡터는 사람에게 사용할 수 있는 FDA의 승인된 유전자 전달방법으로 사람 세포에 직접적으로 플라스미드 DNA를 전달하는 방법이다(Nabel, E. G., et al., Science, 249:1285-1288, 1990). 플라스미드 DNA는 바이러스 벡터와는 달리 균질하게 정제될 수 있는 장점이 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 플라스미드 발현 벡터로는 당업계에 공지된 포유동물 발현 플라스미드를 사용할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 pRK5(유럽특허 제307,247호), pSV16B(국제특허공개 제91/08291호) 및 pVL1392(PharMingen) 등이 대표적이다. 본 발명의 일 실시예에서는 pcDNA3(Invitrogen) 플라스미드를 사용하였다.

본 발명에 따른 핵산을 포함하는 플라스미드 발현 벡터(plasmid expression vector)는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated trans fection), 전기침공법(electropora tion), 유전자 건(gene gun) 및 세포 내로 DNA를 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 종양세포 내로 도입할 수 있다(Wu et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio. Chem., 263:14621-14624, 1988). 바람직하게는, 일시적 형질감염방법을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 바이러스 발현 벡터로는 이에 한정되지는 않으나, 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 허피스바이러스(herpes virus) 및 아비폭스바이러스(avipox virus) 등이 포함된다.

본 발명에서 사용된 용어 "퇴행성 신경질환(neurodegenerative disease)"이란 뇌의 일부분의 신경세포가 서서히 퇴화하면서 신경전달에 장애가 생겨 발생하는 질환을 말한다. 퇴행성 신경질환의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 루게릭 질환, 헌팅톤 질환, 다발성 경화증 등이 있다.

상기 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).상기 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있다. 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는, 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.

상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기에서 '유효량' 이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 바람직하게는 1~10000㎍/체중kg/day, 더욱 바람직하게는 10~1000㎎/체중kg /day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다.

나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 세포독성을 나타내는 당업계에 공지된 약제와 함께 병용투여될 수 있다. 세포독성을 나타내는 약제로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 아자티오프린(Azathiopine), 사이클로포스파미드 (Cyclophosphamide), 빈크리스틴(Vincristine), 메토트레세이트(methotrexate), 사이타라빈(cytarabine), 다티노마이신(datinomycin) 등이 있다.

또한, 소교세포의 아폽토시스에 대한 감수성을 증가시키는 것으로 규명된 리포칼린 2의 발현을 측정함으로써 퇴행성 신경질환을 예측 및/또는 진단할 수 있다. 즉, 생체 내 리포칼린 2의 발현정도를 측정함으로써 소교세포의 활성화 정도 및 활성화된 소교세포의 자가-조절 아폽토시스 정도를 예측하여 퇴행성 신경질환의 진단, 병의 진행 상태 및 치료전후의 예후의 평가를 위한 진단 마커로서 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 리포칼린 2를 이용한 퇴행성 신경질환의 진단 및 예후 평가는 생물학적 시료 중에서 리포칼린 2 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산을 검출하고 검출된 량을 정량하여 정상상태와 비교함으로써 수행될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "진단 마커"란 조직 및 세포에서 발현되고 이의 발현 여부를 확인함으로써 질병의 발병을 확인할 수 있는 물질, 바람직하게는 정상 조직과 질병이 발병된 조직에서 유의한 차이를 보이는 단백질 또는 mRNA 등과 같은 유기 생체 분자를 의미한다. 본 발명에서 진단 마커는 리포칼린 2이며 리포칼린 2 의 발현 정도를 단백질 수준 또는/및 mRNA 수준에서 확인함으로써 퇴행성 신경질환을 진단할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "생물학적 시료" 또는 "시료"는 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 시료, 생검 표본, 조직 배양과 같은 고형 조직 시료 또는 이로부터 유래된 세포가 포함된다. 보다 구체적으로 예를 들면 이에 한정되지는 않으나 조직, 추출물, 세포 용해물, 전혈, 혈장, 혈청, 침, 안구액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 젖, 복수액, 활액, 복막액 등일 수 있다. 상기 시료는 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간으로부터 수득될 수 있다. 상기 시료는 검출에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 시료로부터 핵산 및 단백질을 분리하여 검출에 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "검출"은 표적 리포칼린 2 단백질, 그의 서브 유닛 또는 이를 암호화하는 핵산의 존재를 분석 및 영상화하는 것을 말한다.

상기 리포칼린 2의 발현을 단백질 수준에서 검출하는 방법으로는 당 업계에 공지된 다양한 분석방법을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 시료를 리포칼린 2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시켜 항원-항체 복합체의 형성여부를 측정한다.

본 발명에서 용어 "항원-항체 복합체"란 생물학적 시료 중의 리포칼린 2 단백질과 이를 특이적으로 인지하는 항체의 결합물을 의미한다.

따라서 본 발명은 리포칼린 2 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 퇴행성 신경질환의 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명에 사용되는 항체는 단클론 또는 다클론 항체, 면역학적으로 활성인 단편(예를 들어, Fab 또는 (Fab)₂ 단편), 항체 중쇄, 인간화 항체, 항체 경쇄, 유전자 조작된 단일쇄 Fν 분자, 키메릭 항체 등일 수 있다.

리포칼린 2 단백질은 공지된 단백질이므로 본 발명에 사용되는 항체는 리포칼린 2 단백질을 항원으로 하여 면역학 분야에서 널리 알려져 있는 통상의 방법으로 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 항체의 항원으로서 사용되는 리포칼린 2 단백질은 천연에서 추출하거나 합성될 수 있으며 DNA 서열을 기초로 하여 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다. 유전자 재조합 기술을 이용할 경우 리포칼린 2 단백질을 코딩하는 핵산을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체에서 리포칼린 2 단백질이 발현되도록 숙주 세포를 배양한 후 형질전환체로부터 리포칼린 2 단백질을 회수함으로써 수득될 수 있다.

예를 들어, 다클론 항체는 리포칼린 2 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 항체는 말, 소, 염소, 양, 개, 닭, 칠면조, 토끼, 마우스 또는 래트와 같은 여러 온혈 동물을 이용하여 제조할 수 있다.

단클론 항체도 공지된 융합방법(fusion method)(Kohler and Milstein, European J. Immnunol. 6:511-519 1976), 재조합 DNA 방법(미국특허 제4816567호) 및 파지 항체 라이브러리(Clackson et al., Nature, 352, 624-628, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 58:1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다.

본 발명의 진단용 조성물은 리포칼린 2 단백질에 특이적인 항체이외에 면역학적 분석에 사용되는 당 업계에 공지된 시약을 추가로 포함할 수 있다.

상기에서 면역학적 분석은 항원과 항체의 결합을 측정할 수 있는 있는 방법이라면 모두 포함될 수 있다. 이러한 방법들은 당 분야에 공지되어 있으며 예를 들어, 면역세포화학 및 면역조직화학, 방사선 면역 분석법(radioimmunoassays), 효소결합면역법(ELISA: Enzyme Linked Immunoabsorbent assay), 면역 블롯(immunoblotting), 파아르 분석법(Farr assay), 면역침강, 라텍스 응집, 적혈구 응집, 비탁계법, 면역확산법, 카운터-전류 전기영동법, 단일 라디칼 면역확산법, 면역크로마토그래피법, 단백질 칩 및 면역형광법이 있다.

면역학적 분석에 사용되는 시약으로는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제가 포함된다. 또한, 표지물질이 효소인 경우에는 효소활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다.

상기에서 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지는 항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게 하며, 이의 예로는 효소, 형광물질, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사성 동위원소 등을 사용 할 수 있다. 효소로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라아제, 글리코즈 옥시다아제, 헥소키나제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산디하이드로게나아제, 인버타아제 등을 사용할 수 있다. 형광물로는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, 플루오르신이소티옥시아네이트 등을 사용할 수 있다. 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 있으며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있다. 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있고 레독스 분자로는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있다. 방사성 동위원소로는 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁸⁶Re 등이 있다. 그러나 상기 예시된 것들 외에 면역학적 분석법에 사용할 수 있은 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 진단용 조성물은 진단의 신속도 및 편리성을 높이기 위해, 적합한 담체 또는 지지체상에 공지된 다양한 방법을 이용하여 고정화된 상태로 제공될 수 있다(Antibodies: A Labotory Manual, Harlow ＆ Lane; Cold SpringHarbor, 1988). 적합한 담체 또는 지지체의 예로는 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카복시메틸 셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 유리, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 컵, 플랫 팩(flat packs) 등 이 포함된다. 그 외의 다른 고체 기질로는 세포 배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성 막이 있다. 상기 지지체는 임의의 가능한 형태, 예를 들어 구형(비드), 원통형(시험관 또는 웰 내면), 평면형(시트, 시험 스트립)을 가질 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 리포칼린 2 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 퇴행성 신경질환 진단용 조성물은 진단용 키트 또는 마이크로어레이 형태로 제공될 수 있다.

상기 진단용 키트로는 예를 들면, 혈청 시료 중의 리포칼린 2 단백질을 검출하기 위해 면역크로마토그래피법을 기초로 하는 측방 유동 검정 키트(lateral flow assay kit)의 형태로 제공될 수 있다. 측방 유동 검정 키트는 혈청 시료가 적용되는 샘플패드(sample pad), 탐지용 항체가 코팅되어 있는 방출패드(releasing pad), 시료가 이동하여 분리되고 항원-항체 반응이 일어나는 전개용 막(예를 들어 니트로셀룰로스) 또는 스트립, 그리고 흡수패드(absorption pad)로 이루어져 있다.

상기 마이크로어레이는 일반적으로 특정 시약으로 처리된 슬라이드 글라스 표면 위에 리포칼린 2에 특이적인 항체를 부착하여 항원-항체 반응에 의해 상기 항체에 특이적으로 부착하는 단백질을 검출할 수 있다.

상기 리포칼린 2의 발현을 mRNA 수준에서 검출하는 방법으로는 당 업계에 공지된 다양한 분석방법을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 리포칼린 2 핵산의 검출은 리포칼린 2를 암호화하는 핵산 분자 또는 상기 핵산 분자의 상보물에 하이브리 드화되는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하는 증폭반응에 의해 수행될 수 있다.

보다 구체적으로 프라이머를 이용한 리포칼린 2 핵산의 검출은 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 리포칼린 2 유전자 서열을 증폭한 다음 당 분야에 공지된 방법으로 유전자의 증폭여부를 확인함으로써 수행될 수 있다.

따라서 본 발명은 리포칼린 2 핵산에 특이적인 프라이머를 포함하는 퇴행성 신경질환의 진단용 조성물을 제공한다.

상기 "프라이머"란 짧은 자유 수산화기를 가지는 핵산서열로서 상보적인 템플레이트와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산서열을 말한다. 리포칼린 2 핵산을 증폭하기 위한 프라이머는 당 분야에 공지된 방법에 의해 용이하게 제조할 수 있다. 적합한 프라이머는 리포칼린 2 핵산 분자의 일부를 증폭시킬 수 있는 것으로서 리포칼린 2 핵산 중 7개 이상의 연속적인 아미노산을 암호화하는 핵산 서열을 기본으로 한다. 일반적으로 상기 프라이머는 17-25bp, 바람직하게는 20bp의 길이를 가지며, 리포칼린 2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 약 60%, 바람직하게는 약 75% 이상, 보다 바람직하게는 약 90% 이상의 서열 상동성을 갖는다. 예를 들면, 상기 프라이머는 서열번호 4로 표시되는 마우스 유래 리포칼린 2의 핵산 서열 중 276-295번 또는 622-641번의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 프라이머는 서열번호 5 및 서열번호 6의 서열을 갖는 것일 수 있다.

상기 프라이머를 이용하여 AGR-2 핵산을 검출할 수 있는 방법으로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 중합효소 연쇄반응(PCR), DNA 시퀀싱, RT-PCR, 프라이머 연장법(Nikiforeov et al., Nucl Acids Res 22, 4167-4175, 1994), 올리고뉴클레오타이드 연장 분석(Nickerson et al., Pro Nat Acad Sci USA, 87, 8923-8927, 1990), 대립형질 특이적 PCR법(Rust et al., Nucl Acids Res, 6, 3623-3629, 1993), RNase 불일치 절단(RNase mismatch cleavage, Myers et al., Science, 230, 1242-1246, 1985), 단일가닥 입체 다형화(single strand conformation lymorphism, Orita et al., Pro Nat Acad Sci USA, 86, 2766-2770, 1989), SSCP 및 헤테로두플렉스 동시 분석법(Lee et al., Mol Cells, 5:668-672, 1995), 변성 구배 젤 전기영동(DGGE, Cariello et al., Am J Hum Genet, 42, 726-734, 1988), 변성 고압 액체 크로마토그래피(denaturing high performance liquid chromatography, Underhill et al., Genome Res, 7, 996-1005, 1997), 혼성화 반응, DNA 칩 등이 있다. 상기 혼성화 반응의 예로는 노던 하이브리다이제이션(Maniatis T. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Habor Laboratory, NY, 1982), 인시츄 하이브리다이제이션(Jacquemier et al., Bull Cancer, 90:31-8, 2003) 및 마이크로어레이(Macgregor, Expert Rev Mol Diagn 3:185-200, 2003) 방법 등이 있다.

상기 본 발명의 난소암 진단용 조성물은 상술한 리포칼린 2 핵산을 검출하는 방법에 일반적으로 사용되는 시약을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, PCR 반응에 요구되는 dNTP(deoxynucleotide triphosphate), 내열성 중합효소(polymerase), 염화마그네슘 등의 금속이온염이 포함할 수 있으며, 시퀀싱에 요구되는 dNTP, 시쿼 나제(sequenase) 등을 포함할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 퇴행성 신경질환의 진단용 조성물은 진단용 키트 또는 마이크로어레이의 형태로 제공될 수 있다.

나아가, 본 발명은 퇴행성 신경질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

보다 구체적으로, 본 발명의 퇴행성 신경질환 치료제 스크리닝 방법은 (a) 시험물질을 리포칼린 2 발현 세포와 접촉시키는 단계; 및

(b) 상기 (a) 단계의 세포로부터 리포칼린 2의 발현 수준을 측정하는 단계; 및

(c) 상기 (a) 단계의 시험물질이 리포칼린 2의 발현을 촉진 또는 억제하는지 여부를 확인하는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명의 퇴행성 신경질환 치료제의 스크리닝 방법은 (a) 시험물질을 동물모델에 투여하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계의 동물모델로부터 유래된 생물학적 시료에서 리포칼린 2의 양을 측정하는 단계; 및

(c) 상기 (a) 단계의 시험물질이 리포칼린 2의 발현을 촉진 또는 억제하는지 여부를 확인하는 단계를 포함한다.

본 발명에서 사용된 용어 "시험물질(test agent)"은 임의의 물 질(substance), 분자(molecule), 원소(element), 화합물(compound), 실재물(entity) 또는 이들의 조합을 포함한다. 예컨대, 이에 제한되지는 않으나, 단백질, 폴리펩티드, 소유기 물질(small organic molecule), 다당류(polysaccharide), 폴리뉴클레오티드 등을 포함한다. 또한 자연 산물(natural product), 합성 화합물 또는 화학 화합물 또는 2개 이상의 물질의 조합일 수도 있다. 다르게 지정되지 않는 한, 제제, 물질 및 화합물은 호환성 있게(interchangeably) 사용할 수 있다.

본 발명의 방법으로 스크리닝되거나 동정될 수 있는 시험물질은 폴리펩티드, 베타-턴 미메틱(beta-turn mimetics), 다당류, 인지질, 호르몬, 프로스타글란딘, 스테로이드, 방향족 화합물, 헤테로사이클릭 화합물, 벤조디아제핀(benzodiazepines), 올리고머릭 N-치환 글리신(oligomeric N-substituted glycines), 올리고카르바메이트(oligocarbamates), 당류(saccharides), 지방산, 퓨린, 피리미딘 또는 이들의 유도체, 구조적 아날로그 또는 조합을 포함한다. 상기 시험물질은 합성 또는 자연 화합물의 라이브러리를 포함하는 광범위하고 다양한 출처로부터 얻어질 수 있다. 바람직하게는, 상기 시험물질은 펩타이드, 예컨대, 약 5-30개, 바람직하게는 약 5-20개, 보다 바람직하게는 약 7-15개의 아미노산을 가지는 펩타이드일 수 있다. 상기 펩타이드는 자연적으로 생성되는 단백질, 랜덤 펩티드 또는 "바이어스화(biased)" 랜덤 펩티드의 절단물일 수 있다.

또한 상기 시험물질은 "핵산"일 수 있다. 핵산 시험물질은 자연적으로 생성되는 핵산, 랜덤 핵산, 또는 "바이어스화" 랜덤 핵산일 수 있다.

또한 상기 시험물질은 소분자(예: 약 1,000 이하의 분자량을 갖는 분자)일 수 있다. 소분자의 조절 제제를 스크리닝하기 위한 방법에는 바람직하게는 고속 분석 어세이(high throughput assay)가 적용될 수 있다.

상기에서 리포칼린 2의 발현 정도는 단백질 및/또는 mRNA 수준에서 상술한 바와 같은 면역분석학적 방법, 하이브리드화 반응 및 증폭반응에 의해 측정될 수 있다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에 만 한정되는 것은 아니다.

I. 아폽토시스-저항성 소교세포 변이주의 확립 및 특성 규명

<실시예 1>

아폽토시스 저항성 소교세포 변이주의 확립

일산화질소(NO)는 활성화된 소교세포 아폽토시스에 있어서 주요 세포독성 매개체이다. 따라서 아폽토시스 저항성 소교세포 변이주를 확립하기 위해, NO 독성에 대해 저항성을 가지는 BV-2 마우스 소교세포 변이주 클론을 선별하였다.

BV-2 마우스 소교세포주(고려대학교 최의주 교수로부터 제공받음)는 5% FBS(fetal bovine serum), 2mM 글루타민 및 페니실린-스트렙토마이신(Giboco, Gaithersburg, MD)을 함유한 DMEM에서 배양하였다. 상기 BV-2 마우스 소교세포에 NO 공여자인 SNP(sodium nitroprusside)를 0.3mM 처리하여 26시간 동안 배양한 후 NO 세포독성에 저항성을 나타내는 소교세포 변이주 클론을 선별하고 BV-LS13으로 명명하였다.

상기 BV-LS13의 NO에 의해 유도되는 아폽토시스 저항성을 확인하기 위하여 상기 세포(5×10⁴ cell/200㎕)를 96웰 플레이트에 넣고 0.50, 0.75, 1.00 및 1.25mM의 농도로 SNP를 각각 처리하여 26일간 배양한 후 세포의 생존율을 MTT 분석에 의해 조사하였다. 그 다음 배양 배지를 제거하고 3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드(MTT; 0.5mg/ml)를 첨가한 후 CO₂ 배양기에서 37℃로 2시간 동안 배양하였다. 불용성 결정체를 DMSO에 완전히 용해시킨 후 마이크로플레이트 리더(Anthos Labtec Instruments GmbH, Salzburg, Austria)를 사용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기 실험은 3회 반복하고 실험 결과를 평균±표준편차로 나타내었다. 다른 그룹과의 차이는 스튜던트 T 테스트 또는 그래프패드 프리즘 프로그램(GraphPad Software Inc.)을 이용한 던칸의 다중 비교 및 원-웨이 아노바 테스트를 사용하여 통계적으로 분석하였다. p 값이 0.05 미만인 경우에 통계적으로 유의적인 차이가 있는 것으로 간주하였다.

실험 결과, 본 발명의 BV-LS13 변이주는 모세포(BV-2)와는 달리 NO에 의해 유도되는 아폽토시스에 대해 완벽한 저항성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다(도 1).

<실시예 2>

아폽토시스 저항성 소교세포 변이주의 유전자 발현 특성

<2-1> 마이크로어레이 분석에 의한 유전자 발현 프로파일 분석

모세포(BV-2)와 변이세포(BV-LS13)의 전체 유전자 발현 프로파일을 cDNA 마이크로어레이 분석에 의해 비교하였다. cDNA 마이크로어레이 분석은 7,636 cDNA 스팟을 포함하는 플래티넘 바이오칩(Platinum Biochip) 마우스 7.4k cDNA 칩을 이용하여 치노체크사(GenoCheck Ltd, Ansan, Korea)에서 수행하였다. 데이터 분석은 GenePix pro 4.1 소프트웨어를 이용하여 수행하였다. 이전에 공지된 방법에 따라 비-형질전환(non-transformed) 스팟의 강도를 플롯팅하고 표준화한 다음 추가로 분석하였다. 마이크로어레이에 포함된 유전자의 전체 리스트와 상세한 실험 프로토콜은 웹사이트(www.genocheck.com)에서 확인할 수 있다.

실험 결과, 본 발명의 BV-LS13 변이 세포주에서 리포칼린 2 mRNA의 발현이 모세포(BV-2 세포)에 비해 5배 이상 감소한 것으로 나타났다(도 2).

<2-2> RT-PCR에 의한 리포칼린 2의 mRNA 수준에서의 발현 감소 분석

BV-LS13 세포에서 리포칼린 2의 mRNA 수준에서의 발현 감소를 RT-PCR을 이용 하여 확인하였다. 또한 ATFx의 발현이 조혈 세포 아폽토시스의 프로세스에 있어서 상기 리포칼린 2와는 상반되게 조절된다고 보고 된 바 있으므로(Devireddy et al., Science 293:829-834, 2001; Persengiev et al., Genes Dev 16:1806-1814, 2002), ATFx의 발현도 조사하였다.

모세포(BV-2)와 변이주(BV-LS13)로부터 각각의 총 RNA를 트리졸 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 추출하였다. 상기 총 RNA를 수퍼스크립트(Gibco-BRL) 및 올리고(dT) 프라이머를 이용하여 역전사하였다. 그 다음 표 1의 프라이머를 이용하여 어닐링 온도 55℃에서 30-40 사이클로 PCR 증폭을 수행하였다.

RT-PCR에 사용한 프라이머

프라이머		서열	서열번호	진뱅크 승인 번호	RT-PCR 산물 크기
리포칼린 2	정방향	5’- ATG TCA CCT CCA TCC TGG TC -3’	5	AA087193	363 bp
	역방향	5’- CAC ACT CAC CAC CCA TTC AG -3’	6
ATFx	정방향	5’- ATG GCA TCC CTA CTC AAG AAG GAG -3’	7	NM_030693	366 bp
	역방향	5’- AGC GAC TTA TTC TGG TCT CTC TTC -3’	8
β-액틴	정방향	5’- ATC CTG AAA GAC CTC TAT GC -3’	9	X03672	287 bp
	역방향	5’- AAC GCA GCT CAG TAA CAG TC -3’	10

실험 결과, 변이주(BV-LS13)에서 리포칼린 2의 발현이 모세포(BV-2)에 비해 현저하게 감소되었음을 확인할 수 있었다. 반면, ATFx의 발현은 모세포 및 변이주 세포 사이에서 유의적인 차이를 나타내지 않았다(도 3).

<2-3> 웨스턴 블롯 분석에 의한 리포칼린 2의 단백질 수준에서의 발현 감소 분석

BV-LS13 세포에서 리포칼린 2의 단백질 수준에서의 발현 감소를 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 확인하였다. 모세포(BV-2)와 변이주(BV-LS13) 세포를 각각 트리플-디터전트 용해 버퍼(50mM 트리스-HCl, pH 8.0, 150mM NaCl, 0.02% 소디움 아지드, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.5% 소디움 디옥시콜레이트, 1mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드)로 용해하였다. 세포 용해물 중 단백질 농도를 바이오-라드 단백질 분석 키르를 사용하여 측정하였다. 동일한 양의 단백질을 12% SDS-PAGE로 분리하고 니트로셀룰로스 멤브레인(Hybond ECL nitrocellulose membrane, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)으로 옮겼다. 상기 멤브레인을 5% 스킴 밀크로 블럭킹하고 순차적으로 일차 항체(염소 다클론 항-LCN2 항체, R&D systems 또는 단클론 항-α-튜블린 클론 B-5-1-2 마우스 복수액, Sigma) 및 HRP-컨쥬게이트된 이차 항체(항-토끼 또는 마우스 IgG; Amersham Bioscience)와 함께 배양한 다음 ECL 검출(Amersham Bioscience)을 수행하였다.

실험 결과, 리포칼린 2의 발현은 모세포(BV-2)에 비해 변이주 세포(BV-LS13)에서 현저하게 감소되었음을 확인할 수 있었다(도 4).

Ⅱ. 소교세포에서 리포칼린 2의 프로아폽토시스 활성

<실시예 3>

리포칼린 2 과발현이 소교세포의 아폽토시스에 미치는 영향 조사

상기 실시예 2의 BV-LS13 세포가 아폽토시스-저항성 표현형을 가지는 이유로는 리포칼린-2의 발현이 하향조절되었기 때문이라는 추정을 확인하기 위해 리포칼린 2 과발현 세포를 제조하고, 형질전환 세포주에서 증가된 리포칼린 2의 발현이 세포의 아폽토시스에 미치는 영향을 조사하였다.

<3-1> 리포칼린 2 과발현 세포의 제조

실시예 1의 BV-2 세포를 6-웰 플레이트에 넣고 리포펙타민 시약(lipofectAMINE reagent, Invitrogen)을 이용하여 마우스 리포칼린 2 컨스트럭트 2㎍을 형질감염시켰다. pcDNA3에 클로닝된 마우스 리포칼린 2 포유동물 발현 컨스트럭트는 J.P.Kehrer 박사로부터 제공받았다(University of Texas at Austin, Austin, TX)(Tong et al., Biochem J 391:441-448, 2005). 대조군에는 리포칼린 2가 포함되지 않은 빈 pcDNA3로 형질감염시켰다. 안정적인 형질전환 세포주를 형질감염 후 2일째에 G418(400㎍/ml)의 존재 하에서 선별하여 형질전환 세포주 S1 및 S3를 수득하였다.

<3-2> RT-PCR 및 웨스턴 블롯 분석에 의한 리포칼린 2 과발현 여부 확인

상기 <3-1>에서 수득한 리포칼린 2 과발현 형질전환 세포주(S1 및 S3)에서 리포칼린 2의 mRNA 및 단백질의 발현 수준을 RT-PCR 및 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다.

RT-PCR은 상기 실시예 <2-2>와 동일한 방법으로 수행하였고, 웨스턴 블롯 분석은 상기 실시예 <2-3>과 동일한 방법으로 수행하였다.

실험 결과, 리포칼린 2 과발현 형질전환 세포주(S1 및 S3)의 경우 대조군에 비해 리포칼린 2 mRNA 및 단백질의 발현이 증가하였음을 확인할 수 있었다(도 5).

<3-3> MTT 분석에 의한 리포칼린 2 과발현이 소교세포의 아폽토시스에 미치는 영향 조사

리포칼린 2의 과발현이 소교세포의 아폽토시스에 미치는 영향을 조사하기 위해, 리포칼린 2 과발현 형질전환 세포주에 NO 공여자인 SNP 및 SNAP를 각각 처리하고 이로 인해 유도되는 아폽토시스를 MTT 분석법으로 조사하였다. 한편, NO 공여자 SNP는 NO와 함께 철을 방출한다(Kim et al., Mol Pharmacol 69:1633-1640, 2006). 소량의 철은 소교세포의 생존력(viability)에 영향을 줄 수 있다. 따라서 이러한 SNP의 영향을 배제하기 위해, 철을 방출하지 않는 또 다른 NO 공여자 SNAP(S-nitroso-N-acetylpenicillamine)를 사용하였다.

상기 본 발명의 형질전환 세포주 S1 및 S3에 SNP를 각각 0.25, 0.50, 0.75mM의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. SNAP는 0.5, 1.0, 1.5 및 2.0mM의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 그 다음 형질전환 세포주 S1 및 S3의 생존율을 실시예 1과 동일한 방법으로 MTT 분석을 수행함으로써 조사하였다. 실험 결과는 3회 반복 실험값을 평균±표준편차로 나타내었다.

실험 결과, 리포칼린 2 과발현 형질전환 세포주의 경우 대조군에 비해 NO 공여자에 의한 아폽토시스가 더 많이 유도됨을 확인할 수 있었다. 따라서 리포칼린 2의 과발현은 SNP 및 SNAP와 같은 NO 공여자에 대한 소교세포의 감수성을 증가시킴을 알 수 있었다(도 6).

<3-4> 유세포 분석에 의한 리포칼린 2 과발현이 소교세포의 아폽토시스에 미치는 영향 조사

리포칼린 2의 과발현이 소교세포의 아폽토시스에 미치는 영향을 조사하기 위해, 리포칼린 2 과발현 형질전환 세포주 S1 및 S3에 SNP 0.5mM을 처리하여 24시간 동안 배양한 다음 유세포 분석을 수행하였다.

소교세포를 트립신-EDTA에 부착시킨 다음 차가운 PBS로 2회 세척하였다. 상기 세포를 결합 버퍼(10mM HEPES, 140mM NaCl, 2.5mM CaCl₂, pH 7.4) 250㎕에 재현탁하고 FITC-컨쥬게이트된 아넥신 V(분자 프로브) 3㎕를 처리하여 배양하였다. 상기 세포를 서서히 와동(vortex)시킨 후 실온에서 암 조건으로 15분간 배양하였다. 그 다음 프로피디움 아이오다이드(20㎍/ml)를 첨가하고 1시간 내에 FACSAria(BD Biosciences; San Jose, CA)를 이용하여 유세포 분석을 수행하였다. 분석 결과를 기초로 하여 세포의 아폽토시스 정도를 백분율로 나타내었다. 실험 은 독립적으로 3회 반복실시한 후 실험결과를 평균±표준편차로 나타내었고, 다른 그룹과의 차이는 스튜던트 T 테스트 또는 그래프패드 프리즘 프로그램(GraphPad Software Inc.)을 이용한 던칸의 다중 비교 및 원-웨이 아노바 테스트를 사용하여 통계적으로 분석하였다. p 값이 0.05 미만인 경우에 통계적으로 유의적인 차이가 있는 것으로 간주하였다.

실험 결과, 리포칼린 2 과발현 형질전환 세포주의 경우 대조군에 비해 NO 공여자에 의한 아폽토시스가 더 많이 유도되는 것으로 나타났다. 따라서 리포칼린 2의 과발현은 NO 공여자에 대한 소교세포의 감수성을 증가시킴을 알 수 있었다(도 7).

<3-5> 리포칼린 2의 과발현이 소교세포의 세포독성 약제에 대한 감수성에 미치는 영향

리포칼린-2의 과발현이 다른 종류의 세포독성 약제에 대한 감수성에 미치는 영향을 조사하였다. 이를 위해 리포칼린 2 과발현 형질전환 세포주 S1 및 S3에 에톱포사이드(etoposide), H₂O_2, 스타우로스포린(staurosporine) 및 시스플라틴과 같은 세포독성 약제를 각각 다양한 농도로 처리하여 24시간 동안 배양한 후 상기 실시예 1과 동일한 MTT 분석법에 의해 세포의 생존율을 조사하였다.

실험 결과, 리포칼린-2의 과발현은 에톱포사이드, H₂O₂ 및 스타우로스포린과 같은 세포독성 약제에 대한 소교세포의 감수성을 증가시켰다. 반면 시스플라틴은 소교세포의 감수성에 영향을 미치지 않았다(도 8).

상기 실험 결과들로부터 리포칼린 2가 소교세포의 프로아폽토시스 활성(proapoptotic activity)을 가지고 있음을 알 수 있었다.

<실시예 4>

리포칼린-2의 녹다운이 소교세포의 아폽토시스에 미치는 영향 조사

리포칼린-2 특이적 shRNA 컨스트럭트로 소교세포를 형질감염시켜 리포칼린 2 녹다운 소교세포를 제조하고 리포칼린 2의 녹다운이 소교세포의 아폽토시스에 미치는 영향을 조사하였다.

<4-1> 리포칼린 2 녹다운 소교세포의 제조

실시예 1의 BV-2 세포를 6-웰 플레이트에 넣고 리포펙타민 시약(lipofectAMINE reagent, Invitrogen)을 이용하여 마우스 리포칼린 2 특이적 shRNA 컨스트럭트 2㎍로 형질감염시켰다. 리포칼린 2 특이적 shRNA 컨스트럭트는 L. G. Cantley 박사(Yale University, New Haven, CT)로부터 제공받았다(Gwira et al., J Biol Chem 280:7875-7882, 2005). 리포칼린 2 cDNA의 192-213번 뉴클레오타이드에 상응하는 shRNA, 9-염기 루프 및 역반복(inverted repeat) 부위를 레트로 벡터(pSuppressor Retro vector, Imgenex, San Diego, CA)에 클로닝하여 리포칼린 2 녹다운을 위한 컨스트럭트로 사용하였다. 형질감염 후 2일째에 G418(400㎍/ml)의 존재 하에서 형질전환 세포주를 선별하였다.

<4-2> 웨스턴 블롯 분석에 의한 리포칼린 2 발현 녹다운 확인

상기 실시예 <4-1>의 형질전환 세포주에서 리포칼린 2 발현의 녹다운을 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다. 웨스턴 블롯 분석은 상기 실시예 <2-3>과 동일한 방법으로 수행하였다.

실험 결과, 리포칼린-2 녹다운 형질전환 세포주의 경우 대조군(Scrambled shRNA)에 비해 리포칼린 2의 발현이 감소되었음을 확인할 수 있었다(도 9).

<4-3> MTT 분석에 의한 리포칼린 2 녹다운이 소교세포의 아폽토시스에 미치는 영향 조사

상기 실시예 <4-1>의 형질전환 세포주에 NO 공여자(SNP 또는 SNAP)를 다양한 농도로 처리하여 24시간 동안 배양한 다음 NO 공여자에 의해 유도되는 아폽토시스 정도를 MTT 분석법을 이용하여 조사하였다. MTT 분석은 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.

실험 결과, 리포칼린 2 녹다운 형질전환 세포주(Lcn2 shRNA)의 경우 대조군(Scrambled shRNA)에 비해 NO 공여자의 처리에 의한 아폽토시스 정도가 낮은 것으로 나타났다. 이로 부터 리포칼린 2가 녹다운 되는 경우 NO에 대한 감수성이 감소함을 확인할 수 있었다(도 10).

<실시예 5>

재조합 리포칼린 2 단백질이 소교세포의 아폽토시스에 미치는 영향

재조합 리포칼린 2 단백질을 제조하고 소교세포의 아폽토시스에 미치는 역할을 조사하였다.

<5-1> 재조합 리포칼린 2 단백질의 제조

재조합 리포칼린 2 단백질은 이전에 공지된 방법에 따라 제조하였다(Yang et al., Mol Cell 10:1045-4056, 2002). 즉, 재조합 리포칼린 2 단백질을 E. coli BL21에서 글루타치온 S-트랜스퍼라아제(GST) 융합 단백질의 형태로 발현시켰다. 상기 단백질을 글루타치온-세파로스 4B 비드(Amersham Biosciences)를 이용하여 정제하고 트롬빈을 처리하여 순수한 리포칼린 2 단백질을 분리하였다.

발현된 리포칼린 2 단백질을 포함하는 상기 E. coli의 세포 용해물과 분리 및 정제과정을 거친 리포칼린 2 단백질을 전기영동하였다(도 11).

<5-2> 재조합 리포칼린 2 단백질의 처리가 소교세포의 아폽토시스에 미치는 영향

재조합 리포칼린 2 단백질의 처리가 소교세포의 NO 공여자에 의한 아폽토시스에 미치는 영향을 조사하였다. 이를 위해 실시예 1의 BV-2 세포에 SNP 0, 0.1mM 및 0.5mM의 농도로 각각 처리하고 상기 실시예 <5-1>에서 제조한 재조합 리포칼린 2 단백질을 0, 10, 50㎍/ml의 농도로 각각 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 또한, BV-2세포에 상기 SNP 대신 SNAP를 0, 0.5, 2.0mM의 농도로 처리하고 재조합 리포칼린 2 단백질을 0, 10, 50㎍/ml의 농도로 각각 처리하여 24시간 동안 배양하였다.

또한, 일차 배양한 마우스 소교세포에 0.5mM SNP, 1mM SNAP, 4mM SNAP를 각각 처리하고 재조합 리포칼린 2 단백질을 0, 1, 10, 50㎍/ml의 농도로 각각 처리한 후 세포 생존율을 MTT 분석에 의해 조사하였다. MTT 분석은 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.

마우스 소교세포의 일차배양은 이전에 공지된 방법을 변형하여 수행하였다(Saura et al., Glia 44:183-189, 2003). 갓 태어난 ICR 마우스의 전뇌를 파쇄 한 다음 나일론 체를 이용하여 분리하였다. 상기 세포를 폴리-L-라이신이 코팅된 플라스크에서 10-14일간 배양한 후 마일드 트립신처리(mild trypsinization)에 의해 아교세포 혼합 배양물로부터 소교세포를 분리하였다. 아교세포 혼합 배양물에 1mM CaCl₂가 함유된 PBS로 1:4의 비율로 희석한 트립신 용액(HBSS에 용해된 0.25% 트립신, 1mM EDTA)을 첨가하여 30-60분간 배양하였다. 상기 배양에 의해 성상세포(astrocyte)는 상층으로 분리되고 소교세포는 배양 플라스크의 바닥에 부착되게 된다. 따라서 상기 성상세포 층을 흡인하여 제거하고 남아있는 소교세포(BV-2)를 실험에 사용하였다. 상기 소교세포 배양물의 순도는 이소렉틴 B4 염색에 의해 분석한 결과 95% 이상이었다.

실험 결과, 재조합 리포칼린 2 단백질의 아폽토시스 증강 효과는 BV-2 세포와 일차 배양된 소교세포에서 모두 관찰되었다. 따라서 재조합 리포칼린 2 단백질은 NO의 세포독성에 대한 BV-2 소교세포의 감수성을 증가시킴을 알 수 있었다. 그러나 리포칼린 2 단백질 단독으로는 소교세포의 생존에 영향을 주지 않는 것으로 나타났다(도 12).

<5-3> 철 킬레이트제가 소교세포의 아폽토시스에 미치는 영향 조사

철 킬레이트제가 소교세포의 생존에 미치는 영향을 조사하였다. 이를 위해 실시예 1의 마우스 소교세포주인 BV-2 세포에 NO 공여자인 SNAP를 0, 0.5, 2.0mM의 농도로 각각 처리하고 상기 실시예 <5-1>의 재조합 리포칼린 2 단백질을 0, 1, 10, 50㎍/ml로 각각 처리하였다. 또한, 철 킬레이트제인 사이더로포어-철 복합물(siderophore-iron complex)을 리포칼린 2의 5배 이상의 MOL 농도를 섞어서 처리하였다. 그 다음 각각의 처리가 소교세포의 생존에 미치는 영향을 실시예 1과 동일하게 MTT 분석으로 조사하였다.

실험 결과, 재조합 리포칼린 2 단백질의 처리에 의한 NO 공여자에 대한 소교세포의 증가된 감수성은 사이더로포어-철 복합물의 첨가에 의해 제거되었다(도 13).

이러한 결과는 리포칼린 2의 프로아폽토시스 활성이 철 트랜스포트 및 대사와 관련이 있음을 나타낸다. 즉, 아포-리포칼린 2는 세포내 철의 고갈로 인해 프로아폽토시스를 나타낼 수 있다.

Ⅲ. 소교세포에서 리포칼린 2, 리포칼린 2 수용체 및 Bcl-2 패밀리 단백질의 발현 및 조절

<실시예 6>

염증 또는 독성 자극인자가 소교세포에서 리포칼린 2의 발현에 미치는 영향

실시예 1의 마우스 소교세포주인 BV-2 세포에 SNP(0.5mM), LPS(Lipopolysaccharide, 100ng/ml), PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate, 100㎍/ml), 시스플라틴(1mM), 덱사메타손(1μM)을 각각 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 또한, IFNγ(interferon-γ, 50units/ml), 강글리오사이드 혼합물(ganglioside mixture, 50㎍/ml, Calbiochem, CA), 트롬빈(10㎍/ml), ATP(3mM), 포스콜린(10μM) 및 칼슘 이오노포어 A23187(5μM)을 각각 처리하여 8시간 동안 배양하였다. 또한, 상기 BV-2 세포를 무혈청 조건 하에서 8시간 동안 배양하였다. 배양이 완료된 후 리포칼린 2의 발현을 웨스턴 블롯 분석으로 조사하였다. 웨스턴 블롯 분석은 상기 실시예 <2-3>과 동일한 방법으로 수행하였다.

실험 결과, 리포칼린 2의 발현은 LPS, 무혈청 조건, PMA, 시스플라틴, 덱사메타손, IFNγ 및 칼슘 이오노포어 A23187에 의해 증가된 것으로 나타났다(도 14).

이러한 결과는 소교세포에서 리포칼린 2의 발현이 염증 조건 하에 증가될 수 있음을 의미한다.

<실시예 7>

소교세포에서 리포칼린 2 수용체의 발현

최근, 리포칼린 2 수용체가 리포칼린 2에 의해 유도되는 아폽토시스를 매개한다고 보고 된 바 있다(Devireddy et al., Cell 123:1293-1305, 2005). 이에 소교세포에서 리포칼린 2 수용체가 발현되는지를 RT-PCR에 의해 확인하였다. 소교세포로는 실시예 1의 마우스 소교세포주인 BV-2 세포, 아폽토시스 저항성 BV-LS13 세포 및 일차 배양한 소교세포를 사용하였다. RT-PCR은 상기 실시예 <2-3>과 동일하게 수행하되 리포칼린 2 수용체 (lcn2/24p3R)에 특이적인 프라이머를 사용하였다.

RT-PCR에 사용한 프라이머

프라이머		서열	서열번호	진뱅크 승인 번호	RT-PCR 산물 크기
24p3R	정방향	5'- CCA AGC TTC TGC TAT CCT CAG T -3'	11	NM_021551	454 bp
	역방향	5'- CCT CTG CTA CTT TTC TGG ATG G-3'	12

실험 결과, 마우스 소교세포주인 BV-2 세포, 아폽토시스 저항성 BV-LS13 세포 및 일차 배양한 소교세포에서 리포칼린 2 수용체가 발현됨을 확인할 수 있었다(도 15). 이로부터 소교세포에서 리포칼린 2의 프로아폽토시스 효과는 리포칼린 2 수용체에 의해 매개됨을 알 수 있었다.

<실시예 8>

소교세포에서 Bcl-2 패밀리 단백질의 발현

이에 따라 실시예 1의 마우스 소교 세포주 BV-2 세포, 실시예 <3-1>의 리포칼린 2 과발현 세포 S1 및 S3에 SNP 0.5mM을 8시간 동안 처리한 다음 웨스턴 블롯 분석에 의해 Bcl-2 패밀리 단백질의 발현정도를 조사하였다. 웨스턴 블롯 분석은 상기 실시예 <2-3>과 동일한 방법으로 수행하되, 일차 항체로서 랫트 단클론 항-BIM 항체(Calbiochem), 토끼 다클론 항-BAX 항체(Cell Signaling Technology, Beverly, MA) 및 토끼 다클론 항-BAD 항체(Cell Signaling Technology, Beverly, MA)를 사용하였다.

실험 결과, BIM, BAX 및 BAD와 같은 프로아폽토시스 Bcl-2 패밀리 단백질들의 발현은 리포칼린 2의 상향조절이나 SNP 처리에 의해 유의적으로 영향을 받지 않는 것으로 나타났다(도 16).

이러한 실험 결과는 프로아폽토시스 Bcl-2 패밀리 단백질의 조절이 소교세포에서 리포칼린 2의 아폽토시스-감작 효과와 직접적인 관련성이 없음을 나타낸다.

Ⅳ. 리포칼린 2에 의한 소교세포의 탈분지화

<실시예 9>

리포칼린 2의 과발현이 소교세포의 형태변화에 미치는 영향

리포칼린 2의 발현이 소교세포의 형태변화에 미치는 영향을 조사하였다. 소교세포의 형태변화는 위상차현미경을 이용하여 수행하였다. 이전에 공지된 방법에 따라 실시예 <3-1>의 리포칼린 과발현 소교세포 S1, S3를 이소렉틴 B4로 염색하였다(Lee et al., FASEB J, 17:1943-1944, 2003). 현미경 이미지를 MetaMorph 이미징 시스템(Molecular Devices; Sunnyvlae, CA)을 이용하여 프로세싱하였다.

실험 결과, 리포칼린 2의 과발현은 소교세포의 탈분지화를 유도하였다(도 17).

<실시예 10>

재조합 리포칼린 2 단백질의 처리가 소교세포의 형태변화에 미치는 영향

일차 배양된 소교세포에 실시예 <5-1>의 재조합 리포칼린 2 단백질(10㎍/ml)을 처리하고 소교세포의 형태변화를 실시예 9와 동일한 방법으로 관찰하였다.

또한, 이전에 LPS가 TLR4를 통해 소교세포 아폽토시스를 유도하고 소교세포 탈분지화를 유도함이 보고 된 바 있다. 따라서 일차 배양된 소교세포에 LPS(100ng/ml)를 처리하고 소교세포의 형태변화를 관찰하였다. 또한, 상기 LPS와 함께 리포칼린 2에 대한 항체(염소 다클론 항-LCN2 항체, R&D systems)를 동시에 처리하고 소교세포의 형태변화를 관찰하였다.

소교세포의 탈분지화를 이전의 공지된 방법을 변형하여 정량하였다(Kalla et al., Gila 41:50-63, 2003). 분지 세포는 하나의 돌기(process)가 하나의 세포체 직경보다 더 긴 적어도 두개의 돌기를 갖는 것으로서 정의하였다. 비분지화 세포는 이러한 기준을 만족하지 않는 것으로 정의하였다. 분지화된 세포의 백분율은 적어도 250개의 세포를 포함하는 임의로 선택된 5개의 필드로부터 결정하였다.

실험 결과, 재조합 리포칼린 2 단백질의 처리는 소교세포의 탈분지화를 유도하였다. 또한 LPS를 처리한 경우에도 소교세포의 탈분지화가 관찰되었다. 한편, LPS와 함께 리포칼린 2에 대한 항체를 처리한 경우에는 소교세포의 탈분지화가 관찰되지 않았다(도 18 및 도 19). 이는 리포칼린 2의 항체에 의해 리포칼린이 중화되어 그 작용이 억제되었기 때문이라 사료된다.

<실시예 11>

다양한 자극인자에 의한 소교세포의 형태변화

리포칼린 2 단백질과의 비교를 위해 소교세포에 형태변화를 유도할 것으로 추정되는 자극인자를 처리하고 실시예 9와 동일한 방법으로 소교세포의 형태변화를 관찰하였다. 일차 배양된 소교세포에 재조합 리포칼린 2 단백질(10㎍/ml), ATP(3mM), 포스콜린(10μM), A23187(5μM)을 각각 처리하고 이소렉틴 B4로 염색한 후 현미경으로 관찰하였다. 또한, 상기 실시예 10과 동일한 방법으로 분지화된 소교세포를 정량하였다.

실험 결과, 재조합 리포칼린 2 단백질 뿐 만 아니라 ATP, 포스콜린 및 A23187도 소교세포의 탈분지화를 유사한 수준으로 유도함을 알 수 있었다(도 20 및 도 21).

Ⅴ. 소교세포의 탈분지화와 아폽토시스 표현형과의 관련성

<실시예 12>

소교세포의 탈분지화와 아폽토시스 표현형과의 관련성

리포칼린 2에 의해 유도된 소교세포의 탈분지화가 아폽토시스-감수성 표현형과 관련이 있는지 조사하였다. BV-2 세포 또는 일차 배양된 소교세포에 SNP 0.5mM과 함께 소교세포의 탈분지화를 유도하는 리포칼린 2 재조합 단백질(10㎍/ml), ATP(3mM), 포스콜린(10μM) 및 칼슘 이오노포어 A23187(5μM)을 각각 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 그 다음 세포 생존율을 MTT 분석 및 유세포 분석에 의해 조사하였다. MTT 분석 및 유세포 분석은 상기 실시예 1 및 실시예 <3-4>와 동일한 방법으로 수행하였다.

실험 결과, 상기 자극인자들은 모두 소교세포의 세포사멸을 유도함을 확인할 수 있었다(도 22). 한편, 상기 인자들 중에서 칼슘 이오노포어 A23187만이 리포칼린 2의 발현을 증강시켰다(도 14).

따라서 상기 실험 결과로부터 세포내 칼슘은 리포칼린 2의 발현을 상향조절하여 소교세포의 탈분지화를 유도함을 알 수 있었다. ATP 및 포스콜린은 리포칼린 2와는 독립적으로 영향을 미치는 것으로 보인다. 또한, ATP, 포스콜린 및 칼슘 이오노포어는 소교세포의 형태변화를 유도하는 농도에서 소교세포에 대한 세포독성을 나타낸다. 이는 이러한 자극인자들의 활성 기작이 리포칼린 2와는 상이함을 나타낸다.

재조합 리포칼린 2 단백질을 단독으로 소교세포에 처리한 경우 세포독성을 나타내지 않은 농도에서 소교세포의 형태변화를 유도하였다. 이러한 결과는 소교세포의 아메바 형태 및 이들의 아폽토시스 감수성이 서로 밀접한 관련성이 있으며 리포칼린 2가 소교세포의 아폽토시스 및 형태 조절 기작과 관련이 있음을 의미한다. 리포칼린 2의 이러한 작용에 대한 모식도를 도 23에 나타내었다. 소교세포가 염증성 자극에 의해 활성화되면 리포칼린 2 단백질이 분비된다. 분비된 리포칼린 2 단백질은 소교세포의 형태 및 기능을 변화시킨다. 리포칼린 2는 소교세포의 탈분지화를 유도하고 이러한 소교세포는 아폽토시스 신호에 더욱 민감하게 된다. 이는 생체 내 활성화된 소교세포의 자가-조절 제거에 대한 근거를 제공한다. 다른 종류의 탈분지화-유도 자극인자를 이용한 실험 결과는 소교세포의 형태 변화가 아폽토시스 표현형 변화와 밀접한 관련이 있음을 보여준다.

본 발명의 약학적 조성물은 활성화된 소교세포의 세포독성약제에 대한 감수성을 증가시킴으로써 아폽토시스를 촉진하여 과도한 소교세포의 활성화로 인해 유발된 퇴행성 신경질환을 예방 및 치료할 수 있다. 또한, 리포칼린 2는 퇴행성 신경질환의 진단, 병의 진행 상태 및 치료전후의 예후를 평가하기 위한 진단 마커로서 사용할 수 있으며, 퇴행성 신경질환 치료제의 스크리닝을 위한 타겟으로 이용될 수 있다.

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Claims (16)

1. 리포칼린 2 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산을 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 및 치료용 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 리포칼린 2 단백질이 인간 유래의 것임을 특징으로 하는 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 리포칼린 2 단백질이 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것임을 특징으로 하는 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 핵산이 서열번호 2의 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는 것임을 특징으로 하는 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 퇴행성 신경질환이 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 루게릭 질환, 헌팅톤 질환 및 다발성 경화증으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것임 을 특징으로 하는 조성물.
6. 제1항에 있어서, 세포독성약제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
7. 제6항에 있어서, 상기 세포독성약제가 아자티오프린(Azathiopine), 사이클로포스파미드(Cyclophosphamide), 빈크리스틴(Vincristine), 메토트레세이트(methotrexate), 사이타라빈(cytarabine), 다티노마이신(datinomycin)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 조성물.
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