DE69432629T3

DE69432629T3 - Antikörper gegen beta-amyloid oder derivative davon und seine verwendung

Info

Publication number: DE69432629T3
Application number: DE69432629T
Authority: DE
Inventors: Nobuhiro Tsukuba-shi SUZUKI; Asano Tsukuba-shi ODAKA; Chieko Sakai-shi KITADA
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1993-01-25
Filing date: 1994-01-24
Publication date: 2008-01-17
Anticipated expiration: 2014-01-25
Also published as: EP1308461A2; EP0683234B2; ATE239797T1; US5750349A; WO1994017197A1; EP1308461A3; EP0683234A4; EP0683234B1; EP0683234A1; DE69432629D1; DE69432629T2

Description

Fachgebiet
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Antikörper, die insofern nützlich und neu sind, als sie Bindungsspezifität an β-Amyloide oder ihre Derivate haben. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Antikörper, die für die Entwicklung von Assays für β-Amyloide oder ihre Derivate auf der Basis einer Antigen-Antikörper-Reaktion, Diagnosen von Krankheiten, die mit β-Amyloiden oder ihren Derivaten zusammenhängen (zum Beispiel Alzheimer-Krankheit), oder die Entwicklung von präventiven-therapeutischen Zusammensetzungen für die Alzheimer-Krankheit geeignet sind.
Stand der Technik
Senile Demenz, die durch Alzheimer-Krankheit verursacht ist, führt zu schweren sozialen Problemen, und man möchte eine frühe Entwicklung von Diagnosen und therapeutischen Verfahren für die Alzheimer-Krankheit. Als Läsion, die charakteristisch für die Hirne von Patienten mit Alzheimer-Krankheit ist, ist die übermäßige Bildung von senilen Plaques und neurofibrillären Tangles bekannt. Dabei ist ein β-Amyloid oder Derivat davon einer der Hauptbestandteile der senilen Plaque.
Das β-Amyloid ist ein Peptid, das aus etwa 40 Aminosäuren besteht, und ist in der Nähe des Transmembranbereichs eines Amyloid-Vorläufer-Proteins (im folgenden als APP bezeichnet) codiert. Aminosäuresequenzen der β-Amyloide sind im folgenden gezeigt:
Gemäß neueren Berichten gehören einige der Patienten mit familiärer Alzheimer-Krankheit zu Familien, die Punktmutationen von APP aufweisen, und es wurde auf die Möglichkeit hingewiesen, dass die β-Amyloide eine der Substanzen sein könnten, die die Alzheimer-Krankheit verursachen. Vor diesem Hintergrund wurden die β-Amyloide als Hauptgegenstand für die Untersuchung der Alzheimer-Krankheit intensiv untersucht, und verschiedene Ergebnisse der Untersuchungen wurden vorgelegt.
Assaysysteme zum leichten Nachweis der β-Amyloide mit hoher Empfindlichkeit wurden bisher jedoch kaum beschrieben, obwohl ein starkes Interesse an den β-Amyloiden bekundet wurde. Der Sandwich-Enzym-Immunoassay der β-Amyloide wird nur von P. Seubert et al. beschrieben [Nature, 359, 325-327 (1992)].
Es wird berichtet, dass das Assaysystem von P. Seubert et al. eine Nachweisempfindlichkeit von 100 pg/ml hat, was nicht befriedigend ist. Weiterhin wird berichtet, dass das Assaysystem auch mit einem partiellen Peptid reagiert, das aus 28 N-terminalen Resten besteht [im folgenden als β-Amyloid (1-28) bezeichnet]. Es gibt jedoch mehrere hydrophobe Aminosäuren in C-terminalen Teilen der β-Amyloide β-Amyloid (29-39), β-Amyloid (29-40), β-Amyloid (29-41), β-Amyloid (29-42) oder β-Amyloid (29-43). Man geht daher davon aus, dass dieser C-terminale Bereich in einer Zellmembran eingebettet ist, und es wird angenommen, dass er eine wichtige Rolle bei der Aggregation und Ablagerung von Peptiden spielt. Aus diesem Grund ist es wichtig, β-Amyloide, die die C-terminalen hydrophoben Bereiche aufweisen, zu quantifizieren. Das oben genannte Assaysystem von P. Seubert et al. erfüllt jedoch nicht die sozialen Anforderungen hinsichtlich Spezifität und Empfindlichkeit.
Gewöhnlich werden Antikörper gegen Peptide hergestellt, indem man Komplexe der Peptide mit natürlichen oder synthetischen Polymerträgern für eine Immunisierung verwendet. Auch im Falle der β-Amyloide zeigt der oben beschriebene Gereicht von P. Seubert et al., dass gegenüber β-Amyloid (1-40) reaktive Antikörper hergestellt werden können, indem man N-terminale Teile der β-Amyloide, die hydrophile Bereiche sind, zum Beispiel β-Amyloid (1-16), als Immunogene verwendet. Es ist jedoch nicht klar, ob ein Antikörper gegen den C-terminalen Teil des β-Amyloids, bei dem es sich um den in die Zellmembran eingebetteten hydrophoben Bereich handelt, mit gewöhnlichen Methoden hergestellt werden kann. Selbst wenn der Antikörper gegen einen solchen Bereich erhalten werden kann, ist weiterhin überhaupt nicht gewährleistet, dass er auch mit dem β-Amyloid reagiert. Wenn der Antikörper nur eine äußerst geringe Affinität zu dem β-Amyloid zeigt, ist weiterhin im Allgemeinen nicht ohne weiteres zu erwarten, dass zum Beispiel der oben genannte Sandwich-Enzym-Immunoassay von P. Seubert et al. mit dem Antikörper entwickelt werden kann. Obwohl nämlich bisher verschiedene Antikörper hergestellt wurden, um die β-Amyloide nachzuweisen, gibt es keinen Bericht, dass der Antikörper gegen den C-terminalen Teil des β-Amyloids hergestellt und auf den Sandwich-Enzym-Immunoassay angewendet wurde, wodurch man einen Immunoassay entwickelt hätte, mit dem das β-Amyloid mit hoher Empfindlichkeit und Spezifität ohne Kreuzreaktion mit β-Amyloid (1-28) nachgewiesen werden kann. Es wird weiterhin berichtet, dass das β-Amyloid (25-35) in seiner Aminosäuresequenz eine Homologie mit Tachykinin aufweist und cytotoxisch ist [B.A. Yankner et al., Science, 250, 279-282 (1990)]. Es gibt jedoch überhaupt keinen Bericht, dass ein Antikörper gegen das β-Amyloid (25-35) hergestellt und auf den Sandwich-Enzym-Immunoassay angewendet wurde, wodurch man einen Immunoassay entwickelt hätte, mit dem das β-Amyloid mit hoher Empfindlichkeit und Spezifität ohne Kreuzreaktion mit β-Amyloid (1-28) nachgewiesen werden kann.
Vor kurzem wurde weiterhin berichtet, dass von den β-Amyloiden das β-Amyloid (1-42) hauptsächlich im cerebralen Cortex abgelagert wird (senile Plaques), während das β-Amyloid (1-40) hauptsächlich in den cerebralen Blutgefäßen abgelagert wird (Angiopathie) [Arch. Biochem. Biophys., 301, 41-53 (1993)]. Es wird weiterhin vorgeschlagen, dass die Keimbildung durch Peptide, die den C-terminalen Teil enthalten, wie das β-Amyloid (1-42), das β-Amyloid (26-42), das β-Amyloid (26-43) und das β-Amyloid (34-42), die Ablagerung von wasserlöslichem β-Amyloid (1-40) verursacht [Biochemistry, 32, 4693-4697 (1993)]. Wegen solcher Berichte geht man davon aus, dass der Unterschied in der Ablagerungsweise zwischen β-Amyloid (1-40) und β-Amyloid (1-42) weitgehend mit der Alzheimer-Krankheit zusammenhängt. Wenn Alzheimer-Krankheit diagnostiziert wird, ist daher eine empfindliche und diskriminierende Bestim mung von β-Amyloid (1-40) und β-Amyloid (1-42) wichtig. Geeignete Antikörper für diesen Zweck wurden jedoch noch nicht beschrieben.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, einen neuen Antikörper, der empfindlich und spezifisch ein β-Amyloid mit einem C-terminalen hydrophoben Bereich oder ein Derivat davon bestimmen kann, vorzugsweise einen monoklonalen Antikörper, bereitzustellen. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zum Bestimmen eines β-Amyloids oder eines Derivats davon mit dem Antikörper bereitzustellen.
Offenbarung der Erfindung
Um das oben genannte Problem zu lösen, haben die Erfinder intensive Untersuchungen angestellt. Als Ergebnis haben die Erfinder mehrere monoklonale Antikörper hergestellt, die verschiedene Teile von β-Amyloiden oder Derivaten davon erkennen, und entwickelten ein ausgezeichnetes Verfahren zur Bestimmung von β-Amyloiden durch die Verwendung der Antikörper, woraufhin weitere Untersuchungen folgten, wodurch die vorliegende Erfindung fertiggestellt wurde.
Das heißt, die vorliegende Erfindung stellt bereit: einen monoklonalen Antikörper, der spezifisch gegenüber einem partiellen Peptid auf der C-terminalen Seite eines β-Amyloids oder eines Derivats davon reaktiv ist, wie er in den Ansprüchen 1 bis 6 definiert ist;
eine Hybridomzelle, die den monoklonalen Antikörper produziert;
und einen Immunoassay für ein β-Amyloid oder ein Derivat davon nach einem kompetitiven Verfahren oder einem Sandwich-Verfahren unter Verwendung des Antikörpers (ein Verfahren zum Diagnostizieren der Alzheimer-Krankheit).
Insbesondere haben die Erfinder mehrere monoklonale Antikörper hergestellt, indem sie das β-Amyloid (25-35), das β-Amyloid (35-43), das β-Amyloid (1-40) und das β-Amyloid (1-16) als Immunogene verwendeten. Durch Kombination der Antikörper entwickelten die Erfinder einen Immunoassay, mit dem β-Amyloide oder Derivate davon mit hoher Empfindlichkeit und Spezifität ohne Kreuzreaktion mit dem β-Amyloid (1-28) nachgewiesen werden können. Unter Verwendung von β-Amyloid (25-35), β-Amyloid (35-43) und β-Amyloid (1-40) als Immunogene haben die Erfinder nämlich monoklonale Antikörper entwickelt, die C-terminale Teile von β-Amyloiden oder Derivaten davon erkennen, zum Beispiel Antikörper, die als BA-27a, BS-85a und BC-05a bezeichnet werden. Von diesen zeigen BS-85a und BA-27a in einem kompetitiven Immunoassay unter Verwendung von markierten β-Amyloiden jeweils eine äußerst geringe Affinität zu den β-Amyloiden. Dennoch haben Studien gezeigt, dass Kombinationen davon mit zwei Arten von Antikörpern, die aus monoklonalen Antikörpern gegen einen N-terminalen Teil (β-Amyloid (1-16)) der β-Amyloide ausgewählt sind, nämlich mit Antikörpern, die als BAN-052a und BAN-50a bezeichnet werden, einen Sandwich-Immunoassay mit äußerst hoher Empfindlichkeit gegenüber den β-Amyloiden ergeben können. Weiterhin haben die Erfinder gezeigt, dass ein Sandwich-Immunoassay, bei dem BC-50a mit BAN-50a kombiniert wird, die β-Amyloide in einem Ameisensäureextrakt aus dem Gehirn eines Patienten mit Alzheimer-Krankheit mit hoher Empfindlichkeit ohne Kreuzreaktion mit β-Amyloid (1-40) nachweist.
Eines der Hauptmerkmale der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Sandwich-Immunoassays, die eine hochempfindliche und diskriminierende Bestimmung von β-Amyloid (1-40) und β-Amyloid (1-42) ermöglichen. Der Sandwich-Immunoassay, bei dem BA-27a mit BAN-052a oder BAN-50a kombiniert wird, kann nämlich das β-Amyloid (1-40) nachweisen, kann aber nicht das β-Amyloid (1-42) nachweisen. Weiterhin kann der Sandwich-Immunoassay, bei dem BC-05a mit BAN-052a oder BAN-50a kombiniert wird, das β-Amyloid (1-42) nachweisen, kann aber nicht das β-Amyloid (1-40) nachweisen. Weiterhin kann der Sandwich-Immunoassay, bei dem BS-85a mit BAN-052a oder BAN-50a kombiniert wird, das β-Amyloid (1-40) und das β-Amyloid (1-42) nachweisen. Daher können gemäß den Sandwich-Immunoassays, bei denen die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung miteinander kombiniert werden, eine hochempfindliche und diskriminierende Quantifizierung von β-Amyloid (1-40) und β-Amyloid (1-42) durchgeführt werden. Eine solche Technik ist ein überraschendes Ergebnis, das nicht aus dem Stand der Technik abgeleitet werden kann.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung folgendes bereit:

(1) einen monoklonalen Antikörper, der spezifisch reaktiv ist gegenüber einem partiellen Peptid auf der C-terminalen Seite eines β-Amyloids oder gegenüber einem Derivat des β-Amyloids, das ausgewählt ist aus (a) Peptiden, denen 1 bis 17 Aminosäurereste vom N-terminalen Teil des β-Amyloids fehlen, (b) Peptiden, bei denen L-Asparaginsäure der β-Amyloide zu L-Isoasparaginsäure, D-Isoasparaginsäure oder D-Asparaginsäure isomerisiert ist, und (c) Peptiden, bei denen der N-terminale Teil der β-Amyloide Pyroglutaminsäure aufweist, wobei der Antikörper ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 7 dargestellt wird, nicht erkennt; wobei (i) der Antikörper ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 8 dargestellt wird, und ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 9 dargestellt wird, nicht erkennt; (ii) der Antikörper ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 8 dargestellt wird, erkennt, aber ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 9 dargestellt wird, nicht erkennt; oder (iii) der Antikörper ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 8 dargestellt wird, nicht erkennt, aber ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 9 dargestellt wird, erkennt;
(2) einen monoklonalen Antikörper, der spezifisch reaktiv ist gegenüber einem partiellen Peptid auf der C-terminalen Seite eines β-Amyloids oder gegenüber einem Derivat des β-Amyloids, das ausgewählt ist aus (a) Peptiden, denen 1 bis 17 Aminosäurereste vom N-terminalen Teil des β-Amyloids fehlen, (b) Peptiden, bei denen L-Asparaginsäure der β-Amyloide zu L-Isoasparaginsäure, D-Isoasparaginsäure oder D-Asparaginsäure isomerisiert ist, und (c) Peptiden, bei denen der N-terminale Teil der β-Amyloide Pyroglutaminsäure aufweist, wobei der Antikörper ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 7 dargestellt wird, nicht erkennt, und der spezifisch reaktiv ist gegenüber einem partiellen Peptid auf der C-terminalen Seite eines β-Amyloids mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 1 dargestellt wird, eines β-Amyloids mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 2 dargestellt wird, und/oder eines β-Amyloids mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 3 dargestellt wird, wobei der Antikörper ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 8 dargestellt wird, und/oder ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 9 dargestellt wird, nicht erkennt und ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 5 dargestellt wird, erkennt;
(3) einen monoklonalen Antikörper, der spezifisch reaktiv ist gegenüber einem partiellen Peptid auf der C-terminalen Seite eines β-Amyloids oder gegenüber einem Derivat des β-Amyloids, das ausgewählt ist aus (a) Peptiden, denen 1 bis 17 Aminosäurereste vom N-terminalen Teil des β-Amyloids fehlen, (b) Peptiden, bei denen L-Asparaginsäure der β-Amyloide zu L-Isoasparaginsäure, D-Isoasparaginsäure oder D-Asparaginsäure isomerisiert ist, und (c) Peptiden, bei denen der N-terminale Teil der β-Amyloide Pyroglutaminsäure aufweist, wobei der Antikörper ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 7 dargestellt wird, nicht erkennt, und der spezifisch reaktiv ist gegenüber einem partiellen Peptid auf der C-terminalen Seite eines β-Amyloids mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 1 dargestellt wird, eines β-Amyloids mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 2 dargestellt wird, eines β-Amyloids mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 3 dargestellt wird, und/oder eines β-Amyloids mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 5 dargestellt wird, wobei der Antikörper ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 8 dargestellt wird, erkennt, aber ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 9 dargestellt wird, nicht erkennt;
(4) einen monoklonalen Antikörper, der spezifisch reaktiv ist gegenüber einem partiellen Peptid auf der C-terminalen Seite eines β-Amyloids oder gegenüber einem Derivat des β-Amyloids, das ausgewählt ist aus (a) Peptiden, denen 1 bis 17 Aminosäurereste vom N-terminalen Teil des β-Amyloids fehlen, (b) Peptiden, bei denen L-Asparaginsäure der β-Amyloide zu L-Isoasparaginsäure, D-Isoasparaginsäure oder D-Asparaginsäure isomerisiert ist, und (c) Peptiden, bei denen der N-terminale Teil der β-Amyloide Pyroglutaminsäure aufweist, wobei der Antikörper ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 7 dargestellt wird, nicht erkennt, und der spezifisch reagiert gegenüber einem β-Amyloid oder einem Derivat davon, wie es oben definiert ist und das ausgewählt ist aus einem Peptid mit der Aminosäuresequenz, die aus dem 2. bis 42. Aminosäurerest der Sequenz, die durch SEQ ID NO: 5 dargestellt wird, besteht, einem Peptid mit der Aminosäuresequenz, die aus der 3. bis 42. Aminosäure der Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 5 dargestellt wird, besteht, wobei die N-terminale Glutaminsäure durch Pyroglutaminsäure ersetzt ist, einem Peptid mit der Aminosäuresequenz, die aus der 4. bis 42. Aminosäure der Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 5 dargestellt wird, besteht, und einem Peptid mit der Aminosäuresequenz, der der 1. bis 16. oder der 1. bis 17. Aminosäurerest aus der Sequenz, die durch eine der Sequenzen SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 6 dargestellt wird, fehlt, wobei das β-Amyloid oder sein Derivat in einem Ameisensäureextrakt aus dem Gehirn eines Patienten mit Alzheimer-Krankheit enthalten ist, wobei der Antikörper ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 8 dargestellt wird, nicht erkennt, aber ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 9 dargestellt wird, erkennt und das β-Amyloid oder sein Derivat, das in dem Ameisensäureextrakt aus dem Gehirn eines Patienten mit Alzheimer-Krankheit enthalten ist, ein β-Amyloid mit einer Aminosäuresequenz ist, die durch SEQ ID NO: 5 dargestellt wird, und der Antikörper ein β-Amyloid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 1 dargestellt wird, ein β-Amyloid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 2 dargestellt wird, und ein β-Amyloid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 3 dargestellt wird, nicht erkennt;
(5) den in (1), (2) oder (5) beschriebenen Antikörper, wobei das Derivat des β-Amyloids ausgewählt ist aus einem Peptid mit der Aminosäuresequenz, die aus dem 2. bis 42. Aminosäurerest der Sequenz, die durch SEQ ID NO: 5 dargestellt wird, besteht, einem Peptid mit der Aminosäuresequenz, die aus der 3. bis 42. Aminosäure der Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 5 dargestellt wird, besteht, wobei die N-terminale Glutaminsäure durch Pyroglutaminsäure ersetzt ist, einem Peptid mit der Aminosäuresequenz, die aus der 4. bis 42. Aminosäure der Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 5 dargestellt wird, besteht, und einem Peptid mit der Aminosäuresequenz, der der 1. bis 16. oder der 1. bis 17. Aminosäurerest aus der Sequenz, die durch eine der Sequenzen SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 6 dargestellt wird, fehlt;
(6) den in (1), (2), (3) oder (4) beschriebenen Antikörper, bei dem es sich um einen monoklonalen Antikörper handelt, der als BA-27a (FERM-BP 4139), BS-85a (FERM-BP 4140) oder BC-05a (FERM-BP 4457) bezeichnet wird;
(7) eine Hybridomzelle, die die in (6) beschriebenen monoklonalen Antikörper erzeugt;
(8) ein Verfahren zur Bestimmung eines β-Amyloids oder eines Derivats davon, wie es in (1), (2), (3), (4) oder (5) definiert ist, in einer Testlösung, umfassend die Verwendung eines Antikörpers, wie er in (1) bis (6) definiert ist;
(9) das Verfahren gemäß (8), das zwischen einem β-Amyloid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 3 dargestellt wird, und einem β-Amyloid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 5 dargestellt wird, unterscheidet;
(10) ein Verfahren zur Bestimmung eines β-Amyloids oder eines Derivats davon, wie es in (1) und (5) definiert ist, in einer Testlösung, umfassend die Verwendung: (1) eines Antikörpers, wie er in (1) bis (6) definiert ist; und (2) eines monoklonalen Antikörpers, der (a) als BAN-052a (FERM-BP 4138) oder (b) als BAN-50a (FERM-BP 4163) bezeichnet wird; und spezifisch reaktiv ist gegenüber einem partiellen Peptid auf der N-terminalen Seite eines β-Amyloids oder einem Derivat davon, wobei der Antikörper ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 7 dargestellt wird, und/oder ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 10 dargestellt wird, erkennt;
(11) ein Verfahren zur Bestimmung eines β-Amyloids oder eines Derivats davon, wie es in (1) und (5) definiert ist, in einer Testlösung, umfassend die Verwendung: (1) eines monoklonalen Antikörpers, der spezifisch reaktiv ist gegenüber einem β-Amyloid oder einem Derivat davon, wobei der Antikörper ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 7 dargestellt wird, nicht erkennt, aber ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 12 dargestellt wird, erkennt; und (2) des Antikörpers, wie er in (1) bis (6) definiert ist;
(12) das in (8) bis (11) definierte Verfahren, wobei das Verfahren zur Diagnose der Alzheimer-Krankheit verwendet wird; und
(13) eine Zusammensetzung zur Diagnose der Alzheimer-Krankheit, die einen Antikörper gemäß einem der Abschnitte (1) bis (6) umfasst.

In Ausführungsform (10) ist der mit BAN-052a bezeichnete monoklonale Antikörper spezifisch reaktiv gegenüber einem partiellen Peptid auf der N-terminalen Seite eines β-Amyloids oder Derivats davon und erkennt ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 7 dargestellt wird, und/oder ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 10 dargestellt wird.
Weiterhin ist der mit BAN-50a bezeichnete monoklonale Antikörper spezifisch reaktiv gegenüber einem partiellen Peptid auf der N-terminalen Seite eines β-Amyloids oder Derivats davon und erkennt ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 7 dargestellt wird, und/oder ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 10 dargestellt wird.
In Ausführungsform (11) ist der Antikörper (2) spezifisch reaktiv gegenüber einem β-Amyloid oder einem Derivat davon und erkennt ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 7 dargestellt wird, nicht, erkennt aber ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 12 dargestellt wird.
Der Antikörper ist ein monoklonaler Antikörper.
Bevorzugte Ausführungsformen des oben beschriebenen Aspekts (1) sind wie folgt:

(14) der in (1) beschriebene Antikörper, wobei das β-Amyloid ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz ist, die durch SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 6 dargestellt wird;
(15) der in (1) beschriebene Antikörper, wobei das Derivat des β-Amyloids folgendes ist: ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die aus der 2. bis 42. Aminosäure einer durch SEQ ID NO: 5 dargestellten Aminosäuresequenz besteht, ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die aus der 3. bis 42. Amino säure der durch SEQ ID NO: 5 dargestellten Aminosäuresequenz besteht, wobei die N-terminale Glutaminsäure durch Pyroglutaminsäure substituiert ist, ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die aus der 4. bis 42. Aminosäure der durch SEQ ID NO: 5 dargestellten Aminosäuresequenz besteht, oder ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, der die 1. bis 16. Aminosäure oder die 1. bis 17. Aminosäure einer durch eine der Sequenzen SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenz fehlen;
(16) der in (1) beschriebene Antikörper, wobei das partielle Peptid auf der C-terminalen Seite des β-Amyloids oder das Derivat davon ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz ist, die ab der 25. Aminosäure von der N-terminalen Aminosäure des β-Amyloids aus gezählt oder später beginnt;
(17) der in (1) bzw. (14) bis (16) beschriebene Antikörper, wobei der Antikörper ein partielles Peptid mit einer durch SEQ ID NO: 7 dargestellten Aminosäuresequenz nicht erkennt;
(18) der in (1) bzw. (14) bis (17) beschriebene Antikörper, wobei der Antikörper ein partielles Peptid mit einer durch SEQ ID NO: 8 dargestellten Aminosäuresequenz erkennt; und
(19) der in (1) bzw. (14) bis (17) beschriebene Antikörper, wobei der Antikörper ein partielles Peptid mit einer durch SEQ ID NO: 9 dargestellten Aminosäuresequenz erkennt.

Bevorzugte Ausführungsformen des oben beschriebenen Aspekts (1) (i) sind wie folgt:

(20) ein Antikörper, der spezifisch reaktiv ist gegenüber einem partiellen Peptid auf der C-terminalen Seite eines β-Amyloids mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 1 dargestellt wird, eines β-Amyloids mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 2 dargestellt wird, und/oder eines β-Amyloids mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 3 dargestellt wird, wobei der Antikörper ein partielles Peptid mit einer durch SEQ ID NO: 8 dargestellten Aminosäuresequenz und/oder ein partielles Peptid mit einer durch SEQ ID NO: 9 dargestellten Aminosäuresequenz nicht erkennt; und
(21) der in (20) beschriebene Antikörper, wobei der Antikörper ein partielles Peptid mit einer durch SEQ ID NO: 5 dargestellten Aminosäuresequenz erkennt.

Eine bevorzugte Ausführungsform des oben beschriebenen Aspekts (1) (ii) ist wie folgt:

(22) ein Antikörper, der spezifisch reaktiv ist gegenüber einem partiellen Peptid auf der C-terminalen Seite eines β-Amyloids mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 1 dargestellt wird, eines β-Amyloids mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 2 dargestellt wird, eines β-Amyloids mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 3 dargestellt wird, und/oder eines β-Amyloids mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 5 dargestellt wird, wobei der Antikörper ein partielles Peptid mit einer durch SEQ ID NO: 8 dargestellten Aminosäuresequenz erkennt, aber ein partielles Peptid mit einer durch SEQ ID NO: 9 dargestellten Aminosäuresequenz nicht erkennt.

Bevorzugte Ausführungsformen des oben beschriebenen Aspekts (1) (iii) sind wie folgt:

(23) ein Antikörper, der spezifisch reaktiv ist gegenüber einem β-Amyloid oder einem Derivat davon, das in einem Ameisensäureextrakt aus dem Gehirn eines Patienten mit Alzheimer-Krankheit enthalten ist, wobei der Antikörper ein partielles Peptid mit einer durch SEQ ID NO: 8 dargestellten Aminosäuresequenz nicht erkennt, aber ein partielles Peptid mit einer durch SEQ ID NO: 9 dargestellten Aminosäuresequenz erkennt;
(24) der in (23) beschriebene Antikörper, wobei das β-Amyloid oder sein Derivat, das in dem Ameisensäureextrakt aus dem Gehirn eines Patienten mit Alzheimer- Krankheit enthalten ist, ein β-Amyloid mit einer durch SEQ ID NO: 5 dargestellten Aminosäuresequenz ist; und
(25) der in (24) beschriebene Antikörper, wobei der Antikörper ein β-Amyloid mit einer durch SEQ ID NO: 1 dargestellten Aminosäuresequenz, ein β-Amyloid mit einer durch SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz und ein β-Amyloid mit einer durch SEQ ID NO: 3 dargestellten Aminosäuresequenz nicht erkennt.

Bevorzugte Ausführungsformen des oben beschriebenen Aspekts (6) sind wie folgt:

(26) der in (20) oder (21) beschriebene monoklonale Antikörper, wobei der Antikörper mit BA-27a bezeichnet wird;
(27) der in (22) beschriebene monoklonale Antikörper, wobei der Antikörper mit BS-85a bezeichnet wird; und
(28) der in (23) bis (25) beschriebene monoklonale Antikörper, wobei der Antikörper mit BC-05a bezeichnet wird.

Besonders bevorzugt ist:

(29) der in einem der Abschnitte (1) bis (6) und (14) bis (28) beschriebene Antikörper, wobei der Antikörper für die Bestimmung eines β-Amyloids oder Derivats davon durch einen Sandwich-Enzym-Immunoassay verwendet wird.

Bevorzugte Ausführungsformen des oben beschriebenen Aspekts (7) sind wie folgt:

(30) eine Hybridomzelle, die den in (26) beschriebenen monoklonalen Antikörper produziert;
(31) eine Hybridomzelle, die den in (27) beschriebenen monoklonalen Antikörper produziert; und
(32) eine Hybridomzelle, die den in (28) beschriebenen monoklonalen Antikörper produziert.

Die Antikörper (2) der oben beschriebenen Ausführungsform (13) sind vorzugsweise wie folgt:

(33) der in (11) beschriebene Antikörper, wobei das β-Amyloid ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz ist, die durch SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 6 dargestellt wird;
(34) der in (11) beschriebene Antikörper, wobei das Derivat des β-Amyloids folgendes ist: ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die aus der 2. bis 42. Aminosäure einer durch SEQ ID NO: 5 dargestellten Aminosäuresequenz besteht, ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die aus der 3. bis 42. Aminosäure der durch SEQ ID NO: 5 dargestellten Aminosäuresequenz besteht, wobei die N-terminale Glutaminsäure durch Pyroglutaminsäure substituiert ist, ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die aus der 4. bis 42. Aminosäure der durch SEQ ID NO: 5 dargestellten Aminosäuresequenz besteht, oder ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, der die 1. bis 16. Aminosäure oder die 1. bis 17. Aminosäure einer durch eine der Sequenzen SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenz fehlen;
(35) der in (11) beschriebene Antikörper, wobei das β-Amyloid oder sein Derivat ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, der die 1. bis 16. Aminosäure oder die 1. bis 17. Aminosäure einer durch eine der Sequenzen SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenz fehlen, ist;
(36) der in (11) beschriebene Antikörper, wobei das β-Amyloid oder sein Derivat ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, der die 1. bis 16. Aminosäure oder die 1. bis 17. Aminosäure einer durch SEQ ID NO: 3 dargestellten Aminosäuresequenz fehlen, ist;
(37) der in (11), (33) oder (36) beschriebene Antikörper, wobei der Antikörper ein Peptid mit einer durch SEQ ID NO: 11 dargestellten Aminosäuresequenz erkennt; und
(38) der in (11), (33) oder (36) beschriebene Antikörper, wobei der Antikörper zur Bestimmung eines β-Amyloids oder eines Derivats davon durch ein Sandwich-Enzym-Immunoassay verwendet wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform des oben beschriebenen Aspekts (10) gilt:

(39) der monoklonale Antikörper ist durch BP-90a bezeichnet.

Eine bevorzugte Ausführungsform des oben beschriebenen Aspekts (10) ist wie folgt:

(40) ein Verfahren zur Bestimmung eines β-Amyloids oder eines Derivats davon in einer Testlösung, umfassend das kompetitive Umsetzen des in (1) bis (6) beschriebenen Antikörpers mit der Testlösung und einem markierten β-Amyloid oder einem Derivat davon und das Messen des Verhältnisses des markierten β-Amyloids oder seines Derivats, das an den Antikörper gebunden ist.

Bevorzugte Ausführungsformen des oben beschriebenen Aspekts (10) sind wie folgt:

(41) ein Verfahren zur Bestimmung eines β-Amyloids oder eines Derivats davon in einer Testlösung, umfassend das Umsetzen eines auf einem Träger insolubilisierten Antikörpers gegen ein β-Amyloid oder Derivat davon, eines markierten Antikörpers gegen ein β-Amyloid oder Derivat davon und der Testlösung und dann das Messen der Aktivität eines Markers auf dem Träger, wobei es sich entweder bei dem auf dem Träger insolubilisierten Antikörper gegen das β-Amyloid oder Derivat davon oder bei dem markierten Antikörper gegen das β-Amyloid oder Derivat davon um den in (1) bis (6) beschriebenen Antikörper handelt und der jeweils andere ein Antikörper ist, der ein partielles Peptid mit einer durch SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 10 dargestellten Aminosäuresequenz erkennt;
(42) das in (41) beschriebene Bestimmungsverfahren, wobei der Antikörper, der das partielle Peptid mit der durch SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 10 dargestellten Aminosäuresequenz erkennt, ein monoklonaler Antikörper ist, der durch BAN-052a oder BAN-50a bezeichnet wird;
(43) das in (41) beschriebene Bestimmungsverfahren, wobei es sich entweder bei dem auf dem Träger insolubilisierten Antikörper gegen das β-Amyloid oder bei dem markierten Antikörper gegen das β-Amyloid um einen monoklonalen Antikörper handelt, der durch BA-27a, BS-85a oder BC-05a bezeichnet wird, und der jeweils andere ein monoklonaler Antikörper ist, der durch BAN-052a oder BAN-50a bezeichnet wird;
(44) das in (41) beschriebene Bestimmungsverfahren, wobei es sich entweder bei dem auf dem Träger insolubilisierten Antikörper gegen das β-Amyloid oder bei dem markierten Antikörper gegen das β-Amyloid um einen monoklonalen Antikörper handelt, der durch BA-27a bezeichnet wird, und der jeweils andere ein monoklonaler Antikörper ist, der durch BAN-052a oder BAN-50a bezeichnet wird, und das β-Amyloid oder Derivat davon ein Peptid mit einer durch SEQ ID NO: 1 dargestellten Aminosäuresequenz, ein Peptid mit einer durch SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz, ein Peptid mit einer durch SEQ ID NO: 3 dargestellten Aminosäuresequenz und/oder ein Peptid mit einer durch SEQ ID NO: 5 dargestellten Aminosäuresequenz ist;
(45) das in (41) beschriebene Bestimmungsverfahren, wobei es sich entweder bei dem auf dem Träger insolubilisierten Antikörper gegen das β-Amyloid oder bei dem markierten Antikörper gegen das β-Amyloid um einen monoklonalen Antikörper handelt, der durch BA-85a bezeichnet wird, und der jeweils andere ein monoklonaler Antikörper ist, der durch BAN-052a oder BAN-50a bezeichnet wird, und das β-Amyloid oder Derivat davon ein Peptid mit einer durch SEQ ID NO: 1 dargestellten Aminosäuresequenz, ein Peptid mit einer durch SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz, ein Peptid mit einer durch SEQ ID NO: 3 dargestellten Aminosäuresequenz und/oder ein Peptid mit einer durch SEQ ID NO: 5 dargestellten Aminosäuresequenz ist; und
(46) das in (41) beschriebene Bestimmungsverfahren, wobei es sich entweder bei dem auf dem Träger insolubilisierten Antikörper gegen das β-Amyloid oder bei dem markierten Antikörper gegen das β-Amyloid um einen monoklonalen Antikörper handelt, der durch BC-05a bezeichnet wird, und der jeweils andere ein monoklonaler Antikörper ist, der durch BAN-052a oder BAN-50a bezeichnet wird, und das β-Amyloid oder Derivat davon ein Peptid mit einer durch SEQ ID NO: 5 dargestellten Aminosäuresequenz ist.

(47) ein Verfahren zur Bestimmung eines β-Amyloids oder eines Derivats davon in einer Testlösung, umfassend das Umsetzen eines auf einem Träger insolubilisierten Antikörpers gegen ein β-Amyloid oder Derivat davon, eines markierten Antikörpers gegen ein β-Amyloid oder Derivat davon und der Testlösung und dann das Messen der Aktivität eines Markers auf dem Träger, wobei es sich entweder bei dem auf dem Träger insolubilisierten Antikörper gegen das β-Amyloid oder Derivat davon oder bei dem markierten Antikörper gegen das β-Amyloid oder Derivat davon um den in (10) beschriebenen Antikörper handelt und der jeweils andere der in (1) bis (6) beschriebene Antikörper ist.
(48) das in (47) beschriebene Bestimmungsverfahren, wobei es sich entweder bei dem auf dem Träger insolubilisierten Antikörper gegen das β-Amyloid oder bei dem markierten Antikörper gegen das β-Amyloid um einen monoklonalen Antikörper handelt, der durch BC-90a bezeichnet wird, und der jeweils andere ein monoklonaler Antikörper ist, der durch BA-27a, BS-85a oder BC-05a bezeichnet wird;
(49) das in (47) beschriebene Bestimmungsverfahren, wobei es sich entweder bei dem auf dem Träger insolubilisierten Antikörper gegen das β-Amyloid oder bei dem markierten Antikörper gegen das β-Amyloid um einen monoklonalen Antikörper handelt, der durch BC-90a bezeichnet wird, und der jeweils andere ein monoklonaler Antikörper ist, der durch BA-27a, BS-85a oder BC-05a bezeichnet wird, und das β-Amyloid oder Derivat davon ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz ist, der die 1. bis 16. Aminosäure oder die 1. bis 17. Aminosäure einer durch eine der Sequenzen SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenz fehlen.

Von den durch die vorliegende Erfindung erhaltenen Anti-β-Amyloid-Antikörperproduzierenden Hybridomen wurden BAN-052, BA-27 und BS-85 am 22. Dezember 1992 beim Institute for Fermentation, Osaka, Japan (IFO), unter den folgenden Zugriffsnummern und am 7. Januar 1993 beim National Institute of Bioscience and Human-technology, the Agency of Industrial Science and Technology, the Ministry of International Trade and Industry, Japan (NIBH), unter den folgenden Zugriffsnummern hinterlegt:

Hybridom IFO FERM-BP (NIBH)

BAN-052 50386 4138

BA-27 50387 4139

BS-85 50388 4140
Weiterhin wurde von den durch die vorliegende Erfindung erhaltenen Hybridomzellen BAN-50 am B. Januar 1993 beim Institute for Fermentation, Osaka, Japan (IFO), unter der folgenden Zugriffsnummer und am 27. Januar 1993 beim National Institute of Bioscience and Human-technology, the Agency of Industrial Science and Technology, the Ministry of International Trade and Industry, Japan (NIBH), unter der folgenden Zugriffsnummer hinterlegt:

Hybridom IFO FERM-BP (NIBH)

BAN-50 50390 4163
Weiterhin wurden von den durch die vorliegende Erfindung erhaltenen Hybridomzellen BC-05 und BP-90 am 2. November 1993 beim National Institute of Bioscience and Human-technology, the Agency of Industrial Science and Technology, the Ministry of International Trade and Industry, Japan (NIBH), unter den folgenden Zugriffsnummern hinterlegt:

Hybridom FERM-BP (NIBH)

BAN-05 4457

BS-90 4458
Der Antikörper, der jeweils von den Hybridomen erhalten wird, wird dargestellt, indem man den Suffix "a" an den Namen des Hybridoms anhängt.
Von den in dieser Beschreibung verwendeten SEQ ID NO: bezeichnen SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 12 Aminosäuresequenzen der folgenden Peptide:

[SEQ ID NO: 1] β-Amyloid (1-38)
[SEQ ID NO: 2] β-Amyloid (1-39)
[SEQ ID NO: 3] β-Amyloid (1-40)
[SEQ ID NO: 4] β-Amyloid (1-41)
[SEQ ID NO: 5] β-Amyloid (1-42)
[SEQ ID NO: 6] β-Amyloid (1-43)
[SEQ ID NO: 7] β-Amyloid (1-28)
[SEQ ID NO: 8] β-Amyloid (25-35)
[SEQ ID NO: 9] β-Amyloid (35-43)
[SEQ ID NO: 10] β-Amyloid (1-16)
[SEQ ID NO: 11] β-Amyloid (17-28)
[SEQ ID NO: 12] β-Amyloid (18-28)

Zu den in der vorliegenden Erfindung verwendeten β-Amyloiden gehören das β-Amyloid (1-38) mit der durch SEQ ID NO: 1 dargestellten Aminosäuresequenz, das β-Amyloid (1-39) mit der durch SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz, das β-Amyloid (1-40) mit der durch SEQ ID NO: 3 dargestellten Aminosäuresequenz, das β-Amyloid (1-41) mit der durch SEQ ID NO: 4 dargestellten Aminosäuresequenz, das β-Amyloid (1-42) mit der durch SEQ ID NO: 5 dargestellten Aminosäuresequenz und das β-Amyloid (1-43) mit der durch SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenz.
Zu den Derivaten der in der vorliegenden Erfindung verwendeten β-Amyloiden gehören Peptide, denen jeweils etwa 1 bis 17 Aminosäurereste von den N-terminalen Teilen der oben genannten β-Amyloide fehlen, Peptide, bei denen L-Asparaginsäure der oben genannten β-Amyloide zu L-Isoasparaginsäure, D-Isoasparaginsäure oder D-Asparaginsäure isomerisiert ist, und Peptide, bei denen die N-terminalen Teile der oben genannten β-Amyloide Pyroglutaminsäure aufweisen. Beispiele dafür sind das Peptid mit der Aminosäuresequenz, die aus der 3. bis 42. Aminosäure der durch SEQ ID NO: 5 dargestellten Aminosäuresequenz besteht, das Peptid mit der Aminosäuresequenz, die aus der 3. bis 42. Aminosäure der durch SEQ ID NO: 5 dargestellten Aminosäuresequenz besteht, wobei die N-terminale Glutaminsäure durch Pyroglutaminsäure ersetzt ist, das Peptid mit der Aminosäuresequenz, die aus der 4. bis 42. Aminosäure der durch SEQ ID NO: 5 dargestellten Aminosäuresequenz besteht, und das Peptid mit der Aminosäuresequenz, der die 1. bis 16. Aminosäure oder die 1. bis 17. Aminosäure aus der durch eine der Sequenzen SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenz fehlt (zum Beispiel das β-Amyloid (17-40) oder das β-Amyloid (18-40)). Diese β-Amyloide oder ihre Derivate können zum Beispiel nach an sich bekannten Verfahren aus Säugern, wie Menschen, Affen, Ratten und Mäusen, hergestellt werden, und es kann sich auch um gereinigte natürliche Proben handeln, die kommerziell erhältlich sind.
Beispiele für die partiellen Peptide auf den C-terminalen Seiten der β-Amyloide oder ihrer Derivate sind die partiellen Peptide mit den Aminosäuresequenzen, die jeweils die ab der 25. Aminosäure von der N-terminalen Aminosäure der β-Amyloide aus gezählt oder später beginnen.
Beispiele für die monoklonalen Antikörper, die spezifisch gegenüber den partiellen Peptiden auf den C-terminalen Seiten der β-Amyloide oder ihren Derivaten reaktiv sind, sind die Antikörper, die die partiellen Peptide oder ihre Derivate erkennen, aber nicht das partielle Peptid mit der durch SEQ ID NO: 7 dargestellten Aminosäuresequenz (nämlich das partielle Peptid auf den N-terminalen Seiten der β-Amyloide, das durch das β-Amyloid (1-28) dargestellt wird) erkennen, und wobei

(i) die Antikörper die partiellen Peptide mit jeweils den durch SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 9 dargestellten Aminosäuresequenzen (nämlich β-Amyloid (25-35) und β-Amyloid (35-43)) nicht erkennen;
(ii) die Antikörper das partielle Peptid mit der durch SEQ ID NO: 8 dargestellten Aminosäuresequenz (nämlich β-Amyloid (25-35)) erkennen, aber das partielle Peptid mit der durch SEQ ID NO: 9 dargestellten Aminosäuresequenz (nämlich β-Amyloid (35-43)) nicht erkennen; oder
(iii) die Antikörper das partielle Peptid mit der durch SEQ ID NO: 8 dargestellten Aminosäuresequenz (nämlich β-Amyloid (25-35)) nicht erkennen, aber das partielle Peptid mit der durch SEQ ID NO: 9 dargestellten Aminosäuresequenz (nämlich β-Amyloid (35-43)) erkennen.

Von den Antikörpern des oben beschriebenen Aspekts (i) werden diejenigen Antikörper bevorzugt, die insbesondere das β-Amyloid (1-38) mit der durch SEQ ID NO: 1 dargestellten Aminosäuresequenz, das β-Amyloid (1-39) mit der durch SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz und/oder das β-Amyloid (1-40) mit der durch SEQ ID NO: 3 dargestellten Aminosäuresequenz erkennen. Weiterhin sind solche Antikörper bevorzugt, die das β-Amyloid (1-38) mit der durch SEQ ID NO: 1 dargestellten Aminosäuresequenz, das β-Amyloid (1-39) mit der durch SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz, das β-Amyloid (1-40) Amyloid (1-42) mit der durch SEQ ID NO: 5 dargestellten Aminosäuresequenz erkennen.
Von den Antikörpern des oben beschriebenen Aspekts (ii) werden diejenigen Antikörper bevorzugt, die insbesondere das β-Amyloid (1-38) mit der durch SEQ ID NO: 1 dargestellten Aminosäuresequenz, das β-Amyloid (1-39) mit der durch SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz und/oder das β-Amyloid (1-40) mit der durch SEQ ID NO: 3 dargestellten Aminosäuresequenz und/oder das β-Amyloid (1-42) mit der durch SEQ ID NO: 5 dargestellten Aminosäuresequenz erkennen.
Weiterhin sind von den Antikörpern des oben beschriebenen Aspekts (iii) diejenigen Antikörper bevorzugt, die insbesondere die β-Amyloide erkennen, die in den Ameisensäureextrakten aus den Gehirnen von Patienten mit Alzheimer-Krankheit enthalten sind (insbesondere das β-Amyloid (1-42) mit der durch SEQ ID NO: 5 dargestellten Aminosäuresequenz). Weiterhin sind diejenigen Antikörper bevorzugt, die das β-Amyloid (1-42) mit der durch SEQ ID NO: 5 dargestellten Aminosäuresequenz erkennen, aber das β-Amyloid (1-38) mit der durch SEQ ID NO: 1 dargestellten Aminosäuresequenz, das β-Amyloid (1-39) mit der durch SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz und das β-Amyloid (1-40) mit der durch SEQ ID NO: 3 dargestellten Aminosäuresequenz nicht erkennen.
Typische Beispiele für die Antikörper des oben beschriebenen Aspekts (i) umfassen den mit BA-27a bezeichneten monoklonalen Antikörper, typische Beispiele für die Antikörper des oben beschriebenen Aspekts (ii) umfassen den mit BS-85a bezeichneten monoklonalen Antikörper, und typische Beispiele für die Antikörper des oben beschriebenen Aspekts (iii) umfassen die mit BC-05a, BC-15a, BC-65a, BC-75a und BC-55a bezeichneten monoklonalen Antikörper (insbesondere ist BC-05a bevorzugt).
Zu den in der vorliegenden Erfindung verwendeten monoklonalen Antikörpern, die spezifisch gegenüber den partiellen Peptiden auf den N-terminalen Seiten der β-Amyloide oder deren Derivaten reaktiv sind, gehören zum Beispiel die mo noklonalen Antikörper, die das partielle Peptid mit der durch SEQ ID NO: 7 dargestellten Aminosäuresequenz (β-Amyloid (1-28)) und/oder das partielle Peptid mit der durch SEQ ID NO: 10 dargestellten Aminosäuresequenz (β-Amyloid (1-16)) erkennen. Insbesondere sind die mit BAN-50a, BAN-052a, BAN-11a, BAN-30a, BAN-20a und BAN-40a bezeichneten monoklonalen Antikörper gezeigt, und insbesondere die mit BAN-052a und BAN-50a bezeichneten monoklonalen Antikörper sind bevorzugt.
Weiterhin gehören zu den in der vorliegenden Erfindung verwendeten monoklonalen Antikörpern, die spezifisch gegenüber den partiellen Peptiden in den zentralen Teilen der β-Amyloide oder deren Derivaten reaktiv sind, zum Beispiel die Antikörper (vorzugsweise monoklonalen Antikörper), die das partielle Peptid mit der durch SEQ ID NO: 7 dargestellten Aminosäuresequenz nicht erkennen und das partielle Peptid mit der durch SEQ ID NO: 12 dargestellten Aminosäuresequenz erkennen. Von diesen Antikörpern sind diejenigen Antikörper bevorzugt, die insbesondere die Peptide mit den Aminosäuresequenzen erkennen, denen die 1. bis 16. Aminosäure oder die 1. bis 17. Aminosäure der durch eine der Sequenzen SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenzen fehlen. Insbesondere sind diejenigen Antikörper bevorzugt, die insbesondere das Peptid mit der Aminosäuresequenz, der die 1. bis 16. Aminosäure aus der durch SEQ ID NO: 3 dargestellten Aminosäuresequenz fehlen (die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 11), oder das Peptid mit der Aminosäuresequenz, der die 1. bis 17. Aminosäure daraus fehlen (die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 12), erkennen. Insbesondere werden die mit BP-01a, BP-02a, BP-03a und BP-90a bezeichneten monoklonalen Antikörper verwendet. Von diesen monoklonalen Antikörpern können BP-03a und BP-90a auch das partielle Peptid mit der durch SEQ ID NO: 11 bezeichneten Aminosäuresequenz erkennen. Von diesen monoklonalen Antikörpern ist BP-90a besonders gut geeignet.
Verfahren zur Herstellung der Antigene und Verfahren zur Herstellung der monoklonalen Antikörper sind unten im Einzelnen erläutert.
(1) Herstellung von Antigenen
Als Antigene, die zur Herstellung der Antikörper der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können zum Beispiel beliebige β-Amyloide oder deren Derivate, partielle Peptide, die durch Hydrolysieren der β-Amyloide oder deren Derivate erhalten werden, und synthetische Peptide mit einer oder mehreren Arten von antigenen Determinanten, die dieselben wie die der β-Amyloide sind, verwendet werden (diese werden im folgenden auch kurz als β-Amyloid-Antigene bezeichnet).
Als β-Amyloide oder deren Derivate werden die oben genannten verwendet. Diese β-Amyloide oder ihre Derivate können zum Beispiel nach an sich bekannten Verfahren aus Säugern, wie Menschen, Affen, Ratten und Mäusen, hergestellt werden, und es kann sich auch um gereinigte natürliche Proben handeln, die kommerziell erhältlich sind. Beispiele für die partiellen Peptide, die durch Hydrolysieren der β-Amyloide erhalten werden, sind partielle Peptide, die durch sukzessives Hydrolysieren des β-Amyloids (1-43) mit der durch SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenz vom N-Terminus und/oder vom C-Terminus her mit Exoproteasen, wie Aminopeptidase und Carboxypeptidase oder Gemischen davon, erhalten werden, sowie partielle Peptide, die durch Hydrolysieren des β-Amyloids (1-43) mit verschiedenen Endopeptidasen oder Gemischen davon erhalten werden. Wenn das β-Amyloid (1-42) nach diesem Verfahren hergestellt wird, ist die Probe in manchen Fällen mit β-Amyloid (1-41) und/oder β-Amyloid (1-43) kontaminiert.
Beispiele für die synthetischen Peptide, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind Peptide mit derselben Struktur wie die oben genannten gereinigten natürlichen β-Amyloid-Antigene und Peptide mit einer oder mehreren Arten von Aminosäuresequenzen, die dieselben sind wie diejenigen von beliebigen Teilen, die aus wenigstens 3 Aminosäuren, vorzugsweise wenigstens 6 Aminosäuren, in den Aminosäuresequenzen von β-Amyloid (1-43) usw. bestehen (im folgenden kurz als β-Amyloid-verwandte synthetische Peptide bezeichnet).
Die oben genannten synthetischen Peptide können nach in der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden, bei denen es sich entweder um Festphasen-Syntheseverfahren oder Flüssigphasensyntheseverfahren handeln kann. Beispiele für solche Verfahren der Peptidsynthese sind Verfahren, die in B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85, 2149 (1963), M. Bodanszky und M.A. Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966), Schroder und Lubke, The Peptide/Academic Press, New York (1965), N. Izumiya et al., Peptide Gosei no Kiso to Jikken (Fundamentals and Experiments of Peptide Synthesis), Maruzen (1985), sowie H. Yazima und S. Sakakibara, Seikagaku Jikken Koza 1 (Course of Biochemical Experiments 1), Chemistry of Proteins IV, 205 (1977), beschrieben sind. Wenn die β-Amyloide oder die β-Amyloid-verwandten synthetischen Peptide zum Beispiel nach den Festkörperverfahren synthetisiert werden, werden beliebige Harze, die in der Technik als unlösliche Harze bekannt sind (wie Chlormethylharze und 4-Oxymethylphenylacetamidomethyl-Harze), für eine sukzessive Kondensation von geschützten Aminosäuren an die C-terminalen Seiten der β-Amyloide oder der β-Amyloid-verwandten synthetischen Peptide gemäß den üblichen Verfahren verwendet. Dann werden alle Schutzgruppen durch Behandlung mit Fluorwasserstoff entfernt, und anschließend erfolgt eine Reinigung mit an sich bekannten Verfahren, wie HPLC (high performance liquid chromatography). So können die gewünschten β-Amyloide oder β-Amyloid-verwandten synthetischen Peptide erhalten werden.
N-Geschützte Aminosäuren können nach den Verfahren hergestellt werden, bei denen man die α-Aminogruppen mit Boc-Gruppen schützt; weiterhin zum Beispiel die Hydroxygruppen von Serin und Threonin mit Bzl-Gruppen; die ω-Carbonsäuregruppen von Glutaminsäure und Asparaginsäure mit OBzl-Gruppen; die ε-Aminogruppe von Lysin mit einer Cl-Z-Gruppe; die Guanidogruppe von Arginin mit einer Tos-Gruppe; und die Imidazolgruppe von Histidin mit einer Bom-Gruppe.
Wenn Aminosäuren usw. in der Beschreibung dieser Erfindung durch Abkürzungen bezeichnet werden, werden die Abkürzungen, die von der IUPAC-IUB Commission an Biochemical Nomenclature festgelegt wurden, oder solche, die in der Fachwelt gewöhnlich verwendet werden, eingesetzt. Zum Beispiel werden die folgenden Abkürzungen verwendet. Wenn die Aminosäuren als optische Isomere vorliegen können, sollen die L-Formen gemeint sein, wenn nichts anderes angegeben ist.

PAM:: Phenylacetamidomethyl
Boc:: t-Butyloxycarbonyl
Cl-Z:: 2-Chlorbenzyloxycarbonyl
Br-Z:: 2-Brombenzyloxycarbonyl
Bzl:: Benzyl
OcHex:: Cyclohexylester
OBzl:: Benzylester
Tos:: p-Toluolsulfonyl
HOBt:: 1-Benzotriazol
MeBzl:: 4-Methylbenzyl
Bom:: Benzyloxymethyl
DCC:: N,N'-Dichlorhexylcarbodiimid
Gly:: Glycin
Ala:: Alanin
Val:: Valin
Leu:: Leucin
Ile:: Isoleucin
Ser:: Serin
Thr:: Threonin
Cys:: Cystein
Met:: Methionin
Glu:: Glutaminsäure
Asp:: Asparaginsäure
Lys:: Lysin
Arg:: Arginin
His:: Histidin
Phe:: Phenylalanin
Tyr:: Tyrosin
Trp:: Tryptophan
Pro:: Prolin
Asn:: Asparagin
Gln:: Glutamin

Da die β-Amyloid-Antigene leicht aggregieren, können auch insolubilisierte direkt für die Immunisierung verwendet werden. Weiterhin können auch Komplexe für die Immunisierung verwendet werden, bei denen die β-Amyloid-Antigene an geeignete Träger gebunden oder adsorbiert sind. Was die Träger und das Mischungsverhältnis der Träger zu den η-Amyloid-Antigenen (Haptenen) betrifft, so können die Antigene in beliebigem Verhältnis an beliebige Träger gebunden oder adsorbiert sein, solange die Antikörper gegen die an die Träger gebundenen oder adsorbierten β-Amyloid-Antigene effektiv produziert werden. Es können auch Komplexe verwendet werden, bei denen die Haptenantigene an natürliche oder synthetische Polymerträger, welche gewöhnlich bei der Herstellung von Antikörpern gegen die Haptenantigene verwendet werden, in einem Gewichtsverhältnis von 0,1 bis 100, bezogen auf 1 für das Hapten, gebunden oder adsorbiert sind. Zu den natürlichen Polymerträgern gehören zum Beispiel Serumalbumin von Säugern, wie Rindern, Kaninchen und Menschen, Thyroglobulin von Säugern, wie Rindern und Kaninchen, Hämoglobin von Säugern, wie Rindern, Kaninchen, Menschen und Schafen, sowie Schlitzschnecken-Hämocyanin. Beispiele für die synthetischen Polymerträger, die verwendet werden können, sind verschiedene Latices von Polymeren oder Copolymeren, wie Aminosäurepolymeren, Styrolpolymeren, Acrylpolymeren, Vinylpolymeren und Propylenpolymeren.
Außerdem können verschiedene Kondensationsmittel verwendet werden, um die Haptene und die Träger aneinander zu koppeln. Beispiele für die Kondensationsmittel, die zweckmäßigerweise verwendet werden, sind Diazoniumverbindungen, wie Bis-diazotiertes Benzidin, das Tyrosin, Histidin und Tryptophan miteinander vernetzt; Dialdehydverbindungen, wie Glutaraldehyd, das Aminogruppen miteinander vernetzt, Diisocyanatverbindungen, wie Toluol-2,4-diisocyanat, Dimaleinimidverbindungen, wie N,N'-o-Phenylendimaleinimid, das Thiolgruppen miteinander vernetzt, Maleinimid-Aktivesterverbindungen, die Aminogruppen und Thiolgruppen miteinander vernetzen, sowie Carbodiimidverbindungen, die Aminogruppen und Carboxygruppe miteinander vernetzen. Wenn Aminogruppen miteinander vernetzt werden, gibt es eine andere Methode, mit der ein Aktivesterreagens (zum Beispiel SPDP) mit einer Dithiopyridylgruppe mit einer Aminosäure umgesetzt und anschließend eine Thiolgruppe eingeführt wird, während in die andere Aminogruppe unter Verwendung eines Maleinimid-Aktivester-Reagens eine Maleinimidgruppe eingeführt wird und dann beide miteinander umgesetzt werden.
(2) Herstellung von monoklonalen Antikörpern
Die β-Amyloid-Antigene werden allein oder zusammen mit Trägern und Verdünnungsmitteln warmblütigen Tieren an für die Antikörperproduktion geeigneten Stellen verabreicht, zum Beispiel durch intraperitoneale, intravenöse und subkutane Injektion. Wenn die β-Amyloid-Antigene verabreicht werden, kann auch Freunds vollständiges Adjuvans oder Freunds unvollständiges Adjuvans verabreicht werden, um die Antikörperproduktionsfähigkeit zu erhöhen. Die Dosierung ist gewöhnlich einmal alle 2 bis 6 Wochen, insgesamt 2- bis 10mal. Zu den warmblütigen Tieren gehören zum Beispiel Affen, Kaninchen, Hunde, Meerschweinchen, Mäuse, Ratten, Schafe, Ziegen und Hühner. Für die Herstellung der monoklonalen Antikörper werden vorzugsweise Mäuse und Ratten verwendet.
Bei der Herstellung der monoklonalen Antikörper werden Individuen, die einen hohen Antikörpertiter zeigen, aus den warmblütigen Tieren, zum Beispiel Mäusen, die mit den β-Amyloid-Antigenen immunisiert wurden, ausgewählt. Nach 2 bis 5 Tagen nach der endgültigen Immunisierung werden die Milzen oder die Lymphknoten entnommen, und antikörperproduzierende Zellen, die darin enthalten sind, werden mit Myelomzellen fusioniert, wodurch Hybridome hergestellt werden können, die monoklonale Anti-β-Amyloid-Antikörper produzieren. Der Anti-β-Amyloid-Antikörpertiter in dem Serum wird zum Beispiel bestimmt, indem man ein unten beschriebenen markiertes β-Amyloid mit einem Antiserum umsetzt und dann die Aktivität eines an den Antikörper gebundenen Markierungsmittels bestimmt. Das Fusionsverfahren kann nach in der Technik bekannten Verfahren durchgeführt werden, zum Beispiel nach dem Verfahren von Köhler und Milstein (Nature, 256, 495 (1975)]. Fusionsbeschleuniger, einschließlich Polyethylenglycol (PEG) und Sendai-Virus, können verwendet werden. Insbesondere wird vorzugsweise PEG verwendet. Beispiele für die Myelomzellen sind NS-1, P3U1, SP2/0 und AP-1, und P3U1 wird vorzugsweise verwendet. Das Verhältnis der zu verwendenden antikörperproduzierenden Zellen (Milzzellen) zu den Myelomzellen beträgt vorzugsweise etwa 1:1 bis 20:1. PEG (vorzugsweise PEG 1000 bis PEG 6000) kann in einer Konzentration von etwa 10 bis 80% hinzugefügt werden, woraufhin eine Inkubation bei 20 bis 40°C, vorzugsweise 30 bis 37°C, während 1 bis 10 Minuten erfolgt, wodurch effektiv eine Zellfusion durchgeführt wird.
Verschiedene Verfahren können verwendet werden, um die Hybridome, die Anti-β-Amyloid-Antikörper produzieren, zu durchmustern. Beispiele für solche Verfahren sind ein Verfahren, das folgendes umfasst: die Zugabe eines Überstands einer Hybridomkultur zu einer festen Phase (zum Beispiel einer Mikroplatte), wodurch ein β-Amyloid oder ein β-Amyloid-verwandtes synthetisches Peptid direkt oder zusammen mit einem Träger adsorbiert werden kann, und dann die Zugabe eines Anti-Immunglobulin-Antikörpers (wenn eine Mäusezelle für die Zellfusion verwendet wird, wird ein Anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper verwendet) oder von Protein A, das mit einem radioaktiven Material markiert ist, oder eines Enzyms zum Nachweis eines monoklonalen Anti-β-Amyloid-Antikörpers, der an die feste Phase gebunden ist; und ein Verfahren, das folgendes umfasst: die Zugabe eines Überstands einer Hybridomkultur zu einer festen Phase, wodurch ein Anti-Immunglobulin-Antikörper oder Protein A adsorbiert werden kann, und die Zugabe eines β-Amyloids, das mit einem radioaktiven Material markiert ist, oder eines Enzyms zum Nachweis eines monoklonalen Anti-β-Amyloid-Antikörpers, der an die feste Phase gebunden ist. Die Selektion und Aufzucht des monoklonalen Anti-β-Amyloid-Antikörpers erfolgt gewöhnlich in einem Medium für Tierzellen, das mit 10-20% fetalem Kälberserum ergänzt ist (zum Beispiel RPMI 1640) und mit HAT (Hypoxanthin, Aminopte rin und Thymidin) versetzt wurde. Der Antikörpertiter des Hybridomkulturüberstands kann in ähnlicher Weise bestimmt werden wie bei dem oben genannten Assay für den monoklonalen Anti-β-Amyloid-Antikörper im Antiserum.
Die Abtrennung und Reinigung der monoklonalen Anti-β-Amyloid-Antikörper erfolgen ähnlich wie die übliche Abtrennung und Reinigung von polyklonalen Antikörpern gemäß den Trenn- und Reinigungsverfahren für Immunglobulin [zum Beispiel Salzfällung, Alkoholfällung, isoelektrische Fällung, Elektrophorese, Adsorption und Desorption mit Ionenaustauschmaterialien (zum Beispiel DEAE), Ultrazentrifugation, Gelfiltration und spezifische Reinigung, bei der nur die Antikörper mit aktiven Adsorptionsmitteln, wie antigenbindenden festen Phasen, Protein A und Protein G aufgefangen werden]. Weiterhin können das Hybridom, das die gegenüber einem Teilbereich des β-Amyloids reaktiven monoklonalen Anti-β-Amyloid-Antikörper produziert, und das Hybridom, das die gegenüber dem β-Amyloid reaktiven, aber gegenüber einem Teilbereich davon unreaktiven monoklonalen Anti-β-Amyloid-Antikörper produziert, zum Beispiel dadurch selektiert werden, dass man die Bindungseigenschaft eines Peptids, das dem Teilbereich entspricht, und eines von dem Hybridom produzierten Antikörpers bestimmt.
Der so erhaltene Antikörper der vorliegenden Erfindung, der spezifisch reaktiv gegenüber dem partiellen Peptid auf der C-terminalen Seite des β-Amyloids oder des Derivats davon ist, der mit BAN-052a bezeichnete monoklonale Antikörper, der mit BAN-50a bezeichnete monoklonale Antikörper und der Antikörper, der spezifisch reaktiv gegenüber dem partiellen Peptid im zentralen Teil des β-Amyloids oder des Derivats davon ist, können jeweils spezifisch die partiellen Peptide auf der N-terminalen und der C-terminalen Seite bzw. im zentralen Teil des β-Amyloids erkennen. Sie können daher für die Bestimmung des β-Amyloids oder des Derivats davon in einer Testlösung, insbesondere für die Bestimmung durch den Sandwich-Immunoassay, verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung stellt nämlich folgendes bereit:

(1) ein Verfahren zur Bestimmung eines β-Amyloids oder eines Derivats davon in einer Testlösung, umfassend das kompetitive Umsetzen eines Antikörpers der vorliegenden Erfindung gegen das β-Amyloid oder sein Derivat mit der Testlösung und einem markierten β-Amyloid oder einem Derivat davon und das Messen des Verhältnisses des markierten β-Amyloids oder seines Derivats, das an den Antikörper gebunden ist;
(2) ein Verfahren zur Bestimmung eines β-Amyloids oder eines Derivats davon in einer Testlösung, umfassend das Umsetzen eines auf einem Träger insolubilisierten Antikörpers gegen ein β-Amyloid oder Derivat davon, eines markierten Antikörpers gegen ein β-Amyloid oder Derivat davon und der Testlösung und dann das Messen der Aktivität eines Markers auf dem Träger in dem Verfahren, wobei es sich entweder bei dem auf dem Träger insolubilisierten Antikörper gegen das β-Amyloid oder Derivat davon oder bei dem markierten Antikörper gegen das β-Amyloid oder Derivat davon um einen Antikörper handelt, der spezifisch reaktiv gegenüber einem partiellen Peptid auf der C-terminalen Seite des β-Amyloids oder des Derivats davon ist, und der jeweils andere ein Antikörper ist, der ein partielles Peptid mit einer durch SEQ ID NO: 7 dargestellten Aminosäuresequenz (nämlich β-Amyloid (1-28)) und/oder ein partielles Peptid mit einer durch SEQ ID NO: 10 dargestellten Aminosäuresequenz (nämlich β-Amyloid (1-16)) erkennt; und
(3) ein Verfahren zur Bestimmung eines β-Amyloids oder eines Derivats davon in einer Testlösung, umfassend das Umsetzen eines auf einem Träger insolubilisierten Antikörpers gegen ein β-Amyloid oder Derivat davon, eines markierten Antikörpers gegen ein β-Amyloid oder Derivat davon und der Testlösung und dann das Messen der Aktivität eines Markers auf dem Träger, wobei es sich entweder bei dem auf dem Träger insolubilisierten Antikörper gegen das β-Amyloid oder Derivat davon oder bei dem markierten Antikörper gegen das β-Amyloid oder Derivat davon um einen Antikörper handelt, der spezifisch reaktiv gegenüber einem partiellen Peptid in einem zentralen Teil des β-Amyloids oder des Derivats davon ist, und der jeweils andere ein Antikörper, der ein partielles Peptid auf der C-terminalen Seite des β-Amyloids oder des Derivats davon erkennt, oder ein Antikörper, der ein partielles Peptid mit einer durch SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 10 dargestellten Aminosäuresequenz erkennt, ist.

Insbesondere handelt es sich bei dem Antikörper, der spezifisch reaktiv gegenüber dem partiellen Peptid auf der C-terminalen Seite des β-Amyloids oder des Derivats davon ist, um den mit BA-27a, BS-85a oder BC-05a bezeichneten monoklonalen Antikörper, bei dem Antikörper, der das partielle Peptid mit der durch SEQ ID NO: 7 dargestellten Aminosäuresequenz (nämlich β-Amyloid (1-28)) und/oder das partielle Peptid mit der durch SEQ ID NO: 10 dargestellten Aminosäuresequenz (nämlich β-Amyloid (1-16)) erkennt, um den mit BA-052a oder BAN-50a bezeichneten monoklonalen Antikörper und bei dem Antikörper, der spezifisch reaktiv gegenüber dem partiellen Peptid im zentralen Teil des β-Amyloids oder des Derivats davon ist, um den mit BP-90a bezeichneten Antikörper.
Besonders bevorzugte Beispiele für die oben genannten Bestimmungsverfahren (2) sind:
ein Bestimmungsverfahren, bei dem es sich entweder bei dem auf dem Träger insolubilisierten Antikörper gegen das β-Amyloid oder Derivat davon oder bei dem markierten Antikörper gegen das β-Amyloid oder Derivat davon um den mit BA-27a bezeichneten monoklonalen Antikörper handelt, der jeweils andere der mit BAN-052a oder BAN-50a bezeichnete monoklonale Antikörper ist und es sich bei dem β-Amyloid um das Peptid mit der durch SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 dargestellten Aminosäuresequenz handelt;
ein Bestimmungsverfahren, bei dem es sich entweder bei dem auf dem Träger insolubilisierten Antikörper gegen das β-Amyloid oder Derivat davon oder bei dem markierten Antikörper gegen das β-Amyloid oder Derivat davon um den mit BS-85a bezeichneten monoklonalen Antikörper handelt, der jeweils andere der mit BAN-052a oder BAN-50a bezeichnete monoklonale Antikörper ist und es sich bei dem β-Amyloid um das Peptid mit der durch SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5 dargestellten Aminosäuresequenz handelt; und
ein Bestimmungsverfahren, bei dem es sich entweder bei dem auf dem Träger insolubilisierten Antikörper gegen das β-Amyloid oder Derivat davon oder bei dem markierten Antikörper gegen das β-Amyloid oder Derivat davon um den mit BC-05a bezeichneten monoklonalen Antikörper handelt, der jeweils andere der mit BAN-052a oder BAN-50a bezeichnete monoklonale Antikörper ist und es sich bei dem β-Amyloid um das Peptid mit der durch SEQ ID NO: 5 dargestellten Aminosäuresequenz handelt.
Besonders bevorzugte Beispiele für die oben genannten Bestimmungsverfahren (3) sind:
ein Bestimmungsverfahren, bei dem es sich entweder bei dem auf dem Träger insolubilisierten Antikörper gegen das β-Amyloid oder bei dem markierten Antikörper gegen das β-Amyloid um den mit BP-90a bezeichneten monoklonalen Antikörper handelt, der jeweils andere der mit BAN-052a oder BAN-50a bezeichnete monoklonale Antikörper ist und es sich bei dem β-Amyloid oder dem Derivat davon um das Peptid mit der durch SEQ ID NO: 1 dargestellten Aminosäuresequenz, das Peptid mit der durch SEQ ID NO: 1 dargestellten Aminosäuresequenz, das Peptid mit der durch SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz, das Peptid mit der durch SEQ ID NO: 3 dargestellten Aminosäuresequenz, das Peptid mit der durch SEQ ID NO: 4 dargestellten Aminosäuresequenz, das Peptid mit der durch SEQ ID NO: 5 dargestellten Aminosäuresequenz und/oder das Peptid mit der durch SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenz handelt; und
ein Bestimmungsverfahren, bei dem es sich entweder bei dem auf dem Träger insolubilisierten Antikörper gegen das β-Amyloid oder bei dem markierten Antikörper gegen das β-Amyloid um den mit BP-90a bezeichneten monoklonalen Antikörper handelt, der jeweils andere der mit BA-27a, BS-85a oder BC-05a bezeichnete monoklonale Antikörper ist und es sich bei dem β-Amyloid oder dem Derivat davon um das Peptid mit der Aminosäuresequenz handelt, der die 1. bis 16. Aminosäure oder die 1. bis 17. Aminosäure einer durch eine der Sequenzen SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenz fehlen.
Die Bestimmungsverfahren (Immunoassays) für die β-Amyloide oder Derivate davon (im folgenden kurz als "β-Amyloide" bezeichnet) der vorliegenden Erfindung werden im folgenden ausführlicher beschrieben.
Die Antikörper der vorliegenden Erfindung können die β-Amyloide erkennen, so dass die Bestimmung oder der Nachweis der β-Amyloide durch Gewebefärbung durchgeführt werden können. Für diese Zwecke können entweder die Antikörper selbst oder F(ab')2-, Fab'- oder Fab-Fraktionen von Antikörpermolekülen verwendet werden. Die Messverfahren unter Verwendung der Antikörper der vorliegenden Erfindung unterliegen keiner besonderen Einschränkung. Jedes Messverfahren kann verwendet werden, solange die Menge der Antikörper, der Antigene oder der Antikörper-Antigen-Komplexe, die der Menge der Antigene (zum Beispiel der Menge der β-Amyloide) in zu messenden Lösungen entsprechen, mit chemischen oder physikalischen Mitteln nachgewiesen und anhand von Standardkurven, die unter Verwendung von Standardlösungen, die die Antigene in bekannten Mengen enthalten, hergestellt wurden, berechnet wird. Zum Beispiel werden Nephelometrie, kompetitive Verfahren, immunometrische Verfahren und Sandwich-Verfahren in geeigneter Weise verwendet. Im Hinblick auf die Empfindlichkeit und Spezifität ist es besonders bevorzugt, die unten beschriebenen Sandwich-Verfahren zu verwenden.
Bei Messverfahren unter Verwendung von Markierungssubstanzen werden Radioisotope, Enzyme, fluoreszente Substanzen, lumineszierende Substanzen usw. als Marker verwendet. Beispiele für die Radioisotope sind ¹²⁵I, ¹³¹I, ³H und ¹⁴C. Die oben genannten Enzyme sind vorzugsweise stabil und haben eine hohe spezifische Aktivität. Beispiele dafür sind β-Galactosidase, β-Glucosidase, Alkalische Phosphatase, Peroxidase und Malat-Dehydrogenase. Beispiele für die fluoreszierenden Substanzen sind Fluorescamin und Fluoresceinisothiocyanat. Zu den lumineszierenden Substanzen gehören zum Beispiel Luminol, Luminolderivate, Luciferin und Lucigenin. Weiterhin können auch Biotin-Avidin-Systeme für die Bindung der Antikörper oder der β-Amyloide an die Marker verwendet werden.
Wenn die Antigene oder die Antikörper insolubilisiert werden, kann entweder physikalische Adsorption oder chemische Bindung, die gewöhnlich für die Insolubilisierung oder Fixierung von Proteinen oder Enzymen verwendet wird, eingesetzt werden. Beispiele für die Träger sind unlösliche Polysaccharide, wie Agarose, Dextran und Cellulose, synthetische Harze, wie Polystyrol, Polyacrylamid und Siliconpolymere, sowie Glas.
Bei den Sandwich-Verfahren werden die Testlösungen mit den insolubilisierten Anti-β-Amyloid-Antikörpern umgesetzt (die erste Reaktion), weiterhin werden die markierten Anti-β-Amyloid-Antikörper umgesetzt (die zweite Reaktion), und dann wird die Aktivität der Marker auf den insolubilisierten Trägern bestimmt, wodurch die Menge der β-Amyloide in den Testlösungen bestimmt werden kann. Die erste Reaktion und die zweite Reaktion können gleichzeitig oder nacheinander durchgeführt werden. Die Marker und die Insolubilisierungsverfahren können gemäß den oben beschriebenen verwendet werden. Weiterhin sind bei den Immunoassays durch Sandwich-Verfahren die als Antikörper für feste Phasen verwendeten Antikörper oder die zum Markieren verwendeten Antikörper nicht notwendigerweise von derselben Art, sondern zwei oder mehr Arten von Antikörpern können für den Zweck der Erhöhung der Messempfindlichkeit usw. auch als Gemisch verwendet werden.
In den Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Messen der β-Amyloide durch die Sandwich-Verfahren sind die in der ersten Reaktion verwendeten Anti-β-Amyloid-Antikörper vorzugsweise von denjenigen, die in der zweiten Reaktion verwendet werden, hinsichtlich der Stellen, an denen die Antikörper an die β-Amyloide binden, verschieden. Wenn der in der ersten Reaktion verwendete Antikörper zum Beispiel das partielle Peptid auf der N-terminalen Seite des β-Amyloids erkennt, ist der in der zweiten Reaktion verwendete Antikörper vorzugsweise ein Antikörper, der ein anderes partielles Peptid als das partielle Peptid auf der N-terminalen Seite erkennt (nämlich das partielle Peptid auf der C-terminalen Seite).
Von den monoklonalen Antikörpern, die unter Verwendung des β-Amyloids (1-40) als Immunogen hergestellt werden, wird zweckmäßigerweise insbesondere ein Antikörper, der nicht mit dem β-Amyloid (1-28) reagiert, als monoklonaler Antikörper verwendet, der spezifisch reaktiv gegenüber dem partiellen Peptid auf der C-terminalen Seite des β-Amyloids ist. Die Erfinder entwickelten zwei Arten von Hybridomen, von denen jedes einen solchen Antikörper produziert. Die von diesen Hybridomen produzierten Antikörper zeigten in kompetitiven Enzym-Immunoassays keine Kreuzreaktion mit dem β-Amyloid (1-28) unter Verwendung des unten beschriebenen β-Galactosidase-markierten β-Amyloids (1-40), sie reagierten aber mit dem β-Amyloid (1-40) (Antigenkonzentration, die B/B₀ = 0,5 ergibt: 200 bis 250 nM, 40 bis 50 ng/Napf). Wenn sie weiterhin in den Sandwich-Verfahren verwendet wurden, insbesondere in Kombination mit BAN-50a oder BAN-052a als monoklonale Antikörper, die unter Verwendung des unten beschriebenen β-Amyloids (1-16) als Immunogen, das das partielle Peptid auf der N-terminalen Seite des β-Amyloids erkennt, hergestellt wurden, zeigte das Ergebnis, dass das β-Amyloid unerwarteterweise mit einer höheren Empfindlichkeit (Nachweisempfindlichkeit: 0,2 pg/Napf) gemessen werden konnte. Als monoklonale Antikörper von einer Art, die spezifisch reaktiv gegenüber dem partiellen Peptid auf der C-terminalen Seite des β-Amyloids ist und für die Sandwich-Enzym-Immunoassays der vorliegenden Erfindung geeignet ist, werden nämlich zweckmäßigerweise monoklonale Antikörper verwendet, die mit dem β-Amyloid (1-40) reagieren, aber nicht mit dem β-Amyloid (1-28) kreuzreagieren. Diese Antikörper erfordern nicht notwendigerweise eine hohe Affinität zu dem β-Amyloid (1-40). Zum Beispiel wird zweckmäßigerweise BA-27a als ein solcher Antikörper verwendet.
Als monoklonale Antikörper, die spezifisch reaktiv gegenüber dem partiellen Peptid auf der C-terminalen Seite des β-Amyloids sind und die in den Sandwich-Immunoassays der vorliegenden Erfindung verwendet werden, werden weiterhin zweckmäßigerweise Antikörper verwendet, die unter Verwendung des β-Amyloids (25-35) als Immunogen hergestellt wurden. Die Erfinder entwickelten fünf Arten von Hybridomen, die diese Antikörper produzieren. Die Antikörper reagierten in kompetitiven Enzym-Immunoassays unter Verwendung des unten be schriebenen β-Galactosidase-markierten β-Amyloids (1-40) mit dem β-Amyloid (25-35) (Antigenkonzentration, die B/B₀ = 0,5 ergibt: 20 nM, 1 ng/Napf) und reagierten auch mit dem β-Amyloid (1-40) (Antigenkonzentration, die B/B₀ = 0,5 ergibt: 800 nM, 160 ng/Napf). Weiterhin ergibt die Kombination der Antikörper mit BAN-50a oder BAN-052a unerwarteterweise eine höhere Empfindlichkeit (Nachweisempfindlichkeit: 3 pg/Napf). In den Sandwich-Enzym-Immunoassays der vorliegenden Erfindung werden nämlich zweckmäßigerweise monoklonale Antikörper gegen das β-Amyloid (25-35) als monoklonale Antikörper verwendet, die spezifisch reaktiv gegenüber dem partiellen Peptid auf der C-terminalen Seite des β-Amyloids sind. Diese Antikörper erfordern nicht notwendigerweise eine hohe Affinität zu dem β-Amyloid (1-40). Zum Beispiel wird BS-85a zweckmäßigerweise als ein solcher Antikörper verwendet.
In den Sandwich-Verfahren, bei denen BS-85a mit BAN-50a oder BAN-052a kombiniert wurde oder BA-27a mit BAN-50a oder BAN-052a kombiniert wurde, wurde keine Kreuzreaktivität mit dem β-Amyloid (1-28) beobachtet.
Als monoklonale Antikörper, die spezifisch reaktiv gegenüber dem partiellen Peptid auf der C-terminalen Seite des β-Amyloids sind und die in den Sandwich-Immunoassays der vorliegenden Erfindung verwendet werden, werden weiterhin zweckmäßigerweise Antikörper verwendet, die unter Verwendung des β-Amyloids (35-43) als Immunogen hergestellt wurden. Die Erfinder stellten achtzehn Arten von Hybridomen her, die diese Antikörper produzieren. Von diesen zeigten vier Arten von Antikörpern in kompetitiven Enzym-Immunoassays unter Verwendung des unten beschriebenen Peroxidase-markierten β-Amyloids (35-43) eine hohe Reaktivität gegenüber β-Amyloid-Fraktionen (Ameisensäureextrakte), die nach dem Verfahren von Mori et al. [J. Biol. Chem., 267, 17082-17086 (1988)] aus den Gehirnen der Patienten mit Alzheimer-Krankheit extrahiert wurden, während sie keine Reaktivität gegenüber einem synthetisierten β-Amyloid (1-40) zeigten. Die Verwendung dieser Antikörper in den Sandwich-Verfahren in einer Kombination mit BAN-50a zeigte, dass die in den oben genannten Ameisensäurenextrakten aus den Gehirnen der Patienten mit Alzheimer-Krankheit enthaltenen β-Amyloide mit hoher Empfindlichkeit nachgewiesen wurden und dass das β-Amyloid (1-40) überhaupt nicht nachgewiesen wurde. Die Massenspektrometrie wies darauf hin, dass die in den Ameisensäurenextrakten aus den Gehirnen der Patienten mit Alzheimer-Krankheit enthaltenen β-Amyloide hauptsächlich aus dem β-Amyloid (1-42) bestanden und dass sie weiterhin molekulare Spezies enthielten, denen sukzessive N-terminale Teile fehlten, einschließlich des β-Amyloids (3-42), das Pyroglutaminsäure an der N-terminalen Position aufweist, des β-Amyloids (2-42) und des β-Amyloids (4-42).
Als monoklonale Antikörper, die das partielle Peptid auf der N-terminalen Seite des β-Amyloids erkennen und die in den Sandwich-Immunoassays der vorliegenden Erfindung verwendet werden, werden andererseits zweckmäßigerweise Antikörper verwendet, die unter Verwendung des β-Amyloids (1-16) als Immunogen hergestellt wurden. Die Erfinder stellten acht Arten von Hybridomen her, die diese Antikörper produzieren. Die Reaktivität dieser Antikörper gegenüber β-Amyloid (1-40) wurde durch kompetitive Verfahren unter Verwendung des unten beschriebenen Peroxidase-markierten β-Amyloids (1-16) untersucht. Als Ergebnis zeigten vier Arten von Antikörpern eine gute Reaktivität gegenüber dem β-Amyloid (1-40) (Antigenkonzentration, die B/B₀ = 0,5 ergibt: 25 bis 70 nM, 5 bis 15 ng/Napf). Wenn diese Antikörper auf die Sandwichverfahren angewendet wurden, wurde weiterhin unerwarteterweise ein großer Unterschied in der Empfindlichkeit zwischen diesen Antikörpern beobachtet. Der monoklonale Antikörper BAN-052a ergab nämlich im Vergleich zu drei anderen Arten von Antikörpern (BAN-11a, BAN-20a und BAN-30a) hervorragende hochempfindliche Sandwich-Bestimmungsverfahren. Dann wurden sechzehn Arten von Antikörpern neu hergestellt, um monoklonale Anti-β-Amyloid-(1-16)-Antikörper zu selektieren, die für die Sandwich-Verfahren besser geeignet sind, und nach den kompetitiven Verfahren unter Verwendung von Peroxidase-markiertem β-Amyloid (1-16) untersucht. Als Ergebnis zeigten von diesen Antikörpern zehn Arten eine gute Reaktivität gegenüber β-Amyloid (1-40). Insbesondere ergab BAN-50a unter anderem äußerst hochempfindliche Sandwich-Bestimmungsverfahren. In der vorliegenden Erfindung werden nämlich mehrere Arten von Antikörpern gegenüber dem β-Amyloid (1-16) als Antikörper bereitgestellt, die für die Sandwich-Verfahren geeignet sind und die das partielle Peptid auf der N- terminalen Seite des β-Amyloids erkennen, und insbesondere werden zweckmäßigerweise BAN-50a und BAN-052a verwendet.
Als monoklonale Antikörper, die das partielle Peptid im zentralen Teil des β-Amyloids erkennen und die in den Sandwich-Immunoassays der vorliegenden Erfindung verwendet werden, werden weiterhin zweckmäßigerweise Antikörper verwendet, die unter Verwendung des durch SEQ ID NO: 12 dargestellten β-Amyloids (18-28) als Immunogen hergestellt wurden. Die Erfinder stellten neun Arten von Hybridomen her, die diese Antikörper produzieren. Insbesondere geeignet sind die monoklonalen Antikörper BP-01a, BP-02a, BP-03a und BP-90a, die von den vier Hybridomen BP-01, BP-02, BP-03 und BP-90 produziert werden, und BP-03a und BP-90a können auch das durch SEQ ID NO: 11 dargestellte β-Amyloid (17-28) erkennen. Von diesen monoklonalen Antikörpern ist BP-90a besonders gut geeignet.
Die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung können auch in anderen Assaysystemen als den Sandwichverfahren verwendet werden, zum Beispiel in kompetitiven Verfahren, immunometrischen Verfahren und in der Nephelometrie. Bei den kompetitiven Verfahren werden Antigene in Testlösungen und markierte Antigene kompetitiv mit den Antikörpern umgesetzt, und anschließend erfolgt eine Abtrennung der nicht umgesetzten markierten Antigene (F) von den markierten Antigenen (B), die an die Antikörper gebunden sind (B/F-Trennung). Dann wird die markierte Menge entweder von B oder von F gemessen, um die Menge der Antigene in den Testlösungen zu bestimmen. Zu diesen Reaktionsverfahren gehören Flüssigphasenverfahren, bei denen lösliche Antikörper als Antikörper verwendet werden und Polyethylenglycol und die zweiten Antikörper gegen die oben genannten Antikörper für die B/F-Trennung verwendet werden, und Verfestigungsverfahren, bei denen verfestigte Antikörper als erste Antikörper verwendet werden oder lösliche Antikörper als erste Antikörper verwendet werden und verfestigte Antikörper als zweite Antikörper verwendet werden.
Bei den immunometrischen Verfahren werden Antigene in Testlösungen und verfestigte Antigene kompetitiv mit festen Mengen von markierten Antikörpern umgesetzt, und anschließend erfolgt eine Trennung der festen Phasen von den flüssigen Phasen, oder Antigene in Testlösungen werden mit überschüssigen markierten Antikörpern umgesetzt, und dann werden verfestigte Antikörper hinzugefügt, damit die nicht umgesetzten markierten Antikörper an feste Phasen binden können, und anschließend werden die festen Phasen von den flüssigen Phasen getrennt. Dann wird die markierte Menge beider Phasen gemessen, um die Menge der Antigene in den Testlösungen zu bestimmen.
Bei der Nephelometrie wird die Menge der unlöslichen Niederschläge gemessen, die als Ergebnis einer Antigen-Antikörper-Reaktion in Gelen oder Lösungen entstehen. Selbst wenn die Menge der Antigene in Testlösungen nur gering ist und die Niederschläge nur in kleinen Mengen erhalten werden, wird zweckmäßigerweise Laser-Nephelometrie unter Verwendung von Laserstreuung verwendet.
Wenn diese immunologischen Assays auf die vorliegende Erfindung angewendet werden, müssen keine besonderen Bedingungen und Operationen entwickelt werden. Das gewöhnliche Fachverständnis des Fachmanns kann gewöhnlichen Bedingungen und Operationen bei den jeweiligen Assays hinzugefügt werden, um Assaysysteme für die β-Amyloide aufzubauen. Wegen Einzelheiten dieser allgemeinen technischen Mittel kann auf Übersichtsartikel und Bücher verwiesen werden [zum Beispiel Radioimmunoassays, herausgegeben von H. Irie (Verlag Kodansha, 1974), Radioimmunoassays, zweite Serie, H. Irie H. Irie (Verlag Kodansha, 1979), KOSO MENEKI SOKUTEIHO (Enzyme Immunoassays), herausgegeben von E. Ishikawa et al. (Verlag Igaku Shoin, 1978), KOSO MENEKI SOKUTEIHO (Enzyme Immunoassays) (zweite Auflage, herausgegeben von E. Ishikawa et al. (Verlag Igaku Shoin, 1982), KOSO MENEKI SOKUTEIHO (Enzyme Immunoassays) (dritte Auflage), herausgegeben von E. Ishikawa et al. (Verlag Igaku Shoin, 1987), Methods in ENZYMOLOGY, Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A), Verlag Academic Press, loc. zit., Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B), loc. zit., Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C), loc. zit., Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays), loc. zit., Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods), und loc. zit., Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)]. Wenn die Assaysysteme für die β-Amyloide gemäß den Sandwich-Immunoassays der vorliegenden Erfindung aufgebaut sind, sind sie dementsprechend nicht auf die unten beschriebenen Beispiele beschränkt.
Wie oben beschrieben, können die Antikörper der vorliegenden Erfindung die β-Amyloide oder deren Derivate mit hoher Empfindlichkeit bestimmen, so dass sie als Diagnostikmittel für die Alzheimer-Krankheit geeignet sind.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Graphik, die die Ergebnisse eines Assays für den Antikörpertiter von Mäusen zeigt, die mit dem β-Amyloid (1-40) immunisiert wurden, wobei der Antikörpertiter durch β-Gal-markiertes β-Amyloid (1-40) bestimmt wird;
2 ist eine Graphik, die die Ergebnisse eines Assays für den Antikörpertiter von Mäusen zeigt, die mit dem β-Amyloid (25-35) immunisiert wurden, wobei der Antikörpertiter durch β-Gal-markiertes β-Amyloid (1-40) bestimmt wird;
3 ist eine Graphik, die die Ergebnisse eines Assays für den Antikörpertiter von Mäusen zeigt, die mit dem β-Amyloid (1-16) immunisiert wurden, wobei der Antikörpertiter durch HRP-markiertes β-Amyloid (1-16) bestimmt wird;
4 ist eine Graphik, die die Ergebnisse eines Assays für den Antikörpertiter von Mäusen zeigt, die mit dem β-Amyloid (35-43) immunisiert wurden, wobei der Antikörpertiter durch HRP-markiertes β-Amyloid (35-43) bestimmt wird;
5 zeigt typische Beispiele für die Durchmusterung von Hybridomen nach der Zellfusion. (a) ist ein Fall, bei dem mit β-Amyloid (1-40) immunisierte Mäuse verwendet wurden, (b) ist ein Fall, bei dem mit β-Amyloid (25-35) immunisierte Mäuse verwendet wurden, (c) ist ein Fall, bei dem mit β-Amyloid (1-16) immuni sierte Mäuse verwendet wurden, und (d) ist ein Fall, bei dem mit β-Amyloid (35-43) immunisierte Mäuse verwendet wurden;
6(a) ist eine Graphik, die die Ergebnisse eines Assays für die Reaktivität des monoklonalen Antikörpers BA-27a, der unter Verwendung des β-Amyloids (1-40) als Immunogen hergestellt wurde, gegenüber dem β-Amyloid (1-40)
dem β-Amyloid (1-28) (-Δ-), dem β-Amyloid (1-16) (-O-), dem β-Amyloid (25-35) (-⎕-) und dem β-Amyloid (35-43)
zeigt, wobei diese Reaktivität nach einem kompetitiven EIA-Verfahren unter Verwendung des β-Gal-markierten β-Amyloids (1-40) bestimmt wurde, und 6(b) ist eine Graphik, die in ähnlicher Weise die Ergebnisse eines Assays für die Reaktivität des monoklonalen Antikörpers BS-85a, der unter Verwendung des β-Amyloids (25-35) als Immunogen hergestellt wurde, zeigt, wobei diese Reaktivität nach einem kompetitiven EIA-Verfahren unter Verwendung des β-Gal-markierten β-Amyloids (1-40) bestimmt wurde;
die 7(a) und 7(b) sind Graphiken, die jeweils die Ergebnisse eines Assays für die Reaktivität der monoklonalen Antikörper BAN-052a und BAN-50a, die unter Verwendung des β-Amyloids (1-16) als Immunogen hergestellt wurden, gegenüber dem β-Amyloid (1-40) (-⎕-), dem β-Amyloid (1-28) (-Δ-) und dem β-Amyloid (1-16) (-O-) zeigt, wobei diese Reaktivität nach einem kompetitiven EIA-Verfahren unter Verwendung des HRP-markierten β-Amyloids (1-16) bestimmt wurde;
8 ist eine Graphik, die die Ergebnisse eines Assays für die Reaktivität von BAN-052a
BAN-11a (-O-), BAN-20a (-Δ-), BAN-30a (-⎕-) und BAN-50a
gegenüber dem β-Amyloid (1-40) zeigt, wobei diese Reaktivität mit einem kompetitiven EIA-Verfahren unter Verwendung des HRP-markierten β-Amyloids (1-16) untersucht wurde;
9 ist eine Graphik, die die Standardkurven für das β-Amyloid (1-40) in einem Sandwich-EIA zeigt, wobei BS-85a-HRP als enzymmarkierter Antikörper und BAN-052a
BAN-11a
BAN-20a
bzw. BAN-30a
als Antikörper für feste Phasen verwendet wurden;
10 ist eine Graphik, die die Standardkurven für das β-Amyloid (1-40) in einem Sandwich-EIA zeigt, wobei BA-27a-HRP als enzymmarkierter Antikörper und BAN-052a
BAN-11a
BAN-20a
bzw. BAN-30a
als Antikörper für feste Phasen verwendet wurden;
11 ist eine Graphik, die die Standardkurven für das β-Amyloid (1-40) in einem Sandwich-EIA zeigt, wobei BAN-052a-HRP als enzymmarkierter Antikörper und BA-27a
bzw. BS-85a (-O-) als Antikörper für feste Phasen verwendet wurden;
12 ist eine Graphik, die die Standardkurven für das β-Amyloid (1-40) in einem Sandwich-EIA zeigt, wobei BAN-052a-HRP (-O-) bzw. BA-27a-HRP (-⎕-) als enzymmarkierte Antikörper und BAN-052a als Antikörper für feste Phasen verwendet wurden;
13 ist eine Graphik, die die Standardkurven für das β-Amyloid (1-40)

bzw. das β-Amyloid (1-28) (-O, Δ-) in einem Sandwich-EIA zeigt, wobei BS-85a-HRP als enzymmarkierter Antikörper und BAN-052a
bzw. BAN-50a
als Antikörper für feste Phasen verwendet wurden;
14 ist eine Graphik, die die Standardkurven für das β-Amyloid (1-40)

bzw. das β-Amyloid (1-28) (-O, Δ-) in einem Sandwich-EIA zeigt, wobei BA-27a-HRP als enzymmarkierter Antikörper und BAN-052a
bzw. BAN-50a
als Antikörper für feste Phasen verwendet wurden;
15 zeigt die Standardkurven für das β-Amyloid (1-38) (-O-), für das β-Amyloid (1-39) (-Δ-), für das β-Amyloid (1-40)
für das β-Amyloid (1-42)
bzw. für das β-Amyloid (1-28) (-⎕-) in einem Sandwich-EIA, wobei (a) BS-85a-HRP, (b) BA-27a-HRP bzw. (c) BC-05a-HRP als enzymmarkierte Antikörper und BAN-50a als Antikörper für feste Phasen verwendet wurden;
16 zeigt die Ergebnisse eines Assays für die immunologische Aktivität von β-Amyloid-Fraktionen, die durch Umkehrphasen-HPLC aus dem Liquor von Patienten mit Alzheimer-Krankheit eluiert wurden, wobei die immunologische Aktivität durch ein Sandwich-EIA bestimmt wird, wobei (a) BS-85a-HRP und (b) BA-27a-HRP als enzymmarkierte Antikörper und BAN-50a als Antikörper für feste Phasen verwendet wurden;
17 zeigt die Ergebnisse einer Fraktionierung von β-Amyloid-Fraktionen, die von Patienten mit Alzheimer-Krankheit stammen (Ameisensäureextrakte), durch Umkehrphasen-HPLC (Nachweiswellenlänge: 210 nm) nach einer partiellen Reinigung durch Gelfiltration;
18 zeigt die Massenspektren von (a) Nr. 35, (b) Nr. 41 und (c) Nr. 43 der eluierten Fraktionen der Umkehrphasen-HPLC in 17 von β-Amyloid-Fraktionen, die von den Gehirnen von Patienten mit Alzheimer-Krankheit stammen (Ameisensäureextrakte); und
19 zeigt die Ergebnisse einer Bestimmung der eluierten Fraktionen der Umkehrphasen-HPLC in 17 von β-Amyloid-Fraktionen, die von den Gehirnen von Patienten mit Alzheimer-Krankheit stammen (Ameisensäureextrakte), wobei die Bestimmung mit einem Sandwich-EIA durchgeführt wurde, wobei (a) BS-85a-HRP, (b) BA-27a-HRP und (c) BC-05a-HRP als enzymmarkierte Antikörper und BAN-50a als Antikörper für feste Phasen verwendet wurden.
Beste Methode zur Durchführung der Erfindung
Beispiele
[Beispiel 1] Herstellung von Antigenen
(1) Herstellung des β-Amyloids (1-40)
Das β-Amyloid (1-40) wurde synthetisiert, indem man 0,71 g (0,5 mmol) eines kommerziell erhältlichen Boc-Val-OCH₂-PAM-Harzes (Applied Biosystems) mit einem Peptidsynthesizer (Model 430A, Applied Biosystems) verwendete. Die Boc-Gruppe an dem Harz wurde mit 50% Trifluoressigsäure/Methylenchlorid behandelt, um die Aminogruppe von der Schutzgruppe zu befreien. Dann wurden 2-mmol-Portionen Boc-Gly, Boc-Val, Boc-Met, Boc-Leu, Boc-Ile, Boc-Ala, Boc-Lys(Cl-Z), Boc-Asn, Boc-Asp(OcHex), Boc-Glu(OcHex), Boc-Phe, Boc-Gln, Boc-His(Bom), Boc-Tyr(Br-Z), Boc-Ser(Bzl) und Boc-Arg(Tos) mit HOBt/DCC aktiviert und gemäß der Aminosäuresequenz des β-Amyloids (1-40) miteinander kondensiert, wobei man 2,70 g eines geschützten β-Amyloid-(1-40)-OCH₂-PAM-Harzes erhielt. Das resultierende geschützte β-Amyloid-(1-40)-OCH₂-PAM-Harz (0,56 g) wurde 60 Minuten lang bei 0°C mit 10 ml wasserfreiem Fluorwasserstoff in Gegenwart von p-Cresol behandelt, und anschließend wurde überschüssiger Fluorwasserstoff durch Destillation unter reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde zweimal mit 10 ml Ether gewaschen und dann mit 50%iger wässriger Essigsäure extrahiert. Das unlösliche Material wurde durch Filtration entfernt, und anschließend wurde mit 50%iger wässriger Essigsäure gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen wurden vereinigt, und die kombinierte Lösung wurde unter reduziertem Druck auf 2 bis 3 ml konzentriert. Die konzentrierte Lösung wurde einer Chromatographie auf einer Sephadex-G-25-Säule (2,0 × 85 cm) unterzogen, die mit 50%iger wässriger Essigsäure beladen und mit demselben Lösungsmittel entwickelt wurde. Die Hauptfraktionen wurden aufgefangen und lyophilisiert, wobei man etwa 150 mg eines gelblichweißen Pulvers erhielt. Dieses wurde in 50 ml 20%igem wässrigem Acetonitril (das 0,1% Trifluoressigsäure enthielt) aufgelöst, und die resultierende Lösung wurde einer Chroma tographie auf einer LiChroprep-RP-18-Säule (4,1 × 10 cm) unterzogen, die mit demselben Lösungsmittel gefüllt war, wobei die Säule mit einem linearen Gradienten von 20% bis 70% wässrigem Acetonitril (das 0,1% Trifluoressigsäure enthielt) eluiert wurde. Die Hauptfraktionen wurden aufgefangen und wiederum einer Chromatographie auf einer LiChroprep-RP-18-Säule (2,6 × 6 cm) unterzogen, wobei die Säule mit einem linearen Gradienten von 0% bis 50% wässrigem Acetonitril (das 0,1% Trifluoressigsäure enthielt) eluiert wurde. Die Hauptfraktionen wurden aufgefangen und lyophilisiert, wobei man 10 mg eines weißen Pulvers erhielt.
Analyse der Aminosäuren:

Gly 6.85(6), Ala 3.44(3), Val 5.68(6), Leu 2.00(2), Ile 1.39(2), Met 0.89(1), Phe 3.21(3), Ser 1.89(2), Asp 4.35(4), Glu 4.52(4), Lys 2.05(2), His 2.86(3), Arg 1.10(1), Tyr 0.97(1)
(M + H)⁺ durch Massenspektrometrie: 4328,05
HPLC-Elutionszeit: 22,8 Minuten

Säulenbedingungen:

Säule: Wakosil-5C18 HG (4,6 × 100 mm)
Eluenten: A (0,1% wässrige Trifluoressigsäure) B (Acetonitril, das 0,1% Trifluoressigsäure enthält)
Elution mit einem linearen Gradienten von Eluent A zu Eluent B (während 50 Minuten)
Fließgeschwindigkeit: 1,0 ml/min

(2) Herstellung des [Cys¹⁷]-β-Amyloids (1-16)
Das [Cys¹⁷]-β-Amyloid (1-16) wurde synthetisiert, indem man 0,75 g (0,5 mmol) eines kommerziell erhältlichen Boc-Cys(MeBzl)-OCH₂-PAM-Harzes (Applied Biosystems) mit einem Peptidsynthesizer (Model 430A, Applied Biosystems) verwendete. Die Boc-Gruppe an dem Harz wurde mit 50% Trifluoressigsäure/Methylenchlorid behandelt, um die Aminogruppe von der Schutzgruppe zu befreien. Dann wurden 2-mmol-Portionen Boc-Lys(Cl-Z), Boc-Gln, Boc-His(Bom), Boc-Val, Boc-Glu(OcHex), Boc-Tyr(Br-Z), Boc-Gly, Boc-Ser(Bzl), Boc-Asp(OcHex), Boc-Arg(Tos) und Boc-Phe mit HOBt/DCC aktiviert und gemäß der Aminosäuresequenz des [Cys¹⁷]-β-Amyloids (1-16) miteinander kondensiert, wobei man 1,90 g eines geschützten [Cys¹⁷]-β-Amyloid-(1-16)-(MeBzl)-OCH₂-PAM-Harzes erhielt. Das resultierende geschützte [Cys¹⁷]-β-Amyloid-(1-16)-(MeBzl)-OCH₂-PAM-Harz (0,68 g) wurde 60 Minuten lang bei 0°C mit 10 ml wasserfreiem Fluorwasserstoff in Gegenwart von p-Cresol behandelt, und anschließend wurde überschüssiger Fluorwasserstoff durch Destillation unter reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde zweimal mit 10 ml Ether gewaschen und dann mit 50%iger wässriger Essigsäure extrahiert. Das unlösliche Material wurde durch Filtration entfernt, und anschließend wurde mit 50%iger wässriger Essigsäure gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen wurden vereinigt, und die kombinierte Lösung wurde unter reduziertem Druck auf 1 bis 2 ml konzentriert. Die konzentrierte Lösung wurde einer Chromatographie auf einer Sephadex-G-25-Säule (2,0 × 85 cm) unterzogen, die mit 50%iger wässriger Essigsäure gefüllt und mit demselben Lösungsmittel entwickelt wurde. Die Hauptfraktionen wurden aufgefangen und lyophilisiert, wobei man 136,7 mg eines weißen Pulvers erhielt.
Analyse der Aminosäuren:

Asp 2.17(2), Ser 0.96(1), Glu 3.04(3), Gly 1.00(1), Ala 1.00(1), Cys 0.82(1), Val 0.99(1), Tyr 0.94(1), Phe 1.09(1), Lys 1.05(1), His 2.89(3), Arg 0.97(1),
(M + H)⁺ durch Massenspektrometrie: 2056,83
HPLC-Elutionszeit: 14,8 Minuten

Säulenbedingungen:

(3) Herstellung des β-Amyloids (25-35)
Das β-Amyloid (25-35) wurde synthetisiert, indem man 0,66 g (0,5 mmol) eines kommerziell erhältlichen Boc-Met-OCH₂-PAM-Harzes (Applied Biosystems) mit einem Peptidsynthesizer (Model 430A, Applied Biosystems) verwendete. Die Boc-Gruppe an dem Harz wurde mit 50% Trifluoressigsäure/Methylenchlorid behandelt, um die Aminogruppe von der Schutzgruppe zu befreien. Dann wurden 2-mmol-Portionen Boc-Leu, Boc-Gly, Boc-Ile, Boc-Ala, Boc-Lys(Cl-Z), Boc-Asn und Boc-Ser(Bzl) mit HOBt/DCC aktiviert und gemäß der Aminosäuresequenz des β-Amyloids (25-35) miteinander kondensiert, wobei man 1,14 g eines geschützten β-Amyloid-(25-35)-OCH₂-PAM-Harzes erhielt. Das resultierende geschützte β-Amyloid-(25-35)-OCH₂-PAM-Harz (0,61 g) wurde 60 Minuten lang bei 0°C mit 10 ml wasserfreiem Fluorwasserstoff in Gegenwart von p-Cresol behandelt, und anschließend wurde überschüssiger Fluorwasserstoff durch Destillation unter reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde zweimal mit 10 ml Ether gewaschen und dann mit 50%iger wässriger Essigsäure extrahiert. Das unlösliche Material wurde durch Filtration entfernt, und anschließend wurde mit 50%iger wässriger Essigsäure gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen wurden vereinigt, und die kombinierte Lösung wurde unter reduziertem Druck auf 2 bis 3 ml konzentriert. Die konzentrierte Lösung wurde mit 50 ml 0,1%iger wässriger Trifluoressigsäure verdünnt und dann einer Chromatographie auf einer LiChroprep-RP-18-Säule (2,6 × 10 cm), die mit 0,1%iger wässriger Trifluoressigsäure gefüllt war, unterzogen, wobei die Säule mit einem linearen Gradienten von 0% bis 50% wässrigem Acetonitril (das 0,1% Trifluoressigsäure enthielt) eluiert wurde. Die Hauptfraktionen wurden aufgefangen und lyophilisiert, wobei man 100 mg eines weißen Pulvers erhielt. Dieses Pulver wurde in 0,5 ml N-Essigsäure aufgelöst und einer Chromatographie auf einer mit demselben Lösungsmittel gefüllten Sephadex-LH-20-Säule (1,0 × 96 cm) unterzogen. Die Hauptfraktionen wurden aufgefangen und lyophilisiert, wobei man 91 mg eines weißen Pulvers erhielt.
Analyse der Aminosäuren:

Asp 0.97(1), Ser 0.95(1), Gly 2.94(3), Ala 1.00(1), Met 0.89(1), Ile 1.59(2), Leu 1.00(1), Lys 0.97(1),
(M + H)⁺ durch Massenspektrometrie: 2056,83
HPLC-Elutionszeit: 18,9 Minuten

Säulenbedingungen:

(4) Herstellung des [Cys³⁴]-β-Amyloids (35-43)
Ein Fmoc-Thr(tBu)-Wang-Harz (0,46 g: 0,25 mmol, Watanabe Kagaku) wurde als Ausgangsstoff verwendet. Nach der Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe mit einer 20% Piperidin-DMF-Lösung wurde die Peptidkette von der C-terminalen Seite her nach dem DCC-HOBt-Verfahren nach und nach verlängert, wobei man eine Fmoc-Aminosäurederivat-Kartusche (1,0 mmol, Applied Biosystems) verwendete. So wurden 0,73 g eines geschützten Peptidharzes erhalten, das durch die folgende Formel dargestellt wird: Fmoc-Cys(Trt)-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-Thr(tBu)-Wang-Harz
Dann wurden 0,75 g Phenol, 0,25 ml Butandithiol, 0,5 ml Thioanisol, 0,5 ml entionisiertes Wasser und 10 ml Trifluoressigsäure unter Eiskühlung zu 0,58 g (0,20 mmol) dieses Peptidharzes gegeben, und das Gemisch wurde 1,5 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Harz wurde durch Filtration entfernt, und das Filtrat wurde konzentriert. Ether wurde unter Eiskühlung zu dem Rückstand gegeben, und ein Niederschlag wurde durch Filtration abgetrennt. Nach gründlichem Waschen mit Ether wurde der Niederschlag getrocknet, wobei man ein weißes Pulver erhielt.
Ausbeute: 168 mg (89%)
(M + H)⁺ durch Massenspektrometrie: 949,5 (theoretischer Wert = 949,5)
(5) Herstellung des β-Amyloids (1-38) und des β-Amyloids (1-39)
Das β-Amyloid (1-40) wurde restriktiv mit Carboxypeptidase Y hydrolysiert, wodurch das β-Amyloid (1-38) und das β-Amyloid (1-39) hergestellt wurden. Das heißt, 50 μg des β-Amyloids (1-40) (Bachem) und 0,5 μg Carboxypeptidase Y (Oriental Yeast Co., Ltd.) wurden in 0,5%igem wässrigem Ammoniumacetat gelöst, so dass die Lösung auf 60 μl gebracht wurde, und anschließend erfolgte eine zweistündige Reaktion bei 10°C. Nach der Reaktion wurde das Produkt durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer Vydac-C4-Säule (The Sep/a/ra/tions Group) fraktioniert, und drei Hauptpeaks, die durch UV-Licht (210 nm) nachgewiesen wurden, wurden durch Massenspektrometrie identifiziert.
Säulenbedingungen:

Säule: Vydac C4 (The Sep/a/ra/tions Group, 4,6 × 250 mm)
Eluenten: A (5% Acetonitril, das 0,1% Trifluoressigsäure enthält) B (80%Acetonitril, das 0,1% Trifluoressigsäure enthält)
Elutionsverfahren: Die Konzentration von Eluent B wurde zuerst 5 Minuten lang auf 30% gehalten und dann 60 Minuten lang linear auf 30-50% erhöht.
Fließgeschwindigkeit: 0,5 ml/min

(M + H)⁺ durch Massenspektrometrie:

4132,9: β-Amyloid (1-38) (theoretischer Wert = 4132,6)
4231,6: β-Amyloid (1-39) (theoretischer Wert = 4231,8)
4330,9: β-Amyloid (1-40) (theoretischer Wert = 4330,9)

[Beispiel 2] Herstellung von Immunogenen
(1) Herstellung des Immunogens, das das β-Amyloid (1-40) umfasst
Ein Komplex des im oben beschriebenen Beispiel 1 (1) erhaltenen β-Amyloids (1-40) mit Rinder-Thyroglobulin (BTG) wurde hergestellt und als Immunogen verwendet. Das heißt, 0,6 mg des β-Amyloids (1-40) wurden in 1,1 ml 3 mM Phosphatpuffer (pH 6,5), der 15% DMF enthielt, gelöst, und dann wurden 2,5 mg BTG, die in 0,5 ml Wasser gelöst waren, hinzugefügt. Weiterhin wurde Glutaraldehyd hinzugefügt, so dass man eine Endkonzentration von 0,3% erhielt, und anschließend erfolgte eine dreistündige Reaktion bei Raumtemperatur. Nach der Reaktion wurde das Produkt 2 Tage lang bei 4°C gegen physiologische Kochsalzlösung dialysiert.
(2) Herstellung des Immunogens, das das β-Amyloid (25-35) enthält
Ein Komplex des im oben beschriebenen Beispiel 1 (3) erhaltenen β-Amyloids (25-35) mit BTG wurde hergestellt und als Immunogen verwendet. Das heißt, 0,5 mg des β-Amyloids (25-35) und 2,5 mg BTG wurden in 1 ml Wasser gelöst, das auf pH 4,5 eingestellt war, und weiterhin wurde Glutaraldehyd hinzugefügt, so dass man eine Endkonzentration von 0,4% erhielt, und anschließend erfolgte eine dreistündige Reaktion bei Raumtemperatur. Nach der Reaktion wurde das Produkt 2 Tage lang bei 4°C gegen physiologische Kochsalzlösung dialysiert.
(3) Herstellung des Immunogens, das das β-Amyloid (1-16) enthält
Ein Komplex des im oben beschriebenen Beispiel 1 (2) erhaltenen [Cys¹⁷]-β-Amyloids (1-16) mit BTG wurde hergestellt und als Immunogen verwendet. Das heißt, 20 mg BTG wurden in 1,4 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,9) gelöst, und die resultierende Lösung wurde mit 100 μl einer DMF-Lösung gemischt, die 2,2 mg (8 μmol) N-(γ-Maleinimidobutyryloxy)succinimid (GMBS) enthielt, und anschließend erfolgte eine 40-minütige Reaktion bei Raumtemperatur. Nach der Reaktion wurde das Produkt auf einer Sephadex-G-25-Säule fraktioniert. Dann wurden 15 mg BTG mit eingeführter Maleinimidgruppe mit 3,6 mg des [Cys¹⁷]-β-Amyloids (1-16) gemischt, und anschließend erfolgte eine zweitägige Reaktion bei 4°C. Nach der Reaktion wurde das Produkt 2 Tage lang bei 4°C gegen physiologische Kochsalzlösung dialysiert.
(4) Herstellung des Immunogens, das das β-Amyloid (35-43) enthält
Ein Komplex des in Beispiel 1 (4) erhaltenen [Cys³⁴]-β-Amyloids (35-43) mit Rinderserumalbumin (BSA) wurde hergestellt und als Immunogen verwendet. Das heißt, 21 mg (0,31 μmol) BSA wurden in 1,4 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,8) gelöst, und die resultierende Lösung wurde mit 100 μl einer DMF-Lösung gemischt, die 3,5 mg (12,5 μmol) GMBS enthielt, und anschließend erfolgte eine 35-minütige Reaktion bei Raumtemperatur. Nach der Reaktion wurde das Produkt auf einer Sephadex-G-25-Säule fraktioniert. Dann wurden 4,5 mg BSA mit eingeführter Maleinimidgruppe mit 2,1 mg des [Cys³⁴]-β-Amyloids (35-43) gemischt, und anschließend erfolgte eine Reaktion über Nacht bei 4°C. Nach der Reaktion wurde das Produkt 2 Tage lang bei 4°C gegen physiologische Kochsalzlösung dialysiert.
(5) Herstellung des Immunogens, das das β-Amyloid (18-28) enthält
Ein Komplex des [Cys²⁹]-β-Amyloids (18-28) mit BTG wurde hergestellt und als Immunogen verwendet. Das heißt, 21 mg BTG wurden in 1,5 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,9) gelöst, und die resultierende Lösung wurde mit 100 μl einer DMF-Lösung gemischt, die 2,4 mg (8,4 μmol) GMBS enthielt, und anschließend erfolgte eine 40-minütige Reaktion bei Raumtemperatur. Nach der Reaktion wurde das Produkt auf einer Sephadex-G-25-Säule fraktioniert. Dann wurden etwa 7 mg BTG mit eingeführter Maleinimidgruppe mit 2,0 mg des [Cys²⁹]-β-Amyloids (18-28) (Accord) gemischt, und anschließend erfolgte eine Reaktion über Nacht bei 4°C. Nach der Reaktion wurde das Produkt 3 Tage lang bei 4°C gegen physiologische Kochsalzlösung dialysiert.
[Beispiel 3] Immunisierung
Sechs bis acht Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse wurden subkutan mit etwa 80 μg/Maus jedes der im oben beschriebenen Beispiel 2 erhaltenen Immunogene, dem β-Amyloid-(1-40)-BTG-Komplex, dem β-Amyloid-(25-35)-BTG-Komplex, dem β-Amyloid-(1-16)-BTG-Komplex, dem β-Amyloid-(35-43)-BSA-Komplex und dem β-Amyloid-(18-28)-BTG-Komplex, zusammen mit Freunds vollständigem Adjuvans immunisiert. Danach wurden die Mäuse zusätzlich zwei- bis dreimal in dreiwöchigen Abständen mit derselben Dosis jedes der Immunogene zusammen mit Freunds unvollständigem Adjuvans immunisiert.
[Beispiel 4] Herstellung von enzymmarkierten Antigenen
(1) Herstellung von mit β-D-Galactosidase (β-Gal) markiertem β-Amyloid (1-40)
In 40 μl DMSO wurden 70 μg (16 nmol) β-Amyloid (1-40) gelöst, und 160 nmol (10 μl DMSO-Lösung) Triethylamin sowie 23 nmol (7 μl DMSO-Lösung) N-Succinimidyl-3-(2-pyrimidyldithio)propionat (SPDP) wurden hinzugefügt, und anschließend erfolgte eine 90-minütige Reaktion bei Raumtemperatur. Die Gesamtmenge der Reaktionslösung wurde zu 1,7 mg (3,3 nmol) β-Gal (für Enzym-Immunoassay, Boehringer Mannheim), das in 0,45 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,5) gelöst war, gegeben, und anschließend erfolgte eine eintägige Reaktion bei 4°C. Nach der Reaktion wurde das Produkt auf einer Ultrogel-AcA34-Säule (LKB-Pharmacia) fraktioniert, wobei man β-Gal-markiertes β-Amyloid (1-40) erhielt.
(2) Herstellung von mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) markiertem β-Amyloid (1-16)
Das in dem oben beschriebenen Beispiel 1 (2) erhaltene [Cys¹⁷]-β-Amyloid (1-16) wurde mit HRP (für Enzym-Immunoassay, Boehringer Mannheim) vernetzt, so dass ein markiertes Material für den Enzym-Immunoassay (EIA) hergestellt wurde. Das heißt, 5 mg (125 nmol) HRP wurden in 0,95 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,8) gelöst, und die resultierende Lösung wurde mit 50 μl einer DMF-Lösung gemischt, die 3,6 mg (1,3 μmol) GMBS enthielt, und anschließend erfolgte eine 30-minütige Reaktion bei 4°C. Danach wurde das Reaktionsprodukt auf einer Sephadex-G-25-Säule fraktioniert. Dann wurden 3,3 mg (78 nmol) HRP mit eingeführter Maleinimidgruppe mit 0,56 mg (270 nmol) des [Cys¹⁷]-β-Amyloids (1-16) gemischt, und anschließend erfolgte eine eintägige Reaktion bei 4°C. Nach der Reaktion wurde das Produkt auf einer Ultrogel-AcA34-Säule (LKB-Pharmacia) fraktioniert, wobei man HRP-markiertes β-Amyloid (1-16) erhielt.
(3) Herstellung von HRP-markiertem β-Amyloid (35-43)
Das in dem oben beschriebenen Beispiel 1 (4) erhaltene [Cys³⁴]-β-Amyloid (35-43) wurde mit HRP vernetzt, so dass ein markiertes Material für EIA hergestellt wurde. Das heißt, 12 mg (310 nmol) HRP wurden in 1,4 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,8) gelöst, und die resultierende Lösung wurde mit 100 μl einer DMF-Lösung gemischt, die 1,3 mg (4,5 μmol) GMBS enthielt, und anschließend erfolgte eine 30-minütige Reaktion bei Raumtemperatur. Danach wurde das Reaktionsprodukt auf einer Sephadex-G-25-Säule fraktioniert. Dann wurden 3,2 mg (76 nmol) des so hergestellten HRP mit eingeführter Maleinimidgruppe mit 2,1 mg (7,2 μmol) des in Beispiel 1 (4) erhaltenen [Cys³⁴]-β-Amyloids (35- 43) gemischt, und anschließend erfolgte eine eintägige Reaktion bei 4°C. Nach der Reaktion wurde das Produkt auf einer Ultrogel-AcA34-Säule fraktioniert, wobei man HRP-markiertes β-Amyloid (35-43) erhielt.
(4) Herstellung von HRP-markiertem β-Amyloid (18-28)
Das [Cys²⁹]-β-Amyloid (18-28) wurde mit HRP vernetzt, so dass ein markiertes Material für EIA hergestellt wurde. Das heißt, 16 mg (390 nmol) HRP wurden in 1,4 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,8) gelöst, und die resultierende Lösung wurde mit 100 μl einer DMF-Lösung gemischt, die 1,1 mg (3,9 μmol) GMBS enthielt, und anschließend erfolgte eine 40-minütige Reaktion bei Raumtemperatur. Danach wurde das Reaktionsprodukt auf einer Sephadex-G-25-Säule fraktioniert. Dann wurden 6,0 mg (150 nmol) des so hergestellten HRP mit eingeführter Maleinimidgruppe mit 2,5 mg (1,9 μmol) des [Cys²⁹]-β-Amyloids (18-28) gemischt, und anschließend erfolgte eine zweitägige Reaktion bei 4°C. Nach der Reaktion wurde das Produkt auf einer Ultrogel-AcA34-Säule fraktioniert, wobei man HRP-markiertes β-Amyloid (18-28) erhielt.
[Beispiel 5] Bestimmung des Antikörpertiters
(1) Bestimmung des Antikörpertiters in Antiseren von Mäusen, die mit dem β-Amyloid (1-40) immunisiert wurden
Der Antikörpertiter in den Antiseren von Mäusen, die mit dem β-Amyloid (1-40) immunisiert wurden, wurde nach dem folgenden Verfahren bestimmt. Um eine Mikroplatte mit gebundenem Anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper herzustellen, wurden 100 μl 0,1 M Carbonatpuffer (pH 9,6), der 100 μg/ml eines Anti-Maus-Immunglobulin-Antikörpers (IgG-Fraktion, Kappel) enthielt, in jeden Napf einer 96-Napf-Mikroplatte gegossen und 24 Stunden lang bei 4°C stehen gelassen. Dann wurde die Platte mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) gewaschen, und danach wurden 300 μl PBS, das 25% Block Ace (Snow Brand Milk Products) enthielt, in jeden Napf gegossen, um überschüssige Bindungsstellen der Näpfe zu blockieren, und anschließend wurde wenigstens 24 Stunden lang bei 4°C behandelt. In jeden Napf der oben genannten Mikroplatte mit gebundenem Anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper wurden 50 μl Puffer A [0,02 M Phosphatpuffer (pH 7,0), der 0,1% BSA, 0,1 M NaCl, 1 mM MgCl₂, 0,05% CHAPS (3-[(Cholamidopropyl)dimethylammonio]propansulfonsäure) und 0,1% NaN₃ enthielt] sowie 100 μl des mit Puffer A verdünnten Maus-Anti-β-Amyloid-(25-35)-Antiserums gegeben, und anschließend erfolgte eine 16-stündige Reaktion bei 4°C. Dann, nachdem die Platte mit PBS gewaschen worden war, wurden 100 μl des im oben beschriebenen Beispiel 4 (1) hergestellten β-Gal-markierten β-Amyloids (1-40) (200-fache Verdünnung mit Puffer A) hinzugefügt, und anschließend erfolgte eine eintägige Reaktion bei Raumtemperatur. Dann, nachdem die Platte mit PBS gewaschen worden war, wurden 100 μl einer Lösung von 20 μg/ml 4-Methylumbelliferyl-β-D-galactosid (4-MUG) in Puffer A (mit der Maßgabe, dass kein CHAPS enthalten war) hinzugefügt, und anschließend erfolgte eine dreistündige Reaktion bei 37°C, um die Enzymaktivität an der festen Phase durch 4-MUG zu bestimmen. Nachdem 100 μl 0,2 M Na₂CO₃ hinzugefügt worden waren, um die Reaktion abzubrechen, wurde freigesetztes 4-Methylumbelliferon bei einer Anregungswellenlänge von 355 nm und einer Bestimmungswellenlänge von 460 nm unter Verwendung eines Fluoreszenz-Plattenlesers (Fluoroscan II, Labosystem) bestimmt. Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt. Von den 8 immunisierten Mäusen wiesen 4 Mäuse einen relativ hohen Antikörpertiter auf.
(2) Bestimmung des Antikörpertiters in Antiseren von Mäusen, die mit dem β-Amyloid (25-35) immunisiert wurden
Der Antikörpertiter in den Antiseren von Mäusen, die mit dem β-Amyloid (25-35) immunisiert wurden, wurde in ähnlicher Weise wie oben bestimmt. In jeden Napf der Mikroplatte mit gebundenem Anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper wurden 50 μl Puffer A, 50 μl des mit Puffer A verdünnten Maus-Anti-β-Amyloid-(25-35)-Antiserums und 50 μl des im oben beschriebenen Beispiel 4 (1) hergestellten β-Gal-markierten β-Amyloids (1-40) (100-fache Verdünnung mit Puffer A) gegeben, und anschließend erfolgte eine 16-stündige Reaktion bei 4°C. Dann, nachdem die Platte mit PBS gewaschen worden war, wurde die Enzymaktivität an der festen Phase in ähnlicher Weise unter Verwendung von 4-MUG bestimmt. Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt. Von den 8 immunisierten Mäusen wiesen 5 Mäuse einen relativ hohen Antikörpertiter auf.
(3) Bestimmung des Antikörpertiters in Antiseren von Mäusen, die mit dem β-Amyloid (1-16) immunisiert wurden
Der Antikörpertiter in den Antiseren von Mäusen, die mit dem β-Amyloid (1-16) immunisiert wurden, wurde nach dem folgenden Verfahren bestimmt. In jeden Napf der Mikroplatte mit gebundenem Anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper wurden 50 μl Puffer C [0,02 M Phosphatpuffer (pH 7,0), der 1% BSA, 0,4 M NaCl und 2 mM EDTA enthielt], 50 μl des mit Puffer C verdünnten Maus-Anti-β-Amyloid-(1-16)-Antiserums und 50 μl des im oben beschriebenen Beispiel 4 (2) hergestellten HRP-markierten β-Amyloids (1-16) (200-fache Verdünnung mit Puffer C) gegeben, und anschließend erfolgte eine 16-stündige Reaktion bei 4°C. Dann, nachdem die Platte mit PBS gewaschen worden war, wurde die Enzymaktivität an der festen Phase bestimmt, indem man 100 μl eines TMB-Mikronapf-Peroxidasesubstrat-Systems (Kirkegaard & Perry Lab, Inc., von Funakosi Yakuhin) hinzufügte und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur umsetzte. Nachdem 100 μl 1 M Phosphorsäure hinzugefügt worden waren, um die Reaktion abzubrechen, wurde die Extinktion bei 450 nm mit einem Plattenleser (MTP-32, Corona) gemessen. Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt. Eine Erhöhung des Antikörpertiters gegen das β-Amyloid (1-16) wurde bei allen 7 immunisierten Mäusen beobachtet.
(4) Bestimmung des Antikörpertiters in Antiseren von Mäusen, die mit dem β-Amyloid (35-43) immunisiert wurden
Gemäß dem in dem oben beschriebenen Beispiel 5 (3) beschriebenen Verfahren wurden die Mikroplatte mit gebundenem Anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper, das Maus-Anti-β-Amyloid-(35-43)-Antiserum und das in dem oben beschriebenen Beispiel 4 (3) hergestellte HRP-markierte β-Amyloid (35-43) miteinander umgesetzt, um den Antikörpertiter in den Seren von Mäusen zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt. Von den 9 immunisierten Mäusen wiesen 3 Mäuse einen relativ hohen Antikörpertiter auf.
(5) Bestimmung des Antikörpertiters in Antiseren von Mäusen, die mit dem β-Amyloid (18-28) immunisiert wurden
Gemäß dem in dem oben beschriebenen Beispiel 5 (3) beschriebenen Verfahren wurden die Mikroplatte mit gebundenem Anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper, das Maus-Anti-β-Amyloid-(18-28)-Antiserum und das in dem oben beschriebenen Beispiel 4 (4) hergestellte HRP-markierte β-Amyloid (18-28) miteinander umgesetzt, um den Antikörpertiter in den Seren von Mäusen zu bestimmen. Von den 7 immunisierten Mäusen wiesen 4 Mäuse einen relativ hohen Antikörpertiter auf.
[Beispiel 6] Herstellung von monoklonalem Anti-β-Amyloid-Antikörper
Jede der Mäuse, die einen relativ hohen Antikörpertiter zeigten, wurde intravenös mit 0,25 bis 0,3 ml physiologischer Kochsalzlösung, in der 200 bis 300 μg des Immunogens enthalten waren, geimpft, um die endgültige Immunisierung durchzuführen. Drei bis vier Tage nach der endgültigen Immunisierung wurden den Mäusen die Milzen entnommen, durch ein Edelstahlsieb gedrückt, filtriert und in Eagles minimalessentiellem Medium (MEM) suspendiert, so dass man eine Milzzellensuspension erhielt. Als Zellen, die für die Zellfusion verwendet wurden, wurden die von BALB/c-Mäusen stammenden Myelomzellen P3-X63.Ag8.U1 (P3U1) verwendet [Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1 (1978)]. Die Zellfusion wurde nach dem ursprünglichen Verfahren durchgeführt [Nature, 256, 495 (1975)]. Das heißt, die Milzzellen und P3U1 wurden dreimal mit serumfreiem MEM gewaschen und dann gemischt, so dass man ein Verhältnis der Anzahl der Milzzellen zur Anzahl der P3U1 von 5:1 erhielt. Das Gemisch wurde 15 Minuten lang bei 800 U/min zentrifugiert, um die Zellen zu sedimentieren. Nachdem der Überstand entfernt worden war, wurde das Sediment leicht aufgelockert, und 0,3 ml 45%iges Polyethylenglycol (PEG) 6000 (Kochlight) wurden hinzugefügt. Dann ließ man das Gemisch 7 Minuten lang in einem Wasserbad von 37°C stehen, um die Fusion durchzuführen. Nach der Fusion wurde MEM mit einer Geschwindigkeit von 2 ml pro Minute zu den Zellen gegeben. Nachdem die Gesamtmenge des hinzugefügten MEM 15 ml erreicht hatte, wurde der Übertand durch 15 Minuten Zentrifugation mit 600 U/min entfernt. Das resultierende Zellsediment wurde in GIT-Medium (Wako Pure Chemical Industries), das 10% fetales Kälberserum (GIT-10% FCS) enthielt, suspendiert, was 2 × 10⁵ P3U1-Zellen pro ml ergab. Die Zeltsuspension wurde in einer Menge von 1 ml pro Napf in 120 Näpfen von 24-Napf-Multiplatten (Linbro) ausgestrichen. Nach dem Ausstreichen wurden die Zellen bei 37°C in einem Inkubator mit 5% Kohlendioxid inkubiert. Nach 24 Stunden wurde GIT-10%-FCS-Medium, das HAT (1 × 10^-4 M Hypoxanthin, 4 × 10^-7 M Aminopterin und 1,6 × 10^-3 M Thymidin) enthielt (HAT-Medium), in einer Menge von 1 ml pro Napf hinzugefügt, um eine HAT-Selektionskultur einzuleiten. Die HAT-Selektionskultur wurde fortgesetzt, indem man 3, 6 und 9 Tage nach der Einleitung der Kultur 1 ml der alten Flüssigkeit verwarf und dann 1 ml HAT-Medium hinzufügte. Ein Wachstum der Hybridomzellen wurde 9 bis 14 Tage nach der Zellfusion beobachtet. Als die Kulturlösung gelb geworden war (etwa 1 × 10⁶ Zellen/ml), wurde der Überstand abgetrennt, und der Antikörpertiter wurde nach dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren bestimmt.

Als typisches Beispiel für die Durchmusterung der von der Maus stammenden Hybridome nach Immunisierung mit dem β-Amyloid (1-40) sind die unter Verwendung der Maus Nr. 1 (siehe 1) erhaltenen Ergebnisse in 5(a) gezeigt. Mit diesem wurden insgesamt zwei Arten von Hybridomen ausgewählt (Tabelle 1). Tabelle 1 Reaktionsspezifität der monoklonalen Anti-β-Amyloid-(23-35)- und -(1-40)-Antikörper

Hybridom Stamm Nr.	Immunogen	Reaktivität¹)
		βA(1-40)	βA(1-28)	βA(25-35)	Anmerkung
1	βA(1-40)	±		-	BA-27
2	βA(1-40)	±	-	-
3	βA(25-35)	±		+
4	βA(25-35)	±		+
5	βA(25-35)	±		+	BS-85
6	βA(25-35)	±		+
7	βA(25-35)	±		+

1) Wenn 100 nM des Antigens [βA(1-40), βA(1-28) oder βA(25-35)] vorlagen, bedeuten: +: (B/B₀) < 0,50 ±: 0,50 ≤ (B/B₀) < 0,90 -: 0,90 ≤ (B/B₀) wobei B: die Menge an β-Gal-markiertem βA(1-40), das an den Antikörper gebunden war, wenn das Antigen vorlag; B₀: die Menge an β-Gal-markiertem βA(1-40), das an den Antikörper gebunden war, wenn das Antigen nicht vorlag.

Als typisches Beispiel für die Durchmusterung der von der Maus stammenden Hybridome nach Immunisierung mit dem β-Amyloid (25-35) sind die unter Verwendung der Maus Nr. 8 (siehe 2) erhaltenen Ergebnisse in 5(b) gezeigt. Mit diesem wurden insgesamt fünf Arten von Hybridomen ausgewählt (Tabelle 1).
Als typisches Beispiel für die Durchmusterung von Hybridomen, die von Mäusen stammen, die mit dem β-Amyloid (1-16) immunisiert worden waren, sind die unter Verwendung der Maus Nr. 5 (siehe 3) erhaltenen Ergebnisse in 5(c) gezeigt. Mit diesen wurden zuerst 8 Hybridomstämme ausgewählt, und danach wurden weiterhin 16 Hybridomstämme ausgewählt (Tabelle 2).

Als typisches Beispiel für die Durchmusterung der von der Maus stammenden Hybridome nach Immunisierung mit dem β-Amyloid (35-43) sind die unter Verwendung der Maus Nr. 4 (siehe 4) erhaltenen Ergebnisse in 5(d) gezeigt. Mit diesen wurden insgesamt achtzehn Arten von Hybridomen ausgewählt (Tabelle 3). Weiterhin wurden die von der Maus nach Immunisierung mit dem β-Amyloid (18-28) stammenden Hybridome durchmustert, wobei insgesamt neun Arten von Hybridomen ausgewählt wurden (Tabelle 4). Tabelle 2 Reaktivität von monoklonalem Anti-β-Amyloid-(1-16)-Antikörper

Hybridom Nr.	Reaktivität¹⁾			Anmerkung
	βA(1-40)	βA(1-28)	βA(1-16)	Anmerkung
1	+	+	+	BAN-052
2	+	+	+	BAN-11
3	+	+	+	BAN-30
4	±		+
5	±	±	+
6	+	+	+	BAN-20
7			+
8			+
9	+		+	BAN-40
10	+	+	+
11	+	+	+
12	+	+	+	BAN-50
13	+	±	+
15	+	+	+
16	±	±	+
17	+	+	+
18	+	+	+
19	+	+	+
20	±		+
21			+
22	+	+	+
23	±	±	+
24	±		+

1) Wenn 100 nM des Antigens [βA(1-40), [βA(1-28) oder [βA(1-16)] vorlagen, bedeuten: +: (B/B₀) < 0,50 ±: 0,50 ≤ (B/B₀) < 0,80 -: 0,80 ≤ (B/B₀) wobei B: die Menge an HRP-markiertem βA(1-16), das an den Antikörper gebunden war, wenn das Antigen vorlag; B₀: die Menge an HRP-markiertem βA(1-16), das an den Antikörper gebunden war, wenn das Antigen nicht vorlag.

Hybridom Stamm Nr.	Reaktivität¹⁾		Klasse/Unterklasse	Anmerkung
Hybridom Stamm Nr.	βA(35-43)	Hirnfraktion	Klasse/Unterklasse	Anmerkung
1	+	-
2	±	-
3	+	-	IgA, κ	BC-25
4	+	-	IgG3, κ	BC-35
5	+	+	IgG 1, κ	BC-05
6	+	-
7	+	+	IgG1, κ	BC-15
8	+	+	IgG3, κ	BC-65
9	+	-
10	+	+
11	+	+	IgG1, κ	BC-75
12	+	+
13	+	-	IgM, κ	BC-95
14	+	±
15	+	+	IgGl, κ	BC-55
16	+	±
17	+	-
18	+	-

1) Wenn 500 ng/ml βA(35-43) oder 100 μg/ml des Hirnextrakts von Patienten mit Alzheimer-Krankheit vorlagen, bedeuten: +: (B/B₀) < 0,6 ±: 0,6 ≤ (B/B₀) < 0,8 -: 0,8 ≤ (B/B₀) wobei B: die Menge an HRP-markiertem βA(35-43), das an den Antikörper gebunden war, wenn das Antigen vorlag; B₀: die Menge an HRP-markiertem βA(35-43), das an den Antikörper gebunden war, wenn das Antigen nicht vorlag.

Hybridom Stamm Nr.	Reaktivität¹⁾			Anmerkung
Hybridom Stamm Nr.	βA(17-28)	βA(18-28)	βA(1-28)	Anmerkung
1	+	+	-
2	-	+	-	BP-01
3	-	+	-	BP-02
4	+	+	-	BP-03
5	±	+	-
6	+	+	-	BP-90
7	-	+	-
8	-	+	-
9	±	+	-

1) Wenn 500 ng/ml βA(17-28) oder βA(18-28) oder 1 μg βA(1-28) vorlagen, bedeuten: +: (B/B₀) < 0,6 ±: 0,6 ≤ (B/B₀) < 0,8 -: 0,8 ≤ (B/B₀) wobei B: die Menge an HRP-markiertem βA(18-28), das an den Antikörper gebunden war, wenn das Antigen vorlag; B₀: die Menge an HRP-markiertem βA(18-28), das an den Antikörper gebunden war, wenn das Antigen nicht vorlag.

Dann wurden diese Hybridome nach dem Grenzverdünnungsverfahren kloniert. Beim Klonieren wurden die BALB/c-Maus-Thymocyten als Feederzellen in einer Menge von 5 × 10⁵ Zellen pro Napf hinzugefügt. Nach der Klonierung wurde jedes der Hybridome intraperitoneal in einer Menge von 1 bis 3 × 10⁶ Zellen/Maus an Mäuse (BALB/c) verabreicht, von denen jede zuvor intraperitoneal 0,5 ml Mineralöl erhalten hatte. Nach 6 bis 20 Tagen wurden die antikörperhaltigen Ascitesflüssigkeiten entnommen.
Jeder der monoklonalen Antikörper wurde mit einer Protein-A-Säule aus der resultierenden Ascitesflüssigkeit gereinigt. Das heißt, 6 bis 20 ml der Ascitesflüssigkeit wurden mit derselben Menge Bindungspuffer (1,5 M Glycin, das 3,5 M NaCl und 0,05% NaN₃ enthielt, pH 9,0) verdünnt und dann einer Chromatographie auf einer Säule mit rekombinantem Protein A/Agarose (Repligen), die zuvor mit dem Bindungspuffer äquilibriert worden war, unterzogen, wobei der spezifische Antikörper mit Elutionspuffer (0,1 M Citratpuffer, der 0,05% NaN₃ enthielt, pH 3,0) eluiert wurde. Das Eluat wurde 2 Tage lang bei 4°C gegen PBS dialysiert, und anschließend erfolgte eine Sterilfiltration mit einem 0,22-μm-Filter (Millipore). Die gereinigte Lösung wurde bei 4°C oder -80°C aufbewahrt. Die Klasse und Unterklasse der monoklonalen Antikörper wurde durch einen ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) bestimmt, wobei eine feste Phase mit gebundenem gereinigtem monoklonalem Antikörper verwendet wurde. Das heißt, 100 μl 0,1 M Carbonatpuffer, der 2 μg/ml des Antikörpers enthielt (pH 9,6), wurden in jeden Napf einer 96-Napf-Mikroplatte gegossen, und anschließend wurde die Platte 24 Stunden lang bei 4°C stehen gelassen. Die überschüssigen Bindungsstellen der Näpfe wurden nach dem in dem oben beschriebenen Beispiel 5 beschriebenen Verfahren mit Block Ace blockiert, und anschließend wurden die Klasse und Unterklasse des verfestigten Antikörpers mit ELISA untersucht, wobei man einen Isotyp-Bestimmungskit (Mouse-Typer^TM Sub-Isotyping Kit, Bio RAD) verwendete.
[Beispiel 7] Kompetitive Enzym-Immunoassayverfahren
(1) Kompetitives EIA-Verfahren (1)
Die Reaktionsspezifität des monoklonalen Antikörpers, der unter Verwendung des β-Amyloids (1-40) bzw. des β-Amyloids (25-35) als Immunogen hergestellt worden war, wurde nach dem folgenden Verfahren untersucht. Zuerst wurde der Antikörpertiter jeder Lösung des monoklonalen Antikörpers nach dem Verfahren untersucht, das in Beispiel 5 (1) oder Beispiel 5 (2) beschrieben ist, und die Antikörperkonzentration (etwa 3 bis 15 ng/ml), bei der die Menge des gebundenen markierten Materials etwa 40% der gesättigten gebundenen Menge erreichte, wurde als die bei dem kompetitiven EIA-Verfahren verwendete Antikörperkonzentration bestimmt. Dann wurden in jeden Napf der im oben erwähnten Beispiel 5 beschriebenen Mikroplatte mit gebundenem Anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper 50 μl einer Antikörperlösung, die mit Puffer A auf die bestimmte Konzentration verdünnt wurde, 50 μl einer Puffer-A-Lösung der β-Amyloide oder ihrer partiellen Peptide, nämlich β-Amyloid (1-40) (im folgenden wurde das von Bachem bezogene β-Amyloid (1-40) für den Immunoassay verwendet), β-Amyloid (1-28) (von Peninsula bezogen) und β-Amyloid (25-35), sowie 50 μl des in dem oben erwähnten Beispiel 4 (1) beschriebenen β-Gal-markierten β-Amyloids (1-40) (100fache Verdünnung mit Puffer A) gegeben, und anschließend erfolgte eine 16-stündige Reaktion bei 4°C. Nach der Reaktion wurde die Platte mit PBS gewaschen, und dann wurde die Enzymaktivität an der festen Phase nach dem Verfahren bestimmt, das in dem oben erwähnten Beispiel 5 (2) beschrieben ist. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Alle Antikörper reagierten mit dem β-Gal-markierten β-Amyloid (1-40) und zeigten auch Reaktivität gegenüber dem β-Amyloid (1-40) (Tabelle 1).
Als typische Beispiele sind die Ergebnisse des kompetitiven EIA-Verfahrens, bei dem BA-27a (IgG2a, κ) bzw. BS-85a (IgG1, κ) als Antikörper gegen das β-Amyloid (1-40) bzw. das β-Amyloid (25-35) verwendet wurden, in 6 gezeigt. Die Standardkurve von BA-27a gegen das β-Amyloid (1-40) zeigte, dass die Konzentration an β-Amyloid (1-40), die ein (B/B₀) = 0,5 ergab, 200 nM, 40 ng/Napf, betrug. Weiterhin zeigte dieser Antikörper keine Kreuzreaktivität gegenüber β-Amyloid (1-16), β-Amyloid (1-28) und β-Amyloid (25-35). Dies bewies, dass der Antikörper mit dem partiellen Peptid auf der C-terminalen Seite des β-Amyloids reagiert, aber die partielle Struktur des β-Amyloids (25-35) nicht erkannte (6(a)). Andererseits betrug die Reaktivität von BS-85a gegenüber der partiellen Struktur des β-Amyloids (25-35) (die Antigenkonzentration, die (B/B₀) = 0,5 ergab, betrug 20 nM, 1 ng/Napf) das 40-fache der Reaktivität gegenüber dem β-Amyloid (1-40) (die Antigenkonzentration, die (B/B₀) = 0,5 ergab, betrug 800 nM, 160 ng/Napf) (6(b)).
(2) Kompetitives EIA-Verfahren (2)
Die Reaktionsspezifität des monoklonalen Anti-β-Amyloid-(1-16)-Antikörpers wurde in ähnlicher Weise untersucht, wie es oben beschrieben ist. Zuerst wurde der Antikörpertiter jeder Lösung des monoklonalen Antikörpers nach dem Verfahren untersucht, das in Beispiel 5 (3) beschrieben ist, und die Antikörperkonzentration (etwa 3 bis 50 ng/ml), bei der die Menge des gebundenen markierten Materials etwa 40% der gesättigten gebundenen Menge erreichte, wurde als die bei dem kompetitiven EIA-Verfahren verwendete Antikörperkonzentration bestimmt. Dann wurden in jeden Napf der Mikroplatte mit gebundenem Anti-Maus-_Immunglobulin-Antikörper 50 μl einer Antikörperlösung, die mit Puffer C auf die bestimmte Konzentration verdünnt wurde, 50 μl einer Puffer-C-Lösung der β-Amyloide oder ihrer partiellen Peptide, nämlich β-Amyloid (1-40), β-Amyloid (1-28) und [Cys¹⁷]-β-Amyloid (1-16), sowie 50 μl des in dem oben erwähnten Beispiel 4 (2) beschriebenen HRP-markierten β-Amyloids (1-16) (2000fache Verdünnung mit Puffer C) gegeben, und anschließend erfolgte eine 16-stündige Reaktion bei 4°C. Nach der Reaktion wurde die Platte mit PBS gewaschen, und dann wurde die Enzymaktivität an der festen Phase nach dem Verfahren bestimmt, das in dem oben erwähnten Beispiel 5 (3) beschrieben ist. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Von den acht Arten monoklonaler Antikörper, die zuerst ausgewählt wurden, reagierten vier auch relativ stark mit dem β-Amyloid (1-40), und von den sechzehn Arten monoklonaler Antikörper, die danach neu ausgewählt wurden, reagierten zehn auch relativ stark mit dem β-Amyloid (1-40) (Tabelle 2). Als typische Beispiele sind die Ergebnisse des kompetitiven EIA-Verfahrens mit den monoklonalen Antikörpern BAN-052a (IgG1, κ) und BAN-50a (IgG1, κ), die von diesen Antikörpern die höchste Reaktivität gegenüber dem β-Amyloid (1-40) zeigten, in 7 gezeigt. 7 zeigt, dass diese Antikörper einen ähnlichen Reaktivitätsgrad gegenüber β-Amyloid (1-40), β-Amyloid (1-28) und β-Amyloid (1-16) haben. Weiterhin sind in 8 Standardkurven von β-Amyloid (1-40) bei dem kompetitiven EIA-Verfahren gezeigt, wobei außer diesen beiden Arten von Antikörpern noch die drei Arten von monoklonalen Antikörpern BAN-11a (IgG1, κ), BAN-20a (IgG1, κ) und BAN-30a (IgG1, κ), die zuerst ausgewählt worden waren und eine hohe Reaktivität gegenüber β-Amyloid (1-40) zeigten, verwendet wurden. Die Konzentration an β-Amyloid (1-40), bei der diese Antikörper ein (B/B₀) = 0,5 ergaben, lag innerhalb des Bereichs von 25 bis 70 nM (5-15 ng/Napf), und unter den Antikörpern wurde nur ein Unterschied von weniger als einem Faktor 3 beobachtet. Von diesen war das kompetitive EIA-Verfahren unter Verwendung von BAN-50a am empfindlichsten und konnte etwa 0,6 ng/Napf [(B/B₀) = 0,9] des β-Amyloids (1-40) nachweisen.
(3) Kompetitives EIA-Verfahren (3)
Aus 10 g des Gehirns eines Patienten mit Alzheimer-Krankheit wurden 0,1 g β-Amyloid-Fraktionen (Ameisensäureextrakte) nach dem Verfahren von Mori et al. (siehe den Text) erhalten. Dann ließ man nach dem Verfahren, das in dem oben erwähnten Beispiel 7 (2) beschrieben ist, die Mikroplatte mit gebundenem Anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper, die Antikörperlösung, die β-Amyloide oder ihre partiellen Peptide, nämlich β-Amyloid (1-40) und [Cys³⁴]-β-Amyloid (35-43) oder die oben genannte, aus dem Gehirn eines Patienten mit Alzheimer-Krankheit stammende β-Amyloid-Fraktion, sowie das in dem oben erwähnten Beispiel 4 (3) beschriebene HRP-markierte β-Amyloid (35-43) (50-fache Verdünnung mit Puffer C) miteinander reagieren. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Von den zuerst ausgewählten monoklonalen Antikörpern reagierten vier Arten von Antikörpern relativ stark mit der aus dem Gehirn eines Patienten mit Alzheimer-Krankheit stammenden β-Amyloid-Fraktion. Von diesen wurde der monoklonale Antikörper BC-05a (IgG1, κ), der einen hohen Antikörpertiter zeigte, ausgewählt und in dem folgenden Experiment verwendet.
(4) Kompetitives EIA-Verfahren (4)
Die Reaktionsspezifität des monoklonalen Anti-β-Amyloid-(18-28)-Antikörpers wurde nach dem Verfahren untersucht, das in dem oben erwähnten Beispiel 7 (2) beschrieben ist. Das heißt, nach der Bestimmung der Konzentration jedes Antikörpers wurde eine Reaktion durchgeführt, bei der β-Amyloid (1-40), [Cys²⁹]-β-Amyloid (17-28) (Accord), [Cys²⁹]-β-Amyloid (18-28) und β-Amyloid (1-28) als β-Amyloide oder ihre partiellen Peptide verwendet wurden und das in dem oben erwähnten Beispiel 4 (4) beschriebene HRP-markierte β-Amyloid (18-28) (1000-fache Verdünnung mit Puffer C) als markiertes Antigen verwendet wurde, und anschließend erfolgte ein Assay der Enzymaktivität. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Alle neun ausgewählten Arten von Antikörpern hatten eine hohe Reaktivität gegenüber dem β-Amyloid (18-28), welches ein Antigen ist. Weiterhin reagierten fünf Arten von Antikörpern unter diesen auch relativ stark mit dem β-Amyloid (17-28). Keiner der Antikörper reagierte mit dem β-Amyloid (1-28) oder dem β-Amyloid (1-40).
Von diesen wurde in den anschließenden Experimenten hauptsächlich der monoklonale Antikörper BP-90a (IgG1, κ) verwendet, der eine hohe Reaktivität sowohl gegenüber dem β-Amyloid (17-28) als auch gegenüber dem β-Amyloid (18-28) aufwies.
[Beispiel 8] Herstellung von monoklonalem HRP-markiertem Anti-β-Amyloid-Antikörper
(1) BS-85a-HRP
Zu 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,8), der 4,2 mg (28 nmol) einer gereinigten BS-85a-Fraktion enthielt, wurden 50 μl DMF gegeben, das 420 nmol GMBS enthielt, und anschließend erfolgte eine 40-minütige Reaktion bei Raumtemperatur. Die Reaktionslösung wurde auf einer Sephadex-G-25-Säule (Eluent: 0,1 M Phosphatpuffer, pH 6,7) aufgetrennt, wobei man 3 mg einer Fraktion eines Antikörpers mit eingeführten Maleinimidgruppen erhielt. Dann wurden 50 μl DMF, das 4,5 μmol SPDP enthielt, zu 1,4 ml 0,02 M Phosphatpuffer (der 0,15 M NaCl enthielt, pH 6,8), der 12 mg (300 nmol) HRP enthielt, gegeben, und anschließend erfolgte eine 40-minütige Reaktion bei Raumtemperatur. Dann wurden 0,5 ml 0,2 M Acetatpuffer (pH 4,5), der 68 μmol Dithiothreit enthielt, hinzugefügt, und es wurde 20 Minuten lang bei Raumtemperatur reagieren gelassen, und anschließend erfolgte eine Trennung auf einer Sephadex-G-25-Säule (Eluent: 0,1 M Phosphatpuffer, der 2 mM EDTA enthielt, pH 6), wobei man 8 mg HRP mit eingeführten SH-Gruppen erhielt. Anschließend wurden 8 mg HRP mit eingeführten SH-Gruppen mit 3 mg der Fraktion des Antikörpers mit den eingeführten Maleinimidgruppen gemischt, und das Gemisch wurde mit einem Collodion-Beutel (Sartorius) auf etwa 0,3 ml konzentriert und anschließend 16 Stunden lang bei 4°C stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde einer Chromatographie auf einer Ultrogel-AcA34-Säule unterzogen, wobei 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,5) als Eluent verwendet wurde, und dadurch wurde eine BS-85a-HRP-Komplex-Fraktion gereinigt.
(2) BA-27a-HRP
Unter Verwendung von 4,7 mg einer gereinigten BA-27a-Fraktion und 14 mg HRP wurde in ähnlicher Weise eine BA-27a-HRP-Komplex-Fraktion hergestellt.
(3) BAN-052a-HRP
Unter Verwendung von 5 mg einer gereinigten BAN-052a-Fraktion und 14 mg HRP wurde in ähnlicher Weise eine BAN-052a-HRP-Komplex-Fraktion hergestellt.
(4) BC-05a-HRP
Unter Verwendung von 5 mg einer gereinigten BC-05a-Fraktion und 14 mg HRP wurde in ähnlicher Weise eine BC-05a-HRP-Komplex-Fraktion hergestellt.
[Beispiel 9] Sandwich-EIA-Verfahren (1)
(1) Sandwich-EIA-Verfahren unter Verwendung von BS-85a-HRP
In jeden Napf einer 96-Napf-Mikrotiterplatte wurden 100 μl 0,1 M Carbonatpuffer (pH 9,6) gegeben, der in dem oben erwähnten Beispiel 6 beschriebenen gereinigten monoklonalen Antikörper BAN-052a, BAN-11a, BAN-20a, BAN-30a, BS-85a oder BA-27a enthielt, und anschließend wurde die Platte 24 Stunden lang bei 4°C stehen gelassen. Dann wurden 300 μl Block Ace, das 4-fach mit PBS verdünnt war, hinzugefügt, um überschüssige Bindungsstellen der Näpfe zu inaktivieren.
Zu der Platte, die so hergestellt wurde, wie es oben beschrieben ist, wurden 100 μl einer Standardlösung von β-Amyloid (1-40) gegeben, die mit Puffer E (0,02 M Phosphatpuffer, der 10% Block Ace, 0,2% BSA, 0,4 M NaCl, 0,05% CHAPS und 0,05% NaN₃ enthielt) verdünnt war, und anschließend erfolgte eine 24-stündige Reaktion bei 4°C. Nach dem Waschen mit PBS wurden 100 μl des in Beispiel 8 (1) hergestellten BS-85a-HRP (1500-fache Verdünnung mit Puffer C) hinzugefügt, und anschließend erfolgte eine 24-stündige Reaktion bei 4°C. Nach dem Waschen mit PBS wurde die Enzymaktivität auf der festen Phase unter Verwendung von TMB nach dem Verfahren bestimmt, das in dem oben erwähnten Beispiel 5 (3) beschrieben ist (Enzymreaktion: 20 Minuten). Die Ergebnisse sind in 9 gezeigt. Wie in Beispiel 7 beschrieben ist, ist die Reaktivität von BS-85a gegenüber dem β-Amyloid (1-40) bei dem kompetitiven EIA-Verfahren nicht so hoch. Wenn es jedoch als markierter Antikörper in dem Sandwich-EIA-Verfahren verwendet wurde, bei dem sich der unter Verwendung des β-Amyloids (1-16) als Antigen produzierte monoklonale Antikörper in der festen Phase befand, wie es oben beschrieben ist, wies es das β-Amyloid (1-40) mit einer äußerst hohen Empfindlichkeit nach. Insbesondere die Verwendung der festen Phase mit BAN-052a führte zu einer Empfindlichkeit, die 10- bis 30-mal höher war als die der anderen drei Arten von festen Phasen mit Antikörpern, und es war möglich, 3 pg/Napf des β-Amyloids (1-40) nachzuweisen.
(2) Sandwich-EIA-Verfahren unter Verwendung von BA-27a-HRP
In ähnlicher Weise wurden 100 μl der Standardlösung des β-Amyloids (1-40) zu der Mikroplatte gegeben, auf der BAN-052a, BAN-11a, BAN-20a, BAN-30a, BS-85a oder BA-27a fixiert waren, und anschließend erfolgte eine 24-stündige Reaktion bei 4°C. Nach dem Waschen mit PBS wurden 100 μl des in dem oben beschriebenen Beispiel 8 (2) hergestellten BA-27a-HRP (2500-fache Verdünnung mit Puffer C) hinzugefügt, und anschließend erfolgte eine 24-stündige Reaktion bei 4°C. Nach dem Waschen mit PBS wurde die Enzymaktivität auf der festen Phase unter Verwendung von TMB bestimmt (Enzymreaktion: 20 Minuten). Die Ergebnisse sind in 10 gezeigt. Ähnlich wie BS-85a zeigte auch BA-27a bei dem kompetitiven EIA-Verfahren keine hohe Reaktivität gegenüber dem β-Amyloid (1-40). Wenn es jedoch als markierter Antikörper in dem Sandwich-EIA-Verfahren verwendet wurde, wie es oben beschrieben ist, wies es das β-Amyloid (1-40) mit einer höheren Empfindlichkeit nach als BS-85a. Insbesondere die Verwendung der festen Phase mit BAN-052a führte zu einer Empfindlichkeit, die etwa 30-mal höher war als die der anderen drei Arten von festen Phasen mit Antikörpern, und es war möglich, 0,6 pg/Napf des β-Amyloids (1-40) nachzuweisen.
(3) Sandwich-EIA-Verfahren unter Verwendung von BAN-052a-HRP
Zu der Mikroplatte, an der BS-85a oder BA-27a fixiert war, wurden 100 μl der Standardlösung des β-Amyloids (1-40) gegeben, und anschließend erfolgte eine 24-stündige Reaktion bei 4°C. Nach dem Waschen mit PBS wurden 100 μl des in dem oben beschriebenen Beispiel 8 (3) hergestellten BAN-052a-HRP (2500-fache Verdünnung mit Puffer C) hinzugefügt, und anschließend erfolgte eine 24-stündige Reaktion bei 4°C. Nach dem Waschen mit PBS wurde die Enzymaktivität auf der festen Phase unter Verwendung von TMB bestimmt (Enzymreaktion: 20 Minuten). Die Ergebnisse sind in 11 gezeigt. Also auch in dem System, das umgekehrt aufgebaut ist wie das von Beispiel 8 (2), nämlich in dem Sandwich-EIA-Verfahren, bei dem der C-terminale Antikörper, wie BS-85a oder BA-27a als feste Phase verwendet wurde und der N-terminale Antikörper, BAN- 052a, als markiertes Material verwendet wurde, war es möglich, 80 pg/Napf bzw. 10 pg/Napf des β-Amyloids (1-40) nachzuweisen.
Wenn weiterhin auch BAN-052a-HRP (1000-fache Verdünnung mit Puffer C) als markiertes Material in dem Sandwich-EIA-Verfahren unter Verwendung von BAN-052a als feste Phase verwendet wurde, fiel die Nachweisempfindlichkeit auf 1/100 im Vergleich zu dem Fall, dass BA-27a-HRP (1500-fache Verdünnung mit Puffer C) verwendet wurde. Dies lässt vermuten, dass ein Multimer des β-Amyloids (1-40) unter den in der vorliegenden Erfindung verwendeten experimentellen Bedingungen kaum existiert (12).
[Beispiel 10] Sandwich-EIA-Verfahren (2)
Aufgrund der Tatsache, dass BAN-052a von den monoklonalen Anti-β-Amyloid-(1-16)-Antikörpern das Sandwich-EIA-Verfahren mit einer äußerst hohen Empfindlichkeit ergab, wurden weiterhin sechzehn Arten von Antikörpern hergestellt, um monoklonale Anti-β-Amyloid-(1-16)-Antikörper auszuwählen, die für das Sandwich-EIA-Verfahren besser geeignet sind (Tabelle 2). Als Ergebnis wurde BAN-50a erhalten. Ergebnisse des Sandwich-EIA-Verfahrens unter Verwendung von BAN-50a als fester Antikörper sind in 13 und 14 gezeigt. Obwohl der Assay gemäß dem oben beschriebenen Beispiel 9 (3) durchgeführt wurde, wurde als Konzentration des markierten Materials für BS-85a-HRP eine 1000-fache Verdünnung (13) und für BA-27a-HRP eine 1500-fache Verdünnung verwendet (14). Um weiterhin die Spezifität dieser Assaysysteme zu untersuchen, wurde auch die Reaktivität gegenüber β-Amyloid (1-28) untersucht [in den Figuren bezeichnen
und
die Reaktivität gegenüber dem β-Amyloid (1-40), und O und Δ bezeichnen die Reaktivität gegenüber dem β-Amyloid (1-28)]. Als Ergebnis war selbst dann, wenn eines der beiden markierten Materialien verwendet wurde, die Empfindlichkeit für die feste Phase mit BAN-50a zwei- bis dreimal höher als für die feste Phase mit BAN-052a. Wenn es mit dem BA-27a-HRP-markierten Material kombiniert wurde, war es möglich, 0,2 pg/Napf des β-Amyloids (1-40) nachzuweisen. Weiterhin zeigten die Ergeb nisse, dass keines der Assaysysteme das β-Amyloid (1-28) nachwies und dass alle Assaysysteme spezifisch für das β-Amyloid (1-40) waren.
[Beispiel 11] Sandwich-EIA-Verfahren (3)
(1) Spezifität des Sandwich-EIA-Verfahrens unter Verwendung von BS-85a-HRP oder BA-27a-HRP
Die Spezifität von zwei Arten von Systemen für Sandwich-EIA-Verfahren wurde eingehender untersucht, wobei BAN-50a als Antikörper der festen Phase verwendet wurde und BS-85a-HRP oder BA-27a-HRP als markiertes Material verwendet wurde. Obwohl der Assay gemäß dem oben beschriebenen Beispiel 10 durchgeführt wurde, wurde als Konzentration des markierten Materials für BS-85a-HRP eine 670-fache Verdünnung und für BA-27a-HRP eine 1000-fache Verdünnung verwendet, und die Reaktivität gegenüber β-Amyloid (1-38), β-Amyloid (1-39), β-Amyloid (1-40), β-Amyloid (1-42) und β-Amyloid (1-28) wurde untersucht (15(a) und 15(b)), wobei das β-Amyloid (1-38) und das β-Amyloid (1-39), die in Beispiel 1 (5) hergestellt wurden, verwendet wurden. Die Konzentration des β-Amyloids (1-38) und des β-Amyloid (1-39) in den jeweiligen Fraktionen der Umkehrphasen-HPLC, die diesen in Beispiel 1 (5) entsprachen, wurde nach dem kompetitiven EIA-Verfahren unter Verwendung von BAN-50a gemäß dem Verfahren von Beispiel 7 (2) untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass das Assaysystem, bei dem BS-85a-HRP als markiertes Material verwendet wurde (15(a)), das β-Amyloid (1-38), das β-Amyloid (1-39) und das β-Amyloid (1-40) mit fast der gleichen Empfindlichkeit (0,7 pg/Napf) nachwies und dass es das β-Amyloid (1-42) mit einer Empfindlichkeit nachwies, die die Hälfte bis ein Drittel von der der oben genannten drei Arten von β-Amyloiden betrug. Weiterhin wurde das β-Amyloid (1-28) überhaupt nicht nachgewiesen, was ähnliche Ergebnisse ergab wie in Beispiel 10. Andererseits wies das Assaysystem, bei dem BA-27a-HRP als markiertes Material verwendet wurde (15(b)), das β-Amyloid (1-30) und das β-Amyloid (1-42) mit einer Empfindlichkeit von 0,2 pg/Napf bzw. 18 pg/Napf nach. Weiterhin war es möglich, das β-Amyloid (1-38) und das β-Amyloid (1-39) mit einer Empfindlichkeit von 85 pg/Napf bzw. 17 pg/Napf nachzuweisen.
Die oben genannten Ergebnisse zeigten, dass das Assaysystem, bei dem BS-85a-HRP als markiertes Material verwendet wurde, nicht für die C-terminalen Teile der β-Amyloide spezifisch war und dass es ungefähr gleich empfindlich auf die β-Amyloide reagierte, die die Sequenz des β-Amyloids (25-35) enthielten, bei dem es sich um ein partielles Peptid handelt, das als Immunogen für den markierten Antikörper verwendet wurde. Andererseits wurde das Assaysystem, bei dem BA-27a-HRP als markiertes Material verwendet wurde, als spezifisch für den C-Terminus des β-Amyloids (1-40) angesehen und reagierte nur schwach gegenüber β-Amyloid (1-38), β-Amyloid (1-39) und β-Amyloid (1-40) mit einer Kreuzreaktivität von 2% oder weniger.
(2) Spezifität und Empfindlichkeit des Sandwich-EIA-Verfahrens unter Verwendung von BC-05a-HRP
Die Spezifität und Empfindlichkeit eines Sandwich-EIA-Verfahrens, bei dem BAN-50a als fester Antikörper verwendet wurde und das in dem oben beschriebenen Beispiel 8 (4) hergestellte BC-05a-HRP als markiertes Material verwendet wurde, wurde untersucht. Die Reaktivität gegenüber β-Amyloid (1-38), β-Amyloid (1-39), β-Amyloid (1-40), β-Amyloid (1-42) und β-Amyloid (1-28) wurde in derselben Weise wie in dem oben beschriebenen Beispiel 11 (1) untersucht, mit der Ausnahme, dass als Konzentration des markierten Materials eine 200-fache Verdünnung verwendet wurde (15(c)). Als Ergebnis konnte das Sandwich-EIA-Verfahren unter Verwendung von BC-05a-HRP 0,7 pg/Napf β-Amyloid (1-42) nachweisen, wies aber die vier von β-Amyloid (1-42) verschiedenen Arten von β-Amyloiden, nämlich β-Amyloid (1-38), β-Amyloid (1-39), β-Amyloid (1-40) und β-Amyloid (1-28), überhaupt nicht nach. Damit war bewiesen, dass das Sandwich-EIA-Verfahren, bei dem BAN-50a als fester Antikörper verwendet wurde und BC-05a-HRP als markiertes Material verwendet wurde, das β-Amyloid (1-42) mit einer äußerst hohen Empfindlichkeit und Selektivität nachweisen kann.
Die oben genannten Ergebnisse zeigten, dass das β-Amyloid (1-40) und das β-Amyloid (1-42) getrennt bestimmt werden können, indem man die beiden Arten von Assaysystemen, bei denen BAN-50a als fester Antikörper verwendet wurde und BA-27a-HRP bzw. BC-05a-HRP als markiertes Material verwendet wurden, miteinander kombiniert.
[Beispiel 12] Herstellung einer festen Affinitätsphase mit fixiertem monoklonalem Antikörper
(1) Herstellung einer festen Affinitätsphase mit fixiertem BAN-052a
BAN-052a wurde an einem Harz fixiert, wodurch eine feste Affinitätsphase hergestellt wurde. Das heißt, man ließ 45 mg BAN-052a über Nacht bei 4°C mit 5 g TSKgel AF-Trecyltoyopearl 650M (Toso) in einer 0,1 M wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat, die 0,5 M NaCl enthielt, reagieren. Nach der Reaktion wurde das Produkt mit 0,5 M Kochsalzlösung gewaschen und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in 0,1 M Tris-HCl (pH 8,0), das 0,5 M NaCl enthielt, reagieren gelassen, um überschüssige aktive Gruppen zu blockieren. Dann wurden 25 ml des so erhaltenen BAN-052a-Trecyltoyopearl mit PBS gewaschen und anschließend bei 4°C in Puffer E aufbewahrt.
(2) Herstellung einer festen Affinitätsphase mit fixiertem BA-27a
Ähnlich wie es oben unter (1) beschrieben ist, wurde BA-27a an einem Füllstoff fixiert, wodurch eine feste Affinitätsphase hergestellt wurde. Das heißt, man ließ 15 mg BA-27a mit 2 g TSKgel AF-Trecyltoyopearl 650M reagieren, wobei man 10 ml BA-27a-Trecyltoyopearl erhielt.
[Beispiel 13] Analyse von β-Amyloiden, die im Liquor eines Patienten mit Alzheimer-Krankheit enthalten sind
Der von einem Patienten mit Alzheimer-Krankheit stammende Liquor, der unter Verwendung der in dem oben beschriebenen Beispiel 12 (1) hergestellten festen Affinitätsphase mit dem fixierten BAN-052a gereinigt wurde, wurde durch Umkehrphasen-HPLC fraktioniert und mit dem Sandwich-EIA analysiert.
Zuerst wurden 1,5 ml des Liquors eines Patienten mit Alzheimer-Krankheit zweifach mit Puffer E verdünnt, und anschließend wurde er zur partiellen Reinigung von einer mit BAN-052a-Trecyltoyopearl gefüllten Säule (0,8 × 0,3 cm) eluiert. Als Eluent wurde 60% Acetonitril verwendet, das 0,2% Trifluoressigsäure enthielt. Dann wurden diese eluierten Fraktionen nach der Konzentrierung durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung von Vydac C4 gemäß dem in Beispiel 1 (5) beschriebenen Verfahren getrennt, und in den eluierten Fraktionen enthaltene β-Amyloide wurden nach dem Sandwich-EIA-Verfahren bestimmt, wobei die feste Phase mit dem gebundenen BAN-50a sowie BS-85a-HRP oder BA-27a-HRP verwendet wurden, wie es in Beispiel 10 beschrieben ist. Die Ergebnisse sind in 16 gezeigt. Die Fraktion Nr. 59 stimmte ungefähr mit der Elutionsposition des synthetischen β-Amyloids (1-40) überein, so dass bei der immunologischen Aktivität, die in den beiden 16(a) und 16(b) nachgewiesen wurde, davon ausgegangen wurde, dass es sich um diejenige des β-Amyloids (1-40) handelt. Die Ergebnisse von 16 zeigten daher, dass das β-Amyloid (1-40) im Liquor des Patienten mit Alzheimer-Krankheit in hoher Konzentration vorlag. 16(a) zeigte weiterhin, dass molekulare Spezies, die mit BS-85a-HRP allein nachweisbar waren, ebenfalls in kleinen Mengen enthalten waren (Fraktionen Nr. 47 und 48). Diese werden mit Acetonitrilkonzentrationen eluiert, die geringer sind als diejenigen, mit denen das β-Amyloid (1-40) eluiert wurde. Dementsprechend wird davon ausgegangen, dass die in den Fraktionen Nr. 47 und 48 eluierten Materialien molekulare Spezies sind, die hydrophiler sind als das β-Amyloid (1-40). Die Ergebnisse von Beispiel 11 zeigten, dass das Assaysystem, bei dem BS-85a-HRP als markiertes Material verwendet wurde, auch gegenüber einer molekularen Spezies, der ein oder zwei Reste vom C-Terminus des β-Amyloids (1-40) fehlen, genauso empfindlich war wie gegenüber dem β-Amyloid (1-40). Die Wahrscheinlichkeit ist daher hoch, dass die in den Fraktionen Nr. 47 und 48 beobachtete immunologische Aktivität diejenige gegenüber der molekularen Spezies ist, der der C-terminale Teil des β-Amyloids (1-40) fehlt.
[Beispiel 14] Analyse von β-Amyloid-Fraktionen, die aus dem Liquor eines Patienten mit Alzheimer-Krankheit stammen
In Ameisensäure wurden 11 mg der in dem oben erwähnten Beispiel 7 (3) beschriebenen β-Amyloid-Fraktionen, die aus dem Gehirn des Patienten mit Alzheimer-Krankheit stammen (die Ameisensäureextrakte), gelöst und durch Gelfiltration unter Verwendung von TSK G3000PW aufgetrennt.
Säulenbedingungen:

Säule: TSK G3000PW (Toso)
Eluenten: 40% Acetonitril, das 0,1% Trifluoressigsäure enthält
Fließgeschwindigkeit: 0,5 ml/min

In den eluierten Fraktionen enthaltene β-Amyloide wurden nach dem Sandwich-EIA-Verfahren unter Verwendung einer festen Phase mit gebundenem BAN-50a-Antikörper und BS-85a-HRP, wie es in dem oben erwähnten Beispiel 10 beschrieben ist, nachgewiesen. Als Ergebnis wurde eine hohe immunologische Aktivität zwischen 14 Minuten und 15 Minuten HPLC-Elutionszeit beobachtet. Dann wurde 0,05% CHAPS zu dieser Fraktion gegeben, anschließend wurde konzentriert, und eine Trennung wurde durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung von Vydac C4 gemäß dem in Beispiel 1 (5) beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die Ergebnisse der Elution sind in 17 gezeigt.
Nachdem jeweils 300 μl der resultierenden Fraktionen der Nr. 35 und 41 bis 45 konzentriert worden waren, wurden die konzentrierten Fraktionen einer Massenspektrometrie (HX110, JEOL) unterzogen. Die Ergebnisse der Analyse für die Fraktionen der Nr. 35, 41 und 43 sind in 18 gezeigt. Das β-Amyloid (1-40) war der Hauptbestandteil von Nr. 35, und das β-Amyloid (1-42) von Nr. 41. Von Nr. 43 war das β-Amyloid (3-42) der Hauptbestandteil (es wurde vermutet, dass der N-Terminus des β-Amyloids (3-42) in Pyroglutaminsäure umgewandelt wird, da das Molekulargewicht um 18 kleiner war als erwartet). Weiterhin enthielt Nr. 43 noch weitere, in kleineren Mengen vorhandene molekulare Spezies, denen der N-terminale Teil fehlte, als Gemische. Weiterhin stimmte die Elutionsposition von Nr. 35 mit der von synthetischem β-Amyloid (1-40) überein.
Dann wurde die immunologische Aktivität der eluierten Fraktionen nach dem Verfahren untersucht, das in dem oben erwähnten Beispiel 11 beschrieben ist. In diesem Fall wurden jeweils 3 μl der Fraktionen als Probe verwendet, und BC-05a-HRP wurde als 200-fache Verdünnung verwendet. Die Ergebnisse sind in 19 gezeigt. In dem Assaysystem unter Verwendung von BS-85a wurden sowohl die Peaks von Nr. 35 als auch die von Nr. 41-43 nachgewiesen, in dem Assaysystem unter Verwendung von BA-27a wurde hauptsächlich der Peak von Nr. 35 nachgewiesen, und in dem Assaysystem unter Verwendung von BC-05a wurde der Peak von Nr. 41-45 nachgewiesen.
Die oben genannten Ergebnisse beruhen auf der in Beispiel 11 gezeigten Spezifität der jeweiligen Assaysysteme, was zusammen mit Beispiel 13 darauf hinweist, dass die Assaysysteme gemäß der vorliegenden Erfindung wichtige Mittel für Entwicklungen von Wirkstoffen für die Diagnose und Aufklärung von Gründen der Alzheimer-Krankheit und zur Prävention und Behandlung der Alzheimer-Krankheit bereitstellen können.
[Beispiel 15] Klonierung des Amyloid-Protein-Vorläufer-(APP)-Gens des humanen Typs
β-Amyloide sind nur Teile eines riesigen Vorläuferproteins (APP), und bisher wurden fünf Arten von cDNAs gefunden, die für APP codieren. Diese cDNAs, die APP695, APP714, APP751, APP770 und APP563 genannt werden, werden infolge von alternativem Spleißen bekanntermaßen ausgehend von demselben APP-Gen produziert. Um eine Plasmid-DNA für die hohe Expression des APP695 des humanen Typs zu konstruieren, wurde von diesen ein humanes APP695-Gen kloniert.
Zuerst wurde unter Verwendung des Plasmids pME18s mit einem starken SRα-Promotor [Molecular and Cellular Biology, 8, 466-472 (1988)] als Vektor eine cDNA-Bibliothek von MAC10, von humanen Lungenkrebszellen stammenden Zellen, hergestellt. Auf der Basis der bereits beschriebenen cDNA-Nucleotidsequenz von humanem APP wurde eine synthetische DNA mit der folgenden Sequenz stromaufwärts eines Bereichs, der für das Protein codiert (Sense):
5'-ATCCCACTCGCACAGCAGCGCACTC-3' (SEQ ID NO: 13)
und mit der folgenden Sequenz stromabwärts davon (Antisense):
5'-TGCTGTCCAACTTCAGAGGCTGCTG-3' (SEQ ID NO: 14)
hergestellt, und unter Verwendung derselben als Sonde wurde die oben genannte cDNA-Bibliothek durchmustert. Die resultierende cDNA wurde kloniert, und ihre Nucleotidsequenz wurde nach dem synthetischen Kettenabbruchverfahren bestimmt. Als Ergebnis zeigte sich, dass es sich bei allen um cDNAs handelte, die für APP751 codieren. Dann wurde eine cDNA-Bibliothek des humanen fetalen Hirns, die unter Verwendung von λgt10 als Vektor (Stratagene) hergestellt wurde, in ähnlicher Weise durchmustert. Als Ergebnis wurde eine cDNA erhalten, die für APP695 codiert. Die cDNA-Sequenz von APP751 stimmte vollständig mit der von APP695 überein, abgesehen von einem Protease-Inhibitor-Bereich. Dementsprechend wurden eine Plasmid-DNA, die cDNA von APP751 aufwies, und eine Phagen-DNA, die cDNA von APP695 aufwies, gespalten und rekombiniert, um eine Plasmid-DNA aufzubauen, bei der die cDNA von APP695 stromabwärts des SRα-Promotors ligiert ist.
[Beispiel 16] Aufzucht von humanen APP695-Ratten-C6-Gliomzellen mit hoher Expression
Ratten-C6-Gliomzellen (ATCC CCL 107) wurden auf einer Kulturschale mit einem Durchmesser von 10 cm bei 37°C in DMEM, das 10% fetales Kälberserum enthielt, in Gegenwart von 5% CO₂ kultiviert. Mit 1 μg der Plasmid-DNA pTB6 [Cell Structure and Function, 12, 205-217 (1987)], die ein Neomycinresistenz-Gen aufwies, wurden 20 μg Plasmid-DNA für eine hohe Expression von humanem APP695, die in dem oben beschriebenen Beispiel 15 aufgebaut wurde, gemischt, und das Gemisch wurde nach dem Calciumphosphat-Copräzipitationsverfahren in C6-Gliomzellen eingeführt, die bis zu einer Sättigung von 80% kultiviert wurden. Nach 24 Stunden wurde Neomycin (GIBCO) hinzugefügt, so dass man eine endgültige Konzentration von 750 μg/ml erhielt, und die Kultivierung wurde fortgesetzt, um resistente Stämme zu selektieren. Jeder der 18 so erhaltenen selektierten Stämme wurde in 100 μl PBS suspendiert. Nach der Lyophilisierung und Ultraschallbehandlung wurde eine SDS-Elektrophorese durchgeführt, wobei man ein 8% Polyacrylamid-Gel verwendete. Nach der Transcription des Proteins auf eine Nitrocellulosemembran wurde eine Western-Blot-Analyse unter Verwendung eines monoklonalen Anti-Human-APP-Maus-Antikörpers (Boehringer Mannheim) durchgeführt, wobei man feststellte, dass C6-695-18 die höchste APP695-Expressionsmenge aufwies.
[Beispiel 17] Nachweis des 3-kDa-Peptids, das im Kulturüberstand von humanen APP695-C6-Gliomzellen mit hoher Expression enthalten ist
Um molekulare Spezies von β-Amyloiden zu identifizieren, die im Kulturüberstand der im oben erwähnten Beispiel 16 beschriebenen humanen APP695-C6-Gliomzellen mit hoher Expression enthalten sind, wurde der Kulturüberstand in ähnlicher Weise wie in Beispiel 13 gereinigt und nach dem Sandwich-EIA-Verfahren analysiert. Das heißt, 1 Liter des Kulturüberstands wurde mit einer Säule, die mit dem im oben beschriebenen Beispiel 12 (2) erhaltenen BA-27a-Trecyltoyopearl gefüllt war, partiell gereinigt, und die resultierenden eluierten Fraktionen wurden konzentriert, und anschließend erfolgte eine Fraktionierung durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung von Vydac C4.
Säulenbedingungen:

Säule: Vydac C4 (4,6 × 250 mm)
Eluenten: A (5% Acetonitril, das 0,1% wässrige Trifluoressigsäure enthält) B (80% Acetonitril, das 0,1% Trifluoressigsäure enthält)
Elutionsverfahren: Die Konzentration von Eluent B wurde zuerst 5 Minuten lang von 15% auf 25% erhöht und dann 60 Minuten lang linear von 25 auf 50% erhöht.
Fließgeschwindigkeit: 0,5 ml/min

Unter Verwendung einer 96-Napf-Mikroplatte, auf der BP-90a verfestigt war, und BA-27a-HRP als markiertes Material gemäß dem in Beispiel 9 (1) beschriebenen Verfahren wurden die oben genannten Umkehrphasen-HPLC-Fraktionen einem Sandwich-EIA-Verfahren unterzogen. Die Fraktionen Nr. 28 und Nr. 38-39, bei denen eine hohe immunologische Aktivität beobachtet wurde, wurden konzentriert und einer Massenspektrometrie unterzogen. Als Ergebnis zeigte sich, dass das β-Amyloid (20-40) oder das β-Amyloid (18-40) ein Hauptbestandteil jeder Fraktion war. Die oben genannten Ergebnisse zeigten, dass das Sandwich-EIA-Verfahren unter Verwendung von BP-90a und BA-27a selektiv Derivate auf der C-terminalen Seite des β-Amyloids nachweisen kann. Es wird daher davon ausgegangen, dass dieses Assaysystem ein wichtiges Mittel bereitstellt, wenn der Metabolismus von APP untersucht wird.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Als Läsion, die charakteristisch für die Hirne von Patienten mit Alzheimer-Krankheit ist, ist die Ablagerung von β-Amyloid bekannt, das einer der Hauptbestandteile von seniler Plaque ist. Unter Verwendung der monoklonalen Antikörper dieser Erfindung können die β-Amyloide, die die C-terminalen hydrophoben Bereiche aufweisen, empfindlich und spezifisch bestimmt werden, und dieses Bestimmungsverfahren ist für die Diagnose von Alzheimer-Krankheit usw. geeignet.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Monoklonaler Antikörper, der spezifisch reaktiv ist gegenüber einem partiellen Peptid auf der C-terminalen Seite eines β-Amyloids oder gegenüber einem Derivat des β-Amyloids, das ausgewählt ist aus (a) Peptiden, denen 1 bis 17 Aminosäurereste vom N-terminalen Teil des β-Amyloids fehlen, (b) Peptiden, bei denen L-Asparaginsäure der β-Amyloide zu L-Isoasparaginsäure, D-Isoasparaginsäure oder D-Asparaginsäure isomerisiert ist, und (c) Peptiden, bei denen der N-terminale Teil der β-Amyloide Pyroglutaminsäure aufweist, wobei der Antikörper ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 7 dargestellt wird, nicht erkennt; wobei (i) der Antikörper ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 8 dargestellt wird, und ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 9 dargestellt wird, nicht erkennt; (ii) der Antikörper ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 8 dargestellt wird, erkennt, aber ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 9 dargestellt wird, nicht erkennt; oder (iii) der Antikörper ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 8 dargestellt wird, nicht erkennt, aber ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 9 dargestellt wird, erkennt.
Monoklonaler Antikörper, der spezifisch reaktiv ist gegenüber einem partiellen Peptid auf der C-terminalen Seite eines β-Amyloids oder gegenüber einem Derivat des β-Amyloids, das ausgewählt ist aus (a) Peptiden, denen 1 bis 17 Aminosäurereste vom N-terminalen Teil des β-Amyloids fehlen, (b) Peptiden, bei denen L-Asparaginsäure der β-Amyloide zu 1-Isoasparaginsäure, D-Isoasparaginsäure oder D-Asparaginsäure isomerisiert ist, und (c) Peptiden, bei denen der N-terminale Teil der β-Amyloide Pyroglutaminsäure aufweist, wobei der Antikörper ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 7 dargestellt wird, nicht erkennt, und der spezifisch reaktiv ist gegenüber einem partiellen Peptid auf der C-terminalen Seite eines β-Amyloids mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 1 dargestellt wird, eines β-Amyloids mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 2 dargestellt wird, und/oder eines β-Amyloids mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 3 dargestellt wird, wobei der Antikörper ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 8 dargestellt wird, und/oder ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 9 dargestellt wird, nicht erkennt und ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 5 dargestellt wird, erkennt.
Monoklonaler Antikörper, der spezifisch reaktiv ist gegenüber einem partiellen Peptid auf der C-terminalen Seite eines β-Amyloids oder gegenüber einem Derivat des β-Amyloids, das ausgewählt ist aus (a) Peptiden, denen 1 bis 17 Aminosäurereste vom N-terminalen Teil des β-Amyloids fehlen, (b) Peptiden, bei denen L-Asparaginsäure der β-Amyloide zu L-Isoasparaginsäure, D-Isoasparaginsäure oder D-Asparaginsäure isomerisiert ist, und (c) Peptiden, bei denen der N-terminale Teil der β-Amyloide Pyroglutaminsäure aufweist, wobei der Antikörper ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 7 dargestellt wird, nicht erkennt, und der spezifisch reaktiv ist gegenüber einem partiellen Peptid auf der C-terminalen Seite eines β-Amyloids mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 1 dargestellt wird, eines β-Amyloids mit ei ner Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 2 dargestellt wird, eines β-Amyloids mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 3 dargestellt wird, und/oder eines β-Amyloids mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 5 dargestellt wird, wobei der Antikörper ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 8 dargestellt wird, erkennt, aber ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 9 dargestellt wird, nicht erkennt.
Monoklonaler Antikörper, der spezifisch reaktiv ist gegenüber einem partiellen Peptid auf der C-terminalen Seite eines β-Amyloids oder gegenüber einem Derivat des β-Amyloids, das ausgewählt ist aus (a) Peptiden, denen 1 bis 17 Aminosäurereste vom N-terminalen Teil des β-Amyloids fehlen, (b) Peptiden, bei denen L-Asparaginsäure der β-Amyloide zu L-Isoasparaginsäure, D-Isoasparaginsäure oder D-Asparaginsäure isomerisiert ist, und (c) Peptiden, bei denen der N-terminale Teil der β-Amyloide Pyroglutaminsäure aufweist, wobei der Antikörper ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 7 dargestellt wird, nicht erkennt, und der spezifisch reagiert gegenüber einem β-Amyloid oder einem Derivat davon, wie es oben definiert ist und das ausgewählt ist aus einem Peptid mit der Aminosäuresequenz, die aus dem 2. bis 42. Aminosäurerest der Sequenz, die durch SEQ ID NO: 5 dargestellt wird, besteht, einem Peptid mit der Aminosäuresequenz, die aus der 3. bis 42. Aminosäure der Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 5 dargestellt wird, besteht, wobei die N-terminale Glutaminsäure durch Pyroglutaminsäure ersetzt ist, einem Peptid mit der Aminosäuresequenz, die aus der 4. bis 42. Aminosäure der Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 5 dargestellt wird, besteht, und einem Peptid mit der Aminosäuresequenz, der der 1. bis 16. oder der 1. bis 17. Aminosäurerest aus der Sequenz, die durch eine der Sequenzen SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 6 dargestellt wird, fehlt, wobei das β-Amyloid oder sein Derivat in einem Ameisensäureextrakt aus dem Gehirn eines Patienten mit Alzheimer-Krankheit enthalten ist, wobei der Antikörper ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 8 dargestellt wird, nicht erkennt, aber ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 9 dargestellt wird, erkennt und das β-Amyloid oder sein Derivat, das in dem Ameisensäureextrakt aus dem Gehirn eines Patienten mit Alzheimer-Krankheit enthalten ist, ein β-Amyloid mit einer Aminosäuresequenz ist, die durch SEQ ID NO: 5 dargestellt wird, und der Antikörper ein β-Amyloid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 1 dargestellt wird, ein β-Amyloid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 2 dargestellt wird, und ein β-Amyloid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 3 dargestellt wird, nicht erkennt.
Antikörper gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das Derivat des β-Amyloids ausgewählt ist aus einem Peptid mit der Aminosäuresequenz, die aus dem 2. bis 42. Aminosäurerest der Sequenz, die durch SEQ ID NO: 5 dargestellt wird, besteht, einem Peptid mit der Aminosäuresequenz, die aus der 3. bis 42. Aminosäure der Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 5 dargestellt wird, besteht, wobei die N-terminale Glutaminsäure durch Pyroglutaminsäure ersetzt ist, einem Peptid mit der Aminosäuresequenz, die aus der 4. bis 42. Aminosäure der Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 5 dargestellt wird, besteht, und einem Peptid mit der Aminosäuresequenz, der der 1. bis 16. oder der 1. bis 17. Aminosäurerest aus der Sequenz, die durch eine der Sequenzen SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 6 dargestellt wird, fehlt.
Antikörper gemäß Anspruch 1, 2, 3 oder 4, der als BA-27a (FERM-BP 4139), BS-85a (FERN-BP 4140) oder BC-05a (FERN-BP 4457) bezeichnet wird.
Hybridomzelllinie BA-27 (FERN-BP 4139), BS-85 (FERN-BP 4140) oder BC-05 (FERN-BP 4457), die den monoklonalen Antikörper gemäß Anspruch 6 erzeugt.
Verfahren zur Bestimmung eines β-Amyloids oder eines Derivats davon, wie es in Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5 definiert ist, in einer Testlösung, um fassend die Verwendung eines Antikörpers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6.
Verfahren gemäß Anspruch 8, das zwischen einem β-Amyloid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 3 dargestellt wird, und einem β-Amyloid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 5 dargestellt wird, unterscheidet.
Verfahren zur Bestimmung eines β-Amyloids oder eines Derivats davon, wie es in den Ansprüchen 1 und 5 definiert ist, in einer Testlösung, umfassend die Verwendung: (1) eines Antikörpers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6; und (2) eines monoklonalen Antikörpers, der (a) als BAN-052a (FERM-BP 4138) oder (b) als BAN-50a (FERM-BP 4163) bezeichnet wird; und spezifisch reaktiv ist gegenüber einem partiellen Peptid auf der N-terminalen Seite eines β-Amyloids oder einem Derivat davon, wobei der Antikörper ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 7 dargestellt wird, und/oder ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 10 dargestellt wird, erkennt.
Verfahren zur Bestimmung eines β-Amyloids oder eines Derivats davon, wie es in den Ansprüchen 1 und 5 definiert ist, in einer Testlösung, umfassend die Verwendung: (1) eines monoklonalen Antikörpers, der spezifisch reaktiv ist gegenüber einem β-Amyloid oder einem Derivat davon, wobei der Antikörper ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 7 dargestellt wird, nicht erkennt, aber ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 12 dargestellt wird, erkennt; und (2) des Antikörpers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 8 bis 11, wobei das Verfahren zur Diagnose der Alzheimer-Krankheit verwendet wird.
Zusammensetzung zur Diagnose der Alzheimer-Krankheit, die einen Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 umfasst.