ES2409844T3 - Metodo para el tratamiento y la profilaxis de enfermedades relacionadas con la deposicion de amiloide utilizando IgM - Google Patents
Metodo para el tratamiento y la profilaxis de enfermedades relacionadas con la deposicion de amiloide utilizando IgM Download PDFInfo
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Abstract
Preparación de inmunoglobulina producida a partir de muestras combinadas de plasma humano como material departida, en la que la preparación de inmunoglobulina está enriquecida en inmunoglobulina M (IgM), para suutilización en un método de tratamiento o prevención de una enfermedad neurodegenerativa asociada con amiloide,en la que la preparación de inmunoglobulina comprende anticuerpos IgM que se unen específicamente a Aß 1-42.
Description
Método para el tratamiento y la profilaxis de enfermedades relacionadas con la deposición de amiloide utilizando IgM
Antecedentes de la invención
Se cree que el péptido amiloide � (A�) 1-42 es uno de los factores clave en el desarrollo y la progresión de la enfermedad de Alzheimer. Aunque todavía no se ha determinado de forma definitiva el papel patogénico preciso del péptido amiloide � en dicha enfermedad, cada vez más indicios apoyan la hipótesis de que la producción de péptido amiloide � y su deposición en el cerebro es un acontecimiento causal de la misma. Por consiguiente, el problema de la producción, acumulación y eliminación del péptido amiloide � en el cerebro se ha erigido como uno de los posibles enfoques razonables para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
Recientemente se ha descubierto que las preparaciones de IgG intravenosas contienen anticuerpos específicos del péptido amiloide A� 1-42. Además, en dos pequeños ensayos en humanos, se ha descubierto que la IgG intravenosa ralentiza la progresión de la enfermedad de Alzheimer (Dodel, R y otros, “Intravenous Immunoglobulins containing antibodies against b-amyloid for the treatment of Alzheimer’s disease”, J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry, 75:1472-1474 (2004); y Dodel, R y otros, “Human antibodies against amyloid beta peptide: A potential treatment for Alzheimer’s disease”, Ann. Neurol, 52:253-256 (2002)). Aunque queda por esclarecer el mecanismo de acción de la IgG en esta indicación, los autores han planteado la hipótesis de que la simple eliminación sistémica del péptido A� 1-42 problemático podría ser la razón de la eficacia de la IgG intravenosa.
El documento WO 03/097093 da a conocer la administración de IgM policlonal humana a pacientes que padecen enfermedades inmunitarias, como asma, inmunodeficiencia común variable, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, enfermedad del suero y vasculitis.
En Levy y otros, 2003, se menciona el tratamiento con pentaglobina de un paciente con síndrome de Sjögren.
El documento EP 1 172 378 describe la utilización de anticuerpo IgG humano en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
Los documentos FR 2 824 568, DE 93 27 112 y EP 0 835 880 describen diversos métodos para obtener preparaciones de IgM derivadas de plasma humano.
La inmunoglobulina M (IgM) es la tercera inmunoglobulina por orden de mayor a menor concentración que se encuentra en el suero de la mayoría de animales (aproximadamente un 6-10% del conjunto total de inmunoglobulinas). Las concentraciones plasmáticas normales de IgM en humanos están comprendidas entre aproximadamente 0,6 y aproximadamente 2,5 mg/ml en los hombres y entre aproximadamente 0,7 y aproximadamente 2,8 mg/ml en las mujeres.
La IgM es una molécula 19S con un peso molecular de 950 kDa y está compuesta por cinco subunidades idénticas de 180 kDa. Cada una de estas subunidades es estructuralmente parecida al monómero de IgG, excepto porque poseen cuatro dominios CH en lugar de tres. Los monómeros de IgM están unidos por enlaces disulfuro en una disposición circular que forma una estrella, y un pequeño polipéptido rico en cisteína llamado cadena J (20 kDa) une dos de las unidades (véase la figura 1). Las moléculas de IgM son secretadas intactas por las células plasmáticas, y por consiguiente la cadena J se debe considerar una parte integral de las mismas. La semivida plasmática de la IgM es de aproximadamente 5,1 días.
La IgM es el principal isotipo de inmunoglobulina que se produce en una respuesta inmunitaria primaria. También se produce en una respuesta secundaria, pero este hecho se ve a menudo enmascarado por el predominio de la IgG. Aunque se produce en una cantidad relativamente pequeña, debido a su estructura pentamérica la IgM es considerablemente más eficiente (en términos molares) que la IgG en la activación del complemento, la opsonización, la neutralización de virus y la aglutinación. La mayoría de isoaglutininas presentes en el suero humano, que reconocen los antígenos sanguíneos de tipo A y B, son de la clase IgM. Por consiguiente, pueden adoptarse algunas medidas especiales durante la purificación a fin de eliminar las isoaglutininas y hacer que la preparación sea más compatible con los tipos sanguíneos A y B.
La inmunización pasiva utilizando preparaciones de inmunoglobulina que contienen IgM puede proporcionar ventajas en el tratamiento y/o prevención de trastornos o enfermedades asociados con los péptidos amiloides.
Características de la invención
La presente invención se refiere a una preparación para su utilización en métodos de tratamiento o prevención (incluidas cualquier disminución clínicamente significativa de los síntomas o la ralentización de la progresión de la enfermedad, respectivamente) de enfermedades neurodegenerativas asociadas con el amiloide o de la amiloidosis. La presente invención también se refiere a preparaciones de inmunoglobulina útiles en dichos métodos.
Así, en un aspecto, la presente invención se refiere a una preparación para su utilización en un método de tratamiento o prevención de una enfermedad asociada con los polipéptidos de amiloide que comprende la administración de una preparación de inmunoglobulina obtenida a partir de muestras combinadas de plasma humano como material de partida, en la que la preparación de inmunoglobulina está enriquecida en inmunoglobulina M (IgM). La preparación de inmunoglobulina puede comprender, como mínimo, aproximadamente el 80% de IgM o, como mínimo, aproximadamente el 90% de IgM. La preparación de inmunoglobulina comprende anticuerpos IgM que se unen específicamente a A 1-42. La enfermedad asociada con los polipéptidos de amiloide puede ser una enfermedad neurodegenerativa asociada con amiloide. Dicha enfermedad puede ser la enfermedad de Alzheimer.
En algunas realizaciones, la preparación de inmunoglobulina se puede administrar en una dosis de inmunoglobulina comprendida entre aproximadamente 0,1 Ig por kg de peso corporal y aproximadamente 1.000 mg por kg de peso corporal. La preparación de inmunoglobulina también se puede administrar en una dosis comprendida entre aproximadamente 0,5 Ig por kg de peso corporal y aproximadamente 500 mg por kg de peso corporal; entre aproximadamente 0,5 Ig por kg de peso corporal y aproximadamente 100 mg por kg de peso corporal; o entre aproximadamente 0,5 Ig por kg de peso corporal y aproximadamente 50 mg por kg de peso corporal.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende IgM, una parte de la cual, como mínimo, se une específicamente a A 1-42, en la que la IgM se puede preparar a partir de material de partida que comprende inmunoglobulinas y otras sustancias del siguiente modo: ajustando el pH del material de partida a fin de obtener una solución intermedia que comprende inmunoglobulinas disueltas, ajustando la solución intermedia de la etapa a) a unas condiciones de pH, temperatura y concentración de caprilato que hacen que se forme un primer precipitado y un primer sobrenadante que comprende inmunoglobulinas, separando el primer sobrenadante del primer precipitado, incubando el primer sobrenadante en unas condiciones de tiempo, pH, temperatura y concentración de caprilato que hacen que se forme un segundo precipitado y un segundo sobrenadante que comprende inmunoglobulinas, separando el segundo sobrenadante del segundo precipitado, poniendo en contacto el segundo sobrenadante con una primera resina de intercambio aniónico en unas condiciones de pH y fuerza iónica que hacen que sustancialmente ninguna cantidad de la inmunoglobulina G o la inmunoglobulina M se una a la primera resina, mientras que la inmunoglobulina A y otras sustancias se unan a la misma, separando una fracción que contiene sustancialmente toda la inmunoglobulina G y la inmunoglobulina M a partir del resultado de la etapa anterior, poniendo en contacto las inmunoglobulinas G y M con una segunda resina de intercambio aniónico en unas condiciones de pH y fuerza iónica que hacen que sustancialmente ninguna cantidad de la inmunoglobulina G se una a la segunda resina, mientras que la inmunoglobulina M y otras sustancias se unan a la misma, eluyendo la IgM a partir de la segunda columna de resina de intercambio iónico con una solución tamponada que tiene una conductividad parecida a la que presenta una solución de cloruro de sodio con una concentración, como mínimo, de 100 mM, aplicando la IgM a una resina de filtración en gel y recuperando la IgM, aplicando la IgM a una resina de afinidad que comprende antígenos A y B inmovilizados y recuperar la IgM. El material de partida se puede obtener a partir de hemoderivados humanos combinados. Los hemoderivados humanos combinados se pueden obtener de donantes que no han sido seleccionados para determinar su título de inmunoglobulina anti-A .
Descripción breve de los dibujos
La figura 1 es un dibujo esquemático que ilustra la estructura pentamérica general y las características de las subunidades individuales.
La figura 2 es un gráfico que ilustra la unión de la IgM a pocillos recubiertos con A 1-42, A 22-35, inhibidor de la proteasa a-1 (a1PI) y SUPERBLOCK.
La figura 3 es un gráfico que ilustra la inmunodepleción de la IgM por bolas acopladas a A 1-42 analizadas en placa recubierta con A 1-42 y a1Pl.
Las figuras 4A y 4B son gráficos que ilustran la inhibición de la unión de la IgM a placas recubiertas con A por parte de varios péptidos relacionados y no relacionados con A .
La figura 5 es un gráfico que ilustra la inhibición de la unión de la IgM a placas recubiertas con A mediante GAMUNEX competitivo.
La figura 6 es un dibujo esquemático que ilustra métodos de fragmentación de la IgM.
La figura 7 es una fotografía que muestra los resultados de electroforesis en gel de IgM fragmentada con 2mercaptoetilamina (MEA).
La figura 8 es un gráfico que ilustra la unión de la IgM fragmentada con MEA a pocillos recubiertos con A 1-42.
La figura 9 es un gráfico que ilustra la unión de la IgM a placas recubiertas con A 1-40, A 1-42, A 1-43 y a1Pl.
La figura 10 es un gráfico que ilustra la unión de la IgM a placas recubiertas con A 1-42 en presencia de A 1-40, A 1-42 y 1-43 competitivos.
La figura 11 es un gráfico que ilustra la unión de la IgM a placas recubiertas con A 1-42 en presencia de A 1-40, A 1-42, A 33-42 y A 37-42 competitivos.
La figura 12 es un gráfico que ilustra la unión de la IgM a placas recubiertas con A 1-42 en presencia de A 1-42 y A 1-42 revuelto competitivos.
La figura 13 es un gráfico que ilustra un perfil cromatográfico de una preparación de IgM según la presente invención.
Descripción detallada de realizaciones de la invención
La presente invención se refiere al descubrimiento de que las preparaciones de inmunoglobulina que contienen IgM derivadas de plasma humano combinado comprenden IgM que se une específicamente a los péptidos de amiloide . En ciertos aspectos, la presente invención da a conocer preparaciones de inmunoglobulina y métodos útiles para el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades y trastornos asociados con la amiloidosis, incluida la enfermedad de Alzheimer.
Las composiciones o métodos que “comprenden” uno o más de los elementos citados pueden incluir otros elementos no citados específicamente. Por ejemplo, una composición que comprende IgM puede contener inmunoglobulinas de otro tipo, así como otras sustancias proteicas o no proteicas.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término “aproximadamente” se refiere al hecho de que un valor puede estar comprendido dentro de un intervalo científicamente aceptable para ese tipo de valor, cosa que también dependerá de hasta qué punto se puede alcanzar una medición cuantitativa del valor teniendo en cuenta las herramientas de medición disponibles.
En el presente documento, los términos “anticuerpo” e “inmunoglobulina” se utilizan indistintamente, a menos que se indique explícitamente lo contrario.
Enfermedades y trastornos asociados con la amiloidosis
Una enfermedad o un trastorno neurodegenerativos se asocian a la amiloidosis cuando se detectan depósitos o placas de amiloide en los tejidos afectados por la enfermedad o en su proximidad, o cuando la enfermedad se caracteriza por la sobreproducción de una proteína, particularmente una proteína amiloidea, que es insoluble o se puede volver insoluble. Las placas de amiloide pueden provocar efectos patológicos directa o indirectamente, por mecanismos conocidos o desconocidos. Entre los ejemplos de enfermedades amiloideas se incluyen, aunque sin limitarse a las mismas, enfermedades sistémicas, tales como enfermedades inflamatorias crónicas, mieloma múltiple, macroglobulinemia, polineuropatía amiloidea familiar (portuguesa) y cardiomiopatía amiloidea familiar (danesa), amiloidosis senil sistémica, polinefropatía amiloidea familiar (Iowa), amiloidosis familiar (finlandesa), síndrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker, nefropatía amiloidea familiar con urticaria y sordera (síndrome de Muckle-Wells), carcinoma medular de tiroides, amiloidosis auricular aislada y amiloidosis asociada a hemodiálisis (HAA); y enfermedades neurodegenerativas asociadas al amiloide.
Tal como se ha indicado anteriormente, además de a la amiloidosis sistémica, la presente invención se refiere particularmente a enfermedades neurodegenerativas que comprenden amiloidosis. El término “enfermedad neurodegenerativa” se refiere a una enfermedad o trastorno del sistema nervioso, particularmente con afectación del cerebro, que se manifiesta mediante síntomas característicos de una disfunción cerebral o nerviosa, por ejemplo, lapsus o fallos de memoria a corto o largo plazo, demencia, fallos cognitivos, problemas de equilibrio y coordinación, y deficiencias emocionales y de comportamiento. Estas enfermedades están “asociadas con la amiloidosis” cuando muestras histopatológicas (biopsia) de tejido cerebral de los individuos que muestran dichos síntomas revelan la formación de placas amiloideas. Dado que las muestras de biopsia del cerebro, particularmente del cerebro humano, son muy difíciles o imposibles de obtener en individuos vivos, con frecuencia la asociación de un síntoma o síntomas de enfermedad neurodegenerativa con la amiloidosis se basa en criterios que no son la presencia de depósitos de amiloide en una muestra de biopsia. De este modo, particularmente en lo que respecta a la enfermedad de Alzheimer (EA), el diagnóstico tradicional se basa en la sintomatología y, si resultan relevantes, los antecedentes familiares. En la práctica clínica, el médico diagnostica la EA basándose en los síntomas de demencia senil, que incluyen disfunción cognitiva, amnesia retrógrada (pérdida de memoria de acontecimientos recientes), deterioro progresivo de la memoria remota y, posiblemente, depresión u otros síndromes neuróticos. El individuo presenta una lenta desintegración de la personalidad y las capacidades intelectuales. Las técnicas de imagen pueden revelar una pérdida abundante de células en la corteza cerebral y otras áreas del cerebro. Sin embargo, la EA se diferencia de la demencia senil por la edad a la que se inicia: la EA aparece con probabilidad en el quinto o sexto decenio de vida del individuo, mientras que la demencia senil aparece en el octavo decenio o más tarde.
En una realización específica, según la presente invención, la enfermedad neurodegenerativa asociada con la amiloidosis es la EA, una afección que incluye la EA esporádica, la EA asociada a ApoE4, otras formas de EA con APP mutante (por ejemplo, mutaciones en APP717, que son las mutaciones de APP más comunes), formas de EA familiar (EAF) con PS1 mutante (véase el documento WO 96/34099), formas de EAF con PS2 mutante (véase el documento WO 97/27296) y EA asociada a polimorfismo de a-2-macroglobulina. En otras realizaciones, la enfermedad puede ser la rara enfermedad sueca caracterizada por una doble mutación KM a NL en la proteína precursora del amiloide (APP) cerca del extremo aminoterminal de la porción AP de la APP (Levy y otros, Science 248:1124-26 (1990)). Otra de estas enfermedades es la hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis de tipo holandés (HCHA o HCHWA) (Rozemuller y otros, Am. J. Pathol. 142:1449-57 (1993); Roos y otros, Ann. N.Y. Acad. Sci. 640:155-60 (1991); Timmers y otros, Neurosci. Lett. 118:223-6 (1990); Haan y otros, Arch. Neurol. 47:965-7 (1990)). Otras enfermedades conocidas en la técnica e incluidas dentro del alcance de la presente invención son, sin limitarse a las mismas, la angiopatía amiloidea cerebral esporádica, la angiopatía amiloidea cerebral hereditaria, el síndrome de Down, el Parkinson-demencia de Guam y la angiopatía amiloidea asintomática asociada a la edad (véase, por ejemplo, Haan y Roos, Clin. Neurol. Neurosurg. 92:305-310 (1990); Glenner y Murphy, N. Neurol. Sci. 94:1-28 (1989); Frangione, Ann. Med. 21:69-72 (1989); Haan y otros, Clin. Neuro. Neurosurg. 94:317-8 (1992); Fraser y otros, Biochem. 31:10716-23 (1992); Coria y otros, Lab. invest. 58:454-8 (1988)). La composición real de aminoácidos y el tamaño del AP (péptido amiloide beta) involucrado en cada una de estas enfermedades puede variar, tal como se conoce en la técnica (véase anteriormente, y Wisniewski y otros, Biochem. Biophys. Res. Commun. 179:1247-54 (1991) y Biochem. Biophys. Res. Commun. 180: 1528 (1991) [publicación de errata]; Prelli y otros, Biochem. Biophys. Res. Commun. 170:301-307 (1990); Levy y otros, Science 248:1124-26 (1990)).
Amiloide
Los términos “amiloide”, “placa de amiloide” y “fibrillas de amiloide” se refieren de forma general a sustancias proteínicas insolubles con características físicas concretas independientes de la composición de proteínas u otras moléculas que se encuentran en dicha sustancia. El amiloide se puede identificar por su estructura amorfa, su tinción eosinófila, los cambios que provoca en la fluorescencia de la tioflavina y su apariencia homogénea. En el presente documento, los componentes proteínicos o peptídicos del amiloide se denominan “polipéptidos de amiloide”, y entre ellos se incluyen, aunque sin limitarse a los mismos, el péptido amiloide (A ), incluidos los AP sintéticos correspondientes a los primeros 28, 40 ó 42 aminoácidos de A , es decir, A 1-28, A 1-40, A 1-42, respectivamente, así como un AP sintético correspondiente a los aminoácidos 25 a 35 de A , es decir, A 25-35. Otros péptidos de amiloide incluyen el precursor de la proteína de la tembladera ovina o proteína priónica (asociada a la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob), la sinucleína (asociada a la enfermedad de Parkinson), la proteína de Huntington (asociada con la corea de Huntington), la inmunoglobulina, incluidas cadenas K o A ligeras o pesadas, o fragmentos de las mismas, producidas por los mielomas; amiloide A sérico; 2-microglobulina; ApoAI; gelsolina; cistatina C; (pro)calcitonina; factor natriurético auricular, polipéptido de amiloide de los islotes, también conocido como amilina (véase Westermark y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3881-85, 1987; Westermark y otros, Am. J. Physiol. 127:414-417, 1987; Cooper y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8628-32, 1987; Cooper y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7763-66, 1988; Amiel, Lancet 341:1249-50, 1993); y similares. En un aspecto específico, el término “amiloide” se utiliza en el presente documento para referirse a sustancias que contienen A . “Amiloidosis” se refiere a la deposición o agregación in vivo de proteínas que forman placas o fibrillas de amiloide.
El péptido amiloide de 42 aminoácidos (4,2 kDa) (A 1-42 o AP) deriva de una familia de proteínas mayores precursoras del péptido amiloide (APP) (Glenner y Wong, Biochem. Biophys. Res. Commun. 120:885-890 (1984); Glenner y Wong, Biochem. Biophys. Res. Commun. 122:1131-35 (1984); Goldgaber y otros, Science 235:8778-8780 (1987); Kang y otros, Nature 325:733-736 (1987); Robakis y otros, Proc Natl. Acad. Sci. USA 84:4190-4194 (1987); Tanzi y otros, Science 135:880-884 (1987)). APP 25 es una proteína de transmembrana que se encuentra en diversas isoformas y que en general se denominan en el presente documento APP de longitud completa (flAPP). Además, existe una forma soluble de APP (sAPPa) formada por la acción de la a-secretasa.
El “nivel de A ” en una muestra biológica se puede detectar por cualquier método conocido en la técnica, entre los cuales se incluye, aunque sin limitarse a los mismos, inmunoensayo, análisis bioquímico (por ejemplo, purificación, electroforesis en gel, análisis cuantitativo de secuencia de aminoácidos o análisis de composición, tinción con rojo Congo o tioflavina T, y similares), u otros métodos conocidos por detectar el A . En particular, se utilizan métodos de fluorescencia con tioflavina T para detectar el péptido agregado. El término “muestra biológica” incluye, aunque sin limitarse a los mismos, líquidos corporales (sangre, glóbulos sanguíneos, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, orina), tejidos (por ejemplo, médula espinal, nervios, etc.) u órganos (preferentemente el cerebro, pero también el hígado, el riñón, el páncreas, etc.).
Los ensayos para los anticuerpos anti-amiloide se pueden llevar a cabo mediante técnicas conocidas en la materia, por ejemplo, radioinmunoensayo, ELISA (análisis de inmunoabsorción enzimática), inmunoensayos “sándwich”, ensayos inmunorradiométricos, reacciones de precipitación de difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, inmunoensayos in situ (utilizando oro coloidal, enzima de marcadores radioisotópicos, por ejemplo), transferencias Western, reacciones de precipitación, ensayos de aglutinación (por ejemplo, ensayos de aglutinación en gel, ensayos de hemaglutinación), ensayos de fijación del complemento, ensayos de inmunofluorescencia,
ensayos de proteína A y ensayos de inmunoelectroforesis, etc. En una realización, la unión del anticuerpo se determina por la detección de un marcador en el anticuerpo primario. En otra realización, el anticuerpo primario se detecta determinando la unión de un anticuerpo secundario o reactivo a dicho anticuerpo primario. En otra realización, se marca el anticuerpo secundario. Se conocen muchos medios en la técnica para detectar la unión en un inmunoensayo, y dichos medios están dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, para seleccionar anticuerpos que reconocen un epítopo específico de un péptido amiloide, se pueden analizar los hibridomas generados para un producto que se une a un fragmento de péptido amiloide que contiene dicho epítopo.
Preparaciones de inmunoglobulina
La presente invención se refiere al descubrimiento de que la IgM purificada a partir de fuentes humanas donadas y combinadas muestra especificidad hacia el péptido A 1-42. En un aspecto, las preparaciones de inmunoglobulina que contienen IgM se pueden preparar de acuerdo con la patente de EE.UU. 6.307.028, de Lebing y otros.
Lebing y otros dan a conocer un procedimiento para la preparación de inmunoglobulina intravenosa que incluye una etapa cromatográfica de intercambio aniónico en la que dicha resina conserva la mayor parte de la IgM de los materiales de partida. Según la presente invención, la IgM se eluye en esta resina de intercambio aniónico y se somete a filtración en gel, seguido de la eliminación de isoaglutininas haciendo pasar la preparación a través de una resina sintética que comprende antígenos A y B sintéticos inmovilizados.
La oligomerización de la IgM se reduce mediante el procesamiento a concentraciones bajas y a un pH relativamente bajo, y minimizando la exposición de la IgM a concentraciones salinas elevadas. Las preparaciones finales se formulan en glicina 0,2 M (pH 4,2) para evitar adicionalmente la oligomerización. En el siguiente ejemplo 1 se indican otros detalles referentes a la preparación de IgM según la presente invención. Sin embargo, cabe mencionar que los ejemplos específicos descritos en el presente documento son únicamente ilustrativos de la presente invención y que ninguno de ellos pretende limitar el alcance según la presente invención tal como se especifica en las reivindicaciones.
Unión al péptido Af
Para determinar la unión de la IgM a los péptidos A , se desarrolló un ensayo ELISA para cuantificar el anti-A 1-42 en la muestra de IgM. En este ensayo, se recubrió una placa de microtitulación con el péptido sintético A 1-42, con su versión reducida A 22-35 y con un inhibidor proteínico irrelevante de la proteasa a1, y se añadieron a dicha placa concentraciones variables de IgM combinada derivada de plasma. La IgM unida se detectó utilizando anticuerpo anti-IgM humana de cabra conjugado con peroxidasa de rábano. La IgM mostró una unión elevada y saturada al péptido amiloide de tamaño completo (figura 2), mientras que se detectó una nula o escasa unión al péptido truncado o al inhibidor de la proteasa a1.
Con el fin de comprobar si la unión observada era específica, se llevó a cabo un experimento de control en el que la preparación de IgM se incubó durante una noche con bolas de SEPHAROSE recubiertas covalentemente con péptido A 1-42. Como control negativo, la preparación de IgM también se incubó con bolas de SEPHAROSE sin recubrir en las mismas condiciones. El material desprovisto de proteínas por inmunodepleción se sometió a ensayo para determinar la unión a A 1-42. La preparación de IgM incubada con bolas de SEPHAROSE sin recubrir mostró una unión considerable en los pocillos recubiertos con A 1-42 y ninguna unión en los pocillos recubiertos con a1PI. En cambio, la IgM incubada con bolas recubiertas con A 1-42 mostró muy poca unión en los pocillos recubiertos con A 1-42 (figura 3), lo que indica que la unión de la IgM al péptido amiloide A 1-42 es específica.
Para confirmar adicionalmente que la unión de la IgM al péptido A 1-42 es específica, se llevaron a cabo una serie de experimentos de competencia peptídica a fin de detectar inhibiciones de la señal de ELISA. Se preincubaron concentraciones variables de A 1-42 libre y sus derivados más pequeños (A 22-35, 1-40, 1-28, 25-35) y una proteína no relacionada, a1Pl, con IgM 0,1 mg/ml durante 1 hora y, a continuación, se introdujeron en placas recubiertas con A 1-42. El péptido A de longitud completa fue el único competidor capaz de bloquear la unión de la IgM a la placa (figuras 4A y 4B). Este efecto fue dependiente de la concentración, siendo capaz una concentración de 0,1 mg/ml del péptido A 1-42 libre de inhibir completamente la unión de la IgM a la placa ELISA.
Ninguno de los derivados del péptido A 1-42, tales como A 1-28, A 25-35 o incluso el péptido A 1-40, fueron capaces de competir por la unión de la IgM. Sin pretender limitarse a ninguna teoría en particular, estos resultados pueden indicar que, o bien: 1) las IgM contra A 1-42 requieren que el péptido se encuentre en una conformación concreta; o bien 2) que el sitio de reconocimiento del epítopo se encuentra en la parte carboxiterminal del péptido.
A fin de evaluar adicionalmente la especificidad y la unión de la muestra de IgM humana, se dispuso un experimento de competencia entre la muestra de IgG humana (GAMUNEX, Talecris Biotherapeutics, Research Triangle Part, Carolina del Norte) y la muestra de IgM. Se prepararon varias diluciones de GAMUNEX y se mezclaron con IgM 0,1 mg/ml. A continuación, estas mezclas se añadieron a una placa recubierta con A 1-42. Una concentración de 4 mg/ml de GAMUNEX eliminó completamente la unión de la IgM (figura 5). Este experimento sugiere que la muestra de IgM puede compartir algunos epítopos con las IgG presentes en el plasma contra A 1-42. La serie de
experimentos de inhibición, combinada con los datos de inmunodepleción, confirma la unión de la IgM al péptido de amiloide A 1-42 y que dicha unión es específica.
Además, los fragmentos de IgM generados utilizando 2-mercaptoetilamina (MEA, véase la figura 6 y el ejemplo 6 a continuación) se sometieron a ensayo para determinar la unión a los péptidos A 1-42. Los fragmentos de IgM recién generados se diluyeron y se introdujeron en pocillos recubiertos con A 1-42 y a1Pl a fin de determinar la unión y la especificidad. Los fragmentos de tipo IgG conservaron sus características de unión y especificidad, similares a las de la IgM pentamérica (véase la figura 8).
El descubrimiento de que la IgM combinada contiene anticuerpos contra el péptido de amiloide A 1-42 indica que esta inmunoglobulina puede resultar útil para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. La IgM administrada por vía intravenosa se puede utilizar profilácticamente, en individuos susceptibles de padecer la enfermedad de Alzheimer, o para el tratamiento de los pacientes diagnosticados de dicha enfermedad. Además, también se pueden utilizar IgM monomérica (producida como resultado de una reducción suave de los disulfuros que unen las cinco subunidades con la cadena J) o derivados de bajo peso molecular de la IgM (por ejemplo, fragmentos proteolíticos de la IgM) para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. De hecho, los fragmentos de IgM más pequeños pueden pasar la barrera hematoencefálica de forma más eficiente y, por lo tanto, pueden ser más potentes que la IgM de longitud completa. Dichos derivados de la IgM se pueden someter a ensayo según los métodos y procedimientos dados a conocer en el presente documento para evaluar el mantenimiento de la unión y la selectividad con respecto a los péptidos A 1-42 y relacionados con A .
El término “paciente” incluye individuos humanos y otros mamíferos que reciben tratamiento profiláctico o terapéutico.
Composiciones farmacéuticas y administración
Los individuos con niveles normales de anticuerpos anti-amiloide parecen protegidos frente a las enfermedades neurodegenerativas. Sin embargo, los ensayos clínicos con una vacuna de péptidos A 1-42 ha dado lugar a inflamación encefálica en diversos pacientes. Por consiguiente, la administración de anticuerpos anti-amiloide naturales, es decir, la inmunización pasiva en individuos con riesgo de padecer o que padecen una enfermedad neurodegenerativa, por ejemplo la EA, tiene un mayor potencial en cuanto a seguridad y eficacia. Las preparaciones de inmunoglobulina que comprenden IgM anti-A , según la presente invención, pueden ser una alternativa más segura si se utilizan para la inmunización pasiva de los individuos que padecen una enfermedad asociada con amiloide o con riesgo de desarrollarla.
Las preparaciones de inmunoglobulina anti-péptido amiloide, según la presente invención, se pueden formular en una composición farmacéutica con un vehículo farmacéuticamente aceptable. La expresión “farmacéuticamente aceptable” se refiere a entidades moleculares y composiciones fisiológicamente tolerables y que habitualmente no producen ninguna reacción alérgica o reacción adversa similar, tal como molestias gástricas, mareos y similares, cuando se administra a un ser humano. Tal como se utiliza en el presente documento, el término “farmacéuticamente aceptable” puede significar aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal estadounidense o del gobierno de un estado de la Unión, o que aparece en la Farmacopea de los EE.UU. u otra farmacopea generalmente reconocida, para su utilización en animales, y más particularmente en seres humanos. El término “vehículo” se refiere al diluyente, adyuvante, excipiente o portador con el que se administra el compuesto. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluidos los de petróleo o los de origen animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Como vehículos, se utilizan preferentemente soluciones salinas en agua o solución acuosa y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol, particularmente para soluciones inyectables. En “Remington Pharmaceutical Sciences”, de E. W. Martin, se describen vehículos farmacéuticos adecuados.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden las preparaciones de inmunoglobulina anti-amiloide, según la presente invención, se pueden introducir por vía parenteral, transmucosa, por ejemplo, por vía oral (per os), nasal o rectal, o por vía transdérmica. Entre las vías parenterales se incluyen la administración intravenosa, intraarteriolar, intramuscular, intradérmica, subcutánea, intraperitoneal, intraventricular e intracraneal. La administración se puede realizar directamente en el líquido cefalorraquídeo, por ejemplo, mediante una punción lumbar.
En otras realizaciones, las preparaciones, según la presente invención, se pueden suministrar en una vesícula, particularmente un liposoma (véase Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat y otros, en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein y Fidler (eds.), Liss: Nueva York, págs. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., págs. 317-327; véase generalmente ibid.).
En otra realización, las preparaciones, según la presente invención, se pueden administrar mediante un sistema de liberación controlada. Por ejemplo, se puede administrar un polipéptido utilizando infusión intravenosa con una bomba continua, en una matriz polimérica, tal como de ácido poliláctico/glutámico (PLGA), un gránulo que contiene una mezcla de colesterol y el compuesto de anticuerpo anti-péptido amiloide (SILASTICR, Dow Corning, Midland, Michigan; véase la patente de EE.UU. 5.554.601) implantado por vía subcutánea, una bomba osmótica implantable,
un parche transdérmico, liposomas u otros modos de administración. En una realización, se puede utilizar una bomba (véase Langer (1990); Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald y otros, Surgery 88:507 (1980); Saudek y otros, N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)). En otra realización, se pueden utilizar materiales poliméricos (véase Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise (eds.), CRC Press: Boca Ratón, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen y Ball (eds.), Wiley: Nueva York (1984); Ranger y Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983); véase también Levy y otros, Science 228:190 (1985); During y otros, Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howard y otros, J. Neurosurg. 71:105 (1989)). En otra realización, se puede colocar un sistema de liberación controlada cerca de la diana terapéutica, es decir, el cerebro, con lo que se hace necesaria únicamente una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, págs.115-138 (1984)). Se puede introducir un dispositivo de liberación controlada en el individuo tratado cerca del sitio que presenta amiloidosis. Se describen sistemas de liberación controlada en el artículo de Langer (Science 249:1527-1533 (1990)).
Las preparaciones de inmunoglobulina y los métodos, según la presente invención, son útiles para el tratamiento de enfermedades o trastornos neurológicos asociados con una deficiencia de anticuerpos anti-amiloide. De este modo, una enfermedad o trastorno que puede ser objeto de tratamiento o prevención, según la presente invención, puede ser una neuropatía que implica la deposición de amiloide, y la misma puede estar asociada con una inmunodeficiencia específica o general. Entre estas enfermedades se incluyen, aunque sin limitarse a las mismas, la EA; el kuru, la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob y otras encefalopatías espongiformes; la enfermedad de Parkinson; y la corea de Huntington.
Dosificación y pauta
Se puede garantizar un suministro in vivo constante de los anticuerpos anti-péptido amiloide de las preparaciones de inmunoglobulina, según la presente invención, proporcionando una dosis terapéuticamente eficaz (es decir, una dosis eficaz para inducir cambios metabólicos en el individuo) en los intervalos necesarios, por ejemplo, diariamente, cada 12 horas, etc. Estos parámetros dependerán de la gravedad del estado patológico tratado, de otras acciones que se lleven a cabo, tales como modificaciones de la dieta, del peso, de la edad y del sexo del individuo, y de otros criterios, que pueden ser fácilmente determinados por el experto en la materia según la buena práctica médica. La preparación de inmunoglobulina anti-péptido amiloide se administra durante, como mínimo, diez días, como mínimo, 100 días, o durante toda la vida del receptor.
El término “prevenir” se refiere a interferir profilácticamente con un mecanismo patológico que da lugar a la enfermedad o trastorno, lo que proporciona, como mínimo, cierta disminución clínicamente apreciable de la velocidad de deterioro o la extensión de los daños causados por la enfermedad. En el contexto de la presente invención, un mecanismo patológico de este tipo puede ser un aumento del procesamiento de la forma amiloidogénica de la APP; una desregulación de la eliminación de A ; o una combinación de ambos.
El término “tratar” se refiere a provocar una mejora de un estado asociado con la enfermedad o trastorno. En el contexto de la presente invención, el tratamiento incluye la reducción del nivel de A , la regulación de la formación de A , la disminución de la agregación de A o de la formación de placas de amiloide, o la mejora de una deficiencia cognitiva en un individuo que padece una enfermedad o trastorno asociado con la amiloidosis, por ejemplo, la EA o un modelo animal de EA. Una “cantidad terapéuticamente eficaz” de las preparaciones de inmunoglobulina, según la presente invención, puede tratar o prevenir un déficit clínicamente significativo de la actividad, la función y la respuesta del huésped. Alternativamente, una cantidad terapéuticamente eficaz puede ser suficiente para provocar una mejora clínicamente significativa de un estado patológico en el huésped.
Un individuo que “presenta mayor riesgo de desarrollar” una enfermedad o trastorno neurológico asociado con la amiloidosis puede tener una predisposición genética a desarrollar una amiloidosis, como puede ser, por ejemplo, una persona procedente de una familia con miembros que han padecido EA familiar (EAF). Por otra parte, una persona que se encuentra en su séptimo u octavo decenio de vida tiene mayor riesgo de padecer EA asociada a la edad.
Un individuo que “muestra un síntoma de” una enfermedad o trastorno neurológico asociado con la amiloidosis se presenta con un síntoma o queja que se encuentra en los individuos que padecen o han padecido una enfermedad o trastorno de este tipo. Por ejemplo, en la EA, estos síntomas pueden incluir el desarrollo de demencia, fallos de memoria y similares en el quinto o sexto decenio de vida, tal como se ha indicado anteriormente.
Una “dosis que reduce el nivel de A ” es una cantidad de anticuerpo anti-péptido amiloide que provoca una disminución del nivel de A , por ejemplo, en el cerebro o el líquido cefalorraquídeo de un individuo tratado. Dichas dosis pueden estar comprendidas entre aproximadamente 0,1 Ig de anticuerpos anti-péptido amiloide por kg de peso corporal (Ig/kg) y aproximadamente 100 mg/kg; entre 0,5 Ig de anticuerpos anti-péptido amiloide por kg de peso corporal (Ig/kg) y aproximadamente 50 mg/kg; o entre aproximadamente 5 Ig/kg y aproximadamente 10 mg/kg. La cantidad de anticuerpo anti-péptido amiloide que se utiliza para disminuir el nivel de A puede ser una cantidad correspondiente al nivel de anticuerpo anti-péptido amiloide en una muestra biológica, particularmente la sangre (incluidos el plasma y el suero) y el líquido cefalorraquídeo (LCR) de un individuo normal.
La expresión “reducción del nivel de péptidos de amiloide (A )” puede referirse a la disminución de la cantidad de A 1-42 in vivo. El A se puede acumular en la sangre, el líquido cefalorraquídeo o los órganos. El principal órgano en el que interesa reducir el nivel de A es el cerebro, pero los niveles de A también se pueden reducir en los líquidos corporales, los tejidos y/u otros órganos mediante la presente invención.
Las dosis eficaces de las composiciones, según la presente invención, para el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente varían en función de muchos factores diferentes, incluidos los medios de administración, el sitio diana, el estado fisiológico del paciente, el hecho de que el paciente sea un ser humano o un animal, la administración de otras medicaciones y de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Las dosis de tratamiento se pueden valorar a fin de optimizar la seguridad y la eficacia.
Para la inmunización pasiva con una preparación de anticuerpo o inmunoglobulina, la dosis está comprendida entre aproximadamente 0,0001 y 2.000 mg/kg, entre 200 y 1.000 mg/kg, y más habitualmente entre 0,01 y 100 mg/kg de peso corporal del huésped. Por ejemplo, las dosis pueden ser de 100 mg/kg de peso corporal o de 1.000 mg/kg de peso corporal, o estar dentro del intervalo 100-1.000 mg/kg. Una pauta terapéutica ilustrativa comprende la administración una vez cada dos semanas o una vez al mes o una vez cada 3 a 6 meses. Generalmente, los anticuerpos se administran en diversas tomas. Los intervalos transcurridos entre las dosis individuales pueden ser semanales, mensuales o anuales. Los intervalos también pueden ser irregulares, tal como se indica mediante la medición de los niveles sanguíneos de anticuerpo contra A en el paciente. En algunos métodos, la dosificación se ajusta para alcanzar una concentración plasmática de anticuerpo de 1-50 mg/ml, y en algunos métodos de 1-20 mg/ml. Alternativamente, los anticuerpos se pueden administrar como formulación de liberación controlada, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosis y la frecuencia varían en función de la semivida de los anticuerpos en el paciente.
La dosis y la frecuencia de administración pueden variar en función de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, se administra una dosis relativamente baja a intervalos relativamente infrecuentes a lo largo de un período prolongado. Algunos pacientes continúan recibiendo tratamiento durante el resto de su vida. En aplicaciones terapéuticas, a veces es necesaria una dosis relativamente elevada a intervalos relativamente cortos hasta que se reduce o se detiene la progresión de la enfermedad, y preferentemente hasta que el paciente muestra una mejora parcial o completa de los síntomas de la misma. A partir de entonces, se puede administrar al paciente una pauta profiláctica.
Los agentes, según la presente invención, se pueden administrar opcionalmente combinados con otros agentes como mínimo parcialmente eficaces en el tratamiento de una enfermedad amiloidogénica. En el caso de la EA y del síndrome de Down, en los que los depósitos de amiloide se producen en el cerebro, los agentes, según la presente invención, también se pueden administrar junto con otros agentes que facilitan el paso de los agentes, según la presente invención, a través de la barrera hematoencefálica.
Inmunización pasiva
En general, los procedimientos para llevar a cabo un seguimiento de la inmunización pasiva son parecidos a los que se pueden utilizar para realizar un seguimiento de la inmunización activa. Sin embargo, habitualmente, el perfil de anticuerpos que sigue a una inmunización pasiva muestra un pico inmediato de concentración de anticuerpos seguido de una caída exponencial. Sin ninguna dosificación adicional, la caída de la concentración se aproxima a los niveles anteriores al tratamiento en cuestión de días o meses, dependiendo de la semivida del anticuerpo administrado. Por ejemplo, la semivida de algunos anticuerpos humanos es del orden de 20 días.
En algunos métodos, se puede llevar a cabo una medición basal de anticuerpo anti-A en el paciente antes de la administración, una segunda medición poco después de la misma para determinar el pico de anticuerpos y una o más mediciones adicionales a intervalos para controlar la caída de los niveles de anticuerpos. Cuando el nivel de anticuerpos se ha reducido al valor basal o a un porcentaje predeterminado del pico menos el valor basal (por ejemplo, el 50%, el 25% o el 10%), se administra una dosis adicional de anticuerpo. En algunos métodos, los niveles de pico o medidos posteriormente menos el valor basal se pueden comparar con niveles de referencia determinados previamente para establecer una pauta profiláctica o terapéutica beneficiosa para otros pacientes. Si el nivel de anticuerpos medido es significativamente menor que un nivel de referencia (por ejemplo, menor que la media menos una desviación estándar del valor de preferencia en la población de pacientes que se benefician del tratamiento), se puede indicar la administración de una dosis adicional de anticuerpo.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos son ilustrativos de los métodos y composiciones, según la presente invención, y no pretenden limitar el alcance de la presente invención tal como se expresa en las reivindicaciones.
Ejemplo 1 - Preparación de IgM y fragmentos de IgM
Para resumir, se purificó IgM a partir del eluido de la columna ANX del proceso de preparación de inmunoglobulina intravenosa (la segunda etapa de intercambio aniónico del procedimiento descrito en la patente de EE.UU. 6.307.028, de Lebing y otros (Lebing y otros)), y a continuación se llevó a cabo una filtración en gel sobre SUPEROSE 6 que proporcionó una IgM con una pureza mayor del 90%. Las principales impurezas son IgA (~6-8%) e IgG (<2%). A fin de eliminar las isoaglutininas, la IgM se hizo pasar a través de una columna que contiene antígenos A y B sintéticos inmovilizados.
La preparación de IgM humana altamente purificada, con bajo contenido de isoaglutinina y de oligómeros, se alcanzó mediante cromatografía de exclusión por tamaño de eluido de intercambio aniónico de inmunoglobulina intravenosa (eluido de ANX) seguido de la eliminación de la isoaglutinina por cromatografía de afinidad. El perfil diana de la preparación de IgM se definió de modo que incluyera unos límites de menos del 5% de IgA, menos del 5% de IgM oligomérica y menos de 0,3 UE/ml (unidades de endotoxina/ml). Se aplicó el límite de la Farmacopea Europea (FE) para la actividad de isoaglutinina a la IgM: menos de 1:64 a 50 mg/ml.
Todos los tampones se trataron en autoclave y se filtraron través de un filtro de 0,22 Im para introducirlos en bolsas estériles sin pirógenos antes de su utilización. El material de partida, el eluido de ANX, es una solución proteínica al 0,2%, de pH 5,1, en acetato 0,5 M, que puede contener hasta un 50% de IgM. El material proteínico que no es IgM presente en le eluido de ANX es principalmente IgG e IgA. Se descongelaron 1,3 l de eluido congelado de columna ANX y se ajustó el pH a 7,95 con NaOH 1,0 N. Tras la filtración a través de un filtro estéril de 0,22 Im, el material se concentró en un casete 100 K PELLICON mini y/o PELLICON XL (Millipore Corporation, Bedford, Massachusetts) hasta una concentración comprendida entre 15 mg/ml y 25 mg/ml. Se cargaron 65 ml del concentrado (aproximadamente 1.150 mg de proteína) en una columna SUPEROSE 6 FF Prep Grade de 5,0 cm x 70 cm (Pharmacia, Upsala, Suecia) equilibrada con TBS a un caudal lineal de 15,3 cm/h. Durante la elución de la fracción de IgM, se conectó en serie una columna Atri/Btri PAA SEPHAROSE 6 FF de 5,0 cm x 5,1 cm (GlycoTech Corporation, Rockville, Maryland).
Tal como se puede observar en la figura 13, la porción central del pico de IgM (aproximadamente 200 ml) se recogió en recipientes estériles, se muestreó y se sometió inmediatamente a diálisis frente a glicina 0,2 M, pH 4,2, utilizando tubos de diálisis estériles. La diálisis consistió en cuatro x 2 l cambios a lo largo de un período de 18 horas a 4ºC. Tras la diálisis, los sublotes se filtraron de forma estéril y se diluyeron hasta 2,0 mg/ml, y a continuación se almacenaron a 4ºC hasta su utilización. Los porcentajes de rendimiento para cada sublote fueron de entre el 27% y el 68% de recuperación de la IgM. La mayor parte de las pérdidas de IgM fueron debidas a la oligomerización de la misma, que se eluyó en el volumen muerto de la columna de exclusión por tamaño.
Se combinaron once sublotes de material para formar un único lote de IgM, que a continuación se filtró de forma estéril a través de un filtro de 0,22 Im y se introdujeron en cuatro viales estériles de 280 ml y veinte viales de 1 ml. La formulación del material en tampón de glicina 0,2 M, pH 4,2, dio lugar a un producto que demostró ser estable frente a la oligomerización a 4ºC durante 12 meses. La caracterización bioquímica del material se describe en la tabla 2.4.1.
Tabla 1 - Caracterización de la IgM purificada.
- Prueba
- Método Especificación Resultados del ensayo
- Proteína total
- A280/ml 1,5-2,5 mg/ml 1,6 mg/ml
- % de oligómero
- SEC-HPLC NMT 5 % <1,0%
- % de IgA
- Inmunonefelometría NMT 5% 1,60%
- IgG
- Inmunonefelometría 0,03 mg/ml
- IgM
- Inmunonefelometría 2,51 mg/ml
- CH50
- 100 CH50 <75 unidades 43
- Isoaglutinina
- Prueba de isoaglutinación cruzada Negativo a 1:64 a 50 mg/ml Negativo a 1:4
- Endotoxina
- LAL <0,3 UE/ml <0,06 UE/ml
- pH
- Sin diluir 4,0-4,4 4,24
- Pureza
- Gel de SDS-PAGE reductora 91%
- % de proteína
- Biuret 1-2 mg/ml 2,20 mg/ml
La proteína total se calculó utilizando el coeficiente de extinción específica publicado (£1% 280), de 13,3. El análisis de aminoácidos (Commonwealth Biotechnologies, Richmond, Virginia) de esta preparación de IgM dio un coeficiente de extinción específica de 13,4. El porcentaje de oligómeros se determinó mediante una columna 10/30 SUPEROSE
6 PHARMACIA HR y se define como el porcentaje de área a los 15,7 minutos dividido por el área total del cromatograma. Las muestras que se sometieron a la prueba de isoaglutinación cruzada se concentraron hasta 50 mg/ml tras ajustar el pH a 7,5 con 10 x PBS. La purificación mediante SDS-PAGE reducida se define por un procedimiento de dos etapas. En primer lugar, se determina el contenido de la única banda X sin identificar en el gel; éste indica el porcentaje total de inmunoglobulinas presentes en la preparación. En la segunda etapa, se determina el contenido de IgA e IgG mediante la medición de la intensidad de las bandas de cadena pesada de las tres inmunoglobulinas. De este modo, la pureza de la IgM es igual a 100% - % de banda X - % de IgA - % de IgG.
Se puso de manifiesto que la IgM tiende a formar oligómeros estables en un proceso dependiente del tiempo y la concentración. Por consiguiente, la estrategia de purificación incluyó medidas destinadas a minimizar la oligomerización de la IgM, tales como el procesamiento a pH bajo, el mantenimiento de las preparaciones de IgM a baja concentración y la reducción al mínimo de la exposición de la IgM a concentraciones salinas elevadas. Las preparaciones finales de IgM se formularon en una solución de glicina 0,2 M (pH 4,2) a fin de evitar la formación de oligómeros; en esta formulación, la IgM es estable y adecuada para utilizarse en inyecciones.
Para los experimentos que implican fragmentos de IgM, los mismos se prepararon mediante un kit de fragmentación de IgM disponible en el mercado (Pierce No. de catálogo 4887). Este kit es capaz de fragmentar la IgM por tres métodos (véase la figura 6). Se utilizó la alquilación y reducción de la IgM con 2-mercaptoetilamina y yodoacetamida para generar derivados útiles de la IgM. Las IgM derivadas se analizaron en un ensayo PAGE con tris-acetato al 38% (véase figura 7). Se observaron cuatro fragmentos principales de IgM correspondientes a los pesos moleculares esperados para la IgM monomérica (~200 kDa) y la mitad de la IgM monomérica (~100 kDa). Los fragmentos generados durante un tratamiento con 2-mercaptoetilamina (MEA) de la IgM se compararon con la IgM sin tratar en una prueba en gel de tris-acetato al 3-8% durante 90 minutos a 150 voltios. El gel se tiñó con Coomassie y se escaneó con el software QUANTITY ONE. La figura 6 ilustra los resultados del proceso de fragmentación de la IgM con MEA junto con los resultados obtenidos por otros métodos. La figura 7 muestra los resultados de la electroforesis en gel de la IgM y la IgM tratada con MEA (que muestran especies de fragmentos que corresponden a fragmentos de tipo “IgG” y “r IgG”, ilustrados en la figura 6).
Ejemplos 2-10 - Ensayos de unión
En los siguientes ejemplos 2 a 10, siguiendo los experimentos indicados, se lavaron placas 6 veces con tampón de lavado (tris-solución salina tamponada con monolaurato de sorbitán polioxietilenado 0,1% y azida de sodio 0,01%). Se añadieron 100 Il de un anticuerpo anti-IgM humana de cabra conjugado con peroxidasa de rábano (con especificidad por la región Fc5I) a cada pocillo y la placa se incubó durante 1 hora a 25ºC con agitación suave. A continuación, la placa se lavó 3 veces con tampón de lavado y se reveló con 100 Il de sustrato de peroxidasa de micropocillo TMB (KPL No. de catálogo 50-76-00) durante 5 minutos a temperatura ambiente. A continuación se detuvo la reacción con 100 Il de ácido fosfórico 1 M y la placa se leyó a 450 nm en un lector de placas SPECTRAMAX 190 con una interfaz informática que utiliza el software SOFTMAX PRO 4.0.
Ejemplo 2 - Unión de la IgM a A 1-42 de tamaño completo, A 22-35 e inhibidor de la proteasa a1
Se recubrió de forma pasiva una placa de microtitulación de 96 pocillos Nunc MAXISORP con 100 Il de A 1-42, A 22-35 y una proteína no relacionada (inhibidor de la proteasa a-1, a1PI) a una concentración de 2 Ig/ml durante 1 hora a 25ºC con agitación suave. Las dos últimas filas de la placa se recubrieron con 100 Il de PIERCE SUPERBLOCK para utilizarlas como control negativo (inespecífico). Tras el procedimiento de recubrimiento, la placa se lavó dos veces con 300 Il de tampón de lavado. La placa se bloqueó con 100 Il de SUPERBLOCK durante 1 hora a 25ºC con agitación suave y se lavó dos veces con tampón de lavado. Se añadieron a la placa 100 Il de IgM diluida en serie en SUPERBLOCK y ésta se incubó durante 2 horas a 25ºC con agitación suave. Los resultados se muestran en la figura 2.
Ejemplo 3 - Inmunodepleción de IgM por A 1-42
Se recubrió de forma pasiva una placa de microtitulación de 96 pocillos NUNC MAXISORP con 100 Il de A 1-42y a1Pl 2 Ig/ml durante 1 hora a 25ºC con agitación suave. Tras el procedimiento de recubrimiento, la placa se lavó dos veces con tampón de lavado. La placa se bloqueó con 100 Il de SUPERBLOCK durante 1 hora a 25ºC con agitación suave y se lavó dos veces con tampón de lavado. Previamente se incubaron 0,2 miligramos de IgM con una columna de purificación por afinidad sin acoplar y acoplada a A 1-42 durante una noche a 4ºC con agitación suave. El material de IgM desprovisto de proteínas (fracción no retenida) se diluyó en serie en SUPERBLOCK y se incubó durante 2 horas a 25ºC con agitación suave. Los resultados se muestran en la figura 3.
Ejemplo 4 - Inhibición de la unión de la IgM a A mediante péptidos relacionados y no relacionados con A
Se recubrieron de forma pasiva dos placas de microtitulación de 96 pocillos NUNC MAXISORP con 100 Il de A 142 2 Ig/ml durante 1 hora a 25ºC con agitación suave. Tras el procedimiento de recubrimiento, las placas se lavaron dos veces con tampón de lavado. Las placas se bloquearon con 100 Il de SUPERBLOCK durante 1 hora a 25ºC con agitación suave y se lavaron dos veces con tampón de lavado. 100 Il de péptidos A (A 1-28, A 22-35, A 25
35, A 1-40 y A 1-42) y a1PI se diluyeron en serie SUPERBLOCK con IgM 0,1 mg/ml, se introdujeron en las placas y se incubaron durante 2 horas a 25ºC con agitación suave. Además, se introdujeron 100 Il de IgM diluida en serie en SUPERBLOCK a las dos filas superiores de cada placa. Los resultados se muestran en las figuras 4A y 4B.
Ejemplo 5 - Inhibición de la unión de la IgM a A 1-42 por GAMUNEX competitivo
Se recubrió de forma pasiva una placa de microtitulación de 96 pocillos NUNC MAXISORP con 100 Il de A 1-42 2 Ig/ml durante 1 hora a 25ºC con agitación suave. Tras el procedimiento de recubrimiento, la placa se lavó dos veces con tampón de lavado. La placa se bloqueó con 100 Il de SUPERBLOCK durante 1 hora a 25ºC con agitación suave y se lavó dos veces con tampón de lavado. Se añadieron a la placa 100 Il de GAMUNEX diluido en serie en SUPERBLOCK con IgM 0,1 mg/ml y ésta se incubó durante 2 horas a 25ºC con agitación suave. También se añadieron a la placa 100 Il de IgM y GAMUNEX, diluidos en serie en SUPERBLOCK, que sirvieron como controles positivos y negativos. Los resultados se muestran en la figura 5.
Ejemplo 6 - Unión de A 1-42 por parte de IgM fragmentada con MEA
Se recubrió de forma pasiva una placa de microtitulación de 96 pocillos NUNC MAXISORP con 100 Il de A 1-42y a1Pl 2 Ig/ml durante 1 hora a 25ºC con agitación suave. Tras el procedimiento de recubrimiento, la placa se lavó dos veces con tampón de lavado. La placa se bloqueó con 100 Il de SUPERBLOCK durante 1 hora a 25ºC con agitación suave y se lavó dos veces con tampón de lavado. Se añadieron a la placa 100 Il de IgM e IgM tratada con 2-mercaptoetilamina, diluidas en serie en SUPERBLOCK, y ésta se incubó durante 2 horas a 25ºC con agitación suave. Los resultados se muestran en la figura 8.
Ejemplo 7 - Unión de la IgM a placas recubiertas con A 1-40, A 1-42, A 1-43 y a1Pl
Se recubrió de forma pasiva una placa de microtitulación de 96 pocillos NUNC MAXISORP con 100 Il de A 1-40, A 1-42, A 1-43 y a1Pl (control negativo) a una concentración de 2 Ig/ml durante 1 hora a 25ºC con agitación suave. Tras el procedimiento de recubrimiento, la placa se lavó dos veces con tampón de lavado. La placa se bloqueó con 100 Il de SUPERBLOCK durante 1 hora a 25ºC con agitación suave y se lavó dos veces con tampón de lavado. Se añadieron a la placa 100 Il de IgM diluida en serie en SUPERBLOCK y ésta se incubó durante 2 horas a 25ºC con agitación suave.
En la muestra de IgM, se puso de manifiesto un título muy parecido de actividad de unión específica a A 1-42 y A 1-43. Dicho título es aproximadamente 10 veces mayor que el título en el caso de A 1-40. Los datos demuestran que la mayor parte del título anti-A de la muestra de IgM se dirige al extremo carboxiterminal de A . Por lo tanto, los aminoácidos 41 y 42 parecen ser necesarios para la unión a la IgM. Véase la figura 9.
Ejemplo 8 - Unión de la IgM a placas recubiertas con A 1-40, A 1-42, A 1-43 y a1PI
Se recubrió de forma pasiva una placa de microtitulación de 96 pocillos NUNC MAXISORP con 100 Il de A 1-42 2 Ig/ml durante 1 hora a 25ºC con agitación suave. Tras el procedimiento de recubrimiento, la placa se lavó dos veces con tampón de lavado. La placa se bloqueó con 100 Il de SUPERBLOCK durante 1 hora a 25ºC con agitación suave y se lavó dos veces con tampón de lavado. se inocularon soluciones 0,1 mg/ml de A 1-40, A 1-42 y A 1-43 con IgM 7 mg/ml para obtener una concentración final de IgM de 0,07 mg/ml. A continuación, las soluciones se diluyeron en serie en IgM 0,07 mg/ml, se añadieron 100 Il a la placa y ésta se incubó durante 2 horas a 25ºC con agitación suave. A continuación, la placa se lavó 6 veces con tampón de lavado. Se añadieron 100 Il de anticuerpo anti-IgM humana de cabra conjugado con peroxidasa de rábano a cada pocillo y la placa se incubó durante 1 hora a 25ºC con agitación suave.
Los datos demuestran que A 1-42 y A 1-43 inhiben completamente la unión de la IgM a placas recubiertas con A 1-42. A 1-40, incluso a concentraciones 10 veces mayores que A 1-42 y A 1-43, sólo inhibe aproximadamente el 50% de la unión de la IgM a placas recubiertas con A 1-42. De nuevo, este experimento indica la importancia del extremo carboxiterminal del amiloide (aminoácidos 41 y 42) para la unión a la IgM. Véase la figura 10.
Ejemplo 9 - Unión a A 1-42 - Competencia entre A 1-40, A 1-42, A 33-42 y A 37-42
Se recubrió de forma pasiva una placa de microtitulación de 96 pocillos NUNC MAXISORP con 100 Il de A 1-42 2 Ig/ml durante 1 hora a 25ºC con agitación suave. Tras el procedimiento de recubrimiento, la placa se lavó dos veces con tampón de lavado. La placa se bloqueó con 100 Il de SUPERBLOCK durante 1 hora a 25ºC con agitación suave y se lavó dos veces con tampón de lavado. se inóculo una solución 0,5 mg/ml de A 37-42 y soluciones 0,1 mg/ml de A 1-40, A 1-42 y A 33-42 con IgM 7 mg/ml para obtener una concentración final de IgM de 0,07 mg/ml. A continuación, las soluciones se diluyeron en serie en IgM 0,07 mg/ml, se añadieron 100 Il a la placa y ésta se incubó durante 2 horas a 25ºC con agitación suave.
A 1-42 es capaz de inhibir completamente la unión de la IgM a placas recubiertas con A 1-42. Los péptidos fragmentados de amiloide no muestran más inhibición que A 1-40. Estos datos demuestran que, además de los
aminoácidos 41 y 42, parece que es necesaria la presencia de un péptido con más de 10 aminoácidos, posiblemente con una estructura terciaria, para inhibir la unión de la IgM a placas recubiertas con A 1-42. Véase la figura 11.
Ejemplo 10 - Unión a A 1-42 - Competencia entre A 1-42 y A 1-42 revuelto
Se recubrió de forma pasiva una placa de microtitulación de 96 pocillos NUNC MAXISORP con 100 Il de A 1-42 2 Ig/ml durante 1 hora a 25ºC con agitación suave. Tras el procedimiento de recubrimiento, la placa se lavó dos veces con tampón de lavado. La placa se bloqueó con 100 Il de SUPERBLOCK durante 1 hora a 25ºC con agitación suave y se lavó dos veces con tampón de lavado. Se inocularon soluciones 0,1 mg/ml de A 1-42 y A 1-42 revuelto con IgM 7 mg/ml para obtener una concentración final de IgM de 0,07 mg/ml. A continuación, las soluciones se diluyeron en serie en IgM 0,07 mg/ml, se añadieron 100 Il a la placa y ésta se incubó durante 2 horas a 25ºC con agitación suave.
Los datos demuestran que la especificidad del título de IgM es para con A 1-42, y no para con un péptido del mismo tamaño que contiene los mismos 42 aminoácidos. Véase la figura 12.
Ejemplo 11 - Unión de IgM, IgM monomérica e IgG a A 1-42
El sistema OCTET (ForteBio, Inc., Menlo Park, California) utiliza la tecnología Bio-Layer Interferometry (BLI) para medir la concentración, la afinidad y las características cinéticas entre dos proteínas o péptidos. La BLI detecta cambios en el patrón de interferencia (luz reflejada) como el número de moléculas que aumenta o disminuye en la punta del detector.
En primer lugar, se colocaron biosensores recubiertos con estreptavidina en pocillos que contenían PBS para equilibrar los detectores. A continuación, los biosensores se colocaron en pocillos que contenían A 1-42 biotinilado 2 Ig/ml y luego se trasladaron a pocillos que contenían PBS, de modo que se pudo generar un perfil de interferencia de fondo. A continuación, estos biosensores se trasladaron a pocillos que contenían muestra de IgM, muestra de IgM monomérica o muestra de IgG (GAMUNEX), y se determinaron las velocidades de asociación. Por último, los biosensores se trasladaron a pocillos que contenían PBS a fin de medir las velocidades de disociación.
Los datos generados a partir de este experimento demostraron que la muestra de IgM y la muestra de IgM monomérica tienen, como mínimo, una afinidad 5 veces mayor por A 1-42 biotinilado que la muestra de IgG (GAMUNEX).
Ejemplo 12 - Modelo de EA de ratón transgénico
El ratón B6;SJL-Tg(APPSWE)2576Kha o “Tg2576” expresa una forma mutada del gen APP695 humano promovida por un promotor del gen de la proteína priónica de hámster (véase la patente de EE.UU. 5.877.399.). Estos ratones tienen una memoria de referencia espacial normal a los tres meses de edad, pero muestran deterioro a una edad de entre 9 y 10 meses (Hsiao y otros, “Correlative memory deficits, A elevation, and amyloid plaques in transgenic mice”, Science 274: 99-102 (1996)). El contenido de APP transgénico en el cerebro es 5,6 veces mayor que el de APP endógeno. Este aumento va acompañado de la aparición de determinados déficits de comportamiento. Se observa la presencia de numerosas placas de A que se tiñen con rojo Congo, con niveles elevados de A soluble. Las placas de amiloide parecen estimular una respuesta inflamatoria celular. Rodean las placas tanto astrocitos hipertróficos como microglia activada (Irizarry, M., “APPsw transgenic mice develop age-related A deposits and neuropil abnormalities, but no neuronal loss in CA1”, J. Neuropathol. Exp. Neurol. 56:965-73 (1997); Frautschy, S.A. y otros, “The microglial response to amyloid plaques in APPsw transgenic mice”, Am. J. Pathol. 152: 307-17 (1998)), y aparece angiopatía amiloidea en algunos vasos (Klunk, W. y otros, “Staining of AD and Tg2576 mouse brain with X-34, a highly fluorescent derivative of chrysamine G and a potential in vivo probe for b-sheet fibrils”, Soc. Neurosci. Abstr 23:1638 (1997)). Además, se inducen marcadores clave de estrés oxidativo en el cerebro de ratón Tg2576 (Pappolla, M.A. y otros, “Evidence of oxidative stress and in vivo neurotoxicity of -amyloid in a transgenic mouse model of Alzheimer’s disease”, Am. J. Pathol. 152:871-7 (1998)), de modo parecido a lo que se observa en el cerebro de los pacientes de Alzheimer al realizarles una autopsia.
Del modo habitual, se reciben 14 hembras embarazadas (de 10 a 15 días de gestación) de ratón Tg2576 y 4 hembras embarazadas de ratón de tipo natural (Taconic Farms, Inc., Germantown, Nueva York). Los ratones (crías) se asignan aleatoriamente a grupos de tratamiento del modo siguiente (tabla 2).
Tabla 2. Número aproximado de ratones por tratamiento.
- Cepa
- Núm. / tratamiento Solución salina hIgM
- Tg2576
- 26 8 32
- Tipo natural
- 8 8 8
A las 24 horas del nacimiento, las crías tratadas reciben inyecciones intraperitoneales de solución salina normal estéril (50 Il) o de IgM humana (hIgM) (50 Il de 20 Ig/Il). A continuación, se inyecta a los ratones solución salina o 5
hIgM de acuerdo con el siguiente esquema (tabla 3, véase Khole, V. y otros, “Identification of epididymis specific antigen by neonatal tolerization”, Am. J. Repro. Immunol. 44:350-356 (2000)).
Tabla 3. Pauta de vacunación de tolerancia neonatal
Día 1 Día 5 Día 21 Día 35 Día 49
Víac i. p. i. p. s. c. s. c. s. c.
Concentración 20 Ig/Il 20 Ig/Il 100 Ig/Il 100 Ig/Il 100 Ig/Il
Volumen 50 Il 50 Il 100 Ila 100 Ila 100 Ila
Adyuvanteb No No Sí Sí Sí
a Múltiples sitios.
b TITERMAX® Gold (CytRx Corporation, Parkway Technology Park, Georgia).
c Las inyecciones se llevan a cabo con una aguja de calibre 27, 1/2 pulgada.
La semivida de la IgM humana polirreactiva (hIgM) en ratones es de 8,0 horas (Sigounas, G. y otros, “Half-life of polyreactive antibodies”, J. Clin. Immunol., 14:134-140 (1994)). Por consiguiente, estos anticuerpos se eliminan de la circulación al cabo de 56 horas (7 semividas). A partir de los 6 meses de edad, los ratones reciben 100 Il (400 mg/kg) de hIgM sin adyuvante, por vía subcutánea, el martes y el viernes de cada semana (Dodel, R.C. y otros, “Intravenous immunoglobulins containing antibodies against -amyloid for the treatment of Alzheimer’s disease”, J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 75:1472-4 (2004)). El tratamiento con anticuerpos prosigue hasta la terminación del estudio.
Se toman muestras de los ratones en el día 56 para determinar los anticuerpos a la hIgM. Se obtienen no más de 50 Il de sangre completa por incisión superficial de la vena safena lateral con una hoja de bisturí estéril del número 15. Se aplica presión manual para alcanzar la hemostasia antes de devolver los ratones a las jaulas. Las muestras se centrifugan a temperatura ambiente a fin de separar los glóbulos sanguíneos del plasma. El plasma se recoge y se congela inmediatamente a -80ºC hasta su análisis.
Los ratones se sacrifican sin sufrimiento con CO2 gaseoso a los 12-15 meses de edad; o, si parecen moribundos, antes de esta edad. La sangre se obtiene a través de la vena cava caudal después de la eutanasia. Tras recoger los cerebros, la mitad se somete a congelación rápida para el análisis de péptido A soluble y la otra mitad se introduce en solución de formalina neutra tamponada al 10% para su tinción inmunohistoquímica y su análisis histopatológico. Las placas teñidas se cuentan y se cuantifica el péptido A soluble en el cerebro y el plasma. Los datos se analizan para comprobar la normalidad y la igualdad de varianzas. Se aplica una prueba de la t para determinar las diferencias entre los ratones tratados y los no tratados. Los grupos se consideran diferentes si el valor de P <0,05.
A la vista todo lo anterior, será evidente que la presente memoria da a conocer diversos usos. Por ejemplo, la presente memoria da a conocer la utilización de cualquiera de las preparaciones de inmunoglobulina que se une a A descritas en el presente documento en el tratamiento o la profilaxis de una enfermedad amiloidogénica, o en la fabricación de un medicamento para su utilización en los mismos.
Claims (8)
- REIVINDICACIONES1. Preparación de inmunoglobulina producida a partir de muestras combinadas de plasma humano como material de partida, en la que la preparación de inmunoglobulina está enriquecida en inmunoglobulina M (IgM), para su5 utilización en un método de tratamiento o prevención de una enfermedad neurodegenerativa asociada con amiloide, en la que la preparación de inmunoglobulina comprende anticuerpos IgM que se unen específicamente a A 1-42.
-
- 2.
- Utilización de muestras combinadas de plasma humano como material de partida en la fabricación de una preparación de inmunoglobulina enriquecida en inmunoglobulina M (IgM), para el tratamiento o prevención de una enfermedad neurodegenerativa asociada con amiloide, en la que la preparación de inmunoglobulina comprende anticuerpos IgM que se unen específicamente a A 1-42.
-
- 3.
- Preparación para su utilización según la reivindicación 1, o utilización según la reivindicación 2, en la que la
preparación de inmunoglobulina comprende, como mínimo, aproximadamente el 80% de IgM o, como mínimo, 15 aproximadamente el 90% de IgM. -
- 4.
- Preparación para su utilización según las reivindicaciones 1 ó 3, o utilización según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3, en la que la enfermedad es la enfermedad de Alzheimer.
-
- 5.
- Preparación para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 ó 4, o utilización según cualquiera de las reivindicaciones 2, 3 ó 4, en la que la preparación de inmunoglobulina se administra en una dosis de inmunoglobulina comprendida entre aproximadamente 0,1 Ig por kg de peso corporal y aproximadamente 1.000 mg por kg de peso corporal.
25 6. Preparación para su utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 4 ó 5, o utilización según cualquiera de las reivindicaciones 2, 3, 4 ó 5, en la que la preparación de inmunoglobulina se administra en una dosis comprendida entre aproximadamente 0,5 Ig por kg de peso corporal y aproximadamente 500 mg por kg de peso corporal; entre aproximadamente 0,5 Ig por kg de peso corporal y aproximadamente 100 mg por kg de peso corporal; o entre aproximadamente 0,5 Ig por kg de peso corporal y aproximadamente 50 mg por kg de peso corporal. - 7. Composición farmacéutica, que comprende moléculas de inmunoglobulina M (IgM) que se unen específicamente a A 1-42, para su utilización en un método de tratamiento o prevención de una enfermedad neurodegenerativa asociada con amiloide, en la que la IgM se puede obtener a partir de material de partida, que comprende35 inmunoglobulinas y otras sustancias, del siguiente modo:a) ajustando el pH del material de partida a fin de obtener una solución intermedia que comprende inmunoglobulinas disueltas,b) ajustando la solución intermedia de la etapa a) a unas condiciones de pH, temperatura y concentración de caprilato que hacen que se forme un primer precipitado y un primer sobrenadante que comprende inmunoglobulinas,c) separando el primer sobrenadante del primer precipitado,45 d) incubando el primer sobrenadante en unas condiciones de tiempo, pH, temperatura y concentración de caprilato que hacen que se forme un segundo precipitado y un segundo sobrenadante que comprende inmunoglobulinas,e) separando el segundo sobrenadante del segundo precipitado,f) poniendo en contacto el segundo sobrenadante con una primera resina de intercambio aniónico en unas condiciones de pH y fuerza iónica que hacen que sustancialmente nada de la inmunoglobulina G o la inmunoglobulina M se una a la primera resina, mientras que la inmunoglobulina A y otras sustancias se unan a55 la misma,g) separando una fracción que contiene sustancialmente toda la inmunoglobulina G y la inmunoglobulina M a partir del resultado de la etapa anterior,h) poniendo en contacto las inmunoglobulinas G y M con una segunda resina de intercambio aniónico en unas condiciones de pH y fuerza iónica que hacen que sustancialmente nada de la inmunoglobulina G se una a la segunda resina, mientras que la inmunoglobulina M y otras sustancias se unan a la misma,i) eluyendo la IgM a partir de la segunda columna de resina de intercambio iónico con una solución tamponada65 que tiene una conductividad parecida a la que presenta una solución de cloruro de sodio con una concentración, como mínimo, de 100 mM,j) aplicando la IgM a una resina de filtración en gel y recuperar la IgM,k) aplicando la IgM a una resina de afinidad que comprende antígenos A y B inmovilizados, y 5 l) recuperando la IgM.
- 8. Composición farmacéutica para su utilización según la reivindicación 7, en la que el material de partida se obtienea partir de hemoderivados humanos combinados. 10
- 9. Composición farmacéutica para su utilización según la reivindicación 7 u 8, en la que los hemoderivados humanos combinados se obtienen de donantes que no han sido seleccionados para determinar su título de inmunoglobulina anti-A .
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