ES2281135T3 - Proteinas hibridas de un toxoide tetanico que migran de forma retrograda y transinaptica al snc. - Google Patents
Proteinas hibridas de un toxoide tetanico que migran de forma retrograda y transinaptica al snc. Download PDFInfo
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Abstract
Un fragmento recombinante no tóxico de la toxina tetánica, que es un fragmento recombinante de la toxina tetánica que comprende el fragmento C, más 11 aminoácidos de la cadena pesada que preceden inmediatamente al extremo amino del fragmento C.
Description
Proteínas híbridas de un toxoide tetánico que
migran de forma retrógrada y transináptica al SNC.
Esta invención se refiere al uso de una parte de
la toxina tetánica para el suministro de una composición al sistema
nervioso central de un ser humano o un animal. La invención también
se refiere a un fragmento híbrido de la toxina tetánica, a un
polinucleótido que híbrida con la toxina tetánica natural y a una
composición que contiene el fragmento de la toxina tetánica como
una molécula activa. Además, esta invención se refiere a un vector
que comprende un promotor y una secuencia de ácido nucleico que
codifica el fragmento de la toxina tetánica.
La toxina tetánica es producida por
Clostridium tetani como una única cadena polipeptídica
inactiva de 150 kD, compuesta por tres dominios de 50 kD conectados
por lazos sensibles a proteasas. La toxina se activa por escisión
proteolítica selectiva, la cual genera dos cadenas ligadas por
puentes disulfuro: L (ligera, 50 kD) y H (pesada, 100 kD)
[Montecucco C. y Schiavo G. Q. Rev. Biophys., (1995),
28:423-472].
Las pruebas del transporte axonal retrógrado de
la toxina tetánica al sistema nervioso central (SNC) han sido
descritas por Erdmann y col. [Naunyn Schmiedebergs Arch.
Pharmacol., (1975), 290:357-373], Price y col.,
[Sciende, (1975), 188:945-94] y Stoeckel y col.
[Brain Res., (1975), 99:1-16]. En cada uno de estos
estudios se encontró toxina marcada radiactivamente en el interior
de vesículas unidas a la membrana. Otra propiedad fue el movimiento
transináptico de la toxina tetánica, que fue primeramente demostrado
por localización autorradiográfica de la toxina tetánica marcada
con ^{125}I en interneuronas de la médula espinal después de su
inyección en un músculo [Schwab y Thoenen, Brain Res., (1976),
105:218-227].
La estructura de esta toxina tetánica ha sido
esclarecida por Helting y col. [J. Biol. Chem., (1977),
252:187-193]. La papaína escinde la toxina tetánica
en dos fragmentos:
- la parte C-terminal de la
cadena pesada, 451 aminoácidos, también denominada fragmento C;
y
- la otra parte contenía la porción
complementaria denominada fragmento B, ligada a la cadena ligera
(fragmento A) mediante un puente disulfuro.
La patente europea n° EP 0030496 B1 mostró el
transporte retrógrado de un fragmento B-II_{b} al
SNC que se detectó después de su inyección en el músculo medio del
ojo en neuronas de primer y segundo orden. Este fragmento puede
constar de "isofragmentos" obtenidos por proteolisis
clostrídica. Posteriormente, se demostró que este fragmento
B-II_{b} era idéntico al fragmento C obtenido por
digestión con papaína por Eisel y col. [EMBO J., 1986,
5:2495-2502].
Esta patente EP demostró también el transporte
retrógrado de un conjugado que constaba de un fragmento I_{bc} de
la toxina tetánica acoplado por un puente disulfuro a
B-II_{b}, desde los extremos axonales dentro del
músculo a los pericariones motoneuronales y a los espacios
pericelulares. (El fragmento I_{bc} corresponde a la otra parte
obtenida por digestión con papaína como se ha descrito
anteriormente por Helting y col.). No hay pruebas de que este
conjugado se haya encontrado en neuronas de segundo orden. Los
autores indicaron que un conjugado que constaba del fragmento
B-II_{b} acoplado por un puente disulfuro a un
agente terapéutico fue capaz de una fijación específica a
gangliósidos y a membranas sinápticas. Ningún resultado mostró un
transporte axonal retrógrado o un transporte transináptico para tal
conjugado.
Otra patente europea, la n° EP 0057140 B1,
mostró igualmente el transporte retrógrado de un fragmento II_{c}
al SNC. Como en la patente europea n° EP 0030496 B1, los autores
indicaron que un conjugado que constaba del fragmento II_{c} y un
agente terapéutico fue capaz de una fijación específica, pero tal
afirmación no se ilustró con ningún resultado. Este fragmento
II_{c} corresponde al fragmento ahora denominado C obtenido en la
digestión con papaína.
Francis y col. [J. Biol. Chem., (1995),
270(25):15434-15442] acaban de llevar a cabo
un estudio in vitro que muestra la internalización por
neuronas de híbridos entre SOD-1
(superoxidodismutasa de Cu y Zn) y un fragmento C recombinante de
la toxina tetánica por recombinación genética. Este fragmento útil
para desencadenar una respuesta inmunitaria en el paciente o animal
afectado por una enfermedad del SNC, lo que comprende la
administración de una composición de la invención al paciente o al
animal.
Además, esta invención proporciona fragmentos
polinucleotídicos variantes capaces de hibridar en condiciones
restrictivas con la secuencia de la toxina tetánica natural. Las
condiciones restrictivas son, por ejemplo, las siguientes: a 42°C
durante 4 ó 6 horas en presencia de tampón SSC 6x, disolución de
Denhardt 1x, 1% de SDS y 250 \mug/ml de ARNt. (SSC 1x corresponde
a NaCl 0,15 M y citrato sódico 0,05 M; disolución de Denhardt 1x
corresponde al 0,02% de Ficoll, 0,02% de polivinilpirrolidona y
0,02% de albúmina de suero bovino). Las dos etapas de lavado se
realizan a temperatura ambiente en presencia de SCC 0,1x y el 0,1%
de SDS.
Un fragmento polinucleotídico variante significa
un polinucleótido que codifica una secuencia de la toxina tetánica
derivada de la secuencia de la toxina tetánica nativa y que tiene
las mismas propiedades de transporte.
Adicionalmente, la invención proporciona un
vector que comprende un promotor capaz de expresarse en células
musculares y, opcionalmente, un potenciador, una secuencia de ácido
nucleico que codifica el fragmento de la toxina tetánica de la
invención o un fragmento aminoacídico variante de la invención
asociado con un polinucleótido que codifica una proteína o un
polipéptido de interés. En una realización preferida de la invención
el promotor puede ser el promotor de CMV y, preferentemente, el
promotor de CMV contenido en pcDNA 3.1 (Invitrogen, referencia
V790-20) o el promotor de actina como se describe
en Bronson S.V. y col. (PNAS, (1996),
93:9067-9072).
Adicionalmente, la invención proporciona un
vector que comprende un promotor capaz de expresarse en células
neuronales o en precursores (como las células precursoras NT2 (hNT)
de Stratagene, referencia n° 204101) y, opcionalmente, un
potenciador, una secuencia de ácido nucleico que codifica el
fragmento de la toxina tetánica de la invención o un fragmento
aminoacídico variante de la invención asociado con un
polinucleótido que codifica una proteína o un polipéptido de
interés. En una realización preferida de la invención el promotor
puede ser el de actina (véase la referencia anterior) Estos
vectores son útiles para el tratamiento de un paciente o un animal
afectado por una enfermedad del SNC, lo que comprende la
administración del vector de la invención al paciente o al animal.
Adicionalmente, estos vectores son útiles para desencadenar
respuestas inmunitarias en el paciente o el
animal.
animal.
Una ventaja de la presente invención, que
comprende el fragmento de la toxina tetánica, es obtener un mejor
transporte del fragmento dentro del organismo, en comparación con
el fragmento C. Otra ventaja de la composición de la invención es
obtener una secuencia de aminoácidos bien definida y no una
composición multimérica. Por tanto, es posible manipular fácilmente
esta composición en la terapia génica.
Esta invención se describirá con más detalle con
referencia a los dibujos, en los cuales:
La figura 1 muestra la secuencia de ADN y la
secuencia de aminoácidos del fragmento TTC clonado en pBS:TTC.
La figura 2 muestra los detalles de la
construcción pBS:TTC.
El ADNc de TTC se aisló de una cepa de
Clostridium tetani usando la reacción en cadena de la
polimerasa. Se usaron tres reacciones de PCR para generar tres
fragmentos solapantes, respectivamente de 465 pb (PCR1; cebador 1:
5'-CCCCCCGGGCCACCATGGTTTTTTCAACACCAATTCCATTTTCTTATTC-3'
y cebador 2: 5'-CTAAACCAG
TAATTTCTG-3'), de 648 pb (PCR2; cebador 3: 5'-AATTATGGACTTTAAAAGATTCCGC-3' y cebador 4: 5'-GG
CATTATAACCTACTCTTAGAAT-3') y de 338 pb (PCR3; cebador 5: 5'-AATGCCTTTAATAATCTTGATAGAAAT-3' y cebador 6: 5'-CCCCCCGGGCATATGTCATGAACATATCAATCTGTTTAATC-3'), y los fragmentos se clonaron secuencialmente en pBluescript KS+ para producir el plásmido pBS-TTC. El cebador 1 secuencia arriba contenía el sitio de unión a ribosomas (RBS) y señales de iniciación de la traducción.
TAATTTCTG-3'), de 648 pb (PCR2; cebador 3: 5'-AATTATGGACTTTAAAAGATTCCGC-3' y cebador 4: 5'-GG
CATTATAACCTACTCTTAGAAT-3') y de 338 pb (PCR3; cebador 5: 5'-AATGCCTTTAATAATCTTGATAGAAAT-3' y cebador 6: 5'-CCCCCCGGGCATATGTCATGAACATATCAATCTGTTTAATC-3'), y los fragmentos se clonaron secuencialmente en pBluescript KS+ para producir el plásmido pBS-TTC. El cebador 1 secuencia arriba contenía el sitio de unión a ribosomas (RBS) y señales de iniciación de la traducción.
La figura 3 representa la construcción
pGEX:lacZ-TTC.
La figura 4 muestra la construcción
pGEX:TTC-lacZ.
La figura 5 representa los detalles de la
construcción pCMV:lacZ-TTC
La toxina tetánica es una potente neurotoxina de
1315 aminoácidos, producida por Clostridium tetani (1, 2).
Evita la liberación de neurotransmisores inhibidores desde las
interneuronas de la médula espinal mediante un mecanismo específico
de intoxicación celular (para una revisión véase la referencia 3).
Se ha demostrado que este mecanismo patológico implica el
transporte axonal y transináptico de la toxina tetánica. La toxina
es absorbida por los extremos de los nervios en la unión
neuromuscular, pero no actúa en este punto; más bien, la toxina se
transporta a un compartimento vesicular y viaja a lo largo de los
axones motores a una distancia considerable hasta alcanzar sus
dianas. El movimiento transináptico de la toxina tetánica se
demostró primeramente mediante su localización autorradiográfica en
las interneuronas de la médula espinal después de su inyección en
un músculo (4). Sin embargo, los estudios previos del paso
transináptico de la toxina tetánica desde las motoneuronas
estuvieron limitados por el rápido desarrollo del tétanos clínico y
la muerte del animal de ensayo (4, 5, 6).
Se ha demostrado que un fragmento de la toxina
tetánica obtenido por digestión con proteasas, el fragmento C, es
transportado por las neuronas de forma similar a la de la toxina
nativa sin causar síntomas clínicos (7, 8, 9, 10). Se describió que
un fragmento C recombinante poseía las mismas propiedades que el
fragmento obtenido por digestión con proteasas (11). El hecho de
que un fragmento atóxico de la molécula de la toxina fuera capaz de
migrar de forma retrógrada dentro de los axones y de acumularse en
el SNC condujo a la especulación de que un fragmento tal podría
usarse como un vehículo neurotrófico (12). Un fragmento C conjugado
químicamente con diversas proteínas de gran tamaño fue absorbido
por neuronas en cultivo de tejidos (13) y por neuronas motoras en
modelos animales (referencias 12, 14 y 15). Según esta invención,
el fragmento de la toxina tetánica consta de un fragmento
proteolítico no tóxico de la toxina tetánica (TT) que comprende un
fragmento C más 11 aminoácidos de la cadena pesada que preceden
inmediatamente al extremo amino del fragmento C.
La molécula que tiene una función biológica se
selecciona del grupo constituido por proteínas de interés, por
ejemplo, para la compensación o la modulación de las funciones bajo
control de SNC o la médula espinal o la modulación de las funciones
en el SNC o la médula espinal, o proteínas de interés para ser
suministradas por un sistema de expresión de terapia génica al SNC
o la médula espinal. Las proteínas de interés son, por ejemplo, la
proteína SMN implicada en la atrofia muscular espinal (Lefebvre y
col., Cell (1995), 80:155-165 y Roy y col., Cell
(1955), 80:167-178); factores neurotróficos como
BDNF (factor neurotrófico derivado del cerebro);
NT-3 (neurotrofina-3);
NT-4/5; GDNF (factor neurotrófico derivado de líneas
celulares gliales); IGF (factor de crecimiento similar a la
insulina) (Oppenheim, Neuron, (1996), 17:195-197;
Thoenen y col., Exp. Neurol., (1993), 124:47-55 y
Henderson y col., Adv. Neurol., (1995), 68:235-240);
o PNI (proteasa nexina 1) que estimula el crecimiento de las
neuritas (este factor puede usarse para el tratamiento de la
enfermedad de Alzheimer (Houenou y col., PNAS, (1995),
92:895-899)); o SPI3, una proteína inhibidora de
proteasas de serina (Safaei, Dev. Brain Res., (1997),
100:5-12); o ICE (enzima transformadora de
interleucina 1) un factor implicado en la apoptosis, para inhibir la
apoptosis (Nagata, Cell (1997), 88:355-365); o
Bcl-2 un regulador intracelular clave de la muerte
celular programada (Jacobson, M.D., Current Biology, (1997),
7:R277-R281); o la proteína verde fluorescente
(Lang y col., Neuron, (1997), 18:857-863) como
marcador; enzimas (por ejemplo: -Gal); endonucleasas como
I-Scel (Choulika A., y col., Molecular and Cellular Biology,
(1995), 15(4):1968-1973); o CRE (Gu H., y
col., Science, (1994), 265:103-106); anticuerpos
específicos; fármacos dirigidos específicamente contra enfermedades
neurodegenerativas como la amiotrofia espinal lateral. Varias
moléculas pueden asociarse con un fragmento de TT.
En asociación significa una asociación obtenida
por recombinación genética. Esta asociación puede realizarse tanto
secuencia arriba como secuencia abajo del fragmento de TT. El modo
de realización preferido de la invención es secuencia arriba y se
describe en detalle; también se considera una realización secuencia
abajo. (A pesar de Halpern y col., J. Biol. Chem., (1993),
268(15):11188-11192, que indicaron que los
aminoácidos carboxiterminales contienen el dominio requerido para
la unión a gangliósidos purificados y a células neuronales).
C recombinante de la toxina tetánica fue
obtenido por el grupo de Halpern. (Véase referencia 11).
Además, Kuypers H.G.J.M. y Ugolini G. [TINS,
(1990), 13(2):71-5] indicaron en su
publicación sobre virus como trazadores transneuronales q e, a
pesar del hecho de que el fragmento de la toxina tetánica se une a
receptores específicos en las membranas neuronales, el marca
transneuronal es relativamente débil y puede detectarse sólo en
algunas de la neuronas conectadas sinápticamente.
A pesar de estos avances en la técnica, aún
existe una necesidad de, procedimientos para el suministro de
composiciones al sistema nervioso central humano o animal. También
existe en la técnica una necesidad de agentes biológicos que puedan
alcanzar este resultado.
Esta invención ayuda a satisfacer estas
necesidades de la técnica. Más especialmente, esta invención
proporciona un procedimiento para el suministro de una composición
deseada al sistema nervioso central (SNC) de mamíferos in
vivo, en el que la composición comprende un fragmento
proteolítico no tóxico de la toxina tetánica (TT) en asociación con
al menos una molécula con una función biológica. La composición es
capaz de un transporte retrógrado y de un transporte transináptico
in vivo al SNC y de ser suministrada a diferentes áreas del
SNC.
Esta invención proporciona también un fragmento
híbrido de la toxina tetánica, que comprende el fragmento C más 11
aminoácidos de la cadena pesada que preceden inmediatamente al
extremo amino del fragmento C, capaz de transferir in vivo
una proteína, un péptido o un polinucleótído a través de una unión
neuromuscular y al menos una sinapsis.
Además, esta invención proporciona una
composición que comprende una molécula activa en asociación con el
fragmento híbrido de la toxina tetánica (TT) o una variante del
mismo. La composición es útil para el tratamiento de un paciente o
un animal afectado por una enfermedad del SNC, lo que comprende la
administración de una composición de la invención al paciente o
animal. Adicionalmente, la composición de esta invención puede
ser
El área del SNC deseada significa, por ejemplo,
la lengua, que se elige para dirigir el transporte a la motoneurona
del hipogloso; el músculo del brazo, que se elige para dirigir el
transporte a las motoneuronas de la médula espinal.
Para esta realización del transplante de una
neurona al SNC o a la médula espinal véase Gage, F.H. y col.,
Neuroscience, (1987), 23:725-807, "Grafting
genetically modified cells to the brain: possibilities for the
future".
Las técnicas para la introducción de
polinucleótidos en células se describen en las patentes de EEUU
n^{os} 5.580.859 y 5.589.466, en la que está basada. Por ejemplo,
los nucleótidos pueden introducirse por transfección in
vitro antes de la reimplantación en el área del SNC o la médula
espinal.
\newpage
Para una realización particular de la invención
se considera un ligamiento químico, que comprende la asociación
entre el fragmento de TT y un polinucleótido que codifica la
molécula de interés con sus elementos reguladores, como promotor y
potenciador, capaces de expresar dicho polinucleótido. Entonces, el
fragmento de TT permite el transporte axonal retrógrado y/o el
transporte transináptico y el producto del polinucleótido se
expresa directamente en las neuronas. El ligamiento químico puede
ser covalente o no, pero es preferentemente covalente, realizado
por una reacción de tiolación o por cualquier otra reacción de
unión como se describe en "Bioconjugate Techniques" de Gret T.
Hermanson (Academic press, 1996).
El transporte axonal retrógrado comienza a nivel
muscular, dónde la composición de interés se absorbe en la unión
neuromuscular y migra al cuerpo neurona) de las motoneuronas (que
también se denominan neuronas de primer orden) en el SNC o la
médula espinal. Neuronas de primer orden significan neuronas que
han internalizado la composición de interés y, por tanto, en este
caso corresponden a las motoneuronas.
El transporte retrógrado transináptico
corresponde a las comunicaciones interneuronales a través de las
sinapsis desde las motoneuronas y comprende neuronas de segundo
orden y neuronas de órdenes superiores (de cuarto orden, que
corresponden a las neuronas de la corteza cerebral).
Las diferentes etapas del transporte neurona)
son a través de la unión neuromuscular, la motoneurona, también
denominada neurona de primer orden, las sinapsis en cualquier etapa
entre las neuronas de orden diferente, la neurona de segundo orden
a cuarto orden, que corresponde a la corteza cerebral.
En una realización de esta invención se muestra
que una proteína híbrida
\beta-Gal-TTC (fragmento C de TT)
retiene las actividades biológicas de ambas proteínas in
vivo. Por tanto, la proteína híbrida es susceptible de un
transporte retrógrado y transneuronal a través de una cadena de
neuronas interconectadas, como puede seguirse por su actividad
enzimática. Estos resultados concuerdan con los de otros autores
que usaron TTC conjugado químicamente o TTC fusionado a otras
proteínas (12, 13, 14, 15). En estos análisis in vitro, la
actividad de las proteínas conjugadas o híbridas se retuvo asimismo
o sólo disminuyó ligeramente. Dependiendo de la naturaleza del otro
miembro de la fusión con TTC, pueden preverse diferentes tipos de
aplicaciones potenciales. Por ejemplo, esta aplicación puede usarse
pata suministrar una proteína biológicamente activa al SNC para
fines terapéuticos. Estos genes híbridos pueden usarse también para
analizar y cartografiar neuronas conectadas sinápticamente si se
han fusionado genes informadores, tales como lacZ o la
proteína verde fluorescente (GFP; 29) a TTC.
El transporte retrógrado de la proteína híbrida
puede demostrarse como sigue. Cuando se inyecta en un músculo, la
actividad de \beta-Gal se localiza rápidamente en
los cuerpos celulares de las motoneuronas que inervan el músculo.
La arborización de todo el nervio, axón, cuerpos celulares y
dendritas puede visualizarse fácilmente. Sin embargo, en comparación
con los virus neurotróficos, la amplitud del transporte
transneuronal retrógrado de la proteína híbrida desde las neuronas
del hipogloso indica que sólo se detecta una parte de las neuronas
interconectadas, aunque la mayoría de las áreas que contienen
interneuronas de segundo orden han sido identificadas por el
marcador \beta-Gal-TTC. La
absorción transneuronal se encuentra limitada en su mayor parte a
las neuronas de segundo orden. En tales experimentos, cuando se
inyecta una cantidad limitada de un trazador neuronal en un músculo
o en una célula, sólo una fracción se transportará a través de una
sinapsis, imponiendo, por tanto, una limitación experimental para
su detección. Actualmente, el procedimiento más eficiente, en
cuanto a la amplitud del transporte, se basa en los virus
neurotróficos. Algunos ejemplos incluyen: los virus del herpes
alfa, como el herpes simple de tipo 1 (VHS-1), el
virus de la pseudorrabia (PrV) y los rabdovirus (24, 25). Los
procedimientos víricos son muy sensibles porque cada vez que un
virus infecta una célula nueva, se replica, amplificando en ello la
señal y permitiendo la visualización de las neuronas de orden
superior en una cadena. Sin embargo, a la larga se desea
cartografiar una red neurona) en una situación in vivo, tal
como un animal transgénico. Aquí la desventaja del marcado vírico
es su potencial toxicidad. La mayoría de los virus no son inocuos
para la célula neural y su replicación induce una respuesta celular
y a veces degeneración celular (24). Además, dependiendo de las
condiciones experimentales, puede producirse la gemación del virus,
dando lugar a su propagación a las células y tejidos
adyacentes.
Las diferencias en los mecanismos de migración
transneuronal pueden ser también la causa del limitado número de
neuronas marcadas con
\beta-Gal-TTC. Mateoli y col.,
han proporcionado pruebas convincentes de que la toxina tetánica
intacta cruza las sinapsis parasitando el proceso fisiológico del
reciclado de vesículas sinápticas en el extremo del nervio (22).
Probablemente, la toxina se une a la superficie interna de una
vesícula sináptica durante el tiempo en que el lumen se encuentra
expuesto al medio externo. La endocitosis vesicular proporcionaría
entonces presumiblemente el mecanismo de internalización de la
toxina. Dado que se sabe que el fragmento TTC imita la migración de
la toxina in vivo, podría por tanto, dirigir la proteína de
fusión a lo largo de una ruta transináptica similar. Si se confirma
esta hipótesis sugeriría intensamente que la actividad sináptica es
necesaria para el transporte transneuronal de
\beta-Gal-TTC. Por tanto, la
proteína híbrida sólo detectará circuitos neuronales activos. La
posible dependencia de
\beta-Gal-TTC de la exocitosis y
endocitosis de las vesículas sinápticas podría investigarse aún
más, dado que actualmente se dispone de técnicas para registrar la
actividad sináptica en redes neuronales in vitro (30). En
contraste, la ruta transneuronal de los virus neurotróficos no ha
sido aclarada todavía y podría ser fundamentalmente diferente,
implicando la gemación del virus en proximidad de una sinapsis.
Finalmente, el transporte transneuronal de la proteína híbrida
podría depender de una especificidad sináptica, aunque no se sabe
que la toxina tetánica presente ninguna (7, 23). Por tanto, es
probable que un virus cruce sinapsis diferentes o inactivas. En
resumen, el limitado espectro de transporte interneuronal, además
de su falta de toxicidad, hacen de la proteína híbrida
\beta-Gal-TTC una herramienta
nueva y poderosa para el análisis de las rutas neurales.
Una ventaja de la fusión génica de la invención
para la cartografía neuronal es que se deriva de una única entidad
que es fácilmente susceptible de manipulación e ingeniería
genética. Hace varios años se desarrolló una técnica basada en
recombinación homóloga en células madre embrionarios para
reemplazar específicamente genes en el ratón (31, 32). Este
procedimiento genera una mutación nula en el gen sustituido, aunque
en una estrategia ligeramente modificada puede producirse también
un ARN mensajero dicistrónico (33, 34). Cuando se usa un gen
informador, como lacZ de E. coli, como gen
sustituyente, esta técnica proporciona un medio de marcar las
células mutadas de modo que pueden seguirse durante la
embriogénesis. Por tanto, esta técnica simplifica en gran medida el
análisis tanto de la expresión heterocigota del gen diana como el
fenotipo de los animales mutantes nulos (homocigotos).
Otra ventaja de esta invención es que la
composición que comprende el gen de fusión puede codificar un
antígeno o antígenos. Por tanto, la composición puede usarse para
desencadenar una respuesta inmunitaria en su huésped y
posteriormente conferir protección al huésped frente al antígeno o
antígenos expresados. Estos procedimientos de inmunización se
describen en Robinson y col., documento de patente de EEUU n°
5.43.578. En particular, el procedimiento de inmunizar a un
paciente o un huésped animal comprende la introducción de una
unidad de transcripción de ADN que comprende el gen de fusión de
esta invención, el cual codifica el antígeno o antigenos deseados.
La absorción de la unidad de transcripción de ADN por el huésped
resulta en la expresión del antígeno o antígenos deseados y el
posterior desencadenamiento de las respuestas inmunitarias humoral
y/o mediada por células.
Las células neurales establecen redes
específicas y complejas de células interconectadas. Si se mutara un
gen en una célula neural dada, se esperaría que esta mutación
tuviera un impacto en las funciones de otras células neurales
interconectadas. Teniendo en cuenta estas consideraciones, un
marcador genético que puede difundirse a través de las sinapsis
activas sería muy útil para analizar el efecto de la mutación. En
animales mutantes heterocigotos han podido identificarse las
células en las que el gen diana se transcribe normalmente, así como
las células de una red neural conectadas sinápticamente. En un
animal homocigoto ha podido determinarse el impacto de la mutación
en el establecimiento o la actividad de la red neural. La
viabilidad de un enfoque tal in vivo depende críticamente de
la eficiencia de la transferencia sináptica de la proteína de
fusión, así como de su estabilidad y localización celular.
Otra extensión de la invención es la terapia
génica aplicada al SNC. Esta invención prevé la absorción de un
conjugado enzima-vector no tóxico por los extremos
de los axones y su transporte retrógrado a las motoneuronas del
tronco cerebral. Un mecanismo transináptico retrógrado y selectivo
transporta posteriormente la proteína híbrida a las neuronas de
segundo orden conectadas. Una ruta tal, que evita el paso de la
barrera hematoencefálida, puede suministrar macromoléculas al SNC.
De hecho, los agentes patógenos, como la toxina tetánica y los
virus neurotróficos, se absorben de manera similar por los extremos
de los nervios, se internalizan y transportan de forma retrógrada
hasta los cuerpos celulares de los nervios. En un escenario tal, el
gen informador lacZ se reemplazaría por un gen que codifique
una proteína que proporcione una actividad y/o función necesaria o
interesante. Por ejemplo, la superoxidodismutasa de Cu y Zn humana,
SOD-1, y la
\beta-N-acetilhexosaminidasa A
humana, HexA, se han fusionado o acoplado químicamente al fragmento
TTC (13, 16), y su absorción por neuronas in vitro se
incrementó considerablemente y sus funciones enzimáticas se
conservaron parcialmente. En combinación con los experimentos in
vivo aquí descritos usando
\beta-Gal-TTC, un enfoque de
terapia génica basado en proteínas TTC híbridas parece ser un
procedimiento viable para suministrar una función biológica al SNC.
Sin embargo, han de encontrarse modos de dirigir las proteínas TTC
híbridas, que probablemente quedarían recluidas en vesículas, al
compartimento subcelular adecuado. Una estrategia terapéutica tal
podría ser particularmente útil para el tratamiento de enfermedades
neurodegenerativas y de las motoneuronas, como la esclerosis
lateral amiotrófica (ALS, 35), atrofia muscular espinal (SMA, 36,
37) o enfermedades neurodegenerativas de almacenamiento lisosómico
(38, 39). La inyección en músculos seleccionados, incluso in
utero, podría ayudar al direccionamiento específico a las
neuronas adecuadas. Adicionalmente, un enfoque tal evitaría los
efec-
tos secundarios y potencialmente tóxicos asociados con el uso de virus defectivos para suministrar un gen (40, 41).
tos secundarios y potencialmente tóxicos asociados con el uso de virus defectivos para suministrar un gen (40, 41).
Se generó un ADN de TTC de longitud completa a
partir del ADN genómico de la cepa de Clostridium tetani
(una donación de Dr. M. Popoff, Institut Pasteur) usando PCR. Se
sintetizaron tres fragmentos solapantes: PCR1 de 465 pb (cebador 1:
5'-CCCCCCGGGCCACCATGGTTTTTTCAACACCAATTCCATTTTCTTATTC-3'
y cebador 2:
5'-CTAAACCAGTAATTTCTG-3'), PCR2 de
648 pb (cebador 3:
5'-AATTATGGACTTTAAAAGATTCCGC-3' y
cebador 4:
5'-GGCATTATAACCTACTCTTAGAAT-3') y
PCR3 de 338 pb (cebador 5: 5'-AATGCCTTTAA
TAATCTTGATAGAAAT-3' y cebador 6: 5'-CCCCCCGGGCATATGTCATGAACATATCAATCTGTTTAATC-3'). Los tres fragmentos se introdujeron secuencialmente en pBluescript KS+ (Stratagene) para dar el plásmido pBS:TTC. El cebador 1 secuencia arriba contiene también un sitio de unión a ribosomas (RBS) eucariótico optimizado y señales de iniciación de la traducción. Nuestro fragmento TTC (462 aminoácidos) representa los aminoácidos 854-1315 de la holotoxina tetánica, es decir, los 451 aminoácidos carboxiterminales de la cadena pesada, lo que constituye el fragmento C más 11 aminoácidos de la cadena pesada que preceden inmediatamente al extremo amino del fragmento C. La secuencia de ADN y la secuencia de aminoácidos del fragmento TTC donado en pBS:TTC se muestran en la figura 1. La construcción pBS:TTC se muestra en la figura 2.
TAATCTTGATAGAAAT-3' y cebador 6: 5'-CCCCCCGGGCATATGTCATGAACATATCAATCTGTTTAATC-3'). Los tres fragmentos se introdujeron secuencialmente en pBluescript KS+ (Stratagene) para dar el plásmido pBS:TTC. El cebador 1 secuencia arriba contiene también un sitio de unión a ribosomas (RBS) eucariótico optimizado y señales de iniciación de la traducción. Nuestro fragmento TTC (462 aminoácidos) representa los aminoácidos 854-1315 de la holotoxina tetánica, es decir, los 451 aminoácidos carboxiterminales de la cadena pesada, lo que constituye el fragmento C más 11 aminoácidos de la cadena pesada que preceden inmediatamente al extremo amino del fragmento C. La secuencia de ADN y la secuencia de aminoácidos del fragmento TTC donado en pBS:TTC se muestran en la figura 1. La construcción pBS:TTC se muestra en la figura 2.
El plásmido pGEX:lacZ se obtuvo por
donación de un fragmento lacZ SmaI/XhoI del
vector pGNA (una donación de Dr. H. Le Mouellic) en pGEX
4T-2 (Pharmacia). Para transformar el codón de
parada de lacZ en un sitio de restricción NcoI se usó
PCR. Dos cebadores (secuencia arriba:
5'-CTGAATATCGACGGTTTCCATATG-3' y
secuencia abajo:
5'-GGCAGTCTCGAGTCTAGACCATGGCTTTTTGACACCAGAC-3')
se usaron para amplificar la secuencia entre NdeI y
XhoI, generando pGEX:lacZ (NcoI) a partir de
pGEX:lacZ. El plásmido pGEX:lacZ-TTC se obtuvo por
inserción del fragmento TTC NcoI/XhoI en
pGEX:lacZ (NcoI), fusionando TTC inmediatamente
secuencia abajo de la región codificante de lacZ y en el
mismo marco de lectura. La figura 3 muestra los detalles de la
construcción pGEX:lacZ-TTC.
El plásmido pBS:TTC se modificó para cambiar el
sitio de restricción NcoI a BamHI (ligador
5'-CATGACTGGG
GATCCCCAGT-3') en el inicio del ADN de TTC, para dar el plásmido pBS:TTC (BamHI). El plásmido pGEX:TTC se obtuvo por donación del fragmento TTC BamHI/SmaI de pBS:TTC (BamHI) en pGEX 4T-2 (Pharmacia). Para transformar el codón de parada de TTC en un sitio de restricción NheI se usó PCR. Dos cebadores (secuencia arriba: 5'-TATGATAAAAATGCATCTTTAGGA-3' y secuencia abajo: 5'-TGGAGTCGACGCTAGCAGGATCATTTGTC
CATCCTTC-3') se usaron para amplificar la secuencia entre NsiI y SmaI, generando pGEX:TTC (NheI) a partir de pGEX:TTC. El ADNc de lacZ del plásmido pGNA se modificó en su extremo 5' para cambiar un sitio de restricción SacII a NheI (ligador 5'-GCTAGCGC-3'). El plásmido pGEX:TTC-lacZ se obtuvo por inserción del fragmento lacZ NheI/XhoI en pGEX:TTC (NheI), con la fusión de lacZ inmediatamente secuencia abajo de la región codificante de TTC y en el mismo marco de lectura. Los detalles de la construcción pGEX:TTC-lacZ se muestran en la figura 4.
GATCCCCAGT-3') en el inicio del ADN de TTC, para dar el plásmido pBS:TTC (BamHI). El plásmido pGEX:TTC se obtuvo por donación del fragmento TTC BamHI/SmaI de pBS:TTC (BamHI) en pGEX 4T-2 (Pharmacia). Para transformar el codón de parada de TTC en un sitio de restricción NheI se usó PCR. Dos cebadores (secuencia arriba: 5'-TATGATAAAAATGCATCTTTAGGA-3' y secuencia abajo: 5'-TGGAGTCGACGCTAGCAGGATCATTTGTC
CATCCTTC-3') se usaron para amplificar la secuencia entre NsiI y SmaI, generando pGEX:TTC (NheI) a partir de pGEX:TTC. El ADNc de lacZ del plásmido pGNA se modificó en su extremo 5' para cambiar un sitio de restricción SacII a NheI (ligador 5'-GCTAGCGC-3'). El plásmido pGEX:TTC-lacZ se obtuvo por inserción del fragmento lacZ NheI/XhoI en pGEX:TTC (NheI), con la fusión de lacZ inmediatamente secuencia abajo de la región codificante de TTC y en el mismo marco de lectura. Los detalles de la construcción pGEX:TTC-lacZ se muestran en la figura 4.
El vector pCMV se obtuvo a partir de
pGFP-C1 (Clontech Laboratories) después de algunas
modificaciones. La secuencia de GFP se delecionó mediante una
digestión BglII/NheI y religación, X100, DTT 4 mM, 1
mg/ml de lisozima y una mezcla de antiproteasas (100 \mug/ml de
Pefabloc, 1 \mug/ml de leupeptina, 1 \mug/ml de pepstatina,
benzamidina 1 mM). Después de la rotura de las células en una
prensa francesa, el lisado bacteriano total se centrifugó durante
10 minutos a 30.000 rpm. El sobrenadante resultante se incubó
durante la noche a 4°C con la matriz de afinidad
glutatión-sefarosa 4B (Stratagene) con agitación
lenta. Después de centrifugar durante 5 minutos a 3.000 rpm, la
matriz se lavó tres veces con el mismo tampón de lisis pero sin
lisozima ni glicerina y después tres veces con PBS. La resina se
incubó durante la noche a 4°C con trombina (10 U/ml; Sigma) en PBS
para escindir la proteína de fusión
\beta-Gal-TTC de la secuencia
glutation-S-transferasa (GST) y de
este modo, eluirla de la columna de afinidad. La concentración de la
proteína de fusión eluida se consiguió por centrifugación en tubos
centricon X-100 (Amicon; membrana con límite de
exclusión para PM 100.000).
La proteína híbrida purificada se analizó por
inmunotransferencia después de la separación electroforética en
SDS/PAGE con el 8% de acrilamida en condiciones reductoras, seguida
de la transferencia electroforética a membranas de nitrocelulosa
(porosidad 0,2 mm, BioRad). La inmunodetección de las proteínas
transferidas se realizó con un kit Vectastain ABC de fosfatasa
alcalina (Vector Laboratories) y DAB para el desarrollo del color.
Los anticuerpos se usaron como sigue: antisuero
anti-\beta-Gal de conejo (Capel),
dilución 1:1.000, antisuero anti-TTC de conejo
(Calbiochem), dilución 1:20.000. Una banda principal con una masa
molecular relativa de 180 kDa correspondiente al híbrido
\beta-Gal-TTC y el sitio de
restricción SacII en el poliligador se transformó en un
sitio de restricción AscI (ligadores
5'-GATATCGGCGCGCCAGC-3' y
5'-TGGCGCGCCGATATCGC-3').
El plásmido pBluescript KS+ (Stratagene) se
modificó para cambiar un sitio de restricción XhoI en
AscI (ligador
5'-TCGATGGCGCGCCA-3') dando el
plásmido pBS (AscI). El plásmido pBS:lacZ-TTC se
obtuvo por clonación de un fragmento lacZ-TTC XmaI de
pGEX:lacZ-TTC en el plásmido pBS (AscI). El plásmido
pCMV:lacZ-TTC se obtuvo por inserción del fragmento
lacZ-TTC XmnI/AscI en el vector pCMV en los
sitios XhoI y AscI (XhoI y XmnI se
eliminaron en la clonación), poniendo la fusión secuencia abajo del
promotor de CMV. La figura 5 muestra los detalles de la
construcción pCMV:lacZ-TTC. El plásmido pCMV:lacZ-TTC
se depositó el 12 de agosto de 1997 en la Collection Nationale de
Cultures de Microorganisms (CNCM), Institut Pasteur, 25, Rue de
Docteur Roux, F-75724, Paris Cedex 15, Francia, con
el n° de acceso I-1912.
Para la producción de proteína se usó la cepa
SR3315 de E. coli (una donación de Dr. A. Pugsley, Institut
Pasteur) transfectada con pGEX:lacZ-TTC. Un cultivo
bacteriano de una noche se diluyó 1:100 en medio LB que contenía
100 \mug/ml de ampicilina y se cultivó durante varias horas a 32°C
hasta alcanzar una DO de 0,5. La inducción del promotor Ptac se
consiguió por la adición de IPTG 1 mM y MgCl_{2} 1 mM y otras 2
horas de incubación. Las bacterias inducidas se sedimentaron por
centrifugación durante 20 minutos a 3.000 rpm, se lavaron con PBS y
se resuspendieron en tampón de lisis que contenía Tris 0,1 M pH
7,8, NaCl 0,1 M, 20% de glicerina, EDTA 10 mM, 0,1% de Triton-
proteína se detectó tanto con anticuerpos
anti-\beta-Gal como
anti-TTC.
La línea celular 1009 se derivó de un
teratocarcinoma testicular espontáneo que apareció en una cepa
endógama recombinante de ratón (129 x B6) (17). Las células 1009 se
cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), con el
10% de suero bovino fetal y subcultivos a subconfluencia. La
diferenciación in vitro con ácido retinoico y AMPc se realizó
como se ha descrito (18). A los ocho días del tratamiento con ácido
retinoico, las células se usaron para los experimentos de
internalización con la proteína híbrida o con
\beta-Gal.
La unión e internalización de la fusión
\beta-Gal-TTC se evaluó usando un
protocolo modificado (16). Las células 1009 diferenciadas se
incubaron durante 2 horas a 37°C con 5 \mug/ml de la proteína
\beta-Gal-TTC o
\beta-Gal diluida en tampón de unión (0,25% de
sacarosa, Tris acetato 20 mM, CaCl_{2} 1 mM, MgCl_{2} 1 mM,
0,25% de albúmina de suero bovino, en PBS). Las células se
incubaron entonces con 1 \mug/ml de pronasa E (Sigma) en PBS
durante 10 minutos a 37°C, seguido por un lavado con inhibidores de
proteasas diluidos en PBS (100 \mug/ml de Pefabloc, benzamidina 1
mM).
Las células se fijaron con el 4% de formalina en
PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente (TA) y después se
lavaron extensivamente con PBS. La actividad de
\beta-Gal se detectó en las células fijadas por
tinción durante la noche a 37°C en una disolución de
X-Gal (0,8 mg/ml de X-Gal,
ferricianuro potásico 4 mM, ferrocianuro potásico 4 mM, MgCl_{2} 4
mM en PBS). Para la microscopia electrónica las células se fijaron
además en el 2,5% dé glutaraldehído durante 18 horas y después se
procesaron como se ha descrito (19).
Para el marcado inmunohistoquímico, las células
se fijaron con el 4% de paraformaldehído en PBS durante 10 minutos
a TA, después se lavaron extensivamente con PBS, seguido de 1 hora
de incubación a TA con el 2% de BSA/0,2% de Triton
X-100 en PBS. Las células se coincubaron en
anticuerpos primarios diluidos en 2% de BSA/0,2% de Triton
X-100 en PBS durante 2 horas a TA. Los anticuerpos
usados fueron un anticuerpo antineurofilamenko de ratón (NF 200 Kd,
dilución 1:50; Sigma) o el anticuerpo anti-TTC de
conejo (dilución 1:1.000). El marcado se visualizó usando
anticuerpos secundarios fluorescentes: Cy3,
anti-IgG de conejo de cabra (dilución 1:500;
Amersham) o anti-IgG de ratón con
extravidina-FITC (dilución 1:200; Sigma). Las
células Se montaron en moviol y se visualizaron con
epifluorescencia.
Los ratones B6D2F1 de 14 semanas de edad se
obtuvieron de IFFA-CREDO. Se inyectó el músculo de
la lengua de los animales usando Una jeringa de Hamilton (20 \mul
por animal) bajo anestesia general con el 3% de avertina (15
\mul/g de animal). La concentración de proteína fue de 0,5 a 5
\mug/\mul en PBS; por tanto, los ratones recibieron
aproximadamente 10 a 100 \mug por inyección. Los animales se
mantuvieron vivos durante 12 horas a 48 horas después de la
inyección para permitir la migración de la proteína inyectada y en
ningún caso se detectaron síntomas del tétanos. Los ratones se
sacrificaron por perfusión intracardíaca con el 4% de formaldehído
en PBS mientras estaban profundamente anestesiados. Se recogieron
los cerebros, se lavaron en PBS y se incubaron en el 15% de
sacarosa durante la noche a 4°C, después se montaron en
tissue-tek antes del corte de secciones de 15 \mum
de espesor usando un criostato.
Para la tinción con X-Gal in
toto del cerebro y la lengua diseccionados, los ratones (10
animales) se sacrificaron y fijaron como se ha descrito
anteriormente. El cerebro se cortó además con un escalpelo a lo
largo de un plano medio y se incubó durante 12 horas en la
disolución de X-Gal.
Para la inmunohistología, las secciones se
incubaron en una dilución 1:5.000 del anticuerpo
anti-TTC en el 2% de BSA/0,02% de Triton
X-100 en PBS durante la noche a 4°C después de que
los sitios de unión no específica del anticuerpo fueran bloqueados
por 1 hora de incubación en el mismo tampón. La detección del
anticuerpo se llevó a cabo usando el kit Vectastain ABC de
fosfatasa alcalina con DAB para desarrollo del color. Para la
tinción con X-Gal las secciones se incubaron en la
disolución de X-Gal y se contratiñeron durante 30
segundos con hematoxilina 115 (v/v) en PBS. La histología en
secciones adyacentes se realizó después de la tinción con
X-Gal, usando una incubación de 30 segundos en una
disolución de hematoxilina/tionina. Todas las secciones se montaron
en moviol antes de ocho análisis microscópicos.
\newpage
La diferenciación de las células 1009 con ácido
retinoico y AMPc in vitro produce células neuronales y
gliales (18, 20). La tinción con X-Gal o el marcado
inmunológico se realizaron después de la incubación con la proteína
de fusión \beta-Gal-TTC o bien con
cada una de las proteínas \beta-Gal o TTC en
solitario. Sólo cuando la proteína híbrida se incubó con las células
1009 diferenciadas se detectó una tinción intensa con
X-Gal en las células con un fenotipo neuronal. No se
detectó ninguna señal al incubar sólo \beta-Gal en
las mismas condiciones. Un patrón similar de tinción con
X-Gal se obtuvo después del tratamiento con pronasa
de las células para eliminar las proteínas unidas a la superficie,
indicando que la proteína híbrida había sido internalizada. La
localización intracelular de la proteína híbrida se confirmó además
por análisis de microscopia electrónica de las células teñidas con
X-Gal. Además, la actividad enzimática observada en
los axones pareció estar localizada en vesículas asociadas con
filamentos, lo que está de acuerdo con trabajos previos sobre el
fragmento TTC o la toxina tetánica nativa (14, 21, 22). El
comarcado con anticuerpos antineurofialmento reveló que la actividad
de \beta-Gal se localizaba con el fragmento TTC
en las células neuronales. Ninguna de las células gliales se marcó
con ninguno de los anticuerpos.
El método usado para la internalización fue
idéntico al descrito en el ejemplo 6 anterior. Los resultados
muestran una internalización eficiente del híbrido como en el
ejemplo 6 anterior.
Para estudiar el comportamiento de la proteína
\beta-Gal-TTC in vivo, la
proteína híbrida se ensayó en una red neurona) bien caracterizada,
el sistema del hipogloso. Después de la inyección intramuscular de
la proteína \beta-Gal-TTC en la
lengua del ratón, se analizó la distribución de la proteína híbrida
en el SNC mediante tinción con X-Gal. Se inyectaron
diversas diluciones de la proteína y se analizaron momentos
secuenciales para permitir el transporte de la proteína a las
motoneuronas del hipogloso (XII) y su posterior migración
transneuronal a las neuronas de segundo orden
conectadas.
conectadas.
En la estructura del hipogloso, analizada in
toto a las 12 horas después de la inyección, se observó
claramente un perfil bien definido de neuronas grandes,
aparentemente marcadas de forma retrógrada. También fue evidente un
marcado intenso en el nervio hipogloso (XIIn) de la lengua de los
ratones inyectados. Al nivel de las fibras musculares se observaron
estructuras en forma de botones que pudieran reflejar el marcado de
las uniones neuromusculares donde la proteína híbrida se
internalizó en los axones de los nervios. Estos datos demuestran
que la proteína híbrida
\beta-Gal-TTC puede migrar
rápidamente por transporte axonal retrógrado hasta alcanzar los
cuerpos celulares de las motoneuronas, después de su absorción
previa por los extremos de los nervios en la lengua. Esta absorción
específica y el transporte intraaxonal son similares a las
propiedades que se han descrito para la toxina nativa (6,
21,
23).
23).
El transporte de la proteína híbrida se examinó
con mayor detalle analizando secciones del cerebro teñidas con
X-Gal. Las motoneuronas del núcleo del hipogloso se
marcaron rápidamente, siendo a las 12 horas el momento más temprano
examinado. La mayor parte del marcador estaba confinado en los
cuerpos celulares neuronales, estando los núcleos celulares sin
marcar. La intensidad del marcado depende de la concentración de la
proteína \beta-Gal-TTC inyectada:
al inyectar 10 \mug de proteína, sólo se detectaron los cuerpos
celulares del hipogloso, mientras que con 25 a 50 \mug se
visualizó una red difusa de dendritas; la transferencia
transináptica se detectó con 100 \mug de proteína híbrida. Una
distribución idéntica del marcador se observó en la inmunotinción
de secciones del cerebro con un anticuerpo anti-TTC,
demostrando que \beta-Gal y el fragmento TTC
localizan dentro de las células. Finalmente, la inyección de
\beta-Gal sólo no resultó en el marcado de los
núcleos del hipogloso y confirma, por tanto, que el transporte de
la proteína híbrida depende de TTC. El marcado con un anticuerpo
anti-TTC fue menos informativo que la detección de
actividad de \beta-Gal; por ejemplo, la ruta
nerviosa al cerebro no pudo visualizarse por inmunotinción
anti-TTC. A las 18 horas después de la inyección se
observó un marcado en los núcleos del hipogloso: todos los cuerpos
celulares de las motoneuronas y la parte más proximal de sus
dendritas estaban densamente teñidas. En contraste, nunca se
detectó ningún marcado en las células gliales adyacentes a las
motoneuronas XII o en sus axones. Nuestros resultados están de
acuerdo con otros autores que describieron un patrón idéntico de
marcado inmunológico después de la inyección del fragmento TTC sólo
(9). La transferencia transneuronal es detectable después de 24
horas. Otras 24 horas adicionales y aún más no produjeron una
tinción diferente.
\newpage
Las interneuronas de segundo orden, así como las
neuronas de órdenes superiores que forman sinapsis con las
motoneuronas del hipogloso se han analizado ampliamente usando
marcadores convencionales, tal corno el complejo de aglutinina de
germen de trigo-peroxidasa de rábano
(WGA-HRP) o virus neurotróficos como el herpes alfa
(24) y los rabdovirus (25). También se ha descrito recientemente
una compilación exhaustiva de las regiones en el cerebro que se
conectan sinápticamente con el núcleo del hipogloso (25). En esta
invención, la distribución de la fusión
\beta-Gal-TTC dependió de la
concentración inicial de la proteína inyectada en el músculo y del
tiempo permitido para el transporte después de la inyección. Hasta
24 horas después de la inyección el marcado se limitó a los núcleos
del hipogloso. Después de 24 horas, la distribución de las células
de segundo orden marcadas transneuralmente en varias regiones del
cerebro fue constante y reproducible. Incluso a intervalos más
largos (por ejemplo 48 horas), el marcado del núcleo del hipogloso
se mantuvo constante. Con un aumento mayor se observó una tinción
discreta y localizada de neuronas de segundo orden, sugiriendo que
la proteína híbrida había sido dirigida a vesículas dentro de los
cuerpos celulares, sinapsis y axones. Una distribución irregular
similar ha sido descrita previamente para la toxina tetánica y el
fragmento TTC sólo (14, 21, 22).
Un marcado transneuronal intenso se detectó en
la formación reticular lateral (LRF), donde se ha descrito que las
neuronas reticulares de la médula forman numerosas proyecciones al
núcleo del hipogloso (26, 27). En estas secciones se detectó
actividad de \beta-Gal bilateralmente. Las
proyecciones de LRF marcadas formaron una columna continua a lo
largo del eje rostrocaudal, comenzando lateralmente respecto al
núcleo del hipogloso, con unas pocas neuronas teñidas
preferentemente en los núcleos reticulares dorsales de la médula
(MdD) y los núcleos reticulares ventrales de la médula (MdV). Esta
columna se extiende rostralmente a través de la médula, con neuronas
marcadas más intensamente en el núcleo reticular parvicelular (PCRt,
caudal y rostral). Después de 48 horas, las células en MdD y PCRt
estaban teñidas más intensamente. Una segunda distribución
bilateral de las neuronas de la médula que se proyectan al núcleo
del hipogloso se detectó en el núcleo solitario (Sol), pero el
marcado fue menos intenso que en la formación reticular,
presumiblemente porque menos células del núcleo solitario se
proyectan al núcleo del hipogloso (26). Sin embargo, no se encontró
ningún marcador en el núcleo espinal del trigémino (Sp5), que
también se ha demostrado que se proyecta al núcleo del hipogloso
(26). El transporte transináptico de la proteína
\beta-Gal-TTC se detectó también
en el núcleo reticular caudal del puente (PnC), el locus
ceruleus (LC), el núcleo vestibular medial (MVe) y en unas pocas
células del núcleo vestibular inferior (IV). Se sabe que estos
grupos de células se proyectan al núcleo del hipogloso (25), pero
su marcado fue débil, probablemente debido a la mayor longitud de
sus axones. Unas pocas células marcadas se observaron en el núcleo
paragigantocelular dorsal (DPGi), el núcleo magnocelular caudal
(RMc) y el núcleo caudal del rafe (R); sus conexiones con el núcleo
del hipogloso también han sido descritas (25). Finalmente, se
detectaron bilateralmente neuronas marcadas en proyecciones del
cerebro medio, como las del núcleo mesencefálico del trigémino
(Me5), y unas pocas neuronas se tiñeron en la región gris
mesencefálica central (CG). Estos últimos núcleos se han
clasificado como supuestos grupos celulares de tercer orden,
relacionados con el núcleo del hipogloso (25).
También se marcaron neuronas en el núcleo motor
del trigémino (Mo5) y en el tracto accesorio del trigémino (Acs5),
junto con una población de neuronas en el núcleo facial (N7). Sin
embargo, la interpretación de este marcado es más ambigua, dado que
se sabe que las motoneuronas en esos núcleos también inervan otras
partes del tejido muscular y puede haberse producido una difusión
de la proteína híbrida en el punto de la inyección. A la inversa,
estos núcleos pueden haberse proyectado también a la musculatura de
la lengua a través del nervio XII, dado que se ha descrito que las
neuronas en N7 reciben una aportación directa del nervio hipogloso
(28). Esta última explicación concuerda con el hecho de que el
marcado en estos núcleos se detectó sólo después de 24 horas; sin
embargo, este punto no se investigó posteriormente.
En suma, los datos resumidos en la tabla 1
establecen claramente el transporte transneuronal de la proteína de
fusión \beta-Gal-TTC desde las
neuronas del hipogloso a varias regiones conectadas del tronco
cerebral.
En este documento se han citado las siguientes
publicaciones, que sirven de base
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Claims (23)
1. Un fragmento recombinante no tóxico de la
toxina tetánica, que es un fragmento recombinante de la toxina
tetánica que comprende el fragmento C, más 11 aminoácidos de la
cadena pesada que preceden inmediatamente al extremo amino del
fragmento C.
2. Un polinucleótido que codifica un fragmento
recombinante no tóxico de la toxina tetánica según la
reivindicación 1.
3. Uso de un fragmento recombinante no tóxico de
la toxina tetánica según la reivindicación 1 como vehículo
transináptico para la preparación de un medicamento para el
suministro de al menos una proteína o péptido a neuronas de segundo
orden o de orden superior, en el que dicho fragmento recombinante
no tóxico de la toxina tetánica se destina a la fusión con dicha al
menos una proteína o péptido que se va a suministrar o a su
ligamiento químico con un polinucleótido que codifique una proteína
o péptido tal.
4. Uso de un polinucleótido que codifica un
fragmento recombinante no tóxico de la toxina tetánica según la
reivindicación 1 como un polinucleótido que codifica un vehículo
transináptico en la preparación de un medicamento para el
suministro de al menos una proteína o péptido a neuronas de segundo
orden y de orden superior, en el que dicho polinucleótido que
codifica el vehículo se destina a la fusión con un polinucleótido
que codifica dicha proteína o péptido que se va a suministrar.
5. Uso según la reivindicación 4,
caracterizado porque dicho polinucleótido que codifica dicha
al menos una proteína o péptido que se va a suministrar al SNC
comprende además un promotor capaz de expresarse en células
neuronales o en precursores de células neuronales o en células
musculares.
6. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 3-5, caracterizado porque
dicho medicamento se destina a la compensación o la modulación de
las funciones bajo control del SNC, o a la compensación o la
modulación de las funciones de SNC o al tratamiento de una
enfermedad del SNC.
7. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 3-6, caracterizado porque
dicha al menos una proteína que se va a suministrar al SNC se
selecciona del grupo constituido por la proteína SMN, BDNF (factor
neurotrófico derivado de cerebro), NT-3
(neurotrofina-3), NT-4/5, GDNF
(factor neurotrófico derivado de líneas celulares gliales), IGF
(factor de crecimiento similar a la insulina), PNI (proteasa nexina
I), SPI3 (proteína inhibidora de proteasas de serina), ICE (enzima
transformadora de interleucina 1), Bcl-2, GFP
(proteína verde fluorescente), endonucleasas como I-SceI o
CRE, anticuerpos, fármacos dirigidos específicamente contra
enfermedades neurodegenerativas, fármacos dirigidos específicamente
contra la amiotrofia espinal lateral (LSA).
8. Un polipéptido híbrido que comprende un
fragmento de la toxina tetánica fusionado con al menos una proteína
o péptido, caracterizado porque dicho fragmento de la toxina
tetánica es un fragmento recombinante no tóxico de la toxina
tetánica según la reivindicación 1.
9. Un polipéptido híbrido según la
reivindicación 8 en el que dicha al menos una proteína o péptido
fusionados se seleccionan del grupo constituido por la proteína
SMN, BDNF (factor neurotrófico derivado de cerebro),
NT-3 (neurotrofina-3),
NT-4/5, GDNF (factor neurotrófico derivado de
líneas celulares gliales), IGF (factor de crecimiento similar a la
insulina), PNI (proteasa nexina 1), SPI3 (proteína inhibidora de
proteasas de serina), ICE (enzima transformadora de interleucina 1),
Bcl-2, GFP (proteína verde fluorescente),
endonucleasas como I-SceI o CRE, anticuerpos, fármacos
dirigidos específicamente contra enfermedades neurodegenerativas,
fármacos dirigidos específicamente contra la amiotrofia espinal
lateral (LSA).
10. Un polipéptido híbrido según las
reivindicaciones 8 ó 9, en el que dicha al menos una proteína o
péptido fusionados se fusionan secuencia arriba del fragmento de la
toxina tetánica.
11. Un polipéptido híbrido según las
reivindicaciones 8 ó 9, en el que dicha al menos una proteína o
péptido fusionados se fusionan secuencia abajo del fragmento de la
toxina tetánica.
12. Un polinucleótido que codifica un
polipéptido híbrido según una cualquiera de las reivindicaciones 8
a 11.
13. Un vector que comprende una secuencia de
ácido nucleico que codifica un polipéptido híbrido según una
cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 y un promotor capaz de
expresarse en células neuronales o precursores de células
neuronales y, opcionalmente, un potenciador.
14. Un vector que comprende una secuencia de
ácido nucleico que codifica un polipéptido híbrido según una
cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 y un promotor capaz de
expresarse en células musculares y, opcionalmente, un
potenciador.
15. Un vector según la reivindicación 14,
caracterizado porque dicho vector es el plásmido
pCMV-lacZ-TTC, que ha sido depositado en el C.N.C.M. el 12
de agosto de 1997, con el número de registro
I-1912.
16. Una célula que contiene un polinucleótido
que codifica un polipéptido híbrido según una cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 11.
17. Un fragmento asociado a un polinucleótido
que comprende un fragmento recombinante no tóxico de la toxina
tetánica según la reivindicación 1, ligado químicamente a al menos
un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que
codifica una proteína o un péptido y elementos reguladores de la
expresión.
18. Un fragmento asociado con un polinucleótido
según la reivindicación 17, en el que dicho al menos un
polinucleótido codifica una proteína o péptido seleccionado del
grupo compuesto por la proteína SMN, BDNF (factor neurotrófico
derivado de cerebro), NT-3
(neurotrofina-3), NT-4/5, GDNF
(factor neurotrófico derivado de líneas celulares gliales), IGF
(factor de crecimiento similar a la insulina), PNI (proteasa nexina
I), SPI3 (proteína inhibidora de proteasas de serina), ICE (enzima
transformadora de interleucina 1), Bcl-2, GFP
(proteína verde fluorescente), endonucleasas como I-SceI o
CRE, anticuerpos, fármacos dirigidos específicamente contra
enfermedades neurodegenerativas, fármacos dirigidos específicamente
contra la amiotrofia espinal lateral (LSA).
19. Una célula que contiene un fragmento
asociado a un polinucleótido según una cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 18.
20. Una composición para usar como medicamento
que comprende un polipéptido híbrido según una cualquiera de las
reivindicaciones 8-11, o un polinucleótido según la
reivindicación 12, o un vector según una cualquiera de las
reivindicaciones 13-15, o una célula según la
reivindicación 16, un fragmento asociado a un polinucleótido según
las reivindicaciones 17 ó 18, o una célula según la reivindicación
19.
21. Uso de:
- un polipéptido híbrido que comprende un
fragmento recombinante no tóxico de la toxina tetánica según la
reivindicación 1, fusionado con al menos una proteína o peptido,
o
- un polinucleótido que codifica un polipéptido
híbrido tal, o
- un vector que comprende una secuencia de ácido
nucleico que codifica un polipéptido híbrido tal y un promotor
capaz de expresarse en células neuronales o precursores de células
neuronales o en células musculares, o
- un célula que contiene un polipéptido híbrido
tal, o
- un fragmento asociado a un polipéptido que
comprende un fragmento no tóxico de la toxina tetánica según la
reivindicación 1, ligado químicamente a al menos un polinucleótido
que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una
proteína o péptido y elementos reguladores de la expresión, o
- una célula que contiene un fragmento asociado
a un polinucleótido tal, para la preparación de un medicamento para
el suministro de dicha proteína o péptido fusionados o codificados
a neuronas de segundo orden o de orden superior.
22. Uso según la reivindicación 21,
caracterizado porque dicha composición se destina a la
compensación o la modulación de las funciones bajo el control del
SNC, o a la compensación o la modulación de las funciones del SNC,
o al tratamiento de una enfermedad del SNC.
23. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 21-22, caracterizado porque
dicha al menos una proteína que se va a suministrar al SNC se
selecciona del grupo constituido por la proteína SMN, BDNF (factor
neurotrófico derivado de cerebro), NT-3
(neurotrofina-3), NT-4/5, GDNF
(factor neurotrófico derivado de líneas celulares gliales), IGF
(factor de crecimiento similar a la insulina), PNI (proteasa nexina
I), SPI3 (proteína inhibidora de proteasas de serina), ICE (enzima
transformadora de interleucina 1), Bcl-2, GFP
(proteína verde fluorescente), endonucleasas como I-SceI o
CRE, anticuerpos, fármacos dirigidos específicamente contra
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