KR101413615B1

KR101413615B1 - 인간 프로토피브릴에 선택적인 개선된 항체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101413615B1
Application number: KR1020087023261A
Authority: KR
Inventors: 패어 겔러포스; 라스 란펠트; 닥 제린; 페터손 프리다 에콜름; 힐레비 엥글룬트
Original assignee: 바이오악틱 뉴로사이언스 에이비
Priority date: 2006-03-23
Filing date: 2007-03-23
Publication date: 2014-07-18
Also published as: NZ567888A; ZA200805805B; WO2007108756A1; DK2004688T3; AU2007227813B2; BRPI0709050B1; US9034334B2; EP2004688A1; RU2008141905A; HRP20110203T4; BRPI0709050A2; EP2325209A3; MX2008012223A; JP2009530374A; EP2004688B8; AU2007227813A1; CN101421303B; ATE492561T1; JP5033868B2; US20090258009A1

Abstract

본 발명은 신경퇴행성 질환, 특히 알츠하이머병 및 다른 유사 질환의 예방, 치료 및 진단에 관한 것이다. 더욱 정확하게는, 이의 프로토피브릴 구조에서 아밀로이드 베타 단백질(Aβ)에 선택적인 높은 친화성 10^-7M, 바람직하게는 10^-8M, 10^-9M 미만 또는 10^-10M 또는 10^-11M 항체들 및 Aβ 프로토피브릴의 제거에 효과적이고 염증의 감소된 위험을 가진 높은 Fc 수용체 결합 및 낮은 C1(C1q) 결합을 보유하는 IgG 클래스 및 IgG1 또는 IgG4 서브클래스 또는 이의 조합 또는 이의 돌연변이에 관한 것이다.

신경퇴행성 질환, 프로토피브릴 선택적 항체

Description

인간 프로토피브릴에 선택적인 개선된 항체 및 이의 용도{Improved antibody selective for human protofibrils and the use thereof}

본 발명은 신경퇴행성 질환, 특히 알츠하이머병 및 다른 유사 질환의 예방, 치료 및 진단에 관한 것이다. 더욱 정확하게는, 아밀로이드 베타 단백질(Aβ)의 프로토피브릴 구조에서, 아밀로이드 베타 단백질(Aβ)에 선택적이고, Aβ 프로토피브릴의 제거에 효과적이고 감소된 염증의 위험을 가진 높은, Fc 수용체 결합 및 낮은 C1(C1q) 결합을 보유하는 IgG 클래스 및 IgG1 또는 IgG4 서브클래스 또는 이의 조합 또는 이의 돌연변이의 10^-7M, 바람직하게는 10^-8M, 10^-9M 미만 또는 10^-10M 또는 10^-11M인 고 친화성 항체에 관한 것이다.

알츠하이머병(AD)은 인지, 기억 및 행동 장애를 일으키는 진행성이고, 비가역적인 신경퇴행성 질환이다. 이는 65세 이상의 인구의 약 5% 및 80세 이상의 20%에 영향을 미치는 노인 인구의 치매(dementia)의 가장 일반적인 원인이다. AD는 잠행성 발병과 다중 인지 기능의 진행성 퇴화를 특징으로 한다. 신경 병리학은 세포외 및 세포내 호은성(argyrophillic) 단백질 침전물을 포함한다. 신경반(neuritic plaque)으로 불리는 세포외 침전물은 수상돌기들(부어오르고, 변형된 신경세포 돌기)에 의해 둘러싸인 아밀로이드 베타 단백질(Aβ)로 주로 이루어진다. 이런 세포외 침전물 내의 Aβ는 β-병풍구조를 특징으로 하는 피브릴이다. 이런 침전물에서 Aβ는 특정 염료, 예를 들어, 콩고 레드로 염색될 수 있고 피브릴 울트라 구조를 나타낼 수 있다. 신경반의 피브릴 구조에서 Aβ에 의해 채택된 이런 특징들은 일반 용어인 아밀로이드의 정의이다. 전통적인 세포내 AD 병리학적 장애는 과인산화 미세관-연관단백질인 타우(tau)의 꼬인 가닥으로 이루어진 쌍 나선형 사상체(PHFs)로 불리는 섬유모양 구조로 이루어진 신경섬유다발(NFT)이다. 사후부검 수행 시, 뇌에 빈번한 신경반 및 신경섬유다발 축적은 AD에 대한 진단 기준이다. AD 뇌들은 또한 육안으로 보이는 뇌 위축, 신경세포 손실, 국소 염증(미세아교세포증 및 성성세포증) 및 대뇌혈관 벽에서 종종 대뇌아밀로이드맥관병증(CAA)을 나타낸다.

두 형태의 Aβ 펩타이드, 즉 Aβ40 및 Aβ42는 AD 신경반에서 지배적인 종류인 반면에, Aβ40은 AD와 연관된 대뇌혈관 아밀로이드에서 두드러진 종류이다. Aβ는 효소 활성으로 인해 신체의 모든 세포들에서 건강한 및 AD를 겪는 환자 모두에서 아밀로이드 전구체 단백질(APP)로 불리는 보다 큰 단백질로부터 연속적으로 형성된다. β- 및 γ-세크레타제 활성을 통한 2개의 주요 APP 프로세싱 사건은 Aβ 생산을 가능하게 하는 반면에, α-세크레타제로 불리는 세 번째 효소는 Aβ 서열 내부의 분열에 의해 Aβ 생성을 막는다(Selkoe, 1994; Ester 2001;US5604102). Aβ42는 42개 아미노산 길이의 펩타이드인데, 즉 Aβ40과 비교해서, C-말단에 2개 아미노산이 더 길다. Aβ42는 더욱 친수성이고, Aβ 다이머, Aβ 트라이머, Aβ 테트라머, Aβ 올리고머, Aβ 프로토피브릴 또는 Aβ 피브릴과 같은 Aβ 펩타이드의 더 큰 구조로 더욱 쉽게 응집된다(Jarret 1993). Aβ 피브릴은 소수성이고 불용성인 반면, 다른 구조들은 모두 덜 소수성이고 가용성이다. Aβ 펩타이드의 모든 이들 더 높은 분자 구조들은, 예를 들어 전자 현미경에 의한 구조적 형태, 및 크기-배제 크로마토그래피/웨스턴 블럿으로 분석한 이들의 생물리적 및 생화학적 특징들을 기초로 개별적으로 정해진다. 이런 Aβ 펩타이드, 특히 Aβ42는 수명기간 동안 Aβ의 다양한 더 높은 분자 구조들로 점차적으로 응집할 것이다. 이런 응집 반응이 더욱 빨리 일어난다면 나이에 강하게 의존하는 질환인 AD도 인생에서 보다 빨리 발생할 것이다. 이것은 APP 프로세싱, Aβ42 양 및 이들의 보다 높은 분자 구조로의 결합이 AD의 중요 원인이라고 주장하는 AD의 "아밀로이드 캐스케이드 가설"의 핵심이다. AD 뇌의 모든 다른 신경병리학 및 AD의 증상들, 예컨대 치매는, 어떻게든 Aβ 또는 이들의 결합된 형태들에 의해 야기된다.

Aβ는 다른 길이, 즉, 1-39, 1-40, 1-42 및 1-43 및 절편 크기, 즉, 1-28 및 25-35로 존재할 수 있다. 절단은 펩타이드의 N-말단에서 발생할 수 있다. 모든 이런 펩타이드는 응집할 수 있고, 가용성 중간체 및 불용성 피브릴을 형성할 수 있고, 각 분자 형태는 독특한 구조 형태와 생물리학적 특징을 가진다. 예를 들어, 모노머 Aβ1-42는 정상적인 시냅스 기능에 관여하는 것으로 주장되는 42개의 아미노산 길이의 가용성이고 비독성 펩타이드이다. 특정 조건하에서, Aβ1-42는 다이머, 트라이머, 테트라머, 펜타머 내지 12-mer까지 및 더 큰 올리고머 형태로 응집될 수 있고, 모두는 분자 크기, EM 구조 및 AFM(원자힘 현미경) 형태와 같은 이의 구별된 물리화학적 특징을 가진다. 큰 분자량의 가용성 올리고머 Aβ 형태의 예는 프로토피브릴(Walsh 1997)이고, 겉보기 분자량>100kDa을 가지며 지름 4-11nm 및 길이 <200nm의 곡선형 구조를 가진다. Aβ 프로토피브릴과 같은 가용성 올리고머 Aβ 펩타이드는 해마에서 기억 형성을 나타내는 것으로 생각되는 시냅스 가소성의 기준인 장기상승작용(LTP)을 손상시킨다는 것이 최근에 증명되었다(Walsh 2002). 게다가, 올리고머 북극(Arctic) Aβ 펩타이드는 뇌에서 LTP에 wtAβ보다 훨씬 더 깊은 억제 효과를 나타내는데, 이는 Aβ 프로토피브릴을 형성하는 이들의 강한 경향 때문인 것 같다(Klyubin 2003).

프로토피브릴과 현저하게 상이한, 문헌에 개시된 다른 가용성 올리고머 형태들이 있다. 이런 올리고머 형태 중 하나는 ADDL(아밀로이드 유도 확산 리간드)이다(Lambert 1998). ADDL의 AFM 분석은 17-42kDa의 분자량을 가지며 z-축을 따라 4.7-6.2nm의 현저하게 작은 구상 종들(globular species)을 나타내었다(Stine 1996). 다른 형태는 ASPD(아밀로이드스페로이드)로 불린다(Hoshi 2003). ASPD는 Aβ1-40의 구형 올리고머이다. 독성 연구들은 구형 ASPD >10nm는 더 작은 분자들보다 독성이 더 크다는 것을 보여주었다(Hoshi 2003). 이런 견해는 조발성 AD를 일으키는 북극(E693) APP 돌연변이의 최근 발견으로 지지를 얻었다(US 2002/0162129 Al; Nilsberth et al, 2001). 돌연변이는 Aβ 펩타이드 서열 내부에 위치한다. 돌연변이 운반체는, 예를 들어 북극 Aβ40 및 북극 Aβ42와 같은 Aβ 펩타이드의 변형체를 발생시킬 것이다. 북극 Aβ40 및 북극 Aβ42 모두는 더 큰 분자 구조 즉, 프로토피브릴로 더욱 쉽게 응집될 것이다. 따라서, 북극 돌연변이의 발병 기작은 가용성 더 큰 분자인 프로토피브릴은 AD를 유발하고 특이적인 독특한 에피토프 즉, "AD 질환 에피토프"를 함유한다는 것을 나타낸다.

알츠하이머병(AD) 뇌에서, 세포외 아밀로이드 플라크는 실질(parenchyma)과 혈관벽에서 통상적으로 발견된다. 플라크는 플라크 축적 전에 점차적으로 중합하는 아밀로이드 Aβ38-43 아미노산 길이 소수성이고 자가 응집하는 펩타이드로 구성된다. 가용성 Aβ 올리고머 종들은 아밀로이드 플라크 자체들보다 질환과 더욱 상관관계가 있는 것으로 주장되고 있다(McLean et al, 1999; Naslund et al, 2000). 이런 프리-피브릴라(pre-fibrillar) 중간체 Aβ 중간체들 중에서, 올리고머 형태들이 생체내 및 생체외 모두에서 나쁜 생물학적 효과를 유발하는 것으로 나타났고(Walsh et al., 2002) 따라서 질환 발병학에서 중요한 역할을 할 것이다. 다양한 분자 크기의 여러 올리고머 Aβ 종들이 알려져 있다. 중요한 것은, Aβ의 모노머, 올리고머 및 피브릴 모양의 형태는 다르고 형태 선택성 항체들의 표적이 될 수 있다. 주요 Aβ 병원체의 정체는 비록 일부 증거가 고분자량 Aβ 올리고머는 특히 신경 독성적이라고 나타내고 있지만 명확하지 않다(Hoshi et al., 2003).

조발성 AD를 일으키는 아밀로이드 전구체 단백질(APP) 유전자에서 병원성 돌연변이들이 개시되었다. 이들의 하나인 스웨덴 APP 돌연변이(Mullan et al., 1992)는 Aβ의 양을 증가시킨다. 나머지 하나는 Aβ 도메인 내에 위치한 북극 APP 돌연변이(E693G)는 프로토피브릴, 큰 Aβ 올리고머의 형성을 증가시키는 것으로 발견되었고, 이런 Aβ 중간체들은 특히 병원성이라는 것을 나타낸다(US 2002/0162129 Al; Nilsberth et al, 2001). 북극 APP 돌연변이의 동정과 Aβ APP 프로토피브릴에 대한 독성 효과의 설명은 AD 발병학에서 Aβ 올리고머에 대한 초점을 증가시켰다.

알츠하이머병에 대한 치료 전략으로서 활성 면역은 논문 [Schenk et al. 1999]에 의해 처음 보고되었다. 면역 전략에 대한 목표는 알츠하이머 플라크에서 발견된 Aβ의 피브릴 형태이었다. 백신(AN-1792)으로서 피브릴화된 Aβ를 사용하는 활성 Aβ 백신 접종의 최근 임상 단계 I/II 시험은 소수의 환자들에서 뇌수막염의 발생 때문에 중단해야 했다(Bayer et al., 2005). 이런 연구에서 보여준 부작용들은 혈관벽에서 피브릴 아밀로이드에 대항해 반응하는 항-Aβ 항체들에 의해 일어난 것 같다. CAA에서 피브릴성 아밀로이드는 혈액뇌장벽(BBB)에 매우 근접해 있고 항원-항체 반응은 T-림프구의 CNS 속으로의 침투를 유도하는 BBB에 손상을 일으킬 수 있다(Pfeifer et al, 2002; Racke et al, 2005). 또한, 단지 소수의 참여 환자들만이 Aβ 백신에 대한 면역 반응을 나타내었다. 비록 연구는 조기에 종료되었지만, 활성 Aβ 면역은 AD 환자들의 작은 집단에만 효과가 있다는 것을 알려 주었다.

인간 Aβ 프로토피브릴에 선택적인 단클론 항체들이 개시되었다(US 2002/0162129 A1). 고순도의 안정한 인간 Aβ 프로토피브릴을 생산하는 방법은 북극 돌연변이(Glu22Gly)에 의한 합성 Aβ42 펩타이드를 사용하는 것을 포함한다. 돌연변이는 면역과 Aβ 프로토피브릴 선택성 항체들의 하이브리도마 스크리닝(hybridoma screening)을 촉진한다. 중요한 것은, 이런 항체들은 야생형 Aβ 프로토피브릴과 Aβ-북극 프로토피브릴 모두와 결합한다(PCT/SE 2005/000993).

Aβ 피브릴(O ' Nuallain 2002), 마이셀 Aβ(Kayed 2003), ADDL(Lambert 2001)와 같은 Aβ의 다른 형태에 대해 선택적인 항체들이 개시되었다. 그러나, 이들 중 어느 것도 Aβ 프로토피브릴 선택성이 없다.

본 발명은 알츠하이머병의 예방, 치료 및 진단을 위해 염증의 위험을 감소시키고, IgG 클래스 및 IgG1 또는 IgG4 서브클래스 또는 이의 조합 또는 이의 돌연변이의 고 친화성(10^-7M 미만) Aβ 프로토피브릴 선택적 항체들인 개선된 항체들에 관한 것이다. 상기 항체들은 전통적인 하이브리도마 기술과 항체 처리에 의해 개발되었다.

본 발명은 보체 활성화 및 염증에 대한 위험을 감소시키는 보체 인자 C1q 결합을 감소시키기 위해, Fc 영역의 변이(modifications)와 결합된, "알츠하이머병 에피토프"를 구성하는 Aβ 프로토피브릴인 올리고머 Aβ 형태와 선택적으로 결합하는 항체로부터 VL 및 VH 사슬에 대한 CDR1-3 영역의 공통 아미노산 서열(consensus amino acid sequence)을 개시한다.

항체의 불변부는 많은 중요한 기능, 특히 Fc 수용체와 보체 인자 C1q를 결합하는 기능을 가진다. 후자 기능은 염증 반응을 피하기 위해 비활성화되었다.

요약하면, 이런 형태의 고 친화성 프로토피브릴 선택적 항체들은 다른 공지된 면역치료 처리법과 비교하여 다음과 같은 뚜렷한 장점들을 가진다:

1) 고 친화성을 가진 Aβ 프로토피브릴을 일으키는 질환을 표적화한다

2) 보체 인자 C1q과 약하게 결합하거나 결합하지 않음으로써 염증 부작용, 즉 뇌수막염에 대한 위험을 감소시킨다

3) 고 친화성 항체는 효과적인 치료를 위해 필요한 임상 복용량을 감소시킨다

4) 적절한 복용의 방법을 제공한다

5) 혈관벽에서 Aβ 피브릴, 즉 CAA에 약하게 결합하여 염증 부작용에 대한 위험을 감소시킨다

6) 더 적은 항체가 말초에 결합되고, 따라서 더 많이 혈액뇌장벽을 통과할 것이고 뇌에서 Aβ 올리고머 형태의 결합과 제거에 사용될 것이다.

본 발명의 한 태양은 인간 야생형 Aβ 프로토피브릴(실시예 1)과 결합하는 CDR 영역의 항체 공통 아미노산 서열의 발견이다. 이런 발견은 치료 또는 진단으로 사용하기 위해 야생형 인간 Aβ 프로토피브릴에 대한 높은 친화력과 높은 선택성을 부여하는 결합 부위(CDR 영역)를 의미한다. 면역글로불린(IgG) 분자의 기본 구조는 2개의 동일한 경쇄와 이황화 브리지에 의해 함께 연결된 2개의 동일한 중쇄를 포함한다(도 1). 각각 람다 또는 카파인 경쇄는 각각 대략 110 아미노산 잔기의 가변부(또는 가변 영역)(VL)와 불변부(또는 일정 영역)(CL)를 가진다. 중쇄는 약 110 아미노산 잔기의 가변부(VH)를 가지나 300-400 아미노산 잔기의 훨씬 더 큰 불변부(CH)는 CHγ1, CHγ2 및 CHγ3 영역 또는 도메인을 포함한다.

삭제

불변부(Fc)는 보체 시스템을 활성화하고 감염성 미생물 또는 외부/비-자가 항원들을 섭취하고 파괴하는 대식세포, 소신경세포 및 중성호구 상의 Fc 수용체와 결합한다. 이 기능은 특히 중요한데 이는 항체의 치료 원리의 일부, 즉 Fc 수용체 매개 미세아교세포 식세포작용 및 Aβ 프로토피브릴의 제거이기 때문이다. 다른 항체 매개 제거 메커니즘도 작동하고 있는데, 즉 싱크 가설에 따라 말초에서 Aβ 항체들의 항-응집 특성 및 Aβ 프로토피브릴의 제거이다. 중쇄와 경쇄의 가변부는 상보성 결정 영역(complementary determining region) 또는 CDR로 불리는 3개의 하이퍼 가변부를 함유한다. 이 CDR 영역들은 VL과 VH 영역에 위치한 약 13-23 아미노산 길이의 짧은 범위이다. 항체의 한 "팔(arm)" 상의 6개 CDR 영역은 항원을 결합하는 "주머니"를 형성한다. 도 1은 IgG 면역글로블린과 이의 서브도메인의 기본 구조를 도시한다.

본 발명의 다른 태양은 고 친화성의 프로토피브릴 선택적 항체들에 관한 것이다. 프로토피브릴들의 경우 10^-7M, 바람직하게는 10^-8M, 10^-9M 미만 또는 10^-10M 또는 10^-11M의 범위의 친화성이 개시된다(실시예 2). 이런 항체들은 10^-6M 범위의 친화성을 가진 항체들과 비교하여 더 낮은 양으로 투여될 수 있다는 장점을 가진다. 이것은 주사로 투여되는 이런 고 친화성 항체들은 단지 적은 양의 항체가 효과를 내는데 필요하기 때문에 피하로 제공될 수 있다는 상당한 임상적 장점이 있다. 투여 방법들은 피하 주사에 한정되지 않는다. 게다가, 효과를 위해 필요한 더 적은 양은 항체의 생산을 위한 제품들의 비용을 감소시킬 것이다.

본 발명의 다른 태양은 항체들은 치료용으로 적합한 IgG 클래스라는 것인데 이는 혈액뇌장벽을 통과할 수 있기 때문이다. 뇌 실질에서 Aβ 프로토피브릴의 제거는 소신경세포들에 의한 Fc 수용체 매개 식균작용에 의해 이루어진다. 다른 항-Aβ 제거 메커니즘은 수술하는 것과 유사하다. 가용성 Aβ 프로토피브릴의 이런 제거는 치료의 중심 메커니즘이다. Aβ 프로토피브릴은 매우 신경독성이고, 질환의 진행을 개시하고 촉진하는 것으로 생각된다. 뇌에서 Aβ 프로토피브릴의 제거는 중요한 임상적 가치를 가진다. Aβ 프로토피브릴의 제거 이외에, 다른 Aβ 피브릴을 포함하는 다른 Aβ 올리고머 형태들은 Aβ 프로토피브릴의 제거를 통해 간접적으로 감소될 것인데 이는 다른 Aβ 응집 형태, 즉 다이어, 트라이머, 테트라머 및 프로토피브릴과 피브릴을 포함하는 더 큰 올리고머 형태는 평형상태에 있기 때문이다. Aβ 피브릴을 함유하는 플라크들의 감소의 예는 고 친화성 프로토피브릴 선택적 항체(mAb 158)로 치료한 후 72시간 후 알츠하미머 형질전환 쥐 모델(APP_swe)에서 나타난다(실시예 3). 한편, 상기 항체에 의한 Aβ 프로토피브릴의 제거는 다른 Aβ 응집 또는 올리고머 형태를 간접적으로 감소시키는 장점을 가질 것이다.

본 발명의 또 다른 태양은 뇌의 소신경세포 상에 존재하는 인간 FcγRI 수용체들에 대해 높은 친화성을 가진 IgG1 서브클래스의 고 친화성 인간 Aβ 프로토피브릴 선택적 항체이다. 고 친화성 항체는 상당한 치료 가치를 가지는 효과적인 Aβ 프로토피브릴의 제거를 유도할 것이다. 따라서, 상기 항체들은 다른 Aβ 형태를 표적화하는 IgG1 서브클래스의 다른 단클론 항체들에 의한 단클론 항체 치료 또는 활성 백신과 같은 다른 면역치료 전략들과 비교해서 CNS와 말초 모두에서 Aβ 프로토피브릴의 제거를 나타낼 것이다. 중요하게는, 치료는 Aβ 프로토피브릴과 같은 독성 가용성 Aβ 종들이 증가된 양으로 존재하는 질환 진행의 초기뿐만 아니라 나중에 질환이 진행되는 경우에도 효과적일 것이다. 올리고머 Aβ 형태들의 증가된 양은 스웨덴 및 북극 돌연변이 APP swearc를 나타내는 형질전환 쥐 모델에 개시되었다(Lord A. et al. 2006).

본 발명의 또 다른 태양은 고 친화성 Aβ 프로토피브릴 선택적 항체들은 Aβ 응집을 감소 또는 억제시킴으로써 뇌에서 가용성 올리고머 Aβ 형태들의 양을 감소시킨다는 것이다.

또 다른 본 발명의 태양은 고 친화성 Aβ 프로토피브릴 선택적 항체들은 고 친화성 Aβ의 올리고머 형태들, 즉 CNS 외부의 고 친화성 Aβ 프로토피브릴과 결합할 수 있고 상기 Aβ 형태들의 CNS 레벨을 낮출 수 있는 방식으로 혈액뇌장벽 위로 상기 Aβ 형태들의 평형을 옮긴다(배액).

상기한 대로, 알츠하이머 환자를 치료하는 Aβ 피브릴에 선택적인 상기 Aβ 백신(AN-1792)을 사용하는 엘란 임상 연구는 케이스들의 6%에서 부작용, 즉 뇌수막염을 일으켰다. 뇌 실질뿐만 아니라 중요하게는 혈관 벽들에 존재하는 아밀로이드 플라크들의 코어인 Aβ 피브릴을 표적화하는 전략은 심각한 부작용을 일으켰다. 부작용들은 뇌의 혈관 벽들에서 CAA(대뇌 아밀로이드 맥관병증)에 항체들이 결합함으로써, 염증 반응을 일으키기 시작하여 대부분 일어났다. 이런 심각한 임상적 문제는 감소된 보체 활성화 활성을 가진 개선된 고 친화성 프로토피브릴 선택적 항체들에 의해 피할 수 있게 된다. 이런 항체들은 부작용, 즉 뇌수막염의 Aβ 프로토피브릴 감소된 위험의 높은 제거 효과를 유지할 것이다.

본 발명의 다른 태양은 고 친화성 프로토피브릴 선택적 항체들은 낮은 Aβ 피브릴 결합(실시예 2 참조)을 가지며, CAA에 존재하는 Aβ 피브릴에 덜 결합함으로써 부작용들에 대한 위험을 감소시킨다는 것이다.

본 발명의 또 다른 태양은 고 친화성 Aβ 프로토피브릴 선택성 IgG 항체들은 조작되어 IgG1의 CH2 도메인과 결합하는 보체 인자 C1q를 감소시키고 보체 활성과 염증의 위험을 감소시키는 것이다. 이런 변형은 여러 가지 방식으로 행해질 수 있다. 한 가지 방식은 IgG1 불변부의 CHγ2 도메인이 결실되고, C1q 결합할 수 있게 하는 도메인의 IgG4 또는 일부로부터 상응하는 도메인으로 교환된 키메릭 항체를 제조하는 것이다. IgG4는 C1q와 결합하지 않고 보체 활성화 경로를 활성화하지 않다는 것을 잘 증명되어 있다. 이것을 성취하기 위해서 중쇄(CH)의 불변부는 보체 인자 C1q에 결합하지 않는 IgG4 도메인(CHγ2)을 가진 IgG1에 대한 고 친화성 Fc-수용체 도메인(CHγ3)과 결합하는 방식으로 조작된다. 키메릭 불변 중쇄(IgG1: CHγ1, CHγ2:IgG4, CHγ3:IgG1)를 함유하는 이런 새로운 항체는 Fc-수용체 매개 식균 작용을 통해 Aβ 프로토피브릴의 효과적인 제거, 및 부작용, 즉 뇌수막염과 같은 염증의 감소된 위험성의 중요한 특성들을 갖게 될 것이다.

염증의 위험을 감소시키는 또 다른 방식은 항체의 올리고사카라이드 구조를 변형시켜 보체 인자 C1q 결합 및 보체 활성화를 감소시키는 것이다. 지금까지 인간 IgG1에서 Asn-297에 착물 바이안테너리(biantennary) 올리고사카라이드의 30가지 다른 구조들이 개시되었다. CH2 연관된 탄수화물들의 부재는 항체의 "힌지(hinge)" 영역에 형태 변화를 일으키는 것으로 생각되어, 효과기(effector) 분자들과의 상호작용 효능을 감소시키고, 보체 활성화 기능과 C1q 결합의 손실시킨다.

임의의 다른 아미노산으로 Asn-297의 부위-특이적 돌연변이유발(site-directed mutagenesis)에 의한 고 친화성 인간 Aβ 프로토피브릴 선택적 항체의 변형은 더 적게 C1q 결합을 유지하는 Fc-수용체의 항체를 생산할 것이고, 따라서 특히 혈액뇌장벽에서 염증의 위험을 감소시킬 것이다. 항체에 대한 당화를 변형하는 다른 방법은 효소 N-아세틸글르코사미닐-트랜스페라제 I가 비활성화되는 세포 형태에서 항체를 발현하는 것이다. 이것은 Asn 297에 변형된 탄화수소 구조를 가진 항체를 생산할 것이다. Man₅GlcNAc₂에 한정되지 않는 구조가 형성된다. 이 탄수화물 변형은 보체 인자 C1q 결합을 감소시키고 염증을 억제할 것이다(Wright et al. 1998). 선택적으로, 당화된 프로토피브릴 선택적 항체들은 당화를 억제하는 투니카마이신(tunicamycin)의 존재하에서 항체들을 발현하는 세포들을 배양함으로써 성취될 수 있다. 이런 항체들은 변형된 Fc-수용체 기능뿐만 아니라 변형된 보체 활성화 활성을 가질 것이다(Leathebarrow et al. 1985). 낮은 보체 활성과 높은 Fc-수용체 결합을 가진 항체들을 발현하는 클론들의 스크리닝은 Aβ 프로토피브릴의 제거와 낮은 C1q 결합을 나타내는 프로토피브릴 선택적 항체들을 발생시킬 것이다.

본 발명의 또 다른 태양은 IgG1 서브클래스의 고 친화성 인간 Aβ 프로토피브릴 선택적 항체이고, 여기서 AD의 치료 또는 예방을 위한 보체 인자 C1q의 결합을 감소 또는 억제하는 방식으로 보체 인자 C1q 결합 부위, 즉 Pro331>Ser331는 변형된다(Xu et al. 1994). 인간 IgG1에 위치 331에서 프롤린 잔기는 트레오닌 또는 글리신 또는 임의의 다른 극성 아미노산으로 변할 수 있다. 이런 변형은 부위-특이적 돌연변이유발 또는 DNA 결실과 같은 표준 분자생물학 기술들에 의해 성취될 수 있다.

본 발명의 또 다른 태양은 알츠하이머병에 대한 진단 도구 또는 생체 지표로서 인간 조직들, 특히 뇌척수액(CSF), 혈액, 소변 또는 타액에서 프로토피브릴 양을 특이적으로 결정하는데 고 친화성 인간 Aβ 프로토피브릴 선택적 항체들의 용도이다. CSF 또는 혈액에서 인간 Aβ 프로토피브릴의 양은 알츠하이머병을 갖지 않는 일치된 어른 대조 그룹과 비교해서 다를 가능성이 크다. 알츠하이머병이 진행중인 사람은 CSF 또는 혈액에서 증가된 Aβ 프로토피브릴 수준을 가질 수 있다. 따라서, CSF 또는 혈액에서 Aβ 프로토피브릴 양을 결정함으로써, 질환의 초기 진단을 할 수 있다. 이것은 Aβ 프로토피브릴이 10pM 수준 이하로 결정되는 샌드위치 ELISA 방법(실시예 2A)과 조합한 새로운 고 친화성 Aβ 프로토피브릴 선택적 항체들에 의해 성취할 수 있다. 측정에서 Aβ 피브릴, Aβ 모노머 및 Aβ 절편(1-16; 17-40)과 같은 다른 Aβ형태의 간섭은 10% 미만이다.

본 발명은 또한 알츠하이머병에 대한 가능한 진단 방법을 제공하는, 인간 및 동물 조직, 예를 들어, 뇌척수액, 혈액, 소변 및 뇌 조직에 한정되지 않는 조직에서 Aβ 프로토피브릴의 측정을 위한 고 친화성 프로토피브릴 특이적 항체들의 용도이다. 항-Aβ 프로토피브릴 항체를 사용하는 세포 배양액뿐만 아니라 이런 조직들에서 Aβ 프로토피브릴을 측정하기 위한 적절한 방법들은 ELISA, RIA, 웨스턴 블러팅 또는 도트 블러팅과 같은 면역측정법이다. 상기 방법은 임상 시도에서 다음 치료 효과(프로토피브릴 감소)에 적절할 수 있고 알츠하이머병 또는 다운증후군에 대한 진단 검사로서 적합할 수 있다.

Aβ 프로토피브릴 양이 CSF 및 혈액에서 매우 낮기 때문에, 고 친화성 Aβ 프로토피브릴 선택적 항체는 낮은 양의 Aβ 프로토피브릴을 측정할 수 있도록 ELISA 방법을 기초로 한 진단 검사에 필요하다. 근접 결찰(proximity ligation)(실시예 4)(Gullberg 2004) 또는 유사한 증폭 시스템 또는 바이아코어 또는 유사 기술들과 같은 다른 초민감성 방법이 민감도를 증가시키는데 사용될 수 있다. 근접 결찰 기술은 분석대상물(이 경우 단백질) 상의 다른 에피토프들에 대해 발생된 다른 항체들은 상기 분석대상물 상에 서로 가깝게 결합할 수 있다는 발견에 기초한 것이다. 만일 상기 다른 항체들이 올리고뉴클레오티드와 접합되면, 상기 올리고뉴클레오티드들 사이의 거리는 커넥터 올리고뉴클레오티드에 대해 충분히 짧을 것이고, 결찰 성분들의 도움으로, 올리고뉴클레오티드들 사이에 다리를 형성할 것이다. 증폭 성분들은 RT-PCT이 수행되자마자 첨가된다. 이런 원칙에 의해, 표적 단백질의 정체와 양을 나타내는 증폭가능한 DNA 서열들이 발생된다. 이런 기술은 향상된 신호 반응을 얻게 하며 따라서 더 낮은 농도의 분석대상물을 탐지할 수 있다.

본 발명자들은 놀랍게도 변형된 근접 결찰 기술은 낮은 농도의 더 큰 Aβ 펩타이드 구조, 즉 Aβ 모노머들이 아닌 Aβ 프로토피브릴을 탐지하기 위해서, 이들의 Aβ 프로토피브릴-특이적 항체들과 사용될 수 있다. 이들은 프로토피브릴 형태로, Aβ 펩타이드들은 본 발명에 따른 2개의 항체가 프로토피브릴 상에서 서로 충분히 가깝게 결합하게 하는 구조(반복 단위)를 나타낸다는 것을 발견하였다. 만일 상기 항체들이 올리고뉴클레오티드들과 접합한다면, 상기 올리고뉴클레오티드들은 커넥터 올리고뉴클레오티드를 사용하여 연결될 수 있다. PCR은 증폭 성분들을 사용하여 수행된다. 이런 원리에 의해, 표적 프로토피브릴의 정체와 양을 나타내는 증폭가능한 DNA 서열들이 발생된다(도 4의 A 참조).

근접 결찰 또는 "롤링 서클"로 불리는 기술의 버젼은 매우 민감한 기술이고 알츠하미머병 및 다른 신경퇴행성질환의 진단에 사용되는 Aβ 프로토피브릴과 같은 반복된 서열들을 가진 폴리머 구조들의 탐지에 특히 매우 적합하다.

본 발명은 인간 및 동물 조직에서 Aβ 프로토피브릴의 탐지, 위치측정 및 정량을 위한 영상화에서 고 친화성 프로토피브릴 특이적 항체들의 용도에 관한 것이다. 항체는 탐지 목적들을 위해 I¹³¹, C¹⁴, H³ 또는 갈륨⁶⁸과 같은 그러나 이런 방사능동위원소에 한정되지 않는 방사능활성 리간드로 식별화될 수 있다. 상기 방법은 알츠하이머병 및 다운증후군에 대한 진단 도구로서 적절할 것이다.

본 발명의 또 다른 태양은 가축 의약에 사용하기 특이적인 항체 종들을 제조하는 것이다. 설명된 진단 방법들은 수의사 용도로 적합하다.

본 발명의 다른 태양은 부작용, 즉 치료제 또는 진단제로서 사용될 때 인간에서 상기 항체들에 대항하는 면역반응을 피하기 위해 상기 항체들의 인간화이다.

또 다른 태양은 인간 및 동물에 대한 투여에 적합한, 예를 들어, PBS에 한정되지 않는 PBS인 생리적 버퍼에서 항체의 제제이다. 항체 생성물은 더 나은 안정성을 위해 동결건조될 수 있다. 동결건조된 제제는 동결건조 후 생성물을 안정시키기 위해 만니톨에 한정되지 않는 만니톨과 같은 부형제를 포함할 수 있다.

항체 생성물은 항박테리아제를 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 항체들 또는 절편들은 상기 CDR 영역 및/또는 이의 구조 내에서 아미노산 결실, 치환 및 삽입을 나타낼 수 있다. 삽입되거나 치환된 아미노산들은 항체의 친화성과 특이성이 여전히 온전하다는 조건으로 아미노산 유도체들일 수 있다.

도 1은 IgG 면역글로블린과 이의 서브도메인의 기본 구조를 도시한다.

도 2는 고 친화성 프로토피브릴 선택성 단클론 항체의 특징을 도시한다.

도 3은 형질전환 쥐 모델(APPswe)에서 고 친화성 프로토피브릴 선택적 항체의 치료 효과를 도시한다.

도 4는 근접 결찰 기술에 의해 pM 레벨에서 측정한 인간 Aβ 프로토피브릴을 도시한다.

도 5는 mAb158의 반응성을 도시한다.

도 6은 Aβ 프로토피브릴의 측정 그래프를 도시한다.

도 7은 APP_Arc _- _Swe HEK-세포 배양 배지에서 Aβ 프로토피브릴 농도를 도시한다.

도 8은 mAb158 또는 위약으로 치료 4달 후 APPswearc 형질전환 쥐 뇌 TBS 추출물에서 Aβ 프로토피브릴 양을 도시한다.

도 9는 4달 후 APPswearc 형질전환 쥐 뇌 TBS 추출물에서 전체 Aβ 양을 도시한다.

도 10 및 11은 벡터 지도를 도시한다.

도 12는 키메릭 및 쥐 158 항체들에 의한 Aβ 모노머 결합을 도시한다.

도 13은 키메릭 및 쥐 158 항체들에 대한 결합을 위한 모노머 또는 프로토피 브릴 Aβ의 경쟁을 도시한다.

도 14는 키메릭 158, 쥐 158 항체 및 인간화된 158 항체(BAN2401)에 대한 결합을 위한 모노머 또는 프로토피브릴 Aβ의 경쟁을 도시한다.

다음 실시예들은 설명을 위해 제공되며 본 발명을 이런 특정 실시예들에 한정하려는 것은 아니다.

실시예 1

인간 야생형 Aβ 프로토피브릴 선택성 단클론 항체들을 복제하고 서열화하였다. 가변 중쇄 영역(VH)과 가변 경쇄 영역(VL)의 아미노산 서열은 표 1에 도시된다. CDR 영역 1-3의 위치들은 밑줄쳤고 표 2 및 3에 도시된다. CDR 영역들의 아미노산 서열들 "알츠하이머병 에피토프"를 구성하는 인간 야생형 Aβ 프로토피브릴을 결합하기 위한 구조적 기초를 형성한다.

고 친화성 프로토피브릴 항체 BA9/158을 위한 VL 및 VH의 CDR 영역 1-3의 아미노산 서열은 표 1, 2 및 3에 도시된다. 다른 프로토피브릴 선택적 항체들(BA2, BA3, BA4 및 BA7)의 서열화 데이터는 이런 것들에 한정되지 않는 CDR 영역들의 다른 아미노산 서열들을 제공한다. VH 및 VL 사슬들의 CDR 영역 1-3의 결합된 아미노산 서열들은 고 친화성과 특이성을 가진 인간 Aβ 야생형 프로토피브릴과 결합하는 분자 "주머니"를 생성한다. 이런 "주머니"는 "알츠하이머병 에피토프"의 구조적 기초를 형성한다. CDR 아미노산 서열 길이의 변형들은 VH 사슬 모두에서 관찰되며 VL은 인간 Aβ 프로토피브릴에 대한 양립가능한 결합이다(표 2 및 3). 더 짧은 CDR 영역은 항체의 결합 주머니의 더욱 제한된 3개 3차원 구조를 제공하며, 더 긴 것이 더욱 유연하다.

우리는 표 4 및 5에 도시된 것과 같이 프로토피브릴 특이적 항체들에 대한 인간 VL 및 VH 구조뿐만 아니라 VH 및 VL 사슬의 "쥐 구조" 영역, 즉 CDR 영역의 외부에 아미노산 서열뿐만 아니라 표 1, 2 및 3에 도시된 대로 CDR 서열들을 청구한다. 고 친화성 프로토피브릴 특이적 항체 BA9/158로부터 VL 및 VH의 VL 및 VH 영역 1-3의 구조의 아미노산 서열은 표 4 및 5에 도시된다.

표 1, 2 및 3에 도시된 것 이외의 CDR 영역에 있는 다른 아미노산 치환은 인가 야생형 Aβ 프로토피브릴에 대한 고 친화성과 고 특이성 결합과 양립할 수 있다. 극성 아미노산이 특정 아미노산이 다른 극성 아미노산에 의해 치환될 수 있는 CDR 영역에서 특정 위치에 존재하는 경우, Aβ 프로토피브릴에 대한 고 친화성과 고 특이성이 유지되거나 향상된다. 마찬가지로, 비극성 또는 음성 또는 양성 하전된 아미노산들이 특정 위치에 존재하면, 아미노산은 동일한 그룹의 유사한 아미노산에 의해 치환될 수 있다. 또한, 특정 아미노산 또는 아미노산들은 항체에 유사한 기능과 구조를 부여하는 기능성 동등체에 의해 CDR 영역에서 임의의 위치에서 교환된다.

실시예 2. ELISA 에 의한 고 친화성 인간 Aβ 야생형 프로토피브릴 선택성 단클론 항체의 특징화

실시예 2는 샌드위치 ELISA에 의해 측정된 대로, Aβ 모노머들로 200-1000배 미만 및 Aβ 피브릴로 40배 미만 교차 반응하는 고 친화성 프로토피브릴 선택적 항체들을 도시한다(도 2의 A). 경쟁적인 ELISA 실험들로부터, 항체는 인간 Aβ42 야생형 프로토피브릴에 대한 강한 친화성을 가지나 Aβ 펩타이드 및 Aβ 모노머들의 N-말단 일부에 대해 매우 약한 친화성을 가진다. Aβ의 C-말단 절편에 대한 결합이 관찰되지 않았다(도 2의 B). 게다가, 항체는 메딘 또는 트랜스티레틴과 같은 다른 형태의 아밀로이드와 교차 반응하지 않는다. 게다가 항체는 인간 APP, Aβ의 풍부한 전구체를 인식하지 않는다.

도 2의 A에 샌드위치 ELISA가 도시된다. 항체 158은 웰에서 코팅하고 다른 Aβ 형태를 농도를 증가시켜 웰에 뒤이어 첨가하였다. 결합된 Aβ 형태는 바이오티닐화된 mAb 158과 HRP 식별화된 스트렙타비딘을 첨가함으로써 측정되었다. 색 현상(colour development)은 제조사에 의해 권고된 순서에 따라 측정되었다.

도 2의 B에 경쟁적인 ELISA가 도시된다. ELISA 판은 인간 Aβ 프로토피브릴로 코팅하였다. 이어서 항체 158은 증가된 양의 상이한 Aβ 형태와 함께 배양되었다(경쟁). 배양 믹스를 미세적정(microtiter) 플레이트 웰에 첨가하고 자유 항체를 웰에서 고정된 프로토피브릴에 결합하게 하였다. 결합된 158 항체는 표준 절차를 사용하여 2차 항체에 의해 측정되었다.

실시예 3

고 친화성 Aβ 프로토피브릴 선택적 항체의 효과는 급성 두개내 주사에 의해 알츠하이머 형질전환 쥐 모델(APP_swe)에서 측정하였다. 효과 평가를 위해 사용된 형질전환 쥐들은 스웨덴 돌연변이(APP_swe)를 가진 인간 APP를 발현한다. 이런 전형적인 예에서, 항체들은 뇌 실질의 플라크-풍부 영역 속으로 직접 주사되고 신경병리학에 대한 효과들은 72시간 후 평가된다(wilcock et al., 2003). 다른 연구들은 항-Aβ 항체들의 직접 사용은 생체 내에서 아밀로이드 침전물의 빠른 제거를 일으킨다는 것을 보여주었다(Bacskai et al, 2001; Brendza et al., 2005). 고 친화성 Aβ 프로토피브릴 선택적 항체들의 주사는 APP_swe 쥐 모델에서 유의미한 플라크 감소를 유도한다(도 3).

도 3에서 형질전환 쥐 모델(APP_swe)에서 고 친화성 프로토피브릴 선택적 항체의 치료 효과를 검사하였다. A: A 14개월 APP_swe 형질전환 쥐를 PBS로 두강내 주사하였고 B: 1μg/㎕로 고 친화성 프로토피브릴 선택적 항체(158) 및 주사 후 72 시간 후 검사하였다. Aβ 양의 현저한 제거는 대조군(A; 화살표)과 비교하여 주사 부위(B; 화살표)에 밀접한 해마이행부(subiculum)에서 뚜렷하다.

실시예 4

Aβ 프로토피브릴의 측정을 위해 고 친화성 프로토피브릴 선택적 항체와 조합된 근접 결찰. 인간 야생형 Aβ 프로토피브릴은 10pM-범위 아래로 탐지된 반면에 Aβ 모노머 제제는 전혀 탐지되지 않았다. 초민감성 근접 결찰 방법과 고 친화성 항체의 조합은 특히 유리한데 이는 알츠하이머병 및 프리온 질환, 크로이츠펠트-야콥병, 아밀로이드증 및 파킨슨병과 같은 다른 단백질 "응집" 질환을 진단할 때 특히 적절한 분석대상물의 올리고머 형태만을 측정하는 시스템을 제공하기 때문이다.

도 4에서 인간 Aβ 프로토피브릴은 근접 결찰 기술에 의한 pM 레벨에서 측정된다. 근접 결찰 측정법: 방법 설명(Gullberg et al., 2004): 단계 1, 근접 프로브 쌍과 샘플의 배양(약 1h); 단계 2, 결찰을 위해 필요한 모든 성분의 첨가 및 정량적 PCR에 의한 탐지(약 5분 결찰 시간). 고 친화성 프로토피브릴 선택성 단클론 항체를 측정법에 사용하였다; 단계 3, 정량적 PCR(약 2h). 합성 Aβ 모노머 및 Aβ 프로토피브릴 제제를 희석하고 상기한 근접 결찰 측정법에서 이들의 반응성을 검사하였다.

실시예 5

mAb 158은 유전자 아밀로이드 에피토프를 인식하지 않는다

이전에 보고된 Aβ 형태 의존성 항체들은 올리고머 및 다른 아밀로이드 형성 단백질의 피브릴에 결합하는 것으로 나타났고, 이는 공통 에피토프가 모든 아밀로이드 응집체 상에 존재하는 것을 제안한다. Aβ이외의 다른 아밀로이드 형성 단백질들로부터 프로토피브릴을 발생시키는 것은 기술적으로 어렵기 때문에, mAb158을 다른 아밀로이드 피브릴에 대항해 대신 검사하였다. 도트 블럿 측정법(dot blot assay)이 이런 발현을 위해 사용되었는데, 이는 항체-항원 반응들이 용액에서 일어나는 억제 ELISA가 피브릴과 같은 불용성 항원들에 적합하지 않기 때문이다. 그러나 도트 블럿 측정법은 다양한 Aβ 형태를 위한 항체 특이성의 평가, 즉 프로피브릴과 피브릴에 대한 선택성에 차이들을 측정하는데 적합하지 않다. 메딘, 췌도 아밀로이드 폴리펩타이드(IAPP, islet amyloid polypeptide) 및 α-시뉴클레인의 피브릴들은 이들의 고유 형태들을 유지하기 위해 나이트로셀룰로오스 막 상에 고정화되었다. mAb158은 Aβ 피브릴 이외의 임의의 아밀로이드와 반응성을 나타내지 않았다(도 5의 A). mAb158의 Aβ 피브릴에 대한 결합은 Aβ 프로토피브릴 에피토프의 일부가 Aβ 피브릴 구조에 존재한다는 것을 나타낸다. 양의 대조군으로서 항체 6E10(Aβ), pAb179(메딘), pAb110(IAPP) 및 mAb211(α-시뉴클린)을 사용하였다(도 5의 B). 반복된 실험(n=3)에 의한 대표적 블럿.

mAb158 은 APP 와 결합하지 않는다

APP 및 가용성 APP 절편의 양은 CSR 및 뇌 파쇄액(homogenerate)과 같은 생물학적 샘플에서 Aβ의 양을 통상적으로 초과하며, 따라서 APP에 대한 Aβ-항체의 교차-반응성은 APP에 결합함으로써 치료를 억제할 수 있어서, Aβ 프로토피브릴 및/또는 Aβ 올리고머의 결합과 제거를 위한 자유 항체가 더 적어지게 된다. 또한, Aβ의 샌드위치 ELISA 측정법에 의한 생물학적 샘플들에서 Aβ 프로토피브릴의 측정을 방해할 수 있다. mAb158이 고유 APP에 결합하는지를 설명하기 위해서, 면역침강 실험들을 수행하였다. HEK-세포 배양 배지(가짜, APP_swe 및 APP_Arc-Swe) 및 쥐 뇌 파쇄액(비-형질전환, APP_swe 및 APP_Arc-Swe)을 mAb158 또는 6E10으로 면역침강시키고, 뒤이어 탐지 항체로서 6E10으로 웨스턴 블럿을 변형시켰다(도 5의 C). 도 5의 C에서 볼 수 있듯이, mAb158은 세포 배양 배지로부터 αAPPs 또는 쥐 뇌 파쇄액으로부터 전장 APP를 면역침강시키지 않고, 반면에 예상대로 6E10은 면역침강시켰다. 대조군으로 사용된 합성 Aβ 프로토피브릴들은 항체들 모두에 의해 잘 동일하게 면역침강되었다(도 5의 C). 반복된 실험(n=3)에 의한 대표적 블럿.

실시예 6

Aβ 프로토피브릴 특이적 샌드위치 ELISA의 제조. 생물학적 샘플들에서 Aβ 프로토피브릴의 측정을 하기 위해서 포획 및 탐지 항체 모두로서 mAb158을 가진 샌드위치 ELISA를 제조하였다. 이 측정법은 1pM의 탐지 한계와 250pM까지의 선형 범위로 Aβ 프로토피브릴들을 측정한다(도 6의 A, 라인은 표준 곡선들의 선형회귀분석을 나타낸다). 표준 곡선에 사용된 Aβ 프로토피브릴들의 크기에 관한 불확실성 때문에, 농도 1pM은 비록 프로토피브릴의 분자량은 적어도 100kDa에서 측정되었고, 몰 농도 Aβ 프로토피브릴로 계산된 탐지 한계는 50fM 정도로 낮을 수 있기 때문에 한 Aβ 모노머의 분자량(4514g/mol)을 기초로 한다. Aβ 북극 프로토피브릴들의 표준 곡선은 Aβ 프로토피브릴 크기의 차이들 때문에, 야생형 Aβ 프로토피브릴들보다 더 낮은 신호를 나타내었다(도 6의 A, 도 6의 B). 적정된 합성 LMW-Aβ(저분자량 Aβ). "저분자량 Aβ"이란 용어는 대략 4-12kDa의 분자량을 가진 모노머, 다이머 및 트라이머를 의미한다. Aβ 프로토피브릴 및 Aβ 1-16은 ELISA의 형태 특이성을 평가하는데 사용되었고(도 6의 B), 응집할 것으로 예상되지 않기 때문에 친수성 Aβ 1-16 펩타이드를 사용하였다. 2개의 동일한 항체들로 이루어진 ELISA는 신호를 생산하기 위해 적어도 단백질의 다이머를 필요로 하며 예상대로, Aβ 1-16은 μM-농도에서도 mAb158 샌드위치-ELISA로 탐지되지 않았다(도 6의 B). LMW-Aβ 및 Aβ 프로토피브릴을 응집된 Aβ를 모노머들로 분리하는 것으로 알려진 70% 포름산(FA)으로 선 처리할 때, 샌드위치 ELISA 신호는 사라졌다(데이터 도시되지 않음). 한편, 높은 nM 농도에서 LMW-Aβ의 탐지는 펩타이드 제제의 작은 응집체 함량 때문이다.

생물학적 샘플들에서 천연적으로 발생하는 과량의 모노머 Aβ, holo APP 및 APP-절편들은 포획 항체 코트의 결합 부위들을 차지함으로써 Aβ 프로토피브릴 분석을 간섭할 수 있어서, 프로토피브릴들이 결합하지 못하게 한다. 이 문제는 과량의 Aβ 1-16를 고정 농도의 Aβ 프로토피브릴(모노머 단위로 표현된 50pM)에 첨가하고 이것을 mAb158 ELISA 및 6E10-6E10 샌드위치 ELISA 모두로 분석하여 조사하였다(도 6의 C). Aβ 프로토피브릴과 비교하여 Aβ 1-16의 500 000배의 몰 농도 과량은 예상대로 Aβ 1-16은 포획 항체와 약하게 결합하기 때문에 mAb158 샌드위치 ELISA로 측정을 방해하지 않았다. 반대로, 500배 과량의 Aβ 1-16은 6E10-6E10 ELISA에서 신호를 감소시키기에 충분하였고, Aβ 1-16은 포획 항체에 고 친화성으로 결합한다(도 6의 C). 또한, 합성 Aβ 프로토피브릴들이 가짜 HEK 세포 배양 배지 또는 비-형질전환 쥐 뇌 파쇄액에 첨가될 때, 신호의 90%가 회복되었다(데이터 도시되지 않음).

실시예 7

생물학적 샘플들에서 Aβ 프로토피브릴들의 측정

북극 돌연변이를 가진 세포와 쥐 모델들에서 Aβ 프로토피브릴의 존재가 제안되었으나, 생물학적 샘플들에서 Aβ 프로토피브릴의 직접 측정을 위한 방법이 현재까지 없다. 따라서 mAb158 샌드위치 ELISA는 이런 세포와 쥐 모델들에서 Aβ 프로토피브릴 양을 측정하고 이런 인트라-Aβ 돌연변이 없이 이들과 모델을 비교하는 첫 번째 기회를 제공한다. 단지 스웨덴 돌연변이를 가진 세포들과 쥐들의 샘플들은 야생형 Aβ 프로토피브릴 표준 곡선과 비교한 반면에, 북극 돌연변이를 가진 Aβ를 발현하는 세포들과 쥐들의 샘플들은 Aβ 북극 프로토피브릴 표준 곡선과 비교하였다(도 6의 A). 이런 측정법에서 측정된 모든 Aβ가 가용 상태인 것을 확인하고 Aβ 피브릴에 의한 임의의 어떠한 간섭을 배제하기 위해서, 모든 샘플을 분석하기 전에 17900 x g에서 5분 동안 원심분리하였다. 일시적으로 형질감염(transfection)된 APP_swe 및 APP_Arc-SweHEK-세포들로부터의 세포 배지의 그룹들을 분석하였고, 가짜 HEK-세포 배양 배지와 비교하였다. Aβ 프로토피브릴 양은 트리플리케이트(triplicate)의 평균값으로서 표준 곡선들(도 6의 A)로부터 계산하였고 그런 후에 형질감염 레벨에서의 차이를 보상하기 위해 APP 레벨로 정상화하였다(Stenh 등에 따름). APP_Arc-SweHEK-세포 배양 배지에서 Aβ 프로토피브릴 농도는 APP_swe에서 본 8.2pM(±0.3)보다 현저하게 높은(p<0.0001) 28pM(±2)이었다(도 7의 A). 가짜 배지에서는 Aβ 프로토피브릴이 탐지되지 않는다. Aβ 프로토피브릴의 양은 플라크 및 신경내 Aβ 병리학 모두로 10개월 APP_Arc-Swe및 APP_swe형질전환 쥐들의 뇌에서 측정하였다(Lord 등에 따름). 뇌들을 TBS에서 균질화하였고 가용성 Aβ 부분을 회복하기 위해서 분석 전에 원심분리하였다. 세포 배양 배지를 사용하는 분석과 유사하게, Aβ 프로토피브릴 양은 APP_ArcSwe에서 397pM(±59)및 APP_swe형질전환 쥐 뇌들에서 108pM(±14)으로 그룹들 사이에서 현저하게 달랐다(p=0.005)(도 7의 B).

상기 도면(도 6 및 7)에서 샘플들의 수는 가짜 세포(n=3)이었고 APP_swe(n=8) 및 APP_ArcSwe(n=11)로 일시적으로 형질감염되었다. APP_ArcSwe배지에서 Aβ 프로토피브릴의 양은 APP_swe배지보다 대략 9배 높았던 반면에 가짜 배지는 신호를 나타내지 않았다(A). 비 형질전환 쥐 뇌 파쇄액(n=6)의 TBS-가용성 부분에서 Aβ 프로토피브릴 양의 측정값을 형질전환 쥐들(APP_swe, n=3 및 APP_ArcSwe, n=6)과 비교하였다. 세포 배양 배지와 유사하게, APP_ArcSwe의 Aβ 프로토피브릴의 양은 APP_swe쥐들보다 7배 높았다. 에러 바는 ±SEM을 나타낸다.

실시예 8

mAb158 은 복강내 투여 후 Aβ 프로토피브릴과 APPswearc 형질전환 쥐들에서 전체 Aβ를 현저하게 낮춘다

mAb158(12mg/kg)을 9-10개월 APPswearc 쥐들에게 18주 동안 한 주에 한 번 복강내 주사하였다. 연구 후에, 뇌를 분리하였고 TBS에서 균질화하였고 뒤이어 불용성 물질을 침전하기 위해 원심분리하였다. 불용성 물질을 포름산에서 용해시켰다. 한편, 두 부분, 즉 TBS 부분과 포름산 부분을 쥐 뇌에서 얻었다. TBS 부분에서 Aβ 프로토피브릴 양은 ELISA로 측정하였다. Aβ 프로토피브릴의 현저한 감소가 위약 그룹과 비교해서 mAb158 치료 그룹에서 발견되었다(도 8). 도 8은 mAb158 또는 위약으로 4개월 치료 후 APPswearc 형질절환 쥐 뇌 TBS 추출물에서 Aβ 프로토피브릴 양을 나타낸다.

포름산 부분에서 전체 Aβ는 ELISA에 의해 측정하였다(포름산은 모든 Aβ 형태가 탐지가능하게 하기 위해 모든 Aβ 형태를 용해하는데 사용하였다). 전체 Aβ의 현저한 감소가 위약 그룹과 비교해서 치료 그룹에서 관찰되었다(도 9). 도 9는 mAb158 또는 위약으로 4개월 치료 후 APPswearc 형질절환 쥐 뇌 포름산 추출물에서 Aβ 프로토피브릴 양을 나타낸다.

실시예 9-11

약어

A 아데닌

Ab 프로토콜 AERES 생의약 프로토콜

BHK 아기 햄스터 신장

bp 염기쌍

C 섭씨

C 시토신

CHO 중국 햄스터 난소

CMF 칼슘 및 마그네슘 제거

COS 7 미국 녹색 원숭이 신장 섬유아세포 세포주

dhfr 다이하이드로폴레이트-환원효소

DMEM 듈베코의 변형 이글 배지

DMSO 다이메틸 설폭사이드

DNA 디옥시리보핵산

ELISA 효소면역측정법

FCS 송아지 혈청

g 그램

G 구아닌

hr 시간

HRP 호오스라디쉬 퍼옥시다아제

IgG 면역글로불린

K G 또는 T(IUPAC 협정)

LSAP 큰 가용성 아밀로이드 생성물

mAb 단클론 항체

sec 초

min 분

M A 또는 C(IUPAC 협정)

MTX 미토렉세이트

NIMR 의료 연구를 위한 국립 연구소(영국)

nm 나노미터

OD 광학 밀도

PBS 인산 버퍼 식염수

PCR 중합연쇄반응

R A 또는 G(IUPAC 협정)

RT 실온

S C 또는 G(IUPAC 협정)

T 티민

UV 자외선

V 가변성

V A 또는 C 또는 G(IUPAC 협정)

VH 면역글로불린 중쇄 가변부

VK 면역글로불린 카파 경쇄 가변부

W A 또는 T(IUPAC 협정)

Y C 또는 T(IUPAC 협정)

재료들

장비

장비	UK 공급자	카달로그 번호
DNA 열 순환기: GeneAmp 9600	퍼킨 엘머	N801-0177
UV-램프가 장착된 클래스 II 미생물학적 안정 캐비넷을 함유하는 설정된 조직 배양 실험실	워커 세이프티 캐비넷사	N/a
인노바®벤치 탑 배양기 쉐이커	뉴브린스윅 사이언티픽	4000
벤치 탑 원심분리기	피셔 사이언티픽	C다126-010N
CO2-가스를 채운 37°배양기	로스랩 plc	HSO-501TVBB
미생물 배양기	켄드로/허래우스	B6060
전기작동기 모델: Gene Pulser II	바이오-라드 래브러토리	341BR-3092
ELISA 리더: 마이크로플레이터 리더 3550	바이오-라드 래브러토리	3550
맥킨토시 컴퓨터용 마이크로플레이트 매니저®2.2 데이터 분석 소프트웨어 패키지	바이오-라드 래브러토리	N/a
96-웰 GeneAmp PCR 시스템 9700	ABI	N8050200
ABI PRISM 310 유전 분석기	어플라이드 바이오시스템	310-00-100/120
T100 표면 플라스몬 공명 탐지기	바이아코어

플라스틱 소모품

물품	UK 공급체	카달로그 번호
175cm2 조직 배양 플라스크	스타스테트사	83.1812.002
25cm2 조직 배양 플라스크	코닝 코스타	3056
30ml 만능 용기	스텔린	128C
75cm2 조직 배양 플라스크	스타스테트사	83.1813.002
전기작동 큐벳	바이오-라드 래브러토리	165-2088
ELISA 판: Nunc MaxiSorp	인비트로겐 라이프 테크놀러지	43945A
GeneAmp^TM PCR 반응 튜브	퍼킨 엘머	N801-0180
글라스틱®일회용 세포-카운팅 슬라이드	바이오-스타트 다이그노스틱	887144
Nunc 접종 바늘	라이프 테크놀러지	254399
조직 배양 페트리 100x20mm, 다중-벤트	헬레나 바이오사이언스	93100
조직 배양판: 6-웰 + 마개	코닝	C3516
조직 배양판: 24-웰 + 마개	코닝	C3526

면역학 및 분자 생물학 시약들

물품	UK 공급체	카달로그 번호	로트 번호
1st 가닥 합성 키트	아머샴 바이오사이언스	27-9261-01	3375313
어드밴티지®-HF 2 PCR 키트	클론테크	639123	6040151
아가로스(울트라푸어^TM)	인비트로겐	15510-027	3019491
알부민 소(BSA)	칼비오켐	126575	B65755
앰피실린	시그마	A-9518	B65755
Apa I	프로메가	R636	16007003
테모프라임 + DNA 폴리머라제	아브겐	AB0301	014/0103/11 019/0607/13 020/1808/13
Bam HI	프로메가	R602	15851606
빅다이®터미네이터 v3.0 사이클 시퀀싱 레디 반응 키트	ABI	4390242	0605143 0608154
브롬화 이티듐(10mg/ml)	시그마	E-1510	43H9414
염소 항-인간 IgG(Fc 절편 특이적) 항체	스트라테크 사이언티픽	109-005-098	68215
염소 항-인간 카파 사슬 호오스라디쉬 퍼옥시다아제 접합체	시그마	A7164	032K9157
Hind III	프로메가	R604	16834803
인간 IgG1/카파 항체	더 바인딩 사이트	BP078	223729
K-블루 HRP 기질	스카이바이오	308176	060823
올리고뉴클레오티드	시그마	n.a.
PBS 정제들	시그마	P4417	11K8204
QIAGEN 플라스미드 막시 키트(25)	퀴아겐	12162	124114870
QIA프레 스핀 미니프레 키트	퀴아겐	28106	G10.1.12
레드 스탑 용액(K 블루용)	스카이 바이오사	301475	060104
	퀴아겐	74106	10916587
새우 알칼리성 인산분해효소	USB	70092Y	107635
서브클로닝 효율^TM DH5α^TM 화학적으로 항체반응 유발 대장균	인비트로겐	440098	1164658
T4 DNA 리가아제	프로메가	M1801	167080
HRP용 TMB 원-스탑 기질	스카이 바이오사	KB 176
TOPO-TA 클로닝® 키트	인비트로겐	45-0641	1350772
X-Gal	시그마	B-9146	20965701

의료 연구의 국립 연구소의 용액들

용액 이름	성분들	양
PBS'A' 듈베코스(Ca & Mg 제거)	NaCl KCl Na₂HPO₄ KH₂PO₄ 물	8g 0.2g 0.15g 0.2g 1L
LB	박토 트립톤 효모 추출물 NaCl 물	10g 5g 10g 1L
LB 한천	LB 한천(디프코)	1L 15g

배양 시약들

물품	UK 공급체	카달로그 번호	로트 번호	만료 날짜
글루타맥스TMI, 4500mg/L D-글루코스, 피루브산 나트륨을 가진DMEM(1X) 듈베코의 변형 이글 매질(하이 글루코스)	인비트로겐	41966-047	9206	07/07
DMSO(다이메틸 설폭사이드)	시그마	D2650	125K2409	12/07
페니실린 & 스트렙토마이신	인비트로겐	15070-063	1298401
혈청: 태아 클론 I	페르비오 사이언스	SH30080	AMM17779	12/07
SOC	인비트로겐	15544-034	1306051
트립판 블루	시그마	T8154	19H2388
트립신-EDTA 용액, 검사된 셀 배양액, 0.25%	시그마	T4049	48K2342	04/08

실시예 9 - 158 항체의 DNA 서열

9.1 - RNA 제조

쥐 하이브리도마 158(식별화된 바이알 060824#158 5 x10⁶ 세포)의 급속-냉동된 세포 펠렛을 2006년 10월 3일에 TAG에 의해 받았다. 이런 세포들을 제조사의 프로토콜에 따라 RNA를 분리하기 위해서 퀴아겐 RNeasy 미디 키트를 사용하여 가공하기 전까지 냉동 보관하였다.

9.2 - 1 ^st 가닥 합성

158RNA의 약 5 마이크로그램을 제조사의 프로토콜에 따라 아머샴 바이오사이언스 1st 가닥 합성 키트를 사용하여 158 cDNA를 생산하기 위해 역전사를 시켰다 - 이것은 RT 반응에 의한 DNA 돌연변이를 제거하기 위해서 3개의 독립된 cDNA 생성물(라운드 1, 2 및 3)을 발생시키기 위해 반복되었다.

9.3 158 면역글로불린 cDNA 의 복제

하이브리도마 158 cDNA를 23개 개별 반응에서 PCR에 의해 증폭하였다. 면역글로불린 카파 사슬 가변부(VK) cDNA를 카파 불변부 프라이머 MKC(표6)와 함께 11 VK 프라이머(MKV1-11)를 사용하여 증폭하였다. 유사하게, 면역글로불린 중쇄 가변부(VH) cDNA를 4개 IgG 불변부 프라이머(MHCG1/2a/2b/3:표 7)의 혼합물과 함께 12개 다른 VH 프라이머(MVH1-12)를 사용하여 PCR에 의해 증폭하였다.

IgH PCR 반응의 최초 세트의 결과는 MHV5를 사용하는 단일 증폭 생성물이었다. 다른 11 프라이머 쌍의 어떤 것도 PCR 생성물을 생산하지 못했다. 올리고뉴클레오티드 프라이머들에 의해 준비된 PCR 반응의 생성물: MHV5 + (MHCG1/2a/2b/3 혼합물)을 TOPO-TA 클로닝^® 키트를 사용하여 pCR2.1^®-TOPO^® 벡터 속으로 결찰하였다. IgK PCR 반응들의 최초 세트의 결과는 MKC와 프라이머 MKV1 및 MKV2를 사용하는 2개 단일 증폭 생성물이었다. 다른 9개 프라이머 쌍은 생성물을 발생시키지 않았다. 올리고뉴클레오티드 프라이머들에 의해 준비된 PCR 반응의 생성물들: MKV1 또는 MKV2 + MKC를 TOPO-TA 클로닝^? 키트를 사용하여 pCR2.1^?-TOPO^? 벡터 속으로 결찰하 였다. 결찰된 벡터로 변형된 대장균 TOP 10 박테리아를 한천 그리드 상에서 및 PCR 스크리닝 혼합물 속으로 선택함으로써 LB/앰피실린/X-갈 한천 판에 복제하였다. 복제된 플라스미드 삽입물들을 PCR 증폭에 의해 선별하였다. PCR 생성물들을 겔 전기이동하였고 정확한-크기 PCR 증폭 생성물(대략 500bp)을 생산하는 클론들을 동정하였다. 각 클론의 하루 배양액(5ml)을 QIAprep 스핀 미니프렙 키트 프로토콜(Spin Miniprep Kit Protocol)을 사용하여 가공하여 DNA 플라스미드 미니프렙을 생산하였다.

9.4 - cDNA 서열 측정

RT-PCR, 복제 및 DNA 서열 분석의 완벽한 주기를 각 면역글로불린 사슬에 대한 서열 정보의 3개의 완전히 독립된 세트를 얻기 위해서 반복하였다. RT-PCR 반응들의 각 독립 세트로부터의 플라스미드 클론들은 1212 및 1233 프라이머(표 10)를 사용하여 양 방향에서 서열화하였다. 플라스미드는 바이오다이®터미네이터 v3.0 사이클 시퀀싱 레디 반응 키트(ABI)를 사용하여 서열화하였고, GeneAmp 9600 PCR 장치상에서 순환하고 ABI 310 모세관 시퀀서 상에서 분석하였다.

9.5 - 158 VK DNA 서열

1^st 가닥 cDNAs 라운드 1 및 2에서 PCR 프라이머 MKV2 및 MKC를 사용하여 발생된 VK 클론들의 서열들은 MOPC-21, SP2 및 Ag8과 같은 악성종양 융합 파트너로부터 발생한 살균 카파 복사물과 동일하였다. 이것은 살균 복사물이다. 1^st 가닥 cDNAs 라운드 1-3에서 PCR 프라이머 MKV2 및 MKC를 사용하여 발생된 VK 클론들의 공통 서열(158VK)은 표 11에 도시된다. 이것은 기능성 배치이다. 표 11은 표 1, 4 및 5에 도시된 서열과 일부 차이들을 나타낸다. 이런 차이들은 PCR 프라이머가 위치되어 있는 FW1 영역에 있다. 우리의 프라이머들에 의해 암호화되지 않은 158VK에서 리더의 절편과 가장 동일한 쥐 VK 리더 서열은 K5.1#(표 12)이었다. #K5.1 신호 서열을 정확하게 절단하는 신호 펩타이드에 대한 예측은 예측 프로그램에 의해 수행되었다. 가장 유사하게 예상된 절단 부위는 정확하게 아미노산 잔기 19 및 20 사이이었다(표 13). 키메릭 158VK 단백질 및 DNA 서열은 표 14에 도시된다.

9.6 - 158 VH DNA 서열

1^st 가닥 cDNAs 라운드 1-3에서 PCR 프라이머 MHV5 및 MHCG1/2a/2b/3 혼합물을 사용하여 발생된 VH 클론들의 공통 서열(158VH)은 표 15에 도시된다. 158VK와 함께, 표 1, 4 및 5에 도시된 FW1 서열과 일부 차이들이 있다. 우리의 프라이머들에 의해 암호화되지 않은 리더의 절편과 가장 동일한 쥐 VH 리더 서열은 NL-1이었다(표 16).

실시예 10 - 키메릭 발현 벡터들의 제조

키메릭 발현 벡터들의 제조는 Hin dIII 제한 부위 및 코작 서열 이후에, VH 및 VK에 적절한 리더 서열을 첨가하는 것을 포함한다. 코작 서열(표 8)은 가변부 서열의 효과적인 번역을 가능하게 한다. 이것은 리보솜이 번역을 개시할 수 있고 가장 중요한 염기가 AUG 출발의 상부인, 위치-3에 있는 아데닌인 정확한 AUG 코돈을 정의한다. 리더 서열은 Kabat 데이터베이스에서 가장 유사한 쥐 리더 서열로서 선택된다. 이런 첨가들은 포워드 프라이머 내에서 암호화된다(표 9). 게다가, 키메릭 발현 벡터의 제조는 158의 J 영역의 3'말단과 이웃한 천연 Apa I 제한 부위까지, 인간 γ1 불변부의 5'절편을 주입하는 것을 포함한다. CH는 삽입된 VH 서열의 발현 벡터 하부에서 암호화되나 V-C 인트론이 없다. 경쇄의 경우에, 천연 스플라이스 도너 부위(표 8) 및 Bam HI 부위는 V 영역의 하부에 첨가된다. 스플라이스 도너 서열은 VK의 불변부에 대한 인프레임 부착에 필수적인 카파 V:C 인트론을 접합하는 것을 용이하게 한다. 쥐 VH 및 VK 유전자들은 임의의 원치 않는 스플라이스 도너 부위, 스플라이스 억셉터 부위, 코작 서열 기능성 전체 항체의 서브클로닝 및/또는 발현을 나중에 간섭할 수 있는 임의의 여분의 서브-클로닝 제한 부위의 존재를 확인하기 위해 분석되었다. 이 경우 아무것도 발견되지 않았다.

10.1 - 발현 벡터들

발현 벡터들 pKN100 및 pG1D200의 플라스미드 DNA 제제는 제조사 프로토콜에 다라 퀴아겐 맥시 키트를 사용하여 정제하였다. TOP10 박테리아의 500ml 배양액으로부터 QIAGEM 플라스미드 미디 및 맥시 키트를 사용하는 DNA 정제는 각 벡터로 트랜스펙트되었다. 벡터 지도는 도 10과 도 11에 도시된다.

10.2 - 경쇄 키메라화 프라이머들(chimerisation primers)

쥐 리더 서열 K5.1#을 키메릭 158 VK의 구조 속에 포함시켰다. 프라이머들은 이런 완전한 리더 및 pKN100 발현 벡터 속으로 복제하기 위한 말단 제한 부위 Hind III 및 Bam HI를 가진 158 VK를 함유하는 PCR 생성물을 발생시키도록 설계되었다(표 9). 포워드 프라이머 158v1은 Hind III 제한 부위; 코작 부위 및 K5.1# 리더 서열을 제공한다. 백 프라이머 158vlrev는 스플라이스 도너 부위 및 Bam HI 제한 부위를 제공한다.

10.3 - 중쇄 키메라화 프라이머들

리더 서열 NL-1을 키메릭 158 VH의 구조 속에 포함시켰다. 프라이머들은 이 리더 및 158VH 영역을 함유하는 PCR 생성물을 발생시키도록 설계되었고, pG1D200 발현 벡터 속으로 복제하기 위한 말단 제한 부위 Hin dIII 및 Apa I를 가진다. 이들은 표 9에 도시된다. 포워드 프라이머, 158vh는 Hin dIII 제한 부위; 코작 번역 개시 부위 및 NL-1 리더 서열을 제공한다. 백 프라이머, 158vhrev는 γ1 C 영역의 5'말단 및 천연 Apa I 제한 부위를 제공한다. VK의 리더 신호를 위한 신호 펩타이드 분열 부위는 표 17에 도시된다.

10.4 - 키메릭 158 VH 구조물: pG1D200158VH 의 발생

158 VH DNA 절편은 프라이머들:158vh 및 158vhrev로 증폭하였다(표 9). 450bp(대략) PCR 생성물은 벡터 pCR2.1 속으로 결찰된 T-A이었고 화학적으로 완전한 TOP10 박테리아를 변형시키는데 사용하였다. 클론들은 적절한 삽입물 크기로 선택하고 1212 프라이머를 사용하여 서열화하였다(표 10). 정확한 발현 삽입물은 pG1D200 발현 벡터 속으로 서브클론되었고 정확한 서브클론은 프라이머 BDSH61R를 사용하는 DNA 서열화에 의해 선택하였다(표 10). 이 클론은 제조사 프로토콜을 사용하는 퀴아겐 맥시 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 생산하기 위해 200ml 배양액에서 성장되었다. 키메릭 158VH 단백질과 DNA 서열은 표 18에 도시된다.

10.5 - 키메릭 158 VK 구조물: pKN100158VK 의 발생

158 VK DNA 절편을 프라이머 158v1 및 158vlrev로 증폭하였다(표 9). 450bp(대략) PCR 생성물은 벡터 pCR2.1 속으로 결찰된 T-A이었고 화학적으로 완전한 TOP10 박테리아를 변형시키는데 사용하였다. 클론들은 적절한 삽입물 크기로 선택하고 1212 프라이머를 사용하여 서열화하였다(표 10). 정확한 클론은 pKN100 발현 벡터 속으로 서브클론되었다. 정확한 서브클론은 삽입물 크기에 대한 스크리닝과 프라이머 Hu-K2를 사용하는 DNA 서열화에 의해 선택하였다(표 10). 이 클론은 제조사 프로토콜을 사용하는 퀴아겐 맥시 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 생산하기 위해 200ml 배양액에서 성장하였다.

실시예 11 - 키메릭 158 항체의 생산과 결합 특성들

11.1 - COS 7 세포 변형 및 세포 배양

COS 7 세포들의 한 병을 해동하고 10% 소 클론 I 혈청 및 항생물질로 보충된 DMEM에서 성장시켰다. 한 주 후, 세포들(10⁷/ml에서 0.8ml)을 pG1D200158VH와 pKN100158VK(각각 10㎍ DNA)로 전기천공하였다. 세포들은 3일 동안 페트리 접시에서 8ml의 성장 배지에서 성장하였다.

11.2 - 키메릭 항체 생산

샌드위치 ELISA를 사용하여 COS 7 상청액에서 항체 농도를 측정하였다. 키메릭 158 VH x 158 VK 항체는 일시적으로 공동-형질감염된 COS 세포 제어된 배지에서 0.3㎍/ml에서 그리고 뒤이어 3.7㎍/ml에서(표 19) 발현되었다.

11.3 - 키메릭 항체 활성

2개 ELISA를 사용하여 키메릭 158의 항원 결합을 분석하였다. 3.7㎍/ml 키메릭 항체 제어된 배지를 사용하여, Aβ 모노머에 대한 결합은 직접 ELISA 프로토콜(도 12)에 의해 측정하고 쥐 158IgG와 비교하였다. 두 번째로, 경쟁 ELISA는 항체와 유체 상에서 혼합된 모노머 또는 프로토피브릴을 사용하여 수행하였고, 뒤이어 고체상에서 Aβ 모노머에 결합하였다(도 13). 이런 것들은 키메릭 158 항체는 아밀로이드 Aβ 모노머에 결합하고 프로토피브릴은 유사하게 원래 158 쥐 항체에 결합한다는 것을 나타내었다.

의견

나중 서열화는 표 1과 4에 도시된 쥐 항체 서열 데이터는 5'말단에서 VH 및 VK 사슬 모두에 에러를 포함한다는 것을 보여주었다. 우리는 이것은 V 영역 내에 위치한 프라이머들의 사용 때문이라고 주장한다. 나중 서열화에서, V 영역들 내에서 돌연변이를 유도하지 않는 리더 서열들 내에 위치한 프라이머들을 사용하였다. 나중 서열화는 서열 차이들을 보여주었다(표 15 및 11 참조). 그러나 상기 차이들은 CDR 영역 내에 위치하지 않는다.

키메릭 항체는 각각 직접 결합 ELISA 및 경쟁 ELISA에 의해 도시된 대로 아밀로이드 Aβ 모노머 및 프로토피브릴과 결합한다. 이런 증거는 158 VH 및 158 VK 사슬들의 조합은 항-LSAP 항체 158를 암호화한다는 것을 입증하고 이런 서열들은 인간화된 158 항체를 생산하기 위해 인간화 방법에 적합하다는 것을 나타낸다.

실시예 12 - 인간화된 항체 설계 및 논의

약어 및 정의

158 쥐 단클론 항-LSAP^TM 항체 158

158 VH 쥐 158 항체의 VH

158 VK 쥐 158 항체의 VK

158RKAss 크립틱 스플라이스 부위를 보유하는 158VK의 인간화된 형태

158RKA 크립틱 스플라이스 부위가 제거된 158VK의 인간화된 형태

158RHAss 크립틱 스플라이스 부위를 보유하는 158VH의 인간화된 형태

158RHA 크립틱 스플라이스 부위가 제거된 158VH의 인간화된 형태

A 아데닌

bp 염기쌍

C 시토신

CDR Kabat 넘버링 시스템에서 정의된, 면역글로불린 가변부

에서 상보성 결정 영역

D-유전자 다양성 유전자

DNA 데옥시리보핵산

FW 구조 영역: CDR 영역을 제외한 면역글로불린 가변부

G 구아닌

IgG 면역글로불린 G

J-유전자 결합 유전자

Kabat 엘빈 에이 Kabat에 의해 창시된 면역글로불린 배열 및

넘버링 시스템

mAb 단클론 항체

MRCT 의료 연구 의회 기술

T 티민

VCI 버니어(vernier) 또는 카노니컬(canonical)

또는 VH-VL 계면으로 분류된 구조 잔기

V-유전자 완전한 VH 또는 VK를 발생시키는 J(및 VH의 경우 D) 유전자

와 함께 배열된 유전자 단편

V 영역 다른 항체들 사이의 사열에서 가변인 IgG 사슬들의 단편. 이것은 경쇄에서 Kabat 잔기 109 및 중쇄에서

113까지 연장된다.

VH 면역글로불린 중쇄 가변부

VK 면역글로불린 카파 경쇄 가변부

장비

하드웨어 & 소프트웨어	출처
SGW02 컴퓨터	실리콘 그래픽스
PC 컴퓨터	헤우레트 팩카드
SR 7.6	스티브 스테릴, 웰컴 트러스트 생커 인스티튜드, 캠브리지
Lasergene 6.0	디엔에이스타사
Modeler 9.0	액셀리스사
SignalP	www.cbs.dtu.dk
BlastP	www.ncbi.nlm.nih.gov

12.1 - 인간 V 유전자 데이터베이스

국제 면역학 데이터베이스 2006 및 면역학 대상(최종 업데이트 1999년 11월 17일)의 단백질들의 서열들의 Kabat 데이터베이스 방출 5로부터의 인간 및 쥐 면역글로불린의 단백질 서열들은 Kabat 배열에서 면역글로불린 단백질 서열들의 데이터베이스를 컴파일하는데 사용하였다. 우리 데이터는 9322 인간 VH 및 2689 인간 VK 서열들을 포함한다. 서열 분석 프로그램, SR 7.6은 158VH 및 158VK 단백질 서열을 가진 인간 VH 및 VK 데이터베이스를 질문하는데 사용하였다(표 20).

12.2 - 158 RHA 를 위한 인간 구조의 선택

12.2.1 - 158 VH 와 인간 VH 서열들의 비교

V-영역 구조(FW) 내에 위치하고, 버니어(FooteJ. and G. Winter. 1992. Antibody framework residues affecting the conformation of the hypervariable loops. J Mol . Biol. 224:487-499.), 카노니컬(Morea,V., A.M.Lesk, and A.Tramontano. 2000. Antibody modeling: implications for engineering and design. Methods 20:267-279) 및 VH-VL 계면(Chothia,C, J.Novotny, R.Bruccoleri, and M.Karplus. 1985. Domain association in immunoglobulin molecules. The packing of variable domains. J Mol . Biol . 186:651-663) (VCI) 잔기에서 158VH와 최고의 동일성을 가진 인간 VH 서열들은 표 21에 도시된다. 158과 동일한 VCI 잔기(VCI 스코어) 및 FW 잔기(FW 스코어)의 수도 도시된다. 모든 이런 VH 서열들은 표 21에 도시된 대로, 동일한 VCI 잔기들 및 CDR 길이를 공유한다. AJ556669는 데이터세트에 있는 다른 인간 서열들에서 볼 수 없는 예외적인 Pro74를 가져서, 최초 분석에서 무시하게 한다. 그러나 Pro74는 158VH 서열에 존재하여서, AJ556669는 만일 AF062243을 기초로 한 VH 구조물이 항원과 결합하지 않는다면 인간화를 위한 다 른 FW로 고려할 수 있다. 이런 서열들(표 23)의 배열은 이들의 차이를 강조한다. 이런 데이터세트 내에 유일한 AF062243은 보존성 변화 T(82a)S와 F79의 보존을 가진다. AF062243의 다른 특징들은 보존성 변화 D1E, K19R, A23S, T77S, S118T이다. 모든 다른 FW 변화들은 표 23에 있는 모든 구조에 공통되었다. AF062243은 158RHA를 배치시키는 구조로 선택하였다.

12.3 - 158 RHA 의 생성

158RHA의 구조는 158VH로부터의 CDR 1, 2 및 3을 AF062243의 수용체 FW 속으로 간단히 접붙이기하는 것이다. AF062243과 가장 동일한 인간 생식세포 V-유전자는 VHM99649(VH3-07)(표 24)이고, 이로부터 리더 펩타이드를 추출하였다(표 25). 신호 P 알고리즘(Nielsen,H., J.Engelbrecht, S.Brunak, and G.von Heijne. 1997. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Eng 10:1-6)은 신호 펩타이드로 적절하게 절단할 수 있다는 것을 예측하였다(표 26). 표 27은 158RHA 단백질 서열을 생산하기 위해 8 VH CDR 1, 2 및 3을 AF062243FW 속으로 접붙이기하는 방법을 도시한다. 표 28은 158VH 및 AF062243의 천연 DNA 서열들로부터 DNA 서열 158RHAss의 발생을 도시한다. 158RHAss DNA 서열의 분석은 스플라이스 도너 부위의 존재를 예측하였고, 이의 예측 스코어는 표 29에 도시된다. 비 암호화 돌연변이들은 최종 158RHA DNA 서열을 생산하기 위해 표 30에 도시된 대로, 이런 예상된 스플라이스 부위들을 불활성화하도록 제공되었다(표 31).

12.4 - 158 RKA 를 위한 인간 구조의 선택

12.4.1 - 158 VK 와 인간 VK 서열들과의 비교

VCI 잔기들에서 158VK와 최고의 동일성을 가진 인간 VK 서열들은 158VK와 동일한 I 잔기들(VCI 스코어) 및 FW 잔기들(FW 스코어)과 함께 표 32에 도시된다. 11개 서열들은 158VK와 동일한 모든 VCI 잔기들을 가진다. 표 33은 모든 이런 서열들은 158VK와 동일한 CDR 길이를 가진다는 것을 보여준다. 표 34는 이들의 차이를 강조하며, K45는 또한 I85를 보유하는 B064054에 보유된다는 것을 보여준다. G100P 변화는 P100이 일반적이고, 인간 VK 데이터베이스에서 15%의 발생율을 갖기 때문에 주위를 끌지 못한다. 2개의 치환: T7S 및 K74R은 보존성이고 모든 다른 치환은 표 34의 모든 서열들에 공통되었다. 이런 이유들로 AB064054는 158RKA를 생산하도록 선택되었다.

12.5 - 158 RKA 의 생성

158RKA의 구조는 158VH로부터의 CDR 1, 2 및 3을 인간 AB064054의 수용체 FW 속으로 간단히 접붙이기하는 것이다. AB064054와 가장 근접한 생식세포 V-유전자는 A19(표 35)이고, 이로부터 리더 펩타이드를 추출하였다(표 36). 신호 P 알고리즘은 이 리더 펩타이드의 적절한 절단(표 37)을 예측하였다. 표 38은 158VK CDR의 AB064054의 FW 속으로의 삽입에 의해 158RKA의 단백질 서열의 발생을 도시한다. 표 39는 158VK 및 AB064054의 천연 DNA 서열들로부터 DNA 서열 158RKAss의 발생을 도시한다. 158RKAss의 분석은 스플라이스 도너 부위의 존재를 예측하였고, 이의 예측 스코어는 표 40에 도시된다. 비 암호화 돌연변이들(41)은 이런 부위들을 불활성화하고 최종 158RKA DNA 구조물을 생성하도록 제공되었다(표 42).

12.6 인간화된 항체( BAN2401 ) 결합 활성

158RKA 및 158RHA 유전자들을 IgG1 불변부를 함유하는 발현 벡터 속으로 삽입하였다. 이런 구조물은 COS 세포에서 발현되어 인간화된 158 항체를 생성하였다. 인간화된 158 항체는 경쟁 ELISA에서 결합 활성과 특이성에 대해 검사하였다. 인간화된 항체는 mAb158과 158 키메릭 항체와 동일한 결합 특성들을 나타내었다(도 14 참조).

12.7 158 RHA 및 158 RKA 사슬에서 추가 돌연변이

쥐 생식세포 V 유전자 VH AAK71612와 158VH를 비교함으로써 CDR2에 있는 단일 체세포 돌연변이 A60G를 동정하였다. 게다가, 항체 158의 분자 모델은 158RHA에서 보존되지 않는 5Å의 CDR 잔기들 내에 3개 VH FW 잔기들을 함유한다. 이런 치환들은 D1E, P74A 및 T82S이다(표 43). 유사하게는, 158RKA에서 보존되지 않은 5Å의 CDR 잔기들 내에 2개 VK FW 잔기들이 있다. 이런 치환은 L3V 및 G100P(표 44)이다. 위치 VH-1, VH-74, VH-82, VK-3 및 VK-100에서 백 돌연변이의 인간화된 버젼 158RHB, 158RHC, 158RHD, 158RKB 및 158RKC에서 158RHA 및 158RKA 속으로의 도입이 표 43 및 44에 도시된다.

참조문헌

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본 발명의 내용 중에 포함되어 있음

Claims

인간 Aβ(아밀로이드 베타 단백질) 프로토피브릴(protofibril)에 결합하는 항체로서, 상기 항체는 중쇄(heavy chain) 및 경쇄(light chain)를 포함하고, 상기 중쇄는 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCSASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGSSTIYYGDTVKGRFTISRDNAKNSLFLQMSSLRAEDTAVYYCAREGGYYYGRSYYTMDYWGQGTTVTVS의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄는 DVVMTQSPLSLPVTPGAPASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRESGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAEDVGIYYCFQGSHVPPTFGPGTKLEIK의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체.
제 1 항에 있어서,

상기 항체는 단클론(monoclonal) 항체인 것인 항체.
제 2 항에 있어서,

상기 단클론 항체는 인간화된(humanized) 항체인 것인 항체.
제 3 항에 있어서,

상기 인간화된 항체는 인간 불변부(constant region, Fc)를 포함하는 것인 항체.
제 4 항에 있어서,

상기 인간 불변부는 IgG 클래스인 것인 항체.
제 4 항에 있어서,

상기 인간 불변부는 IgG1 또는 IgG4 서브클래스인 것인 항체.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따르는 항체 및 약학적으로 허용가능한 버퍼(buffer)를 포함하는 알츠하이머병(Alzheimer's disease)의 치료제인 약학적 조성물.
(a) SFGMH의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1;

(b) YISSGSSTIYYGDTVKG의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2;

(c) EGGYYYGRSYYTMDY의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3;

(d) RSSQSIVHSNGNTYLE의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1;

(e) KVSNRFS의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및

(f) FQGSHVPPT의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3

을 포함하는 인간 Aβ(아밀로이드 베타 단백질) 프로토피브릴(protofibril)에 결합하는 항체 또는 그의 절편.
제 8 항에 있어서,

상기 항체 또는 그의 절편은 단클론 항체 또는 그의 절편인 것인 항체 또는 그의 절편.
제 9 항에 있어서,

상기 단클론 항체 또는 그의 절편은 인간화된 항체 또는 그의 절편인 것인 항체 또는 그의 절편.
제 10 항에 있어서,

상기 인간화된 항체 또는 그의 절편은 인간 불변부(constant region, Fc)를 포함하는 것인 항체 또는 그의 절편.
제 11 항에 있어서,

상기 인간 불변부는 IgG 클래스인 것인 항체 또는 그의 절편.
제 11 항에 있어서,

상기 인간 불변부는 IgG1 또는 IgG4 서브클래스인 것인 항체 또는 그의 절편.
제 8 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따르는 항체 또는 그의 절편 및 약학적으로 허용가능한 버퍼를 포함하는 알츠하이머병(Alzheimer's disease)의 치료제인 약학적 조성물.
제 1 항 내지 제 6 항, 또는 제 8 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 정의된 항체를 Aβ(아밀로이드 베타 단백질) 프로토피브릴을 포함하거나 포함하는 것으로 의심되는 생물학적 샘플에 첨가하는 단계; 및

상기 Aβ 프로토피브릴 및 항체 사이에 형성된 컴플렉스(complex)의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 시험관 내에서(in vitro) Aβ 프로토피브릴의 탐지 방법.
제 15 항에 있어서,

상기 탐지 방법은 면역측정법(immunoassay)인 것인 탐지 방법.
제 15 항에 있어서,

상기 탐지 방법은 근접 결찰 측정법(proximity ligation assay)인 것인 탐지 방법.
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