JPS63240797A - モノクローナル抗体、その製法およびそれを含有する診断薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は数の異常なヒトの染色体からコードされる膜た
んぱく質に特異的に結合するモノクローナル抗体、その
製法並びに該抗体を含有する染色体異常症の診断薬に関
するものである。

〔従来の技術〕

近年、遺伝疾患および非遺伝性の染色体の先天異常症が
増加してきており、この傾向は世界的な現象となってい
る。これら異常症の医学的解明は、近年に至るまで外的
要因の分析が主で遺伝的要因、特に染色体の異常に関す
る分析・検査方法は非常に限られていた。何故なら、染
色体は通常の細胞では観察することはできず、***期に
ある細胞でしか見られないためその固定方法に特殊技術
が必要であったためである。従、って、染色体異常の早
期診断、特に出生前診断は社会的要求であり、容易で信
頼性の高い診断方法の確立が求められている。

染色体異常の受精卵は妊娠早期に自然淘汰されることが
多いが、出生児の約１％は異常のままで出産され、その
多くが奇形や強度の精神発達障害を伴う。染色体異常の
種類は、数の異常と構造の異常とに大別され、１個の卵
子に２個の***が受精した三倍体は出生しても成長しな
いのに対し、同一の染色体が核内に過剰に存在するトリ
ソミー（核内に４７本の染色体をもつものをいう。通常
は４６本。）疾患者は精神的、肉体的異常を伴いながら
成長するため、社会全体としての取り組みが要望されて
いる。例えば、染色体２１番の数が１本過剰にあるもの
（２１−）リソミー）がダウン症候群（以下単に「ダウ
ン氏病」と呼ぶ）である、ダウン氏病の出生率は近年の
高齢結婚の増加に伴い、高い値を示す傾向にあり、出生
前の早期診断の方法が望まれている。

また、近年、人間の平均寿命が延びる一方においてアル
ツハイマー症、いわゆる老人性痴呆症の患者数が増加し
大きな社会問題となりつつある。

アルツハイマー症は通例６０才を過ぎて発症するが、予
防及び治療の面から早期診断の方法が望まれている。従
来、アルツハイマー症の生前診断は心理学的テスト及び
脳画像所見（ＣＴ、ＰＥＴなど）の組合せにより行なわ
れているが、複雑でかつ高価な設備を必要とするにも拘
らず死後脳解剖所見に比し信頼性が低いという問題を有
する。そのため、簡便で信頼性の高い生前診断法の確立
が望まれている。

前述のダウン氏病は２５才程でアルツハイマー症と同様
の症状を示すことから、両者の遺伝学的関係に感心がも
たれていたが、最近になって、アルツハイマー症患者の
一部においても染色体２１番の数に異常があることが報
告された（　Ｊ、Ｍ。

Ｄｅｌａｂａｒ　　ら、　八ｎｎａｌｅｓ　　ｄｅ　　
Ｇｅｎｅｔｉｑｕｅ、　　　２　　！ミー、　　２２６
−２２８　（１９８７））。

〔発明の目的〕

そこで、本発明の目的は、数の異常な染色体に起因する
諸疾患を簡便かつ高い信頼性で診断するのに有用である
新規なモノクローナル抗体、その製造方法及び該モノク
ローナル抗体を含有する診断薬を提供することにある。

本発明者らは既に公知の細胞融合技術を応用し、ヒト染
色体における数の異常症を高感度で感知し得るモノクロ
ーナル抗体の取得に成功した。さらに、このモノクロー
ナル抗体の利用により染色体異常の診断、とりわけダウ
ン氏病又はアルツハイマー症の診断にを用である診断薬
を開発するに至った。

〔発明の構成〕

すなわち、本発明は、数の異常なヒト染色体からコード
される膜たんぱく質に特異的に結合するモノクローナル
抗体を提供するものである。

本発明のモノクローナル抗体は、例えば、ヒトの染色体
が導入されていて該ヒト染色体からコードされる膜たん
ぱく質を有するチャイニーズハムスター卵巣細胞で動物
を免疫し、該動物から取得した抗体産生細胞をミエロー
マ細胞と融合させてハイブリドーマを形成させ、選択、
スクリーニング及びクローニングにより数の異常なヒト
染色体からコードされる膜たんぱく質に特異的に結合す
るモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマを得、
該ハイブリドーマを培養する諸工程を備える方法により
得ることができる。

上記の製法で、免疫に用いられるヒト染色体が導入され
ていて該ヒト染色体からコードされる膜たんぱく質を有
するチャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）
は、公知の細胞融合技術によって得られる。このような
ＣＨＯ細胞の例としては、ヒトの染色体２１番が導入さ
れ該染色体からコードされる膜たんば←質を有するＣ　
ＨＯ細胞であって、２Ｆｕ’と称されているものがある
（Ｄ、Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ　ら、Ｓｏｍ、Ｃｅ１ｌ　Ｇ
ｅｎｅｔ、、上、９１〜１１０　　（１９７５）参照）
。

２Ｆｕ’で免疫した場合、上記の製法により、染色体２
１番における数の異常症である２１−トリソミーを感知
し得るモノクローナル抗体を製造できる。染色体の数の
異常症には、他に、１８−トリソミー、１３−トリソミ
ー、タラインフェルター症候群、トリプルＸ症候群、タ
ーナ−症候群などが知られているが、これらの異常症を
忘却して得るモノクローナル抗体も、それに応じたヒト
の染色体が導入されており該染色体からコードされる膜
たんぱく質を有するＣ　ＨＯ細胞を用いることにより製
造することができる。

上記の方法に用いる免疫される動物としては、例えば、
マウス、ラットなどがあげられるが、通常、マウスが用
いられる。

抗原の動物への投与の経路及び計画は種々変えて行うこ
とができる。例えば好ましい投与様式では、抗原をマイ
トマイシン処理し、次いで数回に分けて腹腔内に注射す
る。抗原の投与により該動物の肺臓に抗体が産生ずる。

抗体産生細胞としては、通常、肺細胞が用いられる。

次に、得られた抗体産生細胞と融合させるミエローマ細
胞としては、例えば、ＢＡＬＢ／　ＣマウスＭＯＰＣ２
１骨髄腫から誘導された細胞（ＮＳ−１と称される）が
用いられる。このＫ５−１は、８−アザグアニンに対し
耐性があり、酵素ヒボキサンチン・グアニン・ホスホリ
ボシルトランスフェラーゼを欠くためにヒポキサンチン
−アミノプテリン−チミジンを含有する培地（ＨＡＴ培
地）中で死滅するものであるため、得られるハイブリド
ーマの選択的培養に好都合である。細胞融合の融合剤と
しては、通常、ポリエチレングリコールが用いられる。

以上の融合技術及び用いられるミエローマ細胞等はそれ
自体公知である〔ミエローマ細胞；に６ｈｌｅｒ　ｅｔ
　ａｌ、＋Ｆｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ１．＋　　６．　
２９２〜２９５　　（１９７６）。融合方法；　Ｋ１６
ｈｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、同上、６．５１１〜５１６　
（１９７６）　）。

次にハイブリドーマは、常法にしたがってスクリーニン
グされ、次いでクローニングされ、各系統からの個々の
ハイブリドーマの子孫が得られる。

この細胞系統即ちクローンを細胞培養液（生体外培養）
またはｉｎ　ｖｉν０（生体内培養）において無限に増
殖させ、数の異常なヒト染色体からコードされる膜たん
ぱく質に特異的に結合するモノクローナル抗体を合成・
分泌させ続ける。産生されたモノクローナル抗体は当該
業界で既知の方法により回収される。

こうして得られるモノクローナル抗体は、例えば上記製
法で抗原として２Ｆｕ’が用いられた場合には、例えば
、繊維芽細胞を対象としたとき、数が異常である染色体
２１番にコードされる膜たんぱく質に特異的に結合する
ものである。

本発明は、上述のモノクローナル抗体を含有する診断薬
をも提供するものである。この診断薬を、　゛例えばヒ
トの繊維芽細胞などに適用すると、染色体の数の異常を
容易に判定することができる。したがって、例えば、モ
ノクローナル抗体が、数の異常な染色体２１番からコー
ドされる膜たんぱく質に特異的に結合するものである場
合には、ダウン氏病およびアルツハイマー症の診断を容
易に行なうことができる。本発明の診断薬は、同様に、
１８−トリソミー、１３−トリソミー、タラインフェル
ター症候群、トリプルＸ症候群、ターナ−症候群等の診
断用として調製可能である。

本発明の診断薬の使用法は、いずれの免疫学的試験方法
、例えば、免疫螢光法、免疫粘着血球凝集反応法、放射
性免疫測定法等を利用するものであってもよい。例えば
、免疫螢光法を利用する場合を示すと、ヒトの細胞を本
発明のモノクローナル抗体で処理し、次いで螢光色素（
例えば、ＦＩＴＣ）でラベルされた抗マウスＩｇＧと反
応させ、これを螢光顕微鏡にセットし、発光状態をチェ
ックすることにより染色体異常の有無を容易に診断する
ことができる。

〔実施例〕

以下に本発明のモノクローナル抗体および診断薬を実施
例をもって説明する。

実施例１ （１）（抗体の産生） ヒトの染色体２１番が導入されており、この染色体２１
番からコードされる膜たんば←質を有するＣＨＯ細胞（
２Ｆｕ’）をマイトマイシンで処理し、ＰＢＳ　（リン
酸緩衝液）で洗浄した。５×１０’セル／　０．５　ｃ
ｃの２Ｆｕ’のＰＢＳ懸濁液をＢＡＬＢ／　Ｃマウスの
メスの腹腔に注射（免疫化）した。２週間後同様にｌＸ
ｌ０’セル／　０．５　ｃｃ、更に２週間後ｌＸｌ０’
セル／　０．５　ｃ’ｃを注射し、それから３日後に同
マウスの肺臓を摘出し、ＲＰＭＩ−１６４０培地中で細
砕し、遠心分離（１５００ｒｐｍ）により３回洗い、同
培地中に再懸濁した。

（２）（細胞融合） 前記で得られた肺細胞１．ｌＸ１０”個およびＲＰＭＩ
−１６４０培地で１回洗ったＢＡＬＢ／　Ｃマウスのミ
エローマ細胞（ＮＳ−１）１．０Ｘ１０’個を混合し、
１５００ｒｐｍで５分間遠心し、ペレットを調製した。

次いで、ＲＰＭＩ−１６４０培地にポリエチレングリコ
ール（１５４０）を溶解して５０ｗｔ％とした液ｌｌｌ
１ｌを撹拌下に加え、さらに総量が１０ｍｊ２になるよ
うにＲＰＭＩ−１６４０培地を加え攪拌した。終了後、
１１０００ｒｐで５分間遠心分離を行い融合剤のポリエ
チレングリコールを除去した後、ｌ？ＰＭＩ−１６４０
培地にウシ胎児血清（Ｆｅ２）２０　ｖｏ１％を添加し
た培地４０ｍｊ！に再懸濁した。

（３）（選択、スクリーニング、クローニング）９６穴
組織培養平板の１９２穴の各穴に上記懸濁液０．２ｍｊ
！（細胞数５Ｘ１０ｂ個）を入れ、２〜３日おきに培養
上清液の半量をＨＡＴ培地（ヒポキサンチン１３６．１
■／ＩＩ＋７！、アミノプテリン１．７６■／ｒａｌ、
チミジン３８．７５■／１ＩＩＩりで置換した。培養条
件は３７℃、１００％湿度、ＣＯ□ガス濃度７％である
。１０日後、１１９穴（出現率６２％）にハイプリドー
マが観察された。陽性結果を示した１１９穴の上清を２
Ｆｕ’で酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）により抗体を産生
ずるか否かをチェックしなからスクリーニングしたとこ
ろ、２０穴がプラスだった（金穴の１０．６％）。

この２０穴各々の細胞をＢＡＬＢ／Ｃマウス胸腺細胞１
．０Ｘ１０’個／ｍｌを補充したＨＡＴ培地で限界希釈
し、９６穴組織培養用平板の各穴に０．２ｍｌずつ入れ
培養した。この時、ハイブリドーマの１穴当りの数と穴
数は、１セル／穴が４８穴、５セル／穴が４５穴、２０
セル／穴が３穴であった。培養条件は上と同じである。

その上清液について前述したＥＬＩＳＡ法により、ＣＨ
Ｏ細胞マイナス、ヒト白血病細胞（ＴＡＬＬ）プラスの
ものをスクリーニングした結果３穴にクローンが得られ
た。

更に、残った３大の細胞を限界希釈法により２回再りロ
ーニング操作を行い、得られたハイプリドーマを夫々０
Ｋ−１，０Ｋ−２，０Ｋ−３と命名した。

ハイブリドーマ０Ｋ−１，０Ｋ−２及び０Ｋ−３から産
生されるモノクローナル抗体は、抗マウス抗体を用いた
酵素抗体法で調べたところ、それぞれクラスがｒｇＭ、
　ｒｇＧ、及びＩｇＭのものであることが判明した。

また、０Ｋ−１，０Ｋ−２および０Ｋ−３が産生ずるモ
ノクローナル抗体が認識結合するタンパク質は次のとお
りである。

・０Ｋ−１産生モノクロ一ナル抗体： ヒトの白血病細胞（ＴＡＬＬ）タンパクのウェスタンブ
ロッティングにおいて、４本のバンドを認識する。

・０Ｋ−２産生モノクロ一ナル抗体： ＴＡＬＬ細胞タンパクのウェスタンブロッティングにお
いて、４０および９０キロダルトンのバンドを認識する
。

・０Ｋ−３産生モノクロ一ナル抗体： ＴＡＬＬ細胞タンパクのウェスタンブロッティングにお
いて、８６．４，７４．２，６１．４及び３６６４キロ
ダルトンの４本のバンドを認識する。２Ｆｕ’細胞タン
パクのウェスタンブロッティングにおいては、８９．８
２及び４５キロダルトンの３本のバンドを認識する。

実施例２ 、゛、　　法によるたんばく　の　　診正常人もしくは
ダウン氏病患者の繊維芽細胞をそれぞれ別の直径３５ｍ
のシャーレ中に顕微鏡用カバーガラス（１２Ｘ１２ｍｍ
）とともに入れ、夫々の細胞を培養した。培地としては
、ＭＥＭに、ノンエフセンシャルアミノアシド（ＮＥＡ
Ａ）　　１０％、ピルビン酸ナトリウム１０ｍＭラクト
アルブミンハイドロライゼート（ＬＡＨ）０．１％及び
ＦＣ３１０％を含有させた混合液を使用した。室温で培
養後、ＰＢＳで２〜３回カバーガラスを洗浄し、ただち
に３．７％フォルムアルデヒドのＰＢＳ溶液中で固定し
、細胞蒸留水で洗い、さらに−２０℃のアセトン中で固
定した。

固定した細胞に実施例１で得たモノクローナル抗体（ハ
イブリドーマ０Ｋ−１，０Ｋ−２または０Ｋ−３に由来
のもの）を１５μｌのせ室温で１時間反応させた。ＰＢ
Ｓで３回洗浄後、第２抗体であるＦＩＴＣでラベルされ
た抗マウスＩｇＧ抗体あるいは抗マウスＩｇＭ抗体を１
５μｌのせ、１時間室温で反応させた。ＰＢＳで３回洗
浄し、塩分を取り除くため蒸留水で１回洗い、細胞が固
定されている面を下にしてスライドガラスにのせ、ゲル
バトールで封入し、検査体のピースを得た。

検査体を螢光顕微鏡でその表層の発光有無を調べた。第
１表に得られた結果を示す。ダウン氏病患者の繊維芽細
胞は螢光を有するのに対し、正常人のそれは発光せず、
容易にかつ特別な技術を使用せずに高感度で染色体異常
の有無が診断できることがわかる。

尚、この方法と同時にたんばく質が膜上に存在すること
を確認するため、細胞を固定せず螢光色素と反応させる
膜免疫螢光法でも検索したが、その結果も上記の結果と
同じであった。

第１表　　螢光法による発光の有無 実施例３ 正常人およびアルツハイマー症患者の繊維芽細胞につい
て、実施例２で繊維芽細胞に用いたのと同じ培地を用い
て培養を行なった以外は、実施例２と同様にして検査を
行なった。結果を第２表に示す。

第　　　２　　　表 一：兄元しない 〔発明の効果〕 本発明のモノクローナル抗体は、数の異常なヒト染色体
からコードされるたんばく質に特異的に結合するので、
例えば、ダウン氏病、アルツハイマー症などの染色体の
数の異常に起因する異常症の診断に有用である。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）数の異常なヒト染色体からコードされる膜たんぱ
   く質に特異的に結合するモノクローナル抗体。
2. （２）特許請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体
   であって、前記の数の異常なヒト染色体が、ヒト染色体
   ２１番であるモノクローナル抗体。
3. （３）ヒトの染色体が導入されていて該ヒト染色体から
   コードされる膜たんぱく質を有するチャイニーズハムス
   ター卵巣細胞で動物を免疫し、 該動物から取得した抗体産生細胞をミエロ ーマ細胞と融合させてハイブリドーマを形成させ、 選択、スクリーニングおよびクローニング により数の異常なヒト染色体からコードされる膜たんぱ
   く質に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する
   ハイブリドーマを得、該ハイブリドーマを培養する諸工
   程を備え る前記モノクローナル抗体の製法。
4. （４）特許請求の範囲第３項記載のモノクローナル抗体
   の製法であって、前記のヒト染色体がいずれもヒト染色
   体２１番である製法。
5. （５）数の異常なヒト染色体からコードされる膜たんぱ
   く質に特異的に結合するモノクローナル抗体を含有する
   染色体の数の異常症用診断薬。
6. （６）特許請求の範囲第５項記載の診断薬であって、前
   記の数の異常なヒト染色体がヒト染色体２１番であるダ
   ウン氏病の診断薬。
7. （７）特許請求の範囲第５項記載の診断薬であって、前
   記の数の異常なヒト染色体がヒト染色体２１番であるア
   ルツハイマー症の診断薬。