EA007014B1 - Применение il-18 в качестве диагностического маркера - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к применению IL-18 в качестве диагностического маркера плохого клинического прогноза сердечной недостаточности и рецидивирующих случаев после первого проявления сердечной недостаточности.

Description

Настоящее изобретение относится к области заболеваний сосудов. Более конкретно, изобретение относится к применению ингибиторов 1Б-18 для лечения и/или предотвращения атеросклероза.

Уровень техники

Атеросклероз является широко распространенным и наиболее важным заболеванием сосудов, но известно множество других заболеваний сосудов. Атеросклероз в основном поражает крупные и средние артерии, и повреждения включают полоски жира, фиброзные бляшки и осложненные поражения. Атеросклероз представляет собой хроническое воспалительное заболевание артериальной стенки, характеризующееся прогрессивным накоплением липидов, таких как холестерин, клеток, таких как макрофаги, Тлимфоциты или гладкомышечные клетки, и экстрацеллюлярного матрикса (1). Наиболее крупные скопления называют атеромами или бляшками, которые часто содержат кальций. Жировая ткань может разъедать стенку артерии, снижать эластичность артерии и препятствовать току крови. В итоге, вокруг бляшкообразных отложений могут образовываться тромбы, дополнительно препятствуя току крови, что может привести к полной окклюзии кровеносного сосуда. Обычно атеросклероз связан с повышенными уровнями ЬОЬ-холестерина, Ьр(а) фибриногена и фактора VII, так же как и со сниженным уровнем НЭЬхолестерина. Факторы риска включают более старший возраст, мужской пол, курение, диабет, ожирение, высокий уровень холестерина в крови, диету, богатую жирами, и наличие индивидуального или семейного анамнеза болезни сердца. Он является главной причиной органической ишемии, такой как, например, инфаркта миокарда.

Атерома является наиболее распространенным повреждением артерий, которое далее может осложняться тромбоэмболией. Атероматозные бляшки часто сужают просвет артерий, приводя к ишемии и иногда к атрофии тканей в области с плохим кровоснабжением. Серьезные последствия включают симптом стенокардии вследствие ишемии миокарда, сердечную недостаточность вследствие ишемии или неишемических причин, и гипертензию вследствие сужения почечной артерии и плохого кровоснабжения почек, которое физиологически приводит к увеличению секреции ренина.

Иногда атеросклероз и артериосклероз относят к отдельным патологическим состояниям и, в данном случае, атеросклероз подразумевает уплотнение (склероз) или потерю эластичности артерий конкретно в результате атеромы, хотя атеросклероз представляет собой уплотнение или потерю эластичности артерий в результате любых причин.

Осложнения или последствия атеросклероза включают заболевания коронарных артерий (атеросклероз коронарных артерий), недостаточность кровоснабжения в результате обструкции (ишемия/стенокардия), острый ИМ (инфаркт миокарда, сердечный приступ), транзиторную ишемическую атаку (ΤΙΑ) или инсульт и повреждение кровеносных сосудов, мышечной ткани или органов.

Аневризмы, которые представляют собой постоянные аномальные расширения кровеносных сосудов, также являются широко распространенными последствиями атеросклероза. Атеросклеротические аневризмы брюшной аорты обычно развиваются у пожилых пациентов. Они могут разрываться в забрюшинное пространство. В атеросклеротических аневризмах обычно присутствуют резко выраженная потеря эластичной ткани и фиброз средней оболочки, в основном, в результате ишемии мышечной ткани средней оболочки аорты, сопровождающейся высвобождением макрофагальных ферментов, приводящим к фрагментации эластичных волокон.

Лекарственные средства, рекомендованные для лечения или предотвращения атеросклероза, направлены на снижение уровня липидов/холестерина в крови. В частности, широко применяется терапия, направленная на снижение ЬОЬ-холестерина. В настоящее время наиболее широко применяются статины, специфические ингибиторы НМС СоА-редуктазы. Другие средства, снижающие уровень липидов, включают такие лекарственные средства, как холестирамин, колестипол, никотиновая кислота, гемфиброзил, пробукол, ловастатин и другие.

Другим подходом является минимизирование риска образования тромба на установившемся атероматозном повреждении. Аспирин, который представляет собой специфический ингибитор тромбоксана А2, опосредующего агрегацию тромбоцитов, или антикоагулянты могут применяться для снижения риска образования тромба.

В чрескожной «баллонной ангиопластике» применяется катетер с баллоном на конце для уплощения бляшки и увеличения тока кроки после окклюзии. Технология подобна применяемой технологии для открытия артерий сердца, но она может применяться в отношении многих других артерий организма. Стеноз коронарных артерий шунтируют с помощью сегментов подкожной вены, вшитой в проксимальную часть аорты, или с помощью отсечения внутренней грудной артерии со стороны грудной стенки и создания анастомоза ее дистального конца с артерией на передней поверхности сердца.

Хирургическое удаление отложений (эндартерэктомия) может быть рекомендовано в некоторых случаях (например, эндартерэктомия сонной артерии).

Однако основной рекомендацией остается воздействие или контроль над факторами риска, подобно поддержанию диеты с низким содержанием жира, низким содержанием холестерина и низким содержанием соли и с последующими направленными на поддержание здорового состояния рекомендациями в отношении лечения и контроля за гипертонией, диабетом и другими заболеваниями, снижение массы

- 1 007014 тела и прекращение курения, так же как и регулярные физические упражнения для улучшения состояния сердца и кровообращения.

Воспалительный процесс присутствует на различных стадиях атеросклероза (1). Активация эндотелия с помощью ряда факторов, включающих небольшое касательное напряжение, модифицированные липопротеины и провоспалительные цитокины, считается первой стадией атеросклероза и находится под воспалительным контролем (1). Многие недавние исследования показали, что взаимодействия между клетками сосуда и клетками воспаления являются решающими в атерогенезе (1). В частности, ингибирование отдельных провоспалительных путей замедляет развитие атеросклероза (1).

Воспаление также играет главную роль в распаде атеросклеротической бляшки и тромбозе (2-5) и поэтому влияет на появление острых ишемических синдромов и связанную с ними летальность (6). Действительно тяжелые клинические проявления атеросклероза, включающие инфаркты сердца, мозга и любых других органов, пораженных атеросклерозом, в основном являются результатом окклюзии просвета сосуда тромбом, образованным при взаимодействии с разрушенной атеросклеротической бляшкой (3, 4). Патологические исследования показали, что уязвимые или нестабильные бляшки, т.е. бляшки, склонные к распаду или распадающиеся, сильно отличаются по клеточному и матриксному составу по сравнению со стабильными бляшками, не склонными к распаду (7). Уязвимые бляшки богаты клетками воспаления (макрофаги и Т-лимфоциты), содержат тромбогенное липидное ядро и характеризуются тонким фиброзным верхним слоем с существенным недостатком внеклеточного матрикса (7).

Снижение синтеза коллагена, опосредованное провоспалительным цитокином ΙΡΝ-γ, и повышение активности макрофагальных металлопротеаз, разрушающих матрикс, являются причинами истончения и хрупкости фиброзного верхнего слоя (7). Разрушение хрупкого фиброзного верхнего слоя открывает высоко тромбогенное липидное ядро для контакта с циркулирующей кровью и приводит к образованию окклюзивного тромба (1, 7). Поэтому полагают, что плотность клеток воспаления в определенном атеросклеротическом повреждении является хорошим показателем его нестабильности.

Клинический прогноз для пациента с атеросклерозом только частично зависит от размера повреждения (19, 20). В настоящее время широко признано, что качество (состав бляшки), скорее, чем размер повреждения, может быть даже лучшим показателем развития ишемических случаев. Действительно, тяжелые клинические проявления атеросклероза (инфаркты сердца или мозга) в основном являются результатом окклюзии просвета сосуда тромбом, образованном на поверхности распадающейся атеросклеротической бляшки (19). Патологические исследования показали, что уязвимые или нестабильные бляшки, которые склонны к распаду или распавшиеся, богаты клетками воспаления и характеризуются существенным недостатком содержания гладкомышечных клеток и коллагена (20, 21). Более того, в подобных бляшках обнаружено увеличение апоптотической гибели клеток, ведущей к образованию высоко тромбогенного липидного ядра (13, 22).

Провоспалительные цитокины участвуют в воспалении. Цитокин интерлейкин 18 (IЬ-18) первоначально был описан как фактор, индуцирующий интерферон-γ (ΙΡΝ-γ) (8). Он представляет собой ранний сигнал развития ответа лимфоцитов Т-хелперов типа 1 (ТН1). ΙΠ-18 действует совместно с 1Б-12. 1Ь-2, антигенами, митогенами и возможно другими факторами, индуцируя продукцию ΙΡΝ-γ. ΙΠ-18 также усиливает продукцию ОМ-С8Р и ΙΤ-2, усиливает пролиферацию Т-клеток, вызванную анти-СИ3, и повышает Рак-опосредованную гибель естественных киллеров. Зрелая форма ΙΠ-18 образуется из его предшественника с помощью Ш-Щ-превращающего фермента ЦСЕ, каспаза-1). Рецептор ГБ-18 состоит по крайней мере из двух компонентов, участвующих в связывании лиганда. Высоко- и низкоаффинные сайты связывания ΙΠ-18 были найдены на мышиных Т-клетках, стимулированных ΙΕ-12 (9), предполагая существование многоцепочечного рецепторного комплекса. Две рецепторные субъединицы идентифицированы в настоящий момент, обе принадлежащие к семейству рецептора ΙΠ-1 (10). Передача сигнала ΙΠ-18 включает активацию ΝΡ-кВ (11).

Недавно был выделен растворимый белок, обладающий высокой аффинностью к ΙΠ-18, из мочи человека и были клонированы кДНК мыши и человека, так же как и ген человека (12; АО 99/09063). Белок был назван ΙΕ-18-связывающий белок (ΙΕ-18ΒΡ).

ΙΕ-18ΒΡ не является внеклеточным доменом одного из известных рецепторов ΙΠ-18, а секретируемым естественно циркулирующим белком. Он принадлежит к новому семейству секретируемых белков, кроме того, включающему различные белки, кодируемые Ροχνίιυδ (12). ΙΕ-18ΒΡ постоянно экспрессируется в селезенке (12). Мочевой ΙΕ-18ΒΡ, так же как и рекомбинантный, специфически связывает ΙΠ-18 с высокой аффинностью и модулирует биологическую аффинность ΙΕ-18.

Ген ΙΕ-18ΒΡ расположен на хромосоме человека 11ц13, и в геномной последовательности размером 8,3 т.п.н. не было найдено экзона, кодирующего трансмембранный домен. Четыре варианта сплайсинга или изоформы ΙΕ-18ΒΡ были найдены у человека и обозначены как ΙΕ-18ΒΡ а, Ь, с и ά, все несущие одинаковые Ν-концевые последовательности и отличающиеся С-концевыми последовательностями (12).

Четыре изоформы ΙΕ-18ΒΡ человека и две мышиные изоформы, полученные в результате сплайсинга мРНК и найденные в различных библиотеках кДНК, экспрессировали, очищали и оценивали на связывание и нейтрализацию биологической активности !Б-18 (23). Изоформа ΙΕ-18ΒΡ человека (ΙΡ-18ΒΡ;·ι)

- 2 007014 проявила наибольшую аффинность к 1Б-18 с быстрой активацией (гар1б оп-га1е). медленной инактивацией (Τ1ο\ν оГГ-га1е) и константой диссоциации (К(б)) 399 пМ. 1Б-18ВРС содержит 1д-домен 1Ь-18ВРа за исключением 29 С-концевых аминокислот; К(б) для 1Б-18ВРС в 10 раз меньше (2.94 нМ). Тем не менее. 1Ь18ВРа и 1Б-18ВРС нейтрализуют 1Ь-18 >95% при двойном мольном избытке. В изоформах 1Ь-18ВРЬ и 1Ь-18ВРб отсутствует полный 1д-домен и отсутствует способность связывать или нейтрализовать 1Б-18. Мышиные изоформы 1Б-18ВРС и 1Ь-18ВРб. обладающие идентичным 1д-доменом. также нейтрализуют >95% мышиного 1Б-18 при двойном мольном избытке. Однако мышиный 1Ь-18ВРб. содержащий общую С-концевую последовательность с 1Ь-18ВРа человека. также нейтрализует 1Б-18 человека. Молекулярное моделирование выявило большой смешанный электростатический и гидрофобный сайт связывания на 1ддомене 1Б-18ВР. который может являться объяснением его высокой аффинности связывания лиганда (23).

Сущность изобретения

Изобретение основано на данных. что ингибитор 1Б-18 обладает выраженным благотворным воздействием на образование бляшки. развитие бляшки и стабильность бляшки на мышиной модели атеросклероза. Ингибитор 1Б-18 не только предотвращает образование поражения грудной аорты. но также и индуцирует переключение на фенотип стабильной бляшки для уже сформировавшихся атеросклеротических бляшек.

Поэтому изобретение относится к применению ингибитора 1Б-18 для получения лекарственных средств для предотвращения и/или лечения атеросклероза. Изобретение. кроме того. относится к способам лечения с генным терапевтическим подходом лечения и/или предотвращения атеросклероза.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 представлена гистограмма. отражающая процентное значение выживаемости эндотелиальных клеток пупочной вены человека после инкубации только с окисленными липопротеинами или инкубации вместе с комбинацией окисленных липопротеинов с антителами к 1Б-18 или 1Б-18ВР соответственно.

На фиг. 2 представлен Вестерн-блот. проведенный для белковых экстрактов из атеросклеротических артерий в сравнении с контрольными артериями. В Вестерн-блоте применяли антитела против 1Б-18ВР (ЫБ-18ВР). α-субъединицу рецептора 1Б-18 (ЫЬ-18ВРа). 1Б-18 (ЫЬ-18) и каспазу-1 (Са8ра§е-1 р10).

На фиг. 3 представлен агарозный гель. окрашенный бромистым этидием. показывающий результат ОТ-ПЦР-анализа мРНК 1Б-18 и 1Б-18ВР в клетках атеросклеротической бляшки.

На фиг. 4 представлены результаты ОТ-ПЦР для 1Б-18ВР и 1Б-18 в атеросклеротической бляшке по сравнению с экспрессией йа-актина (контроль) в симптоматических и асимптоматических бляшках.

На фиг. 5 представлена карта экспрессирующего вектора. использованного для внутримышечного электропереноса у мышей.

На фиг. 6 представлена гистограмма. отражающая площадь липидных пятен в атеросклеротических артериях. Количественный компьютерный анализ изображения липидного отложения. Данные представлены в виде средних величин со станд. ошибкой. (п=19 для свободной плазмиды. п=14 для плазмиды. содержащей 1Б-18ВР). Четырьмя звездочками отмечено р<0.0001.

На фиг. 7 представлена гистограмма. отражающая площадь поражения синуса аорты после обработки с помощью 1Б-18ВР по сравнению с контролем (свободная плазмида). Количественный компьютерный анализ изображения площади поражения. Данные представлены в виде средних величин со станд. ошибкой. (п=19 для свободной плазмиды. п=14 для плазмиды. содержащей 1Б-18ВР). Двумя звездочками отмечено р<0.01.

На фиг. 8 представлено влияние обработки с помощью 1Б-18ВР на содержание клеток воспаления в области поражения. Количественный компьютерный анализ изображения применяли для определения процентной величины площадей. положительных по содержанию макрофагов (черные столбики) и количества инфильтрирующих Т-лимфоцитов на мм² (серые столбики) в зонах поражений синуса аорты контрольных (п=12 для окрашивания макрофагов. п=15 для окрашивания Т-лимфоцитов) или обработанных с помощью 1Б-18ВР мышей (п=13 для макрофагов. п=12 для Т-лимфоцитов). Данные представлены в виде средних величин со станд. ошибкой. Тремя звездочками отмечено р<0.005; и четырьмя звездочками отмечено р<0.0001.

На фиг. 9 представлено влияние обработки 1Б-18ВР на содержание гладкомышечных клеток и коллагена в области поражения. Количественный компьютерный анализ изображения применяли для определения процентной величины площадей. положительных по содержанию гладкомышечных клеток (черные столбики). и накопления коллагена (серые столбики) в зонах поражений синуса аорты контрольных (п=6 для гладкомышечных клеток. п=11 для коллагена) или обработанных с помощью 1Б-18ВР мышей (п=6 для гладкомышечных клеток. п=13 для коллагена). Данные представлены в виде средних величин со станд. ошибкой. Одной звездочкой отмечено р<0.05; и двумя звездочками отмечено р<0.01.

Описание изобретения

Изобретение основано на данных о повышенных уровнях циркулирующего 1Б-18 у пациентов с острыми коронарными синдромами и повышенной продукции 1Б-18 в нестабильных атеросклеротиче

- 3 007014 ских бляшках сонной артерии, ответственных за инсульт. Кроме того, показано, что электроперенос ίη νίνο экспрессирующей плазмидной ДНК, кодирующей 1Ь-18ВР, предотвращает развитие жировых полосок в грудной аорте и замедляет прогрессию сформированных атеросклеротических бляшек в синусе аорты на хорошо изученной мышиной модели атеросклероза. Более важно, перенос плазмиды, содержащей 1Б-18ВР. индуцирует сильные изменения в составе бляшки (уменьшение содержания макрофагов, Тклеток, гибели клеток и содержания липидов и увеличение содержания гладкомышечных клеток и коллагена), приводящее к стабильному фенотипу бляшки. Данные результаты впервые показывают важную роль ингибиторов 1Б-18 в снижении формирования бляшки/прогрессии и в стимулировании стабильности бляшки.

Изобретение также относится к применению ингибитора 1Б-18 для получения лекарственного средства для лечения и/или предотвращения атеросклероза.

Термин «предотвращение» в контексте данного изобретения относится не только к полному предотвращению основного последствия, но также и к любому частичному или достаточно существенному предотвращению, ослаблению, уменьшению, снижению или сокращению последствия перед или на ранней стадии начала заболевания.

Термин «лечение» в контексте данного изобретения относится к любому благоприятному воздействию на развитие заболевания, включая ослабление, уменьшение, снижение или сокращение патологического процесса после начала заболевания.

Термин «ингибитор 1Б-18» в контексте данного изобретения относится к любой молекуле, модулирующей продукцию и/или функционирование 1Б-18 таким образом, что продукция и/или функционирование ослабляются, уменьшаются или частично, существенно или полностью предотвращаются или блокируются.

Ингибитор продукции может представлять собой любую молекулу, отрицательно влияющую на синтез, процессинг или созревание 1Б-18. Ингибиторы, рассматриваемые согласно изобретению, могут являться, например, супрессорами экспрессии гена 1Б-18, антисмысловыми мРНК, уменьшающими или предотвращающими транскрипцию мРНК 1Б-18 или приводящими к деградации мРНК, белками, нарушающими правильную укладку или частично или существенно предотвращающими созревание или секрецию 1Б-18, протеазами, разрушающими 1Ь-18 сразу после его синтеза, и подобными. Ингибитор продукции может представлять собой ингибитор каспазы-1 или ингибитор 1СЕ, например, предотвращающий созревание 1Б-18.

Ингибитор функционирования 1Б-18 может представлять собой, например, антагонист 1Б-18. Антагонисты могут как связывать, так и секвестировать саму молекулу 1Б-18 с достаточной аффинностью и специфичностью для частичной или существенной нейтрализации 1Б-18 или сайтов связывания 1Б-18, ответственных за связывание 1Б-18 с его лигандами (такими как, например, его рецепторами). Антагонист также может ингибировать путь передачи сигнала 1Б-18, активирующийся в клетках при связывании 1Ь-18/рецептор.

Ингибиторы функционирования 1Б-18 могут также представлять собой растворимые рецепторы ΙΕ18 или молекулы, имитирующие рецепторы, или вещества, блокирующие рецепторы 1Б-18, антитела против 1Б-18, такие как, например, моноклональные антитела, или любое другое вещество или молекулу, предотвращающие связывание ГБ-18 со своими мишенями, таким образом ослабляя или предотвращая запуск внутри- или внеклеточных реакций, опосредованных ГБ-18.

Атеросклерозом также называют артериосклероз или уплотнение артерий. Согласно контексту настоящего изобретения термин атеросклероз включает в себя все заболевания или болезненные состояния артерий, обычно описываемые как атеросклероз, в ходе которых липидное вещество откладывается на сосудистой стенке, в итоге приводя к сужению и ухудшению тока крови, так же как и к разрыву и/или эрозии с формированием тромба.

Согласно настоящему изобретению атеросклероз означает как уплотнение, так и потерю эластичности артерий в результате атеромы (атеросклероз) и в результате любой другой причины (артериосклероз). Патологические факторы атеросклероза, так же как и осложнения или последствия, которые подразумевается включить в применяемый в описании изобретения термин «атеросклероз», подробно описаны выше в «уровне техники».

Прогрессирование атеросклероза включает образование атеросклеротических бляшек и их переход во все более и более нестабильные формы. Поэтому изобретение также относится к применению ингибитора ГБ-18 для получения лекарственного средства, снижающего или предупреждающего прогрессирование атеросклероза.

Окклюзия сосуда тромбом, сформировавшимся на атеросклеротической бляшке, является решающим событием для инфарктов сердца или мозга, которые находятся в числе наиболее серьезных последствий атеросклероза. Поэтому изобретение также относится к применению ингибитора ГБ-18 для получения лекарственного средства для лечения и/или предотвращения тромбоза на атеросклеротической бляшке.

Стабильность бляшки оказывает влияние на преобразование атеросклеротической бляшки в неблагоприятную или уязвимую бляшку, которая склонна к инициированию тромбоза. Поэтому изобретение,

- 4 007014 кроме того, относится к применению ингибитора 1Ь-18 для получения лекарственного средства для предотвращения и/или лечения нестабильности атеросклеротической бляшки.

Нестабильная бляшка склонна к распаду, и распад бляшки может привести к тромбозу. Поэтому изобретение, кроме того, относится к применению ингибитора 1Ь-18 для получения лекарственного средства для предотвращения эрозии или распада атеросклеротической бляшки.

Нестабильность бляшки и тромбоз, например, могут быть результатом апоптотической гибели клеток, которая приводит к высокой прокоагулянтной активности и может являться ключевым событием, приводящим к тромбозу эрозированных или распавшихся бляшек, так же как и к эмболическим процессам (13, 14). Показано, что окисленные липопротеины (охЬПЬ) индуцируют апоптоз макрофагов и эндотелиальных клеток в культуре (15). Как показано на примерах ниже, в настоящее время установлено, что ингибитор 1Ь-18 способен значительно снижать гибель клеток, индуцированную охЬПЬ.

Согласно настоящему изобретению неожиданно было установлено, что уровни 1Ь-18 в крови были значительно повышены у пациентов с сердечной недостаточностью, страдающих от рецидивирующих явлений, таких как, например, смерть, рекуррентная ишемия, реваскуляризация, прогрессирование атеросклероза или периодически повторяющаяся госпитализация по поводу сердечной недостаточности, по сравнению с пациентами, не требующими повторной госпитализации. Данное повышение уровня 1Ь-18 особенно характерно для пациентов, которые умерли спустя некоторое время, по сравнению с выжившими больными. Повышенные уровни 1Ь-18 в крови наблюдались как у пациентов с ишемией, так и у пациентов без ишемии.

Поэтому изобретение также относится к применению ингибитора 1Ь-18 для получения лекарственного средства для лечения и/или предотвращения рецидивирующих случаев сердечной недостаточности. Рецидивирующие случаи могут представлять собой любые случаи сердечной недостаточности, такие как смерть, рекуррентная ишемия, реваскуляризация, прогрессирование атеросклероза или периодически повторяющаяся госпитализация по поводу сердечной недостаточности.

Согласно предпочтительному воплощению изобретения сердечная недостаточность является ишемической, т.е. результатом ишемии миокарда.

Согласно другому предпочтительному воплощению сердечная недостаточность является не ишемической, например, в результате системной гипертензии, порока клапана сердца или заболевания легких, приводящих к правой и затем застойной сердечной недостаточности.

Согласно предпочтительному воплощению изобретения ингибитор 1Ь-18 выбран из группы, включающей 1СЕ-ингибиторы, антитела против 1Ь-18, антитела против любой из субъединиц рецептора 1Ь-18, ингибиторы передачи сигнала от рецептора 1Ь-18, антагонисты 1Ь-18, которые конкурируют с 1Ь-18 и блокируют рецептор 1Ь-18, и белки, связывающие 1Ь-18, изоформы, мутеины, гибридные белки, функциональные производные, активные фракции или их производные с круговой перестановкой, обладающие такой же активностью.

Применяемый здесь термин «мутеины» относится к аналогам 1Ь-18ВР или аналогам вирусного 1Ь18ВР, в котором один или несколько аминокислотных остатков нативного 1Ь-18ВР или вирусного 1Ь18ВР замещены различными аминокислотными остатками или отсутствуют, или один или несколько аминокислотных остатков добавлены к нативной последовательности 1Ь-18ВР или вирусному 1Ь-18ВР без значительного изменения активности полученных продуктов по сравнению с исходным типом 1Ь18ВР или вирусным 1Ь-18ВР. Данные мутеины получают с помощью известных способов синтеза и/или сайт-специфического мутагенеза или любых известных способов, пригодных для применения в настоящем изобретении.

Любой подобный мутеин предпочтительно имеет аминокислотную последовательность, достаточно повторяющую последовательность 1Ь-18ВР или достаточно повторяющую вирусный 1Ь-18ВР, такой, чтобы обладать в значительной степени сходной активностью с 1Ь-18ВР. Одним проявлением активности 1Ь-18ВР является его способность связывания 1Ь-18. Насколько мутеин обладает достаточной связывающей активностью по отношению к 1Ь-18ВР, настолько он может применяться для очистки 1Ь-18, например, с помощью аффинной хроматографии, и, таким образом, можно считать обладает достаточно схожей активностью с 1Ь-18ВР. Таким образом, можно определить у любого данного мутеина наличие достаточно схожей активности с 1Ь-18ВР посредством обычного экспериментирования, подвергая подобный мутеин, например, простому конкурентному сэндвич-анализу для установления способности связывания соответствующим образом меченного 1Ь-18, например, радиоиммуноанализу или анализу ЕЫ8А.

Мутеиновые полипептиды 1Ь-18ВР или мутеины вирусных 1Ь-18ВР, которые могут применяться согласно настоящему изобретению, или кодирующая их нуклеиновая кислота включают ограниченный набор значительно совпадающих последовательностей как замещающих пептидов или полинуклеотидов, которые могут быть просто получены специалистом в данной области без большого количества экспериментов, основываясь на принципах и руководстве, представленных в описании изобретения.

Предпочтительные модификации мутеинов согласно настоящему изобретению представляют собой замены, известные как «консервативные». Консервативные аминокислотные заместители полипептидов 1Ь-18ВР, или белков, или вирусных 1Ь-18ВР могут включать синонимичные аминокислоты в пределах

- 5 007014 группы, обладающей достаточно схожими физико-химическими свойствами, так что при замещении одного члена группы другим будет сохраняться биологическая функция молекулы (16). Понятно, что также можно осуществить вставки и делеции аминокислот в вышеуказанных последовательностях без изменения их функции, особенно если вставки или делеции содержат только небольшое количество аминокислот, например менее тридцати и предпочтительно менее десяти, и без удаления или перемещения аминокислот, являющихся решающими в функциональной структуре, например, остатков цистеина. Белки и мутеины, полученные с помощью подобных делеции и/или вставок, входят в объем настоящего изобретения.

Предпочтительно синонимичные аминокислотные группы представляют собой указанные в табл. 1. Более предпочтительно синонимичные аминокислотные группы указаны в табл. 2; и наиболее предпочтительные синонимичные аминокислотные группы указаны в табл. 3.

Таблица 1. Предпочтительные группы синонимичных аминокислот

Аминокислота Синонимичная группа

Зег	Зег,	ТЬг,	С1у,	Азп
Агд	Агд,	С1п,	Ьуз,	С1и,	ΗΪ3
Ьеи	Не,	РЬе,	Туг,	МеЬ,	Уа1,	Ьеи
Рго	С1у,	А1а,	ТЬг,	Рго
ТЬг	Рго,	Зег,	А1а,	С1у,	НЬз,	СХп,	ТЬг
АХа	С1у,	ТЬг,	Рго,	А1а
Уа1	МеЬ,	Туг,	РЬе,	Не,	Ьеи,	УаХ
С1у	А1а,	ТЬг,	Рго,	Зег,	С1у
Не	МеЬ,	Туг,	РЬе,	Уа1,	Ьеи,	Не
РЬе	Тгр,	МеЬ,	Туг,	Не,	Уа1,	Ьеи,	РЬе
Туг	Тгр,	МеЬ,	РЬе,	Не,	УаХ,	Ьеи,	Туг
Суз	Зег,	ТЬг,	Суз
ΗΪ3	С1и,	Ьуз,	С1п,	ТЬг,	Агд,	НЬз
С1п	С1и,	Ьуз,	Азп,	ΗΪ3,	ТЬг,	Агд,	СХп
Азп	С1п,	Азр,	Зег,	Азп
Ьуз	С1и,	С1п,	ΗΪ3,	Агд,	Ьуз
Азр	С1и,	Азп,	Азр
С1и	Азр,	Ьуз,	Азп,	С1п,	ΗΪ3,	Агд,	СХи
МеР	РЬе,	Не,	Уа1,	Ьеи,	МеЕ

Тгр Тгр

- 6 007014

Таблица 2. Более предпочтительные группы синонимичных аминокислот

Аминокислота	Синонимичная группа
Зег	Зег
Агд	ΗΪ3, Ьуз, Агд
Ьеи	Ьеи, 11е, РЬе, Мей
Рго	А1а, Рго
ТЬг	ТЬг
А1а	Рго, А1а
Уа1	Уа1, МеЬ, 11е
С1у	С1у
Не	11е, МеЬ, РЬе, Уа1, Ьеи
РЬе	МеЬ, Туг, 11е, Ьеи, РЬе
Туг	РЬе, Туг
Суз	Суз, Зег
ΗΪ3	ΗΪ3, С1п, Агд
С1п	61и, С1п, ΗΪ5
Азп	Азр, Азп
Ьуз	Ьуз, Агд
Азр	Азр, Азп
С1и	С1и, С1п
Мей	Мей, РЬе, 11е, Уа1, Ьеи
Тгр	Тгр

Таблица 3. Наиболее предпочтительные группы синонимичных аминокислот

Аминокислота	Синонимичная	группа
Зег	Зег
Агд	Агд
Ьеи	Ьеи, 11е, МеЬ
Рго	Рго
ТЬг	ТЬг
А1а	А1а
Уа1	Уа1
С1у	С1у
11е	11е, Мей,	Ьеи
РЬе	РЬе
Туг	Туг
Суз	Суз, Зег
ΗΪ3	Нъз
С1п	С1п
Азп	Азп
Ьуз	Ьуз
Азр	Азр
С1и	С1и
МеЬ	МеЬ, 11е,	Ьеи
Тгр	МеЬ

Примеры проведения замещений аминокислот в белках, которые могут применяться для получения мутеиновых полипептидов или белков 1Б-18ВР, или мутеиновых вирусных П.-18ВР для применения со- 7 007014 гласно настоящему изобретению, включают любые известные стадии способов, таких как представленные в патентах США 4959314, 4588585 и 4737462 Магк е! а1.; 5116943 Ко1115 е! а1.; 4965195 Матеи е! а1.; 4879111 Сйоид е! а1.; и 5017691 Ьее е! а1.; и белки, замещенные по лизину, представленные в патенте США № 4904584 (ΗΙι;ι\\ е! а1.).

Термин «гибридный белок» относится к полипептиду, содержащему 1Ь-18ВР, или вирусный 1Ь18ВР, или их мутеин, слитые с другим белком, который, например, обладает продолжительным периодом пребывания в жидких средах организма. 1Ь-18ВР и вирусный 1Ь-18ВР может подобным образом быть присоединен к другому белку, полипептиду или подобному, например, иммуноглобулину или его фрагменту.

Применяемый термин «функциональные производные» включает производные 1Ь-18ВР или вирусного 1Ь-18ВР и их мутеинов и гибридных белков, которые могут быть получены из функциональных групп, которые располагаются в виде боковых цепей на остатках или Ν- или С-концевых групп, с помощью известных в данной области способов, и включены в изобретение, пока они остаются фармацевтически приемлемыми, т.е. они не нарушают активности белка, которая достаточно схожа с активностью 1Ь-18ВР или вирусных 1Ь-18ВР, и не придают токсических свойств содержащей их композиции. Данные производные могут, например, включать полиэтиленгликольные боковые цепи, которые могут маскировать антигенные сайты и увеличивать пребывание 1Ь-18ВР или вирусного 1Ь-18ВР в жидких средах организма. Другие производные включают алифатические сложные эфиры карбоксильных групп, амиды карбоксильных групп, полученные взаимодействием аммиака с первичными или вторичными аминами, Ν-ацильные производные свободных аминогрупп аминокислотных остатков, полученные с помощью ацильных групп (например, алканоил или карбоциклические ароильные группы), или О-ацильные производные свободных гидроксильных групп (например, гидроксильные группы остатков серина или треонила), полученные с помощью ацильных групп.

Под термином «активные фракции» 1Ь-18ВР или вирусного 1Ь-18ВР, мутеинов и гибридных белков настоящее изобретение подразумевает любой фрагмент или предшественники полипептидной цепи белковой молекулы отдельно или вместе со связанными молекулами или остатками, присоединенными к ним, например, остатками Сахаров или фосфатными остатками, или агрегатами самой белковой молекулы или остатков сахаров, обеспечивая, чтобы указанная фракция обладала достаточно схожей активностью с 1Ь-18ВР.

Согласно другому предпочтительному воплощению изобретения ингибитор Ш-18 представляет собой антитело против 1Ь-18. Антитела против ΣΠ-18 могут быть поликлональными или моноклональными, химерными, гуманизированными или даже полностью человеческими. Рекомбинантные антитела или их фрагменты характеризуются высокой аффинностью связывания с Ш-18 ίη νίνο и низкой токсичностью. Антитела, которые могут применяться согласно изобретению, характеризуются по их способности лечения пациентов в течение периода, достаточного для достижения от хорошей до превосходной степени регрессии или ослабления патогенного состояния или любого симптома или группы симптомов, связанных с патогенным состоянием и низкой токсичностью.

Нейтрализующие антитела легко получают от животных, таких как кролики, козы или мыши, путем иммунизации с помощью 1Ь-18. Иммунизированные мыши являются особенно пригодными для обеспечения источников В-клеток для получения гибридом, которые по очереди культивируют для получения больших количеств моноклональных антител против 1Ь-18.

Химерные антитела представляют собой молекулы иммуноглобулина, характеризующиеся двумя или несколькими сегментами или частями, полученными от различных видов животных. Обычно вариабельную область химерного антитела получают из антитела млекопитающего, не человека, такого как мышиное моноклональное антитело, и константную область иммуноглобулина получают из молекулы иммуноглобулина человека. Предпочтительно обе области и комбинация обладают низкой иммуногенностью, что определяется обычным образом (24). Гуманизированные антитела представляют собой молекулы иммуноглобулина, созданные с помощью генно-инженерных технологий, в которых константная область мыши замещена эквивалентной областью человека, при этом сохраняя антиген-связывающие регионы мыши. Полученное химерное антитело мышь-человек предпочтительно обладает пониженной иммуногенностью и улучшенными фармакокинетическими свойствами у человека (25).

Таким образом, согласно другому предпочтительному воплощению антитело против ΣΠ-18 представляет собой гуманизированное антитело против 1Ь-18. Предпочтительные примеры гуманизированных антител против ΣΠ-18 описаны, например, в заявке на выдачу европейского патента ЕР 0974600.

Согласно еще другому предпочтительному воплощению антитело против ΣΠ-18 является полностью человеческим. Технология получения антител человека описана подробно, например, в XVО 00/76310, Χνϋ 99/53049, И8 6162963 или Аи 5336100. Полностью человеческие антитела являются предпочтительно рекомбинантными антителами, продуцируемыми трансгенными животными, например химерными мышами, содержащими полностью или части функциональных локусов Σ§ человека.

Согласно очень предпочтительному воплощению настоящего изобретения ингибитор ΣΠ-18 представляет собой 1Ь-18ВР или его изоформу, мутеин, гибридный белок, функциональное производное, активную фракцию или производное с круговой перестановкой. Данные изоформы, мутеины, гибридные

- 8 007014 белки или функциональные производные сохраняют биологическую активность 1Ь-18ВР, особенно связывания с И-18, и предпочтительно обладают, по крайней мере, существенной активностью, сходной с 1Ь-18ВР. Идеально, подобные белки обладают биологической активностью, которая даже повышена по сравнению с неизмененным 1Ь-18ВР. Предпочтительные активные фракции обладают активностью, более высокой, чем активность 1Ь-18ВР, или имеющей дополнительные преимущества, подобные более высокой стабильности или более низкой токсичности или иммуногенности, или их легче получить в большом количестве или легче очистить.

Последовательности 1Ь-18ВР и его вариантов/изоформ сплайсинга могут быть взяты из ШО 99/09063 или из (12) так же как и из (23).

Функциональные производные 1Ь-18ВР могут быть присоединены к полимерам для улучшения свойств белка, таких как стабильность, полупериод существования, биодоступность, толерантность в отношении организма человека или иммуногенность. Для выполнения данной цели 1Ь-18ВР может быть присоединен, например, к полиэтиленгликолю (РЕС). Присоединение РЕС может проводиться с помощью известных способов, описанных, например, в ШО 92/13095.

Поэтому, согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения, 1Ь-18ВР присоединен к РЕС.

Согласно другому предпочтительному воплощению изобретения ингибитор ИЛ-18 представляет собой гибридный белок, содержащий целиком 1Ь-18-связывающий белок или его часть, которая присоединена к целому иммуноглобулину или его части. Специалисту в данной области будет понятно, что полученный гибридный белок сохраняет биологическую активность 1И-18ВР, в частности, связывания с 1Ь18. Слияние может быть прямым или посредством короткого линкерного белка, который может быть коротким длиной от 1 до 3 аминокислотных остатков или длиннее, например длиной 13 аминокислотных остатков. Указанный линкер может быть трипептидом с последовательностью, например, Е-Е-М (С1иР11с-Мс1). или с линкерной последовательностью в 13 аминокислот, включающей С1и-Рйе-С1у-А1а-С1уЕеиШа1-Ееи-С1у-С1у-С1п-Рйе-Ме1, встроенной между последовательностью 1И-18ВР и последовательностью иммуноглобулина. Полученный гибридный белок обладает улучшенными свойствами, такими как увеличенный период пребывания в жидких средах организма (полупериод существования), повышенная специфическая активность, повышенный уровень экспрессии или облегчение очистки гибридного белка.

Согласно предпочтительному воплощению 1И-18ВР присоединяют к константной области молекулы 1д. Предпочтительно, проводят присоединение к области тяжелых цепей, например, подобно СН₂ и СН₃-доменам 1дС1 человека. Получение специфических гибридных белков, содержащих 1И-18ВР и часть иммуноглобулина, например, описаны в примере 11 ШР 99/09063. Другие изоформы молекулы 1д также пригодны для получения гибридных белков согласно настоящему изобретению, такие как изоформы 1дС₂, или 1дС₄, или другие классы 1д, например, подобно 1дМ или 1дА. Гибридные белки могут быть мономерными или мультимерными, гетеро- или гомомультимерными.

Интерфероны преимущественно известны по эффектам ингибирования вирусной репликации и клеточной пролиферации. Интерферон-γ, например, играет важную роль в развитии иммунного и воспалительного ответов. Указывают, что интерферон-β (ΙΕΝ-β, интерферон типа I) играет противовоспалительную роль.

Изобретение также относится к применению комбинации ингибитора 1Ь-18 и интерферона для получения лекарственного средства для лечения атеросклероза.

Интерфероны также могут быть присоединены к полимерам для улучшения стабильности белков. Конъюгат интерферона β и полиола полиэтиленгликоля (РЕС), например, описан в ШО 99/55377.

Согласно другому предпочтительному воплощению изобретения интерферон представляет собой интерферон-β (ΙΕΝ-β) и более предпочтительно ΙΕΝ-β 1а.

Ингибитор продукции и/или функции [Л-18 предпочтительно применяют одновременно, последовательно или отдельно с интерфероном.

Согласно еще другому воплощению изобретения ингибитор 1Л-18 применяют в сочетании с антагонистом ΤΝΕ. Антагонисты ΤΝΕ проявляют свою активность различными путями. Первый, антагонисты могут связывать или секвестировать саму молекулу ΤΝΕ с достаточной аффинностью и специфичностью для частичной или значительной нейтрализации эпитопа ΤΝΕ или эпитопов, ответственных за связывание с рецептором ΤΝΕ (здесь и далее называемые «секвестирующие антагонисты»). Секвестирующие антагонисты могут, например, быть антителом против ΤΝΕ.

Альтернативно, антагонисты ΤΝΕ могут ингибировать путь передачи сигнала ΤΝΕ, активирующийся с помощью рецептора на поверхности клетки после связывания ΤΝΕ (здесь и далее называемые «сигнальные антагонисты»). Обе группы антагонистов являются приемлемыми как по отдельности, так и вместе, в сочетании с ингибитором [Л-18 при лечении атеросклероза.

Антагонисты ΤΝΕ легко распознаются и оцениваются с помощью обычного отбора кандидатов по их влиянию на активность нативного ΤΝΕ на чувствительных клеточных линиях ίη νίίτο, например, Вклетках человека, в которых ΤΝΕ вызывает пролиферацию и секрецию иммуноглобулинов. Анализ включает состав ΤΝΕ при различных разведениях кандидата-антагониста, например, от 0,1 до 100

- 9 007014 кратного мольного количества ΤΝΡ, применяемого для анализа, и контроля с отсутствием ΤΝΡ или только антагонистом (26).

Секвестирующими антагонистами являются предпочтительные антагонисты ΤΝΡ, применяемые согласно настоящему изобретению. Среди секвестирующих антагонистов предпочтительными являются такие полипептиды, которые связывают ΤΝΡ с высокой аффинностью и обладают низкой иммуногенностью. Растворимые молекулы рецептора ΤΝΡ и нейтрализующие антитела против ΤΝΡ являются особенно предпочтительными. Например, растворимый ΤΝΡ-Ρ.Ι и ΤΝΡ-КП являются пригодными согласно настоящему изобретению. Усеченные формы данных рецепторов, включающие внеклеточные домены рецепторов или их функциональные части, представляют собой особенно предпочтительные антагонисты согласно настоящему изобретению. Усеченные растворимые рецепторы ΤΝΡ типа I и ΤΝΡ типа II, например, описаны в ЕР914431.

Усеченные формы рецепторов ΤΝΡ растворимы и определяемы в моче и сыворотке как 30 и 40 кДа ингибиторные белки, связывающие ΤΝΡ, которые обозначаются ΤΒΡΙ и ΤΒΡΙΙ соответственно (27). Согласно изобретению предпочтительно одновременное, последовательное или отдельное применение ингибитора 1Ь-18 с антагонистом ΤΝΡ и/или интерфероном.

Согласно изобретению ΤΒΡΙ и ΤΒΡΙΙ являются предпочтительными антагонистами ΤΝΡ, применяемыми в сочетании с ингибитором Ш-18. Производные, фрагменты, области и биологически активные участки молекулы рецепторов функционально имеют сходство с молекулами рецепторов и также могут применяться в настоящем изобретении. Подобный биологически активный эквивалент или производное молекулы рецептора относится к участку полипептида или последовательности, кодирующей молекулу рецептора, который имеет существенный размер и способен связывать ΤΝΡ с такой аффинностью, что взаимодействие с мембраносвязанным рецептором ΤΝΡ ингибируется или блокируется.

Согласно дополнительному предпочтительному воплощению растворимый ΤΝΡ-ΚΙ (ΤΒΡΙ) человека представляет собой антагонист ΤΝΡ, применяемый согласно изобретению. Нативные и рекомбинантные молекулы растворимого рецептора ΤΝΡ и способы их получения описаны в европейских патентах ЕР 308378, ЕР 398 327 и ЕР 433900.

Ингибитор ЕС-18 может применяться одновременно, последовательно или отдельно от ингибитора ΤΝΡ. Преимущественно применяется комбинация антитела против ГС-18 или антисыворотка и растворимый рецептор ΤΝΡ, обладающий ингибирующей активностью по отношению к ΤΝΡ.

Согласно другому предпочтительному воплощению изобретения лекарственное средство дополнительно включает ингибитор СОХ, предпочтительно ингибитор СОХ-2. Ингибиторы СОХ известны в данной области. Конкретные ингибиторы СОХ-2 описаны, например, в №О 01/00229.

Ингибиторы тромбоксана, в частности тромбоксана А2, в настоящее время широко применяются для лечения атеросклероза. Следовательно, согласно другому предпочтительному воплощению изобретения лекарственное средство дополнительно включает ингибитор тромбоксана, и в частности, ингибитор тромбоксана А2, для одновременного, последовательного или отдельного применения. Согласно изобретению особенно предпочтительным является применение аспирина в сочетании с ингибитором ΙΕ-18.

Одной из причин атеросклероза становится наличие высокой концентрации липидов в крови. Следовательно, согласно другому предпочтительному воплощению лекарственное средство дополнительно включает агент, снижающий уровень липидов, для одновременного, последовательного или отдельного применения. Любой агент, снижающий уровень липидов, известный в данной области, может применяться согласно изобретению, такой как следующие агенты, снижающие уровень липидов, включающие лекарственные средства, такие как холестирамин, колестипол, никотиновая кислота, гемфиброзил, пробукол и другие. Особенно предпочтительными являются ингибиторы НМО СоА-редуктазы и предпочтительно так называемые статины. Многие статины являются известными в данной области, такие как симвастатин или ловастатин.

Для улучшения предотвращения и/или лечения атеросклероза предпочтительное воплощение изобретения относится к применению ингибитора КС-18 в сочетании с диетой с низким содержанием жира и/или холестерина, и/или соли.

Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения ингибитор РС-18 применяют в дозе приблизительно от 0,0001 до 10 мг/кг массы тела или приблизительно от 0,01 до 5 мг/кг массы тела, или приблизительно от 0,1 до 3 мг/кг массы тела, или приблизительно от 1 до 2 мг/кг массы тела. Согласно еще одному предпочтительному воплощению ингибитор РС-18 применяют в дозе приблизительно от 0,1 до 1000 мкг/кг массы тела или от 1 до 100 мкг/кг массы тела, или от 10 до 50 мкг/кг массы тела.

Изобретение, кроме того, относится к применению экспрессирующего вектора, содержащего последовательность, кодирующую ингибитор РС-18, для получения лекарственного средства для предотвращения и/или лечения атеросклероза. Таким образом, для лечения и/или предотвращения заболевания применяются подходы генной терапии. Преимущественно, экспрессия ингибитора ТС-18 далее будет проходить ίη δίΐιι. таким образом эффективно блокируя ТС-18 непосредственно в ткани(ях) или клетках, подверженных этому заболеванию.

- 10 007014

Как подробно изложено в примерах ниже, показано, что эффективная экспрессия 1Ь-18ВР может быть представлена на мышиной модели заболевания после электропереноса экспрессирующего вектора, содержащего последовательность, кодирующую 1Ь-18ВР.

Следовательно, согласно предпочтительному воплощению экспрессирующий вектор вводят с помощью электропереноса предпочтительно внутримышечно.

Применение вектора для индукции и/или усиления эндогенной продукции ингибитора 1Ь-18 в клетке, обычно не экспрессирующей ингибитор 1Ь-18 или в которой количество экспрессируемого ингибитора не существенно, также рассматривается согласно изобретению. Вектор может содержать регуляторные последовательности, функционирующие в клетках, в которых желательна экспрессия ингибитора 1Ь18. Подобные регуляторные последовательности могут, например, содержать промоторы или энхансеры. Регуляторная последовательность далее может быть встроена в правильный локус генома путем гомологичной рекомбинации, таким образом реально связывая регуляторную последовательность с геном, экспрессию которого необходимо индуцировать или усилить. Технологию обычно относят к «эндогенной активации гена» (ЕСЛ), и она описана, например, в АО 91/09955.

Специалисту в данной области будет понятно, что также возможно прекратить экспрессию №-18. применяя такие же способы, т. е. с помощью встраивания отрицательно регулирующего элемента, например сайленсера, в локус гена 1Ь-18, таким образом, приводя к отрицательной регуляции или прекращению экспрессии 1Ь-18. Специалисту в данной области будет понятно, что подобная отрицательная регуляция или подавление экспрессии №-18 имеет такой же эффект, что и применение ингибитора №-18 для предотвращения и/или лечения заболевания.

Изобретение, кроме того, относится к применению клетки, генетически модифицированной, для продукции ингибитора №-18 для получения лекарственного средства для лечения и/или предотвращения атеросклероза.

Изобретение, кроме того, относится к фармацевтическим композициям, особенно пригодным для предотвращения и/или лечения атеросклероза, которые включают терапевтически эффективное количество ингибитора №-18 и терапевтически эффективное количество интерферона. В качестве ингибитора [№-18 композиция может включать ингибиторы каспазы-1, антитела против [№-18. антитела против любой из субъединиц рецептора №-18. ингибиторы пути передачи сигнала ЕС-18, антагонисты 1С-18, конкурирующие с 1С-18 и блокирующие рецептор 1С-18, и белки, связывающие 1С-18, их изоформы, мутеины, гибридные белки, функциональные производные, активные фракции или производные с круговой перестановкой, обладающие такой же активностью.

1Ь-18ВР и их изоформы, мутеины, гибридные белки, функциональные производные, активные фракции и производные с круговой перестановкой, описанные выше, являются предпочтительными активными составляющими фармацевтических композиций.

Интерферон, входящий в фармацевтическую композицию, предпочтительно представляет собой ΙΕΝ-β.

Согласно еще другому предпочтительному воплощению фармацевтическая композиция включает терапевтически эффективное количество ингибитора 1С-18, необязательно интерферон и антагонист ΤΝΡ. Антагонисты ΤΝΡ могут являться антителами, нейтрализующими активность ΤΝΡ или растворимыми усеченными фрагментами рецептора ΤΝΡ, также обозначаемыми ΤΡΒΙ и ΤΡΒΙΙ. Фармацевтическая композиция согласно изобретению может дополнительно содержать один или несколько ингибиторов СОХ, предпочтительно ингибиторы СОХ-2. Фармацевтическая композиция согласно изобретению может дополнительно содержать ингибитор тромбоксана, такой как аспирин, и/или вещество, снижающее уровень липидов, такое как статин.

Определение «фармацевтически приемлемый» означает включение любого носителя, который не препятствует эффективности биологической активности активного компонента, и не является токсичным по отношению к хозяину, которому он вводится. Например, для парентерального введения активные белки могут быть сформированы в стандартную дозированную форму для инъекций вместе с носителями, такими как солевой раствор, раствор декстрозы, сывороточный альбумин и раствор Рингера.

Активные компоненты фармацевтической композиции согласно изобретению могут вводиться индивидуально различными путями. Пути введения включают внутрикожный, чрескожный (например, при медленно высвобождающихся составах), внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подкожный, пероральный, эпидуральный, местный и интраназальный путь. Может применяться любой другой терапевтически эффективный путь введения, например абсорбция через эпителиальные или эндотелиальные ткани, или путем генной терапии, при котором молекула ДНК, кодирующая активный компонент, вводится пациенту (например, с помощью вектора), что приводит к экспрессии активного компонента и секреции ίη νίνο. Кроме того, белок (белки) согласно изобретению могут вводиться вместе с другими компонентами биологически активных препаратов, такими как фармацевтически приемлемые сурфактанты, эксципиенты, наполнители, разбавители и носители.

Для парентерального введения (например, внутривенного, подкожного, внутримышечного) активный белок (белки) может быть представлен в форме раствора, суспензии, эмульсии или лиофилизованного порошка в сочетании с фармацевтически приемлемым парентеральным носителем (например, водой,

- 11 007014 солевым раствором, раствором декстрозы) и добавками, поддерживающими изотоничность (например, маннит) или химическую стабильность (например, консерванты или буферы). Форму стерилизуют с помощью обычно применяемых способов.

Биодоступность активного белка (белков) согласно изобретению также можно улучшить с помощью способов присоединения, которые увеличивают полупериод существования молекулы в организме человека, например, присоединением молекулы к полиэтиленгликолю, как описано в РСТ-заявке на выдачу патента \¥О 92/13095.

Терапевтически эффективное количество активного белка (белков) может быть функцией многих переменных, включая тип антагониста, аффинность антагониста к 1Б-18, какая-либо остаточная цитотоксическая активность, проявляемая антагонистом, путь введения, клиническое состояние пациента (включая желательность поддержания нетоксичного уровня активности эндогенного ±-18).

«Терапевтически эффективное количество» является таким, что при введении ингибитора 1Ь-18 наблюдается ингибирование биологической активности 1Ь-18. Вводимая доза в виде одной или многократной дозы пациенту будет изменяться в зависимости от ряда факторов, включающих фармакокинетические свойства ингибитора ΣΠ-18, путь введения, состояние пациента и характеристики (пол, возраст, масса тела, состояние здоровья, размер), выраженность симптомов, сопутствующая терапия, частота лечения и желаемый эффект. Подбор и манипулирование установленными границами дозирования входит в компетенцию специалиста в данной области, так же как и способами определения ίη νίίτο и ίη νΐνο ингибирования ΣΠ-18 у пациента.

Согласно изобретению ингибитор ΣΠ-18 применяют в количестве приблизительно от 0,0001 до 10 мг/кг или приблизительно от 0,01 до 5 мг/кг массы тела, или приблизительно от 0,01 до 5 мг/кг массы тела, или приблизительно от 0,1 до 3 мг/кг массы тела, или приблизительно от 1 до 2 мг/кг массы тела. Другое предпочтительное количество ингибиторов ΣΠ-18 составляет приблизительно от 0,1 до 1000 мкг/кг массы тела или приблизительно от 1 до 100 мкг/кг массы тела, или от 10 до 50 мкг/кг массы тела.

Путь введения, являющийся предпочтительным согласно изобретению, представляет собой введение подкожным путем. Внутримышечное введение является другим предпочтительным путем согласно изобретению.

Согласно другим предпочтительным воплощениям ингибитор ΣΠ-18 вводится ежедневно или через день.

Суточные дозы обычно даются в разделенных дозах или в форме с замедленным высвобождением для достижения желаемых результатов. Вторые или последующие введения могут проводиться в такой же дозированной форме в меньшей или большей дозе по сравнению с начальной или предыдущей дозой, вводимой пациенту. Второе или последующее введение может проводиться в ходе или перед началом заболевания.

Согласно изобретению ингибитор ΣΠ-18 может вводиться профилактически или терапевтически пациенту перед, одновременно или последовательно с другими терапевтическими схемами или препаратами (например, схема, включающая несколько лекарств) в терапевтически эффективном количестве. Активные вещества, вводимые одновременно с другими терапевтическими препаратами, могут вводиться в одной или различных композициях.

Изобретение, кроме того, относится к способу лечения и/или предотвращения атеросклероза, включающему введение нуждающемуся в этом хозяину эффективного ингибирующего количества ингибитора Ш-18.

Изобретение, кроме того, относится к способу предотвращения и/или лечения атеросклероза, включающему введение нуждающемуся в этом хозяину экспрессирующего вектора, содержащего последовательность, кодирующую ингибитор ±-18.

Согласно предпочтительному воплощению изобретения экспрессирующий вектор вводят системно и более предпочтительно с помощью внутримышечных инъекций.

Изобретение, кроме того, относится к применению ΣΠ-18 как диагностического маркера плохого клинического прогноза сердечной недостаточности. Плохой клинический прогноз включает любое ухудшение состояния пациента, подобно рецидивным явлениям или даже смерти, последующей за первым инфарктом миокарда.

Предпочтительно ΣΠ-18 применяют как диагностический маркер рецидивирующих случаев после первого проявления сердечной недостаточности. Рецидивирующие случаи включают, но не ограничиваются, смерть, рекуррентную ишемию, реваскуляризацию, прогрессию атеросклероза или периодически повторяющуюся госпитализацию по поводу сердечной недостаточности.

Только что описанное изобретение будет более легко понятно с помощью ссылки на последующие примеры, которые представлены для иллюстрации и не предназначены для ограничения настоящего изобретения.

- 12 007014

Примеры

Материалы и методы

Образцы.

Собирали 41 атеросклеротическую бляшку человека, удаленные у 36 пациентов, подвергшихся эндартерэктомии сонной артерии. Для контроля 2 сонные артерии и 3 внутренних грудных артерии, не пораженные атеросклерозом (2 с минимальными фибромышечными уплотнениями), получали путем аутопсии или в ходе операции коронарного шунтирования. Их быстро погружали в жидкий азот и хранили при -80°С. Бляшки, которые применяли для экстракции белка и РНК, быстро промывали, погружали в жидкий азот перед помещением на хранение при -80°С. Для иммуногистохимических исследований бляшки помещали на 2 ч в свежеприготовленный 4% параформальдегид, далее переносили в 30% раствор сахароза-РВ8 перед быстрым замораживанием в оптимальной среде обработки ткани до температуры резания (О.С.Т. Сотроипй, М11е§ 1пс, Οίαβηοδίίοδ Όίνίδίοη) с помощью жидкого азота и хранили при -80°С для криостатного секционирования. Несколько срезов от 8 до 10 мкм получали из каждого образца для гистологического анализа и иммуногистохимического исследования.

Классификация пациентов.

Для изучения возможной связи между экспрессией 1Ь-18/1Ь-18ВР и признаками нестабильности бляшки авторы собирали клинические данные ίη рго8рес1тое и слепым способом у 23 следующих друг за другом пациентов (из 36), подвергшихся процедуре эндартерэктомии между апрелем и маем 2000. Наличие или отсутствие изъязвления внутри бляшки при макроскопическом исследовании систематически отмечалось хирургом, проводившим процедуру эндартерэктомии. Это давало возможность авторам классифицировать бляшки как изъявленные или неизъязвленные бляшки. Кроме того, пациентов систематизировали согласно клиническим симптомам на две отдельные группы. Пациентов, у которых присутствовали клинические симптомы ишемического нарушения мозгового кровообращения, относящиеся к стенозу сонной артерии, классифицировали как симптоматических. Эндартерэктомию проводили спустя 2-66 дней (17,6 ± 5,3 дней) после появления клинических симптомов у данных пациентов. Пациентов, которые никогда не испытывали симптомы ишемического нарушения мозгового кровообращения в области сонной артерии, классифицировали как асимптоматических. Асимптоматический стеноз сонной артерии определяли на основе систематической клинической оценки пациентов с заболеванием сердца или периферических сосудов, и его тяжесть устанавливали с помощью повторной Допплер-эхографии действительно опытным эхографистом. Даже если асимптоматические пациенты никогда не имели ишемического эпизода в области стеноза сонной артерии, эндартерэктомия сонной артерии была показана полезной данным пациентам, как показано исследователями асимптоматического атеросклероза сонной артерии (АСА8) (28).

Вестерн-блот-анализ.

Белки экстрагировали из 12 атеросклеротических бляшек и 5 контрольных нормальных артерий. Замороженные образцы растирали в присутствии жидкого азота. Порошкообразные массы ресуспендировали в ледяном лизирующем буфере (20 ммоль/л Трис-НС1, рН 7,5, 5 ммоль/л ЕСТА, 150 ммоль/л ΝαΧΙ, 20 ммоль/л глицерофосфата, 10 ммоль/л №1Е 1 ммоль/л ортованадата натрия, 1% Тритон Х-100, 0,1% Тетееп 20, 1 мкг/мл апротинина, 1 ммоль/л РМ8Е, 0,5 ммоль/л Ν-тозил-Ьфенилаланинхлорметилкетона (ТРСК), 0,5 ммоль/л Ма)-п-тозил-Б-лизинхлорметилкетона (ТЬСК)) в соотношении 0,3 мл/10 мг по массе. Экстракты инкубировали на льду в течение 15 мин и далее центрифугировали (12000 д, 15 мин, 4°С). Детергент-растворимые супернатантные фракции сохраняли, и концентрации белка в образцах определяли с помощью белкового анализа Βίο-Кай.

Для проведения Вестерн-блоттинга для 1Ь-18 и 1Б-18Р белковые экстракты кипятили в течение 5 мин и наносили на 7,5 или 15% δΌδ-полиакриламидный гель. Для 1Б-18ВР гЫЬ-18, выделенный из Е. Со11 (8етопо Рйагтасеи11са1 Кекеагсй 1п81йи1е, Сеηеνа) соединяли с АйИде1 15 (Вюгай) на 1 мг/мл смолы согласно протоколу производителей. Белковый экстракт (60 мкг) инкубировали в течение ночи при 4°С с мешалкой вместе с 20 мкл смолы, доведенной до 500 мкл РВ8 0,05% Тетееп. Для удаления любого неспецифического связывания смолу центрифугировали и промывали 10 мМ Трис рН 8, 140 мМ №С1, 0,5% Тритон-Х-100 (Е1ика), 0,5% дезоксихлоратом, затем 50 мМ Трис рН 8, 200 мМ №С1, 0,05% ТХ100, 0,05% пошйе! Р40 (Е1ика), 2 мМ СНАР8 (Воейппдег, Маппйет), с последующей последней промывкой 50 мМ Трис рН 8. Далее смолу центрифугировали, ресуспендировали в буфере для образцов в приведенных условиях, кипятили в течение 5 мин и, наконец, наносили на 10% δΌδ-полиакриламидный гель ΝυРАСЕ (1п\'Цгодеп).

Образцы электрофоретически переносили из полиакриламидных гелей на нитроцеллюлозу. Нитроцеллюлозные мембраны пропитывали в течение 2 ч при комнатной температуре в ТВ8Т (50 ммоль/л Трис-НС1 (рН 7,5), 250 ммоль/л №1С1 и 0,1% солевой раствор Т\гееп), содержащем 5% безлипидного сухого молока. Далее мембраны инкубировали с козьими поликлональными антителами против 1Б-18 и 1Ь18К (α-цепь) человека (1 мкг/мл) (Ρ.&Ό ЗуМепъ), мышиными моноклональными антителами против 1Ь18ВР человека (МаЬ 657,27 5 мкг/мл) (СогЬах е! а1., 2000, рукопись в печати), кроличьими поликлональными антителами против каспазы-1 человека (1 мкг/мл) (А-19, 8ап1а Сгих). Специфичность МаЬ 657,27 анализировали на полоске мембраны путем конкурентного анализа с помощью 200-молярного избытка

- 13 007014 гЫЬ-18РВ-6Ы8 (выделенного из клеток яичника китайского хомячка, 8етопо Рйаттасеийса1 Кекеагск ΙπκΙί1н1е), совместно инкубированного с МаЬ 657.27 в концентрации 5 мкг/мл в течение 1 ч. Последующую инкубацию с НКР, связанным с соответствующими антителами, хемилюминесцентными веществами (ЕСЬ, \Уек1егп Ь1ой1пд; Атегкйат Согр) проводили для обнаружения положительных полос согласно инструкциям производителей, и полосы визуализировали после экспозиции с фотопленкой НуретГибш ЕСЬ (АтегаНат Согр).

Иммуногистохимия.

Замороженные срезы 6 атеросклеротических бляшек инкубировали с нормальной лошадиной сывороткой 1:10 или нормальной козьей сывороткой 1:10 в течение 30 мин при комнатной температуре, однократно промывали РВ8, далее инкубировали либо с первыми мышиными моноклональными антителами против СИ68 для распознавания макрофагов (ИЛКО-СИ68, КР1), либо с первыми мышиными моноклональными антителами против α-актина гладкомышечной ткани человека (1А4, ИАКО) для распознавания гладкомышечных клеток. Для распознавания ΙΠ-18 и рецептора ΙΠ-18 в атеросклеротических бляшках применяли специфические козьи поликлональные антитела (К&И 8ук1етк) в разведении 5 мкг/мл. 1Ь-18ВР определяли с помощью специфических моноклональных антител против рекомбинантной изоформы 1Ь-18ВР человека (Н20) (СогЬах е! а1., 2000, рукопись в печати). После промывания в РВ8 стекла инкубируют со следующими вторыми связанными с биотином антителами: связанные с биотином лошадиные 1дС против иммуноглобулина мыши (Уес1ог ЬаЬогаФпек, 1пс) в разведении 1:200 для определения мест присоединения антител против СИ68, α-актина гладкомышечных клеток и 1Ь-18ВР и связанные с биотином лошадиные ΙβΟ против иммуноглобулина козы (Уес1от) в разведении 1:200 для определения антител против ΙΠ-18 и рецептора 1Ь-18. Иммуноокрашивание визуализировали с помощью авидин-биотиновой НКР системы визуализации (Уес1ак1аш АВС кй РК-6100 Уес1ог). Для отрицательных контролей параллельные срезы выдерживали с подходящими по изотипу посторонними антителами взамен первых антител.

Выделение РНК.

Суммарную РНК экстрагировали из 29 атеросклеротических бляшек в кислом гуанидинтиоцианатном растворе и экстрагировали фенолом и хлороформом согласно способу Оютс/упкЕ! апб 8ассЫ (29). Выделенную РНК растворяли в воде и концентрацию измеряли поглощением при 260 нм. Степень деградации РНК оценивали с помощью электрофореза на 1% агарозных гелях. кДНК синтезировали из 1 мкг суммарной РНК, применяя систему обратной транскрипции Рготеда согласно протоколу производителей.

Полуколичественная и проводимая в режиме реального времени ПЦР ΙΠ-18 и 1Ь-18ВР человека из атеросклеротических бляшек человека.

Полуколичественные реакции ПЦР проводили в полном объеме 50 мкл в присутствии 1ЕД ДНКполимеразы АтрЕТац (Реткш Е1тег, Коске, И.8.А.), 2,5 мМ 6ΝΤΡ (АтегаНат, И.8.А.) и 50 пмоль прямых и обратных ПЦР-праймеров. Реакционные смеси инкубировали в РТС-200 РеШег ЕГГес! Тйетта1 Сус1ег (Мб Векеатсй, И.8.А.) при следующих условиях: денатурация 1 мин при 94°С, отжиг в течение1 мин при 55°С и элонгация в течение 1 мин при 72°С. Для убеждения наличия соответствующего количества ПЦРпродуктов в течение линейной стадии ПЦР-реакции ΙΕ-18ΒΡ, ΙΠ-18 и β-актин анализировали после 25, 28 и 31 цикла. Устанавливали оптимальное количество циклов для ΙΕ-18ΒΡ, ΙΠ-18 и β-актина до насыщения полос (31, 28 и 25 соответственно). ПЦР-праймеры подбирали на основе описанных последовательностей (АЕ110799, Ό49950, Х00351), являющихся следующими: ΙΠ-18, обратная 5'ОСОТСАСТАСАСТСАОСТАА-3'; прямая 5'-ОССТА6А66ТАТ66СТОТАА-3'; Ш-18ВР, прямая 5'АССТОТСТАССТ66А6ТОАА-3'; обратная 5'-ОСАС6АА6АТА66АА6ТСТО-3'; β-актин, обратная 5'06А66А6СААТ6АТСТТ0АТСТТС-3'; прямая 5'-ОСТСАССАТ66АТ6АТ6АТАТСОС-3'. Для исключения амплификации возможной геномной ДНК, присутствующей в образцах, реакции ПЦР проводили в отсутствие матрицы кДНК. ПЦР-продукты (10 мкл) анализировали на 1% агарозных гелях, проводя электрофорез в 1-кратном буфере ТАЕ. Размер ПЦР-продуктов определяли сравнением с последовательно расположенными в виде лестницы окрашенными полосами в 1 т.п.н. на гелях. (С1Ьсо). Относительную количественную оценку полос, окрашенных бромистым этидием, проводили под воздействием УФсвета с помощью Кобак И1дйа1 8с1епсек апа1уйса1 койтеаге, и отмечали как соотношение искомого гена (ЫЕ-18ВР, ЙЕ-18) к контрольно-диспетчерскому гену (Ηβ-актин).

Праймеры 8ΎΒΡ. Отееп Кеа1 Т1те РСК для ΙΠ-18, Ю-18ВР и САРИН (контрольный контрольнодиспетчерский ген) подбирали с помощью Рптег Ехргекк койтеате Ггот РЕ ВюкуДетк согласно опубликованным последовательностям (АЕ110799, Ό49950, ΝΜ 002046), являющимся следующими: ΙΠ-18, обратная 5'-СА6ССОСТТТА6САОССА-8'; прямая 5'-СААО6ААТТ6ТСТСССА6ТОС-3'; Ш-18ВР, обратная 5'' -ААССА66СТТОА6СОТТСС-3'' ; прямая 5'-ТСССАТОТСТСТОСТСАТТТАОТС-3'; САРИН, обратная 5'-ОАТ666АТТТССАТТ6АТОАСА-3'; прямая 5'-ССАСССАТООСАААТТСС-3'; интронОАРИН, обратная 5'-ССТАОТСССА666СТТТОАТТ-3'; прямая 5'-СТОТОСТСССАСТССТОАТТТС-3'. Оценивали специфичность и оптимальную концентрацию праймера. Возможное загрязнение геномной ДНК исключали с помощью проведения ПЦР-реакций со специфическими праймерами интрон-ОАРИН.

- 14 007014

Отсутствие неспецифической амплификации устанавливали по анализу ПЦР-продуктов с помощью электрофореза в 3,5% агарозном геле. ПЦР 8ΥΒΚ Сгееп Кеа1 Т1те проводили с применением 5 мкл/лунка ОТ-продуктов (0,5 нг суммарной РНК), 25 мкл/лунку 8ΥΒΚ Сгееп ГСИ шак1ег т1х (ΡΕ Β^οкукΐет, СА, И8А) с урацил-Ы-гликозилазой АтрЕгаке (υΝΟ) (0,5 Ед/лунка) и 20 мкл праймеров (300 нМ). ПЦР проводили при 50°С в течение 2 мин (для инкубации с АтрЕгаке υΝΟ для удаления всего урацила, встроенного в кДНК), 95°С в течение 10 мин (для активации Атр1|Тас.| СоИ) и далее прохождение 40 циклов при 95°С в течение 15 с, 60°С в течение 1 мин на ΛΒΙ ΡΚΙ8Μ 7700 Эе1ес11оп кук1ет. Обратно транскрибированные образцы кДНК таким образом амплифицировали и определяли значения их С (порогового значения циклов). Все С.'1-величины нормализовали по отношению к контрольно-диспетчерскому гену ΟΛΡΩΗ. Отдельные специфические полосы ДНК для ΙΠ-18, ΙΕ-18ВР и ΟΛΡΩΗ получали с помощью гель-электрофореза.

Принцип определения в режиме реального времени с помощью «8ΎΒΚ Сгееп ГСИ так1ег ιηίχ» основан на непосредственном определении ПЦР-продуктов с помощью измерения увеличения флуоресценции в результате связывания красителя 8ΎΒΚ Сгееп с двойной цепью ДНК.

Статистический анализ.

Данные представлены в виде средних величин ± станд. ошибка. Уровни ΙΒ-18 сравнивали между группами с помощью теста Манна-Уитни. Значение р 0,05 рассматривали как статистически значимое.

Пример 1. Предотвращение ингибиторами ΙΒ-18 гибели эндотелиальных клеток, индуцированной окисленными липопротеинами (охБОБ).

Культивированные эндотелиальные клетки пупочной вены человека (НиУЕС) инкубировали в течение 16 ч вместе с охЬПЬ в присутствии или в отсутствие ΙΕ-18-связывающего белка или антител против ΙΕ-

18. Как представлено на фиг. 1, 83% НиУЕС погибают после инкубации с охБОБ. Совместная инкубация с ΙΕ-18ΒΡ или антителами против ΙΒ-18 почти полностью предохраняет клетки от гибели. При применении ΙΕ-18ΒΡ не было отмечено гибели. При применении антител против ΙΒ-18 89% клеток выжили.

Данный эксперимент ясно показывает защитный эффект двух различных ингибиторов ΙΒ-18, направленный против гибели клеток в результате апоптоза в атеросклеротической бляшке.

Пример 2. Экспрессия белка ΙΒ-18 и его эндогенного ингибитора ΙΕ-18ΒΡ в атеросклеротических бляшках.

Вестерн-блоттинг проводили для белковых экстрактов, полученных из 12 атеросклеротических сонных артерий и 5 нормальных контролей. Белок ΙΒ-18, включая активную форму, высоко экспрессировался во всех атеросклеротических бляшках, несмотря на обнаружение небольшой экспрессии или ее отсутствие в нормальных артериях (фиг. 2). Линии 1-4 содержат образцы из атеросклеротических бляшек, линии 5-7 - из нормальных артерий. Интересно, определение активной формы ΙΒ-18 возможно коррелирует с экспрессией активной формы каспазы-1, которая участвует в процессинге ΙΒ-18 (фиг. 2 четвертый ряд). Значительная экспрессия белка рецептора ΙΒ-18 (α-цепь) также обнаружена во всех атеросклеротических бляшках по сравнению с очень низким уровнем экспрессии в нормальных артериях (фиг. 2 второй ряд). Кроме того, большинство атеросклеротических бляшек экспрессирует ΙΕ-18ΒΡ, хотя уровень экспрессии гетерогенный (фиг. 2 первый ряд).

Пример 3. Клеточная локализация белка ΙΒ-18 и его эндогенного ингибитора ΙΕ-18ΒΡ в атеросклеротических бляшках.

Для установления клеточной локализации ΙΒ-18 и ΙΕ-18ΒΡ проводили иммуногистохимические исследования на 6 атеросклеротических бляшках сонных артерий. Как представлено на фиг. 2, ΙΒ-18 в основном экспрессируется в макрофагах, данные клетки, возможно, являются главным источником ΙΒ-18 в бляшке (не показано). Данные области также богаты СО3-положительными лимфоцитами. Однако не видно, что Т-лимфоциты непосредственно участвуют в продуцировании ΙΕ-18. ΙΒ-18 также экспрессируется в некоторых гладкомышечных клетках интимы и в редких эндотелиальных клетках. Напротив, значительную экспрессию ΙΕ-18ΒΡ обнаружили в эндотелиальных клетках бляшки микрососудов и в их поверхности со стороны просвета, хотя экспрессию во всех сосудах не обнаружили. Относительно низкую и более гетерогенную экспрессию ΙΕ-18ΒΡ также обнаружили, в основном экстрацеллюлярно, в некоторых богатых макрофагами областях.

Пример 4. Экспрессия транскриптов мРНК ΙΒ-18 и ΙΕ-18ΒΡ в атеросклеротических бляшках и взаимосвязь с нестабильностью бляшки.

Для установления наличия экспрессии мРНК ΙΒ-18 и ΙΕ-18ΒΡ в атеросклеротических бляшках сонной артерии человека проводили полуколичественную ОТ-ПЦР на шести атеросклеротических бляшках (фиг. 3). мРНК ΙΒ-18 и ΙΕ-18ΒΡ обнаружили во всех атеросклеротических бляшках, хотя количество мРНК ΙΒ-18 и ΙΕ-18ΒΡ было гетерогенным. Поэтому, для точного количественного определения уровней экспрессии мРНК ΙΒ-18 и ΙΕ-18ΒΡ дополнительно анализировали 23 атеросклеротические бляшки с помощью метода 8ΎΒΚ Сгееп Кеа1-Т1те ΡΟΕ (фиг. 4). Бляшки характеризовали с помощью клинических и патологических признаков как симптоматические (нестабильные) или асимптоматические (стабильные) бляшки, содержащие макроскопически определяемые изъязвления или не содержащие. Клинические характеристики пациентов суммированы в табл. 4. Процентное значение уменьшения диаметра сонной ар

- 15 007014 терии (60-95%) и факторы риска, включающие возраст, диабет, гиперхолестеринемию, гипертензию и курение, не отличались для двух групп.

Таблица 4. Характеристики пациентов

Асимптоматические Симптоматические

	пациенты (п=9)	пациенты1 (:
Возраст	66,9 ± 4,0	70,2 ± 3,9
Пол	Мужской (8)	Мужской (9)
Гипертензия2	8	9
Гиперхолестеринемия3	4	8
Диабет	3	1
Курение в настоящее время	7	8
Заболевание коронарных	5	4
артерий

¹ Представлены пациенты с транзиторным или преходящим ишемическим нарушением мозгового кровообращения за 2-66 дней до эднартерэктомии.

² Количество пациентов с клинически выраженной гипертензией перед началом лечения антигипертензивными препаратами.

³ Количество пациентов с клинически выраженной гиперхолестеринемией перед началом лечения препаратами, снижающими уровень липидов.

Обнаружили, что количество 1Б-18 подвержено положительной регуляции в симптоматических по сравнению с асимптоматическими бляшками (2,03 ± 0,5 против 0,67 ± 0,17 соответственно) (фиг. 4А). Статистический анализ показал, что данное увеличение продукции 1Б-18, наблюдаемое в симптоматических бляшках, является высоко значимым (р<0,0074), в то время как сниженное количество 1Б-18ВР, обнаруживаемое в симптоматических бляшках по сравнению с асимптоматическими, не является значимым (4,64 ± 0,98 против 2,5 ± 0,92 соответственно) (фиг. 4В). Другими словами, хотя обе симптоматическая и асимптоматическая группы обнаруживают положительную корреляцию между мРНК 1Б-18 и II,18ВР, углы наклона значительно отличаются между 2 группами (симптоматическая группа: угол наклона 1,16 [0,19-2,14], г²=0,36 против асимптоматической группы: угол наклона 4,79 [2,39-7,20], г²=0,76; р<0,05). Поэтому предполагается, что относительное увеличение экспрессии 1Б-18ВР в симптоматической группе не является достаточным для компенсации увеличения экспрессии II,-18. Более того, при рассмотрении наличия изъязвления как признака нестабильности бляшки статистический анализ дополнительно проводили для бляшек без изъязвлений или с изъязвлением внутри бляшки и показали существенную положительную регуляцию 1Б-18 для бляшек с наличием изъязвлений (р<0,018) (фиг. 4С).

Полученные данные показывают, что увеличение экспрессии 1Б-18, наблюдаемое в атеросклеротических бляшках, коррелирует с нестабильностью бляшки.

Пример 5. Регуляция 1Б-18ВР развития и стабильности атеросклеротического поражения на модели заболевания ΐη νΐνο.

Методы

Характеристика пациентов.

Образцы плазмы получали от пациентов с острым ишемическим коронарным синдромом (нестабильная стенокардия и инфаркт миокарда), менее чем 7 дней спустя после появления симптомов. Нестабильную стенокардию устанавливали по ассоциации типичной загрудинной боли вместе с либо ишемическими изменениями на электрокардиограмме, либо присутствием заболевания коронарных артерий. Инфаркт миокарда диагностировали на основании типичных ишемических изменений на электрокардиограмме, ассоциированных со значительным повышением ферментов миокарда (креатинфосфокиназы и тропонина I) в крови. Пациенты без ишемии были набраны в это же кардиологическое отделение и совсем не проявляли признаков ишемии. Уровни Ш-18 человека в плазме определяли с помощью коммерчески доступного набора (МВБ, 1арап).

Внутримышечный электроперенос ΐη νΐνο мышам плазмиды, экспрессирующей Ш-18ВР.

Четырнадцать мышей самцов С57ВБ/6 ароЕ КО 14-недельного возраста получали с 3-недельным интервалом 3 инъекции плазмиды, экспрессирующей Ш-18ВР, рсВХА3-Ш18ВР. Контрольные мыши (п=19) получали инъекции контрольной пустой плазмиды. кДНК изоформы ά П.-18ВР, выделенную как описано (номер доступа # Ρ9ΖΟΜ9) (23), субклонировали по сайтам ЕсоКДЖоП в экспрессирующий вектор клеток млекопитающих рс1)\А3 под контролем цитомегаловирусного промотора (ИпПгодеп). Конструкция, обозначенная 334.у11, представлена на фиг. 5. Контрольная плазмида представляла собой подобную конструкцию, лишенную терапевтической кДНК. Плазмиду, экспрессирующую Ш-18ВР, или контрольную плазмиду (60 мкг) вводили инъекционно в обе большеберцовые краниальные мышцы мыши под анестезией, как описано ранее (13). Кратко, чрескожные электрические импульсы (8 электриче

- 16 007014 ских сигналов прямоугольной формы 200 В/см, продолжительностью 20 мс при 2 Гц) посылали с помощью электроимпульсатора Р8-15 (Сеие1тошс8, Егапсе), применяя два плоских электрода из нержавеющей стали, расположенные друг от друга на 4,2-5,3 мм на каждой стороне ноги.

ЕЬ18А ш1Ь-18ВР.

Плашки покрывали в течение ночи г-т1Е-18ВРй-аффинными кроличьими поликлональными антителами (5 мкг/лунку). Растворимый ш1Ь-18ВР определяли с помощью связанных с биотином кроличьих поликлональных антител (0,3 мкг/мл), направленных против г-т1Ь-18ВР Е. Со11 (Рерто!ес) с последующим добавлением пероксидазы ехйауИш (1/1000) (81дта). Связывание кроличьих поликлональных антител оценивали с помощью Вестерн-блота для определения специфичности т1Ь-18ВР. Рекомбинантный т1Ь-18ВР4, продуцируемый клетками НЕК 293, применяли в качестве стандарта. Чувствительность ЕЫ8Л составила 5 нг/мл.

Анализ мышей.

Криостатные срезы (8 мкм) получали из синуса аорты и применяли для определения липидных отложений с помощью 011 красного, определения коллагена с помощью 8ши5 красного и для иммуногистохимического анализа, как описано ранее (13). Срезы выдерживали со специфическими первыми антителами: против макрофагов мыши, клон МОМА2 (Вю8оит5е), против α-актина, конъюгированные со щелочной фосфатазой, для гладкомышечных клеток и против ΟΌ3 для Т-лимфоцитов (Эако). как описано ранее (13). Определение гибели клеток проводили с помощью метода ΤϋΝΕϋ (13). СЭ3положительные клетки подсчитывали микроскопически слепым способом. Атеросклеротические бляшки в синусе аорты и областях у окрашивающихся положительно на наличие макрофагов, гладкомышечных клеток, коллагена или ΤϋΝΕΕ, измеряли с помощью количественного компьютерного анализа изображения (N815000, МтстоуШои), как описано ранее (13). Инкубированием с неиммунными подходящими по изотипу иммуноглобулинами оценивали специфичность иммуноокрашивания. Специфичность ΤϋΝΕϋ оценивали с помощью опущения фермента терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы. Грудные аорты, располагающиеся от левой подключичной артерии до почечных артерий, фиксировали с помощью 10% буферного раствора формалина и окрашивали на отложение липидов с помощью 011 красного. Далее их разрезали в продольном направлении и процентное количество липидных отложений вычисляли с помощью количественного компьютерного анализа изображения (N815000, МютоуШои).

Результаты

В ходе настоящего исследования проверяли гипотезу о том, что регуляция 1Е-18/1Ь-18ВР играет решающую роль как в атерогенезе, так и в стабильности бляшки. Определяли уровни Ιϋ-18 в плазме пациентов с острыми коронарными синдромами (30 мужчин, 18 женщин, средний возраст 66,2 ± 1,8 лет, из которых 14 имеют нестабильную стенокардию и 34 имеют инфаркт миокарда) и у контрольных пациентов без ишемии, находящихся в том же кардиологическом отделении (10 мужчин, 3 женщины, средний возраст 60,0 ± 5,2 лет). Уровни Ιϋ-18 в плазме были значительно повышены у пациентов с острыми коронарными синдромами по сравнению с контролем (146,9 ± 17,1 против 73,0 ± 12,2 пг/мл соответственно, р<0,05) в отличие от уровней циркулирующих 1Ь-18ВР, которые были немного повышенными (20,1 ±2,7 против 7,5 ± 2,5 нг/мл соответственно, р=0,06). Кроме того, уровни Ιϋ-18 коррелировали с тяжестью заболевания, так как наиболее повышенные уровни были найдены у пациентов с тяжелым ишемическим нарушением сердечной деятельности и клиническими признаками отека легких (224,03 ± 39,1 пг/мл, р<0,001 при сравнении с контролем). Данные результаты, полученные для пациентов с острым коронарным заболеванием, вместе с предыдущими наблюдениями, что Ιϋ-18 повышен в атеросклеротических бляшках пациентов с инсультами [Ма11а!, 2001], отводят возможную важную роль регуляции Ιϋ-18/Ιϋ18ВР в атеросклеротическом процессе.

Поэтому авторы проверили данную гипотезу с применением мышей киоскои! (КО) ароЕ, у которых спонтанно образуются атеросклеротические поражения, подобные человеческим. Четырнадцать 14недельных мышей самцов получали добавление 1Й-18ВР путем внутримышечного электропереноса ίη У1уо экспрессирующей плазмидной ДНК, кодирующей мышиный 1Ь-18ВР4, при этом 19 подходящих по возрасту контрольных мышей получали пустую плазмиду. Электроперенос плазмиды повторяли каждые 3 недели и мышей забивали в 23-недельном возрасте после 9 недель обработки. Уровни мышиного Ιϋ18ВР в плазме были ниже, чем пороговое определяемое значение (5 нг/мл) у мышей ароЕ КО, получавших пустую плазмиду. Однако отдельная инъекция плазмиды, содержащей 1Й-18ВР, приводила к высоким уровням 1Й-18ВР в крови с максимумом спустя 2 дня после инъекции (323,5 ± 100,9 нг/мл) и 127,4 ± 35,4 нг/мл спустя 2 недели. После 9 недель обработки плазмидой, содержащей 1Й-18ВР, или пустой плазмидой сывороточные уровни общего холестерина (489,4 ± 34,6 против 480,8 ± 36,3 мг/дл соответственно) и липопротеинов высокой плотности (52,3 ± 9,4 против 48,8 ± 5,1 мг/дл соответственно) не отличались между двумя группами. Умеренное, но достоверное увеличение массы животных получали в обрабатываемой 1Ь-18ВР группе по сравнению с контрольной группой (31,8 ± 0,9 против 28,6 ± 0,8 г соответственно, р<0,05).

Результат влияния добавления 1Й-18ВР на атеросклероз оценивали в 2 различных локализациях: нисходящей грудной аорте и синусе аорты. Грудная аорта была выбрана для определения роли 1Ь-18ВР в

- 17 007014 образовании жировых полосок (атерогенез), поскольку атеросклеротические поражения грудной аорты всегда отсутствуют в возрасте 14 недель (данные не представлены), когда начинали перенос ГБ-18ВР. Синус аорты, где атеросклеротические поражения уже присутствуют в возрасте 14 недель (данные не представлены), оценивали в отношении развития сформированной бляшки и состава, важного определяющего фактора стабильности бляшки. Обработка с помощью ГБ-18ВР мышей ароЕ КО достоверно влияет на развитие атеросклеротического поражения и развития. Оценка грудной аорты показала заметное уменьшение липидного отложения у мышей, обрабатываемых плазмидой 1Ь-18ВР, по сравнению с пустой плазмидой (фиг. 6). Количественный компьютерный анализ изображения показал 69% уменьшение размера атеросклеротических поражений (р<0,0001) (фиг. 6), указывая на решающую содействующую роль ГБ-18 в атерогенезе. Кроме того, обработка с помощью плазмиды, включающей ГБ-18ВР, только в течение 9 недель достоверно ограничила развитие сформированной бляшки в синусе аорты (24% уменьшение размера бляшки, р=0,01) по сравнению с обработкой пустой плазмидой (фиг. 7).

Более важно, что состав сформированного поражения, важный определяющий фактор стабильности бляшки, оказался сильно подвержен влиянию обработки ГБ-18ВР. Атеросклеротические поражения мышей, обрабатываемых с помощью плазмиды, включающей ГБ-18ВР, проявили очень значительное 50% уменьшение инфильтрации макрофагами (р<0,0001) (фиг. 8), содержание менее 67% Т-лимфоцитов (р<0,005) (фиг. 8) и показали 2-кратное увеличение накопления гладкомышечных клеток (р<0,05) (фиг. 9). Кроме того, данные важные изменения в клеточном составе поражения были ассоциированы с достоверным 85% увеличением содержания коллагена (р<0,0005), что установили с помощью окрашивания 8ши8 красным, и со снижением общего содержания липидов.

Поэтому обработка с помощью ГБ-18ВР значительно ослабляет воспалительный процесс в пределах атеросклеротического поражения и индуцирует признаки процесса восстановления стабильности атеросклеротических бляшек. Более того, заметное уменьшение воспалительного компонента в поражениях у мышей, обработанных с помощью ГБ-18ВР, было ассоциировано с существенным снижением гибели клеток в бляшках (2,9 ± 0,9% у обработанных ГБ-18ВР мышей против 10,5 ± 3,6% в контроле, р<0,05), следовательно ограничивая рост и тромбогенность бесклеточного липидного ядра [МаПаГ, 1999].

Выводы

Применяя хорошо изученную мышиную модель атеросклероза, подобного человеческому, представленные выше результаты ясно установили несомненную и решающую роль регуляции ГБ-18 и ГБ18ВР в образовании атеросклеротической бляшки, развитии и стабильности. Несмотря на предотвращение начальной стадии образования поражения в грудной аорте, ингибирование активности ГБ-18 с помощью добавления ГБ-18ВР также сильно влияет на состав сформированного поражения в синусе аорты, индуцируя переключение на стабильный фенотип бляшки.

Клинический прогноз пациента с атеросклерозом только частично зависит от размера поражений. В настоящее время широко признано, что качество (состав бляшки) поражения может являться даже лучшим показателем развития ишемических явлений, чем ее размер. Действительно тяжелые клинические проявления атеросклероза (инфаркты сердца и мозга) являются в основном результатом окклюзии просвета сосуда тромбом, образовавшимся при взаимодействии с распадающейся атеросклеротической бляшкой (19). Патологические исследования показали, что уязвимые или нестабильные бляшки, которые склонны к распаду или распавшиеся, богаты клетками воспаления и обнаруживают существенный недостаток содержания гладкомышечных клеток и коллагена (20, 21). Более того, в подобных бляшках показано значительное увеличение апоптотической гибели клеток, приводящее к образованию высоко тромбогенного липидного ядра (13, 22). Замечательно, что все данные признаки повышения нестабильности бляшки заметно ослаблялись у мышей, обработанных ГБ-18ВР, указывая, что передача сигнала ГБ-18 является основным определяющим фактором нестабильности бляшки.

Значимость результатов, полученных на мышах ароЕ КО, для заболевания человека усиливается обнаружением авторами повышенных уровней циркулирующего ГБ-18 у пациентов с острыми коронарными синдромами и повышенной продукции ГБ-18 в нестабильных атеросклеротических бляшках сонной артерии, ответственных за инсульт. Данные находки в совокупности определили ингибиторы активности ГБ-18 как новый важный терапевтический способ предотвращения и лечения развития атеросклеротических бляшек и ограничения осложнений бляшек.

Пример 6. Повышенные уровни ГБ-18 коррелируют с рецидивирующими явлениями у пациентов с сердечной недостаточностью.

Уровни ГБ-18 определяли в сыворотке крови пациентов с помощью ЕБГ8Л со специфическими антителами против ГБ-18.

В целом обследовали 56 ишемических или неишемических пациентов с признаками сердечной недостаточности или без нее.

У пациентов, скончавшихся позже, уровни ГБ-18 составили 216,0 ± 41,5 пг/мл против 112,2 ± 12,2 пг/мл у пациентов без летального исхода (р=0,0018).

У пациентов с любым рецидивирующим случаем, таким как смерть, рекуррентная ишемия, реваскуляризация, прогрессия атеросклероза или периодически повторяющаяся госпитализация по поводу

- 18 007014 сердечной недостаточности определяли следующие уровни ΣΠ-18: 165,8 ± 23,8 против 107,7 ± 14,6 у пациентов с отсутствием любого рецидивного случая (р=0,03).

Данные результаты показывают, что уровни ΣΠ-18 достоверно повышены у пациентов, имеющих плохой клинический прогноз, подобный рецидивирующим случаям или даже смерти.

В образцах крови 16 неишемических пациентов с признаками сердечной недостаточности или без нее определяли уровень ±-18. У пациентов, которые позже скончались, уровень составил 199,0 ± 34,8 пг/мл против 95,3 ± 20,4 пг/мл у выживших пациентов (р=0,09).

Пациенты с любым рецидивирующим случаем: 146,6 ± 34,4 пг/мл ΣΠ-18 против 95,4 ± 23,9 пг/мл у пациентов с отсутствием любого рецидивирующего случая (р=0,03). Хотя различие в уровнях ΣΠ-18 не достигало статистически значимой величины вследствие небольшого количества пациентов, можно увидеть ясную тенденцию к повышению уровня ΣΕ-18.

У ишемических пациентов уровень ΣΠ-18 составил 214,2 ± 45,9 пг/мл для скончавшихся пациентов против 118,4 ± 12,8 пг/мл для выживших пациентов (р=0,007).

162,8 ± 24,7 пг/мл ΣΠ-18 определяли у пациентов, имеющих любой рецидивирующий случай, против 116,2 ± 16,0 у пациентов с отсутствием любых рецидивирующих случаев.

Ссылки

1. ±088 К. Аб1егозс1егоз1з-ап птПатшаЮгу б1зеазе. N. Епд1. Е Меб. 1999; 340:115-126.

2. νаη бег \Уа1 АС, Вескег АЕ, νаη бег Ьооз СМ, Оаз РК. 8йе оГ 1п11та1 гцрШге ог егозюп оГ 1ЬготЬозеб согопагу а1Ьегозс1его11с р1адиез 18 сЬагайепхеб Ьу ап тПаттаЮгу ргосезз йтезресйуе оГ 1Ье боттагИ р1ас.|ие тогрЬо1оду. Сагси1аРоп 1994; 89:36-44.

3. Еиз1ег V., Ваб1топ Ь., Ваб1топ ЕЕ, СЬезеЬго ЕН. ТЬе рабюдепез1з оГ согопагу аПегу б1зеазе апб Не аси1е согопагу зупбготез (1). N. Епд1. Е Меб. 1992; 326:242-250.

4. Еиз1ег V., Ваб1топ Ь., Ваб1топ ЕЕ, СЬезеЬго ЕН. ТЬе рабюдепез1з оГ согопагу аПегу б1зеазе апб Не аси1е согопагу зупбготез (2). N. Епд1. Е Меб. 1992; 326:310-318.

5. Ьее К.Т., Ь1ЬЬу Р. ТЬе иη8ίаЬ1е абкгота. Айепозс1ег. ТЬготЬ Vа8с. Вю1. 1997; 17:1859-1867.

6. К1бкег Р.М., СизЬтап М., ЕбатрГег М.Е, Тгасу К.Р., Неппекепз С.Н. [пПаттаЬоп. азртп, апб 1Ье пзк оГ сагбютазсгбаг б1зеазе т аррагепбу ЬеаЬЬу теп. N. Епд1. Е Меб. 1997; 336:973-979.

7. Ь1ЬЬу Р. Мо1еси1аг Ьазез оГ 1Ье аси1е согопагу зупбготез. Сагси1аРоп 1995; 91:2844-2850.

8. Накатит, К., Окатига, Н., №да1а, К. апб Татига, Т. (1989). Σηбесί. Σттиη. 57, 590-595.

9. УозЫтоЮ Т., Такеба, К., Тапака, Т., ОЬкизи, К., КазЬтатига, 8., Окатига, Н., Акта, 8. апб NакатзЫ, К. (1998). Е ]ттипо1. 161, 3400-3407.

10. РатеР Р., Сагка, К.Е., Воппей, Т.Р., Ьоуег, 8.К. апб 81тз, ЕЕ. (1996). Е Вю1. СЬет. 271, 39673970.

11. ПЮопа1о, ЕА., Науакауа, М., Коб1\уагГ О.М., 2апб1, Е. апб Капп, М. (1997). №т.1ге 388, 1651416517.

12. ^укк, Ό., К1т, 8.-Н., ЕапШххг С., Ке/шкот, Ь., Птаге11о, С., апб КиЬтз1ет, М. (1999). Σттипйу 10, 127-136.

13. Ма11а1 Ζ., Ниде1 В., ОЬап Е, ЬезесЬе С., Егеуззте! ЕМ., Тебдт А. 8Ьеб тетЬгапе 1тсгорагРс1ез уйЬ ргосоади1ап1 ро1еп(1а1 ш Ьитап аб1егозс1егобс р1ас.|иез. А го1е Гог арор1оз1з ш р1ас.|ие ШготЬодешсйу. С1гси1айоп 1999; 99:348-353.

14. Тпсо1 О., Ма11а1 Ζ., Неутез С., Ве1тт Е, ЬезесЬе С., Тебдт А. Ке1аРоп Веруееп Епбоб1еНа1 Се11 Арор1оз1з апб В1ооб Е1о\у Онесйоп ш Нитап Аб1егозс1егобс Р1ас.|ие. СнсгбаРоп 2000; ш ргезз.

15. Обпте1ег 8., Наепбе1ег Е, Са11е Е, Ζе^Ье^ А.М. Ох1б|/еб 1оу-бепзНу 11рорго1ет тбисез арор1оз1з оГ Ьитап епбоб1е±б се11з Ьу асбтаРоп оГ СРР32-11ке ргсИеазез. А тесЬашзРс с1ие Ю б1е 'гезропзе 1о идигу' Ьуро1Ьез1з. С1гси1аЬоп 1997; 95:1760-3.

16. СгапЛат, 8с1епсе, ^1. 185, рр. 862-864 (1974).

17. Обпте1ег 8., Наепбе1ег Е, Са11е Е, Ζе^Ье^ А.М. Ох1б|/еб 1оу-бепзНу 11рорго1ет тбисез арор1оз1з оГ Ьитап епбоб1е±б се11з Ьу асбтаРоп оГ СРР32-11ке ргсИеазез. А тесЬашзРс с1ие Ю б1е 'гезропзе 1о идигу' Ьуро1Ьез1з. С1гси1аЬоп 1997; 95:1760-3.

18. М1г Ь.М., Вигеаи М.Е., СеЬ1 Е, Капдага К., Коиу Ό., СаШаиб ЕМ., Ьебеге Р., Вгапе11ес Ό., 8сН\уаг1х В., 8сЬегтап Ό. Н1дЬ еГПс1епсу депе ШпзГег 1п1о зке1е1а1 тизс1е теб1а1еб Ьу е1ес1г1с ри1зез. Ргос. №11. Асаб. 8ск И8А 1999; 96:4262-7.

19. Ьее, К.Т. & Ь1ЬЬу, Р. ТЬе ипз1аЬ1е аЛегота. Айепозс1ег. ТЬготЬ Vа8с. Вю1. 17,1859-1867 (1997).

20. Пау1ез, М.Ь ТЬе сотрозбюп оГ согопагу-айегу р1ас|иез [ебйопа1; соттеп1|. N. Епд1. Г Меб. 336, 1312-1314 (1997).

21. ^гтат, К., Ко1обд1е, Ε.Ό., Вике, А.Р., ЕагЬ, А. & 8сЬуай/, 8.М. Ьеззопз Егот зиббеп согопагу беабг а сотргеЬепзгуе тогрЬо1одюа1 с1аззб!саРоп зсЬете Гог аб1егозс1егоРс 1езюпз. Айепозс1ег. ТЬготЬ Vа8с. Вю1. 20, 1262-1275. (2000).

22. Ко1обд1е, Ε.Ό. е1 а1. ЬосаНхаРоп оГ арорЮРс тасгорЬадез а1 б1е зйе оГ р1ас.|ие гирЮге ш зиббеп согопагу беаб1 Цп Ргосезз СйаЬоп]. Ат. I. Рабю1. 157, 1259-1268 (2000).

- 19 007014

23. К1ш, 8.Н. е! а1. 8!гис!ига1 гедшгетеп!з оГ 3ΐχ па!ига11у осситпд 1зоГогтз оГ !ке 1Б-18 Ыпдтд рго!ет ΐο тЫЪй Ш-18. Ргос. ЫаИ. Асад. 8с1. И8А 97, 1190-1195 (2000).

24. ЕШо!!, МД., Ма1П1, Κ.Ν., РеМшапп, М., Бопд-Рох, А., Скаг1ез, Р., Вц1, Н., апд ^ооду, Ι.Ν., 1994, Байсе! 344, 1125-1127.

25. Ктдк! Ό.Μ., Тппк Н., Бе I., 81еде1 8., 8кеа1у Ό., МсБопоидк М., 8са11оп Β. Мооге М.А., Уйсек I., Баддопа Р., е! а1. Сопз!гис!юп апд 1т'11а1 скагас!еп7а!юп оГ а тоизе-китап сЫтепс апй-ΤΝΕ апйЪоду. Мо1. 1ттипо1. 1993 ^ν. 30:16 1443-53.

26. Тисс1, А., Датез, Н., СЫскерогйске, К., ВоппеГоу, Ι.Υ., Бауег, 1.М., апд 2иЪ1ег, К.Н., 1992, I. 1ттипо1. 148,2778-2784.

27. Епде1тапп, Н., Ό. Еоу1ск, апд Ό. ^а11аск. 1990. Т\о !итог песгоз1з Гас!ог-Ыпдтд рго!етз рипйед Ггот китап иппе. ЕхМепсе Гог 1ттипо1о§1са1 сгозз-геас!гуйу ννίίΐι се11 зигГасе !итог песгоз1з Гас!ог гесер!огз.

I. Вю1. Скет. 265:1531-1536.

28. Мооге Ж8., Вате!! НД., Вееке Н.С., е! а1. Сшдейпез Гог сагойд епдаг!егес!оту. А ти1!1д1зс1рйпагу сопзепзиз з!а!етеп! йот !ке Ад Нос СотткГее, Атепсап Неаг! Аззос1а!юп. С1гси1а!юп 1995; 91:56679.

29. Скотс7упзк1 Р., 8асск1 Ν. 8тд1е-з!ер те!код оГ КЕА 1зо1а!юп Ъу ас1д диатдшт !кюсуапа!еркепо1-ск1огоГогт ех!гас!юп. Апа1. Вюскет. 1987; 162:156-9.

Список последовательностей <110> АррНед кеэеагсп 5узГетз АК5 ноТсНпд Ν.ν.

<120> Применение ингибиторов 1Ы8 для лечения и/или предотвращения атеросклероза <130> 443 ЫО <140> РСТ/ЕР01/04843 <141> 2001-04-30 <150> ЕР 00109606.4 <151> 2000-05-05 <160> 14 <170> Рагеп±1п уегзтоп 3.1 <210> 1 <211> 20 <212> ДНК <213> Ното зартепз <221> обратный праймер 1Ы8 <222> (1)..(20) <22 3>

<400> 1 дсдгсасГас ас1садс1аа

<210> <211> <212> <213>	2 20 ДНК Ното эартепз
<220> <221> <222> <223>	прямой праймер 1Ы8 (1)-.(20)

<400> 2 дссиа^адд! агддсгдгаа <210> 3 <211> 20 <212> ДНК <213> Ното зартепз

- 20 007014 <2 21> прямой праймер 1Ы8ВР <222> (1)..(20) <223>

<400>3 ассгдтстас сгддадгдаа

<210> <211> <212> <213>	4 20 ДНК Ното зартепз
<220> <221> <222> <223>	обратный праймер 1Ы8ВР (1)- -(20)

<400>4 дсасдаадаг аддаадгстд <210>5 <211>24 <212> ДНК <213> Ното зарзепз <220>

<2 21> обратный праймер бета-актина <222> (1)..(24) <223>

<400> 5 ддаддадсаа ГдаГсСГдаГ СГИС <210> 6 <211> 24 <212> ДНК <213> Ното зартепБ <220>

<221> прямой праймер бета-актина <222> (1)..(24) <223>

<400> 6 дсгсассагд даТда^дага гсдс

- 21 007014 <210> 7 <211> 18 <212> ДНК <213> Ното 5ар1еп5 <220>

<221> обратный праймер 211--18 <222> (1)..(18) <223>

<400> 7 садссдсГТХ адсадсса

18
<210>	8
<211>	21
<212>	ДНК	зарлепз
<213>	Ното
<220>	прямой праймер 21Ы8
<221>
<222> <223>	(1).	.(21)
<400>	8
сааддааБГд 21	тсгсссадгд с
<210>	9
<211>	19
<212>	ДНК	зартепз
<213>	Ното
<220>	обратный праймер 2 И-'
<221>
<222> <223>	(1).	.(19)
<400>	9
аассас|дс11	дадсдггсс
<210>	10
<211>	24
<212>	ДНК	зартепз
<213>	ното

- 22 007014 <220>

<2 21> прямой праймер 2 И-18ВР <222> (1)..(24) <223>

<400> 10 исссагдгсг сгдстсаггг адтс <210> 11 <211> 22 <212> ДНК <213> Ното зартепз <2 21> обратный праймер ΘΑΡϋΗ <222> (1)..(22) <223>

<400> 11 да^дддакГк ссагтдагда са <210> 12 <211> 18 <212> днк <213> Ното 5артеп5 <22О>

<2 21> прямой праймер ΘΑΡϋΗ <222> (1)..(18) <223>

<400> 12 ссассса1дд сааа11сс <210> 13 <211> 21 <212> ДНК <213> Ното зартепз <22О>

<2 21> обратный праймер интрона ΘΑΡϋΗ <222> (1)..(21) <223>

<400> 13 ссгадгссса дддсггтдаг ΐ <210> 14 <211> 22 <212> ДНК <213> Ното 5ар1*еп5 <220>

<2 21> прямой праймер интрона ΘΑΡϋΗ <222> (1)..(22) <223>

<400> 14 сГд!дсГссс ас1сс1да!1 1с

- 23 007014

Claims (2)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Применение ГБ-18 в качестве диагностического маркера плохого клинического прогноза сердечной недостаточности.
2. 2. Применение ББ-18 в качестве диагностического маркера рецидивирующих случаев после первого проявления сердечной недостаточности.