CN1841066A

CN1841066A - Il－18抑制剂在治疗和/或预防动脉粥样硬化中的应用

Info

Publication number: CN1841066A
Application number: CNA2006100092901A
Authority: CN
Inventors: Y·奇韦提克; A·特奇; Z·马勒特
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Applied Research Systems ARS Holding NV
Current assignee: Merck Serono SA; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 2000-05-05
Filing date: 2001-04-30
Publication date: 2006-10-04
Anticipated expiration: 2021-04-30
Also published as: PL365697A1; HUP0301991A3; AR035640A1; EP1278540B1; BG107218A; DE60134009D1; SK287761B6; MEP64008A; HU229375B1; MXPA02010895A; BG65881B1; HRP20020828A2; NO20025307L; AU2001267390B2; UA87658C2; AU6739001A; BR0110506A; EA005410B1; ME00554B; SK15562002A3

Abstract

本发明涉及IL－18抑制剂在制造治疗和/或预防动脉粥样硬化药物中的应用。

Description

IL-18抑制剂在治疗和/或预防动脉粥样硬化中的应用

本申请是申请日为2001年4月30日，申请号为01809054.0的发明专利申请“IL-18抑制剂在治疗和/或预防动脉粥样硬化中的应用”的分案申请。

技术领域

本发明涉及血管病领域。更具体地说，本发明涉及IL-8抑制剂在治疗和/或预防动脉粥样硬化中的应用。

背景技术

动脉粥样硬化是最常见和最主要的血管病，当然还有许多其它血管病。动脉粥样硬化主要影响大、中动脉，它的病变包括脂肪纹、溶纤维斑块(fibrolyticplaques)和并发症病变。动脉粥样硬化是动脉壁的一种慢性炎症，其特点是脂质，如胆固醇，细胞，如巨噬细胞、T淋巴细胞或平滑肌细胞，及细胞外基质(1)的逐渐积聚。大量积聚称为动脉粥样化或斑块，它们通常含有钙。脂肪组织可侵蚀动脉壁，使动脉的弹性减少，并影响血液流动。最后，在斑积聚周围形成血块，进一步阻碍血液流动，以致完全堵塞血管。动脉粥样硬化通常与高水平低密度脂蛋白(LDL)-胆固醇、Lp(a)纤维蛋白原和因子VII以及低水平高密度脂蛋白(LDL)-胆固醇有关。危险因数包括年纪大、男性、吸烟、糖尿病、肥胖、高胆固醇血症、高脂肪饮食以及有个人和家族史心脏病。器官性局部缺血，如心肌梗塞，是主要原因。

动脉粥样化是动脉最常见的病变，可进一步并发血栓栓塞。动脉粥样化斑块往往使动脉管腔变窄，从而造成局部缺血，有时还会导致血流灌注区的组织萎缩。严重后果包括由于心肌缺血而造成的心绞痛、由于局部缺血或非缺血性事件而造成的心衰竭、由于肾动脉狭窄而造成的高血压以及肾脏在生理上应答肾素分泌增加而出现的血流灌注。

动脉粥样硬化和动脉硬化有时指不同的病理状况，本发明的动脉粥样硬化定义为具体由于动脉粥样化使动脉硬化或失去弹性，而动脉硬化是指由任何一个原因所造成的动脉硬化或失去弹性。

动脉粥样硬化的并发症或后果包括冠状动脉疾病(冠状动脉粥样硬化)、由于阻塞而引致供血不足(局部缺血/心绞痛)、急性心肌梗塞(心肌梗塞、心脏病发)、短暂性缺血发作(TIA)或中风、以及对血管、肌肉或身体器官的损害。

动脉瘤是血管的永久异常扩张，也是动脉粥样硬化的一般成因。动脉粥样硬化腹主动脉瘤通常发生在年老病人身上。它们会破裂进入腹膜后腔。在动脉粥样硬化动脉瘤中，由于主动脉中层的肌肉缺血，所以往往会失去大量弹性组织并使血管中层纤维化，随后释放出巨噬细胞酶，使弹性纤维断裂。

治疗或预防动脉粥样硬化的推荐药物包括减少血脂/胆固醇。具体地说，广泛采用降低LDL-胆固醇治疗法。目前，最常用的是斯达汀斯(statins)，其是HMG CoA还原酶的特异性抑制剂。另外一些降脂剂包括诸如消胆胺(cholestyramine)、降胆宁(colestipol)、烟酸、吉非贝齐(gemfibrozil)、丙丁酚、美降脂(lovastatin)等药物。

另一种方法是在已生成的粥样硬化病变上使血栓形成的危险降至最小。阿斯匹林可用于减少血块形成的危险性，似乎是一种介导血小板凝集的血栓素A2的特异性抑制剂或抗凝剂。

经皮”气囊血管成形术”用顶端气囊导管使斑块变平，并增加流过阻塞的血液。这种技术与用于打开心脏动脉的技术相似，但该技术可应用在身体的其它许多动脉中。冠状动脉狭窄可用缝合在近端主动脉的部分隐静脉的静脉或通过切开胸壁的***内动脉，以及将其远程与心脏前面的动脉吻合来进行分流。

在一些情况(例如：颈动脉的动脉内膜切除)中建议用手术除去积聚(动脉内膜切除术)。

然而，主要还是治疗或控制危险因数，如保持低脂、低胆固醇、和低盐饮食，并按专家建议注意健康，治疗和控制高血压、糖尿病及其它疾病，降低体重和戒烟，以及进行正常锻炼以改善心脏机能和增强循环。

动脉粥样硬化的不同阶段都有炎症过程(1)。由包括低切应力、修饰脂蛋白和发炎前细胞因子等因素引起内皮激活被认为是动脉粥样硬化的第一步，並由炎症控制(1)。最近许多研究均表明，血管和炎症细胞之间的相互作用在动脉粥样化形成中起关键作用(1)。特别是，抑制限定的发炎前通道可减少动脉粥样硬化的产生(1)。

发炎在动脉粥样硬化斑块破裂和血栓形成中也起主导作用(2-5)，从而导致急性缺血性综合征及其相关死亡出现(6)。事实上，动脉粥样硬化的严重临床表现包括心脏、脑及其它动脉粥样硬化影响的器官出现梗塞，主要是由于在破裂动脉粥样硬化斑块的接触面上形成血栓阻塞血管管腔(3，4)。病理研究已经显示，易损或不稳定斑块，即易破裂或已破裂的斑块，与不易破裂的稳定斑块相比在细胞和基质组成上明显不同(7)。炎症细胞(巨噬细胞和T淋巴细胞)含有大量易损斑块，这些斑块包含血栓脂质核心，其特点是薄纤维帽失去大量细胞外基质(7)。

减少由发炎前细胞因子IFNγ介导的胶原合成，以及增加降解金属蛋白酶并衍生自巨噬细胞的基质的活性都可使纤维帽变薄和变脆(7)。易脆纤维帽破裂使高血栓脂质核心受到循环血液的作用，而导致阻塞性血栓形成(1，7)。所以，在给定动脉粥样硬化病变内炎症细胞的密度被认为是其不稳定性的良好指示剂。

动脉粥样硬化病人的临床预后仅部分取决于病变的大小(19，20)。现在普遍认为病变的质量(斑块的组成)而非大小能更好预示缺血事件的出现。事实上，动脉粥样硬化的严重临床表现(心脏和脑梗塞)主要是由于在破裂动脉粥样硬化斑块的接触面上形成血栓阻塞血管管腔(19)。病理研究已经证实，易损或不稳定斑块，即易破裂或已破裂的斑块，主要存在于炎症细胞中，并呈现大量失去平滑肌细胞和胶原量(20，21)。另外，这样一些斑块使凋亡细胞的死亡率大幅提高，从而形成高血栓脂质核心(13，22)。

发炎前细胞因子参与了炎症过程。细胞因子白介素18(IL-18)最初被称为干扰素-γ(IFN-γ)诱导因子(8)。它是T淋巴细胞辅助细胞1(Th1)应答发展中产生的早期信号。IL-18与IL-12、IL-2、抗原、有丝***原、以及一些潜在因子一起作用诱导IFN-γ的产生。IL-18也可增加GM-CSF及IL-2的产生，增强抗CD3诱导的T细胞的增殖能力及增加自然杀伤细胞的Fas介导的杀伤力。成熟的IL-18由L-1β转化酶(ICE，caspase-1)自其前体产生。IL-18受体由至少两个在配体结合中相互协作的成分组成。在经小鼠IL-12刺激的T细胞中发现对IL-18的高和低亲和力结合位(9)，这可假定为一种多链受体复合物。到目前为止，已识别了两种受体亚基，均属于IL-1受体族(10)。IL-18的信号转导包括激活NF-κB(11)。

最近，从人尿液分离出对IL-18有高亲和力的可溶性蛋白质，并克隆了人和小鼠cDNA以及人基因(12；W099/09063)。该蛋白被命名为IL-18结合蛋白(IL-18BP)。

IL-18BP不是已知IL-18受体之一的胞外区域，而是一种分泌性天然循环蛋白。它属于分泌性蛋白的一个新家族，该家族还包括几种痘病毒编码蛋白质(12)。IL-18BP在脾脏中按组成表达(12)。尿液以及重组体IL-18特异性地与具有高亲和力的IL-18结合，并调节IL-18的生物亲合力。

IL-18BP基因位于人染色体11q13上，在8.3Kb的基因组序列中没发现编码跨膜区的外显子。在人身上发现IL-18BP的四种拼接变体或异构体，命名为IL-18BPa，b，c和d，它们均共享相同的N末端，但C末端不同(12)。

在各种cDNA库中，发现因mRNA拼接产生4种人和2种小鼠IL-18BP异构体，其已被表达、纯化并对其结合与中和IL-18生物活性的能力进行了评估(23)。人IL-BP异构体a(IL-18BPa)对IL-18显示出最大的亲和力，结合快，离解慢，离解常数(K(d))为399pM。IL-18BPc除29个C末端氨基酸外，还享有IL-18BPa的Ig区。IL-18BPc的K(d)小10倍(2.94nM)。然而在超过2摩尔浓度时，IL-18BPa和IL-18BPc可中和超过95％的IL-18。IL-18BPb和IL-18BPd异构体缺乏完整的Ig区，并缺乏结合或中和IL-18的能力。小鼠IL-18BPc和IL-18BPd异构体具有相同的Ig区，在超过2摩尔浓度时也可中和超过95％的小鼠IL-18。而具有与人IL-18BPa共同C末端型主的小鼠IL-18BPd也能中和人IL-18。分子模型识别到IL-18BP的Ig区中有一个大的静电和疏水性混合结合位，这可解释其与配体的高亲和力结合(23)。

发明内容

本发明基于这样的研究结果：IL-18抑制剂对动脉粥样硬化的小鼠模型中斑块的产生、斑块的发展及斑块的稳定性具有明确的有益效果。抑制IL-18不仅可预防胸主动脉病变的形成，而且诱导已生成的动脉粥样硬化斑转成稳定斑表型。

因此，本发明涉及用IL-18抑制剂来制造预防和/或治疗动脉粥样硬化的药物。本发明还涉及治疗和/或预防动脉粥样硬化基因疗法的治疗方法。

附图说明

图1所示为人脐静脉内皮细胞分别单独用氧化脂蛋白培育，或用氧化脂蛋白和IL-18抗体或IL-18BP一起培育后的存活率的矩形图。

图2所示为在动脉粥样硬化动脉与受控动脉中的蛋白质提取物上进行的Western Blot的比较。在Western Blot中，使用对IL-18BP(hIL-18BP)、IL-18受体α亚基(hIL18Rα)、IL-18(IL-18BP)及凋亡蛋白酶(Caspase)-1(Caspase-1p10)的抗体。

图3所示为溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶，其显示动脉粥样硬化斑细胞中IL-18及IL-18BP mDNA的RT-PCT分析结果。

图4所示为动脉粥样硬化斑中IL-18及IL-18BP与有症状及无症状斑块的人α-肌动蛋白(调控)表达相比较的有代表性的RT-PCT结果。

图5所示为用于小鼠肌肉内电转移的表达载体的分布图。

图6所示为动脉粥样硬化动脉内脂质染色面积的矩形图。定量计算机辅助图像分析脂质积聚。数据以平均值±标准差表示(空质体n＝19，IL-18BP质体n＝14)。^****表示P＜0.0001。

图7所示为以IL-18BP治疗后与受控(空质体)的主动脉窦病变面积的比较的矩形图。定量计算机辅助图像分析病变区域。数据以平均值±标准差表示(空质体n＝19，IL-18BP质体n＝14)。^**表示P＜0.0001。

图8所示为IL-18BP治疗对病变炎症细胞量的影响。用定量计算机辅助图像分析测定主动脉窦病变受控下(巨噬细胞染色n＝12，T淋巴细胞染色n＝15)或以IL-18BP治疗的小鼠(巨噬细胞n＝13，T淋巴细胞n＝12)巨噬细胞阳性面积(黑色方块)的百分比以及每平方毫米浸润T淋巴细胞的数量(灰色方块)。数据以平均值±标准差表示。^***表示P＜0.0001。

图9所示为IL-18BP治疗对病变平滑肌细胞及胶原含量的影响。用定量计算机辅助图像分析测定主动脉窦病变受控下(平滑肌细胞n＝6，胶原n＝11)和以IL-18BP治疗的小鼠(平滑肌细胞n＝6，胶原n＝13)平滑肌细胞阳性面积(黑色方块)以及胶原积聚(灰色方块)的百分比。数据以平均值±标准差表示。^*表示P＜0.05；^**表示P＜0.01。

具体实施方式

本发明基于这样的研究结果：急性冠状动脉综合征病人的循环IL-18水平会上升及引致中风的不稳定颈动脉粥样硬化斑使IL-18的产生会增加。另外，业已证明，IL-18BP编码的表达质体DNA体内电转移可预防胸主动脉中脂肪纹产生，并减慢非常确实的动脉粥样硬化小鼠模型中主动脉窦晚期动脉粥样硬化斑的发展。更重要的是，以IL-18质体转染可诱导斑组成发生重大变化(巨噬细胞、T细胞、细胞死亡及脂质含量减少，而平滑肌细胞及胶原含量增加)，从而形成稳定的斑块表型。这些结果第一次显示IL-18抑制剂在减少斑块的产生/发展及促进斑块的稳定起着重要作用。

因此，本发明涉及用IL-18抑制剂来制造治疗和/或预防动脉粥样硬化的药物。

本发明上下文中的术语”预防”，不仅指完全预防某一种影响，也指在疾病发作前或发作早期任何部分或基本上预防、减弱、降低、减退或消除这种影响。

本发明上下文中的术语”治疗”，指任何对疾病的进展有益的效果，包括在疾病发作后减弱、降低、减退或消除病理的发展。

本发明上下文中的术语“IL-18抑制剂”，指能以减弱、降低或部分地、大量地或完全地防止或阻断IL-18产生和/或作用的方式来调节IL-18的产生和/或作用的任何分子。

一种生产的抑制剂可以是任何一种对IL-18合成、加工或成熟有负面影响的分子。本发明考虑的抑制剂可以是，例如，白介素IL-18基因表达的抑制基因、降低或阻止IL-18mRNA转录或导致该mRNA降解的反义mRNA、损害正确折叠或部分或基本上阻止IL-18成熟或分泌的蛋白质、一旦合成即能降解IL-18的蛋白酶等。生产的抑制剂可以是，例如，阻止IL-18成熟的Caspase-1抑制剂或ICE抑制剂。

IL-18作用抑制剂可以是，例如，IL-18拮抗剂。拮抗剂可以以足够亲和力和特异性结合或隔离IL-18分子本身而部分或基本上中和负责IL-18与其配体结合的IL-18或IL-18结合位(例如，其受体)。拮抗剂也可抑制在IL-18/受体结合时细胞中所激活的IL-18信号通道。

IL-18作用抑制剂也可以是可溶性IL-18受体或仿真受体的分子，或阻断IL-18受体的物质，或IL-18抗体，如单克隆抗体，或阻止IL-18与其靶结合的其它物质或分子，从而减弱或阻止由IL-18介导的细胞内外反应的触发。

动脉粥样硬化也称为动脉硬化。本发明上下文中的术语”动脉粥样硬化”包括所有通常描述动脉粥样硬化的动脉表现出的疾病或病况，其中脂肪物质积聚在血管壁，最后导致血液流动狭窄和受损，并形成血栓造成破裂和/或侵蚀。

根据本发明，动脉粥样硬化包括由于动脉粥样化(动脉粥样硬化)和其它原因(动脉硬化)而使动脉硬化和失去弹性。本文使用的术语”动脉粥样硬化”包括动脉粥样硬化的病理状况及动脉粥样硬化的并发症或后遗症，在上文”背景技术”中已有详细叙述。

动脉粥样硬化发展包括动脉粥样硬化斑的形成及其发展至越来越不稳定形式。因此，本发明也涉及用IL-18抑制剂来制造减弱或预防动脉粥样硬化发展的药物。

在动脉粥样硬化斑上形成血栓导致血管阻塞是心脏和脑梗塞的主要原因，是动脉粥样硬化最严重的后遗症之一。因此，本发明也涉及用IL-18抑制剂来制造治疗和/或预防动脉粥样硬化斑的血栓形成的药物。

斑稳定性影响动脉粥样硬化斑发展成容易引发血栓形成的有害或易损斑。因此，本发明进一步涉及用IL-18抑制剂来制造预防和/或治疗动脉粥样硬化斑不稳定的药物。

不稳定斑容易破裂，而斑破裂又会导致血栓形成。因此，本发明进一步涉及用IL-18抑制剂来制造预防动脉粥样硬化斑侵蚀或破裂的药物。

斑不稳定性和血栓形成可由细胞凋亡引起，使前凝血活剂的活性提高，这可能是导致破裂或侵蚀的动脉粥样硬化斑形成血栓及造成栓塞的主要原因(13，14)。现已证明，氧化脂蛋白(oxLDL)诱导培养基中的巨噬细胞及内皮细胞凋亡(15)。如以下实施例所示那样，业已发现，IL-18抑制剂能显著减少由氧化脂蛋白诱导的细胞凋亡。

根据本发明，意外发现，与没有返回医院的病人相比，在出现复发事件，如死亡、复发性局部缺血、血管反复闭塞、动脉粥样硬化发展或因心衰竭经常入院的病人中，血液中的IL-18水平显著上升。与生存下来的病人相比，在后来死亡的病人体内这种IL-18水平上升尤为明显。局部缺血病人和非缺血病人的血液循环都有高水平IL-18。

因此，本发明也涉及用IL-18抑制剂来制造治疗和/或预防心衰竭复发的药物。复发事件可以是心衰竭后的任何事件，如死亡、复发性局部缺血、血管反复闭塞、动脉粥样硬化发展或因心衰竭经常入院。

在本发明一优选实施例中，心衰竭是局部缺血，即由于心肌缺血而引起心衰竭。

在另一个优选实施例中，心衰竭是非局部缺血，如由于***性高血压、心血管病、或先回复至正常，然后又发生充血性心力衰竭的肺病。

在本发明一优选实施例中，IL-18抑制剂选自由以下组成的组：ICE抑制剂、抗IL-18抗体、抗任何一个IL-18受体亚基的抗体、IL-18受体信号通道抑制剂、能与IL-18竞争和阻断IL-18受体的拮抗剂、以及IL-18结合蛋白质、其具有相同活性的异构体、突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性片段或循环变换衍生物。

本文所用的术语“突变蛋白”指IL-18BP的同类物，或病毒性IL-18BP的同类物，其中天然IL-18BP或病毒性IL-18BP的一个或多个氨基酸残基被不同氨基酸残基所取代，或缺失，或IL-18BP、病毒性IL-18BP的天然序列中加入了一个或多个氨基酸残基，但所产生的产物的活性与野生型IL-18BP或病毒性IL-18BP相比无显著改变。这些突变型蛋白由已知的合成和/或定位点诱变技术，或任何适合的其它已知技术制备。

任何这一种突变蛋白最好具有一IL-18BP充分复制、或病毒性IL-18BP充分复制的氨基酸序列，从而具有与IL-18BP基本上相似的活性。IL-18BP的活性之一是其能结合IL-18。只要该突变蛋白对IL-18具有很大的结合活性。它就可用于纯化IL-18，如借助亲和力色谱法，从而认为其具有与IL-18BP基本上相似的活性。因此，可借助常规实验方法来确定某个给定突变蛋白是否具有与IL-18BP基本相同的活性，其方法包括对这样一种突变蛋白进行诸如简单的夹心竞争试验(simple sandwich competition assay)来确定它是否能与适当标记的IL-18结合，如放射免疫试验或酶联免疫吸附试验(ELISA)。

本发明可用的IL-18BP多肽突变蛋白或病毒性IL-18BP突变蛋白，或其编码核酸，包括一组有限的基本上与取代肽或多肽相应的序列，本领域普通技术人员可根据本文所述的教导和指引用常规方法获得，而无须进行过多实验。

本发明突变蛋白中的优选变化被称为“保守性”取代。IL-18BP多肽或蛋白或病毒性IL-18BP的保守性氨基酸取代可包括一组内同义氨基酸，其具有足够相似的生理化学特性，该组原子之间的取代将保留该分子的生物功能(16)。很明显，在上述序列中不改变其功能还可进行氨基酸的***和缺失，特别是如果这种***或缺失只涉及少数氨基酸时，如30个以下，最好为10个以下，而且不会移去或取代对功能性构造起关键作用的氨基酸，如半胱氨酸残基。这类缺失和/或***所产生的蛋白质和突变蛋白属于本发明范围。

优选同义氨基酸组是表1列出的那些组；更好的同义氨基酸组是表2列出的那些组；最好的同义氨基酸组是表3列出的那些组。

表1 优选同义氨基酸组

氨基酸同义组

Ser Ser，Thr，Gly，Asn

Arg Arg，Gln，Lys，Glu，His

Leu Ile，Phe，Tyr，Met，Val，Leu

Pro Gly，Ala，Thr，Pro

Thr Pro，Ser，Ala，Gly，His，Gln，Thr

Ala Gly，Thr，Pro，Ala

Val Met，Tyr，Phe，Ile，Leu，Val

Gly Ala，Thr，Pro，Ser，Gly

Ile Met，Tyr，Phe，Val，Leu，Ile

Phe Trp，Met，Tyr，Ile，Val，Leu，Phe

Tyr Trp，Met，Phe，Ile，Val，Leu，Tyr

Cys Ser，Thr，Cys

His Glu，Lys，Gln，Thr，Arg，His

Gln Glu，Lys，Asn，His，Thr，Arg，Gln

Asn Gln，Asp，Ser，Asn

Lys Glu，Gln，His，Arg，Lys

Asp Glu，Asn，Asp

Glu Asp，Lys，Asn，Gln，His，Arg，Glu

Met Phe，Ile，Val，Leu，Met

Trp Trp

表2 更好的同义氨基酸组

氨基酸同义组

Ser Ser

Arg His，Lys，Arg

Leu Leu，Ile，Phe，Met

Pro Ala，Pro

Thr Thr

Ala Pro，Ala

Val Val，Met，Ile

Gly Gly

Ile Ile，Met，Phe，Val，Leu

Phe Met，Tyr，Ile，Leu，Phe

Tyr Phe，Tyr

Cys Cys，Ser

His His，Gln，Arg

Gln Glu，Gln，His

Asn Asp，Asn

Lys Lys，Arg

Asp Asp，Asn

Glu Glu，Gln

Met Met，Phe，Ile，Val，Leu

Trp Trp

表3 最好的同义氨基酸组

氨基酸同义组

Ser Ser

Arg Arg

Leu Leu，Ile，Met

Pro Pro

Thr Thr

Ala Ala

Val Val

Gly Gly

Ile Ile，Met，Leu

Phe Phe

Tyr Tyr

Cys Cys，Ser

His His

Gln Gln

Asn Asn

Lys Lys

Asp Asp

Glu Glu

Met Met，Ile，Leu

Trp Met

在蛋白质中产生氨基酸取代的实施例可用来获得本发明中所用的IL-18BP多肽或蛋白质的突变蛋白，或病毒性IL-18BP的突变蛋白，其包括任何已知的方法步骤，如Mark等人的美国专利4,959,314、4,588,585和4,737,462；Koths等人的5,116,943；Namen等人的4,965,195；Chong等人的4,879,111和Lee等人的5,017,691专利中提出的方法，以及美国专利No.4,904,584(Shaw等人)中提出的赖氨酸取代蛋白质。

术语“融合蛋白”指一多肽包含IL-18BP或病毒性IL-18BP或其突变蛋白与另一蛋白质，如在体液中停留时间延长的蛋白质，融合。故IL-18BP或病毒性IL-18BP可与另一蛋白质、多肽等，如免疫球蛋白或其片段，融合。

本文使用的“功能性衍生物”，包括IL-18BP衍生物或病毒性IL-18BP及其突变蛋白和融合蛋白，它们可用本领域已知方法从残基或N端或C端基团侧链存在的功能性基团制备。只要它们仍然在药学上可接受，即它们没有破坏与IL-18BP或病毒性IL-18BP活性基本上相似的蛋白质活性，并且不会使含它们的组合物具有毒性，均包括在本发明中。这些衍生物例如可以包括聚乙二醇侧链，其可遮蔽抗原位并延长IL-18BP或病毒性IL-18BP在体液中的停留。其它衍生物包括羧基脂肪酯，羧基与氨或伯胺或仲胺反应产生的酰胺、氨基酸残基的游离氨基与酰基部分分子(如烷酰基或碳环芳酰基)形成的N-酰基衍生物、或游离羟基(如丝氨酰或苏氨酰残基的游离羟基)与酰基部分分子形成的O-酰基衍生物。

本发明的IL-18BP或病毒性IL-18BP、突变蛋白和融合蛋白的“活性部分”包括单独蛋白分子多肽链的片段或前体，或蛋白分子与相关分子或与其相连的残基，如糖或磷酸根残基一起，或蛋白分子或糖残基自身的聚集物，只要所述部分具有与IL-18BP基本上相似的活性。

在本发明的另一优选实施例中，IL-18抑制剂是IL-18抗体。抗IL-18抗体可以是多克隆或单克隆、嵌合、人化或甚至完全人化的抗体。重组抗体及其片段的特征是在体内能与IL-18高亲和力结合，而且毒性低。可用于本发明的抗体应具有的特征是对病人进行足够时间的治疗，它们能良好至优异地减退或缓解病情或与病情相关的任何一种症状或一组症状，并且毒性低。

通过以IL-18免疫，易在兔、山羊或小鼠等动物中产生中和抗体。免疫小鼠特别适用于提供B细胞来源以制备杂交瘤，进而培养杂交瘤产生大量抗IL-18单克隆抗体。

嵌合抗体是具有来自不同动物物种的二个或多个节段或部分的免疫球蛋白分子。通常嵌合抗体的可变区来自非人哺乳动物抗体，如鼠单克隆抗体，而该免疫球蛋白的稳定区来自人免疫球蛋白分子。这两个区及其组合最好如常规方法测定那样有低免疫原性(24)。人化抗体是用基因工程技术构建的免疫球蛋白分子，其中用人对比物置换鼠稳定区，而保留鼠抗原结合区。所产生的鼠-人嵌合抗体更好地降低了免疫原性，并改善了在人体中的药物动力学(25)。

因此在另一优选实施例中，IL-18抗体是人化IL-18抗体，例如，欧洲专利申请EP0974600叙述了人化抗IL-18抗体的优选例子。

在另一优选实施例中，IL-18抗体是全人抗体。在WO00/76310，WO99/53049，US6,162,963或AU5336100中详细叙述了产生人抗体的技术。全人抗体优选是转基因动物中产生的重组抗体，例如异种小鼠，含有所有或部分功能的人Ig基因座。

在本发明的一个更优选实施例中，IL-18抑制剂是IL-18BP，或其异构体、突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性部分或循环变换衍生物。这些异构体、突变蛋白、融合蛋白或功能性衍生物保留了IL-18BP的生物活性，特别是结合IL-18的活性，优选具有至少一基本上类似于IL-18BP的活性。理想的话，这些蛋白质具有的生物活性甚至比未改性的IL-18BP更高。优选活性部分的活性比IL-18BP更好或更具优异性，如稳定性更好，毒性或免疫原性更低，或它们更易大量生产，或更易提纯。

IL-18BP及其拼接变体/异构体的序列可从WO99/09063或(12)以及(23)中获得。

可将IL-18BP的功能性衍生物与聚合物结合以改进该蛋白质的性能，如稳定性、半衰期、生物利用性、人体耐受性、或免疫原性。为达到此目的，可将IL-18BP与聚乙二醇(PEG)联接。例如，按WO92/13095所述已知方法进行聚乙二醇化。

因此，本发明的一优选实施例中，IL-18BP是聚乙二醇化的。

在本发明另一优选实施例中，IL-18抑制剂是融合蛋白，包含IL-18结合蛋白的全部或一部分，其与免疫球蛋白全部或一部分融合。本领域技术人员知道所产生的融合蛋白保留了IL-18BP的生物活性，特别是结合IL-18的活性。这种融合可以是直接的，或通过一个短交联肽相融合，长度短至1-3个氨基酸残基或较长，如13个氨基酸残基的长度。所述交联剂可以是E-F-M(Glu-Phe-Met)序列；或13个氨基酸的交联剂序列的三肽，其含位于IL-18BP序列和免疫球蛋白序列之间的Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met。所产生的融合蛋白具有改进的性能，如在体液的停留期(半衰期)延长，比活性提高，表达水平增加或有利于融合蛋白的纯化。

在一优选实施例中，IL-18BP融合于Ig分子的稳定区。优选融合于重链区，例如，人IgG1的CH2和CH3区。产生的特定融合蛋白包括WP99/09063的实施例11所述的IL-18BP和免疫球蛋白的一部分。Ig分子的其它异构体也适合用来产生本发明的融合蛋白，例如，异构体IgG₂或IgG₄，或其它Ig类，如IgM或IgA。融合蛋白可以是单体或多聚体，异质或同质多聚体。

干扰素主要因其对病毒复制和细胞增殖有抑制作用而为人所认知。例如，干扰素-γ在促进免疫和炎症应答中起重要作用。据说干扰素β(IFN-β，I型干扰素)有抗炎症作用。

本发明还涉及IL-18抑制剂和干扰素的组合在制造治疗动脉粥样硬化的药物的应用。

也可将干扰素与聚合物结合以改进该蛋白质的稳定性，例如，WO99/55377叙述了干扰素β和多元醇聚乙二醇(PEG)之间的共轭物。

在本发明另一优选实施例中，干扰素是干扰素-β(IFN-β)，更优选是IFN-β1a。

IL-18产生和/或作用的抑制剂最好与干扰素同时、先后或分开使用。

在本发明另一实施例中，IL-18抑制剂与TNF拮抗剂结合使用。TNF拮抗剂以几种方式发挥其活性。首先，拮抗剂能以足够的亲和力和特异性结合或封蔽TNF分子本身，以致部分或基本上中和了TNF表位或负责与TNF受体结合的表位(以下称为”遮蔽性拮抗剂”)。例如，一种遮蔽性拮抗剂可以是抗TNF的抗体。

另一方面，TNF拮抗剂可抑制TNF结合后由细胞表面受体激活的TNF信号通道(以下称为”信号拮抗剂”)。这二组拮抗剂可单独或一起，与IL-18抑制剂结合使用来治疗动脉粥样硬化。

TNF拮抗剂易于识别并通过常规方法筛选评价，即在体外敏感细胞系，如TNF能引起其增殖和分泌免疫球蛋白的人B细胞中用候选拮抗剂对天然TNF活性的影响来评价。该试验包括不同稀释度，例如，试验所用TNF摩尔量的0.1倍-100倍，的候选拮抗剂的TNF制剂，以及无TNF或只有拮抗剂的调控(26)。

封蔽拮抗剂是本发明优选使用的TNF拮抗剂。在封蔽拮抗剂中，优选使用那些以高亲和力结合TNF并具有低免疫原性的多肽。特别优选使用可溶性TNF受体分子和抗TNF的中和抗体。例如，可溶性TNF-RI和TNF-RII可用于本发明。这些平截形受体是本发明更优选的拮抗剂，其包括受体的细胞外区或其功能部分，例如，EP914431叙述了平截的可溶性TNF-I型和TNF-II型受体。

平截形的TNF受体是可溶的，在尿和血清中检测到30kDa和40kDa的TNF抑制性结合蛋白，这两种TNF抑制性结合蛋白分别称为TBPI和TBPII(27)。根据本发明，IL-18抑制剂与TNF拮抗剂和/或干扰素可同时、先后或分开使用。

根据本发明，优选TNF拮抗剂是TBPI和TBPII，与IL-18抑制剂结合使用。该受体分子的衍生物、片段、区段和生物活性部分，按功能装配成本发明用的受体分子。受体分子的这种生物活性等价物或衍生物，指多肽部分或编码该受体分子的序列部分，其大小足够并能以亲和力结合TNF，以致抑制或封闭与膜结合的TNF受体的相互作用。

本发明另一优选实施例中，可溶性人TNF-RI(TBPI)是本发明用的TNF拮抗剂。欧洲专利EP308378、EP398327和EP433900叙述了天然和重组的可溶性TNF受体分子及其制备方法。

IL-18抑制剂可与TNF抑制剂同时、先后或分开使用。较好是使IL-18抗体或抗血清与具有TNF抑制活性的可溶性TNF受体结合使用。

在本发明另一优选实施例中，这种药物还包括COX-抑制剂，优选COX-2抑制剂。COX抑制剂在本领域已公知。例如，WO01/00229叙述了一些具体COX-2抑制剂。

血栓素(thromboxane)，特别是血栓素A2抑制剂，目前广泛用于治疗动脉粥样硬化。所以，在本发明的另一个优选实施例中，这种药物还包括血栓素抑制剂，特别是血栓素A2抑制剂，可同时、先后或分开使用。根据本发明，特别优选以阿斯匹林和IL-18抑制剂配合使用。

导致动脉粥样硬化的其中一个原因是血液中脂质浓度过高。所以，在本发明的另一个优选实施例中，这种药物还包括降脂剂，可同时、先后或分开使用。本技术领域已知的降脂剂包括消胆胺、降胆宁、烟酸、吉非贝齐、丙丁酚等药物。特别优选是HMG CoA还原酶抑制剂，更好是称为statins的还原酶抑制剂。本领域已知的statins还原酶抑制剂有很多，如Simvastain或lovastatin。

为了更好预防和/或治疗动脉粥样硬化，本发明的一个优选实施例涉及以低脂和/或低胆固醇和/或低盐饮食配合使用IL-18抑制剂。

在本发明一优选实施例中，IL-18抑制剂用量大约为0.0001-10mg/kg体重，或大约0.01-5mg/kg体重，或约0.1-3mg/kg体重，或约1-2mg/kg体重。在另一优选实施例中，IL-18抑制剂用量为约0.1-1000μg/kg体重，或约1-100μg/kg体重，或约10-50μg/kg体重。

本发明还涉及利用含有IL-18抑制剂编码序列的表达载体来制备预防和/或治疗动脉粥样硬化的药物。即采用基因疗法来治疗和/或预防疾病。优点是IL-18抑制剂是原位表达的，从而有效地直接阻断受疾病影响的组织或细胞中的IL-18。

如以下实施例所解释那样，已经表明，在电转移含有IL-18BP编码序列的表达载体后，疾病小鼠模型可显示IL-18BP的有效表达。

所以，在一优选实施例中，表达载体通过电转移，最好在肌肉内注射施用。

本发明还考虑在正常不表达IL-18抑制剂或表达抑制剂的量不充分的细胞中，使用能诱导和/或增强内源性产生IL-18抑制剂的载体。该载体可包含在所需表达IL-18抑制剂的细胞中起作用的调控序列。例如，这类调控序列可以是启动子或增强子。然后，可通过同源重组将该调控序列导入基因组的正确基因座中，使调控序列与基因作可操作性相连，所需要的表达即被诱导或被增强。该技术通常称为”内源性基因激活”(EGA)，在WO91/09955中有所叙述。

本领域技术人员懂得，也可用同一技术降低IL-18表达，即导入一个负调节组件，如沉默组件，到IL-18的基因座中，从而导致下调或防止IL-18表达。本领域技术人员懂得，IL-18表达的这种下调或沉默与使用IL-18抑制剂的效果相同，用于预防和/或治疗疾病。

本发明还涉及使用经过基因修饰，以产生IL-18抑制剂的细胞来制造治疗和/或预防动脉粥样硬化的药物。

本发明还涉及特别用于预防和/或治疗动脉粥样硬化的药物组合物，其包括有效治疗量的IL-18抑制剂和有效治疗量的干扰素。作为IL-18抑制剂，该组合物可包括caspase-1抑制剂、抗IL-18抗体、抗所有IL-18受体亚基的抗体、IL-18信号通道的抑制剂、与IL-18竞争并阻断IL-18受体的IL-18拮抗剂、以及具有相同活性的IL-18结合蛋白、异构体、突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性部分或其循环变换衍生物。

该药物组合物的优选活性成分是上述IL-18BP及其异构体、突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性部分或循环变换衍生物。

该药物组合物的干扰素优选IFN-β。

在另一优选实施例中，该药物组合物包括有效治疗量的IL-18抑制剂，可选择是一干扰素和TNF拮抗剂。该TNF拮抗剂可以是中和TNF活性的抗体，或可溶性平截的TNF受体片段，也称为TBPI和TBPII。本发明的药物组合物还可包括一种或多种COX抑制剂，优选COX-2抑制剂。本发明的药物组合物还可包括血栓素抑制剂，如阿斯匹林，和/或降脂剂，如statins。

定义“药学上可接受的”指包含不会干扰活性成分的生物活性效果，并对施药的宿主无毒性的任何载体。例如，为了在外肠胃道施药，可将这些活性蛋白以注射用剂量单位形式配制在载体中，如盐水，葡萄糖液，血清白蛋白和林格(Ringer)液。

本发明药物组合物的活性成分可以以各种方法给个体施用。施药途径包括皮内、透皮(如缓释制剂)、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、口服、硬膜外、局部和鼻内等途径。也可采用其它有效治疗途径施药，例如通过上皮或内皮组织吸收或通过基因治疗将编码活性药物的DNA分子施加给病人(如通过载体)，导致该活性药物在体内表达和分泌。此外，可将本发明的蛋白质与生物活性药物的其它组分，如药学上可接受的表面活性剂、赋形剂、载体、稀释和载体剂等，一起施用。

对于外肠胃道(如静脉内、皮下、肌肉内)施药，可将活性蛋白质配制成溶液、悬浮液、乳液或与药学上可接受的肠胃道外载体(如水、盐水、葡萄糖液)以及能维持等渗性(如甘露糖醇)或化学稳定性(如防腐剂和缓冲液)的添加剂一起制成冻干粉末。以常规技术给制剂灭菌。

本发明的活性蛋白质也可用共轭方法增加分子在人体内的半衰期而改善其生物利用性。例如，如PCT专利申请WO 92/13095所述那样，使分子与聚乙二醇交联。

活性蛋白的有效治疗量是很多变量的函数，包括拮抗剂类型、拮抗剂对IL-18的亲和力、拮抗剂显示的残留毒性、施用途径、病人的临床状态(包括维持内源性IL-18活性的非毒性水平是否合乎需要)。

“有效治疗量”是施用时IL-18抑制剂抑制IL-18生物活性的量。给个体施加单剂或多剂的剂量取决于各种因素，包括IL-18抑制剂的药物动力学性能、施药途径、病人的病情和特征(性别、年龄、体重、健康状况和身型大小)、症状程度、并行治疗、治疗频度和所要求的效果。本领域技术人员都掌握了调整和操作已确定的剂量范围以及在体内外测定个体IL-18抑制的方法。

按照本发明，IL-18抑制剂的用量约为0.0001-10mg/kg体重，或约0.01-5mg/kg体重，或约0.01-5mg/kg体重，或约0.1-3mg/kg体重，或约1-2mg/kg体重。更优选的IL-18抑制剂用量是约0.1-1000μg/kg体重，或约1-100μ/kg体重或10-50μ/kg体重。

本发明优选的施药途径是皮下途径，本发明更优选的是肌肉内施药。

在另一优选实施例中，IL-18抑制剂是每天或每隔一天施用。

每日药量通常分成几剂或以缓释形式施用，以有效获得所需结果。第二次或随后施药可以与首次或原先施加给该个体的相同剂量、少于或多于此剂量进行。可在疾病发作时或发作前进行第二次或随后施药。

按照本发明，IL-18抑制剂可以以有效量治疗先于、同时或依次与其它治疗方案或药物(如多种药物方案)预防性或治疗性地施加给个体。活性药物可在相同或不同的组合物中与其它治疗剂同时施用。

本发明还涉及一种治疗和/或预防动脉粥样硬化的方法，其包括给有需要的宿主施加一有效抑制量的IL-18抑制剂。

本发明还涉及一种治疗和/或预防动脉粥样硬化的方法，其包括给有需要的宿主施加一包含IL-18抑制剂编码序列表达载体。

在本发明的一优选实施例中，表达载体***地施加，更优选为通过肌肉内注射施加。

本发明进一步涉及使用IL-18作为心衰竭严重临床预后的诊断标记物。严重临床预后包括病人状态的任何恶化，如第一次心肌梗塞后复发，甚至死亡。

IL-18优选用作第一次心衰竭后复发事件的诊断标记物。复发病包括，但不限于，死亡、复发性局部缺血、血管反复闭塞、动脉粥样硬化发展或因心衰竭经常入院。

以上为对本发明进行的叙述，参照以下提供的实施例将会更容易理解本发明的内容，但以下实施例是用于阐述而不意味着对本发明的限制。

实施例

材料和方法

标本

收集进行颈动脉内膜切除术的36个病人切除下来的41块人动脉粥样硬化斑块。用于调控的是无动脉粥样硬化的2条胸和3条***内动脉(其中2条的最小纤维肌肉增厚)，它们取自尸体解剖或冠状动脉分流术。迅速将这些动脉浸在液氮中，并储存在-80℃。用于提取蛋白质和RNA的斑块在储存于-80℃之前要先迅速清洗，然後浸在液氮中。用于免疫组织化学研究的斑块先置于4％新鲜多聚甲醛2小时，再转移到30％蔗糖-PBS溶液中，然后用液氮急速冷冻于最优切割温度组织处理培养基中，并储存在-80℃以便低温恒温切片。每个标本得到几片8至10μm的切片，以进行组织分析和免疫组织化学研究。

病人分类

为了研究IL-18/IL-18BP表达和斑不稳定迹象之间潜在的关系，我们以随机方式收集在2000年5月和8月间进行动脉内膜切除术的连续23(有36个病人)个病人的临床数据。由进行动脉内膜切除术的医生***地报告用肉眼检查斑内是否有溃疡。这样，我们可以将斑分成溃疡性斑或非溃疡性斑。另外，按临床病征将病人分成不同的两组。具有与颈动脉狭窄相关的脑缺血性发作临床病征的病人归为有症状一组。这些病人在临床病征发作后2-66天(17.6±5.3天)进行动脉内膜切除术。而那些从来没有在颈动脉区出现脑缺血病征的病人归为无症状一组。基于对冠状动脉或其周围发病的病人进行的***临床检查，检测到无症状颈动脉狭窄，由一个有经验执业回波描记员用多普勒回波描记术(Doppler echography)重复多次确定其严重程度。尽管无症状病人从未有过颈动脉狭窄区缺血发作，但已有研究显示脑动脉内膜切除术对这些病人的病情有利，如无症状脑动脉粥样硬化研究(ACAS)调查者(Asymptomatic Carotid Atherosclerosis Study investigators)(28)揭示的那样。

Western Blot分析

从12块动脉粥样硬化斑和5条调控正常动脉中提取蛋白质。在液氮条件下将冷冻样本磨成粉末。再以每10mg净重配0.3mL溶液的比率将粉末重新悬浮于冰冻溶解缓冲液[20mmol/L三盐酸，5mmol/L pH7.5 EGTA，150mmol/L氯化钠，20mmol/L甘油磷酸盐，10mmol/L氟化钠，1mmol/L原钒酸钠，1％***X-100，0.1％ Tween 20，1μg/mL抑肽酶，1mmol/L PMSF，0.5mmol/L N-甲基磺酰基-L-苯丙氨酸氯甲基酮(TPCK)，0.5mmol/L N(a)-p-甲基磺酰基-L-赖氨酸氯甲基酮(TLCK)]中。提取液在冰上培养15分钟，然后离心(12000g，15分钟，4℃)。保留可溶于去污剂的上清液馏分，用Bio-Rad蛋白质试验法平衡样本中的蛋白浓度。

为了用werstern blot分析IL-18和IL-18R，将蛋白质提取液煮沸5分钟，并装在7.5％或15％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶。对于IL-18BP，根据制造商的协议，用1mg/mL树脂使从大肠杆菌(E.Coli)(Serono Pharmaceutical Research Institute，Geneva)纯化来的重组人IL-18、rhIL-18与Affligel 15(Biorad)偶联。蛋白质提取液(60μg)在辊筒上于4℃培养过夜，用20μl树脂调整至500μl含0.05％PBS的Tween。为了消除任何非特异性结合，将树脂离心，并用10mM pH8的三盐酸、140mM氯化钠、0.5％***-X-100(Fluka)、0.5％脱氢胆酸盐洗涤，再用50mM pH8的Tris、200mM氯化钠、0.05％***-X-100、0.05％P40去污剂(Fluka)、2mM CHAPS(Boehringer，Mannheim)洗一次，最后用50mM pH8的三盐酸洗涤。然后将树脂离心，在还原条件下使树脂重新悬浮于样本缓冲液中，煮沸5分钟，最后装在10％的SDS-聚丙烯酰胺NuPAGE凝胶(Invitrogen)上。

通过电泳将样本从聚丙烯酰胺凝胶转移到硝酸纤维素。硝酸纤维素膜在室温下浸在含5％无脂无水牛奶的TBST溶液[50mmol/L pH7.5三盐酸，250mmol/L氯化钠，及0.1％ Tween盐水]中2小时。然后，将这些膜和山羊抗人IL-18和IL-18R(α-链)多克隆抗体(1μg/ml)(R&D***)、小鼠抗人IL-18BP单克隆抗体(5μg/ml的单克隆抗体657.27)(Corbaz等人，2000 manuscript submitted)、兔抗人caspase-1多克隆抗体(1μg/ml)(A-19，Santa Cruz)一起培养。使过量200倍摩尔浓度rhIL-18BP-6his(从中国仓鼠卵巢细胞纯化来的，Serono PharmaceuticalResearch Institute，Geneva)与5μg/ml单克隆抗体657.27一起培养1小时，通过竞争在条带膜上分析单克隆抗体657.27的特异性。根据制造商提供的操作规程，再与结合于相应抗体的HRP一起培养，用化学发光物质使阳性条带显露出来，这些条带与Hyperfilm ECL(Amersham公司)接触后，即可用肉眼看到。

免疫组织化学

将来自6块动脉粥样化斑的冷冻切片与1∶10正常马血清或1∶10正常山羊血清在室温下培养30分钟，用PBS洗一次，再与抗CD68主小鼠单克隆抗体一起培养以识别巨噬细胞(DAKO-CD68，KP1)，或与抗人平滑肌α-肌动蛋白主小鼠单克隆抗体一起培养以识别平滑肌细胞(1A4，DAKO)。为了识别动脉粥样化斑内的IL-18和IL-18受体，使用稀释浓度为5μg/ml的特异性山羊多克隆抗体(R&D***)。用抗重组人IL-18BP异构体a(H20)的特异性单克隆抗体(Corbaz等人，2000manuscript submitted)来检测IL-18BP。用PBS洗涤后，将切片与下列第二生物素化抗体培养：稀释浓度为1∶200的生物素化马抗小鼠IgG(Vector Laboratories，Inc.)，其用于检测具有抗CD68、平滑肌α-肌动蛋白以及IL-18BP抗体的染色，以及稀释浓度为1∶200的生物素化马抗山羊IgG(Vector)，其用于检测抗IL-18和抗IL-18受体抗体。用亲合素-生物素HRP显影***(Vectastain ABC Kit PK-6100Vector)观察免疫染色。为了作负调控，用与同型匹配无关的抗体而非主抗体使相邻切片染色。

RNA制备

按照Chomczynski和Sacchi所述方法(29)，自酸性硫氰酸鈲溶液中的29块动脉粥样化斑提取总RNA，再用苯酚和氯仿提取。纯化的RNA溶解在水中，并通过260nm的吸收度测定其浓度。在1％琼脂糖凝胶上电泳评定RNA完整性。根据制造商协议，用Promega逆转录***从1μg总RNA合成cDNA。

人动脉粥样化斑内人IL-18和IL-18BP的半定量和实时(RT)-PCR

在含1U AmpliTag DNA聚合酶(Perkin Elmer Roche，USA)、2.5mMdNTP(Amersham，USA)和50pmole正向和反向PCR引物的50μl总体积中进行半定量PCR反应。反应物按以下条件在PTC-200 Peltiet Effect热循环仪(MJResearch，USA)中进行培育：94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延长1分钟。为了保证与PCR反应线性相时PCR产物的量相当，在循环25、28和31次后分析IL-18BP、IL-18和β-肌动蛋白。测定条带饱和前IL-18BP、IL-18和β-肌动蛋白的最佳循环次数(分别为31、28和25轮)。根据发表的序列(AF110799，D49950，X00351)设计如下PCR引物：IL-18：反向5’-GCGTCACTACACTCAGCTAA-3’，正向5’-GCCTAGAGGTATGGCTGTAA-3’；IL-18BP：正向5’-ACCTGTCTACCTGGAGTGAA-3’，反向5’-GCACGAAGATAGGAAGTCTG-3’；β-肌动蛋白：反向5’-GGAGGAGCAATGATCTTGATCTTC-3’；正向5’-GCTCACCATGGATGATGATATCGC-3’。为了排除可能污染样品基因组DNA的扩增，在没有cDNA模板时进行PCR反应。在1％琼脂糖凝胶上以1×TAE缓冲液对PCR产物(10μl)作电泳分析。凝胶染色后与1kb梯(Gibco)比较验证PCR产物大小。在紫外线灯下用柯达(Kodak)数字科学分析软件进行溴乙锭染色条带的相对定量测定，所得结果用靶基因(hIL-18BP、hIL-18)对管家基因(hβ-肌动蛋白)的比值来表示。

根据发表的序列(AF110799，D49950，NM002046)，用来自PE生物***的引物表达软件设计以下IL-18BP、IL-18和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)(管家基因调控)的SYBR绿色RT-PCR引物：IL-18：反向5’-CAGCCGCTTTAGCAGCCA-3’，正向5’-CAAGGAATTGTCTCCCAGTGC-3’；IL-18BP：反向5’-AACCAGGCTTGAGCGTTCC-3’，正向5’-TCCCATGTCTCTGCTCATTTAGTC-3’；GAPDH：反向5’-GATGGGATTTCCATTGATGACA-3’，正向5’-CCACCCATGGCAAATTCC-3’；内含子GAPDH：反向5’-CCTAGTCCCAGGGCTTTGATT-3’，正向5’-CTGTGCTCCCACTCCTGATTTC-3’。测试特异性和最佳引物浓度。将PCR和特异性内含子GAPDH引物反应以排除可能存在的基因组DNA污染。在3.5％琼脂糖凝胶上对PCR产物作电泳分析以证实没有非特异性扩殖。用5μl/孔的RT产物(0.5ng总DNA)、25μl/孔的含有AmpErase尿嘧啶转葡糖基酶(Uracil N-Glycosylase，简称UNG)(0.5单位/孔)的SYBR绿色PCR主混合物(PE Biosystem，CA，USA)及20μl引物(300nM)进行SYBR绿色RT-PCR。PCR在50℃进行2分钟(用于AmpErase UNG培养以去除任何导入cDNA的尿嘧啶)，在90℃进行10分钟(用于激活Amplitaq Gold)，然后在ABI PRISM 7700检测***上在95℃循环15秒，60℃循环1分钟。这样，使逆转录cDNA扩增，并测定其Ct(循环阈)值。所有Ct值均正常化至管家基因GAPDH。用凝胶电泳分析法观察IL-18、IL-18BP及GAPDH的单特异性DNA条带。

用”SYBR绿色PCR主混合物”实时检测的原理基于SYBR绿色与双链DNA结合而导致荧光增强，从而可直接检测PCR产物。

统计学分析

数据以平均值±标准差(mean±SEM)表示。用Mann-Whitney试验比较组间的IL-18水平，P＜0.05就认为统计上有显著差异。

实施例1：IL-18抑制剂保护因氧化脂蛋白(oxLDL)导致内皮细胞的死亡

在IL-18结合蛋白或抗IL-18抗体存在或不在的情况下，将培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)与氧化脂蛋白接触16小时。如图1所示，83％ HUVEC在与氧化脂蛋白接触后死亡。而与IL-18BP或抗IL-18抗体培养几乎能使全部细胞存活下来。与IL-18BP培养还没发现有细胞死亡。而与抗IL-18抗体培养细胞的存活率为89％。

此试验清楚表明，两种不同IL-18抑制剂对由于动脉粥样硬化斑中的凋亡的细胞死亡的保护效果。

实施例2：动脉粥样硬化斑内IL-18蛋白质及其内源性抑制剂IL-18BP的表达

用Western blot分析来自12条颈动脉粥样硬化动脉和5条正常调控动脉的蛋白质提取液。包括活化型在内的IL-18蛋白质在所有动脉粥样硬化斑内都高度表达，而在正常动脉(图2)内检测到很少或没有表达。条带1至4为来自动脉粥样硬化斑的样本，条带5至7为来自正常动脉的样本。令人感兴趣的是，IL-18活化形式的检测结果好象和参与IL-18处理(图2前排)的caspase-1活化形式的表达有关。在所有动脉粥样硬化斑内还检测到IL-18受体蛋白质(即α链)显著表达，与此相比，正常动脉(图2第二排)只有极低水平表达。另外，虽然表达水平是异源的(图2第一排)，但大部分动脉粥样硬化斑都表达IL-18BP。

实施例3：动脉粥样硬化斑内IL-18蛋白质及其内源性抑制剂IL-18BP的细胞定位

为了确定IL-18蛋白质及IL-18BP的细胞定位，在6块颈动脉粥样硬化斑上进行免疫组织化学研究。如图2所示，IL-18主要在巨噬细胞内表达，这些细胞可能是斑内IL-18(未图示)的主要来源。这些区域也有大量CD3-阳性淋巴细胞。然而，T淋巴细胞似乎没有直接参与IL-18的产生。一些内膜平滑肌细胞和偶然内皮细胞也表达IL-18。不同的是，尽管所有血管都没有表达，但在斑微脉管和腔表面内皮细胞却检测到IL-18BP显著表达。在一些富含巨噬细胞区，主要在细胞外，也检测到相对较低和不均一性更大的IL-18BP表达。

实施例4：动脉粥样硬化斑内IL-18和IL-18BP mRNA转录物的表达及与斑不稳定性的关系

为了测定人颈动脉粥样硬化斑(图3)是否表达hIL-18和IL-18BP mRNA，在6块动脉粥样硬化斑上进行半定量RT-PCR。虽然IL-18和IL-18BP mRNA的量不均一，但所有动脉粥样硬化斑均检测到IL-18和IL-18BP mRNA。所以，为了准确定量IL-18和IL-18BP mRNA表达水平，用SYBR绿色RT-PCR法进一步分析该23块动脉粥样硬化斑(图4)。这些斑的特征是经临床和病理检查分成有症状(不稳定)及无症状(稳定)斑块，肉眼观察到有溃疡或无溃疡。表4简要列出这些病人的临床特征。两组病人之间没有区分颈动脉直径减少的百分比(60％-95％)及危险因数，包括年龄、糖尿病、高胆固醇、高血压和吸烟与否。

表4

病人特征

无症状有症状

病人(n＝9) 病人¹(n＝14)

年龄 66.9±4.0 70.2±3.9

性别男(8) 男(9)

高血压² 8 9

高胆固醇³ 4 8

糖尿病 3 1

正在吸烟 7 8

冠状动脉病 5 4

¹这些病人在进行动脉内膜切除术前2-66天出现短暂或持久脑缺血发作

²用抗高血压剂治疗临床高血压病人的数目

³用降脂剂治疗临床高胆固醇病人的数目

与无症状的动脉粥样硬化斑相比，在有症状的动脉粥样硬化斑内发现IL-18的量被向上调升(分别是0.67±0.17和2.03±0.5)(图4A)。统计学分析表明，在有症状的斑内IL-18的产生量明显增加(p＜0.0074)，而在有症状对无症状的斑内发现IL-18BP的量并无增加，(分别是4.64±0.98和2.5±0.92)(图4B)。换句话说，虽然有症状与无症状两组均显示IL-18和IL-18BP mRNA之间是正函数关系，但两组之间的斜率相差很大(有症状一组：斜率为1.16[0.19-2.14]，r²＝0.36，而无症状一组：斜率为4.79[2.39-7.20]，r²＝0.76；p＜0.05)。所以，有症状一组的IL-18BP表达的相对增加好象不足以补偿IL-18表达的增加。而且，由于溃疡也被认为是造成斑不稳定的其中一个原因，所以在溃疡或无溃疡斑上作进一步统计学分析，结果显示溃疡斑内IL-18的量显著向上调节(p＜0.018)(图4C)。

这些数据表明，动脉粥样硬化斑内IL-18表达的增加与斑不稳定有关。

实施例5：在疾病体内模型中IL-18BP调控动脉粥样硬化斑病变的发展和稳定性

方法

病人特征

在急性缺血性冠状动脉综合征(不稳定心绞痛和心肌梗塞)病人发病后7天内抽取血浆样本。不稳定心绞痛定义为与心电图的缺血性改变或与冠状动脉病相关的典型胸痛。心肌梗塞是基于心电图上与循环血液中的心肌酶(磷酸肌酸激酶和肌钙蛋白)显著上升相关的缺血性改变而作出的诊断。在同一个心脏病学部门就诊的非缺血性病人，他们完全没有缺血迹象。用市售药剂盒(MBL，Japan)测定hIL-18的血浆水平。

小鼠IL-18BP表达质体在体内肌肉内电转移

每隔3个星期，给14只14周大的雄性C57BL/6 apoE KO小鼠注射3次IL-18BP表达质体及pcDNA3 IL-8BP。给调控小鼠(n＝19)注射调控空质体。按已知方法(附属编号为#Q9ZOM9)(23)使小鼠IL-18BP异构体d cDNA分离出来，并在巨细胞病毒激活子(Invitrogen)的控制下将其亚克隆到哺乳动物细胞表达载体pcDNA3的EcoR1/Not1位上。图5所示为称为334.yh的构造。调控质体具有相似构造，但没有治疗性的cDNA。如前所述(13)，在麻醉小鼠的两块胫头颅肌肉内注射IL-18BP或调控表达质体(60μg)。简而言之，在腿两侧设置相距4.2至5.3mm的两块不锈钢电极，经PS-15电脉冲仪发出经皮电脉冲(200V/cm的8方波电脉冲，在2Hz持续200毫秒)。

酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠IL-18BP(mIL-18BP)

孔板用自兔多克隆抗体纯化来的重组小鼠IL-18BP d亲合物(5μg/孔)覆盖过夜。先后用抗大肠菌类的生物素化重组小鼠IL-18BP(Peprotec)的兔多克隆抗体(0.3μg/ml)和外亲合素过氧化酶(1/1000)(Sigma)检测可溶性mIL-18BP。为了确认mIL-18BP的特异性，用Western Blot法测试捕获兔多克隆抗体。以HEK 293细胞产生的重组小鼠IL-18BP d为标准。ELISA的灵敏度为5ng/ml。

分析小鼠

如前所述(13)，从主动脉窦获得低温恒温切片(8μm)，以便用油红检测脂质积聚，用天狼星红(Sirius Red)检测胶原以及进行免疫组织化学分析。如前所述(13)，用特异性主抗体，如抗小鼠巨噬细胞、克隆MOMA2(BioSource)、与磷酸酶碱共轭的抗平滑肌细胞α-肌动蛋白以及抗T淋巴细胞CD3(Dako)，使这些切片染色。用TUNEL技术(13)检测细胞的死亡率。用肉眼随机数一数CD3阳性细胞。如前所述(13)，用计算机辅助图像定量(NS15000 Microvision)测定在主动脉窦和主动脉区内巨噬细胞、平滑肌细胞、胶原或TUNEL的染色为阳性的动脉粥样硬化斑。用具有与非免疫同型匹配的免疫球蛋白的染色来评估免疫染色的特异性。用酶末端脱氧核苷酸转移酶的缺失来评估TUNEL的特异性。用10％缓冲甲醛溶液使跨越左锁骨下动脉和肾动脉的胸主动脉凝固，并用油红使脂质积聚染色。然后，将这些主动脉顺着纵向方向打开，用计算机辅助图像定量(NS15000 Microvision)计算脂质积聚的百分比。

结果

本研究测试证明了假设IL-18/IL-18BP调控在动脉粥样硬化和斑稳定性两方面起关键作用。测量急性冠状动脉综合征病人(20个男性，18个女性，平均年龄为66.2±1.8岁，其中14人有不稳定心绞痛，34人有心肌梗塞)和在同一个心脏病学部门就诊的非缺血性调控病人(10个男性，3个女性，平均年龄为60.0±5.2岁)的IL-18血浆水平。急性冠状动脉综合征病人的IL-18血浆水平与调控病人相比显著上升(分别为73.0±12.2和146.9±17.1pg/ml，p＜0.05)，而IL-18BP的循环水平刚好与此相反，只有轻微升高(分别为7.5±2.5和20.1±2.7ng/ml，p＝0.06)。另外，也发现有严重缺血性心脏机能障碍和肺水肿临床迹象(224.03±39.1pg/ml，与调控相比p＜0.001)的病人，其IL-18水平与疾病的严重程度有关，病情越重，IL-18水平越高。急性冠状动脉病病人所得的这些结果与已知的在中风病人的动脉粥样硬化斑内IL-18水平高的观察结果，均表明IL-18/IL-18BP调控在动脉粥样硬化过程中可能起着重要作用。

为此，我们用自发产生类人动脉粥样硬化病变的apoE昏迷(KO)小鼠测试这一假设。14只14周大的雄性小鼠通过在体内肌肉内电转移编码小鼠IL-18BPd的表达质体DNA来接受IL-18BP补给，而19只年龄相当的调控小鼠接受空质体。每3星期重复质体电转移，治疗9星期后，在23周大时处死小鼠。在注射了空质体的KO小鼠中，小鼠IL-18BP的血浆水平比检测极限(5ng/ml)低。然而，注射单次IL-18BP质体后二天发现，血液的IL-BP水平达到最高(323.5±100.9ng/ml)，二星期后，还测到127.4±35.4ng/ml。用IL-18BP或空质体治疗9个星期后，2组病人之间的总胆固醇(分别为489.4±34.6和480.8±36.3mg/dl)和高密度脂蛋白血清水平(分别为52.3±9.4和48.8±5.1mg/dl)差别不大。与调控一组相比，以IL-18BP治疗的一组动物体重适度地但会显著增加(分别为28.6±0.8g和31.8±0.9g，p＜0.05)。

在两个不同位置检验IL-18补给对动脉粥样硬化的影响，即下胸主动脉和主动脉窦。选择胸主动脉来确定IL-18BP对脂肪纹产生(动脉粥样化形成)的作用，这是因为IL-18BP开始转染时14周大的小鼠(数据未示出)几乎没有出现胸动脉粥样硬化病变。在14周大的小鼠(数据未示出)中却发现主动脉窦动脉粥样硬化病变，用这些主动脉窦检验晚期斑的发展和并发症，这是斑稳定的一个重要决定因素。IL-18BP治疗对apoE KO小鼠的动脉粥样硬化病变的产生和发展有显著影响。胸主动脉的检验结果显示，IL-18BP脂质治疗与空质体治疗相比，小鼠的脂质积聚下降得更多(图6)。定量计算机辅助图像分析显示，动脉粥样硬化病变的程度减低69％(p＜0.0001)(图6)，证明IL-18对动脉粥样硬化有治疗作用。另外，与用空质体治疗相比，用IL-18BP质体治疗仅9星期，就可显著限制主动脉窦动脉粥样硬化斑的发展(斑的面积减少24％，p＝0.01)(图7)。

更重要的是，晚期病变的组成是斑不稳定的一个主要决定因素，通过IL-18BP治疗得到明显改善。用IL-18BP质体治疗小鼠的动脉粥样硬化病变使巨噬细胞浸润大幅减少50％(p＜0.0001)(图8)，T淋巴细胞减少67％(p＜0.005)(图8)，而平滑肌细胞积聚增加2倍(p＜0.05)(图9)。此外，经天狼星红染色确定，病变细胞组成的这些重要改变与胶原含量大幅增加85％，而总脂质含量下降有关。

故IL-18治疗可显著减弱动脉粥样硬化病变的炎症过程，并使动脉粥样硬化斑趋于稳定。而且，在用IL-18BP治疗的小鼠中，病变的炎症组成显著减少也使斑内细胞死亡率大大降低(用IL-18BP治疗的小鼠为2.9±0.9％，而调控小鼠为10.5±3.6％，p＜0.05)，因而限制了非细胞脂质核心的扩大和血栓形成(Mallat，1999)。

结论

通过进展良好的类人动脉粥样硬化小鼠模型，上述结果清楚显示，IL-18和IL-18BP肯定在动脉粥样硬化斑的产生、发展和稳定起着关键作用。而为了预防胸主动脉早期病变的形成，通过补给IL-18BP抑制IL-18活性也对主动脉窦晚期病变组成有显著影响，包括转变成稳定斑表型。

动脉粥样硬化病人的临床预后只会部分取决于病变的面积。现在已有广泛共识，病变的质量(斑的组成)而不是面积能更好预测缺血性疾病的发作。事实上，动脉粥样硬化(心脏和脑梗塞)的严重临床表现主要是在破裂动脉粥样硬化斑的接触面上形成血栓堵塞血管(19)。病理研究业已证明，易损和不稳定斑容易破裂或已破裂，主要存在在炎症细胞中，它们失去大量平滑肌细胞和胶原量(20，21)。另外，这些斑块使凋亡细胞的死亡率大幅提高，从而形成高血栓脂质核心(13，22)。值得注意的是，在用IL-18BP治疗的小鼠中，所有这些斑不稳定迹象均明显减弱，这表明IL-18信号是斑不稳定的一个主要决定因素。

我们发现，急性冠状动脉综合征病人的循环IL-18水平升高，导致中风的不稳定颈动脉样硬化斑内产生的IL-18也增加，由此更加证实了apoE KO小鼠所得的结果与人类疾病的关系。将这些发现综合考虑，确定IL-18抑制剂的活性可作为预防和治疗动脉粥样硬化斑产生及限制斑并发症的重要新治疗手段。

实施例6：高水平IL-18与心衰竭病人的复发有关

用IL-18特异性抗体经ELSIA试验测量病人血清的IL-18水平。

共测试56个有或无心衰竭的缺血性或非缺血性病人。

在后来死亡的病人中，IL-18水平为216.0±41.5pg/ml，而生存的病人中，IL-18水平为112.2±12.2pg/ml(p＝0.0018)。

在出现复发事件的病人中，如死亡、复发性局部缺血、血管反复闭塞、动脉粥样硬化发展或因心衰竭而经常入院，测定的IL-1的水平为165.8±23.8pg/ml，而在任何无复发的病人中，IL-18水平为107.7±14.6pg/ml(p＝0.03)。

这些结果表明，有严重临床预后，如复发或者甚至死亡，的病人的IL-18水平很高。

测定16个有或无心衰竭的非缺血性病人的血样IL-18水平。在后来死亡的病人中，IL-18水平为199.0±34.8pg/ml，而在仍然生存的病人中，IL-18水平为95.3±20.4pg/ml(p＝0.09)。

有复发的病人与无复发的病人的IL-18水平分别是146.6±34.4pg/ml和95.4±23.9pg/ml(p＝0.03)。虽然由于病人数目较小，IL-18水平的差异未达到统计数据，但仍清楚看到IL-18的水平上升这一趋势。

在缺血性病人中，死亡病人与生存病人的IL-18水平分别是214.2±45.9pg/ml和118.4±12.8pg/ml(p＝0.007)。

有复发和无复发的病人的IL-18水平分别是162.8±24.7pg/ml和116.2±16.0pg/ml。

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序列表

<110>应用研究***ARS股份公司

<120>IL-18抑制剂在治疗和/或预防动脉粥样硬化中的应用

<130>026263f1

<150>EP 00109606.4

<151>2000-05-05

<160>14

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

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<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

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<221>IL-18反向引物

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<221>β肌动蛋白反向引物

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<221>GAPDH正向引物

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Claims

1. IL-18用于制造诊断心衰竭严重临床预后的药物的用途。

2. IL-18用于制造诊断第一次心衰竭后复发事件的药物的用途。

3.如权利要求2所述的用途，所述复发事件选自复发性局部缺血、血管反复闭塞、动脉粥样硬化发展和因心衰竭再次入院。

4.如权利要求1-3中任一项所述的用途，所述药物是IL-18抗体。