HU229375B1 - Use of il-18 inhibitors for the treatment and/or prevention of atherosclerosis - Google Patents

Description

A találmány szerinti megoldás a vasácaláris betegségek tárgykörébe tartozik. A találmány tárgya közelebbről IL-lS-inhibítorok alkalmazása aöserossklesőzis· kezelésére és/vagy tnegelőzésére.

Az atheroszklerözís a legelterjedtebb és legjelentősebb vaszktnáris betegség, de sok más vaszkuláris rendellenesség ismeretes.. Az athetoszklerőzis főleg a nagy es közepes méretű artériákat sújt;», és a kóros elváltozásök zsírsav-rétegeket, fbrclhikas plakkokat és: bonyolultabb kóros elváltozásokat tartnhnuzuak. /kz stbtoszklerözís az érfal krónikus gyulladásos betegsége, melyei lipídek, például koleszterin, sejtek, például makrofágok, T-limfoelták vagy simaizom-sejtek és extraeelltüárls mátrix fokozatos felhalmozódása jellemez (I), Nagyobb mértékű felhalmozódást aterósnáknak vagy plakkokrtak hívnak; amelyek gyakran tartahsazuak kalciumot A zsírszövet kikezdheti az artéria falát, i&egsísönteöíeti az artéria rugalmasságát és ellenállást jelenthet a véráramlással szemben. Sőf vérrögök alakulhmnak ki a plakk-lerakódásokkörtll, amelyek tovább zavarják a véráramlást, amely az ér teljés elzáródásához; vezethet. Az atheroszklerózis rendszerint LDL-koleszterin, Lp(a)-ííhrinogén és VH, faktor megnövekedőt mennyiségével, valamim RDL-köleszíerm csökkent mennyiségével asszociált. Rizikófaktor lehet a kor. nem, dohányzás, cukorbetegség, elhízás, magas vér-koleszterin-szint, túlzott zsírfogyasztás és az adott szentély vagy családtag korábban szenvedett súvbetegséghett. A szervi iszkémia, például a szívinfarktus legfőbb oka.

Az ateróma az artériák leggyakoribb kóros elváltozása, amelynek későbbi komplikációja a tromboemboliznms. .Az aterómás plakkok gyakran leszákiíik az artériák belső átmérőiét, amely iszkémíst és néha a kerlngéssel rosszul ellátott terület szöveteinek aítofiáját okozza. Súlyos következmények lehetnek például sugmás: szimptómák szívinfarktus következtében, szívelégtelenség iszkémiás vagy nem-iszkémlás események következtébe»: és magas vérnyomás a veseartériák beszűkülése és rossz vérellátása miatt, amely fokozott rcninkiváiaszíásra adott fiziológiás válasz.

Az atheroszklerőzist és az arterioszkkrózíst néha különböző patológiai állapotnak írják te, ás ebben az esetben aíheroszkierözist úgy defínáljak, mint az artériák keményedését (szklerözis) vagy rugalmasságának elvesztését, amely konkréton az atcrómáknak tulajdonítható, míg az arterioszkierózist úgy definiáljuk, mint az artériák keményedésst vagy rugalmasságának elvesztését, amely bármilyen más okra vezethető vissza.

Az atheroazklerózis komplikációi vagy következményei lehet kcsszorúér-megbetegedés (koszorúerek atheroszkterózisa), vérellátás elégtelensége elzáródás miatt {iszkémia/angina}, akut szívinfarktus (Ml, szívroham), tranziens iszkémlás roham (T1A) vagy szélütés és erek, izmok vagy más íestszervek károsodása..

Aneurixmák, amelyek az erek permanens, rendellenes kiboltosulása (dilatációja), szintét) gyakori következményei az athroszkisrózianak, Atherosaklerotíkw hasi aona-aneurizmák gyakran kí fejlődtrek idős páciensekben, Ezek szétrepedhetnek a retroperitörícális íhashártya mögötti) öregbe. Atheroszkleroiikus aneurizaAbaa rendszerint a rugalmas szövet kifejezett elvesztése és a közeg fibrózisa (rostos elfajulása) figyelhető meg, főleg aorta környéki IztJtok íszkéoőájksak következtében, azután maktofág-enzímek szabadulnak fel, amelyek a rugalmas rostokat feldarabolják,

Átheroszklsrózís kezelésére és megelőzésére ajánlott gyógymód lehet a vérzsinXoleszterÍEr-sziní csökkentése. Különösen az LDL-koIeszterint csökkentő terápiát alkalmazzák elterjedte». Jeletsleg a saíatinokat alkalmazzák legelterjedtebben, amelyek specifikus HMO~CoA redukíáz-isthibitorok. Továbbá zsírcsökkemő ágensek gyógyszereket hrrtahnaznak, példám kolesztramint, kolesztipolt, níkotínsavat, getnftbroziít, prohukoll,

97752.-7195-PÁ

EP1270540 ♦ «*«« ΑΑ Α»*Φ ΦΦ

ΦΧ Φ Φ X « X *

Φ Φ φ Φ X

Φ Φ X X Φ Φ φ Φ»« «φ ΦΦΦΧ XX ΦΦΦ

ΦΦΦ lova&zfeunt és hasonlókat.

Egy másik megközelttésheu alherófnás kóros elváltozásokon kialakuló írombus képződésének kockázatát minimalizálják. Aszpirint, amely úgy tűnik, hogy specifikus inhibitora a hOmboxán-AS-mediált vérlemezksaggregálódásnak, vagy' antiköagulánsokat leket alkalmazni a vérrég-képzádés kockázatának csökkentésére.

Ferkután „ballon sagíeplasztíka·’' alkalmazása esetés egy olyan katétert vezetnek az. elizpftott pl&kkhez, amelynek a végén egy babon van, és ezzel fokozni lehet a véráramlást az elzáródás mellett Ez a technika hasonló ahhoz, amelyben kinyitják a szív artériáit, de ez a testben több más artériában is alkalmazható. Koszorúórszfoiiózssokai elkerülik („bypass”) egy vasa saphena-bél (alsó végtag egyik bőrvéuája) származó szegmenssel, melyet a proximális aortához varrnak, vagy kivágnak egy belső emlő-artériái a mellkas .falából, és összekapcsolják ennek disztálls végéi a szív elülső felszínén lévő artériával.

Bizonyos esetekben sebészeti beavatkozás lehet ajánlott a lerakódások eltávolítására (eodarterektómia,. például nyak! verőér endarterektóutiája).

Azonban a fő Javallat tnaradt továbbra is a rizikófaktorok kezelése és ellenőrzése, mint például az alacsony zsírtartalmú, alacsony koleszterintartalmú és alacsony sótartalmú táplálkozás, és az egészségmegőrzést tanácsok követése, a magas vérnyomás, cukorbetegség és más betegségek kezelésére és ellenőrzésére vonatkozóan, testtömeg csökkentése és a dohányzásról való- leszokás, valamint möásaetss testgyakortaf a szív és a keringés edzettségének javítása céljából,

A gyulladásos folyamat szerepet játszik az aiheroszklerózis kifejlődésének különböző szakaszaiban (1). Az ondótól akfiválódást különféle faktorok váltják ki, példáid alacsony nyírófeszültség, módosult llpöprnteinek és promílammáciős citokinek, amelyről feltételezik, hogy az alheroszklerőzis első lépése és gyulladásos kontroll alatt van (I). A közelmúltban végzett több vizsgálatban kimutatták, hogy a vaszkuláris és gyulladásos sejtek közötti kölcsönhatás döntő fontosságú az atberogenezisben (1). Különösen meghatározott proitiEammácsós folyamateorok gátlása csökkenti az athernszkferózis kifejlődését.

A gyulladás akberoszkferotlkus piakkok feírepedésében és trombózis kialakulásában is fontos szerepet játszik (2-5), és ezért hatással van akut iszkémiás szindrómák elöfordtdására és ezekkel összefüggő mortalitásra (6). Valóban, az áíheroszklerózis súlyos klinikai maniíesztáclői, például szív- és agyínfarktusok és bármilyen más szervben kialakuló infarktusok elsősorban az ér belsejének tromhus általi elzáródására vezethetők vissza, amely a sérült aíheroszklerotikus piákkal való érintkezésnél képződik (3, 4), Patológiai vizsgálatokban kimutatták, hogy sérülékeny és instabil piakkok, azaz amelyek hajlamosak berepedezésre, vagy már herepedeztek, nagymértékben eltérő sejt- és mátrix-összetétellel rendelkeznek, mint a stabil piakhok, amelyek nem hajlamosak berepedezni (?), A sérülékeny piakkok gazdagok gyulladásos sejtekben (makrofegekban és T-limfocitákbsn), amelyek egy trombogén lipld magot tartalmaznak, és vékony, übrózus sapka („eap”) jellemzi azokat, amelyekben az extraeelluláris mátrix lényegi módon elfogyott (7).

A proinflammáciős iENy-cítokm által médiáit, csökkent mértékű kollagénszintézis és a makrofágeredeíö mátrixlehonío metalloproteázök felelősek a őbrózns sapka eivékonyodásáért és törékenységéért (7). A törékeny, nbrőzas sapka fslrepedésévei a nagymértékben trombogén h'píd-mag hozzáférhetővé válik a véráramlás számára, és elzáródást okozó (okkluzlv) tromhus kialakulását eredményezi (1, 7). Ezért egy adott atherosxkferotikus elváltozásban a gyulladásos sejtek sűrűsége instabilitásuk jó indikátorának tekbnhető.

Athmoszklerózisban: szenvedő páciensek klinikai prognózisa csak részben függ a károsodás méretétől (19, 20). Általánosan ismert, hogy az elváltozás minősége (plakk összetétele), ttern a mérete lehet az iszkémiás

A A«r«« «.« **»X X* « ««** « Φ * * » X « « « -« X * < X * ·» * -X\ « » * ♦ * « 9 « * * *“ ,3 *· x«* β> x «♦ ·*< «*♦ ♦ események elöferdasására utaló előre jelzés. Valóban, az atheroszklerozis súlyos. klinikai manifesztáeíói (ssívés agyinfarktusok) efeősorfesn az ér belsejének irombus általi elzáródására vezethetők vissza, amely a sérüli atheroszkieröíites piákkal való érintkezésnél képződik (19). Patológiai vizsgálatokban kimutatták, begy sérülékeny ás instabil plakkok, amelyek hajlamosak berepedezésre, vagy már berepedeztek, gazdagok gyulladásos sejtekben, és lényegi módon kevesebb simaizom-sejtet és kollagént tartalmaznak (20, 21). Továbbá, ilyen plakkok esetés szignifikánsan nagyobb mértéké az spoptetíkus sejtposztuiás, amely nagymértékben trombogén lipid mag kialakulásához vezet (13,22).

Á proinfiammációs citbkioek gyulladás kialakulásában játszanak szerepet. Az interleukin- 18-at (lk-18) eredetileg mierfersn-y-t (IFN-y-t) indukáló faktorként -(8} írták le. Kora: szignált jelent a T-lsmfocíía-helper 1. tí pusú (Túl) válaszok kifejlődésében. fk-18 együtt fejti ki hatását ÍL-12-vel, IL-2-vel, antigénekkel, mítogénekfcel és- valószínűleg további faktorokkal, IFN-y-tennelés indukálása céljából. IL-18 még GM-CSF és ÍL-2 termelését is képes fokozni, az anti-CBS-indukált T-sejtes proliferáeiő hatékonyságát fokozza, és nővel: természetes, kilíer sejtek Fás-médiáit pusztításának mértékét, .Az éred IL-ÍS prekurzoraiből ÍL-10-fea»vertálé enzhn (ICE, kaszpáz-1) működésével képződik. Az ÍL-1 S-receptor legalább két. komponensből áll, amelyek ligandunikötés esetén kooperatfvan műkődnek. Nagy és kis aifmitású kötőhelyeket találtak IL-18-ra egérből származó lL-12-síimnláit T~sejíeken (9), ami alapján több láncból álló receptor-komplex létezését feltételezik. Eddig két receptor-alegységet azonosítottak, mindkettő az íL-l-reeeptorcsaládhoz tartozik (18). IL-1S szignál-ttanszdukciős folyamatának része NF-kS aktiválódása (11).

A közelmúltban ít-lS-ja nagy affinitást mutató, szolubilis fehérjét izoláltak humán vizeletből, és klónozták a butnán és egéreredetü cDNS-t, valamint: a humán gént (12; WO 99/89Ö63. számú nemzetközi közzétételi irat). A fehérjét lt-18-köté fehérjének nevezték (1L-18BF).

Az 1L-1S8P sem az ismert 1L-18-receptorok extracelluiáris dosrénje, hanem egy szekretálí, természetes, keringésben található fehérje. Szekretált fehérjék egy úgy családjához tartozik, amelyben továbbá számos feim.iővlrns áldd kódolt fehérje van (12), 1L-Í8B-P konxiibílivea expresszálödik a lépben (12). A vizeletben előforduló, valamint a rekonrbináns ÍL-Í8BP specifikusa® képes nagy affinitással 11,-18~&t kötni, és az Π..-1.8 biológiai aktivitását modulálni.

.Az IL-18SP-gént a 1 IqiSgelő humán kromoszómában lokalizálták, ős nem találtak transzmemhsán domént kódoló exont egy 8,3' kb mérető genomi szekvenciában. Emberekben IL-lkBP-re négy spiicing-variánsí vagy izofórmát találtak, melyek jelölése: 1L-18BPa, -b, -c és -d, az N-terminábs mindegyikben közös, és a C-terminális különböző (12).

Négy humán és két egérben; előforduló 11L-1 SEfP-izolőrmát találtak mRNS-splicing eredményeként, különböző cDNS-köttyvtárakből, és ezeket expresszáltők, tisztították és meghatározták kötódésSket és 11,-18 biológiai aktivitását semlegesítő képességüket (23). Humán ÍL-18BF a-izöfürnaája (ít~I8BPa) rendelkezik a legnagyobb kötési affinitással ÍL-i 8-ra, gyors asszociációs sebességgel és lassú disszociácios sebességgel, és 399 pM disszociáció» konstanssal (ÉG) rendelkezik, EL-lSBPc és IL-lhSPa Ig-doménje megegyezik, kivéve a 29 C-termsnáiis aminosavat; IL-lSBPe K^-je 1 δ-szer kisebb (2,94 sM), Miudazonáhnk ít-18BPa és IL-lSBPc 95%-uáí nagyobb- mértékben képes ίί,-18-af semlegesíteni kétszeres moláris feleslegnél. 11-18BPb- és íL-lSŐPe-izofortnák nem teriateaanak teljes lg-domént, és nem képesek IL-18-hez kötődni vágj' azt semlegesíteni. Rágcsálóból származó lí~188Po- ős It-BPd-lzoformák egyező Ig-dotnőnnel rendelkeznek, és ezek szintét; 95%-nsl nagyobb mértékben képesek EL-l S-at semlegesíteni kétszeres moláris feleslegnél. Azonban rágcsálóból szármaφ» χ- *

zó ίί..-íSBPd, mely humán IL-lSBPa-vál egyező C-tenminális motívumot tartalmaz, szintén képes humán IL-18-sí semiegesítersí. Molekuláris modellezéssel egy nagy, keveri, elektrosztatikus és bidrofőb kötőhelyet azonosítottak az 1L48BP Ig-doménjében, amely felelős lehet a Ugandám Irányában mutatott nagy affinitásért (23).

A találmány szerinti megoldás arra a felismerésre alapul, hogy 1L-18 inhibitora kifejezetten jótékonyt hatást képes ki fejteni plslek-fejlódésre, piakk-srrogresszióra és píakk-stabilassra atheroszklerózis rágcsálóban felállított modelljében. Az lt~iS inhibitora nemcsak megelőzte káros elváltozások kialakulását mellkasi aortában, hanem kialakult atheroszklerotikns pináinkban átkapcsolást indukált stabil plákk-fenotipus irányába.

Ezért a találmány tárgyát képezi az igénypontokban meghatározott IL-I S-mhlhitor alkalmazása atheroszkletózís megelőzésére és/vagy kezelésére alkalmas gyógyszer előállítására, A. találmány tárgyát képezik továbbá kezelési eljárások génterápiás megközelítésben, atheroszklerózis kezelésére és/raegelőzésére.

Az 1. ábrán lévő hisztogramon bemutatjuk köldőkvéoábői származó endotéi sejtek túlélését egyedül oxidált lipoprotemekkel való mkubálás után, vagy kombinációban oxidált Hpopreteinskkel és íL-lS-eilenanyaggal vagy IL-lSBB-vel, sorrendben, való hrkubálás után.

A 2, ábrán bemutatunk egy Wesfern-blotot atheroszkierotikus artériákból származó febérjexírakíemokkai, kontroli artériákhoz viszonyítva, A Westem-biotban IL-18BP-í« (hlLIS-BP), IL-iS-teceptor «-alegységére'(hit. I SRa), lt-1 R-ra (hit-18} és kaszp&z-1 -re (kasapáz-1 -p 1Ö) specifikus ellenanyagokat aikalmazíunk.

A 3. ábrán bemutatónk etídium-bromiddnl festett agaróz-géít, .amelyen atheroszklerotikus plakkskbars lévő sejtekből származó, lt-18- és ll-l&BP-mRNS-re végzett RT-PCR-asallzis eredményei láthatók.

4. ábra: Reprezentatív RT-PCR-eres&nényék atheroszkferotíkus platótokban lévő IL-lSBP-re és 1L-18ra, ha-aktio-expresszióhoz (kontroll) viszonyítva szimptomatikus és «szimptomatikus plakokkban.

Az 5,, ábrán bemutatjuk. egerek mtxamusskaláris elektrotrausz&rjébez alkalmazott expressziős térképét.

A 6. ábrán lévő híszíogrsmon bemutatjuk a lípldskre festődött területet arányát aíheroszkferetikus artériákban. Kvantitatív, számítógépes leképezési analízist aikalmazítmk íipld-lerskődás kimutatására, Az adatok átlagoknak felelnek meg s.e.tn-értékekkel (s~l9 üres ptasidra, n-14 IL-iSBP-t tartalmazó piazntiára), Négy csillag jelentése: P <Ö,ÖOÖ I.

A ?. ábrán lévő hlsztogramon bemutatjuk aorta sinus károsodott területeit IL~1 SBP-kezelés után, kontrolihoz (üres plazmiddal való kezelés) viszonyítva. Kvantitatív, számítógépes leképezési analízist alkahnaztuok a károsodott rész kimutatására. Az adatok átlagoknak felelnek meg s.s.m-őriékekkei (n~19 üres pl&zmídrs, mri4 IL-lSBP-t tartalmazó plazmádra). Dupla csi llag jelentése : P < 0,01.

A 8, ábrán bemutatjuk ÍL-lSBP-kezeies hatását gyulladásos sejt-tartalomra. Kvantitatív, számítógépes leképezési analízist alkalmaztunk wakrofág-pozttiv területek (százalékosan kifejezve) (fekete oszlopok) és mos³-kést Infiltráló T-limfoetták számának (vonalkázott oszlopok) meghatározására aorta sinusban lévő kóros elváltozásokban, kontroli (n~12 makroíág. festésre, n=4$ T-llmfoolta-festésre) vagy I1..-1 SBP-vei kezelt (n~13 makróiig festésre, n~l2 T-límfeclia-festéste) egerekben. Az. adatok átlagoknak feleinek meg s.e.m-éítékekfcck Három csillag jelentése: P < 0,005 ; és négy csillag jelentése: P < 0,0001.

A 9, ábrán bemutatjuk IL-lSSP-fcezslés hatását símsízoín-scjíeken lévő kóros elváltozásokra és kollagéatartálorora, Kvantitatív, számítógépes leképezési analízist alkalmaztunk simaizom-sejtekre pozitív terület (fekete oszlopok) és a koHagéatsrtalom (vonalközét! oszlopok) meghatározására (százalékosan kifejezve) aorta sinusban lévő kóros elváltozásokban, kontroll (η-ό simaizom-sejtekre, n~l 1 kollagénre) és It-lhBO-vel

ΦΦΚΧ ΧΦ Φ φφ* φφ » φ φ » φ φ β* φ φ φ ♦ φ « φ £ Φ Φ « Φ ♦ χ * ♦ φ

- 3 - βΦΦ ΦΦ «ΦΦΦ ΦΦ ΦΦΝ φφφ ΦΦ kezelt (η~·δ simaizom-sejtekre, »=33 .kollagénre) egerekben. Az adatok átlagoknak letelnek meg s.e.tn-értékekkel. Egy csillag jelentése; ? < 0,05 ; és dupla csillagjelentése; P < ö,ÖÍ.

A találmány szermti megoldás arra alapul, hogy keringésben lévő IL-18 megnövekedőit mennyisége akut szívkoszorúér-megbetegedés szindrómáiban szenvedd páciensekben és fokozod l.L-18-tertnelés jrcm-stabil, uyaki verőérben lévő, atheroszkterotikus pakkokban szélütésért Felelős. Továbbá kimutattok, hogy It-lSBP-t kódoló expresszlos pbzmid-DNS ;« v/vo elefclroírímszferje meggátolja· zsírréteg kialakulását a mellkasi aortában, és· lelassítja atoeroszklerotiktís piakk.ek progresszióját az aorta-sinusban, atheroszkíerózis rágcsálóban jól kidolgozod niodelijébeo. Fontosabb, hogy IL-fSBP-plazmiddái való transziékeió kifejezett váhozAsokal indukál a plakk összetételében (makrofágok, T»sejték, sejtpusztolás· mértékének és iípídtertsíom csőkkesfese, és simaizom-sejt és koliagéntartalosn növekedése), amely stabil plakk-íénotlpushoz vezet Az eredmények elsőként matatják be· lL-18-inhíbítorek fontos szerepé t plakk kifejlődésébert/progressziójábatt és plakk stabilitásának elősegítésében.

Ezért a találmány tárgyát képezi az igénypontokban meghatározott IL-1 8-inhibitor alkalmazása atheroszklerózís kezelésére és/vagy megelőzésére alkalmas gyógyszer előállítására.

A találmányi leírásban a “prevenció” kifejezésen nemcsak egy bizonyos hatás teljes mértékú megelőzését (prevencióját) értjük, hanem a hatás bármilyen részleges vagy lényegi gyengülését, redukálódását,, csökkenését vagy eltűnését a betegség kialakulása előtt vagy-annak korai szakaszában.

A találmányi leírásban “kezelés” kifejezésen betegség progressziójára kifejtett, bármilyen jótékony hatást értőnk, például. a patológiai kifejlődés gyengülését, redukálódását, csökkenését vagy eltűnését a betegség kialakulása után.

A találmányi kiírásban az ‘TL-lS-ítihibitor” kifejezésen ériünk bármilyen: molekulát, amely H.,-18 termelését és/vagy hatását képes modulálni úgy, hogy az IL-ÍS-temelést és/vagy hatást gyengíti, redukálja, vagy részlegesen vagy teljes mértékben meggátolja vagy¹ blokkolja.

Termelés inhibitora lehet bármilyen molekula,, amely negatívan, befolyásolja az 1L-I8 szintéziséi, processzálását vagy érését. A találmány szerinti megoldás vwaöcozásában tfűbttoroknak tokintítík peldátsl interionkin 1L-I8 génexpresszióiánák szupresszöísit amíszessz m&NS-eket, amelyek IL-lS-m.RNS transzkripciójának mértékét csökkentik vagy meggátolják azt, a megfelelő konformáció felvételét befolyásoló vagy IL-iS érését vagy szekrécióját részlegesen vagy lényegi módon gátló fehérjéket, ha már szintetizálődötí, IL-lk-at lebontani képes proteázokat, és hasonlókat Termelés inhibitora lehet például kasxpáz-'l -itoúbttor vagy ÍCEin.bib.itor, gátolva l.L-18 érését.

lL-18-haiás inhibitora tehet például IL-lS-aníagonisía. Antagomsták kötődhetnek vagy lefoglalhatják magát az ít-lS-molekulái elegendő artinítással és specrfíiással ahhoz, hogy részlegesen vagy lényegi módon semlegesítsék az íL-Í8-at vagy ll.-l.k-kőtőbeíye(k.e)t, amelyek felelősek IL-18 lígandumaihoz (például receptoraihoz) való kötődéséért. Egy arttagosista hatást fejthet ki az 11,-18 jeltovábbító folyamatson» ís„ amely a sítekben akitiválódík IL-1 S/receptor-kötődéskor.

Az lL-18-hatás inhibitorai lehetnek sz&hdnlxs Π,~ I k-recepíorok vagy receptorokat mimetizáló molekulák, vagy lE-lS-receptorokat blokkolni képes ágensek, IL- IS-ellenanyagok, mim például moFtokionális ellenanyagok, vagy bármilyen órás -ágens vagy molekula, amely képes ÍL-18 célpontodhoz való kötődését meggátolni, igy megszünteti vagy meggátolja as IL-5 8-meáiált mteacelluláris vagy exiraeeiiulárss reakciók kialakulását.

Az atheroszklerózist artőrioszkierózisnak vágy az artériafel megkeméuyedésének is nevezik. A találX *«

X .· * Φ * * « .· χ » ♦ * » * * * * ·«· * * ΦΦΧ χ» «♦«» ** S*1Í *κ mányi szerinti megoldássá; összefüggésében, az atheroszkferózís kifejezésen értjük az atténák.mfeds® olyan betegségéi vagy beteg állapotát, melyet atheruszkleróziskéní írnak le, amelyben zsír-anyag rakódik le az érfaíban, végűi a véráramlás szűküléséi és gátlását valamint berepedezését és/vagy trombusképzödéssel járó erózióját eredményezve.

A találmány szerinti megoldással összefüggésben, atheroszklerózison értjük az artériák szklerózisáí vagy rugalmasságának elvesztését, amely aterómáknak tulajdonítható (afheroszklerőzí»}, valamint azt is, ha bármilyen más okra vezethető vissza (ítrterioszklerőzis). Az atheroszklerózís patológiai állapotait, valamint az alhsroszkferózís komplikációit vagy következményeit, amelyekre a leírásban szintén alkalmazni kívánjak az „atheroszklerőzis kifejezést, részletesen leírtak fentebb, a találmány műszaki hátterének ismertetésekor.

Az alheroszkíerózis előrehaladása (progressziója) alatt atlferoszklerotikus plakkok kialakulását és egy vagy több instabil formába való kifejlődését értünk. A találmány tárgyát képezi tehát IL-1 S-mhibífor alkalmazása atheroszklerózis előrehaladásának mértékét esökksntő és/vagy azt megelőző gyógyszer slóállitására.

Aíheroszkíerodkus piakkon kialakult írombus általi érelzáródás kritikus eseménye a szlvstfárktusnák és agyi infarktusnak, amely az, stheroszkferőzis legveszélyesebb következményei közólt van. Ezért szintén a találmány tárgyát képezi ÍL-lS-irthibltor alkalmazása atheroszklerotikíís: plakk trombózisának kezelésére és/vagy megelőzésére: alkalmas· gyógyszer előállítására,

A plakk stabilitása befolyásosa azt, hogy az athetoszklerotíkus plakk veszélyes vagy sérülékeny piákká fejlődik-e, amely hajlamos trombózist mícíálni. Ezért a találmány tárgyát képezi továbbá IL-18-inhifcitor alkalmazása athernszkletotikns plakk instabilitásának kezelésére és/vagy megelőzésére alkalmas gyógyszer előállítására.

Nem stabil plakk hajlamos berepedezésre, és plakk berepedezése trombózishoz vezethet, A találmány tárgyát, képezi továbbá 11,-1 .^-inhibitor alkalmazása atberoszkferotikus plakk eróziójának vagy berepedezésének kezelésére és/vagy megelőzésére alkalmas gyógyszer előállítására.

A plakk instabilitása és trombózis lehet például apoploltkus sejipusstulás következménye, amely nagymértékű psrokeagultóós aktivitással jár, és trombózishoz vagy atheroszkleroiikus plakkok eróziójához vagy berepedezéséhez, valamint embóliához vezető kulcsfontosságú esemény lehel: (13, 14), Kimutatták, hogy oxidált iipoproíemek (oxLDL·) makroíágot és endetél sejt apoptózisát indukálják tenyészetben (I 5), A példákban lentebb leírtak szerint, azt találtuk, hogy 11,-18 inhibitora nagymértékben képes csökkentem oxLDk által indukált sejtpusztuiást.

A találmány szerinti megoldás kidolgozása során meglepő módon azt találtuk, hogy 1L-1S mennyisége a vérben szignifikánsan magas olyan szívelégtelenségben szenvedő páciensekben, akikben kiújolő események lépnek fel, tóit például halál, kiújuló íszkémla, re-vaszk'ularlzáció, atheroszklerózís progressziója vagy újabb kórházi kezelés szívelégtelenség miatt, olyan páciensekhez: hasonlítva, akik nem jutottak ismét kórházba. Ez a magas IL-lS-szintéa különösen kifejezett olyan páciensekben, akik később meghaltak, azokhoz viszonyítva, akik túlélték. A vérkeringésben tneguővekedeít IL-lk-szinteket figyeltek meg íszkéntíás páciensekben és nemiszkémiás páciensekben egyaránt.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint az IL-f 8-mhifeltor a következőkből álló csoportbői van kiválasztva; !'L-18-ra specifikus ellenanyagok, 11,-1 h-recepíor bármelyik alegységére specifikus ellenanyagok, az 11-1SBP konzervatív aminosav szubsztitúciókat tartalmazó műfemjei, az IE-ISBP és ImmuaoΦ Φ*χ« «Φ Φ« χ ΧΦΦΦ ** Φ Φ * Φ Φ X ΦΧ φ * χ Φ * * Φ * •γ φ φ χ « « λ χ ♦ φ χ * V * β*Φ *Χ #**♦ X* ΦΦΧ ΦΧΜ ΦΦ gtobís nehéziásc régiók fúziós fehérjéi, fmikciooális származékok, amelyek PEGilált 'ÍL-?8BP«t alkalmaznak, ahol a műiéin, fúziós fehérje és fankcionális származék megtartja az IL~lB~ke;ő biológiai aktivitást.

A leírásban a „muteinek” kifejezésen egy 1L-188F olyan analógjait értj ük, amelyekben egy természetes IL-lSBP-bea vagy több amntosav maradékot különböző aminosav maradékok helyettesítenek konzervatív szubsztitúció- útján. IL-18BP~poiipeptÍdek vagy fehérjék vagy virális IL-I8SF konzervatív mmes&v-sznbsztitenseí lehetnek egy olyas csoporthoz tetőző sziaenha atainosavak, amely csoportban az ammosavak elegendően hasonló Sztke-kémiat tölajdonságokkai rendelkeznek ahhoz, hogy a csoport tagjai közötti szubsztitúció esetén a molekula megtama biológiai funkcióját (lő). Nyilvánvaló, hogy aminosavakst lehet mszertáhú és deletáfaú a fentebb definiált szekvenciákban anélkül, hogy megváltozna tbnkciójok, különösen ha az foszcreiek vagy deiéciók csak néhány amisosavat érintenek, példád 30-n.ál kevesebbet, ás előnyösen lö-nél kevesebbet, és nem. távölítiák el vagy helyettesítik azokat az aminosavakaL példáid eteeineket, amelyek, döntő fontosságúak fhökcíonáik konformáció kialakításához. Ilyen deiéciókkal és/vagy inszereiókkal előállított fehérjék és muteínek szintén a találmány tárgyát képezik,

A szinonim aminosavak előnyös csoportjait: az I. táblázatban defmíáljak. A szinonim amimsavak előnyösebb csoportjait a 11, táblázatban definiáljuk; és a szinonim aminosavak legelőnyösebb csoportjait a IH. táblázatban definiáljuk,

I. táblázat

Szinonim aminosavak előnyös csoportjai

Asnmos&Y	Szinonim csoport
Ser	Ser, Thr, Gly, Asn
Arg	Arg, Gfe, Lys, Gin, His
Les	Be, Phe, Tyr, felet, Val, Leu
Pro	Gly, Aia, Ή», Pro
Thr	Pro. Ser, Alá, Gly, His, Gin, Thr
Alá	Giy, Thr, Pro, Aia
Vaj	Met, Tyr, Pbe, ile, Len, Val
Gly	Aia, Thr, Pro, Ser, Gly
ke	fefeí, Tyr, Fhe, Val, Len, lle
Pbe	Txp, Met, Tyr, He, Val, Leu, Fhe
Tyr	Trp, Met, Pbe, Ife, Val, Lcu, Tyr
Cys	Ser, Thr, Cys
Hís	Gkí, Lys, Gin, Thr, Arg, His
Gin	Gin, Lys, Asn, Kis, Thr, Arg, Gin
Asn	Gin, Asp, Ser, Áss·
Lys	Gin, Gin, His, Arg, 'Lys-
Asp	Gitt, Asn, Asp
Giu	Asp, Lys, Asn, Gin, Hís, Arg, Gitt
Met	Phe, Ile, Val, Len, Met
Trp	Trp

X *

H, táblázat

SxisöAbs aothrosavab ebnyösebh csoportjai

Aíáiaosav	Szbostbí csoport
Ser	Ser
Arg tea	H.ts, Lys, Arg Leu, He, Phe, Met
Pro Tb	Ah, Pro Πν
Ab	Pro, Alá
VG	Vai, Met, Re
Giy He	Giy Re, Met, Phe, Vai, Leu
Phe	Met, Tyr, Re, tea, Phe
Tyr	Ffee, Tyr
Cvs	Cys, Ser
HA	Hss, Gin, Arg
Gb	Gia, Gin, Hss
Áss Lys	Asp, Αν: Lys, Arg
Asp	Asp, Áss
Gb Met	G?u, Gin Met Phe, He, YaL, tea
Trp	Trp
	ΠΙ, táblázat
SzböKím aHtissossvafe iegefóoyösobb csoportjai
Asmoossn	Sxiaooim csoport
Ser	Ser
Afg Pro Thr Aia	Arg tea. Re, Met Pro Thr .Ah
Vai	Val
Giy	Gíy
Re	Hé, Met, Leu
Phe	Phe
Tyr	Tyr
Gys	Cys, Ser
Hu	HA
Gb	Gb
Asn	Aso
Lys	Lys

Asp Asp

Gb Gb

Met	Met, I	le.
Τ»	Met

χχ **ΦΦ φ» Φ φφφΦ

ΦΦ ♦ * * » W Φ ΦΦ φ

Φ Φ Φ * 9 Φ Φ « * > 9 * * Φ * X Φ *«« φφ φφφφ *» φφφ χ*ί ν*

Bármilyen fessen eljárást alkalmazhatunk amínosav-sznbsrthúcíók létrehozására olyan. fshéíjékhen, amelyek ÍL-188.P-polspeptidek muteinjesként vagy fehérjeként a találmány szerinti megoldásban történő alkalmazásra, például az alábbi USA-beít szabadalmi leírások szerint: Mark és- munkatársai, 4,959,314,, 4,588,585. és 4,737,462,:;. Koths· és munkatársai, 5,116,943,: Nwa és sxtsai., 4,965,195,; Choug és munkatársai, 4,879,1 íl,; és Lee és munkatársai, 5,017,691; és hzm-szubsztituált fehérjéket írnak, le a 4,984,584. USA-beli szabadalmi leírásban (Shaw és mísak).

A ‘fúziós fehérje'’ kifejezés a leírásban olyan .polípeptidre ólai, amely £L-188P-t tartalmaz egy másik fehérjével fuzionálva, .amely például hosszabb tartózkodási idővel rendelkezik, tesífolyadékokban, IL-I88P tékát fuzionálva lehet más immtmglobnilnhoz vagy annak fragmenséhez.

Funkcionális származékok, kifejezésen a leírásban JL-1,88P-k olyan származékait értjük,, amelyek pohetilén-gllkol oldalláncokkal rendelkeznek, amelyek ntaszkolhamak antigén-kötö helyeket és megfeosszabbílhatiák az Π..-18ΒΡ tartózkodási idejét a testtőiyadékokban.

A találmány egy további előnyős megvalósítási módja szerint, IL-ÍS-inhifeltorként 1L~! S-ra specifikus ellenanyagot alkalmazunk. Anti-lT-íS-ellenasyagok lehetnek polsklonális vagy monoklonális·, kunéra, humanizált,. sőt, teljesen humán ellenanyagok, Rekoinbináns ellenanyagokat és fragmenseít ll..-18-ra nagymértékű In $wö affinitás és alacsony toxícitás jellemez, A találmány szerinti megoldásban alkalmazható ellenanyagokat .az jellemzi, hogy páciensek kezelésére alkalmas elegendő időtartamig ahhoz, hogy paiogén állapot, vagy pálosén állapottal kapcsolatos bármilyen szimptőma vagy szfeuptómaosoport jő vagy kiváló regresszióját vagy mérséklődését eredményezze,

Semlegesítő ellenanyagokat könnyen lehel termeltetni állatokban, például nyulakbm, kecskében vagy egerekben IL-lB-al való imuttózálássáí. immunizált egerek különösen alkalmasak: S-sejt-ldmisként hibrldómák előállítására, amelyek viszont nagy mennyiségben képesek anti-ll..-18-ellenanyagokat termelni.

.A kimér» ellenanyagok olyan inmmaglöhulm-mölekalák, amelyekben két vagy több szegmens vagy részlet különböző állatfajból származik, A kánéra ellenanyag variábilis: régiója általában ncm-hmmfc emlősszervezetből. például rágcsálóeredetö monoklonális clleanyagból származó ellenanyag, és az immunglobulin konstans régiója humán ioununglobulsn-molekBiábó! származik. Előnyösen mindkét régió és a kembmáeio alacsony mmmoogeolíással rendelkezik, rutin kísérletekkel meghatározva (24), Humanizált ellenanyagok olyan inmamrglöbuiln-molefculíík, amelyek géntechnológiai módosító technikákkal lenek előállítva, amelyekben a rágcsálóból származó konstans régiók megfelelő humán: részekkel varrnak helyettesítve, míg a rágcsálóból, származó anlígénköiő régiók megmaradtak. .Az eredményük kapott egér-humán kiméra ellenanyag előnyösen csökkent immunogenitássa! és javított farmakokinetikai tulajdonságokkal rendelkezik emberekben (25).

Tehát, a találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, IL-í 8-ellenanyagként humanizált ellenanyagot alkalmazunk. Előnyösen alkalmazható, humanizált antl-ÍL-18-ellesasyagokar leírnak például az EP 0 974 60Ö. számú-európai szabadalmi bejelentésben.

A találmány még egy előnyős megvalósítási módja szerint, 11,-1 F-ellen&nyagké ni teljesen humán ellenanyagot alkalmazunk. Humán ellenanyagok előállítására alkalmas technológiát részletesen leírnak például a WO 00/76310., WO99/S3049. számú nemzetközi közzétételi iratban,, a 6,162,963, számú VSA-belí vagy az Ali 53361 GO. számé szabadalmi leírásban. Teljesen humán ellemmyagok előnyösen rekombináns ellenanyagok, trsnszgenikus állatokban, például xeaoegerekbe® fenae&etve, amelyek funkcionális hsmún ig-lőkuszok egészét vagy részleteit tartalmazzák,

Λ * · a > > < * > *

ÍV «·* ** *·♦* »* **♦ X*

A találmány egy nagymértékben előnyös megvalósítási módja szerint, sz '3L· íS-lsthibitora. az 1E-18BP muteinje, amely konzervatív sminosav szubsztitúciót toriak»»», ÍL48BP és immunglobulin nekézíáne régió fúziós fehérjéje vagy PEGllált 1L-188P-1 tartalmazó íímfeíOHáils származék. Ezek á műfemek, fúziós fehérjék vagy furtkeionáiis származékok megtartják az 1L-Í8BF biológiai aktivitását, konkrétan az 1L-18 kötést és előnyösen alapvetően legalább egy, az IL-lSSP-fcez hasonló aktivitásuk vau. Ideális esetben az. ilyen fehérjék rendelkeznék olyan biológiai aktivitással, ásni még: fokozott is a módosítatlan IL-lSBP-hez képest

Az 1E-ISBP szekvenciái és splicing vanánsaí/izoformái megtalálhatók a WO99Á39Öő3. számú nemzetközi közzétételi: Iratban, vagy a (12) valamint <23} hivatkozásokban,

ÍL~íSBP funkcionális száranazéksii polimerekhez konjngáhak a fehérje tulajdonságainak, példást stabilitásának, fél-életidejének, biológiai hozzáférhetőségének, humán test általi toleraac iájának vagy immunogenításának javítása céljából, Ebből a célból IL-i&BP-í például poíietííén-giíkolhez (FEG-hez) konjugáihatjuk. PEGilálást ismert módszerekkel végezhetünk, péidául a WO 92/13095. számú nemzetközi közzétételi iratban leírtak szerint.

Ennélfogva, a találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, PEGiláit IL-Í.88F-Í alkalmazunk.

A találmány vonatkozik továbbá olyan fúziós fehérjére is, amely olyan ΙΕ-18-kötö fehérjét tartalmaz, amely fuzionálva van egy immunglobulin részletéhez. Szakember szántára nyilvánvaló, hogy az eredményűi kapott fúziós fehérje megtartotta 1L-1SBP biolőglial aktivitását, különösen azt, hogy IL-l 8-hoz képes kötődni, A fúzió lehet közvetlen, vagy létrejöhet rövid linkerpeptiden keresztül, amely akár 1-3 aminosav hosszúságú Is lehet, vagy hosszabb, például 13 anúnosav hosszúságú. A ilnkerpeptid lehet például E-E-M szekvenciával rendelkező tripepíld (Glu-Fhe-Met), vagy 13 amin&s?avból álló lixikerszekvencia, amely Gíu-Phe-Gly-Aia-Gly-teuVal-Eeu-Gly-Gly-öln-Phe-Met-szekvenctáí tartalmaz beépítve az f:L-18BP-szőkvencia és az immunglobulmszekveneía közé. Az eredményül kapott fúziós fehérje javított tulajdonságokká! rendelkezik, például hosszabb tartózkodási: idővel (lél-életidövcl) testfolyadékokban, megnövelt specifikus aktivitással, megnövelt mértékű expresszióval, vagy elősegíti a fúziós fehérje tisztítását,

IL-IS-BP-í neitézláue régiókkal fúzionáhatjuk, mint például a humán IgGí €H3 és CB3-doménjs. IL-íSBP-t és immunglobulin egy részletét tartalmazó speciális fúziós: fehérjék előállítását leírták, például a WO99/Ö9Ú63. számú nemzetközi közzétételi iratban. Ig-molekulák más izoformái szintén alkalmasak a találmány szerinti fúziós fehérjék előállítására, például az lgG_; vagy IgGu, vagy más tg-oszíáíyok, mint például IgM vagy lg.A, Fúziós fehérjék tehetnek monomerek vagy multímerek, hsíero- vagy homomukimerek.

Interferonokról főleg az ismeretes, hegy gátló Itatást képesek kifejteni vfrusreplikácíóra és celíniárís prokferáciöra. Például interferon-y fontos szerepet játszik immunválaszok és gyulladásos válaszok elősegítésében. Azt tartják, hogy mierferon-jJ-nak (ΙΕΝ-β, 1, típusú interferon} gytál&dásgtóő szerelte van.

Szintén a találmány tárgyát képezi iL-íS-inhibkor és ínforforon alkalmazása kombinációban aiheroszkierózis kezelésére alkalmas gyógyszer előállítására.

Interferonokat polimerekhez; is kosjugáihatoak a fehérjék stabilitásának javítása céljából. Az Interíeron-S-t és a poliol-pohetílén-glikoit (PEG) tartalmazó komugáíuroot leírták például a WO99/55377. számú szabadalmi irafoan,

A találmány egy másik előnyős megvalósítást módja szerint, interferonként mterföron-β-ί (ΪΕΝ-β), és előnyösebben ΙΕΝ-β-la-t alkalmazunk.

Az 11.,-f 8-ternrelés és/vagy hatás mldbkorát előnyösen egyidejűleg, egymás után vagy függetlenül al-IIΧ>*Χ XX X X-X X X* X «ΑΧ X Α « V X V

X A * ί * * * * * * *

XX »♦«# XX ΧΧν XX* ΑΧ kaimazzuk.

A találmány még egy további előnyös megvalósítási módja szerint, IL-lh-inhihitort TNE-amagonístávai koinhiríáeiöban alkalmazzuk. 7HF~aníagomsiák számos módon kifejthetik hatásukat. Eiőszöris, sotngomsíák kötődhetnek vagy lefoglalhatják magát az XL- I 8-rnolek«iáí elegendó affinitással és spcdfitássai ahhoz, hogy részlegesen vagy lényegi módon semlegesítsék a TFIF-epitöpot vagy epitópokaí, amelyek felelősek. TNP-reeeptor kötődéséért (a továbbiakban a leírásban “lefoglald aníagsoistáfcnak” «evezzük), Lefoglaló aníagotósia lehet például TNF ellen termeltetett ellenanyag.

Ezzel alternatív módon, TNT-antagonisták a TNF jeltovábbító folyamatsert gátolhatják, melyet sejtfelszíni receptor aktivál TNF-fcötÓdés után (a továbbiakban a leírásban jeltováhbitö antagonistákoak” nevezzük). Mindkét aniagonssta-csoport alkalmas, akár egymagában, akár együtt, It-1 S-iuhibiforral kombinációban aífeeroszkterózis terápiájában, történő alkalmazásra.

TNF-antagonisiák könnyes azonosíthatók és értékelhetők kiszemelt molekulák rafia szkrtneiésévoh natív TNF-aktívításí érzékeny sejtvsnaiakra, például humán B-sejiekre kifejtő in vítro hatásuk tekintetében, amelyben TNF proliforációt és immunglobulin-szekréciót okoz, A vizsgálati eljárásban a TNF-forma különböző, például 0,1 -szeres és lÖÖ-szoros .hígításban tartalmaz kiszemelt astagonistát, és TNF-nélfcüh vagy csak antagosistát taríateazó kontrollt alkalmazunk (.2.6).

A találmány szerinti megoldásban TNíF-antagonsstakém előnyösen lefoglaló antagonistákat alkalmazunk.. A lefoglaló aníagonixták között olyas polipepidekeí.részesítünk előnyben, amelyek TN.F~et képesek feöísti nagy affinitással és alacsony ímmonoge»itással rendelkeznek. Szöfobtlis TNF-receptormoldtölák és. TNF-re specifikus· semlegesítő ellenanyagok különösen előnyösen alkalmazhatók. Például szohfoilis TN.F-&1 és TNF-R'O megfelel a találmány szerinti megoldásban, ilyen receptorok rövidített formái, amelyek n receptorok extraceíialáris doménját vagy fonkciorsáíis részeit tartalmazzák, a toláhnány szeriosí megoldásban különösen előnyösen alkalmazott wtagothsták. Rövidített, szofohílis, l, -típusú és '51 típusú 'fbiF-reeeptoroka? leírnak például az EP914431, számú európai közzétételi iratban.

A TNF-receptorok. rövidített formai oldhatóak, és 30 kDa és 40 kDa méretű, TXF-kölő fehérjeként detektáíhatók a vizeiéi és a szérumban, melyet TBPl-oek és TBFB-nek nevezőnk, sorrendben <27). A találmány szerinti megoldásban 1.L-18-inhibifori előnyösen TNF-antagonistávaí és/vagy interferonnal egyidejűleg, egymás után vagy függetlenül alkalmazunk,

A találmány ssertöti megoldásban TNF-aatagonístaként előnyösen TBPl-t és TBPfi-t alkalmazunk H-.-18-inlrfoiforml kombinációban. A receptomobkulák származékai, fingmensei, régiói és biológiailag. aktív részletei funkcionálisan emlékeztetnek olyan receptormoiekoiákra, amelyeket a találmány szerinti megoldásban alkalmazunk. A reeeptormoleknia ilyen biológiailag aktív ekvivalense vagy származéka megfelel olyan poüpeptid vagy a receptormolekulát kódoló szekvencia részletének, amely elegendő mérető, és olyan affinitással képes TNF-et kötni, hogy membrán-kötött TN'F-recepforrai kialakuló kölcsönhatás gátolva vagy blokkolva van.

A találmány egy további előnyős megvalósítási módja szerint, a találmány szerinti megoldásban TNFantagonlstáként TNT-RI-t (TBP1) alkalmazunk. Természetes és rekomhináns, szoluhilis TNF-mceptormeiekuiákat, és előállításukra alkalmas eljárásokat leírtak az EP 30S 37-8, EP 39S 32? és EP 4.33 $öö számú európai szabadalmi leírásokban.

1.L-Í S-ínhlbiíort egvidejöleg, egymás után vagy függetlenül lehet alkalmazni TNF-inbibítorraí. Előnyösen ÍL-i g-elíenanyag vagy suti-szérum, és .szolubibs TNF-receptor kombinációját alkalmazzak, amely TNF-gát* X

-12 ló aktivitással roadelke^k.

A találmány egy további előnyös ntegvalósítási módja szerisí, a gyógyszer továbbá CÖX-lnhibitort, előnyösen COX-2-inhibitort tartalmaz. COX-lnhibitorok. szakember számára jól ismertek. Specifikus COX-2-ίηhibitorokat leírtak például a WO 01/00229. számú nemzetközi közzétételi' iratban,

Tromboxáa mhlblteraif, különösen tromboxáu-AÍ, inhibitorait, jelenleg széles körben alkalmazzák stheroszklerózis kezelésére. Ezért, a találmány egy további előnyős megvalósítási módja szerint, a gyógyszer továbbá tromhoxán-íshibitort, és különösen Sromboxán-AS-mhibitort tartalmaz egyidejű, egymás utáni vagy függésién alkalmazásra. Á találmány szerinti megoldásban különösen előnyösen aszpirint alkalmazunk iL-18-inhiöitorral kombinációban.

Úgy látszik, hogy az atheroszkierózis egyik oka. a Hpídek magas koncentrációin a vérben. Ezért a találmfey egy további előnyős megvalósítási módja szerint, a gyógyszer továbbá bpídcsökkentő ágenst tartalmaz egyidejű, egymás utáni vagy független alkalmazásra,. Szakember által ismert, háríniiyen lipidesökkentő ágenst lehet alkalmazni a találmány szerinti megoldásban. További zsircsőkkenűö ágensek lehetnek olyan gyógyszereit, mint koleszriramh, kefeszíipol, nikotinsav. gemribrosál, probukoi és mások. Különösen előnyösei! H'MG-CoAinhibitort, és előnyösen szimv asztalán vagy lovssztatlní alkalmazunk.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szériát, atheroszkierózis jobb prevenciója és/vagy kezelése- céljából, a találmány tárgyát képezi IL-1 S-inhibitor alkalmazása alacsony zsírtartalmú és/vagy alacsony kolesztoritt-tartahnő és/vagy alacsony sótartalmú, diétával kömbisálva,

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, az aikahönzott IL-18-inhibitort mintegy 0,000 i és- 10 mg/kgáesttömeg közötti, vagy mintegy 0,01 és 5 xng/kg/tesíiőmeg közötti, va^- mintegy 0,1 és 3 mg/kgdesttSraeg közötti, vagy mintegy 1 és 2 mg/kg/íesttösneg közötti mennyiségben alkalmazunk,. A találmány még egy további előnyös megvalósítási módja szerint, az alkalmazott 11,-1 S-ínhlbltor mennyisége 0,1 és 1000 pg/kgrtesítömcg közötti, vagy mintegy 1 és 100 pgékgdesttömeg közötti vagy mintegy 10 és SÓ pg/kg/íesttömeg közötti mennyiség.

A találmány tárgyát képezi továbbá az igénypontokban meghatározott 'ÍL-18-mhibitort kódoló szekvenciát tartalmazó expressziős vektor alkalmazása aíheroszkierózis kezelésére és/vagy megelőzésére alkalmas gyógyszer előállítására. Tehát génterápiás megközelítési alkalmazónk a betegség kezelésére és/vagy megelőzésére, IL'lS-inhibitor expresszlcja ezután előnyösen öt sű.v történik, így hatékonyan képes Π,-18-aí blokkolni közvetlenül a betegség által érintett S2övet(ek)ben vagy sejtekben.

A példákban lentebb részletesen leírtak szerint, kimutatható, hogy IL-ISRP hatékonyan sxpresszálhaíó a betegség, rágcsálóban felállított modelljében IL-ISBP-t kódoló szekvenciát tartalmazó expressziós vektor eíektrofrarsszfeíjét követően.

Ennélfogva, a találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, az expressziés vektort elektrotoittszfetrel, előnyösen feíramosztelárisan adjak be.

Szintén -a találmány tárgyát .képezi továbbá sx igénypontokban meghatározott ϊΕ-lS-lnhífeítor endogén termelését sejtben Indukálni és/vagy fokozni képes vektor alkalmazása egy olyan sejtben, amely msrmálisan nem cxpresszá.1 IL-lS-inhibitort (“csendes”), vagy csak nem kielégítő mértékben expresszálja az inhibitort. A vektor tartalmazhat a kívánt sejtben működőképes szabályzó szekvenciákat, 1L-1 S-ínhlbítor expresszálása céljából, Ilyen szabályzó szekvenciák lehetnek például gromóterefc vagy enhanszerek. A szabályzó szekvenciákat azután bevisszük, a genotre megfelelő iőkuszába homológ rekombinációval, így működőképesen kapcsoljuk a

szabályzó szekvenciái azasal -a génnel, amelynek expressziőját mdakálni vagy fokozni kívánjuk, A technológiát rendszerint 'endogén gémíkti.váíásrsak (EGA) hívják, leírását lásd példáid a WO 91/Ö995S. szásnó nemzetközi közzétételi iratban.

Szakember számára nyilvánvaló, begy ugyanilyen technika alkalmazásával az 1L-18-exprssszió mértékét csökkenteni is lehet, azaz: negatív szabályzó elem, például “csendesítő” elem bevitelével az IL-ÍS-lóktiszba, amely az íL-18-expressxtó leszabályzásához vagy gátlásához vezet. Szakember számára nyilvánvaló, hogy az IL-18-expresszió ilyen leszafeályzása vagy *tesenáesiiése” ugyanolyan hatást képes kifejteni, mint ÍL-18-inhifeítor alkalmazása betegség megelőzésére és/vagy kezelésére,

A találmány tárgyát képezi továbbá az igénypontokban meghatározott Ih-lS-irátibitor termelésére nézve genetikailag módosított sejt alkalmazása atheresxkíeróxis kezelésére és/vagy megelőzésére alkalma» gyógyszer előállítására.

Az igénypontokban meghatározott IL-Í88P kiszerelhető olyan, az atheroszkíerózis megelőzésében és/vagy kezelésében különösen hasznos gyógyászati késztesayefc&é, amelyek tartalmazzák az 1L-1 § inhibitorának terápiásán hatékony mennyiségét és egy interferon terápiásán hatékony mennyiségét, A készítmény ÍL-1S inhibitorként tartalmazhat találmány szerinti inhibitort is,

IL-lkBP, az 1L-1SBP konzervatív aminosav szahsztitációit tartalmazó ínuteirsjei, IL-1SBP és hntnunogiobohn nehézlánc régiók íhziós fehérjéi vagy PEGiláit lL-l§BP-t tartalmazó funkcionális származékok, amely műiéinek, fúziós fehérjék, vagy a funkcionális származékok megtartják az IL-lk-kötÖ biológiai aktivitási, előnyösen alkalmazhatók hatóanyagként a gyógyászati készitményekben.

A gyógyászati készítményben interferonként előnyösen lfN-β-ΐ alkalmazunk.,

A találmány még egy másik előnyös megvalósítási módja szerint, a gyógyászati készítmény az igénypontok szerinti íL-ld-ínhíbítor terápiásán hatásos mennyiségét tartalmazza, adott esetben interferont és TNF-sntagomstát. A TNF-tmtagonísta lehet TNiP-aktivhárt semlegesíteni képes ellenanyag, vagy szoiubilis, rövidített TNF-rseepíor foagmensci, melyek jelölése:: TBPl és TFBlí. A találmány szerinti gyógyászati készítmény tartalmazhat továbbá egy vagy több CÖX-mhlbitort, előnyösen CO.X-2-mhibitort, A találmány szerinti, gyógyászati készítmény tartalmazhat továbbá teomboxán-mhíhhart, például aszpirint és/vagy lípíöesökkentö ágenst, például szíatiní.

A gyogyászatilag elfogadható'’ meghatározás jelentése: a leírásban bármilyen hordozó, amely nem befolyásolja a hatóanyag biológiai aktivitásának hatékonyságát, és amely nem toxikus arra a gazdaszervezetre nézve, amelynek beadjuk. Például parenterálls beadás esetén, az aktív fehérjét (fehérjéket) dózisegységekbe lehet formázni injekcióhoz, vivöanysgban, például náírium-kloríd-oldatban, destróz-oldutbau, szérum albumaiban vagy Ritiger-tele oldatban.

A találmány szerinti gyógyászati késziimány hatóanyagát egy egyénnek sokféle módon lehet beadni, A beadás módja lehet míradermáiís, transsdermális (például lassú, felszabadulást biztosító forma), mtramaszkalárís, imraperitoneáiss, intravénás, szobkután, orális, epidurálís, topíkáiís és inrianazális:. Bármilyen más, terápiásat? hatásos beadási módszert Iei?et alkalmazni, például abszorpciót epitel vagy endotél szöveteken keresztül vagy génterápiát, amelyben a hatóanyagot kódoló DNS-ínolekulá? beadjuk a páciensnek (például egy vektorok keresztit!), amely előidézi a hatóanyag expresszálását és /« vívó szekretálását. Továbbá, a találmány szeríoti fehérjét (fehérjéket) be lehet adni más, biológiailag aktív ágensek k<m-p?>nensesvel, például gyógyászatilag elfogadható felílletakrív anyagokkal, segédanyagokkal, hordozókkal, hfgirószerckkel és vivőastyagokkni.

Pareníeráhs (például intravénás, szubkután, imramuszkuláris) beadás céljából, az aktív fehérjéi (fehérjéket) oldatként, szuszpenzíöként, emubíékést vagy bofshzák .porként lehet formázni, gyógyászatilag elfogadható,, parenterális vivósnyaggal (például vízzel, aáöíma-klond-oídatt< óaxtróz-oldattal), és olyas adalékanyagokkal társítva, amelyek íesmmriják az izotóa^s jelleget (például masnit) vagy kémiai stabilitást (példáid tartósítószereket és puffotokéi). A tonnát általánosan alkalmazott technikákkal lehet sterilizálni.

A találmány szerinti aktív fehérje (fehérjék) biológiai hozzáférhetőségét javítani lehet konjugálás! eljárásokkal, amelyek növelik a molekula fél-élehdejét az emberi testben, például a molekulát pohotilén-giíkolhoz lehet kapcsolni, a FCT/WÖ 92/13095. számó nemzetközi közzétételi iratban leírtak szerint.

Az aktív fehérje (fehérjék) terápiásán hatásos mennyisége sok változó függvénye, például:: az antsgonísta típusa, az kL-i S-antagonísts affinitása, maradék citotoxíkus aktivitás, amellyel az antagorósta rendelkezik, a beadás módja, a páciens kiírókat állapota (beleértve endogén IL-ld-akitivitás nem-taxste, kívánatosa» fenntartott szintiét).

“Terápiásán hatásos mennyiség akkora mewyíség, amelyet ha beadunk, IL~l§~ínhibitor az IL-18 biológiai aktivitásának gátlásai eredményezi. Egy egyénnek beadott dózis, egyetlen vagy több dózisként különféle faktoroktól függően változhat, példán! az lt-18 farmakokínefíkai tulajdonságaitól, a beadás módjától, a páciens állapotától és tulajdonságaitól (nem, kor, testtömeg, egészségi állapot, méret), a.szimptömák mértékétől, egyidejűleg alkalmazott kezelési eljárásoktól, a kezelés gyakoriságától és a kívánt hatástól. Kialakított dózístanosnányokaí szakember képes beállítani és manipulálni, valamint képes ró v&ro és ró vivő módszereket végezni 11,ih-gáflás meghatározására egy egyénben,

A találmány szerinti megoldásban az fL-18-inhíbitóit mintegy δ,ΟίΚΗ és 10 mg/kg/testtömeg közötti, vagy mintegy 0,01 és 5 mg/kg/testfőmeg feSzöhi, vagy mintegy ő, 1 és 3 mg/kg/íesttösneg közötti, vagy mintegy i és 2 rng/kg/testtőmeg közötti nrennyiségben alkalmazunk. További előnyős mennyiség lehet 0,1 és iööö ng/kg/testtörseg közötti, vagy mintegy I és löt) gg/kfotesttömeg közötti vagy mintegy 10 és 50 ggdíg/testtömeg közötti mennyiség.

A iaiálmány szerinti előnyös beadási mód a szubkután beadási mód, A találmány szerinti megöidásbatt továbbá a imramuszkuláris beadást részesítjük előnyben.

A találmány egy további előnyős megvalósítási módja szerint, az Π..-1 S-inhibifort naponta vagy minden másnap beadva adjak be.

A napi dózisokat rendszerint több részre elosztva, vagy késleltetett felszabadulást biztosító formában adjuk be, amely hatásos: a kívánt eredmények eléréséhez. Második vagy azt kővető beadásokban az előző dózissal megegyező, kisebb vagy nagyobb dózist lehet az egyénnek beadni. Második vagy azt követő beadások történhetnek a betegség alatt vagy a betegség megjelenése előtt,

A találmány szerinti megoldásban, az IL-18-inhsbüorl egy egyénnek be lehet sd.nl prorilakrikttsan vagy terápiásán, más terápiás kezelési maiidéi vagy- ágensekkel egyidejűleg vagy egymás után (például több drogot alkalmazó kezelési rendek), terápiásán hatásos mennyiségben. Más terápiás ágensekkel egyidejűleg beadott hatóanyagot beadhatjuk ugyanabban vagy különböző készítménybejt,

A találmány tárgyát képezi továbbá 1L-18 aíkahsazása atheroszklerőzis progressziójának diagnosztikai rRsrkerekést. A találmány szerinti megoldás leírása után, ez még érthetőbbé válik az alábbi példáiéra hlvstkozvs, melyeket csak szemléltetés céljából ismertetünk, és nem kívánjuk' ezekkel a találmány által igényelt oltalmi kört koriátozró.

χ·χ

Aarjegoá és mdtfeerek

Minták ttrnnán artheroszkletobkus plakkot vettünk ki 36 páciensből, akik nvski -verőéi· endarterc-któsriáján estek át. Kontteí&éat atlicfoszkferőzistől mentes, 2 oynki verőeret és 3 belső emlő-artériát vettünk ki boncolás vagy koszoróér-bypass-mőtét közben. Ezeket -gyorsan folyékony nitrogénbe mártottuk, és· -SOO-on tároltuk, A fehérje” és RNS-exirakciöra alkalmazott plakkokat gyorssá megmostuk, folyékony nitrogénbe mártottuk, majd' -8(PC-o» tároltak. ímmuRölőssíekémlai vizsgálatokra, a plakkokat 2 óra hosszáig, friss, 4%-os parafbmialdshidbe helyeztük, azután átvittük ,38%-as. szach&réz-PBS-oldatba, majd folyékony nitrogénben hirtelen lefagyasztottak az optimális vágási hőmérsékletre, a szövet kezelésére alkalmazott: közegben (O.C.T. Compound, Miles Inc., Diagoostlcs Divtaién), és -88*C-on tároltuk a fogyasztott metszetek elkészítéséig. Néhány 8-18 pm-es metszetet készítettünk minden mintából hisztológlai és immattohisztökemiai vizsgálatokhoz.

Fdc/mseÁ osztdiyozósrí li,-1 8/IL48BP-expresszió és plakk-instáhiliíás tünetei közötti potenciális összefüggés vizsgálata céljából, prospektiv és vak módszert, alkalmazva klinikai adatokat gyűjtöttünk 23 egymás követő pácienstől f3ő-ből), akik endarterektómíán estek át 2980, május és augusztus között, Makkon belüli fekély jelenlétét vagy hiányát makroszkópikus megfigyeléssel rendszeresen feljegyezték a sebészek, akik az endarektómióát végezték. Ez lehetővé tette a plakkok osztályozását fekélyes vagy fekéayek nélküli plakkokra. Továbbá, a pácienseket két külön csoportra osztottuk klinikai szimptómák alapján. Azokat a pácienseket akikben nyak! verőér sztesózisáuak iulajdoníihatö, eerebráiis iszkéuúás eerebráiis infarktus klinikai szimptómáit megfigyeltük, szimptomatikus osztályba soroltuk;. .Ezekben a. páciensekben endarterebónriát végeztek 2-66 nappal (17,6±S,3 nappal) a klinikai szimptőmáfc megjelenése után. Azokat a pácienseket, akikben soha nem tapasztaltunk eerebráiis iszkénsia szimptőmáií a ayaki verőér területén, aszim^mnatikös osztályba soroltuk. Ászimptömaíikus nyak! verőér srtentósét. szisztematikus klinikai vizsgálat alapján detektáltunk szívkoszorúér vagy perifériás betegségben szenvedő páciensek esetén, és. súlyosságát ismételi Doppier-echográft-ávai határoztuk meg,, atrselyet képzett echográíus végzett, Sőt, az aszfeptomatjkus páciensekben soha nem fordult, elő iszkésrdás epizód a nyak! szteoózts területén, a szlv-endarterektérnia kinratathatóan jótékony hatású volt ezekben a páciensekben, melyet aszintptomatikus nyak! verőr athsroszkierózis-vizsgálatban (AC.AS) mutattak ki (2k).

ikesterw-óioí nwu/tó

Fehérjéket eztrabáltöttk 12 atberoszlderotikus piákkból és 5 kontroll normát artériából. Fagyasztóit mintákat folyékony nitrogén alatt eiporitottunk. A port felszuszpendálmk jéghideg Özls-pufferrel [28 mtnoi/S Trís-HCl φΗ ?,S), 5 mmokl EGTA, 158 nrmold HaCl, 28 mmoki gllcerofossfitt, lő mmol/í NaF, 1' urmol/l nátriom-orlovanadát, 1% Triton X-lliő,8,1% Tween 20, 1 ggtal aprotinin, 1. mmol/l PMSF, 0,5 nmtoW N-tozil-Lfeníiaianis-klómretil-keton (TPCK), 8,5 tunrokl blísj-p-tozil-L-lizitt-kiórmetli-keíon (TLCK)j, 8,3 rnif lö mg nedves tömegre vonatkoztatva. Az sxlraktnmökat jégen htkufeáltuk 15 percig, és azután centrifugáltuk (12.808-g, 15 percig, 4°C-on). A détergensssl oldható, feíűíószódrakeíőkat megtartottuk, és a febérjekoaeenttáeiökat azonosra állítottuk', az: egyes mintákba», Bío-Rad íebéijevizsgálati eljárás alkalmazásával,

1L-18 és 1.L-18R vizsgálatára alkalmas, westera-biot analízisek céljából, tehéíjeextraktumokat forraltunk 5 percig, és felvittük 7,5%-os vagy 15%-os SDS-poliakrilamid-gélre. £. co/fból tisztított, lL-i§BP-t, rhi’L3k-t (Seren© Pbarmaoeutical Research Institute, Genova) AfSgel-15-re (Biorad) kapcsoltunk, 1 mg/ml gyantát * φφφφ < Ζ X « * -φ * X X <

^ν XV· * *'** ** Χ*Φ* ν* ίΛ» ·*>

alkalmazva, a gyártó eljárása szerint A fohérjeexírakiumhoz (öö ug) hozzáadtunk 20 μ! gyantát térfogatát 5Ö5) ükre állítottuk -0,-05% Tween-t tartatom© PRS-el, és egy éjszakán át inkuhálmk, 4*C-on, a reakcióedény forgatása közben, A nem-specifikus kötődés eltávolítása céljából, a gyantát centrifugálok ás mostuk lö roM Tris-t (pH 8), 1.40 mM N'aCl-í, Ö,5% Triton-X-löO-at (Flaka), 0,5% dezoxikolátot tartatom© pafferel, azután 50 ®M Tris-t (pH 8), 2Ö0 ®M NaCÍ-t, 0,05% Triton-X-IÖö-st, 0,05% nonídet P4O-et (Fiaka), 2 rt CHAPS-ot (Boehrm.ger MaaAetoa) tartalmazó pttferel, majd ezután az utolsó ntosást 50 mM Trls-el (pH 8,0) végeztük. Azután a gyantát centrifugáltuk, felszuszpendáltuk mintapufterben redukáld köfolmények között, 5 percig forraltuk ás végül felvittük 16% SDS-pohakrilamíd NaPAGE-gélre (invíírage®).

A mintákat a poliakrilamtá-gélröl elektroforetikusan átvittük nitroeellulózra, A nítrocel falózmembránokat 2 éra hosszáig, szobahőmérsékleten telítettük. 5% zsírmentes tejport tartalmazó TBST-feea (50 mmol/1 Trls-HC! (pH 7,5), 250 mmol/l HaCI és 0,1 % Tween], A membránokat azután kecskében tOToeiíetett, suti-humán IL-lS-ra és 1L-1 8R-re («-lánc) specifikus, poliklöuális eltenmtyagokkal (1 ug/ml) (R &. D Systems), egéreredetu, anti-hnmán IL-tSSP-re specifikus monoklonáHs ellenanyaggal (Mab 657,27, 5 ngúnl) [Cöfoaz és mtsai,» kézirat leadva (20(10)], nyálban termeítefett, suti-humán Raszpáz-l-re specifikus paliklonális ellenanyaggal (1 pg/ml) (A-19, Santa Crttz) inkubáltuk. Az Mub-ó57;27 specífltását memferáncsikon analizáltuk kompedcíóval, 2ÖÖ x moláris feleslegben hozzáadott rhIL-i8RP~ó?ns (kínai hörcsög perteíészefc-sejtjeíból tisztított, Serono Pharmucoutical Research hrstúaíe) alkalmazásával, melyet együtt foknbáliunk 5 pgdnl Mab657.27-el, 1 óra hosszáig. HRP-vsl. koujugálp megfelelő ellenanyagökkal való mkaháiás után, ketsilummeszeens S2öbS2frátokat (ECU Western hloítin.g; Ámersham Corp.) alkalmaztunk a pozitív csikók előhívására, a gyártó utasításai szerint, és a csíkokat Hyperfítox ECL-en (Amersfeam Corp.) exponálással tettük láthatóvá.

Hat afheroszkieroííkus plakkbó? készített, fagyasztott metszeteket inkubáltunk 1: 10-hig:üásé, normál lószérummal vagy 1:10-hígítású, normál fcecskeszérummal 30 percig, szobabőniérsékleten, egyszer mostuk PBS-el, azután CÖófora specifikus, primer, egéreredetö monoklouáíis ellenanyaggá! (DAKÖ-CD68, KPlj íokubáltak makrofágok azonosítása céljából, vagy hantán simaizomból származó o.-aktmra specifikus, primer, egéreredetű monoklonálls ellenanyaggal (1A4, D^:AKO) inkubáltuk simaizom-sejtek azonosítása céljából. 1L-18 és iI,-!8-receptör atheroszklerotfkus pakkokban való azonosítása céljából, specifikus, kecskében termeltetett, políklonáils elleaanyagökat. (R & D Systems) alkalmaztunk, 5 ug/ml hígításban. IL-18RP~t rekomblnáns. humán IL-BP-lzoformájáta speelftkus monokfonális ellenanyag (H20). alkalmazásával detektáltunk (Corbaz és mtsaí., kézirat leadva (2öf)0)j. PBS-ef mostuk, maid a metszeteket az alábbi szekunder, biotmllált ellenanyagokkal inkubáltuk: hfotímlált, lóban termeltetett, satl-egér IgG (Veder Laböraforíes, Inc) 1:2ÖÖ-arányú hígításban, CD68-ra, simaizomból származó α-aktmra -és lL-18BP-re speciSkus ellenanyagokkal való festés detektálására, és blofinllált, lóban termeltetett, antí-keeske IgG-t (Vectoij 1 ;2b0-hígltáshan antí-IL-18-ra és anti-IL-18receptorra specifikus ellenanyagok detektálására, Az immunológiai festést avldm-bioím-f-íRP rendszerek (Vectastaln ABC kit FR-ólÓö Veetor) alkalmazásával tettük láthatóvá. Negatív kontrollok esetén, a szomszédos metszetet izotípusra egyezó, Irreleváns elletfáítyagokka! lesiettük a primer ellenanyagok helyett, foVÓ-pr'c/.uírafob

Totál RNS-t extraháltunk 29 afberoszklerodkus plakkbó! savas goanldium-dochniát-oldatban, és fenol/'kloroformmal extraháltak Chomesyaskl és Saeebi (29) által leírt eljárás szerint, A tisztított RNS-t vízben · 1? feloldottak, és kcíncestráciöiát 260 nm-en mért abszorbancíával meghatároztuk. Az RNS integritását elekfroíbrézissel határoztuk meg 1%-os ítgítfőz-géten. cDNS-t szintetizáltunk 1 yg totál RNS-böl, Promega révére transzkripciós rendszer alkalmazásával, a gyártó eljárása szerint

F$áve»riíariv ás vette.·? itte/S PCÁ Jíwkíí?! esAerosgítteroísfeís.szá-waső, Aunré«/ó-éő-rn és Zó-MBP-rc

Félkvanthattv FCR-reakciókat 50 td össztérfog&thao végeztetik, I U AmphTTaq DNS-peíirseráz (Perkb Elmer, Roche, USA), 2,5 »M dNTP-k (Aramban, USA) és 50 pmol előremenő és reverz PCR lánciaditó ollgonukleotid jelenlétében. A reakcióelegyeket “PTC-290 Peitier Bftset” (M.1 Research, USA) cikíizáló termosztátban inkbbálttik az alábbi körülmények között; denaíarátás I percig 94*C~on, összehihridizálás I percig 55*-ot: és iánehosszabbítás 1 percig 72Á7oö, Annak biztosítása céljából, hogy a PCR-reakcíő lineáris fázisa alatt tegyenek összehasonlítva a PCR-lsrmékek mennyiségét, IL-lSEtP-f, IL-18-a.t és.β-akriöt 25, 25 és 31 ciklus «tár? analizáltunk, Meghatároztuk az optimális ciklus-számot lU-lSBP-re, IL-IS-ra és β-aktmra a csíkok telítődése előtt (31, 28 és 25, sorrendben). PCR láncindko oftgonukleütídokat terveztünk közölt szekvenciákra alapozva (ÁF1ÍÖ799, D49950, XIXGS!) az alábbiak szerint: IL-IS, reverz: 5’CCGTCACTACACTCÁGCTAA-Γ; előremenő 5’~GCCTáGAGGTATGG€TGTAA~3’; ΓΕ-188P, előremenő 5’-ACCTGTCTACCTGGAGTGAA-3’; reverz 5⁵-GGACGA.AGÁTAGGAAGl'CTG-3’; β-aksjn, reverz. 5’GGAGGAGCAATGATCTIGATCTTC-3’; előremenő 5’~GCTCACCATGGÁTGATGATATCG€~3’. A mintában lévő, potenciális genomi DNS-szennyeződések mnplrfrkádőjának kizárása céljából, PCR-reakciőkat végeztünk cDNS-tempiát jelenlétében. A PCR-termékeket I %-os agaroz-gélen eleklroforettzálftik 1 x TAE-pofferben. A RCR-termékek méretét 1 kb-os móllőuísg-íétráboz (Gíbco) hasonlítva igazoltuk, a gélek festése ólán. Az ©íidmm-bromíddal léstett csíkok relatív mennyiségét UY-ieny alatt határoztak meg, Kodak Digital Sciences analitikai szoftver alkalmazásával,. a célgén (bIL-i 88 P) és belső kontroll („höttsekeepisg*) gén (hb-akfe) arányaként közöljük.

„SYBR Green” valós idejű PCR iáncinditó ísligonaklsoíídokat 1L-1 S-feoz, IL-I SBP-hez és GAPDH-hez (belső Gnousekeeping” kontroll) a PB Biosystems cég állal forgalmazott „Primer Express* szoftver alkalmazásával tervezőtek közölt szekvenciák (AF11Ö799, D4995Ö, NM 002846) alapján: IL-18, reverz 5'CAGCCGCTTTAGGAGGCAG'; előremenő 5’-CAÁGGAATTGTCTCCGAGTGC-3'; 1L-18BP, reverz 5’AACCAGÖCTTGAGCGTTCC-3'; előremenő S’-TCCCATOTCTCTGCTCATtFAGTC-S’; GAPUH, reverz 5’-GATGGG ATn CCATTGAl'GACA-3U előremenő 5⁵-CTGTGCTCCCACTCCIGAITTC-3^!, Teszteltük a specifitásí és a Iáncinditó oligonukleotláok optimális koncentrációját. Potenciális genomi UNS-szesnyezést specifikus istron-GAPDH Iáncinditó oligonkkleolidokkal végzett PCR-reakciókban zártuk ki. Azt, hogy nem volt ^specifikus amplifikáeió, a PCR-fertnékek analizálásával igazoltuk 3,5%-os agaróz-géielektroforézisben, „SYBR. Green” valós idejS PCR-l reakciónként 5 td RT-fermék (0,5 ng totál RNS), 25 pl SYBR Green PCR. uíiotakeverék (PB Biosystem, CA, USA) hozzáadásával, AmpErase aracsl N-glikoziláz (UNG) (0,3 egységfteakcióheiv) és 28 td Iáncinditó oligosukleötid (3ÖÖ suM) alkalmazásával végeztünk. PCR-t 5(ttC-en végeztünk, 2 percig (AtnpErase GNG Inkahálős, bármilyen DNS-be épült uracii eltávolítása céljából), 95%3-on 18 percig (ÁmpliX&q Gold aktiválás) és azután 48 ciklus 95®C-on 15 másodpercig, őiRC-en 1 percig ÁBl PRXSM 7700 áetekclős rendszeren, A reverz átírt cDNS-mlníákst tehát ampftfskáltak és meghatároztak Ct-énékbket (ciklus küszöbérték), Minden Ct-éttéket nomralizálttmk egy belső („housekeeping”) kontrollgénhez, GAPOM-hez. Egyetlen specifikus DNS-esíkof figyeltünk meg EL-18-ra, IL-iSBP-re és GAFDH-ra,

- 18 gélélékttofeaésM-analízís alkalmazásával.

A valós idejű detektálás elve arra alapul ,_sSYBR Gress PCR master mix” alkalmazásával, hogy a PCRterméket közvetlenül detektáljuk a fiuoreszcencb növekedésének stéíésévsl, ssnslyet „SYBR Gteen” idéz elő, ha dupla szálú DNS-hea kötődik.

é&Ofeháo? öno/hÓ

Az adatokat átlagkém + SSM fejeztük ki. Az IL-18 mennyiségeit az egyes csoportok között MannWhiiney-teszí alkalmazásával hasonlitotbik össze, p» értéket tekintettük statisztikailag szignifikánsnak,

ILd g-isfeibitorok védő hatása oxidált öpoproteiaek (oxLSL) által sadnkált, eadotél $e.|tpasad-a~

HSáSÍdülAkíd.

Tenyésztett h-amán, kőldőkvésáböl származó, endotéi sejteket (IfUVEC) ló óra hosszáig kezeltünk oxLDL-el, IL-lS-köíő fehérje vagy asti-lL-1 S-ellenosyag jelenlétébe® vagy miélköl. Az 1, ábrán bemutatotttűt szerint, a 1TÜVEC 83%-a elpusztult oxLDÉ-kezelés után. IL-lkBP-vel vagy ariö-iL-18-eEenursyaggai való együtt-rnkuhálás majdnem teljeses megmentette a sejteket, a pusztulástól. Nem figyeltünk meg sejtpusztalást IL-ISBP-t alkalmazva. A sejtek 89%~a túlélt aatWL-18-elíenaayag alkalmazásával.

A kísérlet eredménye- világosan matatja- kél különböző ít~l 8-irshíbitoi védő hatását apoptotikus sejtpusztulással szemben, az atheroszklerotíkus.plakkban..

It-IS-fehferle .és endogén Inhibitora, 1L-1RBP expresszié ja athereszkleretikus nlakkokhau

Western-bloí-analizist végeztünk. 12, nyak! -vetőéiből származó atheroszklerotikus artériából és 5 normál körittollból származó fehésjeextrakrumön., IL-IS-fehérje, beleértve az aktív formát, nagymértékben expresszáiődik valamennyi atoeroszklerráikas plakkbsn, míg kismértékben, vagy egyáltalán nem detektálhatóexpresszió' normál artériákban (2. ábra). Az 1-4. sávokba atheroszklerotikus plakkokböl származó mintákat, az 5-7. sávokba normál artériákból szfenszó mintákat vittünk léi. Érdekes, hogy az 11-IS aktív formájának detektálása összhangban van kaszpáz-I (amely szerepet játszik sz ll-dS-folyarnaísorban) aktív formájának expresszíójávsi (2. ábra, 4. sor). IL-lS-reeeptorfebesje (o.-lársc) szigniSkáo» mértékű expresszióját is detektáltuk, valamennyi atheroszkleroirkus plakkban, normál artériákban tapasztalt, nagyon kismértékű expresszióhoz (2. ábra, 2. sor) viszonyítva. Továbbá, az atheröszkferotikös plakkok többsége expresszal IL-lbBP-í, bár az expresszié mértéke- heterogén (2. ábra, 1. sor).

11,-18 és IL-18BP oellnláris lokalizációjának meghatározása céljából, ímmimohisztokémlai vizsgálatokat végeztünk: 6, nyafci verőérböl származó athreoszklerotikus plakkon, A 2. ábrán bemutatottak szerint, 11-18 elsősorban mskrofágokban expresszálódlk, valöszhtöleg ezek a sejtek plakkokbm az 11-IS legjelentősebb forrásai (nem mutatjuk). Ezek a területek CD3~pozitív Ihnfoeítákban is gazdagok. Azonban ágy tűnik, hogy a T-íimfbelták nem játszanak közvetlenül szerepet íL-18-termelésben. 11-18 néhány intímalis (erbelhártya) simaizomsdtben is expresszálóálk, és alkalmanként endoiél sejtekben is. Ezzel ellentétben, szlgnsbkáns mértékű ild&BP-expressxiót detektáltunk 8 plakk mlkroereinek és a lumioalis (belső) felszín endotéi sejtjeiben, bár nem : találtunk expressziét valamennyi érben. Viszonylag kismértékű, és heterogénebb ll-18BF-expressziőt is detektáltunk, főleg extracellulánsaa, bizonyos makrofágokban gazdag területeken.

♦ ** * d,

olakk-lnsfahllitás vonaíkoaaásában

Annak meghatározása eéijáhót hogy humá» 11,.-18--és: It-lSB?-:m.RNS-i exprcs,$.zálódík--e humán nyakí verődben lévő, alkeroszklorotikus piakkokhan, íélkvastkaíív RT-PCR-í végezünk hat atharnszkleroiikus plakk©» (3. ábra). Annak meghatározásacéljából, hogy vajon barnán IL-18- és fL»1.8BP-mRN$ expresszálődik-e nyak! verődben lévő atheroszkieroiikus piszkokban, iélkvafiíiíatlv PCR-t végeztünk hat atheroszkieruükus plakk©» (3. ábra). 1L-18- és IL-lSBP-mR.N'S-t valamennyi atheíOSzkíerofikus píakkban -detektáltunk, bár a tnRNS mennyisége 1L-1S és IL-1SSP esetén heterogén voh. Ezért az IL-18- és IL-IdöP-mRNS-expresszió mértékének pontos meghatározása céljából, 2.3 atheroszklerotikus plakkot tovább analizáltunk „SYBR Greeh” valós idejű RCR-eijárással <4, ábra), A piakkokat kliuikailag és patológiáikig jellemeztük szimptomatikus. (nem stabil) vagy aszimpíomatikus (stabil) plakkokkéuí, amelyek tartalmaztak-e vagy nem makroszkopikus Fekélyt. A páciensek klinikai jellemzését ősszefogiaitnk a 4. táblázatban. A nyakí verőéi átmérőjének csökkenése (6Θ%-95%) és ári» zikőfaktorok, például kor, cukorbetegség, lúperkoleszlerolémia, magas vérnyomás és dohányzás nem különbözött a két csoportban.

(Ltáblázat

Páciensek jellemzése

Kor

Nem

Hípertenziö² Hiperkoseszterolémia' Cukorbeteg jelenleg dohányzik

Aszlmptomatikus Páciensek fs-^;9} 66,9±4,Ö

Féri! (8)

Ssssshussibis Páciensek’ (©“14) ?0,2±3,9 Férfi (9;

Ssykoszorúérbetegség_____1........................................4 (Ezekben a páciensekben tranziens vagy perzisziens iszkémiás eerebráhs infarktus fordult elő 66 nappal az endarterektőmla előtt.

^Klinikai hipertenzióban szenvedő, számos pácienst anúiupertenzlv ágensekkel kezeltek.

''Klinikai hiperkoleszterolémiábars szenvedő,, szásnos pácienst lípídesökenfö drogokkal kezeitek.

Azt találtuk, hogy az 11,- j g mennyisége aktiválással szabályozott módon megnövedetí szimptomatikus atheroszklerotikus plakokkbao, az aszánptotnaókus atheroszklerotikus plakkokkoz viszonyítva (2,03 ± 0,5' illetve 0,67 ± 0,17, sorrendben) (4.A ábra). Statisztikai analízissel kimutattuk, hogy az ÍL-lS-mennyisóg említett növekedése a szimptomakikus plakkokban nagymértékben szignifikáns volt (p<Ö_:,Ő074), míg 1L-18BP mennyiségének megfigyelt növekedése a szimptomatikus plakkokban az aszimptomatikas piarcokban megfigyelt mennyiséghez képest (4,64 * 0,98 illetve 2,5 +1/92, sorrendben) nem volt szignifikáns (4.B ábra). Más szavakkal kifejezve, bár a szimptomatikus és az. aszimpíösaaökus csoportban egyaránt pozitív összefüggés var; az 11,-18- és IL-l8BP~mRNS közöd, a meredekségek szignifikánsan különbözőek a 2 csuporban (szimptomatikus csoport; meredekség 1,16 (0,19-2,14), rt^;i;Ö,3ő, az aszimptomatikus csoport viszont meredekség 4,79 •V

-20*** [2,38-7,201. rM3,?ő; ρ<δ,05>, Ezért úgy tőnik, hegy az ÍL-ISBP-expresszió mértékének -viszonylagos növekedése® tótnptonmfikus csopertem sem elég az IL-íS-exprestóé fokozódásának kompenzálására. Továbbá, mivel a fekélyek megjelenését a plakkok instabilitásának tulaidímltiak, a továbbiakban statisztikai analízist végeztünk olyan pbkkokon, amelyek belsejében volt illetve sem. volt fefcéiyeseáés. ezzel kimutattuk ÍL-i 8 mennyiségének aktiválással szabályozott szignifikáns (p<ö,QlS) növekedését olyan platótokban, amelyek fekélyesedtek (4.C ábra).

Ezek az adatok tó mutatják, hogy az atberoszkierot^us plakkokban az IL-1 S-exprcsszió -mértékének növekedése összhangban van a platós instabilitásával.

5, péter kifejlődését fe stabilitását kénes modulálni a betegség »fdijébea

Módszerek

Pdefemek je/femzése

Akut íszkémlás. koszorúér-megbetegedés szindrómáiban (instabil angina és szívinfarktus): szenvedő páciensektől plazmmniníáfcst vettünk, a szanptótnák megjelenése után 7 napon belül, instabil .anginái.ügy -definiálttá!:, mint tipikus mellkasi Sj'dalommaí asszociált, iszkémiás változások vagy elektekardíogrammos lálbatö elváltozások, vagy koszorúér betegség. A szivinfarktost az-elekörokatdío^same® látható, tipikus iszkéraiás elváltozások alapján diagnosztizáltuk, amely tnlokardiábs (szívizomból származó) enzimek (krestin ioszíbkináz és tropomn-í) keringésben .mért mennyiségének szignifikáns növekedésével asszociált. Nem-iszkétmás pácienseket ugyanebben a kardiológiai intézetben kerestöstk, és ezek teljesen mentesek voltak iszkémtás tünetek®!. Humán ÍL-i S mennyiségéi -a plazmában kereskedelemben rendelkezésre álló reagenskésziet alkalmazásával határoztuk meg (MBL, Japan).

jRágesd/d eredet;). /2-7 expressziós plaznatá in vívc intramvszktiiárfe elekfrűtran&fetfe

Tizennégy C57BL.--'ó apoE-t ki nem fejező, 14 hetes egér háromhetente 3 injekcióban pcDNASiti SBP-jelú, 1L-18BP expressziéi plazmidot kapott A kontrol egereket (n-teő) üres, kon-ttol.1 piazmidclal oltottunk. Leírt eljárás- (23) szerint izolált, rágcsálóból származó IL-18BP d-lzofonna cDNS-t (nyilvántartási száma: Q9Z0M9) s-zubklónoztuafc pcDNA3-je!ö, emlős sejtből származó expressziős vektorba,, chmegalovíruspromóter (ínvitrogen) vezérlete alatt. Az: így kapott, 334.yb~ielő konstrukciót bemutatjuk az 5. ábrán. A kontroll plazmid hasonló volt, de sem. tartalmazott terápiás hatású cDNS-t Az IL-lSBP-t tartalmazó vagy a kontroll expresszié* plaztnidot (óO pg) altatott. egerek felső lábszárfeszítő izmába injektáltuk, leírt eljárás szerint (13), Röviden összefoglalva, anatómián elektromos impulzusokat (8 négyszőg-lmllám elektromos impulzus, 200 V/em) adtunk PS-15-típusá elekíröpulzóíorml (Genetramcs, Franciaország), két rozsdamentes acélból készült l&p-elekttóda alkalmazásával melyeket 4,2-5,3 mm-re helyezőik el egymástól, a végtag két oldalán.

Tálcákat egy éjszakán át burkoltunk r-mlt-lkfid atTmiíástisztitotk nyálban termeltetett, pobkíosófis ellenanyaggal (S pg/tstérőhely). Szoiubibs mlt-lSBE-t bíofinilált, nyálba® termeltetett, poiiklonáB ellenanyag (Ö,3 trg/ml), melyet & cobből származó, rmlL-l&SP ellen termehetíönk (Feprotscs, majd extrsvidm-peroxidáz (l/lööö) (Slgma) alkalmazásával deteklállunk. A kifogó, nyúlban termeltetett, poliklonáli-s ellenanyagot Westera-bloítal- tesztetek az. mlL-ISBP-speeifiíás igazolása céljából. HEK293-sejíekkel, rékomblnánsas íorcneketett ndL-lSBPd-t alkalm-azttmk standardként. Az EUSA érzékenysége 5 mosd volt i

**·>· ,ϊ *·’ί * * ,

Egerek vfcsgáfoíö

Kriosztát-ínetszeteket (8 μχη) készítettünk az aorta sinusból lipidíerakődás detektálása céljából Oüvörös alkalmazásával, és kollagén detektálása céljából Sima-vörös alkalmazásával, valamint immnnohisziokémlai analízis céljából korábban leírt eljárás szerint (13). A metszeteket megfestettük specifikus primer ellenanyagokkal: tett-egér tnakrafágjrs, M0xMA-2-klón (BíoSotsrcc), alkal.ikns foszfatázzai kúpingáit artti-aaktin simaizom-sejtekre és aníi-CDS T-limfocitákra (Dako) specifikus eitetmy agukkal, leöt eljárás szerint (13). Sejlpusztölást TUNEL-tochnika (13) alkalmazásával detektáltunk. CDS -pozitív sejteket ndkroszkópíkusan száml'álttmk vakot alkalmazva, Az aorta sinusban lévő aihcroszklerotíkos plakkokaí, és makrofágokra, simaizomsejtekre,, kollagént» pozitívan festődéit területek vagy TŰNÉL méréséhez kvantitatív számítógépes leképezési analízist (“image quanfification”) (NS1555, Microvision) alkalmaztunk, leírt eljárás szerint (13). Nctnimmun, izotlposra egyező immunglobulinokkal való festéssel határoztuk meg az immunológiát festés speclfitását. A TŰNÉL specifitásáí terminális dezsjánukíeotídil transzferáz euzim hiányával határoztuk meg. A mellkasi aorták szubklávlen artériától veseartériáktg terjedő részét fÖ%-os puffé roll formai innal fixáltuk, és kpiáderakódásra teszteltük öil-vörössel. Azután felnyitottuk azokat longhudináhsaii, és a lipiáierakódás százalékos mennyiségét kvantitatív számítógépes leképezési analízissel (“image qnantíilcation”) (NS1555, Mierovisiou) számítottuk ki.

Ebben a vizsgálatban azt a hipotézist teszte ltük, hogy az íL-lSrtL-ISBP-szabályzás döntő szerepet játszik atfeerogenezisben és plakk-stabílításban. Mértük az 1L-18 plazmába lévő. mennyiségét akut szt-vkoszerúérszmárómába» szenvedő páciensek <30 férfi, IS aő, átlagéletkor 66,2+1,8 év, amelyek közöl 14 instabil anginát és 34 szívinfarktust kapott) és nem-sszkémiás, kontroll páciensek esetén (19 férfi, 3 nő, átlagéletkor 60,0+5,3 év), akiket ugyanebben a kardiológiai intézetben kerestünk. Az 1L-18 mennyisége a plazmában szignifikánsan megnőtt akut szívkoszorór-szindrómában szenvedő páciensekben, a kontrollokhoz viszonyítva (149,9+1?, I viszonyítva 73,0+32,2 pgtol értékhez, sorrendben, p<ö,05), ezzel élteiéiben az. IL-í SBP keringésben mért mennyisége kismértékben emelkedett (20,1+2,7 viszonyítva 7,5+2,5 ag/rnl értékhez, sorrendben, p=d),ö6), Továbbá, az ÍL-18-mennyiségek összhangban voltak a betegség súlyosságával, mivel a legnagyobb mennyiséget azokban a páciensekben figyeltük meg, akik súlyos iszkteiás szívelégtelenségben szenvedtek és pulmonáris ödéma klinikai tüneteit mutatták (224,03+39,1 pg'ml, p«0,9Öl, kosiróltokhoz viszonyítva). Akut ssívkoszoröér-betegségben szenvedő páciensek esetén kapóit eredményeket, továbbá korábbi megfigyelések alapján, amelyek szerint 1L-18 mennyisége szélttfest kapott páciensekben kifejlődött atbreoszklerotíkus piakkokhan megnövekedőit, feltételezzük, hegy az IL-IKTL-lSBB-szabályzás fontos szerepet játszik az alhreoszklerotiknx folyamat szabályzásában.

Ezért ezi az elméletet apoE-í ki nem fejező (KO) egerekben leszíeltük, amelyekben spontán kifejlődnek olyan atheroszfcferoííkus elváltozások, amelyek hasonlóak az emberek kifejlődő ilyen elváltozásokhoz. Tizennégy··, 14-hetes egér kapott ÍL-18BP-kÍegészitésí egéreredeíő IL-.l8BPd-i kódoló expressziós plazmiá-DNS-fcéttt, ifi vfeo írüramuszkulárís eiektrottaaszíerrel, míg 19, azonos életkorú kontroll üres piazmldot kapott. A plazmíd efekttotrattszierjét 3-btenfö megismételtük, és az egereket 23-hstes korukban, 9-hctes kezelés utáa elpusz&tötttik. Rágcsáló eredetű 1L-18BP mennyisége a plazmában kevesebb volt, mim a dstekcíős limit (5 ng/rol), az üres píazmiddal injektált apoE-KO-egerekhen. Azonban JL-ÍSBP-t kódoló plazmid egyetlen injektálása magasabb iL-l8BP-sxhrtekei eredményezett a vérben, amely az Injekció után. 2 nappal ért el maximumot

-221 , * ·* $ (323,5+1(10,9 ng/mlj és 127,4+35,4 sg/ml értékei mértünk 2 héttel később. Akár IL-lSS.P~t kódoló, akár üres

* X X » * ♦♦ ««« «*:

pi&zudddal. '9 hetes kezelés után ax őaszkoleszterín (489,4+34,6· viszonyítva; 489,8*363 mg/di, sorrendben) és a nagy .söröségS Upoprstem (52,3+9,4 viszonyítva 48,8*5,.1 ntg/dl, sorrendben) mennyisége a szérumban nem különbözött a 2 csoportban. Mérsékelt, de szignülkáns figyeltünk meg az állatok tömegében az IL-i&BP-vel kezek csoportban, a kontroli-csoporthoz viszonyítva (3 L8+Ő,9 viszonyítva 28,6+0,8- g értékhez, sorrendben, p<Ö,OS),

11,-1 §BP-kiegőszíiés kimenetelét vizsgáltok atheroszklerózishan, 2 különböző helyen: a leszálló mellkasi aortában és az aorta sinusban. A mellkasi aortát választottuk annak meghatározására, hogy az 1.E-18BP milyen szerepet tölt be a zsírréteg kifejlődésében (aíherogenezisben), mível a mellkasi aortában vannak legkevésbé jelen atheroszklerotíkus elváltozások 14 hetes tóban (az adatokat nem mutatjuk), amikor az ÍL.-1SBPírauszfekcíöf kezdtük. Az aorta sinus, ahol 14 hetes korban már jelen vannak atheroszkíerotikus elváltozások (az adatokat nem mutatják), előrehaladott píakk-pragressziót és plakk-összetéteJt vizsgáltunk, amely a plakkstabilitás fontos meghatározó tényezője. ApoS-t ki nem fejező (K.O) egerek iL-í8BP-veí való kezelése szignifikáns mértékben befolyásolta az atheroszklerotikus kóros elváltozások kifejlődését és progresszióját. A mellkasi aorta vizsgálatával kimutattuk a ilpid-ierakóáás jelentős csökkenését. IL-lSBP-plazraiddaí kezelt egerekben, üres plazmiddai kezelt egerekhez viszonyítva (6, ábra), Kvantitatív számítógépes leképezési analízissel kimutattuk, hogy az atheroszklerotikus kóros elváltozások kiterjedése 69%-al csókkent (p<ö,öŐ01) (6. ábra), ami rámutat az 11-18- atherogertezísben betöltött, döntő fontosság» szerepére. Továbbá, ÍL-1 SBP-t kódoló plazmiddal már 9 hetes kezelés is szignifikánsan korlátozta előrehaladott atheroszklerotíkus plakkok progresszióját az aorta sinusban (a plakk-méret 24%-os csökkenése, ρ~δ,01), üres plazmáddal való kezeléshez kénest (7. ábra).

Még jelentősebb, hogy az előrehaladott, kőrös elváltozások összetételét, amely a. legfontosabb meghatározó tényezője a plakk- íusíabtlkásának, H-i&BP-kezeiés feltűnő mértékben befolyásolta, IL-ISÖP-plazmlddal kezelt egerekben, az atheroszklerotíkus elváltozásokban nagyon, szignifikánsan (p<0,0Ü01), 50%-aI csökkent a makrofög-mfiltráeíö (&. ábra), Ö7%~&1 csökkent a T-lmtfocha-ttataiöm ip<9,0öS) (8. ábra), és a simaizom-sejt felhalmozódásának mértéke 2-szeresére növekedett (p<Ö.O5) (9, ábra). Továbbá, ezek a jelentős változások a celluláris összetételben a köllagéntartniofn szigniőkáns <p<Ö,ÖŐ05), 85%-os növekedésével társultak. Sinusvöröst alkalmazó festéssel meghatározva, és az össz-lipidtartalom csökkent.

Ennélfogva, IL-íSBF-kezelés szignifikánsan csillapította a gyulladásos folyamatot az athroszklerotíkus elváltozásokban, ás olyan gyógyulási folyamatot indukált, amely stabil atheroszkíerotíkns plakkotea jellemző. Továbbá, a l'L-I SSP-vei kezeit egerek kóros elváltozásaiban a gyulladásos tóasponess mértékének jelentős csökkenése a plakkofeban megfigyelt sejfousztulás lényegi csökkenésével társult.(2,9+0,9% IL-lSSF-vel kezelt egerekben, ezzel szemben kontroliokban 10,5 + 3 ,ő%, p<0,ö5), így korlátozta az acelluláris hpid mag expanzióját és trombogén jellegét (Máltát, (1999jj.

Köveíkgrtgtos^:

lói vstídált (érvényesített), humán atheroszklerózis egérben kialakított modelljében a fentebb leírt eredmények nyilvánvalóan alátámasztják IL-lk és Π..-ΙΑ korábban nem- feltételezett és döntő szerepét az atheroszklerotíkus plakk kifejlődésének, progressziójának és stabilitásának szabályzásában. Míg a kőrös elváltozások korai kialakulását megelőzte mellkasi aortában, az íL-lS-aktlvitás gátlása 11,-I ŐBF-klegészítéssel alapvetően befolyásolta előrehaladott elváltozások összetételét az aorta, sinusban is, eltolódást Indukálva stabil plakk-ténotipns irányába.

Atheroxzkierőzisban szenvedő páciensek klinikai prognózisa csak részben függ a károsodás méretétől.

-23φ * « φ » * 2 * * « « φ φ »**#*# » » * ** *«»:? φ» ΦΦφ ¥«« #0

Általánosan ismert, hogy az elváltozás minősége (plakk összetétele), nem a mérete lehet sz Iszkémiás események előfordulására utaló előre jelzés, Valóban, az atheroszklerózis súlyos klinikai manifesztácíóí (szív- és agyi&farictosok) elsősorban az őr belsejének trombns: általi elzáródására vezethetők vissza, amely a sérült atherossklerotlkus piákkal való érintkezésnél képződik (19). Patológiai vizsgálatokban kimutatták, hogy sérülékeny és instabil piakkok, amelyek hajlamosak berepedezésre, vagy már berepedeztek, gazdagok gyulladásos sejtekben, és lényegi módon kevesebb simaizom-sejtet és kollagént tartalmaznak (20, 21). Továbbá, ilyen piakkok esteién szignifikánsan nagyobb mértékű az apopfotíkus sejípusztuiás, amely nagymértékben fiombogén lipld mag kiaksktúásához vezet 03, 22), Érdemes megemlíteni, hogy fokozott plakk-síabilitásra utaló valemennyi említett jel jelentősen gyengíthető IL-lSBf-vel kezeit egerekben, ami azt mutatja, hogy IL-lS-jeltováhbítás a. plakk-instabilltás legfontosabb meghatározó tényezője.

Eredményeink megerősítik, hogy ApoE-t ki nem fejező (KO) egerekkel végzett kísérletek eredményei helytállóak humán betegségre is, amely szerint akut koszorőér-színdrőnákat mutató páciensek keringésében megnövekszik 1L-18 mennyisége, és IL-lS-íerrneles: fokozódik a szélütésért felelős, nyak! verőéiben kialakuló, instabil atheroszklerotikus piakkok megjelenése esetén. Ezek az eredmények együttvéve az IL-I8-aktivitás inhibitorait új terápiás eszközként azonosítják aíheroszklerotikus piakkok kifejlődésének megelőzésére és kezelésére, és a piakkok komplikációnak korlátozására.

ő,

EL~S8 megtsővekedert mennyisége szívelégtelenségben szenvedő rtáelensekben kiújnlő eseményekkel van összhangban

IL-18 mennyiségeit páciensek vérszérumában ELISA-val mértük, IL-tS-specitlkux eltenanyag alkalmazásával.

Összesen 56 iszkémiás vagy nem-sszkémiás, szívelégtelenségben szenvedő vagy aüől mentes pácienst teszteltünk.

Azokban a páciensekben, akik később meghallak, IL-18 mennyisége 21ó,Ö±4l,5 pg/ml volt, ezzel szemben olyan páciensekben, akik életben maradtak, ugyanez 112,2+12,2 pg/ml volt (p^;rtl,0ŐI8).

Olyan páciensekben, akikben nem lépett fel semmilyen kiújuló esemény, például halál, kiújuló iszkémia, re-vaszkslarlÁtcíó, atheroszklerózis progressziója vagy újabb kórházi kezelés szívelégtelenség miatt, az alábbi IL-JS-mennyiségekeí mértük; 165,8+23,8, ezzel szemben olyan páciensekben, akiknél fellépett kiújuld esemény, ugyanez 107,7+14,6 volt t>O3).

Ezek az eredmények azt mutatják, hogy IL-18 mennyisége szignifikánsan megnő olyan páciensekben, akik rossz klinikai prognózissal rendelkeznek, mint például előfordultak kiújuló események, sőt meghaltak.

nem iszkémiás (szívelégtelenségben szenvedő vagy attól mentes) páciensből származó vérmintában megmértük az IL-18 memtyiségét. Azokban a páciensekbe®, akik később meghaltak, az érték 119,8+34,8 pg/ml volt, ezzel szembest olyan páciensekben, akik életben maradtak, ugyanez 9S,3+2Ö,4 pg/ml volt (p~Ö,ö9},

Olyan páciensekben, akikben nem lépett fel semmilyen kiújuló esemény, az IL-lk-mennyisége 146,6+34,4 pg/ml volt, ezzel szemben olyast páciensekben, akiknél fellépett kiújuló esemény, ugyanez 95,4+23,9 volt (ρ^Ο,Οο). Bár az IL-18-nte;tnyíségek különbsége nem érte el statisztikailag szignifikáns értéket, a páciensek kis száma miatt, világos tendenciát lehet megfigyelni IL-18 mennyiségének növekedésében,

Iszkémiás páciensekben, akik később meghaltak, IL-18 mennyisége 118,4+12,8 pg/ml volt, ezzel szemben olyan páciensekben, akik életben maradtak, ugyanez 118,4+12,8 pgyml volt (p~0,007).

- 24 Λ «« ««« ”·ί &

Olyan páciensekben, akikben nem lépett fel semmilyen kiújuló esemény, az IL-18-mennyisége i62,8±24,7 pg/fttl veh, ezzel szemben olyan páciensekben, akiknél fellépett kínjaié esemény, ugyanez f 16ΛΗΟ vdt « * XX

Hivatkozások, jegys^e

I. Ross R. Atberöselerosis-art iniltsrantaiöry disease, N BngI I Msd 1999; 340:1 15-126.

2'. van dér Wal AC, Beste AE, vas dór Loos CM, Das FK. Siíe of inttmaí raprure or erostoa of rórombosed corooary atberosclerotle plaques is charaeierized by au irdlammaíory process teespective of the dorainarsf plaque morphelogy. Circuiation 1994; 89; 36-44.

3. Fuster V, Bárómon L, Hadimon 33, Chesebro JH. The pathogenexis of «oronary srtery disease aad the acate ceronary syndroates fi). N Btgi 3 Med 1992; 326:242-250.

4. Pusíer V, Bárómon L, Hadimon 33, Chesebro JR, The patbogenexis of ooroiwy srtery disease aad. the ácsié coronary syndrames (2). N E&glJMed 1992; 326:310-318.

5. Lee RT, Llbby p, The asstabb atheroma, Arterioseler Thromh Vasé Bioi 1997; 17:1859-1847.

4. Ridte PM, Cushmsn M, Siampíer MT, Trasy RP, Hennekeas €H. Máiamatíon, aspíria, and the risk ef earróovaxcular disease is apparenfly feealthy mén. H Esgl J Med 1997; 336:973-979.

7. Líbfey P. Moiecidar bases of the aeute coronaty synriFomes-. Circulaöon 1995; 91:2844-2.850.

8. Nakamura, K, Gkatuura, H, Nagata, K and Tamara,. T. (1989). Inféct. immun. 57,390-595.

9. Ynshánoto T, Takeda, K, Taaaka, T, Ohkusu, K, Kasfcwsmm, S, Okamura, 11, A&a, S and Natamshx, K (1998). 3. Immunoi 161,3400-3407.

19. Fámét, P, Garka, K E, Bonsert, T P, Dosver, S K, and Sims, 1 E. (1996). 3, ölel. Chem. 271, 3947-3970,

II, DiDosato, 1 A, Hayakawa, M, RoEhwarf D M, Kandi, E and Karfa, M. (1997). Natúré 388, 16514-16517,

12, Novick, D, Kim, S-B, Eantazzi, G, Rezuiköv, L, Dinarello, C, aad Rablnsteln, M (1999). Immnníty 10,127-136,

13, Malist Z, Húgéi B, öhan 3, Leseehe G, Prsyssinet JM, Teáguí A, Shed membráné mieropMicies wdh procoagulatd petential itt humán siheroscterotie plaques. A role tor apoptosls is plaque thronróegenicity. Cheulation 1999; 99: 348-353.

14, Tríeot O, Mailai Z, Heymes C, Hetem 3, Leseehe G, Tedgui A. Relatson Between Esdöthelial Cél! Apopiosís· and Blood. Fiow Dimciion m Hunján AEheröselerotic Piaque,Circniation 2000; m press.

15, Dimmeler 5, Haendeler 1, Gallé í, Zeróer ÁM. Oxidized löw-denxity ilpoprotoin mduces apöptosls of humán endothelial ceiis by aelivatiou of CEF32-hke proteasex. A meehaslstíe due to the ’respoase to injary’ bypöthesls. Cirealaliorj 1997; 95:1749-3.

16, Graatham, Seiesce, Vol. 185, pp, 862-864 (1974),

17, Dísuoeler S, Haendeler 3, Gallé k Zeróer AM. Oxidized Iw-dens&y- iipoprotein róduess apöptosls of tanán endotheKró ceiis by aatívatba of CFP32-l:ilíe proteases; A meehanístk- due to the ’respoass to fepny’ hypothesis. Circulaboa 1997; 95:1760-3,

IS. Mir LM. Humán MF, Gehl j. Rangara R, Rouy D, CaiMaud JM, Hellere F, Bmteiíec D, Scbwariz δ, Scfeermaa D. High eíSeiency gene transfer iato skeleíal rnuscld médiaiad by eleetrh palses. Proc NaO Acad Sej USA 1999; 96: 4262-7,

19. Lee, R.T. & léíbby, P. The unslable aíherotua. Arterioseler Thromh Vasé Bioi 17,1859-1S6? (1997).

X *

2620. Daviea, MJ. The oemposiiion of coronary-_artery plaques {edhorial; comment]. N £h§I J Med 336,

1312-1314(1997),

21, Vinnarú, R., Kolodgte, F.D., Bürke, A.P., Farit, A, & Sefcwartz, S.M. Lessotts from snddcn eorosary death: a eosrsprehesslve morphoioglcal classi&adon sebemé for afheroscisrotíc íesíons. Aríerioseler Tbrernb Vasé Bioi 20, 1262-1275. (2ÖÖ0),

22. Kolodgle, F.D. et &t Locaibetloí? of apoptotie macrephages a( the site of plaqus reptere is seddes coronary deaih (in Process Citaílos). Am J Pafool 157, 1259-1268 (200(1),

23. Kim, S.H. et al. Sriucforal rsqniísínents of six mturally oecerrisg isoferms of (he ÍL- 18 bindlsg protein. $o inhihit 1L-18, Proe Kati Aesá Se: Ll S A 97, 119Ö-1195 (2006).

24, Ehioíí, M.J., Mató, P.N., Példmam, M,, Losg-Fox, A., Charles, P._f Bljl, PL, ásd Woody, J.N., 1994, Láncét 344, 1125-1127.

25. Kníght DM, Trlnfe H, Le J, Sisgel S, Sfeealy D, McDonough M, Scalion B, Moore MA, Vilcek I, Daddooa F, et at Cosstrseíson and lnííia.1 charaeíerízatios of a roome-human ehímeric anti-TNF antibody.Mol immunoi 1993 Nov 30: 16 1443-53

26. Tueci, A., James, PL, Chicheportiehe, R., Bonnefoy, J,Y„ Dayer, J.M., ásd Zabler, R.H., 1992, JJmmtmol 148,2778-2784.

27. Fsgelmann, H., D. Novick, and D.. Waliach. 199(1. Two tumor necrosss feeíor-bindisg proteiss pnrified front humán uríne. Evsdence for smmunological cross- _ reaeíivity with cell snrface tumor seerosls factor receptora. .1. 8i»L Cfrera, 265:1531-1536.

28, Moore WS_s. Barmit 111, Beebe HG, sí ai. Guldelínes for earotid endartereeiomy.. A muMdisciplinary coasensw statement front the Ad Hoc Commiítee, American. Heast Ássoelation. Cfrcuiatioo 1995: 91:566-79.

29, Cbomozymki P, .Sacchí N. Single-step method ef RKA isolatíos by aeld gsasidraai thíocysáatephenol-ehloroforín extracílos. Ami Bfochem 1987; 162:156-9.

Claims (35)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   Μ · *

   ΦΦΧΦ ** » «*«♦ {:. ΪΙ..-18 inhibitor alkalmazása atberoszklerózis kezelésére és/vagy megelőzésére szolgáló gyógyszer előállítására, ahol az ÍL-18 Inhibitor a következőkből állő csoportból van kiválasztva: JL-IS elleni ellenanyagok, bármely !L~ I 8-reeepte alegység vagy IL~18-köí6 fehérje (IL-iSBk) elleni antitest, IL-18BP 'konzervatív aminosav szubsztitöciőka! tartalmazó muteipje, ll,~i8BP ás immunglobulinrselséziánc régiók fúziós fehérjéje és PEGIlált IL-ISBP, ahol a móléin, fúziós fehérje és PLOilálf IL-18BP meghutja IL-lS-kőtő biológiai aktivitását.
2. 2. Az ·. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer atheroszklerotlkos plakk trombózisának kezelésére és/vagy megelőzésére szolgál,
3. 3. Az 1. vagy 2.. Igénypont .szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer atheroszkierotikus plakk-fekély kezelésére és/vagy megelőzésére: szolgál..
4. 4. Az előző igérjypontok. bármelyike szerinti áfaisnaszás;, ahol a gyógyszer atheroszkterotikus plakk destabilizálódásának kezelésére és/vagy megelőzésére szolgál,
5. 5. Az előző igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol & gyógyszer stheroszkterotikus plakk destabilizálódására visszavezethető, íszkcmiás szimirőmák kezelésére é&'vagy megelőzésére szolgál.
6. 6. Az előző igénypontok bármelyike szeritől alkalmazás, ahol a gyógyszer sfheroszkleroiiktís plakk· berepedezésének kezelésére és/vagy megelőzésére szolgál..
7. 7,. ?\z előző Igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az lL~lS~inhsbitorIL-18 elleni ellenanyag.
8. 8, /Íz előző igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az ellenanyag humanizált ellenanyag.
9. 9. Az előző igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az ellenanyag humán ellenanyag, lő.
10. Az i-ó, igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az 31-18 inhibitor 11-18BP, konzervatív aminosav szubsztitúciókat tartalmazó íL-18BP-mutein, íL-lSBP és Immunglobulin nehézláoc régiók fúziós fehérjéje vagy PBGifált IL-1S8P, ahol a mutefe, fúziós fehérje vagy PEGilált IL-I8BP megtartja IL-18-kötó biológiai aktivitását,
11. 11. A iö. Igénypont szerinti alkalmazás, ahol a fúziós fehérje immunglobulin része IgGl vagy 3gG2 izoíipusú,
12. 12. Az előző igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer tartalmaz interferont is, egyidejűleg, szekvenciálisán vagy elkhlönlícttsn történő alkalmazásra.
13. 13. A 12. igénypont szedni; alkalmazás, ahol az: interferon p-inísíferoo.
14. 14. Az előző igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer tartalmaz tumor nekrőzis faktor (TNP) asíagortistái is szimultán, szekvenciálisán vagy elkülönítetten történő alkalmazásra.
15. 15- A 14. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a íNF-antagonista TBEI és/vagy TBP1L lő.
16. Az előző igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer tartalmaz COX-isbibitort is, szimultán, szekvenciálisán vagy elküiőnitetíen történő alkalmazásra.
17. 17. A ló. igénypont: szerinti alkalmazás, ahol a CöX-mbihitor CÖX-2-iuhibitor.
18. 18. Az előzd igénypontok, bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer tartalmaz tro;r;bosán-inhibitort is, szimultán:, szekvenciálisán vagy elktliöaitetten történő alkalmazásra.
19. 19. A 18, igénypont szerinti alkalmazás, ahol a íromboxán-htitibkor aszpirin.

    2ő.
20. Az előző igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszer tartalmaz lípid csökkentő szert Is szimultán, szekvenciálisán vagy elkülönítetten történő alkalmazásra.

    - 2S» «Φ»* ♦« «φ * * * * * *

    X X Φ * φφφ «V ♦ *** κ ΦΦ ·* * φ φ * ·.*

    X * * »·* » φφ «.«« ♦:*-»
21. 21, A 2ö. Igénypont szerinti alkahnazás, ahol a lipkl csökkentő szer ΙΊΜΟ CoA-snhjbsitor.
22. 22, A 21, igénypont szerinti: alkalmazás, ahol a HMö CoA-íahlbitor salait».
23. 23, Az előző igénypontok' bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a gyógyszert alacsony zsírtartalmú és/vagy alacsony fcoleszteroí tartalmú és/vagy alacsony sótartalmú diétával kombináltan alkalmazzák,
24. 24. Az előző igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az 1L-I8~infelfeiior mintegy 0001-18 mghesttömeg-kg vagy mintegy 0,01-5 mg/iesttőmeg-kg vagy mintegy 0,1-3 mg/tesrtömeg-kg vagyát -mtegy 1-2 mg/iesitörneg-kg mennyiségben alkalmazandó,
25. 25. Az előző igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az il.-lk-mhihítm' mintegy 0,1-1000 pg/testtömeg-kg vagy mintegy 1-iOö pg/tesdőmeg-kg vagy mintegy 10-50 pg/íesítömeg-kg mennyiségben alkalmazandó.
26. 26. Az előző igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az lL-18-mbibiíor szubkatán alkalmazandó.·
27. 27, Az előző igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az Π.,-18-inhibitor Iniramoszknlárisan alk&lnmzmtáő.
28. 28, Az előző igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol azI.L-18-lnhibit<sr naponta alkalmazandó.
29. 29, Az előző igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az ÍL-ÍS-lnhibitor kétnaponta alkalmazandó,
30. 30, .Egy 1L-I k-uibibltor kódoló szekvenciáját tartalmazó expresszlós vektor alkalmazása athercszklerözis kezelésére és/vagy megelőzésére szolgáló gyógyszer előállításához, ahol az íL-18-ínhibitor a következőkből álló csoportból van kiválasztva; 1L-18 elleni ellenanyagok, -bármely H..-18-receptor alegység vagy IL-lS-kŐtö fehérje (IL-iSBF): elleni ellenanyag, konzervatív smisosav szofesziitúoiót tartalmazó IL-1 SBP-matein, IL-I8BP és iímnonglobídln ne-hézlánc régiók fúziós fehérjéje es PEGilált 1L-18BP, ahol a nsníeln, lazíés fehérje és PBGiiált 1L-18SP megőrzi IL-íS-kötő biológiai aktivitását.
31. 31, A 30. igénypont: szerinti: alkalmazás, ahol -az expressziős vektort eleköOtranszfer útján alkalmazzák.
32. 32« A 30. vagy 31. igénypont szerinti alkalmazás, almi az expressziős vektort szisztémása alkalmazzák.
33. 33. Az előző igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az expressziós vektort mtrarrmszkulárisao alkalmazzák.
34. 34, 11..-1S termelésére genetikailag módosított sejt alkalmazása aíheroszklerózis kezelésére és/vagy megelőzésére szolgáló gyógyszer előállitásám, ahol az 1L-1 S-inltibitor a következőkből álló csoporttól van kiválasztva: 1L-1S elleni ellenanyagok, bármely IL-18-recepíor alegység vagy .11,-18-kötő fehérje (1L-1SBP) elleni ellenanyag, konzervatív amlnosav szofcsztitöciőt tartalmazó .1L-1S.BF nmteinje, IL-I8BP és: intntönglobulin nehőzláne régiók föziős fehérjéje és FBGiiúlí 1L-18SF, ahol a móléin, fúziós lekérte és PEGIlált 1L-I88F megtartja lL-18-kőtö biológiai aktivitását,
35. 35.1L-18 alkalmazása afneroszklerózis progressziójának /« viízo dí&gnosztíkos markerekéat

    A meghatalmazott: