BG107218A - Използване на il-18 инхибитори за лечение и/или предпазване от атеросклероза - Google Patents
Използване на il-18 инхибитори за лечение и/или предпазване от атеросклероза Download PDFInfo
- Publication number
- BG107218A BG107218A BG107218A BG10721802A BG107218A BG 107218 A BG107218 A BG 107218A BG 107218 A BG107218 A BG 107218A BG 10721802 A BG10721802 A BG 10721802A BG 107218 A BG107218 A BG 107218A
- Authority
- BG
- Bulgaria
- Prior art keywords
- inhibitor
- medicament
- atherosclerosis
- treatment
- prevention
- Prior art date
Links
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 title claims abstract description 195
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 title claims abstract description 126
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims abstract description 85
- 230000002265 prevention Effects 0.000 title claims abstract description 57
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 claims abstract description 425
- 102000003810 Interleukin-18 Human genes 0.000 claims abstract description 423
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 73
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 63
- 108010070145 interleukin-18 binding protein Proteins 0.000 claims description 241
- 102000044166 interleukin-18 binding protein Human genes 0.000 claims description 239
- 208000037260 Atherosclerotic Plaque Diseases 0.000 claims description 104
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims description 62
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 50
- 230000037396 body weight Effects 0.000 claims description 46
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 claims description 42
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 claims description 40
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 claims description 38
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 37
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 37
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 claims description 33
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 claims description 33
- 102100035017 Interleukin-18-binding protein Human genes 0.000 claims description 32
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 claims description 28
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims description 28
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 28
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 28
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 28
- 102000004557 Interleukin-18 Receptors Human genes 0.000 claims description 26
- 108010017537 Interleukin-18 Receptors Proteins 0.000 claims description 26
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims description 22
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims description 22
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 claims description 22
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 21
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 21
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims description 18
- -1 muteins Proteins 0.000 claims description 17
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 claims description 16
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 14
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 claims description 12
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims description 12
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 12
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 claims description 12
- 101710205006 Interleukin-18-binding protein Proteins 0.000 claims description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 11
- 229940124638 COX inhibitor Drugs 0.000 claims description 10
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 10
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 10
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 claims description 10
- RZWIIPASKMUIAC-VQTJNVASSA-N thromboxane Chemical compound CCCCCCCC[C@H]1OCCC[C@@H]1CCCCCCC RZWIIPASKMUIAC-VQTJNVASSA-N 0.000 claims description 10
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 9
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical group CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 claims description 8
- 229960001138 acetylsalicylic acid Drugs 0.000 claims description 8
- 229940111134 coxibs Drugs 0.000 claims description 8
- 239000003255 cyclooxygenase 2 inhibitor Substances 0.000 claims description 8
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 8
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 claims description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 8
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 6
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims description 6
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 claims description 4
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 claims description 4
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 claims description 4
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 claims description 4
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims description 4
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims 6
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 claims 6
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 claims 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 67
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 60
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 59
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 59
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 56
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 54
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 50
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 42
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 40
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 40
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 36
- 238000011161 development Methods 0.000 description 36
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 description 34
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 32
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 31
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 30
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 30
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 30
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 28
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 27
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 26
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 25
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 24
- 101001019591 Homo sapiens Interleukin-18-binding protein Proteins 0.000 description 23
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 22
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 22
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 22
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 22
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 21
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 20
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 20
- 210000003291 sinus of valsalva Anatomy 0.000 description 20
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 18
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 18
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 18
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 18
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 18
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 16
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 16
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 16
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 14
- 210000002376 aorta thoracic Anatomy 0.000 description 14
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 14
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 14
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 14
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 14
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 14
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 description 14
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 14
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 14
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 14
- 102100035904 Caspase-1 Human genes 0.000 description 12
- 108090000426 Caspase-1 Proteins 0.000 description 12
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 12
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 12
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 12
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 12
- 238000013171 endarterectomy Methods 0.000 description 12
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 12
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 12
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 12
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 10
- 101150037123 APOE gene Proteins 0.000 description 10
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 10
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 10
- 101100216294 Danio rerio apoeb gene Proteins 0.000 description 10
- 101000960954 Homo sapiens Interleukin-18 Proteins 0.000 description 10
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 10
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 10
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 10
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 10
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 10
- 230000034994 death Effects 0.000 description 10
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 10
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 10
- 102000043959 human IL18 Human genes 0.000 description 10
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 10
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 10
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 10
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 10
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 10
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 10
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 9
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 8
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 8
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 8
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 8
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 8
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 8
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 8
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 8
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 8
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 8
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 8
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 8
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 8
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 8
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 230000002885 thrombogenetic effect Effects 0.000 description 8
- 229940121710 HMGCoA reductase inhibitor Drugs 0.000 description 7
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 7
- 239000002471 hydroxymethylglutaryl coenzyme A reductase inhibitor Substances 0.000 description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 7
- 208000004476 Acute Coronary Syndrome Diseases 0.000 description 6
- 206010002388 Angina unstable Diseases 0.000 description 6
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 6
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 6
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 6
- 208000007814 Unstable Angina Diseases 0.000 description 6
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 6
- 201000008247 brain infarction Diseases 0.000 description 6
- 208000006170 carotid stenosis Diseases 0.000 description 6
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 6
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 6
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 6
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- 201000004332 intermediate coronary syndrome Diseases 0.000 description 6
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 6
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 6
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 6
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 6
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 6
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 description 6
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 6
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 6
- DSNBHJFQCNUKMA-SCKDECHMSA-N thromboxane A2 Chemical compound OC(=O)CCC\C=C/C[C@@H]1[C@@H](/C=C/[C@@H](O)CCCCC)O[C@@H]2O[C@H]1C2 DSNBHJFQCNUKMA-SCKDECHMSA-N 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 6
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 6
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 6
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 5
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010002329 Aneurysm Diseases 0.000 description 4
- 206010002383 Angina Pectoris Diseases 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001268 Cholestyramine Polymers 0.000 description 4
- 229920002911 Colestipol Polymers 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 4
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 4
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEMJJKBWTPKOJG-UHFFFAOYSA-N Gemfibrozil Chemical compound CC1=CC=C(C)C(OCCCC(C)(C)C(O)=O)=C1 HEMJJKBWTPKOJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 101000934372 Homo sapiens Macrosialin Proteins 0.000 description 4
- 101500028161 Homo sapiens Tumor necrosis factor-binding protein 1 Proteins 0.000 description 4
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 4
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 4
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 4
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 4
- 108010028554 LDL Cholesterol Proteins 0.000 description 4
- 238000008214 LDL Cholesterol Methods 0.000 description 4
- 102100025136 Macrosialin Human genes 0.000 description 4
- PCZOHLXUXFIOCF-UHFFFAOYSA-N Monacolin X Natural products C12C(OC(=O)C(C)CC)CC(C)C=C2C=CC(C)C1CCC1CC(O)CC(=O)O1 PCZOHLXUXFIOCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 4
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 238000010818 SYBR green PCR Master Mix Methods 0.000 description 4
- 208000034189 Sclerosis Diseases 0.000 description 4
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 4
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 4
- 102400000089 Tumor necrosis factor-binding protein 1 Human genes 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 4
- 210000001715 carotid artery Anatomy 0.000 description 4
- 238000013172 carotid endarterectomy Methods 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 4
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 4
- GMRWGQCZJGVHKL-UHFFFAOYSA-N colestipol Chemical compound ClCC1CO1.NCCNCCNCCNCCN GMRWGQCZJGVHKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960002604 colestipol Drugs 0.000 description 4
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 210000004177 elastic tissue Anatomy 0.000 description 4
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 4
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 4
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 4
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 4
- 230000003176 fibrotic effect Effects 0.000 description 4
- 229960003627 gemfibrozil Drugs 0.000 description 4
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 4
- 230000036541 health Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 4
- 230000031037 interleukin-18 production Effects 0.000 description 4
- 102000008625 interleukin-18 receptor activity proteins Human genes 0.000 description 4
- 108040002014 interleukin-18 receptor activity proteins Proteins 0.000 description 4
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 4
- PCZOHLXUXFIOCF-BXMDZJJMSA-N lovastatin Chemical compound C([C@H]1[C@@H](C)C=CC2=C[C@H](C)C[C@@H]([C@H]12)OC(=O)[C@@H](C)CC)C[C@@H]1C[C@@H](O)CC(=O)O1 PCZOHLXUXFIOCF-BXMDZJJMSA-N 0.000 description 4
- 229960004844 lovastatin Drugs 0.000 description 4
- QLJODMDSTUBWDW-UHFFFAOYSA-N lovastatin hydroxy acid Natural products C1=CC(C)C(CCC(O)CC(O)CC(O)=O)C2C(OC(=O)C(C)CC)CC(C)C=C21 QLJODMDSTUBWDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 4
- 210000001349 mammary artery Anatomy 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 description 4
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 4
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- FYPMFJGVHOHGLL-UHFFFAOYSA-N probucol Chemical compound C=1C(C(C)(C)C)=C(O)C(C(C)(C)C)=CC=1SC(C)(C)SC1=CC(C(C)(C)C)=C(O)C(C(C)(C)C)=C1 FYPMFJGVHOHGLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960003912 probucol Drugs 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 4
- 210000002254 renal artery Anatomy 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 230000000250 revascularization Effects 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- PFBLRDXPNUJYJM-UHFFFAOYSA-N tert-butyl 2-methylpropaneperoxoate Chemical compound CC(C)C(=O)OOC(C)(C)C PFBLRDXPNUJYJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 4
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 3
- 101710187743 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Proteins 0.000 description 3
- 102100033732 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Human genes 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 108010085203 methionylmethionine Proteins 0.000 description 3
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 2
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 2
- NTAZNGWBXRVEDJ-FXQIFTODSA-N Arg-Asp-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NTAZNGWBXRVEDJ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- 206010003211 Arteriosclerosis coronary artery Diseases 0.000 description 2
- BZMWJLLUAKSIMH-FXQIFTODSA-N Asn-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BZMWJLLUAKSIMH-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- ZYPWIUFLYMQZBS-SRVKXCTJSA-N Asn-Lys-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N ZYPWIUFLYMQZBS-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 2
- 201000006474 Brain Ischemia Diseases 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 2
- 206010008120 Cerebral ischaemia Diseases 0.000 description 2
- 206010008479 Chest Pain Diseases 0.000 description 2
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 201000000057 Coronary Stenosis Diseases 0.000 description 2
- 206010011089 Coronary artery stenosis Diseases 0.000 description 2
- 101000828805 Cowpox virus (strain Brighton Red) Serine proteinase inhibitor 2 Proteins 0.000 description 2
- 102000004420 Creatine Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108010042126 Creatine kinase Proteins 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 2
- 102100033215 DNA nucleotidylexotransferase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 101150064015 FAS gene Proteins 0.000 description 2
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 description 2
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 2
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 2
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 2
- CHDWDBPJOZVZSE-KKUMJFAQSA-N Glu-Phe-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O CHDWDBPJOZVZSE-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 2
- 108010023302 HDL Cholesterol Proteins 0.000 description 2
- 108010010234 HDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000015779 HDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 208000010496 Heart Arrest Diseases 0.000 description 2
- OMNVOTCFQQLEQU-CIUDSAMLSA-N His-Asn-Asp Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N OMNVOTCFQQLEQU-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- 102000004286 Hydroxymethylglutaryl CoA Reductases Human genes 0.000 description 2
- 108090000895 Hydroxymethylglutaryl CoA Reductases Proteins 0.000 description 2
- 206010058558 Hypoperfusion Diseases 0.000 description 2
- 102000002227 Interferon Type I Human genes 0.000 description 2
- 108010014726 Interferon Type I Proteins 0.000 description 2
- 102000019223 Interleukin-1 receptor Human genes 0.000 description 2
- 108050006617 Interleukin-1 receptor Proteins 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- WPIKRJDRQVFRHP-TUSQITKMSA-N Leu-Trp-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O WPIKRJDRQVFRHP-TUSQITKMSA-N 0.000 description 2
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 2
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 2
- ZYTPOUNUXRBYGW-YUMQZZPRSA-N Met-Met Chemical compound CSCC[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CCSC ZYTPOUNUXRBYGW-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 230000005679 Peltier effect Effects 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- JMCOUWKXLXDERB-WMZOPIPTSA-N Phe-Trp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 JMCOUWKXLXDERB-WMZOPIPTSA-N 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- AIOWVDNPESPXRB-YTWAJWBKSA-N Pro-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@@H]2CCCN2)O AIOWVDNPESPXRB-YTWAJWBKSA-N 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 206010037423 Pulmonary oedema Diseases 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 2
- 206010063897 Renal ischaemia Diseases 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- RYMZZMVNJRMUDD-UHFFFAOYSA-N SJ000286063 Natural products C12C(OC(=O)C(C)(C)CC)CC(C)C=C2C=CC(C)C1CCC1CC(O)CC(=O)O1 RYMZZMVNJRMUDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IOVBCLGAJJXOHK-SRVKXCTJSA-N Ser-His-His Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 IOVBCLGAJJXOHK-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 2
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 2
- 208000001435 Thromboembolism Diseases 0.000 description 2
- 208000032109 Transient ischaemic attack Diseases 0.000 description 2
- 102000013394 Troponin I Human genes 0.000 description 2
- 108010065729 Troponin I Proteins 0.000 description 2
- 101710187830 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Proteins 0.000 description 2
- 102100033733 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Human genes 0.000 description 2
- CGDZGRLRXPNCOC-SRVKXCTJSA-N Tyr-Cys-Cys Chemical compound SC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 CGDZGRLRXPNCOC-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- CGWAPUBOXJWXMS-HOTGVXAUSA-N Tyr-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 CGWAPUBOXJWXMS-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 2
- 102000006943 Uracil-DNA Glycosidase Human genes 0.000 description 2
- 108010072685 Uracil-DNA Glycosidase Proteins 0.000 description 2
- 208000002223 abdominal aortic aneurysm Diseases 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 2
- AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N alpha-glycerophosphate Natural products OCC(O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002399 angioplasty Methods 0.000 description 2
- 230000003276 anti-hypertensive effect Effects 0.000 description 2
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 2
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 2
- 125000003435 aroyl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000036523 atherogenesis Effects 0.000 description 2
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 210000001043 capillary endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 125000001589 carboacyl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 206010008118 cerebral infarction Diseases 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 2
- 208000037893 chronic inflammatory disorder Diseases 0.000 description 2
- 238000005056 compaction Methods 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000254 damaging effect Effects 0.000 description 2
- 238000001804 debridement Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 2
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 230000010339 dilation Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 230000004528 endothelial cell apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 2
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 239000012520 frozen sample Substances 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 125000003827 glycol group Chemical group 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001046 green dye Substances 0.000 description 2
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 2
- 230000005986 heart dysfunction Effects 0.000 description 2
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 102000043827 human Smooth muscle Human genes 0.000 description 2
- 108700038605 human Smooth muscle Proteins 0.000 description 2
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 2
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 2
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 2
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 2
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 2
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 2
- 108010027775 interleukin-1beta-converting enzyme inhibitor Proteins 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 208000023589 ischemic disease Diseases 0.000 description 2
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 235000004213 low-fat Nutrition 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 230000013227 macrophage apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000000116 mitigating effect Effects 0.000 description 2
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 2
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 2
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 2
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 2
- YFCUZWYIPBUQBD-ZOWNYOTGSA-N n-[(3s)-7-amino-1-chloro-2-oxoheptan-3-yl]-4-methylbenzenesulfonamide;hydron;chloride Chemical compound Cl.CC1=CC=C(S(=O)(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)CCl)C=C1 YFCUZWYIPBUQBD-ZOWNYOTGSA-N 0.000 description 2
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 231100001160 nonlethal Toxicity 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 2
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 239000008180 pharmaceutical surfactant Substances 0.000 description 2
- 108010083476 phenylalanyltryptophan Proteins 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- 230000006461 physiological response Effects 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 2
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 230000034190 positive regulation of NF-kappaB transcription factor activity Effects 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000002947 procoagulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 2
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 2
- 208000005333 pulmonary edema Diseases 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 description 2
- 210000000574 retroperitoneal space Anatomy 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 2
- 229960002855 simvastatin Drugs 0.000 description 2
- RYMZZMVNJRMUDD-HGQWONQESA-N simvastatin Chemical compound C([C@H]1[C@@H](C)C=CC2=C[C@H](C)C[C@@H]([C@H]12)OC(=O)C(C)(C)CC)C[C@@H]1C[C@@H](O)CC(=O)O1 RYMZZMVNJRMUDD-HGQWONQESA-N 0.000 description 2
- 238000012868 site-directed mutagenesis technique Methods 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- 230000005586 smoking cessation Effects 0.000 description 2
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 2
- AWUCVROLDVIAJX-GSVOUGTGSA-N sn-glycerol 3-phosphate Chemical compound OC[C@@H](O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 2
- 239000000344 soap Substances 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 2
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 210000003270 subclavian artery Anatomy 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 2
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 2
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000011285 therapeutic regimen Methods 0.000 description 2
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 2
- 210000000779 thoracic wall Anatomy 0.000 description 2
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 231100000563 toxic property Toxicity 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 201000010875 transient cerebral ischemia Diseases 0.000 description 2
- IHIXIJGXTJIKRB-UHFFFAOYSA-N trisodium vanadate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-][V]([O-])([O-])=O IHIXIJGXTJIKRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940046728 tumor necrosis factor alpha inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 239000002451 tumor necrosis factor inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- 210000005167 vascular cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- DSGKWFGEUBCEIE-UHFFFAOYSA-N (2-carbonochloridoylphenyl) acetate Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(Cl)=O DSGKWFGEUBCEIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BZBMCJVNCJFKEN-QRPNPIFTSA-N (2s)-2-amino-3-phenylpropanoic acid;1,3-dichloropropan-2-one Chemical compound ClCC(=O)CCl.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 BZBMCJVNCJFKEN-QRPNPIFTSA-N 0.000 description 1
- BNODVYXZAAXSHW-IUCAKERBSA-N Arg-His Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 BNODVYXZAAXSHW-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- NMRHDSAOIURTNT-RWMBFGLXSA-N Arg-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N NMRHDSAOIURTNT-RWMBFGLXSA-N 0.000 description 1
- GMRGSBAMMMVDGG-GUBZILKMSA-N Asn-Arg-Arg Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)CN=C(N)N GMRGSBAMMMVDGG-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- APHUDFFMXFYRKP-CIUDSAMLSA-N Asn-Asn-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N APHUDFFMXFYRKP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- IIFDPDVJAHQFSR-WHFBIAKZSA-N Asn-Glu Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O IIFDPDVJAHQFSR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- FTSAJSADJCMDHH-CIUDSAMLSA-N Asn-Lys-Asp Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N FTSAJSADJCMDHH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- FBODFHMLALOPHP-GUBZILKMSA-N Asn-Lys-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O FBODFHMLALOPHP-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- FRYULLIZUDQONW-IMJSIDKUSA-N Asp-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FRYULLIZUDQONW-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- XAJRHVUUVUPFQL-ACZMJKKPSA-N Asp-Glu-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O XAJRHVUUVUPFQL-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- BUXAPSQPMALTOY-WHFBIAKZSA-N Cys-Glu Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O BUXAPSQPMALTOY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- KPENUVBHAKRDQR-GUBZILKMSA-N Cys-His-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O KPENUVBHAKRDQR-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- KASDBWKLWJKTLJ-GUBZILKMSA-N Glu-Glu-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O KASDBWKLWJKTLJ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- XEKAJTCACGEBOK-KKUMJFAQSA-N Glu-Met-Phe Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N XEKAJTCACGEBOK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- HOIPREWORBVRLD-XIRDDKMYSA-N Glu-Met-Trp Chemical compound CSCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(O)=O HOIPREWORBVRLD-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- XMBSYZWANAQXEV-QWRGUYRKSA-N Glu-Phe Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- VHOLZZKNEBBHTH-YUMQZZPRSA-N His-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CNC=N1 VHOLZZKNEBBHTH-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- MMFKFJORZBJVNF-UWVGGRQHSA-N His-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 MMFKFJORZBJVNF-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- WXDRGWBQZIMJDE-ULQDDVLXSA-N Leu-Phe-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O WXDRGWBQZIMJDE-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- UCBPDSYUVAAHCD-UWVGGRQHSA-N Leu-Pro-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O UCBPDSYUVAAHCD-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- UIIMIKFNIYPDJF-WDSOQIARSA-N Leu-Trp-Met Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)=CNC2=C1 UIIMIKFNIYPDJF-WDSOQIARSA-N 0.000 description 1
- QUYCUALODHJQLK-CIUDSAMLSA-N Lys-Asp-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O QUYCUALODHJQLK-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- OVIVOCSURJYCTM-GUBZILKMSA-N Lys-Asp-Glu Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O OVIVOCSURJYCTM-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- UGTZHPSKYRIGRJ-YUMQZZPRSA-N Lys-Glu Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O UGTZHPSKYRIGRJ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- DZMGFGQBRYWJOR-YUMQZZPRSA-N Met-Pro Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O DZMGFGQBRYWJOR-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- XYVRXLDSCKEYES-JSGCOSHPSA-N Met-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(O)=O)=CNC2=C1 XYVRXLDSCKEYES-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N N-alpha-L-glutamyl-L-phenylalanine Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- CVAUVSOFHJKCHN-BZSNNMDCSA-N Phe-Tyr-Cys Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CVAUVSOFHJKCHN-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- IPVPGAADZXRZSH-RNXOBYDBSA-N Phe-Tyr-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O IPVPGAADZXRZSH-RNXOBYDBSA-N 0.000 description 1
- GZNYIXWOIUFLGO-ZJDVBMNYSA-N Pro-Thr-Thr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GZNYIXWOIUFLGO-ZJDVBMNYSA-N 0.000 description 1
- TYVAWPFQYFPSBR-BFHQHQDPSA-N Thr-Ala-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O TYVAWPFQYFPSBR-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 1
- WJKJJGXZRHDNTN-UWVGGRQHSA-N Tyr-Cys Chemical compound SC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 WJKJJGXZRHDNTN-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- ZSXJENBJGRHKIG-UWVGGRQHSA-N Tyr-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 ZSXJENBJGRHKIG-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- CELJCNRXKZPTCX-XPUUQOCRSA-N Val-Gly-Ala Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CELJCNRXKZPTCX-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 1
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- BULLHNJGPPOUOX-UHFFFAOYSA-N chloroacetone Chemical compound CC(=O)CCl BULLHNJGPPOUOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010025306 histidylleucine Proteins 0.000 description 1
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010054155 lysyllysine Proteins 0.000 description 1
- 108010034507 methionyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 229940096701 plain lipid modifying drug hmg coa reductase inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/06—Antihyperlipidemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/244—Interleukins [IL]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Obesity (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Изобретението се отнася до използването на IL-18 инхибитор за производство на лекарствен препарат, предназначен за лечение и/или предпазване от атеросклероза.
Description
ИЗПОЛЗВАНЕ НА IL-18 ИНХИБИТОРИ ЗА ЛЕЧЕНИЕ И/ИЛИ ПРЕДПАЗВАНЕ ОТ АТЕРОСКЛЕРОЗА
ОБЛАСТ НА ТЕХНИКАТА
Настоящото изобретение е в областта на съдовите заболявания. По-специално, изобретението се отнася до използването на инхибитори на IL-18 за лечение и/или предпазване от атеросклероза.
ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА
Атеросклерозата е широко разпространено и много важно съдово заболяване, но са известни и много други съдови нарушения. Основно, атеросклерозата засяга големите артерии и тези със среден размер и пораженията и включват мастни уплътнения, фобролитични плаки и поражения с усложнения.
Атеросклерозата е хронично възпалително заболяване на артериалната стена, характеризиращо се с прогресивно акумулиране на липиди, като холестерол, клетки, като макрофаги, Т лимфоцити или гладко мускулни клетки и извънклетъчен матрикс (1). Големите отлагания се наричат атероми или плаки, които често съдържат калций. Мастната тъкан може да разрушава стената на артерията, като намалява еластичността на артерията и по този начин пречи на кръвния поток. Евентуално, могат да се образуват тромби около отложените плаки, които по-нататък пречат на кръвния поток, което може да доведе до общо запушване на кръвоносния съд. Обикновено атеросклерозата е свързана с увеличени нива на LDL-холестерол, Lp(a) фибриноген и фактор VII, както и с намалени нива на HDL-холестерол. Рисковите фактори включват увеличена възраст, мъжки пол, пушене, диабет, затлъстяване, високо съдържание на холестерол в кръвта, храни богати на мазнини и хора, индивидуално или фамилно обременени от сърдечно заболяване. Тя най-често причинява исхемия на органите, например като инфаркт на миокарда.
Атеромът е широко разпространено увреждане на артериите, което по-нататък може да се усложни от тромбо-емболизъм. Атероматозните плаки често стесняват лумена на артериите като причиняват исхемия, а понякога атрофия на тъканите в хипоперфузния участък. Сериозните последствия включват симптома на ангина, дължащ се на исхемия на миокарда, сърдечна недостатъчност, дължаща се на исхемия или на не-исхемични случаи и хипертензия, дължаща се на стесняване на реналната артерия и хипоперфузия на бъбреците, чиито физиологичен отговор е повишена секреция на ренин.
Понякога атеросклерозата и артериосклерозата се споменават като отделни патологични състояния и в този случай, атеросклерозата се определя като включваща втвърдяване (склероза) или загуба на еластичност на артериите, дължаща се поспециално на атером, докато артериосклерозата е втвърдяване или загуба на еластичност на артериите, поради каквато и да е друга причина.
Усложненията или последствията от атеросклероза включват коронарно артериални заболявания (атеросклероза на коронарните артерии), недостатъчно кръвоснабдяване, поради обструкция (исхемия/ангина,) остър MI (инфаркт на миокарда, сърдечна атака), транзиторна исхемична атака (TIA) или мозъчен удар и увреждане на кръвоносни съдове, мускули или телесни органи.
Аневризмите, които са постоянни, анормални дилатации на кръвоносните съдове, също са обичайни последствия от атеросклерозата. Атеросклеротичните абдоминални аортни аневризми се развиват обикновено във възрастни пациенти. Те могат да се спукат в ретроперитонеалното пространство. При атеросклеротичните аневризми обикновено има ясно изразена загуба на еластична тъкан и фиброза на медията, главно вследствие на исхемия на мускулът на аортната медия, последвано от освобождаване на макрофагиални ензими, водещи до фрагментация на еластичните фибри.
Медикаментите, които се препоръчват за лечение или предпазване от атеросклероза включват понижаване на мазнините/холестерола в кръвта. По-специално широко се използва терапията за понижаване на LDL-холестерола. Понастоящем найшироко използвани са статините, които са специфични инхибитори на HMG СоА редуктазата. Освен това други компоненти, понижаващи мазнините включват лекарствени препарати като холестирамин, колестипол, никотинова киселина, гемфиброзил, пробукол, ловастатин и други.
Друг подход е да се намали риска от образуване на тромби при установени атероматозни увреждания. Аспиринът, който се счита за специфичен инхибитор на тромбоксан А2 медиираната тромбоцитна агрегация или антикоагулант, може да се използва за намаляване на риска от тромбоза.
Подкожната “балонна ангиопластика” използва катетър с балонно-крайче, за да се изгладят плаките и за да се увеличи кръвният поток преминаващ през запушените участъци. Техниката е подобна на тази, използвана за отваряне на артериите на сърцето, но тя може да се приложи и към много други артерии в тялото. На коронарните артериални стенози се прави байпас е части от вена сафена, зашита с проксималната аорта или чрез дисекция на вътрешната мамарна артерия от стената на гръдния кош и съединяването на дисталния и край с артерия от предната повърхност на сърцето.
Хирургично отстраняване на отлагания (ендартеректомия), може да се препоръча само в някои случаи (например: ендартеректомия на сънната артерия).
Основната препоръка обаче е да се лекуват или да се контролират рисковите фактори, като поддържане на ниско съдържание на мазнини, нисък холестерол и храни с ограничено количество сол и да се спазват препоръките на здравеопазването за лечение и контрол на хипертензия, диабет и други заболявания, понижаване на телесното тегло и преустановяване на пушенето, така както и периодичен преглед за установяване на нормалното състояние и функциониране на сърдечната дейност.
Възпалителният процес е включен при всички различни етапи на атеросклерозата (1). Счита се, че първият етап от атеросклерозата, който може да се контролира, е ендотелиално активиране от различни фактори, включващи по-слаб контакт между клетките, модифицирани липопротеини и про-възпалителни цитокини (1). Много изследвания напоследък показват, че взаимодействията между съдовите клетки и тези на мястото на възпалението са критични за атеросклерозата (1). По-специално, подтискането на определени пред-възпалителни пътища, намалява развитието на атеросклерозата (1).
Възпалението има главна роля при разрушаване на атеросклеротичните плаки и тромбозата (2-5) и следователно повлиява случаите на остри исхемични синдроми и свързаната с тях смъртност (6). Всъщност тежките клинични прояви на атеросклерозата, включващи инфаркти на сърцето, мозъка и други органи, повлияни от атеросклерозата, се дължат главно на запушване на съдовия лумен от тромби, образувани вследствие на контакта с разрушената атеросклеротична плака (3, 4).
Патологичните изследвания показват, че уязвимите или нестабилни плаки, т.е. плаките предразположени към разкъсване или които вече са разкъсани, се различават до голяма степен по клетъчен състав и по състав на матрикса, в сравнение със стабилните плаки, които не са податливи на разкъсване (7). Уязвимите плаки са много във възпалителните клетки (макрофаги и Т лимфоцити) и те съдържат тромбогенна липидна сърцевина и се характеризират с фина фиброзна покривка със значителна загуба на извънклетъчен матрикс (7).
Намаленият синтез на колаген, медииран от провъзпалителния цитокин IFNy и увеличената активност на макрофагиално-получените матрикс деградиращи металопротеинази, са отговорни за изтъняването и чупливостта на фиброзното покритие (7). Разкъсването на чупливото фиброзно покритие излага силно тромбогенната липидна сърцевина в циркулиращата кръв и води до образуване на тромбоза (1, 7). Следователно, счита се, че плътността на клетките вследствие възпалението при дадено атеросклеротично увреждане, е добра индикация за нейната нестабилност.
Клиничната прогноза за пациент с атеросклероза зависи само отчасти от размера на лезията (19;20). Днес е широко разпространено мнението, че по-скоро качеството (състава на плаката), отколкото размера на увреждането може да е дори подобър показател за появата на исхемични случаи. Всъщност, тежките клинични прояви на атеросклерозата (инфаркти на сърцето и мозъка), се дължат главно на запушване на съдовия лумен, поради формиране на тромби, при контакта на разрушената атеросклеротична плака (19). Патологичните изследвания показват, че уязвимите или нестабилни плаки, които са предразположени към разкъсване или които са разкъсани, са богати на възпалителни клетки и показват значителна загуба на гладко-мускулни клетки и съдържание на колаген (20, 21). Освен това, такива плаки показват значително увеличаване на апоптозната клетъчна смърт, водеща до формиране на силно тромбогенна липидна сърцевина (13,22).
Προ-възпалителните цитокини са включени във възпалението.
Цитокинът интерлевкин 18 (IL-18) първоначално е описан като уСинтерферон (IFN-y) индуциращ фактор (8). Той е един ранен сигнал при развитието на Т-лимфоцитните хелперно-клетъчен тип1 (Thl) отговори. IL-18 действа заедно с IL-12, IL-2, антигени, митогени и вероятно други фактори, за да индуцира продукция на IFN-γ. IL-18 увеличава също така продукцията на GM-CSF и IL-2, потенциира анти-СОЗ индуцираната Т клетъчна пролиферация и повишава Fas-медиираното унищожаване на естествените клетки килъри. Зрелият IL-18 се получава от неговия прекурсор, чрез ILΙβ превръщащия ензим (ICE, каспаза-1). Рецепторът на IL-18 се състои поне от два компонента, коопериращи се в свързването на лиганд. Силно- и слабо- афинитетни свързващи места за IL-18 са С намерени в миши IL-12 стимулирани Т клетки (9), което предполага многоверижен рецепторен комплекс. До сега са идентифицирани две рецепторни субединици, като и двете принадлежат към семейството на IL-1 рецепторите (10).
Сигналната трансдукция на IL-18 включва активиране на NF-kB (И)·
Неотдавна от човешка урина е изолиран разтворим белтък, който има силен афинитет към IL-18 и са клонирани човешката и миша кДНКи, така както и човешкия ген (12; WO 99/09063). Белтъкът е означен като IL-18 свързващ белтък (IL-18BP).
IL18BP не е извънклетъчен домен на един от известните IL18 рецептори, а секретиран, естествено циркулиращ белтък. Той принадлежи към ново семейство от секретирани белтъци, включващи по-нататък няколко Poxvirus-кодирани белтъци (12). IL18BP се експресира непрекъснато в далака (12). Белтъкът от урината, така както и рекомбинантният IL18BP, се свързват специфично с IL-18 с голям афинитет и модулират биологичния афинитет на IL-18.
Генът на IL18BP е локализиран в човешката хромозома 1 lql3 и не е открит екзон, кодиращ трансмембранен домен в геномната секвенция от 8.3 kb. При човек са открити четири сплайс варианта или изоформи на IL18BP и са означени като IL18BP а, Ь, с и d, като всичките имат един и същи N-край и се различават по С-краищата си (12).
Четири човешки и две миши изоформи на IL-18BP, получени от сплайсинга на иРНК и открити в различни кДНК библиотеки, са експресирани, пречистени и оценени за свързване и неутрализиране на биологичните активности на IL-18 (23). Човешката IL-18BP изоформа a (IL-18BPa), показва най-голям афинитет към IL-18 с бързо включваща се и изключваща се скорост и дисоциационна константа (K(d)) от 399 рМ. IL-18BP споделя Ig домена на IL-18BP а, с изключение на С-крайните 29 аминокиселини; K(d) на IL-18BP с е 10-пъти по-слаба (2.94 пМ). Независимо от това, IL-18BP а и IL-18BP с неутрализират IL-18 > 95 % при моларен излишък от двете. Изоформите на IL-18BP b и IL-18BP d не притежават пълен Ig домен и не са способни да се свързват или да неутрализират IL-18. Мишите IL-18BP с и IL-18BP d изоформи, притежават идентичен Ig домен и също така неутрализират > 95 % мишия IL-18 при моларен излишък от двете. Обаче мишият IL-18BP d, който има общ С-краен мотив с човешкия IL-18BP а, също така неутрализира човешкият IL-18. Молекулното моделиране идентифицира големи смесени електростатични и хидрофобни свързващи места в Ig домена на IL18ВР, което може да обясни неговият силен афинитет за свързване с лиганда (23).
ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
Изобретението се базира на откритието, че инхибиторът на IL-18 има ясно изразен благоприятен ефект върху развитието на плаките, прогресията на плаките и тяхната стабилност в миши модел на атеросклероза. Инхибиторът на IL-18 не само предпазва образуването на лезии в торакалната аорта, но индуцира също така превключване към стабилен плаков фенотип във вече установените атеросклеротични плаки.
Следователно, изобретението се отнася до използването на IL-18 инхибитор за производство на лекарствен препарат, за предпазване и/или лечение на атеросклероза. Освен това изобретението се отнася до методи за лечение, чрез генно терапевтичен подход, за лечение и/или предпазване от атеросклероза.
КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ГРАФИКИТЕ
Фигура 1 представлява хистограма, показваща процента на преживяване на човешки ендотелни клетки от пъпната вена, след инкубиране само с окислени липопротеини, или инкубирани с комбинация от окислени липопротеини и IL-18 антитяло или IL 18ВР респективно.
Фигура 2 показва Western блот, проведен с белтъчни екстракти от атеросклеротични артерии, в сравнение с контролни артерии. При Western блотинга са използвани антитела насочени срещу IL-18BP (hIL18BP), IL-18 рецепторната а субединица (hIL18Ra), IL-18 (hILl 8) и Каспаза-1 (Каспаза-1 рЮ).
Фигура 3 показва оцветен с етидиев бромид агарозен гел, показващ резултата от RT-PCR анализа за IL-18 и IL-18BP иРНК, в клетки от атеросклеротична плака.
Фигура 4 Типични RT-PCR резултати за IL-18BP и IL-18 в атеросклеротични плаки, в сравнение с експресията на ha-актин (контрола) в симптоматични и асимптоматични плаки.
Фигура 5 показва картата на експресионния вектор, използван за интрамускулен електротрансфер в мишки.
Фигура 6 представлява хистограма, показваща оцветената липидна област в атеросклеротичните артерии. Компютърно създаден образ за количествения анализ на липидно отлагане. Данните представляват средни стойности е s.e.m. (η = 19 за празен плазмид, η = 14 за плазмид IL-18BP). Четирите звезди означават Р < 0.0001.
Фигура 7 представлява хистограма, показваща лезия на аортната синусова област, след IL-lSBP-третиране, в сравнение с контролата (празен плазмид). Компютърно създаден образ за количествения анализ на увредената област. Данните представляват средни стойности с s.e.m. (η = 19 за празен плазмид, η = 14 за плазмид IL-18BP). Двете звезди означават Р < 0.01.
Фигура 8 показва ефектът на третиране с IL-18BP върху съдържанието на увредените възпалителни клетки. Използва се компютърно създаден образ за количествения анализ, за определяне процента на макрофагиално-положителните области (черните ивици) и броят на инфилтрираните Т лимфоцити на mm
(сивите линии) в лезии от аортен синус от контрола (п = 12 за оцветяване на макрофаги, η = 15 за оцветяване на Т лимфоцити) или IL-18BP третирани мишки (п = 13 за макрофаги, η = 12 за Т лимфоцити). Данните представляват средни стойности е s.e.m. Трите звезди означават Р < 0.005; а четирите звезди означават Р < 0.0001.
Фигура 9 показва ефекта на IL-18BP третиране върху лезия на гладко мускулна клетка и съдържание на колаген. Използван е компютърно създаден образ за количествения анализ, за определяне процента на позитивната област от гладко мускулна клетка (черни линии) и натрупването на колаген (сиви линии), в лезии от аортен синус от контрола (п = 6 за гладко мускулни клетки, η = 11 за колаген) и третирани е IL-18ВР мишки (п = 6 за гладко мускулни клетки, η = 13 за колаген). Данните представят средните стойности е s.e.m. Единичната звезда означава Р < 0.05; а двете звезди означават Р < 0.01.
ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
Изобретението се базира на откритието за повишени нива на циркулиращ IL-18 в пациенти, е остри коронарни синдроми и повишена продукция на IL-18, в нестабилни каротидни атеросклеротични плаки, отговорни за мозъчен удар. В допълнение към това е показано, че in vivo електротрансфер на експресионен ДНК плазмид, кодиращ IL-18BP, предпазва развитието на мастни уплътнения в торакалната аорта и забавя развитието на напредналите атеросклеротични плаки в аортния синус, в добре установен миши модел на атеросклероза. Особено важно е, че трансфекцията е IL-18BP плазмида, индуцира дълбоки промени в състава на плаката (намаляване на макрофаги, Т клетки, клетъчна смърт и липидно съдържание и увеличаване на гладко мускулните клетки и съдържание на колаген), което води до стабилен плаков фенотип. Тези резултати показват за първи пъти важната роля на IL-18 инхибиторите, за намаляване развитието на плаки/напредъка и подпомагането на стабилността на плаките.
Следователно изобретението се отнася до използването на IL18 инхибитор за производство на лекарствен препарат, за лечение и/или предпазване от атеросклероза.
Терминът ‘‘предпазване” в контекста на това изобретение, се отнася не само до цялостно предпазване от някакъв ефект, но също така до каквото и да е частично или важно предотвратяване, намаляване, редукция, понижаване или отстраняване на ефекта, преди или в самото начало на заболяването.
Терминът “лечение” в контекста на това изобретение, се отнася до всеки един благоприятен ефект при напредване на болестта, включващ смекчаване, редукция, намаляване или отстраняване на патологичното развитие, след начало на заболяването.
Терминът “инхибитор на IL-18” в контекста на това изобретение, се отнася до всяко молекула, модулираща продукцията на IL-18 и/или действието по такъв начин, че продукцията на IL-18 и/или действието се смекчава, редуцира или фактически се предотвратява частично или напълно, или се блокира.
Инхибитор на продукцията може да е всяка молекула, въздействаща отрицателно върху синтеза, процесинга или узряването на IL-18. Инхибиторите съгласно изобретението могат да бъдат например, супресори на генната експресия на интерлевкина IL-18, антисенс иРНКи, редуциращи или възпрепятстващи транскрипцията на IL-18 иРНК или водещи до деградация на иРНК, белтъци увреждащи коректното нагъване, или частично, или до голяма степен възпрепятстващи съзряването или секрецията на IL-18, протеази разграждащи IL-18, веднъж след като той вече е синтезиран и други подобни. Инхибитор на продукцията може да е Каспаза-1 инхибитора или ICE инхибитора, например като възпрепятства съзряването на IL-18.
Например, инхибитор на действието на IL-18 може да е IL-18 антагонист. Антагонистите могат или да се свързват със или да отделят самата IL-18 молекула със значителен афинитет и специфичност, за да неутрализират частично или напълно IL-18 или IL-18 свързващите места, отговорни за свързването на IL-18 с неговите лиганди (например, подобно на неговите рецептори). Антагонистът може също така да подтисне IL-18 сигналният път, активиран в клетките след свързване на IL-18 рецептора.
Инхибиторите на действието на IL-18 могат да бъдат също така разтворими IL-18 рецептори или молекули, наподобяващи рецепторите, или компоненти, блокиращи IL-18 рецепторите, IL-18 антитела, например подобни на моноклоналните антитела, или какъвто и да е друг компонент или молекула, възпрепятстваща свързването на IL-18 с неговите прицелни места, като по този начин се намаляват или предпазват прицелните вътреклетъчни- или извънклетъчни реакции, медиирани от IL-18.
Атеросклерозата се нарича също така артериосклероза или втвърдяване на артериите. В контекста на настоящото изобретение, терминът атеросклероза включва всички заболявания или болестни състояния на артериите, описвани обикновено като атеросклероза, при които мастният материал се отлага в стените на съдовете, което евентуално води до стесняване и увреждане на кръвния поток, така както и до разкъсване и/или ерозия с образуване на тромби.
Съгласно настоящото изобретение, атеросклерозата включва както склерозата, така и загубата на еластичност на артериите, дължаща се на атером (атеросклероза) или поради каквато и да е друга причина (артериосклероза). Патологичните състояния на атеросклероза, така както и усложненията или последствията от атеросклероза, които се предвиждат да бъдат включени в термина “атеросклероза”, който е използван тук, са описани подробно в “предшестващото ниво на техниката” по-горе.
Развитието на атеросклерозата включва формиране на атеросклеротични плаки и тяхното развитие във все повече и повече нестабилни форми. Следователно изобретението се отнася също така до използването на IL-18 инхибитор за производство на лекарствен препарат, необходим за редуциране или спиране на понататъшното развитие на атеросклерозата.
Запушването на съд при образуване на тромб от атеросклеротична плака, е критично събитие при инфаркт на сърцето и мозъка, които са сред най-вредните последствия на атеросклерозата. Следователно, изобретението се отнася също така до използването на IL-18 инхибитор за производство на лекарствен препарат за лечение и/или предпазване от тромбоза от атеросклеротична плака.
Стабилността на плаката влияе върху развитието на атеросклеротичната плака, към вредна или уязвима плака, което е предпоставка за иницииране на тромбоза. Следователно, понататък изобретението се отнася до използването на IL-18 инхибитор за производство на лекарствен препарат за предпазване и/или лечение на нестабилността на атеросклеротичната плака.
Нестабилната плака е склонна към разрушаване, а разрушаването на плаката може да доведе до тромбоза. Следователно, по-нататък изобретението се отнася до използването на IL-18 инхибитор за производство на лекарствен препарат, за предпазване от ерозия или разрушаване на атеросклеротична плака.
Нестабилността на плаката и тромбозата могат да се дължат например на апоптозна клетъчна смърт, което води до висока прокоагулантна активност и може да е ключово събитие, водещо до тромбоза на разрушените или разкъсаните атеросклеротични плаки, така както и до емболии (13, 14). Показано е, че окислените липопротеини (oxLDL) индуцират макрофагиална и ендотелна клетъчна апоптоза в култура (15). Както е показано в примерите по-долу, сега е открито, че инхибитор на IL-18, е способен да редуцира до голяма степен клетъчната смърт, индуцирана от oxLDL.
Съгласно настоящото изобретение, съвсем изненадващо е намерено, че нивата на IL-18 в кръвта са увеличени значително при пациенти със сърдечна недостатъчност, страдащи от повтарящи се случаи, например като смърт, периодична исхемия, реваскуларизация, прогресивна атеросклероза или ре-хоспитализация при сърдечна недостатъчност, в сравнение с пациентите, които не постъпват повторно в болница. Това повишаване на нивата на IL18 е съобщено специално за тези пациенти, които по-късно умират, в сравнение е тези които преживяват. Повишени нива на IL-18 в кръвния поток се наблюдават както при пациенти е исхемия, така и при пациенти без исхемия.
Следователно, изобретението се отнася също така до използването на инхибитори на IL-18, за производство на лекарствен препарат за лечение и/или предпазване от периодично повтарящи се случаи на сърдечна недостатъчност. Периодично повтарящ се случай може да бъде всеки един случай след сърдечна недостатъчност, като смърт, периодична исхемия, ре15
/а*'%ви· васкуларизация, прогресивна атеросклероза или ре-хоспитализация при сърдечна недостатъчност.
В предпочитан вариант от изобретението, сърдечната недостатъчност е исхемия, т.е. дължаща се на исхемия на миокарда.
В друг предпочитан вариант сърдечната недостатъчност не е свързана с исхемия, например като тази, дължаща се на постоянна хипертензия, функционално сърдечно заболяване или белодробно заболяване, водещо до внезапна и в този случай затруднена сърдечна недостатъчност.
В предпочитан вариант от изобретението, инхибиторът на IL18 е избран от групата, състояща се от ICE-инхибитори, антитела срещу IL-18, антитела срещу която и да е от субединиците на IL-18 рецептора, инхибитори на IL-18 рецепторния сигнален път, антагонисти на IL-18, които се конкурират с IL-18 и блокират рецептора за IL-18 и IL-18 свързващи белтъци, изоформи, мутеини, рекомбинантни белтъци, функционални производни, активни фракции или техни циклични пермутирани производни, притежаващи същата активност.
Използваният тук термин “мутеини”, се отнася до аналози на IL-18BP или аналози на вирусен IL-18BP, при които един или повече от аминокиселинните остатъци на естествения IL-18BP или вирусния IL-18BP, са заместени с различни аминокиселинни остатъци, или са премахнати, или са добавени един или повече аминокиселинни остатъка към нормалната секвенция на IL-18BP, или вирусния IL-18BP, без да се променя значително активността на получените продукти, в сравнение с дивия тип IL-18BP или вирусния IL-18BP. Тези мутеини се получават чрез известните методи за синтез и/или чрез техниките за място-насочен мутагенезис, или каквито и да са други известни техники подходящи за това.
За предпочитане е всеки един такъв мутеин да има секвенция от аминокиселини, наподобяваща значително тази на IL-18BP или копираща до голяма степен тази на вирусния IL-18ВР така, че по същество да има сходна активност с тази на IL-18BP. Една активност на IL-18BP е способността му да се свързва с IL-18. Тъй като мутеинът притежава значителна активност за свързване с IL-18, той може да се използва за пречистване на IL-18, например чрез такива начини като афинитетна хроматография, което означава, че той може да се разглежда като притежаващ по същество сходна с IL-18BP активност. Следователно, чрез рутинни експерименти може да се определи дали даден мутеин притежава фактически същата активност като тази на IL-18BP, включващи прилагане на такъв мутеин, например при конкурентен сандвич анализ, за да се определи дали той се свърза или не се свързва с подходящо белязан IL-18, например като радиоимунологичен или ELISA анализ.
Мутеините на IL-18BP полипептиди или мутеините на вирусните IL-18BPs, които могат да се използват съгласно настоящото изобретение, или нуклеиновите киселини които ги кодират, включват по същество определен набор от съответни секвенции като заместващи пептиди или полинуклеотиди, които могат да се получат чрез рутинни пътища от специалистите в областта, без да е необходимо да имат голям опит, въз основа на техниките и ръководството което е предоставено тук.
Предпочитани промени за мутеините съгласно изобретението са тези, известни като консервативни замени. Консервативни аминокиселинни замени на IL-18BP полипептиди или белтъци, или вирусни IL-18BPs, могат да включват синонимни аминокиселини в група, която има достатъчно сходни физикохимични свойства, така че заместването между членовете на групата ще запази биологичната функция на молекулата (16). Ясно е също така, че е възможно да се прави вмъкване и премахване на аминокиселини в по-горе определените секвенции, без да се променя тяхната функция, особено ако инсерциите или делециите включват само няколко аминокиселини, например под трийсет и за предпочитане под десет, като не се премахват или заменят аминокиселини, които са критични за функционалната конформация, например цистеиновите остатъци. Белтъците и мутеините получени чрез такива делеции и/или инсерции спадат в обсега на настоящото изобретение.
Синонимни аминокиселинни групи са предимно тези, определени в Таблица I. За предпочитане е синонимните аминокиселинни групи да са тези, определени в Таблица II; а още по-добре е синонимните аминокиселинни групи да са тези, определени в Таблица III.
ТАБЛИЦА I
Предпочитани групи от синонимни аминокиселини
Аминокиселина
Синонимна група
Ser
Arg
Leu
Pro
Thr
Ala Val
Gly
Ser, Thr, Gly, Asn
Arg, Gin, Lys, Glu, His lie, Phe, Tyr, Met, Val, Leu
Gly, Ala, Thr, Pro
Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gin, Thr
Gly, Thr, Pro, Ala
Met, Tyr, Phe, lie, Leu, Val
Ala, Thr, Pro, Ser, Gly
Пе | Met, Tyr, Phe, Val, Leu, lie |
Phe | Trp, Met, Tyr, lie, Val, Leu, Phe |
Tyr | Trp, Met, Phe, He, Val, Leu, Tyr |
Cys | Ser, Thr, Cys |
His | Glu, Lys, Gin, Thr, Arg, His |
Gin | Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gin |
Asn | Gin, Asp, Ser, Asn |
Lys | Glu, Gin, His, Arg, Lys |
Asp | Glu, Asn, Asp |
Glu | Asp, Lys, Asn, Gin, His, Arg, Glu |
Met | Phe, He, Val, Leu, Met |
Trp
Trp
ТАБЛИЦА II
По-предпочитани групи от синонимни аминокиселини
Аминокиселина
Синонимна група
Ser | Ser |
Arg | His, Lys, Arg |
Leu | Leu, He, Phe, Met |
Pro | Ala, Pro |
Thr | Thr |
Ala | Pro, Ala |
Val | Val, Met, He |
Gly | Gly |
He | He, Met, Phe, Val, Leu |
Phe | Met, Tyr, lie, Leu, Phe |
Tyr | Phe, Tyr |
Cys | Cys, Ser |
His | His, Gin, Arg |
Gin | Glu, Gin, His |
Asn | Asp, Asn |
Lys | Lys, Arg |
Asp | Asp, Asn |
Glu | Glu, Gin |
Met | Met, Phe, lie, Vai, Leu |
Trp | Trp |
ТАБЛИЦА III
Най-предпочитани групи от синонимни аминокиселини
Аминокиселина
Ser
Arg
Leu
Pro
Thr
Ala
Vai
Gly lie
Phe
Tyr
Cys
His
Синонимна група
Ser
Arg
Leu, He, Met
Pro
Thr
Ala
Vai
Gly
He, Met, Leu
Phe
Tyr
Cys, Ser
His
Gin | Gin |
Asn | Asn |
Lys | Lys |
Asp | Asp |
Glu | Glu |
Met | Met, lie, Leu |
Trp | Met |
Примери за получаване на аминокиселинни замествания в белтъци, които могат да се използват за получаване на мутеини на IL-18BP полипептиди или белтъци, или мутеини на вирусните IL-18BPs, за използване в настоящото изобретение, включват който и да е от известните методични етапи, като тези представени в U S патенти 4,959,314, 4,588,585 и 4,737,462, от Mark et al; 5,116,943 от Koths et al., 4,965,195 от Namen et al; 4,879,111 от Chong et al; и 5,017,691 от Lee et al; и заместените c лизин белтъци, представени в U S патент №. 4,904,584 (Shaw et al).
Терминът рекомбинантен белтък, се отнася до полипептид, включващ IL-18BP, или вирусен IL-18BP, или техен мутеин, свързан с друг белтък, който например съществува продължително време в телесните течности. Следователно IL-18BP или вирусен IL-18BP, могат да бъдат свързани с друг белтък, полипептид или друг подобен, например имуноглобулин или негов фрагмент.
Използваният тук термин Функционални производни”, обхваща производни на IL-18BPs или вирусен IL-18BP и техните мутеини и рекомбинантни белтъци, които могат да се получат от функционални групи, които се срещат като странични вериги в остатъците или в N- или С-крайните групи, чрез начини познати от нивото на техниката и които са включени в изобретението, тъй като те съществуват като фармацевтично приемливи, т.е. те не
нарушават активността на белтъка, който фактически е с активност сходна на IL-18BP, или на вирусните IL-18BPs и техните състави и не притежават токсични свойства. Тези производни могат да включват например полиетилен гликол странични-вериги, които могат да маскират антигенните места и да удължават пребиваването на IL-18BP или на вирусния IL-18BP в телесните течности. Други производни включват алифатни естери на карбоксилните групи, амиди на карбоксилните групи чрез реакции е амоняк или с първични или вторични амини, N-ацилни производни на свободни аминогрупи от аминокиселинните остатъци, образувани с ацилни групи (например алканоил или карбоксициклични ароилни групи), или О-ацилни производни на свободни хидроксилни групи (например тези на серил или треонил остатъците), образувани с ацилни групи.
С термина активни фракции на IL-18BP или на вирусен IL-18BP, мутеини и рекомбинантни белтъци, настоящото изобретение обхваща който и да е фрагмент или прекурсори на полипептидната верига на дадена белтъчна молекула, отделно или заедно със свързани с нея молекули или остатъци, например захарни или фосфатни остатъци, или агрегати от самата белтъчна молекула или от самите захарни остатъци, при условие, че споменатата фракция има фактически сходна с IL-18BP активност.
В друг предпочитан вариант от изобретението, инхибиторът на IL-18 е IL-18 антитяло. Анти-1Ь-18 антителата могат да бъдат поликлонални или моноклонални, химерни, наподобяващи човешките или дори напълно човешки. Рекомбинантните антитела и техните фрагменти се характеризират с висок афинитет на свързване с IL-18 in vivo и ниска токсичност. Антителата, които могат да се използват в изобретението се характеризират със способността си да лекуват пациенти, за период достатъчен, за да се получи една много добра регресия или подобряване на патогенетичното състояние или какъвто и да е симптом или група от симптоми, свързани с патогенетичното състояние и слаба токсичност.
Неутрализиращите антитела могат да се създадат лесно в животни, такива като зайци, кози или мишки, чрез имунизиране с IL-18. Имунизираните мишки са особено полезни като източници за доставяне на В клетки, за промишлено производство на хибридоми, които от своя страна се култивират, за да се получат големи количества от анти-1Ь-18 моноклонални антитела.
Химерните антитела са имуноглобулинови молекули, които се характеризират с два или повече сегмента или части, получени от различни животински видове. Обикновено, вариабелната област на химерното антитяло е получена от антитяло на бозайник, различен от човек, като мишо моноклонално антитяло, а имуноглобулиновата константна област е получена от човешка имуноглобулинова молекула. За предпочитане е и двете области и комбинацията от тях да са с ниска имуногенност, която може да бъде определена рутинно (24). Антителата наподобяващи човешките, са имуноглобулинови молекули, създадени чрез генно инженерни техники, при които мишите константни области се заменят с човешки копия, като се запазват мишите антигенсвързващи области. Полученото мишо-човешко химерно антитяло има предимно намалена имуногенност и подобрени фармакокинетики при човек. (25).
Следователно в друг предпочитан вариант, IL-18 антитялото е антитяло, наподобяващо човешко IL-18 антитяло. Предпочитани примери за наподобяващи човешките анти-1Ь-18 антитела, са описани например в Европейската Патентна Заявка ЕР 0 974 600.
В друг предпочитан вариант, IL-18 антитялото е напълно човешко. Технологията за получаване на човешки антитела е описана подробно например във WO00/76310, WO99/53049, US 6,162,963 или AU 5336100. Напълно човешките антитела са предимно рекомбинантни антитела, получени в трансгенни животни, например xenomice, включващи всички или части от функционални човешки Ig локуси.
В много предпочитан вариант от настоящото изобретение, инхибиторът на IL-18 е IL-18BP, или изоформа, мутеин, рекомбинантен белтък, функционално производно, активна w фракция или негово циклично пермутирано производно. Тези изоформи, мутеини, рекомбинантни белтъци или функционални производни, съхраняват биологичната активност на IL-18BP, поспециално свързването с IL-18, и за предпочитане имат поне активност, която фактически е сходна с тази на IL-18BP. Идеално е ако тези белтъци имат биологична активност, която е дори повисока в сравнение с немодифициран IL-18BP. Предпочитаните активни фракции имат активност, която е по-добра отколкото активността на IL-18BP, или които имат други предимства, като по-добра стабилност или по-ниска токсичност или имуногенност, или те могат да се получават по-лесно в големи количества или да ** се пречистват по-лесно.
Секвенциите на IL-18BP и неговите сплайс варианти/изоформи могат да се вземат от W099/09063 или от (12), така както и от (23).
Функционалните производни на IL-18BP могат да бъдат конюгирани с полимери, за да се подобрят свойствата на белтъка, такива като стабилност, полу-живот, бионаличност, поносимост от човешкия организъм или имуногенност. За да се постигне тази цел, IL18-BP може да бъде свързан например с Полиетиленгликол (PEG). РЕИликолирането може да се извърши чрез известните методи, описани например във WO 92/13095.
Следователно в предпочитан вариант от настоящото изобретение, IL-18BP е РЕОликолиран.
В друг предпочитан вариант от изобретението, инхибиторът на IL-18 е рекомбинантен белтък, включващ целия или част от IL18 свързващ белтък, който е свързан с целия или с част от имуноглобулин. За специалистите в областта е ясно, че полученият рекомбинантен белтък запазва биологичната активност на IL-18BP, по-специално възможността да се свързва с IL-18. Свързването може да стане директно или чрез къс линкерен пептид, който може да е с дължина от 1 до 3 аминокиселинни остатъка или по-дълъг, например, с дължина от 13 аминокиселинни остатъка. Споменатият линкер може да е трипептид, например със секвенция E-F-M (GluPhe-Met), или 13-аминокиселинна линкерна секвенция включваща Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met, вмъкнати между IL-18BP секвенцията и имуноглобулиновата секвенция. Полученият рекомбинантен белтък има подобрени свойства, такива като продължително време на живот в телесните течности (полуживот), повишена специфична активност, повишено експресионно ниво или е улеснено пречистването на рекомбинантния белтък.
В предпочитан вариант, IL-18BP е свързан с константната област на Ig молекула. За предпочитане е той да е свързан с областите от тежката верига, например като СН2 и СНЗ домените на човешкия IgGl. Получаването на специфични рекомбинантни белтъци, включващи IL-18BP и част от имуноглобулин е описано например в Пример 11 на WP99/09063. Други изоформи на Ig молекулите са също така подходящи за получаване на рекомбинантни белтъци, съгласно настоящото изобретение, такива като изоформи IgG2 или IgG4, или други Ig класове, например като
IgM или IgA. Рекомбинантните белтъци могат да са мономерни или мултимерни, хетеро- или хомомултимерни.
Интерфероните са известни предимно като такива, които имат инхибиторни ефекти върху вирусната репликация и клетъчната пролиферация. Например интерферон-γ, играе важна роля като подпомага имунните и възпалителните отговори. Счита се, че интерферон β (IFN-β, интерферон тип I), има противовъзпалителна роля.
Изобретението се отнася също така до използването на комбинация от инхибитор на IL-18 и интерферон, за производство на лекарствен препарат за лечение на атеросклероза.
Интерфероните могат да бъдат конюгирани също така с полимери, за да се подобри стабилността на белтъците. Конюгиране между интерферон β и полиолът Полиетиленгликол (PEG) е описано например във WO99/55377.
В друг предпочитан вариант от изобретението, интерферонът е Интерферон-β (IFN-β), а още по-добре е да е IFN-β 1а.
Инхибиторът на IL-18 продукцията и/или действието се използва предимно едновременно, последователно или поотделно с интерферона.
В друг вариант от изобретението, инхибиторът на IL-18 се използва в комбинация с TNF антагонист. TNF антагонистите, упражняват своята активност по няколко начина. Първо, антагонистите могат да се свързват със или самите те да отделят TNF молекулата с достатъчен афинитет и специфичност, за да неутрализират частично или до голяма степен TNF епитопа или епитопите, отговорни за свързването с TNF рецептора (тук по-долу наречени “отделящи антагонисти”). Например, отделящ антагонист може да бъде антитяло насочено срещу TNF.
Съответно, TNF антагонистите могат да подтиснат TNF сигналния път, активиран от клетъчно повърхностния рецептор, след свързване е TNF (тук по-долу наречени “сигнални антагонисти”). И двете групи антагонисти са полезни или поотделно, или заедно в комбинация с IL-18 инхибитора в терапията на атеросклерозата.
TNF антагонистите се идентифицират лесно и се оценяват чрез рутинно скриниране на кандидатите, за техният ефект върху активността на нативен TNF върху чуствителни клетъчни линии in vitro, например човешки В клетки, в които TNF предизвиква пролиферация и имуноглобулинова секреция. Анализът включва TNF препарат е различни разреждания на кандидата антагонист, например от 0,1 до 100 пъти моларното количество на TNF, използвано в анализа и контролите без TNF или само е антагонист (26).
Съгласно настоящото изобретение, отделящите антагонисти са предпочитани TNF антагонисти за използване. Сред отделящите антагонисти за предпочитане са тези полипептиди, които се свързват е TNF с висок афинитет и които притежават ниска имуногенност. Особено предпочитани са разтворими TNF рецепторни молекули и неутрализиращите TNF антитела. Например, разтворимите TNF-RI и TNF-RII са полезни в настоящото изобретение. Скъсените форми на тези рецептори, включващи извънклетъчните домени на рецепторите или техни функционални части, са особено предпочитани антагонисти съгласно настоящото изобретение. Скъсени разтворими TNF тип-1 и тип-П рецептори са описани например в ЕР914431.
Скъсените форми на TNF рецепторите са разтворими и са открити в урина и серум като 30 kDa и 40 kDa TNF инхибиторно свързващи белтъци, които са наречени съответно TBP I and TBP II (27). Съгласно изобретението, за предпочитане е едновременното, последователно или поотделно използване на IL-18 инхибитора е TNF антагониста и/или интерферона.
Съгласно изобретението, TBP I и TBP II са предпочитани TNF антагонисти за използване в комбинация е IL-18 инхибитор. В настоящото изобретение могат да се използват също така производни, фрагменти, участъци и биологично активни части от рецепторните молекули, които функционално наподобяват рецепторните молекули. Такъв биологично активен еквивалент или производно на рецепторната молекула се отнася до част от полипептида или до секвенцията кодираща рецепторната молекула, която е с достатъчен размер и е способна да се свързва е TNF с такъв афинитет, че взаимодействието е мембранно-свързания TNF рецептор се подтиска или блокира.
В друг предпочитан вариант, се използва човешкият разтворим TNF-RI (TBPI), който е TNF антагонист съгласно изобретението. Естествените и рекомбинантно разтворимите TNF рецепторни молекули и методите за тяхното получаване, са описани в Европейските Патенти ЕР 308 378, ЕР 398 327 и ЕР 433 900.
Инхибиторът IL-18 може да се използва едновременно, последователно или поотделно с TNF инхибитора. Благоприятно е използването на комбинация от IL-18 антитяло или антисерум и разтворим рецептор на TNF, притежаваща TNF инхибиторна активност.
В друг предпочитан вариант от изобретението, лекарственият препарат включва COX-инхибитор, за предпочитане СОХ-2 инхибитор. СОХ инхибиторите са известни в областта на техниката. Специфични СОХ-2 инхибитори са описани например във WO 01/00229.
Инхибиторите на тромбоксана, по-специално тромбоксан А2, понастоящем се използват широко за лечение на атеросклероза. Следователно, в друг предпочитан вариант от изобретението, лекарственият препарат освен това включва инхибитор на тромбоксана и по-специално инхибитор на тромбоксан А2, за едновременно, последователно или поотделно използване. Съгласно изобретението, особено предпочитан за използване е аспиринът в комбинация с инхибитора на IL-18.
Една от причините за атеросклероза изглежда че е високата концентрация на липиди в кръвта. Следователно, в друг w предпочитан вариант, лекарственият препарат по-нататък включва компонент, намаляващ липидите за едновременно, последователно или поотделно използване. Съгласно изобретението, може да се използва всеки един компонент, известен от областта на техниката, който понижава липидите. Компонентите понижаващи мазнините включват лекарствени средства като холестирамин, колестипол, никотинова киселина, гемфиброзил, пробукол и други. Особено предпочитани са HMG СоА редуктазните инхибитори и особено така наречените статини. От нивото на техниката са известни много статини, такива като Simvastatin или lovastatin.
г' За предпазване и/или лечение на атеросклерозата, още подобре е да се използва предпочитан вариант от изобретението, отнасящ се до използването на инхибитор за IL-18, в комбинация с храни с ниско съдържание на мазнини и/или с ниско съдържание на холестерол и/или с ниско съдържание на сол.
В предпочитан вариант от настоящото изобретение, инхибиторът на IL-18 се използва в количество от около 0.0001 до 10 mg/kg телесно тегло или от около 0.01 до 5 mg/kg телесно тегло, или от около 0.1 до 3 mg/kg телесно тегло, или от около 1 до 2 mg/kg телесно тегло. В друг предпочитан вариант, инхибиторът на
Jim.
IL-18 се използва в количество от около 0.1 до 1000 pg/kg телесно тегло или от 1 до 100 pg/kg телесно тегло, или от около 10 до 50 pg/kg телесно тегло.
Изобретението се отнася по-нататък до използването на експресионен вектор, включващ кодиращата секвенция за инхибитор на IL-18, при получаването на лекарствен препарат за предпазване и/или лечение на атеросклероза. Следователно, използва се генно терапевтичен подход за лечение и/или предпазване от заболяването. Благоприятен е фактът, че експресията на инхибитора за IL-18 ще се провежда in situ, като по този начин ще се блокира ефективно IL-18 директно в тъканта(те) или клетките повлияни от заболяването.
Както е обяснено подробно в примерите по-долу, намерено е че ефективна експресия на IL-18BP може да се наблюдава в миши модел на болестта, след електротрансфер на експресионен вектор, включващ кодиращата секвенция на IL-18BP.
Следователно в предпочитан вариант, експресионният вектор се прилага чрез електротрансфер, за предпочитане интрамускулно.
Съгласно изобретението също така се планира използването на вектор за индуциране и/или повишаване на ендогенната продукция на инхибитор на IL-18 в клетка, която нормално е мълчалива за експресия на IL-18 инхибитор или която експресира количества от инхибитора, които обаче не са достатъчни. Векторът може да включва регулаторни секвенции, функциониращи в клетките, които ще експресират инхибитора или IL-18. Такива регулаторни секвенции могат да бъдат например промотори или енхансери. След това, регулаторната секвенция може да бъде въведена в правилен локус от генома чрез хомоложна рекомбинация, като по този начин става оперативно свързване на регулаторната секвенция с гена, чиято експресия е необходимо да бъде индуцирана или повишена. Технологията обикновено се споменава като “ендогенно генно активиране” (EGA), и е описана например във WO 91/09955.
За специалистите в областта е ясно също така, че е възможно да се изключи експресията на IL-18, като се използва същата техника, т.е. чрез въвеждане на негативен регулаторен елемент, например като мълчалив елемент в генния локус на IL-18, което ще доведе до подтискане на регулацията или предпазване на експресията на IL-18. За специалистите в областта ще е ясно, че тази подтисната регулация или мълчалива IL-18 експресия, ще има същият ефект, както използването на IL-18 инхибитора, за предпазване и/или лечение на заболяването.
Изобретението се отнася по-нататък до използването на клетка, която е генетично модифицирана, за да продуцира инхибитор на IL-18, при производството на лекарствен препарат за лечение и/или предпазване от атеросклероза.
Освен това изобретението се отнася до фармацевтични състави, особено полезни за предпазване и/или лечение на атеросклероза, които включват терапевтично ефективно количество от инхибитор за IL-18 и терапевтично ефективно количество от интерферон. Като инхибитор за IL-18, съставът може да включва инхибитори за каспаза-1, антитела срещу IL-18, антитела срещу която и да е от IL-18 рецепторните субединици, инхибитори на IL-18 сигналния път, антагонисти на IL-18, които се конкурират с IL-18 и блокират рецептора на IL-18 и IL-18 свързващи белтъци, изоформи, мутеини, рекомбинантни белтъци, функционални производни, активни фракции или техни циклични пермутирани производни, притежаващи същата активност.
IL-18BP и неговите изоформи, мутеини, рекомбинантни белтъци, функционални производни, активни фракции или циклични пермутирани производни, както е описано по-горе, са предпочитани активни компоненти на фармацевтичните състави.
За предпочитане е интерферонът включен във фармацевтичния състав да е IFN-β.
В друг предпочитан вариант, фармацевтичният състав включва терапевтични ефективни количества от IL-18 инхибитор, по избор интерферон и TNF антагонист. TNF антагонистите могат да бъдат антитела, неутрализиращи активността на TNF, или разтворими скъсени TNF рецепторни фрагменти, наречени също така TBPI и ТРВП. Фармацевтичният състав съгласно изобретението може да включва освен това един или повече СОХ инхибитори, за предпочитане СОХ-2 инхибитори. Фармацевтичният състав съгласно изобретението може да включва освен това инхибитор на тромбоксан, такъв като аспирин и/или компонент понижаващ липидите, например като статии.
Определението “фармацевтично приемлив означава, че включва всеки един носител, който не повлиява ефективността на биологичната активност на активната съставка и който не е токсичен за гостоприемника към който се прилага. Например, за парентерално приложение, активният белтък(ци) може да се приготви като единично дозирана форма за инжектиране в носител, такъв като солеви разтвор, разтвор от декстроза, серумен албумин и Рингеров разтвор.
Активните съставки от фармацевтичния състав съгласно изобретението, могат да се прилагат на индивида по различни начини. Начините за прилагане включват интрадермално, трансдермално (например като бавно освобождаващи препарати), интрамускулно, интраперитонеално, интравенозно, подкожно, орално, епидурално, локално и интраназално. Може да се използва всеки един терапевтично ефективен начин за прилагане, например абсорбция през епителната или ендотелната тъкан или чрез генна терапия, където на пациента се прилага ДНК молекула, кодираща активният компонент (например чрез вектор), което води до експресия и секреция in vivo на активния компонент. В допълнение, белтъкът(те) съгласно изобретението, може да се прилага заедно с други компоненти от биологично активни вещества, такива като фармацевтично приемливи сърфактанти, ексципиенти, носители, разредители и носители.
За парентерално приложение (например, интравенозно, подкожно, интрамускулно), активният белтък(ци) може да се приготви като разтвор, суспензия, емулсия или лиофилизиран прах, свързан с фармацевтично приемлив парентерален носител (например, вода, солеви разтвор, разтвор от декстроза) и добавки, които поддържат изотоничността (например манитол), или химичната стабилност (например консерванти и буфери). Препаратът се стерилизира чрез стандартно използваните техники.
Бионаличността на активния белтък(ци) съгласно изобретението, може да бъде подобрена също така чрез използване на методите за конюгиране, което увеличава полу-живота на молекулата в човешкото тяло, например свързване на молекулата с полиетиленгликол, както е описано в РСТ Патентна Заявка WO 92/13095.
Терапевтично ефективните количества от активния белтък(ци) ще са функция от много променливи, включващи типа на антагониста, афинитета на антагониста за IL-18, всяка остатъчна цитотоксична активност, която притежава антагониста, начинът на прилагане, клиничното състояние на пациента (включващо желанието за поддържане на нетоксично ниво на ендогенна IL-18 активност).
Терапевтично ефективно количество е това количество, което когато се прилага, IL-18 инхибиторът води до подтискане на биологичната активност на IL-18. Прилаганата към индивида доза, като единична или многократна доза, ще варира в зависимост от различни фактори, включващи фармакокинетични свойства на IL18 инхибитора, начините на прилагане, състоянието на пациента и характеристики (пол, възраст, телесно тегло, здравословно състояние, преценка), степен на симптомите, паралелни лечения, честота на лечение и желан ефект. Нагласяването и манипулирането на установените дозови обхвати са добре известни на специалистите в областта, така както и in vitro и in vivo методите за определяне на подтискането на IL-18 в отделния индвид.
Съгласно изобретението, инхибиторът на IL-18 се използва в количество от около 0.0001 до 10 mg/kg или около 0.01 до 5 mg/kg телесно тегло, или около 0.01 до 5 mg/kg телесно тегло, или около 0.1 до 3 mg/kg телесно тегло, или около 1 до 2 mg/kg телесно тегло. Други предпочитани количества от IL-18 инхибиторите са количества от около 0.1 до 1000 gg/kg телесно тегло, или около 1 до 100 gg/kg телесно тегло, или около 10 до 50 gg/kg телесно тегло.
Начинът на прилагане, който се предпочита съгласно изобретението е подкожно прилагане. Друг предпочитан начин съгласно изобретението е интрамускулното приложение.
В други предпочитани варианти, инхибиторът на IL-18 се прилага ежедневно или през ден.
Дневните дози обикновено се дават като две отделни дози или под формата на постоянно освобождаваща се ефективни дози, за получаване на желаните резултати. Второто или последващите приложения могат да се направят със същата доза, по-малка от или по-голяма от първоначалната или предишната доза приложена на индивида. Второто или последващо приложение може да се извърши по време на или преди началото на заболяването.
Съгласно изобретението, инхибиторът IL-18 може да се приложи на пациента профилактично или терапевтично, преди, едновременно или последователно с други терапевтични режими или препарати (например, режими с много лекарствени препарати), в терапевтично ефективно количество. Активните компоненти, които се прилагат едновременно е други терапевтични вещества, могат да се приложат със същите или с различни състави.
Изобретението се отнася освен това до метод за лечение и/или предпазване от атеросклероза, включващ прилагане към гостоприемник нуждаещ се от него, на ефективно инхибиращо количество от IL-18 инхибитор.
Изобретението по-нататък се отнася до метод за предпазване и/или лечение на атеросклероза, включващ прилагане към гостоприемник нуждаещ се от него, на експресионен вектор, включващ кодиращата секвенция на инхибитора на IL-18.
В предпочитан вариант от изобретението, експресионният вектор се прилага постоянно, а още по-добре чрез интрамускулна инжекция.
Изобретението освен това се отнася до използването на IL-18 като диагностичен маркер за лоша клинична прогноза при сърдечна недостатъчност. Лошата клинична прогноза включва всяко влошаване на състоянието на пациентите, като периодично повтарящи се състояния, или дори смърт, последвани от инфаркт на миокарда.
За предпочитане е IL-18 да се използва като диагностичен маркер за повтарящи се състояния след първия случай на сърдечна недостатъчност. Периодичните състояния включват, но не се ограничават само до, повтаряща се исхемия, ре-васкуларизация, прогресивна атеросклероза или ре-хоспитализация при сърдечна недостатъчност.
След като описахме изобретението, то ще бъде много подобре разбрано със следните примери, които дават възможност то да бъде илюстрирано и по никакъв начин нямат за цел да ограничават настоящото изобретение.
ПРИМЕРИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
Материали и методи
Проби
Събрани са четиридесет и една човешки атеросклеротични плаки, получени от 36 пациента, подложени на каротидна ендартеректомия. Като контроли са получени 2 каротидни и 3 вътрешни мамарни артерии, без атеросклероза (2 с минимални фибромускулни уплътнения), при аутопсия или по време на хирургичен коронарен байпас. Те се поставят веднага в течен азот и се съхраняват при -80°С. Плаките, които се използват за екстракция на белтък и РНК, се изплакват бързо и се поставят в течен азот, преди да се съхраняват при -80°С. За имунохистохимични изследвания, плаките се поставят за 2 часа в свеж 4 % параформалдехид, след това се пренасят в 30 % захарозен-PBS разтвор, преди да се замразят и отчупят при оптимална температура за рязане в нужната среда (О.С.Т. Compound, Miles Inc, Diagnostics Division) c течен азот и се съхраняват при -80°С за криостатни срези. От всяка проба се получават по няколко срези с дебелина от 8- до 10-рт, за хистологичен анализ и имунохистохимични изследвания.
Класификация на пациентите
За да се изследва възможната връзка между експресията на IL-18/IL-l 8ВР и признаците на плакова нестабилност, ние събрахме по предполагаем и случаен начин клинични данни от 23 поредни пациента (от 36), подложени на ендартеректомична процедура между май и август 2000. Информация за присъствието или отсъствието на интра-плакови язви при макроскопско изследване, се подава постоянно от хирурга, който провежда ς ендартеректомичната процедура. Това дава възможност плаките да се класифицират като плаки с язва или без язва. В допълнение, пациентите бяха класифицирани съгласно клиничните симптоми в две отделни групи. Пациентите които са с клинични симптоми на церебрална исхемична атака, отнасяща се до каротидна стеноза, са класифицирани като симптоматични. Ендартеректомията се провежда 2-66 дена (17.6 ± 5.3 дена) след началото на клиничните симптоми при тези пациенти. Пациентите, които никога не са имали симптоми на церебрална исхемия в областта на каротидната артерия, са класифицирани като асимптоматични. Асимптоматичните каротидни стенози се откриват въз основа на С системни клинични изследвания на пациенти с коронарно или периферно заболяване, като тежестта на заболяването се определя чрез използване на периодична Доплерова ехография от опитен, утвърден ехографист. Въпреки че асимптоматичните пациенти никога не са имали случаи на исхемия в областта на каротидната стеноза, каротидната ендартеректомия показва че е благоприятна за тези пациенти, както и посочват изследователите (28) при Асимптоматично Каротидно Атеросклеротично изследване (ACAS).
Western блот анализ
Екстрахират се белтъци от 12 атеросклеротични плаки и от 5 контролни нормални артерии. Замразените проби се разрушават под течен азот. Прахообразните проби се ресуспендират в ледено студен лизис-буфер [20 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 5 mmol/L EGTA, 150 mmol/L NaCl, 20 mmol/L глицерофосфат, 10 mmol/L NaF, 1 mmol/L натриев ортованадат, 1 % Triton X-100, 0.1% Tween 20, 1 pg/mL апротинин, 1 mmol/L PMSF, 0.5 mmol/L N-TO3mi-Lζ* фенилаланин хлорометил кетон (ТРСК), 0.5 mmol/L N(a)-p-TO3miL-лизин хлорометил кетон (TLCK)] при съотношение от 0.3 mL/10 mg мокро тегло. Екстрактите се инкубират върху лед, в продължение на 15 минути и след това се центрофугират (12 000 g, 15 минути, 4°С). Детергент-разтворимите супернатантни фракции се запазват и белтъчните концентрации в пробите се изравняват чрез използване на Bio-Rad белтъчен анализ.
За да се проведе western блот анализ за IL-18 и IL-18R, белтъчните екстракти се варят в продължение на 5 минути и се нанасят върху 7.5 % или 15 % SDS-полиакриламиден гел. IL-18BP, rhIL-18 пречистен от E.Coli (Serono Pharmaceutical Research W Institute, Geneva), се свързват c Affligel 15 (Biorad) c 1 mg/ml от смолата, съгласно протокола на производителите. Белтъчните екстракти (60 pg) се инкубират за една нощ, при 4°С върху ролер с 20 μΐ от смолата, нагласена до 500 μΐ с PBS 0.05 % Tween. За да се отстрани всяко неспецифично свързване, смолата се центрофугира и се измива с 10 mM Tris pH 8, 140 mM NaCl, 0.5 % Triton-X-100 (Fluka), 0.5 % дезоксихолат, след това с 50 mM Tris pH 8, 200 тМ NaCl, 0.05 % ТХ100, 0.05 % .нонидет Р40 (Fluka), 2 тМ CHAPS (Boehringer, Mannheim), след което следва последно измиване с 50 тМ Tris, pH 8. След това смолата се центрофугира, ресуспендира се в буфера за пробата при редуциращи условия, вари се в продължение на 5 минути и най-накрая се нанася върху 10 % SDSполиакриламиден NuPAGE гел (Invitrogen).
Пробите се прехвърлят електрофоретично от полиакриламидния гел върху нитроцелулоза. Нитроцелулозните мембрани се насищат в продължение на 2 часа, на стайна температура в TBST [50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5), 250 mmol/L NaCl, and 0.1 % Tween солеви разтвор], съдържащ 5 % сухо обезмаслено мляко. След това мембраните се инкубират с козе анти-човешки IL-18 и IL-18R (α-верига) поликлонални антитела (1 pg/ml) (R & D Systems), мишо анти-човешко IL-18 ВР моноклонално антитяло (МаЬ 657.27 с 5 pg/ml) (Corbaz et al., 2000 статията е представена), заешко анти-човешко каспаза-1 поликлонално антитяло (1 pg/ml) (А-19, Santa Cruz). Специфичността на МаЬ 657.27 се анализира върху нарязана мембранна лентичка, като за конкурент се използва 200 х моларен излишък от rhIL-18BP-6his (пречистен от овариални клетки на китайски хамстер, Serono Pharmaceutical Research Institute), коинкубиран c Mab 657.27 c 5 Lg/ml, в продължение на 1 час. След инкубация със съответните HRP конюгирани антитела, се използват хемилуминесцентни субстрати (ECL, Western blotting; Amersham Corp), за да се проявят положителните ивици, съгласно инструкцията на производителите, като ивиците се визуализират след експониране е Hyperfilm ECL (Amersham Corp).
Имунохистохимия
Замразени срези от 6 атеросклеротични плаки се инкубират с 1:10 нормален конски серум или 1:10 нормален кози серум в продължение на 30 минути на стайна температура, измиват се веднъж с PBS, след това се инкубират или с първо мишо моноклонално антитяло срещу CD68 за макрофагиална идентификация (DAKO-CD68, КР1), или с първо мишо моноклонално антитяло срещу човешки гладко мускулен а-актин (1А4, DAKO), за идентифициране на гладко мускулни клетки. За да се идентифицират IL-18 и IL-18 рецептора в атеросклеротичните плаки, се използват специфични кози поликлонални антитела (R & D Systems), при разреждане 5 pg/mL. IL-18 ВР се детектира чрез използване на специфично моноклонално антитяло, насочено срещу рекомбинантна човешка IL-18BP изоформа (Н20) (Corbaz et al., 2000 статията е представена). След измиване с PBS, срезите са инкубират със следните втори биотинилирани антитела: биотинилирано конско анти-мишо IgG (Vector Laboratories, Inc), при разреждане 1:200, за детекция на оцветяването с антитела срещу CD68, гладко мускулен α-актин и IL-18 ВР, и биотинилирано конско анти-козе IgG (Vector), при разреждане 1:200, за детекция на анти-IL-18 и анти-IL-18 рецепторни антитела. Имунооцветяването се визуализира като се използват авидинбиотин HRP визуализиращи системи (Vectastain ABC kit РК-6100 Vector). Като негативни контроли се оцветяват съседни срезчета с •w- изотип-подобни несвързани антитела, вместо с първични антитела.
РНК препарат
От 29 атеросклеротични плаки се екстрахира тотална РНК в разтвор от кисел гуанидин тиоцианат и се екстрахира с фенол и хлороформ, съгласно метода на Chomczynski и Sacchi (29). Пречистената РНК се разтваря във вода и концентрацията и се измерва чрез абсорбция при 260 nm. Целостта на РНК се оценява чрез електрофореза върху 1 % агарозен гел. Синтезира се кДНК от pg тотална PHK, като се използва Promega обратна траскриптазна система, съгласно протокола на производителите.
Полу-количествен и Real-time PCR на човешки IL-18 и IL18ВР в човешки атеросклеротични плаки
Полу-количествени PCR реакции се провеждат в общ обем от 50 μΐ, в присъствие на 1U от AmpliTaq ДНК Полимераза (Perkin Elmer, Roche, U.S.A), 2.5 mM dNTPs (Amersham, U.S.A) и 50 pmoles от прав и обратен PCR праймери. Реакциите се инкубират в РТС200 Peltier Effect Thermal Cycler (MJ Research, U.S.A), при следните условия: денатурация 1 минута, при 94°С, хибридизация за 1 минута при 5 5°C и продължаване на реакцията за 1 минута при 72°С. За да се обезпечи сравнението на количеството от PCR продукти по време на линейната фаза от PCR реакцията, се анализират IL-18BP, IL-18 и β-актин, след 25, 28 и 31 цикъл. Определен е оптималният брой цикли за IL-18BP, IL-18 и β-актин, преди насищането на ивиците (31, 28 и 25, респективно). PCR праймерите са конструирани въз основа на публикуваните секвенции (AF110799, D49950, Х00351) както следва:
IL-18,
IL18BP, β-актин, обратен прав прав обратен обратен прав изключи
5’-GCGTCACTACACTCAGCTAA-3’; 5’-GCCTAGAGGTATGGCTGTAA-3’;
’ -ACCTGTCTACCTGGAGTGAA-3 ’;
’ -GCACGAAGATAGGAAGTCTG-3 ’;
’-GGAGGAGCAATGATCTTGATCTTC-3 ’;
’ -GCTC ACC ATGGATGATGATATCGC-3 ’. амплификацията на възможна геномна ДНК,
За да се контаминираща пробите, PCR реакциите се провеждат в отсъствие на кДНК матрица. PCR продуктите (10μ1) се анализират върху 1 % агарозни гелове, чрез електрофореза в lx ТАЕ буфер. Размерът на
PCR продуктите се проверява чрез сравняване с 1 kb стълбица (Gibco), след оцветяване на телчетата. Провежда се оценка за относителното количество на оцветените с етидиев бромид ивици под UV светлина, като се използва Kodak Digital Sciences аналитичен софтуер и то е съобщено като съотношение на прицелен ген (hIL-18BP, hIL-18) към housekeeping гена (Ιιβ-actm).
SYBR Green Real Time PCR праймери са проектирани за IL18, IL-18BP и GAPDH (house-keeping контрола), като се използва Primer Express софтуер от РЕ Biosystems, съгласно публикуваните секвенции (AF110799, D49950, NM 002046) както следва: IL-18, обратен 5’-CAGCCGCTTTAGCAGCCA-3’;
прав 5’-CAAGGAATTGTCTCCCAGTGC-3’;
IL 18ВР, обратен 5 ’-ААССAGGCTTGAGCGTTCC-3 ’; прав 5 ’-TCCCATGTCTCTGCTCATTTAGTC-3 ’;
GAPDH, обратен 5’-GATGGGATTTCCATTGATGACA-3’;
прав 5’-CCACCCATGGCAAATTCC-3’;
интрон- GAPDH, обратен 5’-CCTAGTCCCAGGGCTTTGATT-3’; прав 5 ’ -CTGTGCTCCC ACTCCTGATTTC-3 ’.
Анализират се специфичността и оптималната праймерна w концентрация. Възможна геномна ДНК контаминация се изключва чрез провеждане на PCR реакцията със специфични интронGAPDH праймери. Отсъствието на неспецифична амплификация се потвърждава чрез електрофоретичен анализ на PCR продуктите с 3.5 % агарозен гел. SYBR Green Real-Time PCR се провежда с 5 μΐ /ямка от RT-продукти (0.5 ng тотална RNA), 25 μΐ/ямка от SYBR Green PCR master смес (PE Biosystem, СА, USA), с AmpErase Урацил N-Гликозилаза (UNG) (0.5 Unit /ямка) и 20 μΐ праймери (300 пМ). PCR се провежда при 50°С за 2 минути (за AmpErase UNG инкубация, за да се отстрани всеки урацил включен в кДНК),
95°С за 10 min (за AmpliTaq Gold активиране) и след това провеждане на 40 цикъла при 95°С за 15 секунди, 60°С за 1 минута с ABI PRISM 7700 Система за детекция. По този начин с обратна транскриптаза се амплифицират кДНК проби и се определят стойностите на техния Ct (прагов цикъл). Всички Ct стойности са нормализирани спрямо housekeeping гена GAPDH. Наблюдава се единична специфична ДНК ивица за IL-18, IL-18BP и GAPDH, като се използва гел електрофоретичен анализ.
Принципът на real-time детекция, като се използва “SYBR Green PCR master mix”, се базира на директна детекция на PCR продукта, чрез измерване на увеличената флуоресценция, причинена от свързването на боята SYBR Green с двойноверижната ДНК.
Статистически анализ
Данните са дадени като средни стойности ± SEM. Нивата на IL-18 се сравняват между групите, като се използва Mann-Whitney теста. Стойността на р 0.05 се счита за статистически значима.
Пример 1: Протектиране от IL-18 инхибиторите на ендотелна клетъчна смърт, индуцирана от окислени липопротеини (oxLDL)
Култивирани човешки ендотелни клетки от пъпната вена (HUVECs) се излагат в продължение на 16 часа на oxLDL, в присъствие или отсъствие на IL-18 свързващ белтък или анти-1Е-18 антитяло. Както е показано на Фигура 1, 83 % от HUVECs умират след излагането им на действието на oxLDL. Ко-инкубацията с IL18ВР или с aHTH-IL-18 антитяло, спасява почти напълно клетките от смърт. Не се наблюдава клетъчна смърт при използване на IL18ВР. 89 % от клетките преживяват, когато се използва анти-1Ь-18 антитяло.
Този експеримент ясно показва защитният ефект на два различни IL-18 инхибитора срещу клетъчната смърт, дължаща се на апоптоза в атеросклеротичната плака.
Пример 2: Експресия на белтъка IL-18 и неговия ендогенен инхибитор IL-18 ВР в атеросклеротични плаки
Проведени са Western блот анализи на белтъчни екстракти от 12 каротидни атеросклеротични артерии и 5 нормални контролни. Белтъкът IL-18 включващ активната форма, се експресира силно във всички атеросклеротични плаки, докато почти не се открива експресия или тя напълно липсва в нормални артерии (Фигура 2). Стартовете от 1 до 4 съдържат проби от атеросклеротични плаки, стартове от 5 до 7 са от нормални артерии. Интересното е, че детекцията на активната форма на IL-18 вероятно корелира с експресията на активната форма на каспаза-1, която е включена в процесинга на IL-18 (Фигура 2 четвърти ред). Наблюдава се също така значителна експресия на IL-18 рецепторния белтък (аверигата), във всички атеросклеротични плаки, в сравнение с много слабото ниво на експресия в нормални артерии (Фигура 2 втори ред). В допълнение, по-голяма част от атеросклеротичните плаки експресират IL-18BP, въпреки че нивото на експресия е хетерогенно (Фигура 2 първи ред).
Пример 3: Клетъчна локализация на белтъка IL-18 и неговия ендогенен инхибитор IL-18BP в атеросклеротични плаки
За да се определи клетъчната локализация на IL-18 и IL-18BP, се провеждат имунохистохимични изследвания с 6 каротидни атеросклеротични плаки. Както се вижда от Фигура 2, IL-18 се експресира главно в макрофаги, като тези клетки вероятно са основния източник за IL-18 в плаката (не е показано). Тези области са богати също така и на СОЗ-позитивни лимфоцити. Обаче изглежда, че Т лимфоцитите не са включени директно в получаването на IL-18. IL-18 се експресира също така в някои вътрешни гладко мускулни клетки и по-рядко в ендотелни клетки. За разлика от това, значителна експресия на IL-18BP се открива в капилярни ендотелни клетки с плаки и в тези от повърхността на лумена, въпреки че експресията не се открива във всички съдове. Относително ниска и по-хетерогенна експресия на IL-18 ВР се открива също така, главно извънклетъчно в някои богати на макрофаги области.
Пример 4: Експресия на IL-18 и IL-18BP иРНК транскрипти в атеросклеротични плаки и връзка с нестабилността на плаката
За да се определи дали човешки IL-18 и IL-18BP иРНК се експресират в човешки каротидни атеросклеротични плаки, се провежда полу-количествен RT-PCR със шест атеросклеротични плаки (Фигура 3). IL-18 и IL-18BP иРНКи се откриват във всички атеросклеротични плаки, въпреки че количеството на иРНК за IL18 и IL-18BP е хетерогенно. Следователно, за да се изчислят акуратно нивата на количеството на IL-18 и IL-18BP иРНК експресията, по-нататък се анализират 23 атеросклеротични плаки с метода SYBR Green Real-Time PCR (Фигура 4). Плаките се характеризират чрез клинично и патологично изследване като симптоматични (нестабилни) или асимптоматични (стабилни) плаки, съдържащи макроскопски или не съдържащи язви. Клиничните характеристики на пациентите са обобщени в Таблица 4. Процентът на редукция на каротидния диаметър (60 % - 95 %) и рисковите фактори, включващи възраст, диабети, хиперхолестеролемия, хипертензия и тютюнопушене, не се различава между двете групи.
Таблица 4
Характеристики на пациента
Асимптоматични | Симптоматични | |
Пациенти (п = 9) | Пациенти1 (п = 14) | |
Възраст 66.9 ± 4.0 | 70.2 ±3.9 | |
Род Мъжки (8) | Мъжки (9) | |
Хипертензия 8 | 9 | |
Хиперхолестеролемия3 | 4 | 8 |
Диабети | 3 | 1 |
Понастоящем пушачи | 7 | 8 |
Коронарно артериално заболяване 5 | 4 | |
*Тези пациенти са | с временна | или упорита исхемична |
церебрална атака 2-66 дена преди ендартеректомия.
2Брой пациенти с клинична хипертензия, които са лекувани с антихипертензивни компоненти.
3Брой пациенти с клинична хиперхолестеролемия, които са лекувани с лекарствени препарати, понижаващи липидното съдържание.
Намерено е, че количеството на IL-18 се регулира нагоре в симптоматичните, в сравнение с асимптоматичните атеросклеротични плаки (2.03 ± 0.5 срещу 0.67 ±0.17, респективно) (Фигура 4А). Статистическият анализ показва, че това увеличение в продукцията на IL-18, наблюдавано в симптоматичните плаки е с висока значимост (р < 0.0074), докато увеличеното количество на IL-18BP, наблюдавано в симптоматичните спрямо асимптоматичните плаки не е (4.64 ± 0.98 срещу 2.5 ± 0.92, респективно) (Фигура 4В). С други думи, въпреки че и двете групи симптоматични и асимптоматични показват положителна корелация между IL-18 и IL-18BP иРНК, наклоните са значително различни между двете групи (симптоматична група: наклон 1.16 [0.19-2.14], г2 = 0.36 срещу асимптоматична група: наклон 4.79 [2.39-7.20], г2 = 0.76; р < 0.05). Следователно, изглежда че относителното повишаване на експресията на IL-18BP в симптоматичната група не е достатъчно, за да компенсира повишената експресия на IL-18. Освен това, тъй като присъствието на възпаление се счита като отличителна характеристика за нестабилността на плаките, затова по-нататък е проведен статистически анализ с плаки, притежаващи или не вътре-плакови възпаления и е показана значително повишена регулация на IL-18 в плаките в които присъстват язвички (р < 0.018) (Фигура 4С).
Тези данни показват, че увеличаването на експресията на IL18, наблюдавана в атеросклеротичните плаки, корелира с нестабилността на плаката.
Пример 5: IL-18BP модулира развитието на атеросклеротична лезия и стабилността в in vivo модели на болестта
Методи
Характеристики на пациента
Плазмени проби се получават от пациенти с остри исхемични коронарни синдроми (нестабилна ангина и инфаркт на миокарда), по-малко от 7 дни след началото на симптомите. Нестабилната ангина се определя като свързана с типична гръдна болка, или с исхемични промени в електрокардиограмата, или с присъствието на коронарно артериално заболяване. Инфаркт на миокарда се диагностицира въз основа на типичните исхемични промени в електрокардиограмата, свързана със значително увеличаване на миокардиални ензими (креатин фосфокиназа и тропонин I) в циркулиращата кръв. Пациентите без исхемия се набират в същия кардиологичен департамент и те са лишени напълно от сигнали за исхемия. Определят се плазмените нива на човешки IL-18, като се използва наличен в търговската мрежа кит (MBL, Japan).
In vivo интрамускулен електротрансфер на миши IL-18BP експресионен плазмид
Четиринадесет мъжки C57BL/6 ароЕ КО мишки, на възраст 14-седмици, получават през интервал от три седмици, 3 инжекции с експресионния IL-18BP плазмид, pcDNA3-IL18BP. Контролните мишки (п = 19) се инжектират с контролен празен плазмид. Мишата IL-18BP изоформа d кДНК, изолирана както е описано (номер за достъп # Q9ZOM9) (23), се субклонира в EcoRl/Notl места от експресионен вектор на клетка от бозайник pcDNA3, под контрола на цитомегаловирусния промотор (Invitrogen). Конструктът наречен 334.yh, е показан на Фигура 5. По подобен начин е конструиран контролен плазмид, лишен от терапевтична кДНК. IL-18BP или контролният експресионен плазмид (60 Rg) се инжектират както в тибиалните, така и в краниалните мускули на анестезирана мишка, както е описано преди това (13). Накратко, електрични импулси през кожата (8 правоъгълни (квадратни) електрични импулса 200 V/cm, 20 msec продължителност, 2 Hz) се доставят от PS-15 електропулсатор (Genetronics, France), като се използват два плоски електрода от неръждаема стомана, поставени на 4.2 до 5.3 mm един от друг, от всяка страна на крака.
Elisa mIL-18BP
Плаките се покриват за една нощ с r-mlL-18ВР0-афинитетно пречистено заешко поликлонално антитяло (5 pg/ямка). Разтворимият mIL-18BP се детектира, като се използва биотинилирано заешко поликлонално антитяло (0.3 pg/ml), получено срещу Е. coli r-mIL-18BP (Peprotec), след което следва екстравидин пероксидаза (1/1000) (Sigma). Свързаното заешко поликлонално антитяло се анализира чрез Western блот, за да се потвърди специфичността на mIL-18BP. Като стандарт се използва рекомбинантен mIL-18BPd, получен от НЕК 293 клетки. Чуствителността на ELISA е 5 ng/ml.
Анализ на мишки
От аортния синус се получават криостатни срези (8 pm) и се използват за детектиране на липидно отлагане като се използва Oil red, за детектиране на колаген чрез използване на Sirius red и за имунохистохимичен анализ, както е описано преди това (13). Срезите се оцветяват със специфични първи антитела: анти-мишо макрофагиално, клон МОМА2 (BioSource), конюгирана алкална фосфатаза анти-а-актин за гладко-мускулни клетки и анти-СОЗ за
Т лимфоцити (Dako), както е описано преди това (13). За детектиране на клетъчна смърт се прилага използването на TUNEL техниката (13). Преброяват се случайно CD3 позитивни клетки микроскопски. Атеросклеротичните плаки в аортния синус и областите които са оцветени позитивно за макрофаги, гладко мускулни клетки, колаген или TUNEL, се измерват като се използва компютърно създаден образ за определяне на количеството (NS15000, Microvision), както е описано преди това (13). Оцветяването с неимунни изотип-подобни имуноглобулини определя специфичността на имунооцветяването. Специфичността на TUNEL се определя чрез изпускане на ензима терминална дезоксинуклеотидил трансфераза. Торакалните аорти обхващащи лявата субклавиална артерия до бъбречните артерии се фиксират с 10 % буфериран формалин и се оцветяват за липидно отлагане с Oil red. След това те се отварят по дължина и се изчислява процентът на липидното отлагане чрез компютърно създаден образ за определяне на количеството (NS15000, Microvision).
Резултати
X; В настоящото изследване е анализирана хипотезата, че регулирането на IL-18/IL-18BP има критична роля както за атеросклерозата, така и за стабилността на плаките. Измерени са плазмените нива на IL-18 в пациенти с остри коронарни синдроми (30 мъже, 18 жени, със средна възраст 66.2 ± 1.8 години, от които 14 имат нестабилна ангина, а 34 имат инфаркт на миокарда) и в контролни пациенти без исхемия, набрани в същия кардиологичен департамент (10 мъже, 3 жени, със средна възраст 60.0 ±5.2 години). Плазмените нива на IL-18 се увеличават значително при пациенти с остро коронарно заболяване, в сравнение с контролите (146.9 ±17.1 спрямо 73.0 ± 12.2 pg/ml, респективно, р < 0.05), в сравнение с циркулиращите нива на IL-18BP, които са слабо увеличени (20.1 ± 2.7 спрямо 7.5 ± 2.5 ng/ml, респективно, р = 0.06). В допълнение, нивата на IL-18 корелират с тежестта на заболяването, като най-високи нива се наблюдават при пациенти с тежка исхемична сърдечна дисфункция и клинични сигнали за белодробен едем (224.03 ± 39.1 pg/ml, р < 0.001 в сравнение с контролите). Тези резултати получени от пациенти с остро сърдечно заболяване, заедно с предишните наблюдения, че IL-18 се повишава в атеросклеротичните плаки при пациенти е мозъчен удар [Mallat, 2001], допускат възможната важна роля за регулацията на IL-18/IL-18BP в атеросклеротичния процес.
Следователно, ние проверихме тази хипотеза, като използвахме ароЕ нокаут (КО) мишки, които развиват спонтанно подобни на човешките, атеросклеротични увреждания. Четиринадесет мишки на възраст 14 седмици, получават като допълнение IL-18BP интрамускулно, чрез in vivo електротрансфер на експресираща се плазмидна ДНК, кодираща миши IL-18BPd, докато 19 контролни със сходна възраст, получават празен плазмид. Плазмидният електротрансфер се повтаря всеки 3 седмици и мишките се убиват на 23 седмица на възраст 9 седмици след третирането. Плазмените нива на мишия IL-18BP са по-ниски, отколкото определените граници (5 ng/ml) в ароЕ КО мишки, инжектирани с празния плазмид. Обаче еднократна инжекция от IL-18BP плазмида води до високи нива на IL-18BP в кръвта, с максимално увеличение 2 дена след инжекцията (323.5 ± 100.9 ng/ml) и 127.4 ± 35.4 ng/ml, измерени след 2 седмици. Девет седмици след третирането или е IL-18BP, или с празен плазимд, общият холестерол (489.4 ± 34.6 спрямо 480.8 ± 36.3 mg/dl, респективно) и серумните нива на високо-плътностните липопротеини (52.3 ± 9.4 спрямо 48.8 ± 5.1 mg/dl, респективно) не се различават между двете групи. Умерено, но значително увеличение на теглото на животните се наблюдава при IL-18BPтретираната група, в сравнение с контролната група (31.8 ± 0.9 спрямо 28.6 ± 0.8 g, респективно, р < 0.05).
Резултатът от добавянето на IL-18BP при атеросклероза се оценява в два различни участъка: низходящата торакална аорта и аортния синус. Торакалната аорта е избрана, за да се определи ролята на IL-18BP в развитието на мастното уплътняване (атерогенеза), тъй като торакални атеросклеротични лезии отсъстват почти напълно на възраст 14 седмици (данните не са показани), където е започнала IL-18BP трансфекцията. Аортният синус, където вече присъстват атеросклеротични лезии на възраст 14 седмици (данните не са показани), се изследва за напреднала прогресия на плаките и състава, един важен фактор за стабилността на плаките. 1Ь-18ВР-третирането на ароЕ КО мишки повлиява значително развитието и прогресията на атеросклеротичната лезия. Изследването на торакалната аорта показва значителна редукция на липидното отлагане в мишки, третирани с IL-18BP плазмида, в сравнение с празния плазмид (Фигура 6). Компютърно създаден образ за количествения анализ показва 69 % намаляване на степента на атеросклеротичните лезии (р < 0.0001) (Фигура 6), което показва критичната, решаваща роля на IL-18 за атеросклерозата. В допълнение, третирането с IL-18BP плазмида само за 9 седмици, ограничава значително развитието на напредналите атеросклеротични плаки в аортния синус (24 % намаление в размера на плаката, р = 0.01), в сравнение с третирането с празен плазмид (Фигура 7).
Много по-важно е, че съставът на напредналите лезии, като основен фактор за нестабилността на плаките, е силно повлиян от третирането е IL-18BP. Атеросклеротичните лезии на мишки третирани с IL-18BP плазмида, показват значително 50 % намаляване на макрофагиална инфилтрация (р < 0.0001) (Фигура 8), съдържаща 67 % по-малко Т лимфоцити (р < 0.005) (Фигура 8), и показва двукратно увеличаване на натрупването в гладко мускулните клетки (р < 0.05) (Фигура 9). В допълнение, тези важни промени в увредения клетъчен състав, са свързани със значително 85 % увеличаване на съдържанието на колаген (р < 0.0005), което е определено чрез оцветяване със Sirius red и намаляване на общото липидно съдържание.
Следователно, третирането с IL-18BP води до значително намаляване на възпалителният процес в атеросклеротичните лезии и индуцира лечебен процес, характеристика на стабилните атеросклеротични плаки. Освен това, отбелязаната редукция във възпалителния компонент на лезиите в мишки, третирани с IL18ВР, е свързана със значителна редукция на случаите на клетъчна смърт в плаките (2.9 ± 0.9 % при IL-18BP третирани мишки спрямо
10.5 ± 3.6 % при контролите, р < 0.05), като по този начин следователно се намалява разширяването и тромбогенността на ацелуларната липидна сърцевина [Mallat, 1999].
Заключения:
Като се използва добре утвърден миши модел, наподобяващ атеросклерозата при човек, резултатите съобщени по-горе ясно показват неочакваната и критична роля на регулацията на IL-18 и IL-18BP в развитието, прогресията и стабилността на атеросклеротичните плаки. Така както и предпазването от образуване на ранна лезия в торакалната аорта, инхибирането на IL-18 активността чрез добавяне на IL-18BP, повлиява също така силно състава на напредналите лезии в аортния синус, индуцирайки превключване към стабилен фенотип на плаките.
Клиничната прогноза при пациенти с атеросклероза зависи само отчасти от размера на лезиите. Днес все повече се приема идеята, че по скоро качеството (съставът на плаката), отколкото размера на лезията може да бъде дори по-добър пророк за честотата на исхемичните случаи. Наистина, тежките клинични прояви на атеросклерозата (инфаркти на сърцето и мозъка) се дължат главно на запушване на съдовия лумен от тромб, който се образува в мястото на контакта на разрушената атеросклеротична плака (19). Патологичните изследвания показват, че уязвимите или нестабилни плаки, които са предразположени към разрушаване или са разрушени, са богати на възпалителни клетки и показват значителна загуба на гладко-мускулни клетки и съдържани на колаген (20, 21). Освен това, такива плаки показват значително увеличаване на апоптозна клетъчна смърт, което води до формиране на силно тромбогенна липидна сърцевина (13, 22). Заслужава внимание фактът, че всички тези сигнали за увеличена нестабилност на плаките намаляват значително в мишки, третирани с IL-18BP, което показва, че IL-18 сигнализацията е основен фактор за нестабилността на плаките.
Практическото значение на резултатите получени при ароЕ КО мишки, по отношение на заболяванията при човека, се засилват от нашите открития за повишени нива на циркулиращия IL-18, при пациенти с остри коронарни синдроми и увеличена продукция на IL-18 в нестабилни каротидни атеросклеротични плаки, отговорни за мозъчния инсулт. Всички тези открития взети заедно, идентифицират инхибиторите на активността на IL-18, като нови важни терапевтични средства за предпазване и лечение от развитието на атеросклеротични плаки и за ограничаване на усложненията при тяхното развитие.
Пример 6: Повишените нива на IL-18 корелират с периодични случаи на пациенти със сърдечна недостатъчност
Нивата на IL-18 се измерват в кръвния серум на пациенти чрез ELSIA с IL-18 специфично антитяло.
Подлагат се на анализ всичките, 56 исхемично болни пациенти както и пациентите без исхемия, със сърдечна недостатъчност или пациенти, които нямат такава.
В пациентите, които умират по-късно, нивата на IL-18 са 216.0 + 41.5 pg/ml, спрямо 112.2 + 12.2 pg/ml при пациенти без смъртоносен изход (р = 0.0018).
При пациенти, при които се наблюдават каквито и да са периодични случаи, като смърт, периодична исхемия, реваскуларизация, прогресивна атеросклероза или ре-хоспитализация при сърдечна недостатъчност, са измерени следните нива на IL-18: 165.8 + 23.8 спрямо 107.7 + 14.6, при пациенти при които не се наблюдават периодично повтарящи се случаи (р = 0.03).
Тези резултати показват, че нивата на IL-18 са значително повишени при пациенти с лоша клинична прогноза, такива като тези с периодично повтарящи се състояния или дори при тези завършващи със смърт.
Измерени са нивата на IL-18 в кръвни проби на 16 пациенти, които не страдат от исхемично заболяване, които имат или при които липсва сърдечна недостатъчност. При пациенти, които покъсно умират, нивата са 199.0 + 34.8 pg/ml спрямо 95.3 + 20.4 pg/ml, при тези пациенти, които остават живи (р = 0.09).
Пациенти с каквито и да са периодично повтарящи се състояния: 146.6 + 34.4 pg/ml IL-18, спрямо 95.4 + 23.9 pg/ml, при пациенти при които не се срещат периодично повтарящи се случаи (р = 0.03). Въпреки че различията в нивата на IL-18 не са статистическа значими, поради малкия брой пациенти, наблюдава се ясна тенденция към повишаване на нивата на IL-18.
При пациенти с исхемия, нивата на IL-18 са 214.2 + 45.9 pg/ml при пациенти, които умират, спрямо 118.4 + 12.8 pg/ml при тези, които остават живи (р = 0.007).
При пациенти, които са с каквото и да е периодично повтарящо се състояние, измерените нивата на IL-18 са 162.8 + 24.7 pg/ml, спрямо 116.2 + 16.0, при пациенти при които не се срещат периодично повтарящи се състояния.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ross R. Atherosclerosis-an inflammatory disease. N Engl J Med 1999;340:115-126.
2. van der Wai AC, Becker AE, van der Loos CM, Das PK. Site of intimal rupture or erosion of thrombosed coronary atherosclerotic plaques is characterized by an inflammatory process irrespective of the dominant plaque morphology. Circulation 1994;89:36-44.
3. Fuster V, Badimon L, Badimon JJ, Chesebro JH. The pathogenesis of coronary artery disease and the acute coronary syndromes (1). N Engl J Med 1992;326:242-250.
4. Fuster V, Badimon L, Badimon JJ, Chesebro JH. The pathogenesis of coronary artery disease and the acute coronary syndromes (2). N Engl J Med 1992;326:310-318.
5. Lee RT, Libby P. The unstable atheroma. Arterioscler Thromb Vase Biol 1997; 17:1859-1867.
6. Ridker PM, Cushman M, Stampfer MJ, Tracy RP, Hennekens CH. Inflammation, aspirin, and the risk of cardiovascular disease in apparently healthy men. N Engl J Med 1997;336:973-979.
7. Libby P. Molecular bases of the acute coronary syndromes. Circulation 1995;91:2844-2850.
8. Nakamura, K, Okamura, H, Nagata, K and Tamura, T. (1989). Infect. Immun. 57, 590-595.
9. Yoshimoto T, Takeda, K, Tanaka, T, Ohkusu, K, Kashiwamura, S, Okamura, H, Akira, S and Nakanishi, K (1998). J. Immunol. 161, 3400-3407.
10. Pamet, P, Garka, K E, Bonnert, T P, Dower, S K, and Sims, J E. (1996). J. Biol. Chem. 271, 3967-3970.
11. DiDonato, J A, Hayakawa, M, Rothwarf, D M, Zandi, E and Karin, M. (1997). Nature 388, 16514-16517.
12. Novick, D, Kim, S-H, Fantuzzi, G, Reznikov, L, Dinarello, C, and Rubinstein, M (1999). Immunity 10, 127-136.
13. Mallat Z, Hugel B, Ohan J, Leseche G, Freyssinet JM, Tedgui A. Shed membrane microparticles with procoagulant potential in human atherosclerotic plaques. A role for apoptosis in plaque thrombogenicity. Circulation 1999;99:348-353.
14. Tricot 0, Mallat Z, Heymes C, Belmin J, Leseche G, Tedgui A. Relation Between Endothelial Cell Apoptosis and Blood Flow
C Direction in Human Atherosclerotic Plaque.Circulation 2000;in press.
15. Dimmeler S, Haendeler J, Galle J, Zeiher AM. Oxidized low-density lipoprotein induces apoptosis of human endothelial cells by activation of CPP32-like proteases. A mechanistic clue to the 'response to injury' hypothesis. Circulation 1997;95:1760-3.
16. Grantham, Science, Vol. 185, pp. 862-864 (1974).
17. Dimmeler S, Haendeler J, Galle J, Zeiher AM. Oxidized low-density lipoprotein induces apoptosis of human endothelial cells by activation of CPP32-like proteases. A mechanistic clue to the 'response to injury' hypothesis. Circulation 1997;95:1760-3.
18. Mir LM, Bureau MF, Gehl J, Rangara R, Rouy D, Caillaud JM, Dellere P, Branellec D, Schwartz B, Scherman D. High efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96:4262-7.
19. Lee, R.T. & Libby, P. The unstable atheroma. Arterioscler Thromb Vase Biol 17, 1859-1867 (1997).
20. Davies, M.J. The composition of coronary-artery plaques [editorial; comment]. N Engl J Med 336, 1312-1314 (1997).
21. Virmani, R., Kolodgie, F.D., Burke, A.P., Farb, A. & Schwartz, S.M. Lessons from sudden coronary death: a comprehensive morphological classification scheme for atherosclerotic lesions. Arterioscler Thromb Vase Biol 20, 1262-1275. (2000).
22. Kolodgie, F.D. et al. Localization of apoptotic macrophages at the site of plaque rupture in sudden coronary death [In Process Citation]. Am J Pathol 157, 1259-1268 (2000).
23. Kim, S.H. et al. Structural requirements of six naturally occurring isoforms of the IL- 18 binding protein to inhibit IL-18. Proc Natl Acad Sci USA 9Ί, 1190-1195 (2000).
24. Elliott, M.J., Maini, R.N., Feldmann, M., Long-Fox, A., Charles, P., Bijl, H., and Woody, J.N., 1994, Lancet 344, 1125-1127.
25. Knight DM, Trinh H, Le J, Siegel S, Shealy D, McDonough M, Scallon B, Moore MA, Vilcek J, Daddona P, et al. Construction and initial characterization of a mouse-human chimeric anti-TNF antibody.Mol Immunol 1993 Nov 30:16 1443-53
26. Tucci, A., James, H., Chicheportiche, R., Bonnefoy, J.Y., Dayer, J.M., and Zubler, R.H., 1992, J.Immunol. 148, 2778-2784.
27. Engelmann, H., D. Novick, and D. Wallach. 1990. Two tumor necrosis factor-binding proteins purified from human urine. Evidence for immunological cross-reactivity with cell surface tumor necrosis factor receptors. J. Biol. Chem. 265:1531-1536.
28. Moore WS, Barnett HJ, Beebe HG, et al. Guidelines for carotid endarterectomy. A multidisciplinary consensus statement from the Ad Hoc Committee, American Heart Association. Circulation 1995;91:566-79.
29. Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 1987;162:156-9.
С ИЗПОЛЗВАНЕ НА IL-18 ИНХИБИТОРИ ЗА ЛЕЧЕНИЕ И/ИЛИ ПРЕДПАЗВАНЕ ОТ АТЕРОСКЛЕРОЗА (Реферат)
Изобретението се отнася до използването на IL-18 инхибитор за производство на лекарствен препарат, за лечение и/или предпазване от атеросклероза.
2235/02-ГП
ИЗПОЛЗВАНЕ НА IL-18 ИНХИБИТОРИ ЗА ЛЕЧЕНИЕ И/ИЛИ ПРЕДПАЗВАНЕ ОТ АТЕРОСКЛЕРОЗА
ОБЛАСТ НА ТЕХНИКАТА
Настоящото изобретение е в областта на съдовите заболявания. По-специално, изобретението се отнася до използването на инхибитори на IL-18 за лечение и/или предпазване от атеросклероза.
ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА
Атеросклерозата е широко разпространено и много важно съдово заболяване, но са известни и много други съдови нарушения. Основно, атеросклерозата засяга големите артерии и тези със среден размер и пораженията и включват мастни уплътнения, фобролитични плаки и поражения с усложнения.
Атеросклерозата е хронично възпалително заболяване на артериалната стена, характеризиращо се с прогресивно акумулиране на липиди, като холестерол, клетки, като макрофаги, Т лимфоцити или гладко мускулни клетки и извънклетъчен матрикс (1). Големите отлагания се наричат атероми или плаки, които често съдържат калций. Мастната тъкан може да разрушава стената на артерията, като намалява еластичността на артерията и по този начин пречи на кръвния поток. Евентуално, могат да се образуват тромби около отложените плаки, които по-нататък пречат на кръвния поток, което може да доведе до общо запушване на кръвоносния съд. Обикновено атеросклерозата е свързана с увеличени нива на LDL-холестерол, Lp(a) фибриноген и фактор VII, както и с намалени нива на HDL-холестерол. Рисковите фактори включват увеличена възраст, мъжки пол, пушене, диабет, затлъстяване, високо съдържание на холестерол в кръвта, храни богати на мазнини и хора, индивидуално или фамилно обременени от сърдечно заболяване. Тя най-често причинява исхемия на органите, например като инфаркт на миокарда.
Атеромът е широко разпространено увреждане на артериите, което по-нататък може да се усложни от тромбо-емболизъм. Атероматозните плаки често стесняват лумена на артериите като причиняват исхемия, а понякога атрофия на тъканите в хипоперфузния участък. Сериозните последствия включват симптома на ангина, дължащ се на исхемия на миокарда, сърдечна недостатъчност, дължаща се на исхемия или на не-исхемични случаи и хипертензия, дължаща се на стесняване на реналната артерия и хипоперфузия на бъбреците, чиито физиологичен отговор е повишена секреция на ренин.
Понякога атеросклерозата и артериосклерозата се споменават като отделни патологични състояния и в този случай, атеросклерозата се определя като включваща втвърдяване (склероза) или загуба на еластичност на артериите, дължаща се поспециално на атером, докато артериосклерозата е втвърдяване или загуба на еластичност на артериите, поради каквато и да е друга причина.
Усложненията или последствията от атеросклероза включват коронарно артериални заболявания (атеросклероза на коронарните артерии), недостатъчно кръвоснабдяване, поради обструкция (исхемия/ангина,) остър MI (инфаркт на миокарда, сърдечна атака), транзиторна исхемична атака (TIA) или мозъчен удар и увреждане на кръвоносни съдове, мускули или телесни органи.
Аневризмите, които са постоянни, анормални дилатации на кръвоносните съдове, също са обичайни последствия от атеросклерозата. Атеросклеротичните абдоминални аортни аневризми се развиват обикновено във възрастни пациенти. Те могат да се спукат в ретроперитонеалното пространство. При атеросклеротичните аневризми обикновено има ясно изразена загуба на еластична тъкан и фиброза на медията, главно вследствие на исхемия на мускулът на аортната медия, последвано от освобождаване на макрофагиални ензими, водещи до фрагментация на еластичните фибри.
Медикаментите, които се препоръчват за лечение или предпазване от атеросклероза включват понижаване на мазнините/холестерола в кръвта. По-специално широко се използва терапията за понижаване на LDL-холестерола. Понастоящем найшироко използвани са статините, които са специфични инхибитори на HMG СоА редуктазата. Освен това други компоненти, понижаващи мазнините включват лекарствени препарати като холестирамин, колестипол, никотинова киселина, гемфиброзил, пробукол, ловастатин и други.
Друг подход е да се намали риска от образуване на тромби при установени атероматозни увреждания. Аспиринът, който се счита за специфичен инхибитор на тромбоксан А2 медиираната тромбоцитна агрегация или антикоагулант, може да се използва за намаляване на риска от тромбоза.
Подкожната “балонна ангиопластика” използва катетър с балонно-крайче, за да се изгладят плаките и за да се увеличи кръвният поток преминаващ през запушените участъци. Техниката е подобна на тази, използвана за отваряне на артериите на сърцето, но тя може да се приложи и към много други артерии в тялото. На коронарните артериални стенози се прави байпас с части от вена сафена, зашита с проксималната аорта или чрез дисекция на вътрешната мамарна артерия от стената на гръдния кош и съединяването на дисталния и край с артерия от предната повърхност на сърцето.
Хирургично отстраняване на отлагания (ендартеректомия), може да се препоръча само в някои случаи (например: ендартеректомия на сънната артерия).
Основната препоръка обаче е да се лекуват или да се контролират рисковите фактори, като поддържане на ниско съдържание на мазнини, нисък холестерол и храни с ограничено количество сол и да се спазват препоръките на здравеопазването за лечение и контрол на хипертензия, диабет и други заболявания, понижаване на телесното тегло и преустановяване на пушенето, така както и периодичен преглед за установяване на нормалното състояние и функциониране на сърдечната дейност.
Възпалителният процес е включен при всички различни етапи на атеросклерозата (1). Счита се, че първият етап от атеросклерозата, който може да се контролира, е ендотелиално активиране от различни фактори, включващи по-слаб контакт между клетките, модифицирани липопротеини и про-възпалителни цитокини (1). Много изследвания напоследък показват, че взаимодействията между съдовите клетки и тези на мястото на възпалението са критични за атеросклерозата (1). По-специално, подтискането на определени пред-възпалителни пътища, намалява развитието на атеросклерозата (1).
Възпалението има главна роля при разрушаване на атеросклеротичните плаки и тромбозата (2-5) и следователно повлиява случаите на остри исхемични синдроми и свързаната с тях смъртност (6). Всъщност тежките клинични прояви на атеросклерозата, включващи инфаркти на сърцето, мозъка и други органи, повлияни от атеросклерозата, се дължат главно на запушване на съдовия лумен от тромби, образувани вследствие на контакта с разрушената атеросклеротична плака (3, 4).
Патологичните изследвания показват, че уязвимите или нестабилни плаки, т.е. плаките предразположени към разкъсване или които вече са разкъсани, се различават до голяма степен по клетъчен състав и по състав на матрикса, в сравнение със стабилните плаки, които не са податливи на разкъсване (7). Уязвимите плаки са много във възпалителните клетки (макрофаги и Т лимфоцити) и те съдържат тромбогенна липидна сърцевина и се характеризират с фина фиброзна покривка със значителна загуба на извънклетъчен матрикс (7).
Намаленият синтез на колаген, медииран от провъзпалителния цитокин IFNy и увеличената активност на макрофагиално-получените матрикс деградиращи металопротеинази, са отговорни за изтъняването и чупливостта на фиброзното покритие (7). Разкъсването на чупливото фиброзно покритие излага силно тромбогенната липидна сърцевина в циркулиращата кръв и води до образуване на тромбоза (1, 7). Следователно, счита се, че плътността на клетките вследствие възпалението при дадено атеросклеротично увреждане, е добра индикация за нейната нестабилност.
Клиничната прогноза за пациент с атеросклероза зависи само отчасти от размера на лезията (19;20). Днес е широко разпространено мнението, че по-скоро качеството (състава на плаката), отколкото размера на увреждането може да е дори подобър показател за появата на исхемични случаи. Всъщност, тежките клинични прояви на атеросклерозата (инфаркти на сърцето и мозъка), се дължат главно на запушване на съдовия лумен, поради формиране на тромби, при контакта на разрушената атеросклеротична плака (19). Патологичните изследвания показват, че уязвимите или нестабилни плаки, които са предразположени към разкъсване или които са разкъсани, са богати на възпалителни клетки и показват значителна загуба на гладко-мускулни клетки и съдържание на колаген (20, 21). Освен това, такива плаки показват значително увеличаване на апоптозната клетъчна смърт, водеща до формиране на силно тромбогенна липидна сърцевина (13, 22).
Προ-възпалителните цитокини са включени във възпалението.
Цитокинът интерлевкин 18 (IL-18) първоначално е описан като у£ интерферон (IFN-y) индуциращ фактор (8). Той е един ранен сигнал при развитието на Т-лимфоцитните хелперно-клетъчен тип1 (Thl) отговори. IL-18 действа заедно с IL-12, IL-2, антигени, митогени и вероятно други фактори, за да индуцира продукция на IFN-γ. IL-18 увеличава също така продукцията на GM-CSF и IL-2, потенциира анти-СОЗ индуцираната Т клетъчна пролиферация и повишава Fas-медиираното унищожаване на естествените клетки килъри. Зрелият IL-18 се получава от неговия прекурсор, чрез IL1β превръщащия ензим (ICE, каспаза-1). Рецепторът на IL-18 се състои поне от два компонента, коопериращи се в свързването на лиганд. Силно- и слабо- афинитетни свързващи места за IL-18 са С намерени в миши IL-12 стимулирани Т клетки (9), което предполага многоверижен рецепторен комплекс. До сега са идентифицирани две рецепторни субединици, като и двете принадлежат към семейството на IL-1 рецепторите (10).
Сигналната трансдукция на IL-18 включва активиране на NF-kB (11).
Неотдавна от човешка урина е изолиран разтворим белтък, който има силен афинитет към IL-18 и са клонирани човешката и миша кДНКи, така както и човешкия ген (12; WO 99/09063). Белтъкът е означен като IL-18 свързващ белтък (IL-18BP).
IL18BP не е извънклетъчен домен на един от известните IL18 рецептори, а секретиран, естествено циркулиращ белтък. Той принадлежи към ново семейство от секретирани белтъци, включващи по-нататък няколко Poxvirus-кодирани белтъци (12). IL18BP се експресира непрекъснато в далака (12). Белтъкът от урината, така както и рекомбинантният IL18BP, се свързват специфично с IL-18 с голям афинитет и модулират биологичния афинитет на IL-18.
Генът на IL18BP е локализиран в човешката хромозома 1 lql3 и не е открит екзон, кодиращ трансмембранен домен в геномната секвенция от 8.3 kb. При човек са открити четири сплайс варианта или изоформи на IL18BP и са означени като IL18BP а, Ь, с и d, като всичките имат един и същи N-край и се различават по С-краищата си (12).
Четири човешки и две миши изоформи на IL-18BP, получени от сплайсинга на иРНК и открити в различни кДНК библиотеки, са експресирани, пречистени и оценени за свързване и неутрализиране на биологичните активности на IL-18 (23). Човешката IL-18BP изоформа a (IL-18BPa), показва най-голям афинитет към IL-18 с бързо включваща се и изключваща се скорост и дисоциационна константа (K(d)) от 399 рМ. IL-18BP споделя Ig домена на IL-18BP а, с изключение на С-крайните 29 аминокиселини; K(d) на IL-18BP с е 10-пъти по-слаба (2.94 пМ). Независимо от това, IL-18BP а и IL-18BP е неутрализират IL-18 > 95 % при моларен излишък от двете. Изоформите на IL-18BP b и IL-18BP d не притежават пълен Ig домен и не са способни да се свързват или да неутрализират IL-18. Мишите IL-18BP с и IL-18BP d изоформи, притежават идентичен Ig домен и също така неутрализират > 95 % мишия IL-18 при моларен излишък от двете. Обаче мишият IL-18BP d, който има общ С-краен мотив с човешкия IL-18BP а, също така неутрализира човешкият IL-18. Молекулното моделиране идентифицира големи смесени електростатични и хидрофобни свързващи места в Ig домена на IL18ВР, което може да обясни неговият силен афинитет за свързване с лиганда (23).
ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
Изобретението се базира на откритието, че инхибиторът на IL-18 има ясно изразен благоприятен ефект върху развитието на плаките, прогресията на плаките и тяхната стабилност в миши модел на атеросклероза. Инхибиторът на IL-18 не само предпазва образуването на лезии в торакалната аорта, но индуцира също така превключване към стабилен плаков фенотип във вече установените атеросклеротични плаки.
Следователно, изобретението се отнася до използването на IL-18 инхибитор за производство на лекарствен препарат, за предпазване и/или лечение на атеросклероза. Освен това изобретението се отнася до методи за лечение, чрез генно терапевтичен подход, за лечение и/или предпазване от атеросклероза.
КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ГРАФИКИТЕ
Фигура 1 представлява хистограма, показваща процента на преживяване на човешки ендотелни клетки от пъпната вена, след инкубиране само с окислени липопротеини, или инкубирани с комбинация от окислени липопротеини и IL-18 антитяло или IL 18ВР респективно.
Фигура 2 показва Western блот, проведен с белтъчни екстракти от атеросклеротични артерии, в сравнение с контролни артерии. При Western блотинга са използвани антитела насочени срещу IL-18BP (hIL18BP), IL-18 рецепторната а субединица (hIL18Ra), IL-18 (hILl 8) и Каспаза-1 (Каспаза-1 р10).
Фигура 3 показва оцветен с етидиев бромид агарозен гел, показващ резултата от RT-PCR анализа за IL-18 и IL-18BP иРНК, в клетки от атеросклеротична плака.
Фигура 4 Типични RT-PCR резултати за IL-18BP и IL-18 в атеросклеротични плаки, в сравнение с експресията на ha-актин (контрола) в симптоматични и асимптоматични плаки.
Фигура 5 показва картата на експресионния вектор, използван за интрамускулен електротрансфер в мишки.
Фигура 6 представлява хистограма, показваща оцветената липидна област в атеросклеротичните артерии. Компютърно създаден образ за количествения анализ на липидно отлагане. Данните представляват средни стойности с s.e.m. (η = 19 за празен плазмид, η = 14 за плазмид IL-18BP). Четирите звезди означават Р < 0.0001.
Фигура 7 представлява хистограма, показваща лезия на аортната синусова област, след IL-18ВР-третиране, в сравнение с контролата (празен плазмид). Компютърно създаден образ за количествения анализ на увредената област. Данните представляват средни стойности с s.e.m. (η = 19 за празен плазмид, η = 14 за плазмид IL-18BP). Двете звезди означават Р < 0.01.
Фигура 8 показва ефектът на третиране с IL-18BP върху съдържанието на увредените възпалителни клетки. Използва се компютърно създаден образ за количествения анализ, за определяне процента на макрофагиално-положителните области (черните ивици) и броят на инфилтрираните Т лимфоцити на mm (сивите линии) в лезии от аортен синус от контрола (п = 12 за оцветяване на макрофаги, η = 15 за оцветяване на Т лимфоцити) или IL-18BP третирани мишки (п = 13 за макрофаги, η = 12 за Т лимфоцити). Данните представляват средни стойности с s.e.m. Трите звезди означават Р < 0.005; а четирите звезди означават Р < 0.0001.
Фигура 9 показва ефекта на IL-18BP третиране върху лезия на гладко мускулна клетка и съдържание на колаген. Използван е компютърно създаден образ за количествения анализ, за определяне процента на позитивната област от гладко мускулна клетка (черни линии) и натрупването на колаген (сиви линии), в лезии от аортен синус от контрола (п = 6 за гладко мускулни клетки, η = 11 за колаген) и третирани с IL-18BP мишки (п = 6 за гладко мускулни клетки, η = 13 за колаген). Данните представят средните стойности с s.e.m. Единичната звезда означава Р < 0.05; а двете звезди означават Р < 0.01.
ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
Изобретението се базира на откритието за повишени нива на циркулиращ IL-18 в пациенти, с остри коронарни синдроми и повишена продукция на IL-18, в нестабилни каротидни атеросклеротични плаки, отговорни за мозъчен удар. В допълнение към това е показано, че in vivo електротрансфер на експресионен ДНК плазмид, кодиращ IL-18BP, предпазва развитието на мастни уплътнения в торакалната аорта и забавя развитието на напредналите атеросклеротични плаки в аортния синус, в добре установен миши модел на атеросклероза. Особено важно е, че трансфекцията с IL-18BP плазмида, индуцира дълбоки промени в състава на плаката (намаляване на макрофаги, Т клетки, клетъчна смърт и липидно съдържание и увеличаване на гладко мускулните клетки и съдържание на колаген), което води до стабилен плаков фенотип. Тези резултати показват за първи пъти важната роля на IL-18 инхибиторите, за намаляване развитието на плаки/напредъка и подпомагането на стабилността на плаките.
Следователно изобретението се отнася до използването на IL18 инхибитор за производство на лекарствен препарат, за лечение и/или предпазване от атеросклероза.
Терминът “предпазване” в контекста на това изобретение, се отнася не само до цялостно предпазване от някакъв ефект, но също така до каквото и да е частично или важно предотвратяване, намаляване, редукция, понижаване или отстраняване на ефекта, преди или в самото начало на заболяването.
Терминът “лечение” в контекста на това изобретение, се отнася до всеки един благоприятен ефект при напредване на болестта, включващ смекчаване, редукция, намаляване или отстраняване на патологичното развитие, след начало на заболяването.
Терминът “инхибитор на IL-18” в контекста на това изобретение, се отнася до всяко молекула, модулираща продукцията на IL-18 и/или действието по такъв начин, че продукцията на IL-18 и/или действието се смекчава, редуцира или фактически се предотвратява частично или напълно, или се блокира.
Инхибитор на продукцията може да е всяка молекула, въздействаща отрицателно върху синтеза, процесинга или узряването на IL-18. Инхибиторите съгласно изобретението могат да бъдат например, супресори на генната експресия на интерлевкина IL-18, антисенс иРНКи, редуциращи или възпрепятстващи транскрипцията на IL-18 иРНК или водещи до деградация на иРНК, белтъци увреждащи коректното нагъване, или частично, или до голяма степен възпрепятстващи съзряването или секрецията на IL-18, протеази разграждащи IL-18, веднъж след като той вече е синтезиран и други подобни. Инхибитор на продукцията може да е Каспаза-1 инхибитора или ICE инхибитора, например като възпрепятства съзряването на IL-18.
Например, инхибитор на действието на IL-18 може да е IL-18 антагонист. Антагонистите могат или да се свързват със или да отделят самата IL-18 молекула със значителен афинитет и специфичност, за да неутрализират частично или напълно IL-18 или IL-18 свързващите места, отговорни за свързването на IL-18 с неговите лиганди (например, подобно на неговите рецептори). Антагонистът може също така да подтисне IL-18 сигналният път, активиран в клетките след свързване на IL-18 рецептора.
Инхибиторите на действието на IL-18 могат да бъдат също така разтворими IL-18 рецептори или молекули, наподобяващи рецепторите, или компоненти, блокиращи IL-18 рецепторите, IL-18 антитела, например подобни на моноклоналните антитела, или какъвто и да е друг компонент или молекула, възпрепятстваща свързването на IL-18 с неговите прицелни места, като по този начин се намаляват или предпазват прицелните вътреклетъчни- или извънклетъчни реакции, медиирани от IL-18.
Атеросклерозата се нарича също така артериосклероза или втвърдяване на артериите. В контекста на настоящото изобретение, терминът атеросклероза включва всички заболявания или болестни състояния на артериите, описвани обикновено като атеросклероза, при които мастният материал се отлага в стените на съдовете, което евентуално води до стесняване и увреждане на кръвния поток, така както и до разкъсване и/или ерозия е образуване на тромби.
Съгласно настоящото изобретение, атеросклерозата включва както склерозата, така и загубата на еластичност на артериите, дължаща се на атером (атеросклероза) или поради каквато и да е друга причина (артериосклероза). Патологичните състояния на атеросклероза, така както и усложненията или последствията от атеросклероза, които се предвиждат да бъдат включени в термина “атеросклероза”, който е използван тук, са описани подробно в “предшестващото ниво на техниката” по-горе.
Развитието на атеросклерозата включва формиране на атеросклеротични плаки и тяхното развитие във все повече и повече нестабилни форми. Следователно изобретението се отнася също така до използването на IL-18 инхибитор за производство на лекарствен препарат, необходим за редуциране или спиране на понататъшното развитие на атеросклерозата.
Запушването на съд при образуване на тромб от атеросклеротична плака, е критично събитие при инфаркт на сърцето и мозъка, които са сред най-вредните последствия на атеросклерозата. Следователно, изобретението се отнася също така до използването на IL-18 инхибитор за производство на лекарствен препарат за лечение и/или предпазване от тромбоза от атеросклеротична плака.
Стабилността на плаката влияе върху развитието на атеросклеротичната плака, към вредна или уязвима плака, което е предпоставка за иницииране на тромбоза. Следователно, понататък изобретението се отнася до използването на IL-18 инхибитор за производство на лекарствен препарат за предпазване и/или лечение на нестабилността на атеросклеротичната плака.
Нестабилната плака е склонна към разрушаване, а разрушаването на плаката може да доведе до тромбоза. Следователно, по-нататък изобретението се отнася до използването на IL-18 инхибитор за производство на лекарствен препарат, за предпазване от ерозия или разрушаване на атеросклеротична плака.
Нестабилността на плаката и тромбозата могат да се дължат например на апоптозна клетъчна смърт, което води до висока прокоагулантна активност и може да е ключово събитие, водещо до тромбоза на разрушените или разкъсаните атеросклеротични плаки, така както и до емболии (13, 14). Показано е, че окислените липопротеини (oxLDL) индуцират макрофагиална и ендотелна клетъчна апоптоза в култура (15). Както е показано в примерите по-долу, сега е открито, че инхибитор на IL-18, е способен да ** редуцира до голяма степен клетъчната смърт, индуцирана от oxLDL.
Съгласно настоящото изобретение, съвсем изненадващо е намерено, че нивата на IL-18 в кръвта са увеличени значително при пациенти със сърдечна недостатъчност, страдащи от повтарящи се случаи, например като смърт, периодична исхемия, реваскуларизация, прогресивна атеросклероза или ре-хоспитализация при сърдечна недостатъчност, в сравнение с пациентите, които не постъпват повторно в болница. Това повишаване на нивата на IL18 е съобщено специално за тези пациенти, които по-късно умират, в сравнение с тези които преживяват. Повишени нива на IL-18 в кръвния поток се наблюдават както при пациенти с исхемия, така и при пациенти без исхемия.
Следователно, изобретението се отнася също така до използването на инхибитори на IL-18, за производство на лекарствен препарат за лечение и/или предпазване от периодично повтарящи се случаи на сърдечна недостатъчност. Периодично повтарящ се случай може да бъде всеки един случай след сърдечна недостатъчност, като смърт, периодична исхемия, ре15
васкуларизация, прогресивна атеросклероза или ре-хоспитализация при сърдечна недостатъчност.
В предпочитан вариант от изобретението, сърдечната недостатъчност е исхемия, т.е. дължаща се на исхемия на миокарда.
В друг предпочитан вариант сърдечната недостатъчност не е свързана с исхемия, например като тази, дължаща се на постоянна хипертензия, функционално сърдечно заболяване или белодробно заболяване, водещо до внезапна и в този случай затруднена сърдечна недостатъчност.
В предпочитан вариант от изобретението, инхибиторът на IL18 е избран от групата, състояща се от ICE-инхибитори, антитела срещу IL-18, антитела срещу която и да е от субединиците на IL-18 рецептора, инхибитори на IL-18 рецепторния сигнален път, антагонисти на IL-18, които се конкурират с IL-18 и блокират рецептора за IL-18 и IL-18 свързващи белтъци, изоформи, мутеини, рекомбинантни белтъци, функционални производни, активни фракции или техни циклични пермутирани производни, притежаващи същата активност.
Използваният тук термин “мутеини”, се отнася до аналози на IL-18BP или аналози на вирусен IL-18BP, при които един или повече от аминокиселинните остатъци на естествения IL-18ВР или вирусния IL-18BP, са заместени с различни аминокиселинни остатъци, или са премахнати, или са добавени един или повече аминокиселинни остатъка към нормалната секвенция на IL-18BP, или вирусния IL-18BP, без да се променя значително активността на получените продукти, в сравнение с дивия тип IL-18BP или вирусния IL-18BP. Тези мутеини се получават чрез известните методи за синтез и/или чрез техниките за място-насочен мутагенезис, или каквито и да са други известни техники подходящи за това.
За предпочитане е всеки един такъв мутеин да има секвенция от аминокиселини, наподобяваща значително тази на IL-18BP или копираща до голяма степен тази на вирусния IL-18BP така, че по същество да има сходна активност с тази на IL-18BP. Една активност на IL-18BP е способността му да се свързва с IL-18. Тъй като мутеинът притежава значителна активност за свързване с IL-18, той може да се използва за пречистване на IL-18, например чрез такива начини като афинитетна хроматография, което означава, че той може да се разглежда като притежаващ по същество сходна с IL-18BP активност. Следователно, чрез рутинни експерименти може да се определи дали даден мутеин притежава фактически същата активност като тази на IL-18BP, включващи прилагане на такъв мутеин, например при конкурентен сандвич анализ, за да се определи дали той се свърза или не се свързва с подходящо белязан IL-18, например като радиоимунологичен или ELISA анализ.
Мутеините на IL-18BP полипептиди или мутеините на вирусните IL-18BPs, които могат да се използват съгласно настоящото изобретение, или нуклеиновите киселини които ги кодират, включват по същество определен набор от съответни секвенции като заместващи пептиди или полинуклеотиди, които могат да се получат чрез рутинни пътища от специалистите в областта, без да е необходимо да имат голям опит, въз основа на техниките и ръководството което е предоставено тук.
Предпочитани промени за мутеините съгласно изобретението са тези, известни като консервативни замени. Консервативни аминокиселинни замени на IL-18BP полипептиди или белтъци, или вирусни IL-18BPs, могат да включват синонимни аминокиселини в група, която има достатъчно сходни физикохимични свойства, така че заместването между членовете на групата ще запази биологичната функция на молекулата (16). Ясно е също така, че е възможно да се прави вмъкване и премахване на аминокиселини в по-горе определените секвенции, без да се променя тяхната функция, особено ако инсерциите или делециите включват само няколко аминокиселини, например под трийсет и за предпочитане под десет, като не се премахват или заменят аминокиселини, които са критични за функционалната конформация, например цистеиновите остатъци. Белтъците и мутеините получени чрез такива делеции и/или инсерции спадат в обсега на настоящото изобретение.
Синонимни аминокиселинни групи са предимно тези, определени в Таблица I. За предпочитане е синонимните аминокиселинни групи да са тези, определени в Таблица И; а още по-добре е синонимните аминокиселинни групи да са тези, определс и в Таблица III.
ТАБЛИЦА I
Предпочитани групи от синонимни аминокиселини
Аминокиселина Синонимна група
Ser | Ser, Thr, Gly, Asn |
Arg | Arg, Gin, Lys, Glu, His |
Leu | He, Phe, Tyr, Met, Val, Leu |
Pro | Gly, Ala, Thr, Pro |
Thr | Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gin, Thr |
Ala | Gly, Thr, Pro, Ala |
Val | Met, Tyr, Phe, lie, Leu, Val |
Gly | Ala, Thr, Pro, Ser, Gly |
Пе Phe Tyr Cys His Gin Asn Lys Asp Glu Met Trp | Met, Tyr, Phe, Vai, Leu, lie Trp, Met, Tyr, lie, Vai, Leu, Phe Trp, Met, Phe, He, Vai, Leu, Tyr Ser, Thr, Cys Glu, Lys, Gin, Thr, Arg, His Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gin Gin, Asp, Ser, Asn Glu, Gin, His, Arg, Lys Glu, Asn, Asp Asp, Lys, Asn, Gin, His, Arg, Glu Phe, He, Vai, Leu, Met Trp ТАБЛИЦА II |
По-предпочитани групи от синонимни аминокиселини
Аминокиселина | Синонимна група |
Ser Arg Leu Pro Thr Ala Vai Gly lie Phe | Ser His, Lys, Arg Leu, He, Phe, Met Ala, Pro Thr Pro, Ala Vai, Met, He Gly lie, Met, Phe, Vai, Leu Met, Tyr, He, Leu, Phe |
Tyr | Phe, Tyr |
Cys | Cys, Ser |
His | His, Gin, Arg |
Gin | Glu, Gin, His |
Asn | Asp, Asn |
Lys | Lys, Arg |
Asp | Asp, Asn |
Glu | Glu, Gin |
Met | Met, Phe, lie, Val, Leu |
Trp | Trp |
ТАБЛИЦА III
Най-предпочитани групи от синонимни аминокиселини
Аминокиселина
Ser
Arg
Leu
Pro
Thr
Ala
Val
Gly
He
Phe
Tyr
Cys
His
Синонимна група
Ser
Arg
Leu, lie, Met
Pro
Thr
Ala
Val
Gly
He, Met, Leu
Phe
Tyr
Cys, Ser
His
Gin | Gin |
Asn | Asn |
Lys | Lys |
Asp | Asp |
Glu | Glu |
Met | Met, He, Leu |
Trp | Met |
Примери за получаване на аминокиселинни замествания в белтъци, които могат да се използват за получаване на мутеини на IL-18BP полипептиди или белтъци, или мутеини на вирусните IL-18BPs, за използване в настоящото изобретение, включват който и да е от известните методични етапи, като тези представени в U S патенти 4,959,314, 4,588,585 и 4,737,462, от Mark et al; 5,116,943 от Koths et al., 4,965,195 от Namen et al; 4,879,111 от Chong et al; и 5,017,691 от Lee et al; и заместените c лизин белтъци, представени в U S патент №. 4,904,584 (Shaw et al).
Терминът рекомбинантен белтък, се отнася до полипептид, включващ IL-18BP, или вирусен IL-18BP, или техен мутеин, свързан с друг белтък, който например съществува продължително време в телесните течности. Следователно IL-18BP или вирусен IL-18BP, могат да бъдат свързани с друг белтък, полипептид или друг подобен, например имуноглобулин или негов фрагмент.
Използваният тук термин Функционални производни, обхваща производни на IL-18BPs или вирусен IL-18BP и техните мутеини и рекомбинантни белтъци, които могат да се получат от функционални групи, които се срещат като странични вериги в остатъците или в N- или С-крайните групи, чрез начини познати от нивото на техниката и които са включени в изобретението, тъй като те съществуват като фармацевтично приемливи, т.е. те не нарушават активността на белтъка, който фактически е с активност сходна на IL-18BP, или на вирусните IL-18BPs и техните състави и не притежават токсични свойства. Тези производни могат да включват например полиетилен гликол странични-вериги, които могат да маскират антигенните места и да удължават пребиваването на IL-18BP или на вирусния IL-18BP в телесните течности. Други производни включват алифатни естери на карбоксилните групи, амиди на карбоксилните групи чрез реакции с амоняк или с първични или вторични амини, N-ацилни производни на свободни аминогрупи от аминокиселинните остатъци, образувани с ацилни групи (например алканоил или карбоксициклични ароилни групи), или О-ацилни производни на свободни хидроксилни групи (например тези на серил или треонил остатъците), образувани с ацилни групи.
С термина активни фракции на IL-18BP или на вирусен IL-18BP, мутеини и рекомбинантни белтъци, настоящото изобретение обхваща който и да е фрагмент или прекурсори на полипептидната верига на дадена белтъчна молекула, отделно или заедно със свързани с нея молекули или остатъци, например захарни или фосфатни остатъци, или агрегати от самата белтъчна молекула или от самите захарни остатъци, при условие, че споменатата фракция има фактически сходна с IL-18BP активност.
В друг предпочитан вариант от изобретението, инхибиторът на IL-18 е IL-18 антитяло. Ahth-IL-18 антителата могат да бъдат поликлонални или моноклонални, химерни, наподобяващи човешките или дори напълно човешки. Рекомбинантните антитела и техните фрагменти се характеризират с висок афинитет на свързване с IL-18 in vivo и ниска токсичност. Антителата, които могат да се използват в изобретението се характеризират със способността си да лекуват пациенти, за период достатъчен, за да се получи една много добра регресия или подобряване на патогенетичното състояние или какъвто и да е симптом или група от симптоми, свързани с патогенетичното състояние и слаба токсичност.
Неутрализиращите антитела могат да се създадат лесно в животни, такива като зайци, кози или мишки, чрез имунизиране с IL-18. Имунизираните мишки са особено полезни като източници за доставяне на В клетки, за промишлено производство на хибридоми, които от своя страна се култивират, за да се получат големи количества от анти-1Ь-18 моноклонални антитела.
Химерните антитела са имуноглобулинови молекули, които се характеризират с два или повече сегмента или части, получени от различни животински видове. Обикновено, вариабелната област на химерното антитяло е получена от антитяло на бозайник, различен от човек, като мишо моноклонално антитяло, а имуноглобулиновата константна област е получена от човешка имуноглобулинова молекула. За предпочитане е и двете области и комбинацията от тях да са с ниска имуногенност, която може да бъде определена рутинно (24). Антителата наподобяващи човешките, са имуноглобулинови молекули, създадени чрез генно инженерни техники, при които мишите константни области се заменят с човешки копия, като се запазват мишите антигенсвързващи области. Полученото мишо-човешко химерно антитяло има предимно намалена имуногенност и подобрени фармакокинетики при човек. (25).
Следователно в друг предпочитан вариант, IL-18 антитялото е антитяло, наподобяващо човешко IL-18 антитяло. Предпочитани примери за наподобяващи човешките анти-1Ь-18 антитела, са описани например в Европейската Патентна Заявка ЕР 0 974 600.
В друг предпочитан вариант, IL-18 антитялото е напълно човешко. Технологията за получаване на човешки антитела е описана подробно например във WO00/76310, WO99/53049, US 6,162,963 или AU 5336100. Напълно човешките антитела са предимно рекомбинантни антитела, получени в трансгенни животни, например xenomice, включващи всички или части от функционални човешки Ig локуси.
В много предпочитан вариант от настоящото изобретение, инхибиторът на IL-18 е IL-18BP, или изоформа, мутеин, рекомбинантен белтък, функционално производно, активна фракция или негово циклично пермутирано производно. Тези изоформи, мутеини, рекомбинантни белтъци или функционални производни, съхраняват биологичната активност на IL-18BP, поспециално свързването с IL-18, и за предпочитане имат поне активност, която фактически е сходна с тази на IL-18BP. Идеално е ако тези белтъци имат биологична активност, която е дори повисока в сравнение с немодифициран IL-18BP. Предпочитаните активни фракции имат активност, която е по-добра отколкото активността на IL-18BP, или които имат други предимства, като по-добра стабилност или по-ниска токсичност или имуногенност, или те могат да се получават по-лесно в големи количества или да се пречистват по-лесно.
Секвенциите на IL-18BP и неговите сплайс варианти/изоформи могат да се вземат от W099/09063 или от (12), така както и от (23).
Функционалните производни на IL-18BP могат да бъдат конюгирани с полимери, за да се подобрят свойствата на белтъка, такива като стабилност, полу-живот, бионаличност, поносимост от човешкия организъм или имуногенност. За да се постигне тази цел, IL18-BP може да бъде свързан например с Полиетиленгликол (PEG). РЕСликолирането може да се извърши чрез известните методи, описани например във WO 92/13095.
Следователно в предпочитан вариант от настоящото изобретение, IL-18BP е РЕОликолиран.
В друг предпочитан вариант от изобретението, инхибиторът на IL-18 е рекомбинантен белтък, включващ целия или част от IL18 свързващ белтък, който е свързан е целия или с част от имуноглобулин. За специалистите в областта е ясно, че полученият рекомбинантен белтък запазва биологичната активност на IL-18BP, по-специално възможността да се свързва с IL-18. Свързването може да стане директно или чрез къс линкерен пептид, който може да е е дължина от 1 до 3 аминокиселинни остатъка или по-дълъг, например, е дължина от 13 аминокиселинни остатъка. Споменатият линкер може да е трипептид, например със секвенция E-F-M (GluPhe-Met), или 13-аминокиселинна линкерна секвенция включваща Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-V al-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met, вмъкнати между IL-18BP секвенцията и имуноглобулиновата секвенция. Полученият рекомбинантен белтък има подобрени свойства, такива като продължително време на живот в телесните течности (полуживот), повишена специфична активност, повишено експресионно ниво или е улеснено пречистването на рекомбинантния белтък.
В предпочитан вариант, IL-18BP е свързан е константната област на Ig молекула. За предпочитане е той да е свързан с областите от тежката верига, например като СН2 и СНЗ домените на човешкия IgGl. Получаването на специфични рекомбинантни белтъци, включващи IL-18BP и част от имуноглобулин е описано например в Пример 11 на WP99/09063. Други изоформи на Ig молекулите са също така подходящи за получаване на рекомбинантни белтъци, съгласно настоящото изобретение, такива като изоформи IgG? или IgG4, или други Ig класове, например като
IgM или IgA. Рекомбинантните белтъци могат да са мономерни или мултимерни, хетеро- или хомомултимерни.
Интерфероните са известни предимно като такива, които имат инхибиторни ефекти върху вирусната репликация и клетъчната пролиферация. Например интерферон-γ, играе важна роля като подпомага имунните и възпалителните отговори. Счита се, че интерферон β (IFN-β, интерферон тип I), има противовъзпалителна роля.
Изобретението се отнася също така до използването на комбинация от инхибитор на IL-18 и интерферон, за производство на лекарствен препарат за лечение на атеросклероза.
Интерфероните могат да бъдат конюгирани също така с полимери, за да се подобри стабилността на белтъците. Конюгиране между интерферон β и полиолът Полиетиленгликол (PEG) е описано например във WO99/55377.
В друг предпочитан вариант от изобретението, интерферонът е Интерферон-β (IFN-β), а още по-добре е да е IFN-β 1а.
Инхибиторът на IL-18 продукцията и/или действието се използва предимно едновременно, последователно или поотделно с интерферона.
В друг вариант от изобретението, инхибиторът на IL-18 се използва в комбинация с TNF антагонист. TNF антагонистите, упражняват своята активност по няколко начина. Първо, антагонистите могат да се свързват със или самите те да отделят TNF молекулата с достатъчен афинитет и специфичност, за да неутрализират частично или до голяма степен TNF епитопа или епитопите, отговорни за свързването с TNF рецептора (тук по-долу наречени “отделящи антагонисти”). Например, отделящ антагонист може да бъде антитяло насочено срещу TNF.
Съответно, TNF антагонистите могат да подтиснат TNF сигналния път, активиран от клетъчно повърхностния рецептор, след свързване с TNF (тук по-долу наречени “сигнални антагонисти”). И двете групи антагонисти са полезни или поотделно, или заедно в комбинация с IL-18 инхибитора в терапията на атеросклерозата.
TNF антагонистите се идентифицират лесно и се оценяват чрез рутинно скриниране на кандидатите, за техният ефект върху активността на нативен TNF върху чуствителни клетъчни линии in vitro, например човешки В клетки, в които TNF предизвиква пролиферация и имуноглобулинова секреция. Анализът включва TNF препарат с различни разреждания на кандидата антагонист, например от 0,1 до 100 пъти моларното количество на TNF, използвано в анализа и контролите без TNF или само с антагонист (26).
Съгласно настоящото изобретение, отделящите антагонисти са предпочитани TNF антагонисти за използване. Сред отделящите антагонисти за предпочитане са тези полипептиди, които се свързват с TNF с висок афинитет и които притежават ниска имуногенност. Особено предпочитани са разтворими TNF рецепторни молекули и неутрализиращите TNF антитела. Например, разтворимите TNF-RJ и TNF-RII са полезни в настоящото изобретение. Скъсените форми на тези рецептори, включващи извънклетъчните домени на рецепторите или техни функционални части, са особено предпочитани антагонисти съгласно настоящото изобретение. Скъсени разтворими TNF тип-1 и тип-П рецептори са описани например в ЕР914431.
Скъсените форми на TNF рецепторите са разтворими и са открити в урина и серум като 30 kDa и 40 kDa TNF инхибиторно свързващи белтъци, които са наречени съответно TBP I and TBP II (27). Съгласно изобретението, за предпочитане е едновременното, последователно или поотделно използване на IL-18 инхибитора с TNF антагониста и/или интерферона.
Съгласно изобретението, TBP I и TBP II са предпочитани TNF антагонисти за използване в комбинация с IL-18 инхибитор. В настоящото изобретение могат да се използват също така производни, фрагменти, участъци и биологично активни части от рецепторните молекули, които функционално наподобяват рецепторните молекули. Такъв биологично активен еквивалент или производно на рецепторната молекула се отнася до част от полипептида или до секвенцията кодираща рецепторната молекула, която е с достатъчен размер и е способна да се свързва с TNF с такъв афинитет, че взаимодействието с мембранно-свързания TNF рецептор се подтиска или блокира.
В друг предпочитан вариант, се използва човешкият разтворим TNF-RI (TBPI), който е TNF антагонист съгласно изобретението. Естествените и рекомбинантно разтворимите TNF рецепторни молекули и методите за тяхното получаване, са описани в Европейските Патенти ЕР 308 378, ЕР 398 327 и ЕР 433 900.
Инхибиторът IL-18 може да се използва едновременно, последователно или поотделно с TNF инхибитора. Благоприятно е използването на комбинация от IL-18 антитяло или антисерум и разтворим рецептор на TNF, притежаваща TNF инхибиторна активност.
В друг предпочитан вариант от изобретението, лекарственият препарат включва COX-инхибитор, за предпочитане СОХ-2 инхибитор. СОХ инхибиторите са известни в областта на техниката. Специфични СОХ-2 инхибитори са описани например във WO 01/00229.
Инхибиторите на тромбоксана, по-специално тромбоксан А2, понастоящем се използват широко за лечение на атеросклероза. Следователно, в друг предпочитан вариант от изобретението, лекарственият препарат освен това включва инхибитор на тромбоксана и по-специално инхибитор на тромбоксан А2, за едновременно, последователно или поотделно използване. Съгласно изобретението, особено предпочитан за използване е аспиринът в комбинация с инхибитора на IL-18.
Една от причините за атеросклероза изглежда че е високата концентрация на липиди в кръвта. Следователно, в друг предпочитан вариант, лекарственият препарат по-нататък включва компонент, намаляващ липидите за едновременно, последователно или поотделно използване. Съгласно изобретението, може да се използва всеки един компонент, известен от областта на техниката, който понижава липидите. Компонентите понижаващи мазнините включват лекарствени средства като холестирамин, колестипол, никотинова киселина, гемфиброзил, пробукол и други. Особено предпочитани са HMG Co А редуктазните инхибитори и особено така наречените статини. От нивото на техниката са известни много статини, такива като Simvastatin или lovastatin.
За предпазване и/или лечение на атеросклерозата, още подобре е да се използва предпочитан вариант от изобретението, отнасящ се до използването на инхибитор за IL-18, в комбинация с храни с ниско съдържание на мазнини и/или с ниско съдържание на холестерол и/или с ниско съдържание на сол.
В предпочитан вариант от настоящото изобретение, инхибиторът на IL-18 се използва в количество от около 0.0001 до 10 mg/kg телесно тегло или от около 0.01 до 5 mg/kg телесно тегло, или от около 0.1 до 3 mg/kg телесно тегло, или от около 1 до 2 mg/kg телесно тегло. В друг предпочитан вариант, инхибиторът на
IL-18 се използва в количество от около 0.1 до 1000 pg/kg телесно тегло или от 1 до 100 pg/kg телесно тегло, или от около 10 до 50 pg/kg телесно тегло.
Изобретението се отнася по-нататък до използването на експресионен вектор, включващ кодиращата секвенция за инхибитор на IL-18, при получаването на лекарствен препарат за предпазване и/или лечение на атеросклероза. Следователно, използва се генно терапевтичен подход за лечение и/или предпазване от заболяването. Благоприятен е фактът, че експресията на инхибитора за IL-18 ще се провежда in situ, като по този начин ще се блокира ефективно IL-18 директно в тъканта(те) или клетките повлияни от заболяването.
Както е обяснено подробно в примерите по-долу, намерено е че ефективна експресия на IL-18BP може да се наблюдава в миши модел на болестта, след електротрансфер на експресионен вектор, включващ кодиращата секвенция на IL-18ВР.
Следователно в предпочитан вариант, експресионният вектор се прилага чрез електротрансфер, за предпочитане интрамускулно.
Съгласно изобретението също така се планира използването на вектор за индуциране и/или повишаване на ендогенната продукция на инхибитор на IL-18 в клетка, която нормално е мълчалива за експресия на IL-18 инхибитор или която експресира количества от инхибитора, които обаче не са достатъчни. Векторът може да включва регулаторни секвенции, функциониращи в клетките, които ще експресират инхибитора или IL-18. Такива регулаторни секвенции могат да бъдат например промотори или енхансери. След това, регулаторната секвенция може да бъде въведена в правилен локус от генома чрез хомоложна рекомбинация, като по този начин става оперативно свързване на регулаторната секвенция с гена, чиято експресия е необходимо да бъде индуцирана или повишена. Технологията обикновено се споменава като “ендогенно генно активиране” (EGA), и е описана например във WO 91/09955.
За специалистите в областта е ясно също така, че е възможно да се изключи експресията на IL-18, като се използва същата техника, т.е. чрез въвеждане на негативен регулаторен елемент, например като мълчалив елемент в генния локус на IL-18, което ще доведе до подтискане на регулацията или предпазване на експресията на IL-18. За специалистите в областта ще е ясно, че тази подтисната регулация или мълчалива IL-18 експресия, ще има същият ефект, както използването на IL-18 инхибитора, за предпазване и/или лечение на заболяването.
Изобретението се отнася по-нататък до използването на клетка, която е генетично модифицирана, за да продуцира инхибитор на IL-18, при производството на лекарствен препарат за лечение и/или предпазване от атеросклероза.
Освен това изобретението се отнася до фармацевтични състави, особено полезни за предпазване и/или лечение на атеросклероза, които включват терапевтично ефективно количество от инхибитор за IL-18 и терапевтично ефективно количество от интерферон. Като инхибитор за IL-18, съставът може да включва инхибитори за каспаза-1, антитела срещу IL-18, антитела срещу която и да е от IL-18 рецепторните субединици, инхибитори на IL-18 сигналния път, антагонисти на IL-18, които се конкурират с IL-18 и блокират рецептора на IL-18 и IL-18 свързващи белтъци, изоформи, мутеини, рекомбинантни белтъци, функционални производни, активни фракции или техни циклични пермутирани производни, притежаващи същата активност.
IL-18BP и неговите изоформи, мутеини, рекомбинантни белтъци, функционални производни, активни фракции или циклични пермутирани производни, както е описано по-горе, са предпочитани активни компоненти на фармацевтичните състави.
За предпочитане е интерферонът включен във фармацевтичния състав да е IFN-β.
В друг предпочитан вариант, фармацевтичният състав включва терапевтични ефективни количества от IL-18 инхибитор, по избор интерферон и TNF антагонист. TNF антагонистите могат да бъдат антитела, неутрализиращи активността на TNF, или разтворими скъсени TNF рецепторни фрагменти, наречени също така TBPI и ТРВП. Фармацевтичният състав съгласно изобретението може да включва освен това един или повече СОХ инхибитори, за предпочитане СОХ-2 инхибитори. Фармацевтичният състав съгласно изобретението може да включва освен това инхибитор на тромбоксан, такъв като аспирин и/или компонент понижаващ липидите, например като статии.
Определението “фармацевтично приемлив означава, че включва всеки един носител, който не повлиява ефективността на биологичната активност на активната съставка и който не е токсичен за гостоприемника към който се прилага. Например, за парентерално приложение, активният белтък(ци) може да се приготви като единично дозирана форма за инжектиране в носител, такъв като солеви разтвор, разтвор от декстроза, серумен албумин и Рингеров разтвор.
Активните съставки от фармацевтичния състав съгласно изобретението, могат да се прилагат на индивида по различни начини. Начините за прилагане включват интрадермално, трансдермално (например като бавно освобождаващи препарати), интрамускулно, интраперитонеално, интравенозно, подкожно, орално, епидурално, локално и интраназално. Може да се използва всеки един терапевтично ефективен начин за прилагане, например абсорбция през епителната или ендотелната тъкан или чрез генна терапия, където на пациента се прилага ДНК молекула, кодираща активният компонент (например чрез вектор), което води до експресия и секреция in vivo на активния компонент. В допълнение, белтъкът(те) съгласно изобретението, може да се прилага заедно с други компоненти от биологично активни вещества, такива като фармацевтично приемливи сърфактанти, ексципиенти, носители, разредители и носители.
За парентерално приложение (например, интравенозно, подкожно, интрамускулно), активният белтък(ци) може да се приготви като разтвор, суспензия, емулсия или лиофилизиран прах, свързан с фармацевтично приемлив парентерален носител (например, вода, солеви разтвор, разтвор от декстроза) и добавки, които поддържат изотоничността (например манитол), или химичната стабилност (например консерванти и буфери). Препаратът се стерилизира чрез стандартно използваните техники.
Бионаличността на активния белтък(ци) съгласно изобретението, може да бъде подобрена също така чрез използване на методите за конюгиране, което увеличава полу-живота на молекулата в човешкото тяло, например свързване на молекулата с полиетиленгликол, както е описано в РСТ Патентна Заявка WO 92/13095.
Терапевтично ефективните количества от активния белтък(ци) ще са функция от много променливи, включващи типа на антагониста, афинитета на антагониста за IL-18, всяка остатъчна цитотоксична активност, която притежава антагониста, начинът на прилагане, клиничното състояние на пациента (включващо желанието за поддържане на нетоксично ниво на ендогенна IL-18 активност).
Терапевтично ефективно количество е това количество, което когато се прилага, IL-18 инхибиторът води до подтискане на биологичната активност на IL-18. Прилаганата към индивида доза, като единична или многократна доза, ще варира в зависимост от различни фактори, включващи фармакокинетични свойства на IL18 инхибитора, начините на прилагане, състоянието на пациента и характеристики (пол, възраст, телесно тегло, здравословно състояние, преценка), степен на симптомите, паралелни лечения, честота на лечение и желан ефект. Нагласяването и манипулирането на установените дозови обхвати са добре известни на специалистите в областта, така както и in vitro и in vivo методите за определяне на подтискането на IL-18 в отделния индвид.
Съгласно изобретението, инхибиторът на IL-18 се използва в количество от около 0.0001 до 10 mg/kg или около 0.01 до 5 mg/kg телесно тегло, или около 0.01 до 5 mg/kg телесно тегло, или около 0.1 до 3 mg/kg телесно тегло, или около 1 до 2 mg/kg телесно тегло. Други предпочитани количества от IL-18 инхибиторите са количества от около 0.1 до 1000 pg/kg телесно тегло, или около 1 до 100 pg/kg телесно тегло, или около 10 до 50 pg/kg телесно тегло.
Начинът на прилагане, който се предпочита съгласно изобретението е подкожно прилагане. Друг предпочитан начин съгласно изобретението е интрамускулното приложение.
В други предпочитани варианти, инхибиторът на IL-18 се прилага ежедневно или през ден.
Дневните дози обикновено се дават като две отделни дози или под формата на постоянно освобождаваща се ефективни дози, за получаване на желаните резултати. Второто или последващите приложения могат да се направят със същата доза, по-малка от или по-голяма от първоначалната или предишната доза приложена на индивида. Второто или последващо приложение може да се извърши по време на или преди началото на заболяването.
Съгласно изобретението, инхибиторът IL-18 може да се приложи на пациента профилактично или терапевтично, преди, едновременно или последователно с други терапевтични режими или препарати (например, режими с много лекарствени препарати), в терапевтично ефективно количество. Активните компоненти, които се прилагат едновременно с други терапевтични вещества, могат да се приложат със същите или с различни състави.
Изобретението се отнася освен това до метод за лечение и/или предпазване от атеросклероза, включващ прилагане към гостоприемник нуждаещ се от него, на ефективно инхибиращо количество от IL-18 инхибитор.
Изобретението по-нататък се отнася до метод за предпазване и/или лечение на атеросклероза, включващ прилагане към гостоприемник нуждаещ се от него, на експресионен вектор, включващ кодиращата секвенция на инхибитора на IL-18.
В предпочитан вариант от изобретението, експресионният вектор се прилага постоянно, а още по-добре чрез интрамускулна инжекция.
Изобретението освен това се отнася до използването на IL-18 като диагностичен маркер за лоша клинична прогноза при сърдечна недостатъчност. Лошата клинична прогноза включва всяко влошаване на състоянието на пациентите, като периодично повтарящи се състояния, или дори смърт, последвани от инфаркт на миокарда.
За предпочитане е IL-18 да се използва като диагностичен маркер за повтарящи се състояния след първия случай на сърдечна недостатъчност. Периодичните състояния включват, но не се ограничават само до, повтаряща се исхемия, ре-васкуларизация, прогресивна атеросклероза или ре-хоспитализация при сърдечна недостатъчност.
След като описахме изобретението, то ще бъде много подобре разбрано със следните примери, които дават възможност то да бъде илюстрирано и по никакъв начин нямат за цел да ограничават настоящото изобретение.
ПРИМЕРИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
Материали и методи
Проби
Събрани са четиридесет и една човешки атеросклеротични плаки, получени от 36 пациента, подложени на каротидна ендартеректомия. Като контроли са получени 2 каротидни и 3 вътрешни мамарни артерии, без атеросклероза (2 с минимални фибромускулни уплътнения), при аутопсия или по време на хирургичен коронарен байпас. Те се поставят веднага в течен азот и се съхраняват при -80°С. Плаките, които се използват за екстракция на белтък и РНК, се изплакват бързо и се поставят в течен азот, преди да се съхраняват при -80°С. За имунохистохимични изследвания, плаките се поставят за 2 часа в свеж 4 % параформалдехид, след това се пренасят в 30 % захарозен-PBS разтвор, преди да се замразят и отчупят при оптимална температура за рязане в нужната среда (О.С.Т. Compound, Miles Inc, Diagnostics Division) c течен азот и се съхраняват при -80°С за криостатни срези. От всяка проба се получават по няколко срези с дебелина от 8- до Ю-рт, за хистологичен анализ и имунохистохимични изследвания.
Класификация на пациентите
За да се изследва възможната връзка между експресията на IL-18/IL-18BP и признаците на плакова нестабилност, ние събрахме по предполагаем и случаен начин клинични данни от 23 поредни пациента (от 36), подложени на ендартеректомична процедура между май и август 2000. Информация за присъствието или отсъствието на интра-плакови язви при макроскопско изследване, се подава постоянно от хирурга, който провежда ендартеректомичната процедура. Това дава възможност плаките да се класифицират като плаки с язва или без язва. В допълнение, пациентите бяха класифицирани съгласно клиничните симптоми в две отделни групи. Пациентите които са с клинични симптоми на церебрална исхемична атака, отнасяща се до каротидна стеноза, са класифицирани като симптоматични. Ендартеректомията се провежда 2-66 дена (17.6 ± 5.3 дена) след началото на клиничните симптоми при тези пациенти. Пациентите, които никога не са имали симптоми на церебрална исхемия в областта на каротидната артерия, са класифицирани като асимптоматични. Асимптоматичните каротидни стенози се откриват въз основа на системни клинични изследвания на пациенти с коронарно или периферно заболяване, като тежестта на заболяването се определя чрез използване на периодична Доплерова ехография от опитен, утвърден ехографист. Въпреки че асимптоматичните пациенти никога не са имали случаи на исхемия в областта на каротидната стеноза, каротидната ендартеректомия показва че е благоприятна за тези пациенти, както и посочват изследователите (28) при Асимптоматично Каротидно Атеросклеротично изследване (ACAS).
Western блот анализ
Екстрахират се белтъци от 12 атеросклеротични плаки и от 5 контролни нормални артерии. Замразените проби се разрушават под течен азот. Прахообразните проби се ресуспендират в ледено студен лизис-буфер [20 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 5 mmol/L EGTA, 150 mmol/L NaCl, 20 mmol/L глицерофосфат, 10 mmol/L NaF, 1 mmol/L натриев ортованадат, 1 % Triton X-100, 0.1% Tween 20, 1 pg/mL апротинин, 1 mmol/L PMSF, 0.5 mmol/L N-тозил-ТСфенилаланин хлорометил кетон (TPCK), 0.5 mmol/L И(а)-р-тозилL-лизин хлорометил кетон (TLCK)] при съотношение от 0.3 mL/10 mg мокро тегло. Екстрактите се инкубират върху лед, в продължение на 15 минути и след това се центрофугират (12 000 g, 15 минути, 4°С). Детергент-разтворимите супернатантни фракции се запазват и белтъчните концентрации в пробите се изравняват чрез използване на Bio-Rad белтъчен анализ.
За да се проведе western блот анализ за IL-18 и IL-18R, белтъчните екстракти се варят в продължение на 5 минути и се нанасят върху 7.5 % или 15 % SDS-полиакриламиден гел. IL-18BP, rhIL-18 пречистен от E.Coli (Serono Pharmaceutical Research C Institute, Geneva), се свързват c Affligel 15 (Biorad) c 1 mg/ml от смолата, съгласно протокола на производителите. Белтъчните екстракти (60 pg) се инкубират за една нощ, при 4°С върху ролер с 20 μΐ от смолата, нагласена до 500 μΐ е PBS 0.05 % Tween. За да се отстрани всяко неспецифично свързване, смолата се центрофугира и се измива е 10 mM Tris pH 8, 140 тМ NaCl, 0.5 % Triton-X-100 (Fluka), 0.5 % дезоксихолат, след това с 50 mM Tris pH 8, 200 тМ NaCl, 0.05 % ТХ100, 0.05 % .нонидет Р40 (Fluka), 2 mM CHAPS (Boehringer, Mannheim), след което следва последно измиване с 50 mM Tris, pH 8. След това смолата се центрофугира, ресуспендира се в буфера за пробата при редуциращи условия, вари се в продължение на 5 минути и най-накрая се нанася върху 10 % SDSполиакриламиден NuPAGE гел (Invitrogen).
Пробите се прехвърлят електрофоретично от полиакриламидния гел върху нитроцелулоза. Нитроцелулозните мембрани се насищат в продължение на 2 часа, на стайна температура в TBST [50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5), 250 mmol/L NaCl, and 0.1 % Tween солеви разтвор], съдържащ 5 % сухо обезмаслено мляко. След това мембраните се инкубират с козе анти-човешки IL-18 и IL-18R (α-верига) поликлонални антитела (1 pg/ml) (R & D Systems), мишо анти-човешко IL-18 ВР моноклонално антитяло (Mab 657.27 с 5 pg/ml) (Corbaz et al., 2000 статията е представена), заешко анти-човешко каспаза-1 поликлонално антитяло (1 pg/ml) (А-19, Santa Cruz). Специфичността на Mab 657.27 се анализира върху нарязана мембранна лентичка, като за конкурент се използва 200 х моларен излишък от rhIL-18BP-6his (пречистен от овариални клетки на китайски хамстер, Serono Pharmaceutical Research Institute), коинкубиран c Mab 657.27 c 5 pg/ml, в продължение на 1 час. След инкубация със съответните HRP конюгирани антитела, се използват хемилуминесцентни субстрати (ECL, Western blotting; Amersham Corp), за да се проявят положителните ивици, съгласно инструкцията на производителите, като ивиците се визуализират след експониране с Hyperfilm ECL (Amersham Corp).
Имунохистохимия
Замразени срези от 6 атеросклеротични плаки се инкубират с 1:10 нормален конски серум или 1:10 нормален кози серум в продължение на 30 минути на стайна температура, измиват се веднъж с PBS, след това се инкубират или с първо мишо моноклонално антитяло срещу CD68 за макрофагиална идентификация (DAKO-CD68, КР1), или с първо мишо моноклонално антитяло срещу човешки гладко мускулен а-актин (1А4, DAKO), за идентифициране на гладко мускулни клетки. За да се идентифицират IL-18 и IL-18 рецептора в атеросклеротичните плаки, се използват специфични кози поликлонални антитела (R & D Systems), при разреждане 5 pg/mL. IL-18 ВР се детектира чрез използване на специфично моноклонално антитяло, насочено срещу рекомбинантна човешка IL-18BP изоформа (Н20) (Corbaz et al., 2000 статията е представена). След измиване с PBS, срезите са инкубират със следните втори биотинилирани антитела: биотинилирано конско анти-мишо IgG (Vector Laboratories, Inc), при разреждане 1:200, за детекция на оцветяването с антитела срещу CD68, гладко мускулен α-актин и IL-18 ВР, и биотинилирано конско анти-козе IgG (Vector), при разреждане 1:200, за детекция на анти-1Е-18 и aHTH-IL-18 рецепторни антитела. Имунооцветяването се визуализира като се използват авидинбиотин HRP визуализиращи системи (Vectastain ABC kit РК-6100 Vector). Като негативни контроли се оцветяват съседни срезчета с изотип-подобни несвързани антитела, вместо с първични антитела.
РНК препарат
От 29 атеросклеротични плаки се екстрахира тотална РНК в разтвор от кисел гуанидин тиоцианат и се екстрахира с фенол и хлороформ, съгласно метода на Chomczynski и Sacchi (29). Пречистената РНК се разтваря във вода и концентрацията и се измерва чрез абсорбция при 260 nm. Целостта на РНК се оценява чрез електрофореза върху 1 % агарозен гел. Синтезира се кДНК от pg тотална PHK, като се използва Promega обратна траскриптазна система, съгласно протокола на производителите.
Полу-количествен и Real-time PCR на човешки IL-18 и IL18ВР в човешки атеросклеротични плаки
Полу-количествени PCR реакции се провеждат в общ обем от 50 pl, в присъствие на Ш от AmpliTaq ДНК Полимераза (Perkin Elmer, Roche, U.S.A), 2.5 mM dNTPs (Amersham, U.S.A) и 50 pmoles от прав и обратен PCR праймери. Реакциите се инкубират в РТС200 Peltier Effect Thermal Cycler (MJ Research, U.S.A), при следните условия: денатурация 1 минута, при 94°С, хибридизация за 1 минута при 55°C и продължаване на реакцията за 1 минута при 72°С. За да се обезпечи сравнението на количеството от PCR продукти по време на линейната фаза от PCR реакцията, се анализират IL-18BP, IL-18 и β-актин, след 25, 28 и 31 цикъл. Определен е оптималният брой цикли за IL-18BP, IL-18 и β-актин, преди насищането на ивиците (31, 28 и 25, респективно). PCR праймерите са конструирани въз основа на публикуваните секвенции (AF110799, D49950, Х00351) както следва:
IL-18, обратен 5’-GCGTCACTACACTCAGCTAA-3’;
прав
IL18BP, прав обратен β-актин, обратен
5’-GCCTAGAGGTATGGCTGTAA-3’;
’ - ACCTGTCTACCTGGAGTGAA-3 ’;
’ -GC ACGA AGATAGGAAGTCTG-3 ’;
’-GGAGGAGCAATGATCTTGATCTTC-3 ’;
прав 5 ’-GCTCACCATGGATGATGATATCGC-3 ’.
За да се изключи амплификацията на възможна геномна ДНК, контаминираща пробите, PCR реакциите се провеждат в отсъствие на кДНК матрица. PCR продуктите (10μ1) се анализират върху 1 % агарозни гелове, чрез електрофореза в lx ТАЕ буфер. Размерът на
PCR продуктите се проверява чрез сравняване с 1 kb стълбица (Gibco), след оцветяване на телчетата. Провежда се оценка за относителното количество на оцветените с етидиев бромид ивици под UV светлина, като се използва Kodak Digital Sciences аналитичен софтуер и то е съобщено като съотношение на прицелен ген (hIL-18BP, hIL-18) към housekeeping гена (hp-actin).
SYBR Green Real Time PCR праймери са проектирани за IL18, IL-18BP и GAPDH (house-keeping контрола), като се използва Primer Express софтуер от РЕ Biosystems, съгласно публикуваните секвенции (AF110799, D49950, NM 002046) както следва: IL-18, обратен 5’-CAGCCGCTTTAGCAGCCA-3’;
прав 5 ’-CAAGGAATTGTCTCCCAGTGC-3 ’;
IL18BP, обратен 5’-AACCAGGCTTGAGCGTTCC-3’; прав 5 ’-TCCCATGTCTCTGCTCATTTAGTC-3 ’;
GAPDH, обратен 5’-GATGGGATTTCCATTGATGACA-3’; прав 5 ’ -СС АССС ATGGC АААТТСС-3 ’;
интрон- GAPDH, обратен 5 ’ -CCTAGTCCCAGGGCTTTGATT-3 ’; прав 5 ’-CTGTGCTCCCACTCCTGATTTC-3 ’.
Анализират се специфичността и оптималната праймерна концентрация. Възможна геномна ДНК контаминация се изключва чрез провеждане на PCR реакцията със специфични интронGAPDH праймери. Отсъствието на неспецифична амплификация се потвърждава чрез електрофоретичен анализ на PCR продуктите с
3.5 % агарозен гел. SYBR Green Real-Time PCR се провежда с 5 μΐ /ямка от RT-продукти (0.5 ng тотална RNA), 25 μΐ/ямка от SYBR Green PCR master смес (PE Biosystem, СА, USA), с AmpErase Урацил N-Гликозилаза (UNG) (0.5 Unit /ямка) и 20 μΐ праймери (300 nM). PCR се провежда при 50°С за 2 минути (за AmpErase UNG инкубация, за да се отстрани всеки урацил включен в кДНК),
95°С за 10 min (за AmpliTaq Gold активиране) и след това провеждане на 40 цикъла при 95°С за 15 секунди, 60°С за 1 минута с ABI PRISM 7700 Система за детекция. По този начин с обратна транскриптаза се амплифицират кДНК проби и се определят стойностите на техния Ct (прагов цикъл). Всички Ct стойности са нормализирани спрямо housekeeping гена GAPDH. Наблюдава се единична специфична ДНК ивица за IL-18, IL-18BP и GAPDH, като се използва гел електрофоретичен анализ.
Принципът на real-time детекция, като се използва “SYBR Green PCR master mix”, се базира на директна детекция на PCR продукта, чрез измерване на увеличената флуоресценция, причинена от свързването на боята SYBR Green с двойноверижната ДНК.
Статистически анализ
Данните са дадени като средни стойности ± SEM. Нивата на IL-18 се сравняват между групите, като се използва Mann-Whitney теста. Стойността на р 0.05 се счита за статистически значима.
Пример 1: Протектиране от IL-18 инхибиторите на ендотелна клетъчна смърт, индуцирана от окислени липопротеини (oxLDL)
Култивирани човешки ендотелни клетки от пъпната вена (HUVECs) се излагат в продължение на 16 часа на oxLDL, в присъствие или отсъствие на IL-18 свързващ белтък или анти-IL-18 антитяло. Както е показано на Фигура 1, 83 % от HUVECs умират след излагането им на действието на oxLDL. Ко-инкубацията с IL18ВР или с анти-IL-18 антитяло, спасява почти напълно клетките от смърт. Не се наблюдава клетъчна смърт при използване на IL18ВР. 89 % от клетките преживяват, когато се използва анти-1Ь-18 антитяло.
Този експеримент ясно показва защитният ефект на два различни IL-18 инхибитора срещу клетъчната смърт, дължаща се на апоптоза в атеросклеротичната плака.
Пример 2: Експресия на белтъка IL-18 и неговия ендогенен инхибитор IL-18 ВР в атеросклеротични плаки
Проведени са Western блот анализи на белтъчни екстракти от 12 каротидни атеросклеротични артерии и 5 нормални контролни. Белтъкът IL-18 включващ активната форма, се експресира силно във всички атеросклеротични плаки, докато почти не се открива експресия или тя напълно липсва в нормални артерии (Фигура 2). Стартовете от 1 до 4 съдържат проби от атеросклеротични плаки, стартове от 5 до 7 са от нормални артерии. Интересното е, че детекцията на активната форма на IL-18 вероятно корелира с експресията на активната форма на каспаза-1, която е включена в процесинга на IL-18 (Фигура 2 четвърти ред). Наблюдава се също така значителна експресия на IL-18 рецепторния белтък (осверигата), във всички атеросклеротични плаки, в сравнение с много слабото ниво на експресия в нормални артерии (Фигура 2 втори ред). В допълнение, по-голяма част от атеросклеротичните плаки експресират IL-18BP, въпреки че нивото на експресия е хетерогенно (Фигура 2 първи ред).
Пример 3: Клетъчна локализация на белтъка IL-18 и неговия ендогенен инхибитор IL-18BP в атеросклеротични плаки
За да се определи клетъчната локализация на IL-18 и IL-18ВР, се провеждат имунохистохимични изследвания е 6 каротидни атеросклеротични плаки. Както се вижда от Фигура 2, IL-18 се експресира главно в макрофаги, като тези клетки вероятно са основния източник за IL-18 в плаката (не е показано). Тези области са богати също така и на CD3-позитивни лимфоцити. Обаче изглежда, че Т лимфоцитите не са включени директно в получаването на IL-18. IL-18 се експресира също така в някои вътрешни гладко мускулни клетки и по-рядко в ендотелни клетки. За разлика от това, значителна експресия на IL-18BP се открива в капилярни ендотелни клетки е плаки и в тези от повърхността на лумена, въпреки че експресията не се открива във всички съдове. Относително ниска и по-хетерогенна експресия на IL-18 ВР се открива също така, главно извънклетъчно в някои богати на макрофаги области.
Пример 4: Експресия на IL-18 и IL-18BP иРНК транскрипти в атеросклеротични плаки и връзка е нестабилността на плаката
За да се определи дали човешки IL-18 и IL-18BP иРНК се експресират в човешки каротидни атеросклеротични плаки, се провежда полу-количествен RT-PCR със шест атеросклеротични плаки (Фигура 3). IL-18 и IL-18BP иРНКи се откриват във всички атеросклеротични плаки, въпреки че количеството на иРНК за IL18 и IL-18BP е хетерогенно. Следователно, за да се изчислят акуратно нивата на количеството на IL-18 и IL-18BP иРНК експресията, по-нататък се анализират 23 атеросклеротични плаки е метода SYBR Green Real-Time PCR (Фигура 4). Плаките се характеризират чрез клинично и патологично изследване като симптоматични (нестабилни) или асимптоматични (стабилни) плаки, съдържащи макроскопски или не съдържащи язви. Клиничните характеристики на пациентите са обобщени в Таблица 4. Процентът на редукция на каротидния диаметър (60 % - 95 %) и рисковите фактори, включващи възраст, диабети, хиперхолестеролемия, хипертензия и тютюнопушене, не се различава между двете групи.
Таблица 4
Характеристики на пациента
Асимптоматични | Симптоматични | |
Пациенти (п = 9) | Пациенти1(п =14) | |
Възраст 66.9 ± 4.0 | 70.2 ±3.9 | |
Род Мъжки (8) | Мъжки (9) | |
Хипертензия2 8 | 9 | |
Хиперхолестеролемия3 | 4 | 8 |
Диабети | 3 | 1 |
Понастоящем пушачи | 7 | 8 |
Коронарно артериално заболяване 5 | 4 | |
’Тези пациенти са | с временна | или упорита исхемична |
церебрална атака 2-66 дена преди ендартеректомия.
2Брой пациенти с клинична хипертензия, които са лекувани с антихипертензивни компоненти.
3Брой пациенти с клинична хиперхолестеролемия, които са лекувани с лекарствени препарати, понижаващи липидното съдържание.
Намерено е, че количеството на IL-18 се регулира нагоре в симптоматичните, в сравнение с асимптоматичните атеросклеротични плаки (2.03 ± 0.5 срещу 0.67 ±0.17, респективно) (Фигура 4А). Статистическият анализ показва, че това увеличение в продукцията на IL-18, наблюдавано в симптоматичните плаки е с висока значимост (р < 0.0074), докато увеличеното количество на IL-18BP, наблюдавано в симптоматичните спрямо асимптоматичните плаки не е (4.64 ± 0.98 срещу 2.5 ± 0.92, респективно) (Фигура 4В). С други думи, въпреки че и двете групи симптоматични и асимптоматични показват положителна корелация между IL-18 и IL-18BP иРНК, наклоните са значително различни между двете групи (симптоматична група: наклон 1.16 [0.19-2.14], г = 0.36 срещу асимптоматична група: наклон 4.79 [2.39-7.20], г2 = 0.76; р < 0.05). Следователно, изглежда че относителното повишаване на експресията на IL-18BP в симптоматичната група не е достатъчно, за да компенсира повишената експресия на IL-18. Освен това, тъй като присъствието на възпаление се счита като отличителна характеристика за нестабилността на плаките, затова по-нататък е проведен статистически анализ с плаки, притежаващи или не вътре-плакови възпаления и е показана значително повишена регулация на IL-18 в плаките в които присъстват язвички (р < 0.018) (Фигура 4С).
Тези данни показват, че увеличаването на експресията на IL18, наблюдавана в атеросклеротичните плаки, корелира с нестабилността на плаката.
Пример 5: IL-18BP модулира развитието на атеросклеротична лезия и стабилността в in vivo модели на болестта
Методи
Характеристики на пациента
Плазмени проби се получават от пациенти с остри исхемични коронарни синдроми (нестабилна ангина и инфаркт на миокарда), по-малко от 7 дни след началото на симптомите. Нестабилната ангина се определя като свързана с типична гръдна болка, или с исхемични промени в електрокардиограмата, или с присъствието на коронарно артериално заболяване. Инфаркт на миокарда се диагностицира въз основа на типичните исхемични промени в електрокардиограмата, свързана със значително увеличаване на миокардиални ензими (креатин фосфокиназа и тропонин I) в циркулиращата кръв. Пациентите без исхемия се набират в същия кардиологичен департамент и те са лишени напълно от сигнали за исхемия. Определят се плазмените нива на човешки IL-18, като се използва наличен в търговската мрежа кит (MBL, Japan).
In vivo интрамускулен електротрансфер на миши IL-18BP експресионен плазмид
Четиринадесет мъжки C57BL/6 ароЕ КО мишки, на възраст 14-седмици, получават през интервал от три седмици, 3 инжекции с експресионния IL-18BP плазмид, pcDNA3-IL18BP. Контролните мишки (п = 19) се инжектират с контролен празен плазмид. Мишата IL-18BP изоформа d кДНК, изолирана както е описано (номер за достъп # Q9ZOM9) (23), се субклонира в EcoRl/Notl места от експресионен вектор на клетка от бозайник pcDNA3, под контрола на цитомегаловирусния промотор (Invitrogen). Конструктът наречен 334.yh, е показан на Фигура 5. По подобен начин е конструиран контролен плазмид, лишен от терапевтична кДНК. IL-18BP или контролният експресионен плазмид (60 pg) се инжектират както в тибиалните, така и в краниалните мускули на анестезирана мишка, както е описано преди това (13). Накратко, електрични импулси през кожата (8 правоъгълни (квадратни) електрични импулса 200 V/cm, 20 msec продължителност, 2 Hz) се доставят от PS-15 електропулсатор (Genetronics, France), като се използват два плоски електрода от неръждаема стомана, поставени на 4.2 до 5.3 mm един от друг, от всяка страна на крака.
Elisa mIL-18BP
Плаките се покриват за една нощ е г-т1Ь-18ВР(1-афинитетно пречистено заешко поликлонално антитяло (5 pg/ямка). Разтворимият mIL-18BP се детектира, като се използва биотинилирано заешко поликлонално антитяло (0.3 pg/ml), получено срещу Е. coli r-mIL-18BP (Peprotec), след което следва екстравидин пероксидаза (1/1000) (Sigma). Свързаното заешко поликлонално антитяло се анализира чрез Western блот, за да се потвърди специфичността на mIL-18BP. Като стандарт се използва рекомбинантен mIL-18BPd, получен от НЕК 293 клетки. Чуствителността на ELISA е 5 ng/ml.
Анализ на мишки
От аортния синус се получават криостатни срези (8 pm) и се използват за детектиране на липидно отлагане като се използва Oil red, за детектиране на колаген чрез използване на Sirius red и за имунохистохимичен анализ, както е описано преди това (13). Срезите се оцветяват със специфични първи антитела: анти-мишо макрофагиално, клон МОМА2 (BioSource), конюгирана алкална фосфатаза анти-а-актин за гладко-мускулни клетки и анти-СОЗ за
Т лимфоцити (Dako), както е описано преди това (13). За детектиране на клетъчна смърт се прилага използването на TUNEL техниката (13). Преброяват се случайно CD3 позитивни клетки микроскопски. Атеросклеротичните плаки в аортния синус и областите които са оцветени позитивно за макрофаги, гладко мускулни клетки, колаген или TUNEL, се измерват като се използва компютърно създаден образ за определяне на количеството (NS15000, Microvision), както е описано преди това (13). Оцветяването с неимунни изотип-подобни имуноглобулини определя специфичността на имунооцветяването. Специфичността на TUNEL се определя чрез изпускане на ензима терминална дезоксинуклеотидил трансфераза. Торакалните аорти обхващащи лявата субклавиална артерия до бъбречните артерии се фиксират с 10 % буфериран формалин и се оцветяват за липидно отлагане с Oil red. След това те се отварят по дължина и се изчислява процентът на липидното отлагане чрез компютърно създаден образ за определяне на количеството (NS15000, Microvision).
Резултати
В настоящото изследване е анализирана хипотезата, че регулирането на IL-18/IL-18BP има критична роля както за атеросклерозата, така и за стабилността на плаките. Измерени са плазмените нива на IL-18 в пациенти с остри коронарни синдроми (30 мъже, 18 жени, със средна възраст 66.2 ± 1.8 години, от които 14 имат нестабилна ангина, а 34 имат инфаркт на миокарда) и в контролни пациенти без исхемия, набрани в същия кардиологичен департамент (10 мъже, 3 жени, със средна възраст 60.0 ± 5.2 години). Плазмените нива на IL-18 се увеличават значително при пациенти с остро коронарно заболяване, в сравнение с контролите (146.9 ± 17.1 спрямо 73.0 ± 12.2 pg/ml, респективно, р < 0.05), в сравнение с циркулиращите нива на IL-18BP, които са слабо увеличени (20.1 ± 2.7 спрямо 7.5 ± 2.5 ng/ml, респективно, р = 0.06). В допълнение, нивата на IL-18 корелират с тежестта на заболяването, като най-високи нива се наблюдават при пациенти с тежка исхемична сърдечна дисфункция и клинични сигнали за белодробен едем (224.03 ± 39.1 pg/ml, р < 0.001 в сравнение с контролите). Тези резултати получени от пациенти с остро сърдечно заболяване, заедно с предишните наблюдения, че IL-18 се повишава в атеросклеротичните плаки при пациенти с мозъчен удар [Mallat, 2001], допускат възможната важна роля за регулацията на IL-18/IL-18BP в атеросклеротичния процес.
Следователно, ние проверихме тази хипотеза, като използвахме ароЕ нокаут (КО) мишки, които развиват спонтанно подобни на човешките, атеросклеротични увреждания. Четиринадесет мишки на възраст 14 седмици, получават като допълнение IL-18BP интрамускулно, чрез in vivo електротрансфер на експресираща се плазмидна ДНК, кодираща миши IL-18BPd, докато 19 контролни със сходна възраст, получават празен плазмид. Плазмидният електротрансфер се повтаря всеки 3 седмици и мишките се убиват на 23 седмица на възраст 9 седмици след третирането. Плазмените нива на мишия IL-18BP са по-ниски, отколкото определените граници (5 ng/ml) в ароЕ КО мишки, инжектирани с празния плазмид. Обаче еднократна инжекция от IL-18BP плазмида води до високи нива на IL-18BP в кръвта, с максимално увеличение 2 дена след инжекцията (323.5 ± 100.9 ng/ml) и 127.4 ± 35.4 ng/ml, измерени след 2 седмици. Девет седмици след третирането или с IL-18BP, или с празен плазимд, общият холестерол (489.4 ± 34.6 спрямо 480.8 ± 36.3 mg/dl, респективно) и серумните нива на високо-плътностните липопротеини (52.3 ± 9.4 спрямо 48.8 ±5.1 mg/dl, респективно) не се различават между двете групи. Умерено, но значително увеличение на теглото на животните се наблюдава при IL-18BPтретираната група, в сравнение с контролната група (31.8 ± 0.9 спрямо 28.6 ± 0.8 g, респективно, р < 0.05).
Резултатът от добавянето на IL-18BP при атеросклероза се оценява в два различни участъка: низходящата торакална аорта и аортния синус. Торакалната аорта е избрана, за да се определи ролята на IL-18BP в развитието на мастното уплътняване (атерогенеза), тъй като торакални атеросклеротични лезии отсъстват почти напълно на възраст 14 седмици (данните не са показани), където е започнала IL-18BP трансфекцията. Аортният синус, където вече присъстват атеросклеротични лезии на възраст 14 седмици (данните не са показани), се изследва за напреднала прогресия на плаките и състава, един важен фактор за стабилността на плаките. 1Ь-18ВР-третирането на ароЕ КО мишки повлиява значително развитието и прогресията на атеросклеротичната лезия. Изследването на торакалната аорта показва значителна редукция на липидното отлагане в мишки, третирани с IL-18BP плазмида, в сравнение с празния плазмид (Фигура 6). Компютърно създаден образ за количествения анализ показва 69 % намаляване на степента на атеросклеротичните лезии (р < 0.0001) (Фигура 6), което показва критичната, решаваща роля на IL-18 за атеросклерозата. В допълнение, третирането с IL-18BP плазмида само за 9 седмици, ограничава значително развитието на напредналите атеросклеротични плаки в аортния синус (24 % намаление в размера на плаката, р = 0.01), в сравнение с третирането с празен плазмид (Фигура 7).
Много по-важно е, че съставът на напредналите лезии, като основен фактор за нестабилността на плаките, е силно повлиян от третирането с IL-18BP. Атеросклеротичните лезии на мишки третирани с IL-18BP плазмида, показват значително 50 % намаляване на макрофагиална инфилтрация (р < 0.0001) (Фигура 8), съдържаща 67 % по-малко Т лимфоцити (р < 0.005) (Фигура 8), и показва двукратно увеличаване на натрупването в гладко мускулните клетки (р < 0.05) (Фигура 9). В допълнение, тези важни промени в увредения клетъчен състав, са свързани със значително 85 % увеличаване на съдържанието на колаген (р < 0.0005), което е определено чрез оцветяване със Sirius red и намаляване на общото липидно съдържание.
Следователно, третирането с IL-18BP води до значително намаляване на възпалителният процес в атеросклеротичните лезии и индуцира лечебен процес, характеристика на стабилните атеросклеротични плаки. Освен това, отбелязаната редукция във възпалителния компонент на лезиите в мишки, третирани с IL18ВР, е свързана със значителна редукция на случаите на клетъчна смърт в плаките Д9 ± 0.9 % при IL-18BP третирани мишки спрямо
10.5 ± 3.6 % гои контролите, р < 0.05), като по този начин следователно се намалява разширяването и тромбогенността на ацелуларната ли идна сърцевина [Mallat, 1999].
Заключения:
Като се из олзва добре утвърден миши модел, наподобяващ атеросклерозата :ри човек, резултатите съобщени по-горе ясно показват неочакваната и критична роля на регулацията на IL-18 и IL-18BP в развитието, прогресията и стабилността на атеросклеротичните плаки. Така както и предпазването от образуване на ргнна лезия в торакалната аорта, инхибирането на IL-18 активнос т чрез добавяне на IL-18BP, повлиява също така силно състава на напредналите лезии в аортния синус, индуцирайки превключване към стабилен фенотип на плаките.
Клиничната прогноза при пациенти с атеросклероза зависи само отчасти от размера на лезиите. Днес все повече се приема идеята, че по скоро качеството (съставът на плаката), отколкото размера на лезията може да бъде дори по-добър пророк за честотата на исхемичните случаи. Наистина, тежките клинични прояви на атеросклерозата (инфаркти на сърцето и мозъка) се дължат главно на запушване на съдовия лумен от тромб, който се образува в мястото на контакта на разрушената атеросклеротична плака (19). Патологичните изследвания показват, че уязвимите или нестабилни плаки, които са предразположени към разрушаване или са разрушени, са богати на възпалителни клетки и показват значителна загуба на гладко-мускулни клетки и съдържани на колаген (20, 21). Освен това, такива плаки показват значително увеличаване на апоптозна клетъчна смърт, което води до формиране на силно тромбогенна липидна сърцевина (13, 22). Заслужава внимание фактът, че всички тези сигнали за увеличена нестабилност на плаките намаляват значително в мишки, третирани с IL-18BP, което показва, че IL-18 сигнализацията е основен фактор за нестабилността на плаките.
Практическото значение на резултатите получени при ароЕ КО мишки, по отношение на заболяванията при човека, се засилват от нашите открития за повишени нива на циркулиращия IL-18, при пациенти с остри коронарни синдроми и увеличена продукция на IL-18 в нестабилни каротидни атеросклеротични плаки, отговорни за мозъчния инсулт. Всички тези открития взети заедно, идентифицират инхибиторите на активността на IL-18, като нови важни терапевтични средства за предпазване и лечение от развитието на атеросклеротични плаки и за ограничаване на усложненията при тяхното развитие.
Пример 6: Повишените нива на IL-18 корелират с периодични случаи на пациенти със сърдечна недостатъчност
Нивата на IL-18 се измерват в кръвния серум на пациенти чрез ELSIA с IL-18 специфично антитяло.
Подлагат се на анализ всичките, 56 исхемично болни пациенти както и пациентите без исхемия, със сърдечна недостатъчност или пациенти, които нямат такава.
В пациентите, които умират по-късно, нивата на IL-18 са 216.0 + 41.5 pg/ml, спрямо 112.2 + 12.2 pg/ml при пациенти без смъртоносен изход (р = 0.0018).
При пациенти, при които се наблюдават каквито и да са периодични случаи, като смърт, периодична исхемия, реваскуларизация, прогресивна атеросклероза или ре-хоспитализация при сърдечна недостатъчност, са измерени следните нива на IL-18: 165.8 + 23.8 спрямо 107.7 + 14.6, при пациенти при които не се наблюдават периодично повтарящи се случаи (р = 0.03).
Тези резултати показват, че нивата на IL-18 са значително повишени при пациенти с лоша клинична прогноза, такива като тези с периодично повтарящи се състояния или дори при тези завършващи със смърт.
Измерени са нивата на IL-18 в кръвни проби на 16 пациенти, които не страдат от исхемично заболяване, които имат или при които липсва сърдечна недостатъчност. При пациенти, които покъсно умират, нивата са 199.0 + 34.8 pg/ml спрямо 95.3 + 20.4 pg/ml, при тези пациенти, които остават живи (р = 0.09).
Пациенти с каквито и да са периодично повтарящи се състояния: 146.6 + 34.4 pg/ml IL-18, спрямо 95.4 + 23.9 pg/ml, при пациенти при които не се срещат периодично повтарящи се случаи (р = 0.03). Въпреки че различията в нивата на IL-18 не са статистическа значими, поради малкия брой пациенти, наблюдава се ясна тенденция към повишаване на нивата на IL-18.
При пациенти с исхемия, нивата на IL-18 са 214.2 + 45.9 pg/ml при пациенти, които умират, спрямо 118.4 + 12.8 pg/ml при тези, които остават живи (р = 0.007).
При пациенти, които са с каквото и да е периодично повтарящо се състояние, измерените нивата на IL-18 са 162.8 + 24.7 pg/ml, спрямо 116.2 + 16.0, при пациенти при които не се срещат периодично повтарящи се състояния.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ross R. Atherosclerosis-an inflammatory disease. N Engl J Med 1999;340:115-126.
2. van der Wai AC, Becker AE, van der Loos CM, Das PK. Site of intimal rupture or erosion of thrombosed coronary atherosclerotic plaques is characterized by an inflammatory process irrespective of the dominant plaque morphology. Circulation 1994;89:36-44.
3. Fuster V, Badimon L, Badimon JJ, Chesebro JH. The pathogenesis of coronary artery disease and the acute coronary syndromes (1). N Engl J Med 1992;326:242-250.
4. Fuster V, Badimon L, Badimon JJ, Chesebro JH. The pathogenesis of coronary artery disease and the acute coronary syndromes (2). N Engl J Med 1992;326:310-318.
5. Lee RT, Libby P. The unstable atheroma. Arterioscler Thromb Vase Biol 1997; 17:1859-1867.
6. Ridker PM, Cushman M, Stampfer MJ, Tracy RP, Hennekens CH. Inflammation, aspirin, and the risk of cardiovascular disease in apparently healthy men. N Engl J Med 1997;336:973-979.
7. Libby P. Molecular bases of the acute coronary syndromes. Circulation 1995;91:2844-2850.
8. Nakamura, K, Okamura, H, Nagata, K and Tamura, T. (1989). Infect. Immun. 57, 590-595.
9. Yoshimoto T, Takeda, K, Tanaka, T, Ohkusu, K, Kashiwamura, S, Okamura, H, Akira, S and Nakanishi, K (1998). J. Immunol. 161, 3400-3407.
10. Pamet, P, Garka, K E, Bonnert, T P, Dower, S K, and Sims, J E. (1996). J. Biol. Chem. 271, 3967-3970.
11. DiDonato, J A, Hayakawa, M, Rothwarf, D M, Zandi, E and Karin, M. (1997). Nature 388, 16514-16517.
12. Novick, D, Kim, S-H, Fantuzzi, G, Reznikov, L, Dinarello, C, and Rubinstein, M (1999). Immunity 10, 127-136.
13. Mallat Z, Hugel B, Ohan J, Leseche G, Freyssinet JM, Tedgui A. Shed membrane microparticles with procoagulant potential in human atherosclerotic plaques. A role for apoptosis in plaque thrombogenicity. Circulation 1999;99:348-353.
14. Tricot O, Mallat Z, Heymes C, Belmin J, Leseche G, Tedgui A. Relation Between Endothelial Cell Apoptosis and Blood Flow
V Direction in Human Atherosclerotic Plaque.Circulation 2000;in press.
15. Dimmeler S, Haendeler J, Galle J, Zeiher AM. Oxidized low-density lipoprotein induces apoptosis of human endothelial cells by activation of CPP32-like proteases. A mechanistic clue to the 'response to injury' hypothesis. Circulation 1997;95:1760-3.
16. Grantham, Science, Vol. 185, pp. 862-864 (1974).
17. Dimmeler S, Haendeler J, Galle J, Zeiher AM. Oxidized low-density lipoprotein induces apoptosis of human endothelial cells by activation of CPP32-like proteases. A mechanistic clue to the 'response to injury' hypothesis. Circulation 1997;95:1760-3.
Cl 8. Mir LM, Bureau MF, Gehl J, Rangara R, Rouy D, Caillaud JM, Dellere P, Branellec D, Schwartz B, Scherman D. High efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96:4262-7.
19. Lee, R.T. & Libby, P. The unstable atheroma. Arterioscler Thromb Vase Biol 17, 1859-1867 (1997).
20. Davies, M.J. The composition of coronary-artery plaques [editorial; comment]. N Engl J Med 336, 1312-1314 (1997).
21. Virmani, R., Kolodgie, F.D., Burke, A.P., Farb, A. & Schwartz, S.M. Lessons from sudden coronary death: a comprehensive morphological classification scheme for atherosclerotic lesions. Arterioscler Thromb Vase Biol 20, 1262-1275. (2000).
22. Kolodgie, F.D. et al. Localization of apoptotic macrophages at the site of plaque rupture in sudden coronary death [In Process Citation]. Am J Pathol 157, 1259-1268 (2000).
23. Kim, S.H. et al. Structural requirements of six naturally occurring isoforms of the IL- 18 binding protein to inhibit IL-18. Proc Natl Acad Sci U S A 97, 1190-1195 (2000).
24. Elliott, M.J., Maini, R.N., Feldmann, M., Long-Fox, A., Charles, P., Bijl, H., and Woody, J.N., 1994, Lancet 344, 1125-1127.
25. Knight DM, Trinh H, Le J, Siegel S, Shealy D, McDonough M, Scallon B, Moore MA, Vilcek J, Daddona P, et al. Construction and initial characterization of a mouse-human chimeric anti-TNF antibody .Mol Immunol 1993 Nov 30:16 1443-53
26. Tucci, A., James, H., Chicheportiche, R., Bonnefoy, J.Y., Dayer, J.M., and Zubler, R.H., 1992, J.Immunol. 148,2778-2784.
27. Engelmann, H., D. Novick, and D. Wallach. 1990. Two tumor necrosis factor-binding proteins purified from human urine. Evidence for immunological cross-reactivity with cell surface tumor necrosis factor receptors. J. Biol. Chem. 265:1531-1536.
28. Moore WS, Barnett HJ, Beebe HG, et al. Guidelines for carotid endarterectomy. A multidisciplinary consensus statement from the Ad Hoc Committee, American Heart Association. Circulation 1995;91:566-79.
29. Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 1987;162:156-9.
Claims (48)
- ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ1. Използване на IL-18 инхибитор за производство на лекарствен препарат, за лечение и/или предпазване от атеросклероза.
- 2. Използване на IL-18 инхибитор за производство на лекарствен препарат, за лечение и/или предпазване от тромбоза от атеросклеротична плака.
- 3. Използване на IL-18 инхибитор за производство на лекарствен препарат, за лечение и/или предпазване от язвена атеросклеротична плака.
- 4. Използване на IL-18 инхибитор за производство на лекарствен препарат, за лечение и/или предпазване от дестабилизация на атеросклеротична плака..
- 5. Използване на IL-18 инхибитор за производство на лекарствен препарат, за предпазване и/или лечение на исхемични синдроми, поради нестабилност на плаката.
- 6. Използване на IL-18 инхибитор за производство на лекарствен препарат, за лечение и/или предпазване от разрушаване на атеросклеротична плака.
- 7. Използване на IL-18 инхибитор за производство на лекарствен препарат, за лечение и/или предпазване от периодично повтарящи се състояния на сърдечна недостатъчност.
- 8. Използване съгласно Претенция 7, където сърдечната недостатъчност е исхемия.
- 9. Използване съгласно Претенция 7, където сърдечната недостатъчност е не е исхемия.
- 10. Използването съгласно която и да е от Претенции от 1 до 9, където инхибиторът IL-18 е избран от групата, съставена от ICE-инхибитори, антитела срещу IL-18, антитела срещу която и да е от рецепторните IL-18 субединици, инхибитори на рецепторния IL-18 сигнален път, антагонисти на IL-18, които се конкурират с IL-18 и блокират IL-18 рецептора и IL-18 свързващи белтъци, изоформи, мутеини, рекомбинантни белтъци, функционални производни, активни фракции или техни циклични пермутирани производни.
- 11. Използването съгласно Претенция 10, инхибиторът IL-18 е антитяло, насочено срещу IL-18.
- 12. Използването съгласно Претенция 11, антитялото е антитяло наподобяващо човешко.където където
- 13. Използването съгласно Претенция антитялото е човешко антитяло.
- 14. Използването съгласно Претенция11, където10, където инхибиторът за действието на IL-18 е IL-18BP, или изоформа, мутеин, производно или негов фрагмент.
- 15. Използването съгласно която и да е от Претенции от 10 до 14, където IL-18 свързващия белтък е РЕОликолиран.
- 16. Използването съгласно която и да е от Претенции от 10 до 15, където инхибиторът на IL-18 е рекомбинантен белтък, включващ целия или част от IL-18 свързващ белтък, свързан с целия или с част от имуноглобулин и където рекомбинантният белтък се свързва с IL-18.
- 17. Използването съгласно Претенция 16, където рекомбинантният белтък включва цялата или част от константната област на имуноглобулин.
- 18. Използването съгласно Претенция 17, където имуноглобулинът е от IgGl или IgG2 изотип.
- 19. Използването съгласно която и да е от предишните Претенции, където лекарственият препарат освен това включва интерферон, за едновременно, последователно или самостоятелно използване.
- 20. Използването съгласно Претенция 19, където интерферонът е интерферон-β.
- 21. Използването съгласно която и да е от предишните Претенции, където лекарственият препарат освен това включва Тумор некрозис фактор (TNF) антагонист за едновременно, последователно или самостоятелно използване.
- 22. Използването съгласно Претенция 21, където TNF антагонистът е TBP I и/или TBP II.
- 23. Използването съгласно която и да е от предишните Претенции, където лекарственият препарат освен това включва COX-инхибитор за едновременно, последователно или самостоятелно използване.
- 24. Използването съгласно Претенция 23, където СОХинхибиторът е СОХ-2 инхибитор.
- 25. Използването съгласно която и да е от предишните Претенции, където лекарственият препарат освен това включва инхибитор на тромбоксана, за едновременно, последователно или самостоятелно използване.
- 26. Използването съгласно Претенция 25, където инхибиторът на тромбоксана е аспирин.
- 27. Използването съгласно която и да е от предишните Претенции, където лекарственият препарат освен това включва компонент, понижаващ нивото на липидите, за едновременно, последователно или самостоятелно използване.
- 28. Използването съгласно Претенция 27, където компонентът, понижаващ нивото на липидите е HMG СоА инхибитор.
- 29. Използването съгласно Претенция 28, където HMG СоА инхибиторът е статии.
- 30. Използване съгласно която и да е от предишните Претенции, където лекарственият препарат се използва в комбинация с храни, с ниско съдържание на мазнини и/или ниско съдържание на холестерол и/или ниско съдържание на сол.
- 31. Използването съгласно която и да е от предишните Претенции, където инхибиторът на IL-18 се използва в количество от около 0.0001 до 10 mg/kg телесно тегло или от около 0.01 до 5 mg/kg телесно тегло, или около 0.1 до 3 mg/kg телесно тегло, или около 1 до 2 mg/kg телесно тегло.
- 32. Използването съгласно която и да е от предишните Претенции, където инхибиторът на IL-18 се използва в количество от около 0.1 до 1000 μg/kg телесно тегло или около 1 до 100 μg/kg 0.1 до 3 mg/kg телесно тегло, или около 10 до 50 gg/kg телесно тегло.
- 33. Използването съгласно която и да е от предишните Претенции, където инхибиторът на IL-18 се прилага подкожно.
- 34. Използването съгласно която и да е от предишните Претенции, където инхибиторът на IL-18 се прилага интрамускулно.
- 35. Използването съгласно която и да е от предишните Претенции, където инхибиторът на IL-18 се прилага ежедневно.
- 36. Използването съгласно която и да е от предишните Претенции, където инхибиторът на IL-18 се прилага през ден.
- 37. Използване на експресионен вектор, включващ кодиращата секвенция на инхибитора на IL-18, за производство на лекарствен препарат, за лечение и/или предпазване от атеросклероза.
- 38. Използване съгласно Претенция 37, където експресионният вектор се прилага чрез електротрансфер.
- 39. Използване съгласно Претенция 37 или 38, където експресионният вектор се прилага системно.
- 40. Използване съгласно всяка една от предишните Претенции, където експресионният вектор се прилага интрамускулно.
- 41. Използване на вектор за индуциране и/или повишаване на ендогенната продукция на инхибитор на IL-18 в клетка, за производство на лекарствен препарат за лечение и/или предпазване от атеросклероза.
- 42. Използване на клетка, която е генетично модифицирана, за получаване на инхибитор на IL-18, за производството на лекарствен препарат за лечение и/или предпазване от атеросклероза.
- 43. Метод за лечение и/или предпазване от атеросклероза, характеризиращ се с това, че включва прилагане на гостоприемник нуждаещ се от него, на ефективно инхибиращо количество от IL-18 инхибитор.
- 44. Метод за предпазване и/или лечение на атеросклероза, характеризиращ се с това, че включва прилагане на гостоприемник нуждаещ се от него, на експресионен вектор, включващ кодиращата секвенция на инхибитора на IL-18.
- 45. Метод съгласно Претенция 44, характеризиращ се с това, че експресионният вектор се прилага системно.
- 46. Метод съгласно Претенция 44 или 45, характеризиращ се с това, че експресионният вектор се прилага чрез интрамускулна инжекция.
- 47. Използване на IL-18 като диагностичен маркер за лоша клинична прогноза при сърдечна недостатъчност.
- 48. Използване на IL-18 като диагностичен маркер, при периодично повтарящи се състояния, след първоначален случай на сърдечна недостатъчност.ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ1. Използване на IL-18 инхибитор за производство на лекарствен препарат, за лечение и/или предпазване от атеросклероза.2. Използване на IL-18 инхибитор за производство на лекарствен препарат, за лечение и/или предпазване от тромбоза от атеросклеротична плака.3. Използване на IL-18 инхибитор за производство на лекарствен препарат, за лечение и/или предпазване от язвена атеросклеротична плака.4. Използване на IL-18 инхибитор за производство на лекарствен препарат, за лечение и/или предпазване от дестабилизация на атеросклеротична плака..5. Използване на IL-18 инхибитор за производство на лекарствен препарат, за предпазване и/или лечение на исхемични синдроми, поради нестабилност на плаката.6. Използване на IL-18 инхибитор за производство на лекарствен препарат, за лечение и/или предпазване от разрушаване на атеросклеротична плака.7. Използване на IL-18 инхибитор за производство на лекарствен препарат, за лечение и/или предпазване от периодично повтарящи се състояния на сърдечна недостатъчност.8. Използване съгласно Претенция 7, където сърдечната недостатъчност е исхемия.9. Използване съгласно Претенция 7, където сърдечната недостатъчност е не е исхемия.10. Използването съгласно която и да е от Претенции от 1 до 9, където инхибиторът IL-18 е избран от групата, съставена от ICE-инхибитори, антитела срещу IL-18, антитела срещу която и да е от рецепторните IL-18 субединици, инхибитори на рецепторния IL-18 сигнален път, антагонисти на IL-18, които се конкурират с IL-18 и блокират IL-18 рецептора и IL-18 свързващи белтъци, изоформи, мутеини, рекомбинантни белтъци, функционални производни, активни фракции или техни циклични пермутирани производни.11. Използването съгласно Претенция 10, инхибиторът IL-18 е антитяло, насочено срещу IL-18.където12. Използването съгласно Претенция антитялото е антитяло наподобяващо човешко.13. Използването съгласно Претенция антитялото е човешко антитяло.14. Използването съгласно Претенция11, където11, където10, където инхибиторът за действието на IL-18 е IL-18BP, или изоформа, мутеин, производно или негов фрагмент.15. Използването съгласно която и да е от Претенции от 10 до 14, където IL-18 свързващия белтък е РЕОликолиран.16. Използването съгласно която и да е от Претенции от 10 до 15, където инхибиторът на IL-18 е рекомбинантен белтък, включващ целия или част от IL-18 свързващ белтък, свързан с целия или с част от имуноглобулин и където рекомбинантният белтък се свързва с IL-18.17. Използването съгласно Претенция 16, където рекомбинантният белтък включва цялата или част от константната област на имуноглобулин.18. Използването съгласно Претенция 17, където имуноглобулинът е от IgGl или IgG2 изотип.19. Използването съгласно която и да е от предишните Претенции, където лекарственият препарат освен това включва интерферон, за едновременно, последователно или самостоятелно използване.20. Използването съгласно Претенция 19, където интерферонът е интерферон-β.21. Използването съгласно която и да е от предишните Претенции, където лекарственият препарат освен това включва Тумор некрозис фактор (TNF) антагонист за едновременно, последователно или самостоятелно използване.22. Използването съгласно Претенция 21, където TNF антагонистът е TBP I и/или TBP II.23. Използването съгласно която и да е от предишните Претенции, където лекарственият препарат освен това включва COX-инхибитор за едновременно, последователно или самостоятелно използване.24. Използването съгласно Претенция 23, където СОХинхибиторът е СОХ-2 инхибитор.25. Използването съгласно която и да е от предишните Претенции, където лекарственият препарат освен това включва инхибитор на тромбоксана, за едновременно, последователно или самостоятелно използване.26. Използването съгласно Претенция 25, където инхибиторът на тромбоксана е аспирин.27. Използването съгласно която и да е от предишните Претенции, където лекарственият препарат освен това включва компонент, понижаващ нивото на липидите, за едновременно, последователно или самостоятелно използване.28. Използването съгласно Претенция 27, където компонентът, понижаващ нивото на липидите е HMG СоА инхибитор.29. Използването съгласно Претенция 28, където HMG СоА инхибиторът е статии.30. Използване съгласно която и да е от предишните Претенции, където лекарственият препарат се използва в комбинация с храни, с ниско съдържание на мазнини и/или ниско съдържание на холестерол и/или ниско съдържание на сол.31. Използването съгласно която и да е от предишните Претенции, където инхибиторът на IL-18 се използва в количество от около 0.0001 до 10 mg/kg телесно тегло или от около 0.01 до 5 mg/kg телесно тегло, или около 0.1 до 3 mg/kg телесно тегло, или около 1 до 2 mg/kg телесно тегло.32. Използването съгласно която и да е от предишните Претенции, където инхибиторът на IL-18 се използва в количество от около 0.1 до 1000 μg/kg телесно тегло или около 1 до 100 pg/kg 0.1 до 3 mg/kg телесно тегло, или около 10 до 50 pg/kg телесно тегло.33. Използването съгласно която и да е от предишните Претенции, където инхибиторът на IL-18 се прилага подкожно.34. Използването съгласно която и да е от предишните Претенции, където инхибиторът на IL-18 се прилага интрамускулно.35. Използването съгласно която и да е от предишните Претенции, където инхибиторът на IL-18 се прилага ежедневно.36. Използването съгласно която и да е от предишните Претенции, където инхибиторът на IL-18 се прилага през ден.37. Използване на експресионен вектор, включващ кодиращата секвенция на инхибитора на IL-18, за производство на лекарствен препарат, за лечение и/или предпазване от атеросклероза.38. Използване съгласно Претенция 37, където експресионният вектор се прилага чрез електротрансфер.39. Използване съгласно Претенция 37 или 38, където експресионният вектор се прилага системно.40. Използване съгласно всяка една от предишните Претенции, където експресионният вектор се прилага интрамускулно.41. Използване на вектор за индуциране и/или повишаване на ендогенната продукция на инхибитор на IL-18 в клетка, за производство на лекарствен препарат за лечение и/или предпазване от атеросклероза.42. Използване на клетка, която е генетично модифицирана, за получаване на инхибитор на IL-18, за производството на лекарствен препарат за лечение и/или предпазване от атеросклероза.43. Метод за лечение и/или предпазване от атеросклероза, характеризиращ се с това, че включва прилагане на гостоприемник нуждаещ се от него, на ефективно инхибиращо количество от IL-18 инхибитор.44. Метод за предпазване и/или лечение на атеросклероза,V характеризиращ се с това, че включва прилагане на гостоприемник нуждаещ се от него, на експресионен вектор, включващ кодиращата секвенция на инхибитора на IL-18.45. Метод съгласно Претенция 44, характеризиращ се с това, че експресионният вектор се прилага системно.46. Метод съгласно Претенция 44 или 45, характеризиращ се с това, че експресионният вектор се прилага чрез интрамускулна инжекция.47. Използване на IL-18 като диагностичен маркер за лоша клинична прогноза при сърдечна недостатъчност.48. Използване на IL-18 като диагностичен маркер, при периодично повтарящи се състояния, след първоначален случай на сърдечна недостатъчност.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP00109606 | 2000-05-05 | ||
PCT/EP2001/004843 WO2001085201A2 (en) | 2000-05-05 | 2001-04-30 | Use of il-18 inhibitors for the treatment and/or prevention of atherosclerosis |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
BG107218A true BG107218A (bg) | 2003-06-30 |
BG65881B1 BG65881B1 (bg) | 2010-04-30 |
Family
ID=8168631
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
BG107218A BG65881B1 (bg) | 2000-05-05 | 2002-10-24 | Използване на il-18 инхибитори за лечение и/или предпазване от атеросклероза |
Country Status (33)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20040076628A1 (bg) |
EP (1) | EP1278540B1 (bg) |
JP (1) | JP5122053B2 (bg) |
KR (2) | KR100798545B1 (bg) |
CN (2) | CN1841066B (bg) |
AR (1) | AR035640A1 (bg) |
AT (1) | ATE395075T1 (bg) |
AU (2) | AU6739001A (bg) |
BG (1) | BG65881B1 (bg) |
BR (1) | BRPI0110506B8 (bg) |
CA (1) | CA2407895C (bg) |
CY (1) | CY1110385T1 (bg) |
CZ (1) | CZ300792B6 (bg) |
DE (1) | DE60134009D1 (bg) |
DK (1) | DK1278540T3 (bg) |
EA (2) | EA005410B1 (bg) |
EE (1) | EE05056B1 (bg) |
ES (1) | ES2305082T3 (bg) |
HK (2) | HK1055681A1 (bg) |
HR (1) | HRP20020828A2 (bg) |
HU (1) | HU229375B1 (bg) |
IL (2) | IL152567A0 (bg) |
ME (1) | ME00554B (bg) |
MX (1) | MXPA02010895A (bg) |
NO (1) | NO329821B1 (bg) |
PL (1) | PL209371B1 (bg) |
PT (1) | PT1278540E (bg) |
RS (1) | RS50926B (bg) |
SI (1) | SI1278540T1 (bg) |
SK (1) | SK287761B6 (bg) |
UA (2) | UA87658C2 (bg) |
WO (1) | WO2001085201A2 (bg) |
ZA (1) | ZA200208228B (bg) |
Families Citing this family (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001058956A2 (en) * | 2000-02-10 | 2001-08-16 | Abbott Laboratories | Antibodies that bind human interleukin-18 and methods of making and using |
CA2435466C (en) * | 2001-01-29 | 2012-04-03 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Use of il-18 inhibitors for the treatment and/or prevention of heart disease |
CN1305529C (zh) * | 2001-05-25 | 2007-03-21 | 阿雷斯贸易股份有限公司 | Il-18抑制剂在治疗或预防中枢神经***损伤中的应用 |
US6797727B2 (en) | 2001-07-16 | 2004-09-28 | Transition Therapeutics Inc. | Use of rhein or diacerhein compounds for the treatment or prevention of vascular diseases |
US8729124B2 (en) | 2002-03-05 | 2014-05-20 | Pronova Biopharma Norge As | Use of EPA and DHA in secondary prevention |
GB0210212D0 (en) * | 2002-05-03 | 2002-06-12 | Univ Southampton | Effects of dietary N-3 and N-6 pufa intake on atheromatous plaque stability |
ME00548B (me) * | 2002-03-22 | 2011-10-10 | Serono Lab | Korišćenje inhibitora il-18 za liječenje i/ili prevenciju perifernih vaskularnih bolesti |
ATE399872T1 (de) * | 2003-03-11 | 2008-07-15 | Serono Lab | Expressionvektoren, die den promotor des ie2-gens des maus cytomegalovirus enthalten |
SI1622939T1 (sl) | 2003-05-13 | 2012-06-29 | Merck Serono Sa | Akrivne variante il-18 vezavnega proteina in medicinske uporabe le-tega |
US7968684B2 (en) | 2003-11-12 | 2011-06-28 | Abbott Laboratories | IL-18 binding proteins |
PT1755642E (pt) * | 2004-04-15 | 2010-04-20 | Athera Biotechnologies Ab | Anexina v para prevenção de aterotrombose e da ruptura de placas |
CN101219208B (zh) * | 2005-01-04 | 2010-08-11 | 健能隆医药技术(上海)有限公司 | 白介素-22的医药用途 |
AU2006254103B2 (en) | 2005-06-03 | 2012-09-06 | Ares Trading S.A. | Production of recombinant IL-18 binding protein |
RS52273B (en) | 2005-06-10 | 2012-10-31 | Ares Trading S.A. | PROCESS FOR PURIFICATION OF IL-18 BINDING PROTEIN |
RU2013110874A (ru) | 2010-08-25 | 2014-09-27 | Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг | Антитела против il-18r1 и их применения |
JOP20200308A1 (ar) | 2012-09-07 | 2017-06-16 | Novartis Ag | جزيئات إرتباط il-18 |
MD707Z (ro) * | 2013-01-18 | 2014-07-31 | Институт Зоологии Академии Наук Молдовы | Metodă de identificare a secvenţelor polimorfe 4a/4b ale genei sintetazei endoteliale a oxidului nitric |
HUE055608T2 (hu) | 2013-09-05 | 2021-12-28 | Ab2 Bio Sa | IL-18-kötõ fehérje (IL-18BP) gyulladásos betegségekben |
MX2017010919A (es) | 2015-03-05 | 2017-12-07 | Ab2 Bio Sa | Proteina de union il-18 (il-18bp) y anticuerpos en enfermedades inflamatorias. |
CN110273591B (zh) | 2019-08-13 | 2023-12-12 | 上海杉脉电子科技发展有限公司 | 一种单动力微型智能锁 |
TW202233675A (zh) | 2020-10-29 | 2022-09-01 | 瑞士商諾華公司 | Il-18拮抗劑用於治療和/或預防異位性皮炎或相關病症之用途 |
CN112972655A (zh) * | 2021-04-16 | 2021-06-18 | 武汉大学 | 白细胞介素12在制备预防、缓解和/或治疗主动脉瘤药物中的应用 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5985863A (en) * | 1996-09-12 | 1999-11-16 | Vertex Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for decreasing IGIF and IFN-γ production by administering an ICE inhibitor |
US5877197A (en) * | 1996-12-16 | 1999-03-02 | Karanewsky; Donald S. | C-terminal modified (N-substituted)-2-indolyl dipeptides as inhibitors of the ICE/ced-3 family of cysteine proteases |
IL121860A0 (en) * | 1997-08-14 | 1998-02-22 | Yeda Res & Dev | Interleukin-18 binding proteins their preparation and use |
CA2276216A1 (en) * | 1998-06-24 | 1999-12-24 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | An artificial peptide capable of neutralizing the biological activity of interleukin-18 |
EP0987552A3 (en) * | 1998-08-31 | 2000-06-07 | Pfizer Products Inc. | Diarylsulfonylurea binding proteins |
KR100537558B1 (ko) * | 1998-09-01 | 2005-12-19 | 가부시끼가이샤 하야시바라 세이부쓰 가가꾸 겐꾸조 | 인터류킨-18 결합 단백질 |
-
2001
- 2001-04-30 UA UAA200507913A patent/UA87658C2/uk unknown
- 2001-04-30 US US10/275,341 patent/US20040076628A1/en not_active Abandoned
- 2001-04-30 SK SK1556-2002A patent/SK287761B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2001-04-30 CN CN2006100092901A patent/CN1841066B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2001-04-30 IL IL15256701A patent/IL152567A0/xx unknown
- 2001-04-30 HU HU0301991A patent/HU229375B1/hu unknown
- 2001-04-30 DK DK01945064T patent/DK1278540T3/da active
- 2001-04-30 CZ CZ20023644A patent/CZ300792B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2001-04-30 BR BRPI0110506A patent/BRPI0110506B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-04-30 PT PT01945064T patent/PT1278540E/pt unknown
- 2001-04-30 JP JP2001581854A patent/JP5122053B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-04-30 KR KR1020077014038A patent/KR100798545B1/ko active IP Right Grant
- 2001-04-30 ME MEP-2008-640A patent/ME00554B/me unknown
- 2001-04-30 DE DE60134009T patent/DE60134009D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-04-30 PL PL365697A patent/PL209371B1/pl unknown
- 2001-04-30 SI SI200130832T patent/SI1278540T1/sl unknown
- 2001-04-30 EA EA200201175A patent/EA005410B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2001-04-30 EE EEP200200620A patent/EE05056B1/xx unknown
- 2001-04-30 EA EA200401183A patent/EA007014B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2001-04-30 AU AU6739001A patent/AU6739001A/xx active Pending
- 2001-04-30 CA CA2407895A patent/CA2407895C/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-04-30 AT AT01945064T patent/ATE395075T1/de active
- 2001-04-30 WO PCT/EP2001/004843 patent/WO2001085201A2/en active IP Right Grant
- 2001-04-30 UA UA2002129704A patent/UA78492C2/uk unknown
- 2001-04-30 RS YUP-826/02A patent/RS50926B/sr unknown
- 2001-04-30 EP EP01945064A patent/EP1278540B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-04-30 ES ES01945064T patent/ES2305082T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-04-30 MX MXPA02010895A patent/MXPA02010895A/es active IP Right Grant
- 2001-04-30 KR KR1020027014755A patent/KR20030016254A/ko not_active Application Discontinuation
- 2001-04-30 AU AU2001267390A patent/AU2001267390B2/en not_active Expired
- 2001-04-30 CN CNB018090540A patent/CN1250286C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2001-05-04 AR ARP010102129A patent/AR035640A1/es unknown
-
2002
- 2002-10-11 ZA ZA2002/08228A patent/ZA200208228B/en unknown
- 2002-10-16 HR HRP20020828 patent/HRP20020828A2/hr not_active Application Discontinuation
- 2002-10-24 BG BG107218A patent/BG65881B1/bg unknown
- 2002-10-31 IL IL152567A patent/IL152567A/en active IP Right Grant
- 2002-11-05 NO NO20025307A patent/NO329821B1/no not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-11-05 HK HK03107981A patent/HK1055681A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-03-02 HK HK07102380.7A patent/HK1094909A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2008
- 2008-06-30 CY CY20081100684T patent/CY1110385T1/el unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CA2407895C (en) | Use of il-18 inhibitors for the treatment and/or prevention of atherosclerosis | |
AU2001267390A1 (en) | Use of IL-18 inhibitors for the treatment and/or prevention of atherosclerosis | |
US7786274B2 (en) | Anti-IL-20 antibody and its use in treating IL-20 associated inflammatory diseases | |
JP4885424B2 (ja) | 末梢脈管疾患の治療および/または予防のためのil−18阻害剤の使用 | |
KR20020086540A (ko) | Il-18 저해물질의 용도 | |
BG66483B1 (bg) | Използване на инхибитори на интерлевкин -18 за лечение и/или профилактика на сърдечни заболявания | |
SK288413B6 (sk) | Použitie proteínu viažuceho IL-18 | |
AU2005211606B2 (en) | Use of IL-18 inhibitors for the treatment and/or prevention of atherosclerosis |