NO329821B1 - Anvendelse av IL-18 inhibitorer, ekspresjonsvektorer som koder for IL-18 inhibitorer og celler genetisk modifisert til a fremstille inhibitorer av IL-18 for fremstilling av medikamenter til behandling og/eller forebygging av aterosklerose, samt anvendelse av IL-18 som diagnostisk markor for progresjon av aterosklerose - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår vaskulære sykdommer. Mer spesifikt angår oppfinnelsen anvendelsen av IL-18-inhibitorer for fremstilling av medikamenter til behandling og/eller forebygging av aterosklerose.

Aterosklerose er den vanligste og mest viktige vaskulære sykdommen, men det er også kjent andre vaskulære lidelser og sykdommer. Aterosklerose påvirker de store og middels store arteriene, og dens sår innbefatter fettstreker, fibrolytiske plaketter og kompliserte sår. Aterosklerose er en kronisk inflammatorisk sykdom i arterieveggen,karakterisert vedprogressiv akkumulering av lipider som for eksempel kolesterol, celler, for eksempel makrofager, T-lymfocytter og glatte muskelceller, foruten en ekstracellulær matrise (1). Større akkumulasjoner kalles ateromer eller plakk, og inneholder ofte kalsium. Fettvevet kan erodere arterieveggen, noe som svekker arterienes elastisitet, og dette påvirker igjen blodstrømmen. Eventuelt kan det dannes klumper eller propper omkring plakkavsetningene, og dette påvirker igjen blodstrømmen og kan endelig føre til en total tiltetning av blodkaret. Vanligvis er aterosklerose assosiert med forhøyede nivåer av LDL-kolesterol, Lp(a)-fibrinogen og faktor VII, så vel som reduserte nivåer av HDL-kolesterol. Risikofaktorer innbefatter økende alder, hannkjønn, røyking, diabetes, overvekt, høyt blodinnhold av kolesterol, en diett med høyt fettinnhold og en personlig eller familiehistorie med hjertesykdommer. Aterosklerose er hovedårsaken til organiskemi, for eksempel myokardialt infarkt.

Aterom er den vanligste sårtypen i arteriene, og kan være ytterligere komplisert ved tromboembolisme. Ateromatøst plakk gjør ofte hulrommet i arteriene trangere, noe som kan forårsake iskemi og enkelte ganger atrofi av vevet i det hypoperfuserte området. Alvorlige konsekvenser innbefatte symptomer på angina, noe som skyldes myokardial iskemi, hjertesvikt som skyldes iskemi eller andre ikke-iskemiske reaksjoner, foruten hypertensjon som skyldes tiltetning av nyrenes arterier foruten hypoperfusjon av nyrene, som responderer fysiologisk ved økende sekresjon av renin.

Enkelte ganger blir aterosklerose og arteriosklerose angitt som separate patologiske tilstander, og i slike tilfeller vil aterosklerose være definert ved en hardning (sklerose) eller tap av elastisitet i arteriene som spesifikt skyldes aterom, mens arteriosklerose er en hardning eller et tap av elastisiteten i arteriene av andre årsaker.

Komplikasjoner eller konsekvenser av aterosklerose innbefatter koronar arteriesykdom (aterosklerose i hjertearteriene), manglende blodtilførsel som skyldes obstruksjon (iskemi/angina), akutt MI (hjerteinfarkt, hjerteattakk), forbigående iskemisk attakk (TIA) eller slag, og skade på blodkar, muskler eller kroppsorganer.

Aneurisme som er en permanent og unormal utvidelse av blodkarene er en vanlig konsekvens av aterosklerose. Hos eldre pasienter er det ofte vanlig å se en utvikling av aterosklerotisk abdominal aneurisme i aorta. Disse kan ofte bryte inn i det retroperitoneale rommet. I aterosklerotisk aneurisme er det vanlig å observere et betydelig tap av elastisk vev og fibrose i media (det mellomste laget av blodkarveggen), som i alt vesentlig skyldes iskemi i musklene i aorta media, noe som forårsaker en frigjøring av makrofagenzymer som igjen frembringer en fragmentering av elastiske fibrer.

Medikamentregimer som er anbefalt for behandling og/eller for å hindre aterosklerose innbefatter en reduksjon av blodfett/kolesterol. Spesielt er det vanlig å anvende en terapi for å senke nivået av LDL-kolesterol. For tiden er det mest vanlig å bruke statiner som er spesifikke inhibitorer av HMG CoA-reduktase. Andre fettsenkende midler innbefatter medikamenter som kolestyramin, kolestipol, nikotinsyre, gemfibrozil, probucol, lovastin og andre.

En annen fremgangsmåte er å minimalisere risikoen for trombedannelse på etablerte ateromatøse sår. Aspirin som synes å være en spesifikk inhibitor av tromboksan A2-kontrollert plateaggregering, eller antikoaguleringsmidler, kan brukes for å redusere risikoen for blodproppdannelse.

Perkutan "ballongangioplasti" bruker et kateter med en ballong i enden for å flate ut plakk eller for å øke blodstrømmen forbi en fortetning. Denne teknikken er lik den som brukes for å åpne hjertearteriene, men kan også anvendes på mange andre arterier i kroppen. Koronare arteriestenoser kan omgås (bypassed) med segmenter av safenøs vene som sys inn i den proksimale aorta, eller ved å dissekere den indre brystarterien fra brystveggen og så anastomosere dens distale ende til en arterie på den fremre overflaten av hjertet.

Kirurgisk fjerning av avsetninger (endarterektomi) kan anbefales i visse tilfeller (for eksempel karotid endarterektomi).

Hovedanbefalingen er imidlertid å behandle eller å kontrollere risikofaktorene, det vil si en diett som er lav på fett, kolesterol og salt, og dessuten følge helsepersonellets anbefalinger med hensyn til behandling og kontroll av hypertensjon, diabetes og andre sykdommer, reduksjon av kroppsvekten, stoppe røyking så vel som regelmessig mosjon for å bedre hjertets tilstand og sirkulasjon.

Den inflammatoriske prosessen som er nevnt ovenfor inngår i alle de forskjellige trinnene av aterosklerose (1). Endotelisk aktivering som skyldes forskjellige faktorer som blant annet lav skjærspenning, modifiserte lipoproteiner og proinflammatoriske cytokiner anses å være det første trinnet ved utviklingen av aterosklerose og er under inflammatorisk kontroll (1). Mange nylige undersøkelser har vist at interaksjonene mellom de vaskulære og inflammatoriske cellene er avgjørende med hensyn til aterogenesen (1). Spesielt har det vist seg at en hemming av definerte proinflammatoriske reaksjonsveier reduserte utviklingen av aterosklerose (1).

Inflammasjon spiller også en viktig rolle ved oppbryting av aterosklerotiske plakk og trombose (2-5), og påvirker følgelig forekomsten av akutte iskemiske syndromer og deres relaterte mortalitet (6). Flere alvorlige kliniske manifestasjoner av aterosklerose så som infarkter i hjertet, i hjernen og eventuelle andre organer som er påvirket av aterosklerose, skyldes i alt vesentlig at karhulrommet er tiltettet av en trombe som er dannet ved kontakt med et oppbrutt eller sprengt aterosklerotisk plakk (3,4). Patologiske undersøkelser har vist at utsatte eller ustabile plakk, det vil si plakk som er utsatt for sprengning eller brudd eller som allerede er brutt, skiller seg i vesentlig grad med hensyn til celle- og matrisesammensetning sammenlignet med stabile plakk, som ikke er utsatt for brudd (7). De utsatte plakk er rike på inflammatoriske celler (makrofager og T-lymfocytter), inneholder en trombogen lipidkjerne og erkarakterisert veden tynn fibrøs kappe med et vesentlig tap av ekstracellulær matrise (7).

Nedsatt kollagensyntese som er kontrollert av det proinflammatoriske cytokinet IFN a og økt aktivitet av makrofagavledet matrisenedbrytende metalloproteinaser, er ansvarlige for at den fibrøse kappen blir tynnere og sprøere (7). Brudd eller sprengning av den sprø fibrøse kappen eksponerer den sterkt trombogene lipidkjernen for det sirkulerende blodet, og dette resulterer i en tiltettende trombedannelse (1, 7). Tettheten av inflammatoriske celler i et gitt aterosklerotisk sår er derfor ansett å være en god indikator på dens ustabilitet.

Den kliniske prognosen for en pasient med aterosklerose er bare delvis avhengig av størrelsen på sårene (19; 20). Det er nå velkjent at kvaliteten (plakksammensetningen), snarere enn størrelsen på såret, vil være en enda bedre prediktor på forekomsten av iskemiske reaksjoner eller anfall. Flere alvorlige kliniske manifestasjoner på aterosklerose (infarkt i hjertet eller hjernen) skyldes i virkeligheten at karets hulrom er tiltettet på grunn av en trombe som er dannet ved kontakten med det brutte eller sprengte aterosklerotiske plakk (19). Patologiske undersøkelser har vist at utsatte eller ustabile plakk som er utsatt for brudd eller som allerede er brutt eller sprengt, er rike på inflammatoriske celler og viser et vesentlig tap med hensyn til glatte muskelceller og kollageninnhold (20, 21). Slike plakk viser videre en signifikant økning med hensyn til apoptotisk celledød som fører til dannelsen av en sterkt trombogen lipidkjerne (13, 22).

Proinflammatoriske cytokiner inngår i inflammasjonen. Cytokininterleukinet 18 (IL-18) ble opprinnelig beskrevet som en interferon-y (IFN-y) induserende faktor (8). Den er et tidlig signal på utviklingen av T-lymfocytthjelpeceller type 1 (Thl) reaksjoner. IL-18 virker sammen med IL-12, IL-2, antigener, mitogener og eventuelt andre faktorer for å indusere produksjonen av IFN-y. IL-18 bedrer eller øker også produksjonen av GM-CSF og IL-2, forsterker anti-CD3-indusert T-celleoppformering og øker Fas-kontrollert dreping av naturlige dreperceller. Modent IL-18 blir fremstilt fra sin forløper ved hjelp av et IL-1 (3-omdannende enzym (ICE, kaspase-1). IL-18-reseptoren består av minst to komponenter som virker sammen ved ligandbindingen. Høy- og lavaffinitetsbindingsseter for IL-18 ble påvist i muse IL-12-stimulerte T-celler (9), noe som antyder et multippelkjedereseptorkompleks. Det er hittil identifisert to reseptorsubenheter, og begge hører til IL-1-reseptorgruppen (10). Signaltransduksjonen av IL-18 innbefatter aktivering av NF-k B(ll).

Nylig er det blitt isolert et løselig protein med høy affinitet for IL-18 fra human urin, og de humane og muse cDNA-molekylene så vel som det humane genet ble klonet (12; WO 99/09063). Proteinet ble gitt betegnelsen IL-18-bindende protein (IL18BP).

IL18BP er ikke det ekstracellulære domenet for noen av de kjente IL-18-reseptorene, men er et utskilt og naturlig sirkulerende protein. Det hører til en ny

gruppe av utskilte proteiner, og som også innbefatter flere Poxviruskodede proteiner (12). IL18BP blir konstitutivt uttrykt i milten (12). Urinært så vel som rekombinant IL18BP binder seg spesifikt til IL-18 med høy affinitet og modulerer den biologiske aktiviteten for IL-18.

IL18BP-genet er blitt lokalisert til det humane kromosomet 1 lql3, og det ble ikke funnet noe ekson som koder for et transmembrandomene i en 8,3 kb genomisk sekvens. Fire spleisevarianter eller isoformer av ILI 8BP ble funnet i mennesker, og betegnet IL18BP a, b, c og d, og de har alle den samme N-terminus og skiller seg med hensyn til C-terminus (12).

Fire humane og to museisoformer av IL-18BP, som er et resultat av mRNA-spleising og som er funnet i forskjellige cDNA-bibliotek, er blitt uttrykt, renset og undersøkt for binding og nøytralisering av IL-18 biologiske aktiviteter (23). Den humane IL-18BP-isoformen a (IL-18BPa) viser den største affiniteten for IL-18 med en rask tilfestningshastighet og en langsom avspaltningshastighet, og en dissosiasjonskonstant (K(d)) på 399 pM. IL-18BPc har det samme Ig-domenet som IL-18BPa, bortsett fra de 29 C-terminale aminosyrene; og K(d) for IL-18BPc er 10 ganger lavere (2,94 nM). Ikke desto mindre så nøytraliserer IL-18BPa og IL-18BPc IL-18 med mer enn 95 % ved et molart overskudd av de to nevnte proteinene. IL-18BPb- og IL-18BPd-isoformene mangler et fullstendig Ig-domene og mangler evnen til å binde eller nøytralisere IL-18. Muse IL-18BPc og iL-18BPd-isoformene har identiske Ig-domener, og nøytraliserer også over 95 % muse IL-18 ved et molart overskudd av de to nevnte isoformene. Muse IL-18BPd som har et felles vanlig C-terminalt motiv med humant IL-18BPa, nøytraliserer imidlertid også humant IL-18. Molekylær modellering identifiserte et større blandet elektrostatisk og hydrofobt bindingssete i Ig-domenet hos IL-18BP, og dette kan være årsaken til dens høye affinitetsbinding til liganden (23). Teknikkens stand beskrives også i (30, 31, 32).

Foreliggende oppfinnelse er basert på oppdagelsen av at en inhibitor av IL-18 har en sterk fordelaktig effekt på plakkutvikling, plakkprogresjon og plakkstabilitet i en musemodell på aterosklerose. Inhibitoren av IL-18 ikke bare hindrer sårdannelse i toraks aorta, men induserte også en overgang mot en stabil plakkfenotype i allerede etablerte aterosklerotiske plakk.

Oppfinnelsen angår således anvendelse av en IL-18-inhibitor for fremstillingen av et medikament for å hindre og/eller behandle aterosklerose.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Figur 1 er et histogram som viser overlevelsesprosenten for humane umbilikale veneendotelceller etter innkubering med oksiderte lipoproteiner alene, eller inkubering med en kombinasjon av oksiderte lipoproteiner og henholdsvis et IL-18-antistoff eller IL18BP. Figur 2 er et Western Blot som ble utført på proteinekstrakter fra aterosklerotiske arterier i sammenligning med kontrollarterier. I dette Western Blot ble det brukt antistoffer som var rettet inn mot IL-18BP (hILl 8BP), IL-18-reseptor a-underenhet (hIL18Ra), IL-18 (hIL18) og kaspase-1 (kaspase-1 plO). Figur 3 viser en etidiumbromidfarget agarosegel som viser resultatet av en RT-PCR-analyse for IL-18 og 1L-18BP mRNA i celler fra aterosklerotisk plakk. Figur 4 er representative RT-PCR-resultater for IL-18BP og IL-18 i aterosklerotisk plakk sammenlignet med ha-aktin (kontroll) ekspresjon i symptomatiske og asymptomatiske plakk. Figur 5 viser kartet for den ekspresjonsvektoren som ble brukt for intramuskulær elektrooverføring i mus. Figur 6 er et histogram som viser lipidfargingsområdet i aterosklerotiske arterier. Kvantitativ dataassistert billedanalyse av lipidavsetning. Dataene representerer middelverdier med s.e.m. (n = 19 for tomme plasmider, n = 14 for IL-18BP-plasmid). Fire stjerner indikerer P < 0,0001. Figur 7 er et histogram som viser aortasinussårområdet etter en IL-18BP-behandling sammenlignet med en kontroll (tomt plasmid). Kvantitativ dataassistert billedanalyse av sårområdet. De angitte data representerer middelverdier med s.e.m. (n = 19 for tomt plasmid, n = 14 for IL-18BP-plasmid). Doble stjerner indikerer P < 0,01. Figur 8 viser effekten av IL-18BP-behandling på sårinflammatorisk celleinnhold. Det ble anvendt kvantitativt dataassistert billedanalyse for å bestemme prosenten av makrofagpositive områder (svarte søyler) og antallet av infiltrerende T-lymfocytter pr mm (grå søyler) i aortasinusspor hos kontroll (n = 12 for makrofagfarging, n = 15 for T-lymfocyttfarging), eller IL-18BP-behandlede mus (n = 13 for makrofager, n = 12 for T-lymfocytter). De angitte data representerer middelverdier med s.e.m. Tre stjerner indikerer P < 0,005; og fire stjerner indikerer P < 0,0001. Figur 9 viser effekten av IL-18BP-behandling på sårinnhold av glatte muskelceller og kollagen. Det ble brukt kvantitativt dataassistert billedanalyse for å bestemme prosenten av glatte muskelcellepositive områder (svarte søyler) og kollagenakkumulering (grå søyler) i aortasinusspor hos kontroll (n = 6 for glatte muskelceller, n = 13 for kollagen) og IL-18BP-behandlede mus (n = 6 for glatte muskelceller, n = 13 for kollagen). De angitte data representerer middelverdier med s.e.m. Enkelt stjerne indikerer P < 0,05; og doble stjerner indikerer P < 0,01.

Oppfinnelsen er basert på oppdagelsen av økende nivåer av sirkulerende IL-18 i pasienter med akutte koronare syndromer, og en økt IL-18-produksjon i ustabile karotidaterosklerotiske plakk som forårsaker slag. I tillegg er det blitt vist at in vivo elektrooverføring av et ekspresjonsplasmid DNA som koder for IL-18BP vil kunne hindre fettutvikling i toraks aorta og svekke progresjonen av utviklet aterosklerotiske plakk i aortasinus i en veletablert musemodell på aterosklerose. Viktigere er det at en transfeksjon med IL-18BP-plasmidet induserer omfattende forandringer i plakksammensetning (nedsatt antall makrofager og T-celler, senket celledød og lipidinnhold og en økning med hensyn til glatte muskelceller og kollagen) noe som fører til en stabil plakkfenotype. Disse resultatene viser for første gang at IL-18-inhibitorer spiller en viktig rolle for reduksjon av plakkutvikling/progresjon og for å fremme plakkstabilitet.

Oppfinnelsen angår derfor anvendelsen av en IL-18-inhibitor for fremstillingen av et medikament for behandling og/eller for å hindre aterosklerose.

Med begrepet "hindre" forstås i foreliggende oppfinnelse ikke bare en fullstendig hindring av en viss effekt, men også enhver delvis eller vesentlig hindring, svekkelse, reduksjon, nedsettelse eller eliminering av effekten før eller på et tidlig tidspunkt av sykdommen.

Med begrepet "behandling" forstås i foreliggende oppfinnelse enhver fordelaktig effekt på sykdomsutviklingen, heri inngår en svekkelse, reduksjon, nedsettelse mildning av den patologiske utviklingen etter at sykdommen har utviklet seg.

Med begrepet "inhibitor av IL-18" forstås i foreliggende oppfinnelse ethvert molekyl som modulerer IL-18-produksjon og/eller virkning på en slik måte at IL- 18-produksjonen eller dens virkning blir svekket, redusert eller delvis, i alt vesentlig eller fullstendig hindret eller blokkert.

En produksjonsinhibitor kan være ethvert molekyl som negativt påvirker syntesen, bearbeidingen eller modningen av IL-18. Inhibitorene ifølge foreliggende oppfinnelse kan for eksempel være undertykkere av genekspresjonen av interleukin IL-18, antisens mRNA som reduserer eller hindrer transkripsjonen av IL-18 mRNA, eller som fører til en nedbrytning eller degradering av mRNA, proteiner som svekker korrekt folding, eller som delvis eller i alt vesentlig hindrer modning eller sekresjon av IL-18, proteaser som bryter ned IL-18 så snart det er blitt syntetisert og lignende. En produksjonsinhibitor kan være en kaspase-1-inhibitor, eller en ICE-inhibitor, for eksempel en som hindrer modningen av IL-18.

En inhibitor av IL-18-virkning kan for eksempel være en IL-18-antagonist. Antagonister kan enten binde seg til eller isolere IL-18-molekylet som sådan med tilstrekkelig affinitet og spesifisitet til delvis eller i alt vesentlig å nøytralisere IL-18 eller IL-18-bindende seter, som er ansvarlige for IL-18-binding til dens ligander (for eksempel dens reseptorer). En antagonist kan også hemme IL-18-signalreaksjonsveien, eller kan bli aktivert inne i cellene ved IL-18/reseptorbinding.

Inhibitorer av IL-18-virkning kan også være løselige i IL-18-reseptorer eller molekyler som etterligner reseptorene, eller midler som blokkerer IL-18-reseptorene, IL-18-antistoffer, for eksempel monoklonale antistoffer, eller ethvert annet middel eller molekyl som hindrer bindingen av IL-18 til dens mål, for derved å svekke eller å hindre en utløsning av de intra- eller ekstracellulære reaksjonene som kontrolleres av IL-18.

Aterosklerose blir også betegnet arteriosklerose eller herding av arteriene. I foreliggende oppfinnelse betyr begrepet aterosklerose alle sykdommer eller sykdomstilstander i arteriene som vanligvis beskrives som aterosklerose, og hvor fettmaterialet blir avsatt på karveggen, og hvor dette eventuelt resulterer i en fortetning eller svekkelse av blodstrømmen så vel som brudd og/eller erosjon med trombedannelse.

I overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse er det underforstått at aterosklerose innbefatter både sklerose eller tap av arterieelastisitet som skyldes aterom (aterosklerose) eller som skyldes andre årsaker (arteriosklerose). De patologiske tilstandene med hensyn til aterosklerose, så vel som de komplikasjoner eller konsekvenser som oppstår på grunn av aterosklerose, inngår i foreliggende oppfinnelse i begrepet "aterosklerose", sli det detaljert er beskrevet tidligere i avsnittet "bakgrunn for oppfinnelsen".

Progresjon av aterosklerose innbefatter dannelsen av aterosklerotisk plakk og deres utvikling til mer og mer ustabile former. Oppfinnelsen angår derfor bruken av en IL-18-inhibitor for fremstillingen av et medikament for å kunne redusere eller å hindre progresjonen av aterosklerose.

Kartiltetning på grunn av en trombe som er dannet på et aterosklerotisk plakk er et kritisk punkt under infarkt i hjernen eller hjertet, og er blant de mest skadelige konsekvensene av aterosklerose. Oppfinnelsen angår følgelig bruken av en IL-18-inhibitor for fremstillingen av et medikament for å behandle og/eller å hindre trombose på et aterosklerotisk plakk.

Plakkstabiliteten påvirker utviklingen av et aterosklerotisk plakk til et skadelig og utsatt plakk som lett vil kunne starte trombose. Oppfinnelsen angår derfor videre anvendelsen av en IL-18-inhibitor for fremstillingen av et medikament for å kunne hindre og/eller behandle aterosklerotisk plakkustabilitet.

Et ustabilt plakk er utsatt for opprivning eller sprengning, og en slik opprivning eller sprengning av et plakk kan føre til en trombose. Oppfinnelsen angår derfor anvendelsen av en IL-18-inhibitor for fremstillingen av et medikament for å hindre aterosklerotisk plakkerosjon eller sprengning.

Plakkustabiliteten og trombosen kan eventuelt føre til apoptotisk celledød, noe som gir en høy prokoagulerende aktivitet og dette igjen kan spille en vesentlig rolle ved utviklingen av trombose av de eroderte eller sprengte aterosklerotiske plakk så vel som emboliske reaksjoner (13, 14). Det er blitt vist at oksiderte lipoproteiner (oxLDL) induserer makrofag og endotelisk celleapoptose i kultur (15). Som vist i de etterfølgende eksemplene er det nå blitt påvist at en inhibitor av IL-18 er i stand til i høy grad å redusere celledøden som er indusert av oxLDL.

I overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse er det overraskende blitt funnet at IL-18-nivåene i blodet var signifikant forhøyet hos hjertesviktpasienter som led av gjentatte anfall, for eksempel død, gjentatt iskemi, revaskularisering, progresjon av aterosklerose og fornyet sykehusinnleggelse på grunn av hjertesvikt, sammenlignet med pasienter som ikke kom tilbake til sykehuset. Denne økningen av IL-18-nivåene var spesielt påfallende i de pasientene som senere døde sammenlignet med dem som overlevde. Forhøyede IL-18-nivåer i blodsirkulasjonen ble observert både hos iskemipasienter så vel som hos ikke-iskemiske pasienter.

I en foretrukket utførelse av oppfinnelsen er IL-18-inhibitoren valgt fra gruppen bestående av antistoffer mot IL-18, antistoffer mot enhver av IL-18-reseptorunderenhetene, inhibitorer av IL-18-reseptorsignalreaksjonsveien, antagonister av IL-18 som konkurrerer med IL-18 og blokkerer IL-18-reseptoren, og IL-18-bindende proteiner, isoformer, muteiner, fusjonerte proteiner, funksjonelle derivater, aktive deler eller sirkulerende permuterte derivater av disse som har den samme aktiviteten.

Med begrepet "muteiner" forstås her analoger av et IL-18BP, eller analoger av et viralt IL-18BP, hvor en eller flere av de naturlig forekommende aminosyreresiduaene i IL-18BP eller viralt IL-18BP, er blitt erstattet med forskjellige aminosyreresidua, eller er blitt fjernet, eller hvor en eller flere aminosyreresidua er lagt til den naturlige sekvensen i et IL-18BP eller et viralt IL-18BP, uten dermed i særlig grad å forandre aktiviteten på de resulterende produktene sammenlignet med villtypen av IL-18BP eller viralt IL-18BP. Disse muteinene kan fremstilles ved hjelp av kjente synteseteknikker og/eller ved seterettet mutageneseteknikker, eller enhver annen kjent teknikk som er egnet for dette formålet.

Ethvert slikt mutein har fortrinnsvis en sekvens av aminosyrer som er tilstrekkelig lik den som forefinnes i et IL-18BP, eller er tilstrekkelig likt et viralt IL-18BP, slik at det i alt vesentlig har samme aktivitet som IL-18BP. En aktivitet for IL-18BP er dens evne til å binde IL-18. Så lenge nevnte mutein i alt vesentlig har en bindingsaktivitet til IL-18, kan det brukes ved rensingen av IL-18, for eksempel ved hjelp av affinitetskromatografi, og kan således anses å ha en i alt vesentlig lik aktivitet som IL-18BP. Det er således mulig å bestemme hvorvidt et gitt mutein i alt vesentlig har samme aktivitet som IL-18BP, ved hjelp av rutineeksperimenter som innbefatter å underkaste et slikt mutein, for eksempel en enkelt blandet konkurranseprøve for å bestemme hvorvidt den binder seg eller ikke binder seg til et passende merket IL-18, for eksempel en radioimmunoprøve eller en ELISA-prøve.

Muteiner av IL-18BP-polypeptider eller muteiner av virale IL-18BP-polypeptider som kan brukes i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse, eller nukleinsyrer som koder for disse, innbefatter et bestemt sett av i alt vesentlig tilsvarende sekvenser som substitusjonspeptider eller polynukleotider som ved en fagperson rutinemessig kan fremstilles uten for omfattende eksperimentering, basert på de beskrivelser og veiledninger som er angitt her.

Foretrukne forandringer for muteiner i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse, er det som er betegnet som "konservative" substitusjoner. Konservative aminosyresubstitusjoner i IL-18BP-polypeptider eller proteiner eller virale IL-18BP-polypeptider, kan innbefatte synonyme aminosyrer innenfor en gruppe som har tilstrekkelig like fysiokjemiske egenskaper, slik at en substitusjon mellom syrene i gruppen vil bevare molekylets biologiske funksjon (16). Det er underforstått at innsettinger og delesjoner av aminosyrer også kan utføres i de ovenfor definerte sekvensene uten at dette endrer deres funksjon, spesielt hvis innsettingene eller delesjonene bare innbefatter et par aminosyrer, det vil si under tretti og fortrinnsvis under ti, og ikke fjerner eller forskyver aminosyrer som er kritiske for en funksjonell konformasjon, for eksempel cysteinresidua. Proteiner og muteiner fremstilt ved slike delesjoner og/eller innsettinger ligger innenfor den foreliggende oppfinnelsen.

De synonyme aminosyregruppene er fortrinnsvis de som er definert i tabell I. Mer foretrukket er de synonyme aminosyregruppene de som er definert i tabell II; og mest foretrukket er de synonyme aminosyregruppene de som er definert i tabell III. Eksempler på produksjon av aminosyresubstitusjoner i proteiner som kan brukes for å fremstille muteiner av IL-18BP-polypeptider eller proteiner, eller muteiner av virale IL-18BP-proteiner, og som kan brukes i foreliggende oppfinnelse, innbefatter ethvert kjent syntesetrinn, slik det for eksempel er beskrevet i US patentene 4,959,314, 4,558,585 og 4,737,462 til Mark et al; 5,116,943 til Koths et al., 4,965,195 til Nåmen et al; 4,789,111 til Chong et al; og 5,017,691 til Lee et al; og de lysinsubstituerte proteinene som er angitt i US patent nr. 4,904,584 (Shaw et al).

Begrepet "fusjonert protein" refererer seg til et polypeptid som innbefatter et IL-18BP eller et viralt IL-18BP eller et mutein av disse som er fusjonert eller kondensert med et annet protein som for eksempel har en forlenget oppholdstid i kroppsvæsker. Et 1L-18BP eller et viralt IL-18BP kan således være fusjonert til et annet protein, polypeptid eller lignende, for eksempel et immunoglobulin eller et fragment av dette.

"Funksjonelle derivater" slik det brukes her, innbefatter derivater av IL-18BP-polypeptider eller proteiner eller et viralt IL-18BP og deres muteiner og fusjonerte

proteiner, som kan fremstilles via funksjonelle grupper som opptrer som sidekjeder fra residua, eller fra N- eller C-terminale grupper ved hjelp av fremgangsmåter som i seg selv er kjente, og inngår som sådan i oppfinnelsen så lenge de er farmasøytisk akseptable, det vil si at de ikke ødelegger proteinets aktivitet, som i alt vesentlig er lik aktiviteten til IL-18BP eller viralt IL-18BP, og som ikke tilveiebringer toksiske egenskaper i de sammensetninger eller preparater hvor de forefinnes. Disse derivatene kan for eksempel innbefatte polyetylenglykolsidekjeder som kan maskere antigene seter og kan forlenge oppholdstiden for IL-18BP eller et viralt IL-18BP i kroppsvæsker. Andre derivater innbefatter alifatiske estere av karboksylgruppene, amider av karboksylgruppene, ved en reaksjon med ammoniakk eller med primære eller sekundære aminer, N-acylderivater av frie aminogrupper i aminosyreresidua, dannet med acylgrupper (for eksempel alkanoyl eller karbosykliske aroylgrupper), eller O-acylderivater av frie hydroksylgrupper (for eksempel av den typen som forefinnes i seryl eller treonylresidua) dannet med acylgrupper.

Som "aktive fraksjoner" av et IL-18BP eller et viralt IL-18BP, eller muteiner og fusjonerte proteiner, innbefatter foreliggende oppfinnelse ethvert fragment eller forløpere for polypeptidkjeden i proteinmolekylet alene, eller sammen med assosierte molekyler eller residua som er bundet til disse, for eksempel sukker- eller fosfatgrupper eller aggregater av proteinmolekylet, eller sukkergruppene som sådan, forutsatt at nevnte fraksjon i alt vesentlig har samme aktivitet som IL-18BP.

I en ytterligere foretrukket utførelse av oppfinnelsen, er inhibitoren av IL-18 et IL-18-antistoff. Anti-IL-18-antistoffene kan være polyklonale eller monoklonale, kimeriske, humaniserte eller endog helt ut humane. Rekombinante antistoffer og fragmenter av disse erkarakterisert vedhøy affinitetsbinding til IL-18 in vivo og har lav toksisitet. Antistoffene som kan brukes ifølge foreliggende oppfinnelse erkarakterisert vedsin evne til å behandle pasienter i et tilstrekkelig langt tidsrom til å ha god til utmerke regresjon eller lindring av den patogene tilstanden eller ethvert symptom eller en gruppe av symptomer som er relatert til en patogen tilstand, og som samtidig har lav toksisitet.

Nøytraliserende antistoffer kan lett utvikles i dyr så som kaniner, geiter eller mus, ved immunisering med IL-18. Immuniserte mus er spesielt fordelaktige for å tilveiebringe kilder for B-celler for fremstillingen av hybridomer som så igjen kan dyrkes for å få fremstilt store mengder av anti-IL-18-monoklonale antistoffer.

Kimeriske antistoffer er immunoglobulinmolekyler som erkarakterisert vedat to eller flere segmenter eller deler av disse er avledet fra andre dyrearter. Generelt vil det variable området i et kimerisk antistoff være avledet fra et ikke-humant pattedyrantistoff, så som et monoklonalt museantistoff, mens immunoglobulinets konstante områder er avledet av et humant immunoglobulinmolekyl. Fortrinnsvis bør begge områdene og kombinasjonen ha lav immunogenisitet slik dette kan bestemmes ved hjelp av rutineeksperimenter (24). Humaniserte antistoffer er immunoglobulinmolekyler som er utviklet eller fremstilt ved hjelp av molekylære teknikker, og hvor de musekonstante områdene er erstattet med humane motparter, samtidig som molekylene har beholdt sine museantigenbindende områder. Det resulterende muse-humane kimeriske antistoffet har fortrinnsvis redusert immunogenisitet og bedret farmakokinetikk i mennesker (25).

I et ytterligere foretrukket utførelse er således IL-18-antistoffet et humanisert IL-18-antistoff. Foretrukne eksempler på humaniserte anti-IL-18-antistoffer er for eksempel beskrevet i europeisk patentsøknad EP 0 974 600.

I en enda mer foretrukket utførelse av oppfinnelsen, er IL-18-antistoffet helt ut humant. Teknologien for fremstilling av humane antistoffer er for eksempel detaljert beskrevet i WO00/76310, WO99/53049, US 6,162,963 eller AU 5336100. Helhumane antistoffer er fortrinnsvis rekombinante antistoffer fremstilt i transgene dyr, for eksempel xenomus, og som innbefatter alt eller deler av de funksjonelle humane lg loci.

I en sterkt foretrukket utførelse av foreliggende oppfinnelse, er inhibitoren av IL-18 et IL-18BP, eller en isoform, et mutein, fusjonert protein, funksjonelt derivat, aktiv del eller sirkulært permutert derivat av dette. Slike isoformer, muteiner, fusjonerte proteiner eller funksjonelle derivater har beholdt den biologiske aktiviteten for IL-18BP, spesielt bindingen til IL-18, og har fortrinnsvis i alt vesentlig minst én aktivitet som er den samme som for IL-18BP. Ideelt bør slike proteiner ha en biologisk aktivitet som er enda bedre sammenlignet med umodifisert IL-18BP. Foretrukne aktive fraksjoner har en aktivitet som er bedre enn aktiviteten for IL-18BP, eller som har ytterligere fordeler, for eksempel bedre stabilitet eller en lavere toksisitet eller immunogenisitet, eller som er lettere å produsere i større mengder, eller er lettere å rense.

Sekvensene for IL-18BP og dens spleisevarianter/isoformer kan tas fra WO99/09063 eller fra (12) så vel som fra (23).

Funksjonelle derivater av IL-18BP kan være konjugerte til polymerer for å bedre proteinets egenskaper, så som stabilitet, halvliv, biofilgjengelighet, toleranse i menneskekroppen eller immunogenisitet. For å oppnå dette kan IL-18BP bindes for eksempel til polyetylenglykol (PEG). PEGylering kan utføres ved hjelp av kjente fremgangsmåter, for eksempel slik det er beskrevet i WO 92/13095.

I en foretrukket utførelse ifølge foreliggende oppfinnelse, er derfor IL-18BP PEGylert.

I en ytterligere foretrukket utførelse av oppfinnelsen, er inhibitoren av IL-18 et kondensert eller fusjonert protein som innbefatter alt eller en del av et IL-18-bindende protein som er fusjonert til hele eller en del av et immunoglobulin. Det er underforstått for fagfolk innenfor bioteknologien at det resulterende fusjonerte proteinet har beholdt den biologiske aktiviteten til IL-18BP, da spesielt bindingen til IL-18. Fusjonen kan være direkte eller ved hjelp av et kort sammenbindende peptid som kan være så kort som fra 1 til 3 aminosyreresidua i lengde eller lenger, for eksempel med en lengde på 13 aminosyreresidua. Nevnte sammenbindende protein kan være et tripeptid, for eksempel med sekvensen E-F-M (Gly-Phe-Met), eller en 13 aminosyrers sammenbindende sekvens som innbefatter Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met som innføres mellom IL-18BP-sekvensen og immunoglobulinsekvensen. Det resulterende fusjonerte proteinet har bedrede egenskaper, så som forlenget oppholdstid i kroppsvæsker (halvliv), økt spesifikk aktivitet, økt ekspresjonsnivå eller at det letter rensingen av fusjonsproteinet.

I en foretrukket utførelse er IL-18BP fusjonert til det konstante området i et Ig-molekyl. Fortrinnsvis er det fusjonert til tunge kjedeområder, for eksempel CH2- og CH3-domenene i det humane IgGl. Utviklingen av spesifikke fusjonsproteiner som innbefatter IL-18BP og en del av et immunoglobulin er for eksempel beskrevet i eksempel 11 i WP99/09063. Andre isoformer av Ig-molekyler er også egnet for fremstilling eller utvikling av fusjonsproteiner ifølge foreliggende oppfinnelse, så som isoformene IgG2eller IgG-t, eller andre Ig-klasser, for eksempel IgM eller IgA. Fusjonsproteinene kan være monomeriske eller multimeriske, hetero- eller homomultimeriske.

Interferoner er først og fremst kjent for hemmende effekter på viral replikasjon eller cellulær oppformering. Interferon-y spiller for eksempel en viktig rolle for å fremme immune og inflammatoriske reaksjoner eller responser. Interferon (3 (IFN-p\en interferon type I), er angitt å spille en antiinflammatorisk rolle.

Oppfinnelsen angår også bruken av en kombinasjon av en inhibitor av IL-18 og et interferon for fremstillingen av et medikament for behandlingen av aterosklerose.

Interferoner kan også konjugeres til polymerer for å bedre proteinenes stabilitet. Et konjugat mellom interferon P og polyolen polyetylenglykol (PEG) er for eksempel beskrevet i W099/55377.

I en annen foretrukket utførelse av oppfinnelsen, er interferonet interferon-(3 (IFN-(J ) og mer foretrukket IFN-0 la.

Inhibitoren av IL-18-produksjon og/eller virkning brukes fortrinnsvis samtidig, i rekkefølge eller separat sammen med interferonet.

I enda en utførelse av oppfinnelsen, brukes en inhibitor av IL-18 sammen med en TNF-antagonist. TNF-antagonister utøver sin aktivitet på flere forskjellige måter. For det første kan antagonistene binde seg til eller isolere selve TNF-molekylet som sådan med tilstrekkelig affinitet og spesifisitet til helt eller delvis å nøytralisere TNF-epitopen eller epitoper som er ansvarlige for TNF-reseptorbinding (heretter betegnet "isolerende antagonister"). En isolerende antagonist kan for eksempel være et antistoff som er rettet inn mot TNF.

Alternativt kan TNF-antagonistene hemme TNF-signalreaksjonsveien som er aktivert av celleoverflatereseptoren etter TNF-binding (heretter betegnet "signalantagonister"). Begge grupper av antagonister kan brukes, enten alene eller sammen, i kombinasjon med en IL-18-inhibitor ved terapeutisk behandling av aterosklerose.

TNF-antagonister kan lett identifiseres og bedømmes ved rutinemessig screening av kandidater for deres effekt på aktiviteten av naturlig TNF i utvalgte cellelinjer in vitro, for eksempel humane B-celler, hvor TNF er årsak til oppformering og immunoglobulinsekresjon. Prøven anvender TNF-preparater i forskjellige fortynninger av kandidatantagonistene, for eksempel fra 0,1 til 100 ganger den molare mengden av TNF som brukes i prøven, og kontroller uten TNF eller bare med antagonist (26).

Isolerende antagonister er de foretrukne TNF-antagonistene som brukes ifølge foreliggende oppfinnelse. Blant isolerende antagonister er det foretrukket å bruke de polypeptider som binder TNF med høy affinitet og har lav immunogenisitet. Det er også foretrukket å bruke løselige TNF-reseptormolekyler og nøytraliserende antistoffer til TNF. For eksempel kan løselig TNF-RI og TNF-RII brukes i foreliggende oppfinnelse. Spesielt foretrukne antagonister ifølge foreliggende oppfinnelse, er trunkerte former av disse reseptorene som innbefatter de ekstracellulære domenene av reseptorene eller funksjonelle deler av disse. Trunkerte løselige TNF type-I og type-II-reseptorer er for eksempel beskrevet i EP914431.

Trunkerte former av TNF-reseptorene er løselige og er blitt påvist i urin og serum som 30 kDa og 40 kDa TNF-hemmende proteiner, og er betegnet TBPI og TBPH henholdsvis (27). Samtidig, sekvensmessig eller separat anvendelse av IL-18-inhibitoren sammen med TNF-antagonisten og/eller et interferon, er foretrukket ifølge foreliggende oppfinnelse.

Ifølge oppfinnelsen er TBPI og TBPII foretrukne TNF-antagonister som kan brukes i kombinasjon med en IL-18-inhibitor. Derivater, fragmenter, områder og biologisk aktive deler av reseptormolekylene som funksjonelt ligner reseptormolekylene kan også brukes i foreliggende oppfinnelse. Med en slik biologisk aktiv ekvivalent eller derivat av reseptormolekylet, forstås den delen av polypeptidet eller den sekvensen som koder reseptormolekylet og som har tilstrekkelig størrelse og som er i stand til å binde TNF med en slik affinitet at interaksjonen med den membrandbundede TNF-reseptoren blir hemmet eller blokkert.

Ifølge en ytterligere foretrukket utførelse av oppfinnelsen, kan humant løselig TNF-RI (TBPI) brukes som TNF-antagonisten. Naturlige og rekombinante løselige TNF-reseptormolekyler og fremgangsmåter for deres fremstilling er blant annet beskrevet i de europeiske patentene EP 308 378, EP 398 327 og EP 433 900. IL-18-inhibitoren kan brukes samtidig, i rekkefølge med eller separat med TNF-inhibitoren. Med fordel er det mulig å bruke en kombinasjon av et IL-18-antistoff eller antiserum, og en løselig reseptor av TNF med TNF-hemmende aktivitet.

I en ytterligere foretrukket utførelse av oppfinnelsen, innbefatter medikamentet videre en COX-inhibitor, fortrinnsvis en COX-2-inhibitor. Slike COX-inhibitorer er velkjente innenfor molekylærbiologien. Spesifikke COX-2-inhibitorer er for eksempel beskrevet i WO 01/00229.

Inhibitorer av tromboksan, da spesielt tromboksan A2, er for tiden mye brukt ved behandlingen av aterosklerose. Ifølge en ytterligere foretrukket utførelse av oppfinnelsen, innbefatter derfor medikamentet en tromboksaninhibitor, og da spesielt en inhibitor av tromboksan A2 for samtidig, sekvensmessig eller separat bruk. Aspirin er spesielt foretrukket å bruke i kombinasjon med IL-18-inhibitoren ifølge oppfinnelsen.

En av årsakene til aterosklerose synes å være en høy konsentrasjon av lipider i blodet. Ifølge en ytterligere foretrukket utførelse av oppfinnelsen, innbefatter således medikamentet et lipidsenkende middel for samtidig, sekvensmessig eller separat bruk. Ethvert lipidsenkende kjent middel innenfor farmasien kan brukes ifølge foreliggende oppfinnelse, for eksempel en rekke kjente fettsenkende midler så som kolestyramin, kolestipol, nikotinsyre, gemfibrozil, probucol og andre. Spesielt foretrukket er HMG CoA-reduktaseinhibitorer, og da spesielt de såkalte statinene. Det er kjent mange statiner innen den farmasøytiske industrien, for eksempel simvastatin eller lovastatin.

For å hindre og/eller å behandle aterosklerose enda bedre, så angår en foretrukket utførelse av oppfinnelsen bruken av en IL-18-inhibitor sammen med en diett som har lavt innhold av fett og/eller kolesterol og/eller salt.

I en foretrukket utførelse av foreliggende oppfinnelse, brukes inhibitoren av IL-18 i en mengde på fra 0,0001 til 10 mg/kg kroppsvekt, eller ca 0,01 til 5 mg/kg kroppsvekt eller ca 0,1 til 3 mg/kg kroppsvekt, eller fra ca 1 til 2 mg/kg kroppsvekt. I en ytterligere foretrukket utførelse, brukes inhibitoren av IL-18 i en mengde på fra 0,1 til 100 u.g/kg kroppsvekt eller fra 1 til 100 f.ig/kg kroppsvekt eller fra ca 10 til 50 u.g/kg kroppsvekt.

Oppfinnelsen angår videre bruken av en ekspresjonsvektor som innbefatter den kodende sekvensen for en inhibitor av IL-18 ved fremstillingen av et medikament for å hindre og/eller å behandle aterosklerose. En genterapeutisk metode blir således anvendt for å behandle og/eller hindre sykdommen. Fordelaktig skjer ekspresjonen av IL-18-inhibitoren in situ, noe som effektivt vil blokkere IL-18 direkte i det vevet eller de celler som er utsatt eller påvirket av sykdommen.

Som detaljert forklart i de etterfølgende eksemplene, er det blitt vist at en effektiv ekspresjon av IL-18BP kan skje i en musemodell på sykdommen etter en elektrooverføring av en ekspresjonsvektor som innbefatter den IL-18BP-kodende sekvensen.

I en foretrukket utførelse vil derfor ekspresjonsvektoren bli administrert ved elektrooverføring, fortrinnsvis intramuskulært.

Bruken av en vektor for å indusere og/eller bedre den endogene produksjonen av en inhibitor av IL-18 i en celle som normalt ikke uttrykker en IL-18-inhibitor, eller som uttrykker mengder av inhibitoren som ikke er tilstrekkelige, inngår også i foreliggende oppfinnelse. Vektoren kan innbefatte de regulerende sekvensene som fungerer i celler hvor det er ønskelig å uttrykke inhibitoren eller IL-18. Slike regulerende sekvenser kan for eksempel være promotorer eller andre stimulerende forbindelser (enhancere). De regulerende sekvensene kan innføres på det rette locus i genomet ved homologe rekombinasjoner, og således operativt bundet til den regulerende sekvensen med det gen hvis ekspresjon det er ønskelig å indusere eller bedre. Denne teknologien blir vanligvis betegnet som "endogen genaktivering"

(EGA), og er blant annet beskrevet i WO 91/09955.

Det er også underforstått at det er mulig å stanse IL-18-ekspresjonen ved å bruke den samme teknikken, det vil si å innføre et negativt regulerende element, for eksempel et dempende element i genlocuset for IL-18, noe som fører til en nedregulering eller en total hindring av IL-18-ekspresjon. Det er underforstått for en fagperson at en slik nedregulering eller demping av IL-18-ekspresjonen har den samme effekten som å bruke en IL-18-inhibitor for å hindre og/eller behandle sykdommen.

Oppfinnelsen angår videre bruken av en celle som er blitt genetisk modifisert for å fremstille en inhibitor av IL-18 ved fremstillingen av et medikament for å behandle og/eller å hindre aterosklerose.

Med begrepet "farmasøytisk akseptabel" forstås enhver bærer som ikke påvirker den positive biologiske aktiviteten til den aktive bestanddelen, og som ikke er giftig for verten.

De aktive bestanddelene i farmasøytiske sammensetninger kan administreres et individ på en rekke forskjellige måter. Administrasjonsveiene innbefatter intradermalt, transdermalt (for eksempel i preparater med langsom frigjøring), intramuskulært, intraperitonealt, intravenøst, subkutant, oralt, epiduralt, topikalt og intranasalt. Det er også mulig å bruke andre terapeutisk effektive administrasjons vei er, for eksempel absorpsjon gjennom epitelisk eller endotelisk vev eller ved hjelp av genterapi, hvor et DNA-molekyl som koder den aktive bestanddelen blir administrert pasienten (for eksempel via en vektor), noe som gjør at det aktive middelet blir uttrykt eller utskilt in vivo. I tillegg til dette kan proteinene administreres sammen med andre komponenter av biologisk aktive midler, for eksempel farmasøytisk akseptable overflateaktive midler, fortynningsmidler, bærere og forskjellige typer væsker.

For parenteral (for eksempel intravenøs, subkutan og intramuskulær) administrering, kan det eller de aktive proteinene opparbeides som en løsning, suspensjon, emulsjon eller et frysetørket pulver sammen med en farmasøytisk akseptabel parenteral væske (for eksempel vann, saltløsning eller dekstroseløsning), og additiver som opprettholder isotonisitet (for eksempel mannitol) eller kjemisk stabilitet (det vil si konserveringsmidler og buffere). Preparatet vil deretter bli sterilisert på vanlig kjent måte.

Biotilgjengeligheten av det eller de aktive proteinene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også bedres ved konjugeringsmetoder som øker molekylets halvliv i menneskekroppen, for eksempel ved å forbinde molekylet til polyetylenglykol, for eksempel slik det er beskrevet i PCT patentsøknad WO 92/13095.

De terapeutisk effektive mengdene av det eller de aktive proteinene vil være en funksjon av mange variabler, heri inngår type av antagonist, antagonistens affinitet for IL-18, eventuell gjenværende cytotoksisk aktivitet som utøves av antagonistene, administrasjonsveien, pasientens kliniske tilstand (her inngår ønskeligheten av å opprettholde et ikke-toksisk nivå av endogen IL-18-aktivitet).

En "terapeutisk effektiv mengde" er slik at når den administreres, så vil IL-18-inhibitoren resultere i en inhibitor av den biologiske aktiviteten til IL-18. Den dosen som administreres, enten som enkeltdose eller som multiple doser til et individ, vil være avhengig av en rekke forskjellige faktorer, så som de farmakokinetiske egenskapene til IL-18-inhibitoren, administrasjonsveien, pasientens tilstand og egenskaper for øvrig (kjønn, alder, kroppsvekt, helse og størrelse), graden av symptomer, samtidige behandlinger, behandlingsfrekvens og den effekt som er ønskelig. Justering og manipulering av etablerte doseringsområder vil lett kunne bestemmes av den behandlende legen, for eksempel ved hjelp av kjente in vitro og in vivo metoder for å bestemme inhiberingen av IL-18 hos en pasient.

Ifølge foreliggende oppfinnelse blir inhibitoren av IL-18 brukt i en mengde fra ca 0,0001 til 10 mg/kg eller ca 0,01 til 5 mg/kg kroppsvekt, eller ca 0,01 til 5 mg/kg kroppsvekt eller ca 0,1 til 3 mg/kg kroppsvekt, eller ca 1 til 2 mg/kg kroppsvekt. Foretrukne mengder av IL-18-inhibitorene er videre mengder fra 0,1 til 1000 u.g/kg kroppsvekt eller ca 1 til 100 u,g/kg kroppsvekt eller ca 10 til 50 u.g/kg kroppsvekt.

Den administrasjonsveien som er foretrukket ifølge foreliggende oppfinnelse, er administrering subkutant. Intramuskulær administrering er ytterligere foretrukket ifølge oppfinnelsen.

I en ytterligere foretrukket utførelse, blir inhibitoren av IL-18 administrert daglig eller hver andre dag.

De daglige dosene blir vanligvis gitt i oppdelte doser eller i en vedvarende frigjøringsform som er effektiv for å oppnå de forønskede resultatene. Den neste og etterfølgende administreringen kan utføres i en dose som er en samme, mindre eller større enn den første eller de tidligere dosene som er administrert pasienten. En andre og etterfølgende administrering kan utføres under eller før sykdommen begynner å utvikle seg. IL-18-inhibitoren kan administreres profylaktisk eller terapeutisk til et individ før, samtidig eller etter at andre terapeutiske regimer eller midler er anvendt (for eksempel multiple medikamentregimer), i en terapeutisk effektiv mengde. Aktive midler som administreres samtidig med andre terapeutiske midler kan administreres i den samme eller i andre sammensetninger.

Oppsummert vedrører foreliggende oppfinnelse således anvendelse av en IL-18-inhibitor for fremstillingen av et medikament for å behandle og/eller forebygge aterosklerose, der IL-18-inhibitoren er valgt fra gruppen som består av antistoffer mot IL-18, antistoffer mot enhver av IL-18-reseptorsubenhetene og IL-18-bindende protein (IL-18BP), et mutein av IL-18BP som omfatter konservative aminosyresubstitusjoner, et fusjonert protein av IL-18BP og immunoglobulintungkjederegioner, eller et funksjonelt derivat som omfatter PEGylert IL-18BP, der muteinet, det fusjonerte proteinet eller det funksjonelle derivatet opprettholder den biologiske aktiviteten i å binde til IL-18.

I tillegg gjelder oppfinnelsen anvendelse av en ekspresjonsvektor som omfatter den kodende sekvensen for en IL-18-inhibitor for fremstillingen av et medikament til behandlingen og/eller forebyggingen av aterosklerose, der IL-18-inhibitoren er valgt fra gruppen som består av antistoffer mot IL-18, antistoffer mot enhver av IL-18-reseptorsubenhetene og en IL-18BP, et mutein av IL-18BP som omfatter konservative aminosyresubstitusjoner, et fusjonert protein av IL-18BP og immunoglobulintungkjederegioner, eller et funksjonelt derivat som omfatter PEGylert IL-18BP, der muteinet, det fusjonerte proteinet eller det funksjonelle derivatet opprettholder den biologiske aktiviteten i å binde til IL-18.

Oppfinnelsen gjelder også anvendelse av en celle som har blitt genetisk modifisert for å fremstille en inhibitor av IL-18 i fremstillingen av et medikament til behandlingen og/eller forebyggingen av aterosklerose, der IL-18 inhibitoren er valgt fra gruppen som består av antistoffer mot IL-18, antistoffer mot enhver av IL-18-reseptorsubenhetene, og IL-18BP, et mutein av IL-18BP som omfatter konservative aminosyresubstitusjoner, et fusjonert protein av IL-18BP og immunoglobulintungkjederegioner, eller et funksjonelt derivat som omfatter PEGylert IL-18BP, der muteinet, det fusjonerte proteinet eller det funksjonelle derivatet opprettholder den biologiske aktiviteten i å binde til IL-18.

Oppfinnelsen angår videre anvendelsen av IL-18 som en diagnostisk markør for progresjon av aterosklerose.

Etter den foregående beskrivelsen av oppfinnelsen, vil det nå bli refererer til de følgende eksemplene som alle er tilveiebrakt som illustrasjoner av oppfinnelsen, og det bør være underforstått at de ikke er begrensende for oppfinnelsen som sådan.

EKSEMPLER

Materialer oe metoder

Prøver

41 aterosklerotiske plakk ble fjernet fra 36 pasienter som var underkastet karotidendarterektomi. For kontroller ble det oppnådd 2 karotid og 3 indre brystarterier som var fri for aterosklerose (2 med minimal fibromuskulær fortykning) ved obduksjon eller under kirurgisk inngrep i forbindelse med hjertebypass. Disse ble raskt nedsenket i flytende nitrogen og lagret ved -80°C.

Plakk som ble brukt for protein- og RNA-ekstraksjon ble raskt vasket og nedsenket

i flytende nitrogen før de ble lagret ved -80°C. For immunohistokjemiske undersøkelser ble nevnte plakk plassert i 2 timer i frisk 4 % paraformaldehyd og så overført til en 30 % sukrose-PBS-løsning før de ble hurtigfrosset ved optimal skjæretemperatur i et vevsbearbeidende medium (O.C.T. Compound, Miles Inc, Diagnostics Division) med flytende nitrogen og lagret ved -80°C for kryostatsnitting. Flere 8 til 10 um tykke snitt ble tatt fra hver enkelt prøve for histologisk analyse og immunohistokjemiske undersøkelser.

Pasientklassifikasjon

For å undersøke et mulig forhold mellom IL-18/IL-18BP-ekspresjon og tegn på plakkustabilitet, ble det ved hjelp av blindprøver innsamlet kliniske data fra 23 fortløpende pasienter (ut av 36) som var underkastet endarterektomi mellom mai og august 2000. Nærværet eller fraværet av et intraplakksår ved makroskopisk undersøkelse ble systematisk angitt av den legen som utførte endarterektomiinngrepet. Dette gjorde det mulig å klassifisere de innsamlede plakk som enten ulcerøse eller ikke-ulcerøse. I tillegg ble pasientene klassifisert etter sine kliniske symptomer i to separate grupper. Pasienter som hadde kliniske symptomer på cerebralt iskemisk anfall i forhold til karotidstenose, ble klassifisert som symptomatiske. Endarterektomi ble utført fra 2. til 66. dag (17,6 + 5,3 dager) etter at pasienten hadde utviklet nevnte kliniske symptomer. Pasienter som aldri hadde vist symptomer på cerebral iskemi i karotidarterieområdet, ble klassifisert som asymptomatiske. Asymptomatisk karotidstenose ble påvist på basis av systematisk klinisk undersøkelse av pasienter med koronare eller perifere sykdommer, og dens grad ble bestemt ved å bruke gjentatt Doppler ekkografi ved hjelp av en erfaren og kvalifisert ekkografist. Selv om de asymptomatiske pasientene aldri hadde hatt et iskemisk anfall i karotidstenoseområdet, har det vist seg at karotidendarterektomi har vært fordelaktig for disse pasientene, slik det er vist av forskere i Asymptomatic Carotid Atherosclerosis Study (ACAS) (28).

Western Blot- analyse

Proteiner ble ekstrahert fra 12 aterosklerotiske plakk og 5 kontroll normale arterier. Frosne prøver ble pulverisert under flytende nitrogen. Pulverne ble så igjen suspendert i iskald oppløsningsbuffer [20 mmol/1 Tris-HCl, pH 7,5, 5 mmol/1 EGTA, 10 mmol/1 NaCl, 20 mmol/1 glyserofosfat, 10 mmol/1 NaF, 1 mmol/1 natriumortovanadat, 1 % Triton X-100, 0,1 % Tween 20, 1 u.g/ml aprotinin, 1 mmol/1 PMSF, 0,5 mmol/1 N-tosyl-L-fenylalaninklormetylketon (TPCK), 0,5 mmol/1 N(a)-p-tosyl-L-lysinklormetylketon (TLCK)] i en mengde på 0,3 ml/10 mg våtvekt. Ekstraktene ble inkubert på is i 15 minutter og så sentrifugert (12000 g, 15 minutter 4°C). Rensemiddelløselige supernatantfraksjoner ble beholdt, mens proteinkonsentrasjonene i prøvene ble bestemt ved å bruke en Bio-Rad proteinprøve.

For å utføre Western Blot-prøver for IL-18 og IL-18R, ble proteinekstraktene kokt i 5 minutter og påsatt en 7,5 % eller 15 % SDS-polyakrylamidgel. For IL-18BP, ble rhIL-18 renset fra E. Coli (Serono Pharmaceutical Research Institute, Genéve) koblet til Affligel 15 (Biorad) i en mengde på 1 mg/ml harpiks ifølge fabrikantens protokoll. 60 ug proteinekstrakt ble innkubert over natten ved 4°C på en valse med 20 ul harpiks justert til 500 ul PBS 0,05 % Tween. For å fjerne eventuell ikke-spesifikk binding, ble harpiksen sentrifugert og vasket med 10 mM Tris, pH 8, 140 mM NaCl, 0,5 % Triton-X-100 (Fluka), 0,5 % deoksycholat og så med 50 mM Tris, pH 8, 200 mM NaCl, 0,05 % TX100, 0,05 % nonidet P40 (Fluka), 2 mM CHAPS (Boehringer, Mannheim) fulgt av en siste vasking med 50 mM Tris, pH 8. Harpiksen ble så sentrifugert, igjen suspendert i prøvebufferen under reduserte betingelser, kokt i 5 minutter og så til slutt påsatt en 10 % SDS-polyakrylamid NuPAGE-gel (Invitrogen).

Prøvene ble elektroforetisk overført fra polyakrylamidgelene til nitrocellulose. Nitrocellulosemembranene ble mettet i 2 timer ved romtemperatur i TBST [50 mmol/1 Tris-HCl (pH 7,5), 250 mmol/1 NaCl og 0,1 % Tween saltløsning] som inneholdt 5 % fettfri tørrmelk. Membranene ble så innkubert med geit anti-humant IL-18 og IL-18R (oc-kjede) polyklonale antistoffer (1 u.g/ml) (R & D Systems), muse anti-humant IL-18BP monoklonalt antistoff (Mab 657.27 med 5 u.g/ml)

(Corbaz et al., 2000 innsendt manuskript), kanin anti-humant kaspase-1 polyklonalt antistoff (1 u.g/ml) (A-I9, Santa Cruz). Spesifisiteten for Mab 657.27 ble analysert på den rensede membranen ved konkurranse med et 200 gangers molart overskudd av rhIL-18BP-6his (renset fra kinesiske hamstereggstokkceller, Serono Pharmaceutical Research Institute) og innkubert sammen med Mab 657-27 i en mengde på 5 \ xg/ ml i 1 time. Etter innkubering med HRP-konjugerte tilsvarende antistoffer, ble kjemiluminescenssubstrater (ECL, Western blotting; Amersham Corp) brukt for å påvise positive bånd etter fabrikantens instruksjoner, og båndene ble så visualisert etter eksponering for Hyperfilm ECL (Amersham Corp).

Immunohistokjemi

Frosne snitt av 6 aterosklerotiske plakk ble innkubert med 1:10 normalt hesteserum eller 1:10 normalt geiteserum i 30 minutter ved romtemperatur, vasket en gang i PBS og så innkubert, enten med et primært monoklonalt museantistoff mot CD68 for makrofagidentifikasjon (DAKO-CD68, KP1), eller et primært monoklonalt museantistoff mot humant glatt muskel a-aktin (1A4, DAKO) for å identifisere glatte muskelceller. For å identifisere IL-18 og IL-18-reseptorer i nevnte aterosklerotiske plakk, ble spesifikke geite polyklonale antistoffer (R & D Systems) brukt ved en fortynning på 5 u.g/ml. IL-18BP ble påvist ved å bruke et spesifikt monoklonalt antistoff som var rettet inn mot rekombinant humant IL-18BP-isoform a (H20) (Corbaz et al., 2000 innsendt manuskript). Etter vasking i PBS ble snittene innkubert med følgende sekundært biotinylerte antistoffer: Et biotinylert heste anti-mus IgG (Vector Laboratories, Inc) i en fortynning på 1:200 for å påvise farging med antistoffer mot CD68, glatt muskel cc-aktin og IL-18BP, og et biotinylert heste anti-geit IgG (Vector) i en fortynning på 1:200 for påvisning av anti-IL-18 og anti-IL-18-reseptorantistoffer. Immunofarging ble visualisert ved hjelp av et avidin-biotin HRP visualiseringssystem (Vectastain ABC-sett PK-6100 Vector). For negative kontroller ble tilstøtende snitt farget med isotypetilpassede irrelevante antistoffer i stedet for med de primære antistoffene.

RNA - fremstilling

Totalt RNA ble ekstrahert fra 29 aterosklerotiske plakk i en sur guanidiumtiocyanatløsning og ekstrahert med fenol og kloroform ved hjelp av fremgangsmåten til Chomczynski og Sacchi (29). Det rensede RNA ble løst i vann, og konsentrasjonen ble målt ved absorpsjon ved 260 nm. RNAs integritet ble undersøkt ved elektroforese på 1 % agarosegeler. cDNA ble syntetisert fra 1 u.g totalt RNA ved å bruke Promegas reverse transkripsjonssystem ved å følge fabrikantens protokoll.

Semikvantitative og virkelig tids PCR av humant IL- 18 og IL- 18BP i humane aterosklerotiske plakk

Semikvantitative PCR-reaksjoner ble utført i et totalt volum på 50 ul i nærværet av 1 U AmpliTaq DNA polymerase (Perkin Eimer, Roche, U.S.A), 2,5 mM dNTP (Amersham, U.S.A) og 50 pmol av forover og reverse PCR-primere. Reaksjonsblandingene ble innkubert i et PCT-200 Peltier Effect Thermal Cycler-apparat (MJ Research, U.S.A) under de følgende betingelser: Denaturering i 1 minutt ved 94°C, sammenligning i 1 minutt ved 55°C og forlengelse i 1 minutt ved 72°C. For å sikre en sammenligning ble mengden av PCR-produkter under den lineære fasen av PCR-reaksjonen, det vil si IL-18BP, IL-18 og P-aktin, analysert etter 25, 28 og 31 sykluser. Det optimale antallet sykluser for IL-18BP, IL-18 og aktin før båndmetning ble bestemt (31, 28 og 25 henholdsvis). PCR-primerne ble utformet basert på publiserte sekvenser (AF-110799, D49950, X00351) som følger: IL-18, revers 5'-GCGTCACTACACTCAGCTAA-3forover 5'-GCCTAGAGGTATGGCTGTAA-3'; IL-18BP, forover 5'-ACCTGTCTACCTGGAGTGAA-3'; revers 5'-GCACGAAGATAGGAAGTCTG-3'; p-aktin, revers 5'-GGAGGAGCAATGATCTTGATCTTC-3'; og forover 5'-GCTCACCATGGATGATGATATCGC-3<*>. For å utelukke en oppformering av mulig genomisk DNA som kunne forurense prøvene, ble PCR-reaksjonene utført i et fravær av cDNA-templaten. PCR-produktene (10 ul) ble analysert på 1 % agarosegeler med elektroforese i lx TAE-buffer. Størrelsen på PCR-produktene ble verifisert ved en sammenligning med en 1 kb stige (ladder) (Gibco) etter farging av gelene. Relativ kvantifisering av etidiumbromidfargede bånd ble utført under UV-lys ved å bruke Kodak Digital Sciences analytisk programvare, og ble angitt som forholdet mellom målgenet (hIL-18BP, hIL-18) til husholdningsgenet (hp-aktin). ;SYBR Green Real Time PCR-primere for IL-18, IL-18BP og GAPDH (husholdningskontroll) ble utformet ved å bruke Primer Express programvare fra PE Biosystems ved hjelp av de publiserte sekvensene (AF110799, D49950, NM002046) som følger: IL-18, revers 5'-CAGACCGCTTTAGCAGCCA-3'; forover 5'-CAAGGAATTGTCTCCCAGTGC-3'; IL-18BP, revers 5'-AACCAGGCTTGAGCGTTCC-3'; forover 5'-TCCCATGTCTCTGCTCATTTAGTC-3'; GAPDH, revers 5'-GATGGGATTTCCATTGATGACA-3'; forover 5'-CCACCCATGGCAAATTCC-3'; intron-GAPDH, revers 5'-CCTAGTCCCAGGGCTTTGATT-3'; forover 5'-CTGTGCTCCCACTCCTGATTTC-3<*>. Spesifisiteten og den optimale primerkonsentrasjonen ble undersøkt. Mulig genomisk DNA-forurensning ble utelukket ved å utføre PCR-reaksjonene med spesifikke intron-GAPDH-primere. Fraværet av ikke-spesifikk oppformering ble bekreftet ved å analysere PCR-produktene ved hjelp av elektroforese på en 3,5 % agarosegel. SYBR Green Real-Time PCR ble utført med 5 ul/brønn av RT-produkter (0,5 ng totalt RNA), 25 u. l/brønn av SYBR Green PCR masterblanding (PE Biosystems, CA, USA) med AmpErase Uracil N-glykosylase (UNG) (0,5 enheter/brønn) og 20 ul av primerne (300 nM). PCR ble utført ved 50°C i 2 minutter (ved AmpErase UNG-innkubering for å fjerne eventuelt uracil som var inkorporert i cDNA), 95°C i 10 minutter (for AmpliTaq gullaktivering), og så kjørt i 40 sykluser ved 95°C i 15 sekunder, 60°C i 1 minutt og så gjennom ABI PRISM 7700 påvisningssystemet. De revers transkriberte cDNA-prøvene ble således oppformert, og deres Ct (syklusterskel) verdier ble så bestemt. Alle Ct-verdiene ble normalisert i forhold til husholdningsgenet GAPDH. Det ble observert et enkelt spesifikt DNA-bånd for IL-18, IL-18BP og GAPDH ved å bruke gelelektroforeseanalyse.

Prinsippet ved en såkalt real-time-påvisning ved å bruke "SYBR Green PCR masterblanding" er basert på en direkte påvisning av PCR-produkt ved å måle den økning av fluorescensen som er forårsaket av bindingen av SYBR Green-fargestoffet til dobbelttrådet DNA.

Statistisk analyse

Dataene ble uttrykt som ± SEM. Nivåene av IL-18 ble sammenlignet mellom grupper ved hjelp av Mann-Whitney-testen. En verdi på p 0,05 ble ansett å være statistisk signifikant.

Eksempel 1: Beskyttelse av IL-18-inhibitorer mot endotelisk celledød indusert ved å oksidere lipoproteiner (oxLDL)

Dyrkede humane navleveneendoteliske celler (HUVEC-celler) ble eksponert i 16 timer for oxLDL i nærværet eller fraværet av IL-18-bindende protein eller anti-IL-18-antistoff. Som vist på figur 1, så døde 83 % av nevnte HUVEC-celler etter eksponeringen for oxLDL. En samtidig innkubering med IL-18BP eller anti-IL-18-antistoff gjorde at nesten ingen celler døde. Det ble ikke observert noen døde celler ved å bruke IL-18BP. 89 % av cellene overlevde ved å bruke anti-IL-18-antistoff.

Dette eksperimentet viser klart den beskyttende effekten av to forskjellige IL-18-inhibitorer mot celledød som skyldes apoptose inne i aterosklerotisk plakk.

Eksempel 2: Ekspresjon av IL-18-protein og dens endogene inhibitor IL-18BP i aterosklerotiske plakk

Western blot-analyser ble utført på proteinekstrakter fra 12 karotide aterosklerotiske arterier og 5 normale kontroller. IL-18-protein, og heri inngår den aktive formen, ble i høy grad uttrykt i alle de undersøkte aterosklerotiske plakkene, mens det bare lot seg påvise lite eller ingen ekspresjon i normale arterier (figur 2). Stripene 1 til 4 inneholder prøver fra aterosklerotisk plakk, mens stripene 5 til 7 er fra normale arterier. Påvisning av den aktive formen av IL-18 synes interessant nok å være korrelert med ekspresjonen av den aktive formen av kaspase-1 som inngår i IL-18-bearbeidingen (figur 2, fjerde rad). Signifikant ekspresjon av IL-18-reseptorprotein (a-kjeden) ble også påvist i alle de undersøkte aterosklerotiske plakkene sammenlignet med et meget lavt ekspresjonsnivå i normale arterier (figur 2, andre rad). I tillegg ble det påvist at mesteparten av de aterosklerotiske plakkene uttrykte IL-18BP, skjønt ekspresjonsnivået var heterogent (figur 1, første rad).

Eksempel 3: Cellulær lokalisering av IL-18-protein og dens endogene inhibitor IL-18BP i aterosklerotisk plakk

For å bestemme den cellulære lokaliseringen av IL-18 og IL-18BP, ble det utført immunohistokjemiske undersøkelser på 6 karotide aterosklerotiske plakk. Som vist på figur 2, ble IL-18 i alt vesentlig uttrykt i makrofager, og sannsynligvis er disse cellene hovedkilden for IL-18 i plakk (ikke vist). Disse områdene var også rike på CD3-positive lymfocytter. T-lymfocytter synes imidlertid ikke direkte å inngå i IL-18-produksjon. IL-18 ble også uttrykt i noen av de innerste glatte muskelcellene og nå og da også i endoteliske celler. I motsetning ble det påvist signifikant ekspresjon av IL-18BP i endoteliske celler fra plakk mikrokar og den luminale overflaten, skjønt ekspresjonen ble ikke funnet i alle karene. Relativt lav og mer heterogen IL-18BP-ekspresjon ble også påvist, i alt vesentlig ekstracellulært, i enkelte makrofagrike områder.

Eksempel 4: Ekspresjon av IL-18 og IL-18BP mRNA-transkripter i aterosklerotiske plakk og deres forhold til plakkustabilitet

For å bestemme hvorvidt humant IL-18 og IL-18BP mRNA ble uttrykt i humane karotide aterosklerotiske plakk, ble det utført semikvantitativ RT-PCR på seks aterosklerotiske plakk (figur 3). IL-18 og IL-18BP mRNA ble påvist i alle de aterosklerotiske plakk, skjønt mengden av mRNA for IL-18 og IL-18BP var heterogen. For derved mer nøyaktig å kvantifisere nivåene av IL-18 og IL-18BP mRNA-ekspresjon, ble ytterligere 23 aterosklerotiske plakk analysert ved hjelp av SYBR Green Real-Time PCR-metoden (figur 4). De anvendte plakkene blekarakterisert vedklinisk og patologisk undersøkelse som symptomatiske (ustabile) eller asymptomatiske (stabile) plakk på basis av hvorvidt de inneholdt makroskopiske sår eller ikke. De kliniske karakteristika for pasientene er angitt i tabell 4. Prosent med karotiddiameterreduksjon (60-95%) og risikofaktorer så som alder, diabetes, hyperkolesterolemi, hypertensjon og sigarettrøyking, var ikke forskjellige mellom de to gruppene.

'Disse pasientene hadde forbigående eller vedvarende iskemisk cerebralt anfall 2-66 dager før endarterektomi.

De pasientene som hadde klinisk hypertensjon ble behandlet med antihypertensive midler.

De pasientene som hadde klinisk hyperkolesterolemi ble behandlet med lipidsenkende medikamenter.

Mengden av IL-18 ble funnet å være oppregulert i de symptomatiske sammenlignet med de asymptomatiske aterosklerotiske plakkene (2,03 + 0,5 vs 0,67 ±0,17 henholdsvis) (figur 4A). Statistisk analyse viste at denne økningen av IL-18-produksjonen som ble observert i de symptomatiske plakkene var sterkt signifikant (p < 0,0074), mens den økte mengden av IL-18BP som ble observert i de symptomatiske versus de asymptomatiske plakkene ikke var signifikante (4,64 0,98 vs 2,5 ± 0,92 henholdsvis) (figur 4B). Med andre ord, både de symptomatiske og asymptomatiske gruppene viste positiv korrelering mellom IL-18 og IL-18BP mRNA, men helningsgradene var signifikant forskjellige mellom de to gruppene (symptomatisk gruppe: helning 1,16 [0,19-2,14], r<2>= 0,36 vs asymptomatisk gruppe: helning 4,79 [2,39-7,20], r2 = 0,76; p < 0,05). Det synes derfor som om den relative økningen med hensyn til IL-18-ekspresjon i den symptomatiske gruppen ikke er tilstrekkelig til å kompensere for økningen i IL-18-ekspresjon. Ettersom nærværet av sår er ansett å være en egenskap ved ustabile plakk, ble det videre utført en statistisk analyse på plakk med eller uten intra-plakksår, og dette viste en signifikant oppregulering av IL-18 i de plakkene hvor sår var tilstede (p < 0,018)

(figur 4C).

Disse dataene viser at økningen i IL-18-ekspresjon som kan observeres i aterosklerotisk plakk, er korrelert med at disse er ustabile.

Eksempel 5: IL-18BP modulerer aterosklerotisk sårutvikling og stabilitet i en in vivo modell på sykdommen

Metoder

Pasientkarakteristika

Det ble oppnådd plasmaprøver fra pasienter med akutte iskemiske koronare syndromer (ustabil angina og hjerteinfarkt) mindre enn 7 dager etter at symptomene var begynt å utvikle seg. Ustabil angina ble definert som assosiasjonen mellom typiske brystsmerter og enten iskemiske forandringer i elektrokardiogrammet, eller nærværet av koronær arteriesykdom. Hjerteinfarkt ble diagnostisert på basis av typiske iskemiske forandringer i elektrokardiogrammet assosiert med signifikant økning av de myokardiale enzymene (kreatinfosfokinase og troponin I) i det sirkulerende blodet. Ikke-iskemiske pasienter ble samlet fra den samme kardiologiavdelingen og var fullstendig fri for iskemiske signaler. Plasmanivåer med hensyn til humant IL-18 ble bestemt v ed å bruke et kommersielt tilgjengelig sett (MBL, Japan).

In vivo intramuskulær elektrooverføring av muse IL- 18BP ekspresjonsplasmid

14 hannlige C57BL/6 ApoE KO-mus, 14 uker gamle, fikk med 3 ukers mellom tre injeksjoner med iL-18BP-ekspresjonsplasmidet pcDNA3-IL18BP. Kontrollmus (n = 19) ble injisert med tomt plasmid. Muse IL-18BP-isoform d cDNA isolert som beskrevet tidligere (tilvekstnummer # Q9ZOM9) (23) ble så subklonet over i EcoRl/Noti-setene av pattedyrcelleekspresjonsvektoren pcDNA3 under kontroll av cytomegaloviruspromotoren (Invitrogen). Konstruksjonen som kalles 334.yh, er vist på figur 5. Kontrollplasmidene var tilsvarende konstruert, men var uten innhold av terapeutisk cDNA. IL-18BP eller kontrollekspresjonsplasmidet (60 (j.g) ble injisert i både kinnben og kraniemusklene hos bedøvede mus slik det tidligere er beskrevet (13). Kort beskrevet ble transkutane elektriske pulser (8 kvadratiske bølgeelektriske pulser på 200 V/cm, varighet 20 millisekunder ved 2 Hz) tilført ved hjelp av en PS-15 elektropulsator (Genetronics, Frankrike), ved å bruke to plateelektroder av rustfritt stål plassert 4,2 og 5,3 mm fra hverandre på hver side av benet.

ELISA mIL- 18BP

Platene ble over natten dekket med r-mIL-18BPd-affinitetsrenset kanin polyklonalt antistoff (5 u.g/brønn). Løselig mIL-18BP ble påvist ved å bruke biotinylert kanin polyklonalt antistoff (0,3 u.g/ml) som var utviklet mot E. coli r-mIL-18BP (Peprotec) fulgt av ekstravidinperoksidase (1/1000) (Sigma). Det innfangende kanin polyklonale antistoffet ble testet ved Western Blot for å bekrefte mIL-18BP-spesifitet. Rekombinant mIL-18BPd fremstilt av HEK 293-celler ble brukt som standard. Følsomheten på ELISA-prøven var 5 ng/ml.

Analyse av mus

Kryostatsnitt (8 u.m) ble fremstilt fra aortasinus og ble brukt for påvisning av lipidavsetning ved å bruke fargestoffet Oil rød, mens kollagen ble påvist ved å bruke fargestoffet Sirius rød, mens den immunohistokjemiske analysen ble utført som beskrevet tidligere (13). Snittene ble farget med spesifikke primære antistoffer: Anti-mus makrofag, klon MOMA2 (BioSource), fosfatase alkalisk-konjugert anti-a-aktin for glatte muskelceller og anti-CD3 for T-lymfocytter (Dako) som beskrevet tidligere (13). Påvisning av celledød ble utført ved å bruke TUNEL-teknikken (13). CD3-positive celler ble mikroskopisk telt ved hjelp av blindprøver. Aterosklerotiske plakk i aortasinus og områder som farget positive for makrofager, glatte muskelceller, kollagen eller TUNEL, ble målt ved å bruke datamaskinassistert billedkvantifisering (NS15000, Microvision) som beskrevet tidligere (13). Farging med ikke-immun isotypetilpassede immunoglobuliner ble brukt for å bedømme spesifisiteten på immunofargingen. Spesifisiteten for TUNEL ble bedømt ved å utelate enzymet terminal deoksynukleotidyltransferase. Hjerteaortablodårene som går fra venstre subklaviske arterie til nyrearteriene, ble fiksert med 10 % bufret formalin og farget for lipidavsetning med fargestoffet Oil rød. De ble så åpnet på langs, og prosenten av lipidavsetning ble beregnet ved å bruke datamaskinassistert billedkvantifisering (NS 15000, Microvision).

Resultater

Den foreliggende undersøkelsen testet hypotesen at IL-18/IL-18BP-reguleringen spiller en viktig rolle både ved aterogenesen og plakkstabiliteten. Plasmanivåene for IL-18 hos pasienter med akutte koronære syndromer (30 menn og 18 kvinner, midlere alder 66,2 +1,8 år, hvorav 14 hadde ustabil angina og 34 hadde hjerteinfarkt), og i ikke-iskemiske kontrollpasienter som var samlet fra samme kardiologiavdeling (10 menn og 3 kvinner, midlere alder 60,0 ± 5,2 år) ble målt. Plasmanivåene av IL-18 var signifikant forhøyet hos akutte koronære pasienter sammenlignet med kontrollene (146,9 ± 17,1 vs 73,0 ± 12,2 pg/ml henholdsvis, p < 0,05), i motsetning til sirkulerende nivåer av IL-18BP som var svakt forhøyede (20,1 ± 2,7 vs 7,5 ± 2,5 ng/ml henholdsvis, p = 0,06). I tillegg var IL-18-nivåene korrelert med graden av sykdommen, slik at de høyeste nivåene ble observert hos pasienter med alvorlig iskemisk hjertedysfunksjon og kliniske signaler på lungeødem (224,03 + 39,1 pg/ml, p < 0,001 sammenlignet med kontrollene). Disse resultatene som ble oppnådd fra pasienter med akutt koronær sykdom sammen med tidligere observasjoner at IL-18 er forhøyet i aterosklerotisk plakk fra pasienter med slag [Mallar, 2001], antyder at IL-18/IL-18BP-regulering spiller en meget viktig rolle i den aterosklerotiske prosessen.

Vi testet derfor denne hypotesen ved å bruke apoE knockout (KO) mus som

spontant utviklet menneskelignende aterosklerotiske sår. Et antall på fjorten 14 uker gamle hannmus mottok IL-18BP via en in vivo intramuskulær elektrooverføring av et ekspresjonsplasmid DNA som koder for muse IL-18BPd, mens 19 mus av samme alder som kontroller fikk det tomme plasmidet. Plasmidelektrooverføringen ble gjentatt hver tredje uke, og musene ble avlivet da de var 23 uker gamle etter 9 ukers behandling. Plasmanivåene for mus IL-18BP var lavere enn påvisningsgrensen (5 ng/ml) i apoE KO-mus injisert med det tomme plasmidet. En enkelt injeksjon av IL-18BP-plasmidet resulterte imidlertid i høye nivåer av IL-18BP i blodet med et maksimum 2 dager etter injeksjonen (323,5 ± 100,9 ng/ml) og 127,4 ± 35,4 ng/ml målt etter 2 uker. Etter 9 ukers behandling med enten IL-18BP eller det tomme plasmidet, så var nivåene av totalt kolesterol (489,4 ± 34,6 vs 480,8 ± 36,3 mg/dl henholdsvis) og høytetthets lipoproteinserumnivåer (52,3 ± 9,4 vs 48,8 + 5,1 mg/dl henholdsvis) ikke forskjellig mellom de to gruppene. En moderat, men signifikant økning av dyrenes vekt ble observert i den gruppen som var behandlet med IL-18BP sammenlignet med kontrollgruppen (31,8 ± 0,9 vs 28,6 + 0,8 g henholdsvis, p < 0,05).

Effekten av tilførselen av IL-18BP på aterosklerosen ble undersøkt på to forskjellige steder: Den nedadgående toraksaortaen og på aortasinus. Toraksaorta ble valgt for å bestemme hvorvidt IL-18BP spiller en rolle ved utviklingen av fettstreker (aterogenese) ettersom toraksaterosklerotiske sår var nesten fraværende ved en alder på 14 uker (data ikke vist), da IL-18BP-transfeksjonen startet. Aortasinus, hvor aterosklerotiske sår allerede var tilstede ved en alder på 14 uker (data ikke vist), ble undersøkt for fremskreden plakkprogresjon og sammensetning, en viktig determinant for plakkstabilitet. IL-18BP-behandlingen av apoE KO-mus påvirket signifikant utviklingen av aterosklerotiske sår og sykdommens generelle progresjon. En undersøkelse av toraksaorta viste en markant reduksjon av lipidavsetningen hos de mus som var behandlet med IL-18BP-plasmidet sammenlignet med det tomme plasmidet (figur 6). Kvantitativ datamaskinassistert

billedanalyse viste 69 % reduksjon med hensyn til graden av aterosklerotiske sår (p

< 0,0001) (figur 6), noe som viser at IL-18 spiller en kritisk rolle ved utviklingen av aterogenese. En behandling med IL-18BP-plasmidet i bare 9 uker viste dessuten en signifikant begrensning med hensyn til progresjonen av fremskredet aterosklerotiske plakk i aortasinus (24 % reduksjon av plakkstørrelsen, p = 0,01), sammenlignet med behandlingen med det tomme plasmidet (figur 7).

Viktigere var det at sammensetningen av de fremskredne sårene, en viktig determinant for plakkustabilitet, ble betydelig påvirket av IL-18BP-behandlingen. Aterosklerotiske sår hos mus behandlet med IL-18BP-plasmidet viste en meget signifikant 50 % reduksjon med hensyn til makrofaginfiltrering (p < 0,0001) (figur 8), inneholdt 67 % færre T-lymfocytter (p < 0,005) (figur 8), og viste en dobling med hensyn til glatt muskelcelleakkumulering (p < 0,05) (figur 9). Disse viktige forandringene med hensyn til den sårcellulære sammensetningen var dessuten assosiert med en signifikant 85 % økning av kollageninnholdet (p < 0,0005) slik dette kunne bestemmes ved farging med Sirius rødt og en senkning av det totale lipidinnholdet. IL-18BP-behandlingen senker eller demper således den inflammatoriske prosessen signifikant inne i de aterosklerotiske sårene, og induserer en helingsprosess som er karakteristisk for stabile aterosklerotiske plakk. Den markerte reduksjonen av den inflammatoriske komponenten i sårene hos IL-18BP-behandlede mus, var videre assosiert med en vesentlig reduksjon med hensyn til opptreden av celledød inne i plakkene (2,9 ± 0,9 % i IL-18BP-behandlede mus vs 10,5 ± 3,6 % i kontrollmusene, p < 0,05), noe som derfor begrenser ekspansjonen og trombogenisiteten for den acellulære lipidkjernen [Mallat, 1999].

Konklusjoner:

Ved å bruke en velkjent og godt underbygget musemodell på humanlignende aterosklerose, så viser de ovennevnte resultatene at IL-18 og IL-18BP-regulering spiller en uventet og meget viktig rolle ved aterosklerotisk plakkutvikling, progresjon og stabilitet. Mens inhibering av IL-18-aktivitet ved IL-18BP-tilførsel både hindrer tidlig sårdannelse i toraksaorta, så har aktiviteten også en sterk effekt på sårsammensetningen i aortasinus, noe som vender utviklingen mot en mer stabil plakkfenotype.

Den kliniske prognosen for en pasient med aterosklerose er ikke bare avhengig av størrelsen på sårene. Det er nå velkjent at kvaliteten (plakksammensetning), snarere enn størrelsen på såret, vil ha bedre predikasjons verdi med hensyn til fremtidig forekomst av iskemiske anfall. De fleste alvorlige kliniske manifestasjonene på aterosklerose (infarkt i hjertet eller hjernen) skyldes i virkeligheten vanligvis at karhulrommet er tiltettet ved en trombedannelse som er dannet ved kontakt med et sprukket aterosklerotisk plakk (19). Patologiske undersøkelser har vist at utsatte eller ustabile plakk som har en tendens til brudd elleTsom har sprukket, er rike på inflammatoriske celler og viser et vesentlig tap av glatte muskelceller og nedsatt kollageninnhold (20, 21). Videre viser slike plakk en signifikant forøkning med hensyn til apoptotisk celledød, noe som fører til dannelsen av en sterkt trombogen lipidkjerne (13, 22). Det er verd å merke seg at alle disse tegnene på økende plakkustabilitet ble markert dempet eller svekket i IL-18BP-behandlede mus, noe som indikerer at IL-18-signalisering er en viktig faktor ved dannelsen av plakkustabilitet.

De resultatene som ble oppnådd i apoE KO-mus i forhold til sykdommen hos mennesker, får styrket relevans ved de her angitte observasjonene av økende nivåer av sirkulerende IL-18 hos pasienter med akutte koronære syndromer, og økt IL-18-produksjon i ustabile karotidaterosklerotiske plakk som er ansvarlige for slag. Samlet identifiserer disse oppdagelsene at inhibitorer av IL-18-aktivitet kan brukes som nye, viktige terapeutiske redskaper for å hindre og behandle aterosklerotisk plakkutvikling og derved begrense plakkomplikasjoner.

Eksempel 6: Forhøyede nivåer av IL-18 er korrelert med tilbakevendende anfall hos hj ertesviktpasienter

Nivåene av IL-18 ble målt i blodsera hos pasienter ved hjelp av ELISA og med et IL-18-spesifikt antistoff.

Til sammen ble det undersøkt 56 iskemiske og ikke-iskemiske pasienter, med eller uten hjertesvikt.

Hos pasienter som senere døde, var nivåene av IL-18 216,0 + 41,5 pg/ml versus 112,2 ± 12,2 pg/ml hos pasienter uten dødsfall (p = 0,0018).

Hos pasienter som på en eller annen måte fikk et tilbakevendende anfall, så som død, tilbakevendende iskemi, revaskularisering, progresjon av aterosklerose eller fornyet innleggelse på sykehus på grunn av hjertesvikt, ble følgende IL-18-nivåer målt: 165,8 ± 23,8 versus 107,7 ± 14,6 hos pasienter uten noen form for tilbakevendende anfall (p = 0,03).

Disse resultatene viser at IL-18-nivåene er signifikant forhøyede hos pasienter med dårlig klinisk prognose, for eksempel tilbakevendende anfall eller endog dødsfall.

Blodprøver hos 16 ikke-iskemiske pasienter, med eller uten hjertesvikt, ble målt for innhold av IL-18. Hos de pasientene som senere døde, var nivåene 199,0 ± 34,8 pg/ml versus 95,3 ± 20,4 pg/ml hos de pasientene som overlevde (p = 0,09).

Pasienter med en eller annen form for tilbakevendende anfall: 146,6 34,4 pg/ml IL-18 versus 95,4 ± 23,9 pg/ml hos pasienter som ikke hadde noen form for tilbakevendende anfall (p = 0,03). Skjønt forskjellen med hensyn til IL-18-nivåene ikke nådde statistisk signifikans, noe som skyldes det lave antallet pasienter, så var det mulig å observere en klar tendens mot forhøyede nivåer av IL-18.

Hos iskemiske pasienter var IL-18-nivåene 214,2 ± 45,9 pg/ml hos pasientene som døde versus 118,4 ± 12,8 pg/ml hos de som overlevde (p = 0,007).

162,8 ± 24,7 pg/ml av IL-18 ble målt hos pasienter som hadde en eller annen form for tilbakevendende anfall versus 116,2 ± 16,0 hos de pasientene som ikke hadde noen form for tilbakevendende anfall.

REFERANSER

1. Ross R. Atherosclerosis-an inflammatory disease. N Engl J Med 1999; 340: 115-1126. 2. van der Wal AC, Becker AE, van der Loos CM, Das PK. Site of intimal rupture or erosion of thrombosed coronary atherosclerotic plaques ischaracterized byan inflammatory process irrespective of the dominant plaque morphology. Circulation 1994; 89: 36-44. 3. Fuster V, Badimon L, Badimon JJ, Chesebro JH. The pathogenesis of coronary artery disease and the acute coronary syndromes (1). N Engl J Med 1992; 326: 242-250. 4. Fuster V, Badimon L, Badimon JJ, Chesebro JH. The pathogenesis of coronary artery disease and the acute coronary syndromes (2). N Engl J Med 1992; 326: 310-318. 5. Lee RT, Libby P. The unstable atheroma. Arterioscler Thromb Vase Biol 1997; 17: 1859-1867. 6. Ridker PM, Cushman M, Stampfer MJ, Tracy RP, Hennekens CH. Inflammation, aspirin, and the risk of cardiovascular disease in apparently healthy men. N Engl J Med 1997; 336: 973-979. 7. Libby P. Molecular bases of the acute coronary syndromes. Circulation 1995; 91: 2844-2850. 8. Nakamura, K, Okamura, H, Nagata, K and Tamura, T. (1989). Infect Immun. 57, 590-595. 9. Yoshimoto T, Takeda K, K, Tanaka, T, Ohkusu, K, Kashiwamura, S, Okamura, H, Akira, S and Nakanishi, K (1998). J. Immunol 161, 3400-3407. 10. Parnet, P, Garka, K E, Bonnert, T P, Dower, S K, and Sims, J E. (1996). J. Biol. Chem. 271, 3967-3970. 11. DiDonato, J A, Hayakawa, M, Rothwarf, D M, Zandi, E and Karin, M. (1997). Naturel, 16514-16517. 12. Novick, D, Kim, S-H, Fantuzzi, G, Reznikov, L, Dinarello, C, and Rubinstein, M (1999). Immunity 10, 127-136. 13. Mallat Z, Hugel B, Ohan J, Leséche G, Freyssinet JM, Tedgui A. Shed membrane microparticles with procoagulant potential in human atherosclerotic plaques. A role for apoptosis in plaque thrombogenicity. Circulation 1999; 99: 348-353. 14. Tricot O, Mallat Z, Heymes C, Belmin J, Leséche G, Tedgui A. Relation Between Endothelial Cell Apoptosis and Blood Flow Direction in Human Atherosclerotic Plaque Circulation 2000; in press. 15. Dimmeler S, Haendeler J, Galle J, Zeiher AM. Oxidized low-density lipoprotein induces apoptosis of human endothelial cells by activation of CPP32-like proteases. A mechanistic clue to 'response to injury' hypothesis. Circulation 1997; 95: 1760-3.

16. Grantham, Science, Vol. 185, pp. 862-864 (1974).

17. Dimmeler S, Haendeler J, Galle J, Zeiher AM. Oxidized low-density lipoprotein induces apoptosis of human endothelial cells by activation of CPP32-like proteases. A mechanistic clue to the 'response to injury' hypothesis. Circulation 1997; 95: 1760-3. 18. Mir LM, Bureau MF, Gehl J, Rangara R, Rouy D, Caillaud JM, Dellere P, Branellec D, Schwartz B, Scherman D. High efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proe Nati Acad Sei USA 1999; 96: 4262-7. 19. Lee, R.T. & Libby, P. The unstable atheroma. Arterioscler Thromb Vase Biol 17, 1859-1867 (1997). 20. Davies, M.J. The composition of coronary-artery plaques [editorial; comment]. N EnglJ Med 336, 1312-1314 (1997). 21. Virmani, R., Kolodgie, F.D., Burke, A.P., Farb, A. & Schwartz, S.M. Lessons from sudden coronary death: a comprehensive morphological classification scheme for atherosclerotic lesions. Arterioscler Thromb Vase Biol 20, 1262-1275. (2000). 22. Kolodgie, F.D. et al. Localization of apoptotic macrophages at the site of plaque rupture in sudden coronary death [In Process Citation]. Am JPathol 157, 1259-1268 (2000). 23. Kim, S.H. el al. Structural requirements of six naturally occurring isoforms of the IL-18 binding protein to inhibit IL-18. Proe Nati Acad Sei USA97,\ 190-1195 (2000). 24. Elliott, M.J., Maini, R.N., Feldmann, M., Long-Fox, A., Charles, P., Bijl, H., Moore MA, Vilcek J, Daddona P, et al. Construction and initial characterization of a mouse-human chimeric anti-TNF antibody. Mol Immunol 1993 Nov 30: 16 1443-53. 26. Tucci, A., James, H., Chicheportiche, R., Bonnefoy, J.Y., Dayer, J.M., and Zubler, R.H., 1992, J. Immunol. 148, 2778-2784. 27. Engelmann, FL, D. Novick, and D. Wallach. 1990. Two tumor necrosis factor-binding proteins purified from human urine. Evidence for immunological cross-reactivity with cell surface tumor necrosis factor receptors. J. Biol. Chem. 265: 1531-1536. 28. Moore WS, Barnett HJ, Beebe HG, et al. Guidelines for carotid endarterectomy. A multidisciplinary consensus statement from the Ad Hoc Committee, American Heart Association. Circulation 1995; 91: 566-79. 29. Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 1987; 162: 156-9. 30. US 5877197, (Karanewsky, D.S.), 1999.03.02. 31. Young, J.L., et al., "The Serpin protease inhibitor 9 is an endogenous inhibitor of interleukin-1-beta-converting enzyme (Caspase-1) activity in human vascular smooth muscle cells.", 2000.05.01, Jour. Of Exp. Med., Vol. 191, No.9, pp. 1535-44. 32. Seta, Y. et al., "Interleukin 18 in acute myocardial infarction", Heart, BMJ, 2000.12.06, Vol.84, No.6, p.668.

Claims (35)

1. Anvendelse av en IL-18-inhibitor for fremstillingen av et medikament for å behandle og/eller forebygge aterosklerose, der IL-18-inhibitoren er valgt fra gruppen som består av antistoffer mot IL-18, antistoffer mot enhver av IL-18-reseptorsubenhetene og IL-18-bindende protein (IL-18BP), et mutein av IL-18BP som omfatter konservative aminosyresubstitusjoner, et fusjonert protein av IL-18BP og immunoglobulintungkjederegioner, eller et funksjonelt derivat som omfatter PEGylert IL-18BP, der muteinet, det fusjonerte proteinet eller det funksjonelle derivatet opprettholder den biologiske aktiviteten i å binde til IL-18.

2. Anvendelse ifølge krav 1, der medikamentet er til behandlingen og/eller forebyggingen av trombose i en aterosklerotisk plakk.

3. Anvendelse ifølge krav 1 eller 2, der medikamentet er til behandlingen og/eller forebyggingen av aterosklerotiske plakksår.

4. Anvendelse ifølge ethvert av de foregående krav, der medikamentet er til behandlingen og/eller forebyggingen av aterosklerotisk plakkdestabilisering.

5. Anvendelse ifølge ethvert av de foregående krav, der medikamentet er til behandlingen og/eller forebyggingen av iskemiske syndromer som skyldes plakkdestabilisering.

6. Anvendelse ifølge ethvert av de foregående krav, der medikamentet er til behandlingen og/eller forebyggingen av aterosklerotisk plakkoppsprekking.

7. Anvendelse ifølge ethvert av de foregående krav, der IL-18-inhibitoren er et antistoff rettet mot IL-18.

8. Anvendelse ifølge ethvert av de foregående krav, der antistoffet er et humanisert antistoff.

9. Anvendelse ifølge ethvert av de foregående krav, der antistoffet er et humant antistoff.

10. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 1-6, der IL-18-inhibitoren er IL-18BP, et mutein av IL-18BP som omfatter konservative aminosyresubstitusjoner, et fusjonert protein av IL-18BP og immunoglobulintungkjederegioner, eller et funksjonelt derivat som omfatter PEGylert IL-18BP, der muteinet, det fusjonerte proteinet eller det funksjonelle derivatet opprettholder den biologiske aktiviteten i å binde til IL-18.

11. Anvendelse ifølge krav 10, der immunoglobulinet i det fusjonerte proteinet er av isotypen IgGl eller IgG2.

12. Anvendelse ifølge ethvert av de foregående krav, der medikamentet ytterligere omfatter et interferon for simultan, sekvensiell eller separat anvendelse.

13. Anvendelse ifølge krav 12, der interferonet er interferon-p\

14. Anvendelse ifølge ethvert av de foregående krav, der medikamentet ytterligere omfatter en tumornekrosefaktor (TNF)-antagonist for simultan, sekvensiell, eller separat anvendelse.

15. Anvendelse ifølge krav 14, der TNF-antagonisten er TBI og/eller TBPII.

16. Anvendelse ifølge ethvert av de foregående krav, der medikamentet ytterligere omfatter en COX-inhibitor for simultan, sekvensiell eller separat anvendelse.

17. Anvendelse ifølge krav 16, der COX-inhibitoren er en COX-2-inhibitor.

18. Anvendelse ifølge ethvert av de foregående krav, der medikamentet ytterligere omfatter en tromboksaninhibitor, for simultan, sekvensiell eller separat anvendelse.

19. Anvendelse ifølge krav 18, der tromboksaninhibitoren er aspirin.

20. Anvendelse ifølge ethvert av de foregående krav, der medikamentet ytterligere omfatter et lipidsenkende middel, for simultan, sekvensiell eller separat anvendelse.

21. Anvendelse ifølge krav 20, der det lipidsenkende midlet er en HMG-CoA-inhibitor.

22. Anvendelse ifølge krav 21, der HMG-CoA-inhibitoren er et statin.

23. Anvendelse ifølge ethvert av de foregående krav, der medikamentet blir benyttet i kombinasjon med en diett med lavt fettinnhold og/eller lavt kolesterolinnhold og/eller lavt saltinnhold.

24. Anvendelse ifølge ethvert av de foregående krav, der inhibitoren av IL-18 skal bli benyttet i en mengde på omtrent 0,0001 til 10 mg/kg kroppsvekt, eller omtrent 0,01 til 5 mg/kg kroppsvekt, eller omtrent 0,1 til 3 mg/kg kroppsvakt, eller omtrent 1 til 2 mg/kg kroppsvekt.

25. Anvendelse ifølge ethvert av de foregående krav, der inhibitoren av IL-18 skal bli benyttet i en mengde på omtrent 0,1 til 1000 ug/kg kroppsvekt, eller omtrent 1 til 100 jxg/kg kroppsvekt, eller omtrent 10 til 50 ug/kg kroppsvekt.

26. Anvendelse ifølge ethvert av de foregående krav, der IL-18-inhibitoren skal bli administrert subkutant.

27. Anvendelse ifølge ethvert av de foregående krav, der IL-18-inhibitoren skal bli administrert intramuskulært.

28. Anvendelse ifølge ethvert av de foregående krav, der IL-18-inhibitoren skal bli administrert daglig.

29. Anvendelse ifølge ethvert av de foregående krav, der IL-18-inhibitoren skal bli administrert hver annen dag.

30. Anvendelse av en ekspresjonsvektor som omfatter den kodende sekvensen for en IL-18-inhibitor for fremstillingen av et medikament til behandlingen og/eller forebyggingen av aterosklerose, der IL-18-inhibitoren er valgt fra gruppen som består av antistoffer mot IL-18, antistoffer mot enhver av IL-18-reseptorsubenhetene og en IL-18BP, et mutein av IL-18BP som omfatter konservative aminosyresubstitusjoner, et fusjonert protein av IL-18BP og immunoglobulintungkjederegioner, eller et funksjonelt derivat som omfatter PEGylert IL-18BP, der muteinet, det fusjonerte proteinet eller det funksjonelle derivatet opprettholder den biologiske aktiviteten i å binde til IL-18.

31. Anvendelse ifølge krav 30, der ekspresjonsvektoren blir administrert ved elektrooverføring.

32. Anvendelse ifølge krav 30 eller 31, ekspresjonsvektoren blir administrert systemisk.

33. Anvendelse ifølge ethvert av de foregående krav, der ekspresjonsvektoren blir administrert intramuskulært.

34. Anvendelse av en celle som har blitt genetisk modifisert for å fremstille en inhibitor av IL-18 i fremstillingen av et medikament til behandlingen og/eller forebyggingen av aterosklerose, der IL-18 inhibitoren er valgt fra gruppen som består av antistoffer mot IL-18, antistoffer mot enhver av IL-18-reseptorsubenhetene, og IL-18BP, et mutein av IL-18BP som omfatter konservative aminosyresubstitusjoner, et fusjonert protein av IL-18BP og immunoglobulintungkjederegioner, eller et funksjonelt derivat som omfatter PEGylert IL-18BP, der muteinet, det fusjonerte proteinet eller det funksjonelle derivatet opprettholder den biologiske aktiviteten i å binde til IL-18.

35. Anvendelse av IL-18 som en diagnostisk markør for progresjon av aterosklerose.