UA78492C2 - Use of il-18 inhibitor for treatment and/or prevention of atherosclerosis - Google Patents

Description

тіла, або приблизно від 0,1 до Змг/кг маси тіла, або 41. Застосування за п.17, для одержання лікар- приблизно від 1 до 2мг/кг маси тіла. ського засобу для лікування і/або запобігання де- 23. Застосування за будь-яким з пунктів 15-22, яке стабілізації атеросклеротичної бляшки. відрізняється тим, що інгібітор І/-18 застосову- 42. Застосування за п.41, яке відрізняється тим, ють в кількості приблизно від 0,1 до 1000мкг/кг що 1-18 зв'язуючий білок є пегільованим. маси тіла або приблизно від 1 до 100мкг/кг маси 43. Застосування за п.41, яке відрізняється тим, тіла, або від 10 до 5Омкг/кг маси тіла. що імуноглобулін відноситься до ізотипу (901 або 24. Застосування за будь-яким з пунктів 15-23, яке Ідс2. відрізняється тим, що інгібітор І--18 вводять під- 44. Застосування за будь-яким з пунктів 41-43, яке шкірно. відрізняється тим, що лікарський засіб додатково 25. Застосування за будь-яким з пунктів 15-24, яке містить речовину, що знижує рівень ліпідів, для відрізняється тим, що інгібітор І--18 вводять вну- одночасного, послідовного або роздільного засто- трішньом'язово. сування. 26. Застосування за будь-яким з пунктів 15-25, яке 45. Застосування за п.44, яке відрізняється тим, відрізняється тим, що інгібітор І--18 вводять що- що речовина, що знижує рівень ліпідів, являє со- дня. бою інгібітор НМО СоА. 27. Застосування за будь-яким з пунктів 15-26, яке 46. Застосування за п.45, яке відрізняється тим, відрізняється тим, що інгібітор ІІ/-18 вводять че- що інгібітор НМО СоА являє собою статин. рез день. 47. Застосування за будь-яким з пунктів 41-46, яке 28. Застосування за п.1ї7, для одержання лікар- відрізняється тим, що лікарський засіб застосо- ського засобу для лікування і/або запобігання пок- вують в поєднанні з дієтою зі зниженим вмістом риттю виразками атеросклеротичної бляшки. жиру і/або холестерину, і/або солі. 29. Застосування за п.28, яке відрізняється тим, 48. Застосування за будь-яким з пунктів 41-47, яке що 1-18 зв'язуючий білок є пегільованим. відрізняється тим, що інгібітор І--18 застосову- 30. Застосування за п.28, яке відрізняється тим, ють в кількості приблизно від 0,0001 до 10мг/кг що імуноглобулін відноситься до ізотипу (ДО1 або маси тіла або приблизно від 0,01 до 5мг/кг маси

Іа. тіла, або приблизно від 0,1 до Змг/кг маси тіла, або 31. Застосування за будь-яким з пунктів 28-30, яке приблизно від 1 до 2мг/кг маси тіла. відрізняється тим, що лікарський засіб додатково 49. Застосування за будь-яким з пунктів 41-48, яке містить речовину, що знижує рівень ліпідів, для відрізняється тим, що інгібітор І--18 застосову- одночасного, послідовного або роздільного засто- ють в кількості приблизно від 0,1 до 100Омкг/кг сування. маси тіла або приблизно від 1 до 10Омкг/кг маси 32. Застосування за п.З1, яке відрізняється тим, тіла, або від 10 до 5Омкг/кг маси тіла. що речовина, що знижує рівень ліпідів, являє со- 50. Застосування за будь-яким з пунктів 41-49, яке бою інгібітор НМО СоА. відрізняється тим, що інгібітор І--18 вводять під- 33. Застосування за п.32, яке відрізняється тим, шкірно. що інгібітор НМО СоА являє собою статин. 51. Застосування за будь-яким з пунктів 41-50, яке 34. Застосування за будь-яким з пунктів 28-33, яке відрізняється тим, що інгібітор ІІ-18 вводять вну- відрізняється тим, що лікарський засіб застосо- трішньом'язово. вують в поєднанні з дієтою зі зниженим вмістом 52. Застосування за будь-яким з пунктів 41-51, яке жиру і/або холестерину і/або солі. відрізняється тим, що інгібітор І--18 вводять що- 35. Застосування за будь-яким з пунктів 28-34, яке дня. відрізняється тим, що інгібітор І/-18 застосову- 53. Застосування за будь-яким з пунктів 41-52, яке ють в кількості приблизно від 0,0001 до 10Омг/кг відрізняється тим, що інгібітор І--18 вводять че- маси тіла або приблизно від 0,01 до 5мг/кг маси рез день. тіла, або приблизно від 0,1 до Змг/кг маси тіла, або 54. Застосування за п.1ї7, для одержання лікар- приблизно від 1 до 2мг/кг маси тіла. ського засобу для лікування і/або запобігання роз- 36. Застосування за будь-яким з пунктів 28-35, яке риву атеросклеротичної бляшки. відрізняється тим, що інгібітор І/-18 застосову- 55. Застосування за п.54, яке відрізняється тим, ють в кількості приблизно від 0,1 до 1000мкг/кг що 1-18 зв'язуючий білок є пегільованим. маси тіла або приблизно від 1 до 10О0мкг/кг маси 56. Застосування за п.54, яке відрізняється тим, тіла, або від 10 до 5Омкг/кг маси тіла. що імуноглобулін відноситься до ізотипу (ДО1 або 37. Застосування за будь-яким з пунктів 28-36, яке Ідс2. відрізняється тим, що інгібітор І--18 вводять під- 57. Застосування за будь-яким з пунктів 54-56, яке шкірно. відрізняється тим, що лікарський засіб додатково 38. Застосування за будь-яким з пунктів 28-37, яке містить речовину, що знижує рівень ліпідів, для відрізняється тим, що інгібітор І--18 вводять вну- одночасного, послідовного або роздільного засто- трішньом'язово. сування. 39. Застосування за будь-яким з пунктів 28-38, яке 58. Застосування за п.57, яке відрізняється тим, відрізняється тим, що інгібітор І--18 вводять що- що речовина, що знижує рівень ліпідів, являє со- дня. бою інгібітор НМО СоА. 40. Застосування за будь-яким з пунктів 28-39, яке 59. Застосування за п.58, яке відрізняється тим, відрізняється тим, що інгібітор ІІ/-18 вводять че- що інгібітор НМО СоА являє собою статин. рез день. 60. Застосування за будь-яким з пунктів 54-59, яке відрізняється тим, що лікарський засіб застосо-

вують в поєднанні з дієтою зі зниженим вмістом 68. Застосування за п.6б7, яке відрізняється тим, жиру і/або холестерину і/або солі. що експресуючий вектор вводять шляхом елект- 61. Застосування за будь-яким з пунктів 54-60, яке роперенесення. відрізняється тим, що інгібітор І/-18 застосову- 69. Застосування за п.67 або 68, яке відрізняєть- ють в кількості приблизно від 0,0001 до 1Омг/кг ся тим, що експресуючий вектор вводять систем- маси тіла або приблизно від 0,01 до 5мг/кг маси но. тіла, або приблизно від 0,1 до Змг/кг маси тіла, або 70. Застосування за будь-яким з пунктів 67-69, яке приблизно від 1 до 2мг/кг маси тіла. відрізняється тим, що експресуючий вектор вво- 62. Застосування за будь-яким з пунктів 54-61, яке дять внутрішньом'язово. відрізняється тим, що інгібітор І/-18 застосову- 71. Застосування генетично модифікованої клітини ють в кількості приблизно від 0,1 до 1000мкг/кг для продукування інгібітора 1І--18, де інгібітором ІІ-- маси тіла або приблизно від 1 до 100мкг/кг маси 18 є ІС-18 зв'язуючий білок, для одержання лікар- тіла, або від 10 до 5Омкг/кг маси тіла. ського засобу для лікування і/або запобігання ате- 63. Застосування за будь-яким з пунктів 54-62, яке росклерозу. відрізняється тим, що інгібітор І--18 вводять під- 72. Спосіб лікування і/або запобігання атероскле- шкірно. розу, що включає введення організму-хазяїну, 64. Застосування за будь-яким з пунктів 54-63, яке який потребує цього, ефективної інгібуючої кілько- відрізняється тим, що інгібітор І--18 вводять вну- сті інгібітора 1І--18, де інгібітором 1-18 є 1-18 зв'я- трішньом'язово. зуючий білок. 65. Застосування за будь-яким з пунктів 54-64, яке 73. Спосіб запобігання і/або лікування атероскле- відрізняється тим, що інгібітор І--18 вводять що- розу, що включає введення організму-хазяїну, дня. який потребує цього, експресуючого вектора, що 66. Застосування за будь-яким з пунктів 54-65, яке містить послідовність, яка кодує інгібітор 1-18, де відрізняється тим, що інгібітор ІІ/-18 вводять че- інгібітором 1-18 є 1-18 зв'язуючий білок. рез день. 74. Спосіб за п.73, який відрізняється тим, що 67. Застосування експресуючого вектора, що міс- експресуючий вектор вводять системно. тить послідовність, яка кодує інгібітор 1І--18, де 75. Спосіб за п.73, який відрізняється тим, що інгібітором є І--18 зв'язуючий білок, для одержан- експресуючий вектор вводять шляхом внутріш- ня лікарського засобу для лікування і/або запобі- ньом'язової ін'єкції. гання атеросклерозу.

Даний винахід відноситься до області захво- хвороби серця. Він є головною причиною органіч- рювань судин. Більш конкретно, винахід відно- ної ішемії, такої як, наприклад, інфаркту міокарда. ситься до застосування інгібіторів І--18 для ліку- Атерома є найбільш поширеним пошкоджен- вання і/або запобігання атеросклерозу. ням артерій, яке далі може ускладнюватись тро-

Атеросклероз є широко поширеним і найбільш мбоемболією. Атероматозні бляшки часто звужу- важливим захворюванням судин, але відома мно- ють просвіт артерій, приводячи до ішемії і іноді до жина інших захворювань судин. Атеросклероз в атрофії тканин в області з поганим кровопостачан- основному вражає великі і середні артерії, і пош- ням. Серйозні наслідки включають симптом стено- кодження включають смужки жиру, фіброзні бляш- кардії внаслідок ішемії міокарда, серцеву недоста- ки і ускладнені ураження. Атеросклероз являє со- тність внаслідок ішемії або неішемічних причин, і бою хронічне запальне захворювання артеріальної гіпертензію внаслідок звуження ниркової артерії і стінки, що характеризується прогресивним нако- поганого кровопостачання нирок, яке фізіологічно пиченням ліпідів, таких як холестерин, клітин, та- приводить до збільшення секреції реніну. ких як макрофаги, Т-лімфоцити або гладком'язові Іноді атеросклероз і артеріосклероз відносять клітини, і екстрацелюлярного матриксу (1). Най- до окремих патологічних станів і, в цьому випадку, більш великі скупчення називають атеромами або атеросклероз має на увазі ущільнення (склероз) бляшками, які часто містять кальцій. Жирова тка- або втрату еластичності артерій конкретно в ре- нина може роз'їдати стінку артерії, знижувати ела- зультаті атероми, хоча атеросклероз являє собою стичність артерії і перешкоджати току крові. У ре- ущільнення або втрату еластичності артерій вна- зультаті, навколо бляшкоподібних відкладень слідок будь-яких причин. можуть утворюватися тромби, додатково переш- Ускладнення або наслідки атеросклерозу коджаючи току крові, що може привести до повної включають захворювання коронарних артерій оклюзії кровоносної судини. Звичайно атероскле- (атеросклероз коронарних артерій), недостатність роз пов'язаний з підвищеними рівнями 01 - кровопостачання в результаті обструкції (іше- холестерину, І р(а) фібриногену і фактора МІЇ, так мія/стенокардія), гострий ІМ (інфаркт міокарда, само як і зі зниженим рівнем НОЇ -холестерину. серцевий приступ), транзиторну ішемічну атаку

Фактори ризику включають більш старший вік, чо- (ТІА) або інсульт і пошкодження кровоносних су- ловічу стать, куріння, діабет, ожиріння, високий дин, м'язової тканини або органів. рівень холестерину в крові, дієту, багату жирами, і Аневризми, які являють собою постійні анома- наявність індивідуального або сімейного анамнезу льні розширення кровоносних судин, також є ши-

роко поширеними наслідками атеросклерозу. Ате- Запалення також грає головну роль в розпаді росклеротичні аневризми черевної аорти звичайно атеросклеротичної бляшки і тромбозі (|2-5|, і тому розвиваються у немолодих пацієнтів. Вони можуть впливає на появу гострих ішемічних синдромів і розриватися в зачеревинний простір. В атероскле- пов'язану з ними летальність |б6|. Дійсно важкі клі- ротичних аневризмах звичайно присутні різко ви- нічні вияви атеросклерозу, що включають інфарк- ражена втрата еластичної тканини і фіброз серед- ти серця, мозку і будь-яких інших органів, ураже- ньої оболонки, в основному внаслідок ішемії ного атеросклерозом, в основному є результатом м'язової тканини середньої оболонки аорти, що оклюзії просвіту судини тромбом, утвореним при супроводжується вивільненням макрофагальних взаємодії із зруйнованою атеросклеротичною ферментів, що приводить до фрагментації еласти- бляшкою (3, 4). Патологічні дослідження показали, чних волокон. що вразливі або нестабільні бляшки, тобто бляш-

Лікарські засоби, рекомендовані для лікування ки, схильні до розпаду або які розпадаються, си- або запобігання атеросклерозу, направлені на льно відрізняються за клітинним і матриксним зниження рівня ліпідів/холестерину в крові. Зокре- складом в порівнянні зі стабільними бляшками, не ма, широко застосовується терапія, направлена на схильними до розпаду (71. Вразливі бляшки багаті зниження І ОіІ-холестерину. У цей час найбільш клітинами запалення (макрофаги і Т-лімфоцити), широко застосовуються статини, специфічні інгібі- містять тромбогенне ліпідне ядро і характеризу- тори НМО СоА-редуктази. Інші засоби, що знижу- ються тонким фіброзним верхнім шаром з істотним ють рівень ліпідів, включають такі лікарські засоби, недоліком позаклітинного матриксу (71. як холестирамін, колестипол, нікотинова кислота, Зниження синтезу колагену, опосередковане гемфіброзил, пробукол, ловастатин і інші. прозапальним цитокіном ІРМ-у, і підвищення акти-

Іншим підходом є мінімізація ризику утворення вності макрофагальних металопротеаз, що руйну- тромбу на сталому атероматозному пошкодженні. ють матрикс, є причинами потоншення і крихкості

Аспірин, який являє собою специфічний інгібітор фіброзного верхнього шару (|7|. Руйнування крих- тромбоксану Аг, який опосередковує агрегацію кого фіброзного верхнього шару відкриває високо тромбоцитів, або антикоагулянти можуть застосо- тромбогенне ліпідне ядро для контакту з цирку- вуватися для зниження ризику утворення тромбу. люючою кров'ю і приводить до утворення оклюзи-

У черезшкірній «балонній ангіопластиці» за- вного тромбу (1, 7|. Тому вважають, що щільність стосовується катетер з балоном на кінці для клітин запалення в певному атеросклеротичному сплющення бляшки і збільшення току крові після пошкодженні є хорошим показником його нестабі- оклюзії. Технологія подібна технології, що засто- льності. совується для відкриття артерій серця, але вона Клінічний прогноз для пацієнта з атеросклеро- може застосовуватися відносно багатьох інших зом тільки частково залежить від розміру пошко- артерій організму. Стеноз коронарних артерій шу- дження (19, 20Ї. У цей час широко визнано, що нтують за допомогою сегментів підшкірної вени, якість (склад бляшки), швидше, ніж розмір пошко- вшитої в проксимальну частину аорти, або за до- дження, може бути навіть кращим показником роз- помогою відсікання внутрішньої грудної артерії з витку ішемічних випадків. Дійсно, важкі клінічні боку грудної стінки і створення анастомозу її дис- вияви атеросклерозу (інфаркти серця або мозку) в тального кінця з артерією на передній поверхні основному є результатом оклюзії просвіту судини серця. тромбом, утвореному на поверхні атеросклероти-

Хірургічне видалення відкладення (ендартере- чної бляшки, що розпадається (19). Патологічні ктомія) може бути рекомендоване в деяких випад- дослідження показали, що вразливі або нестабі- ках (наприклад: ендартеректомія сонної артерії). льні бляшки, які схильні до розпаду або які розпа-

Однак основною рекомендацією залишається лися, багаті клітинами запалення і характеризу- вплив або контроль над факторами ризику, подіб- ються істотним недоліком вмісту гладком'язових но підтримці дієти з низьким вмістом жиру, низь- клітин і колагену (20, 21). Більш того, в подібних ким вмістом холестерину і низьким вмістом солі із бляшках виявлене збільшення апоптотичної заги- подальшими направленими на підтримку здорово- белі клітин, що веде до утворення високо тромбо- го стану рекомендаціями відносно лікування і кон- генного ліпідного ядра (13, 221. тролю за гіпертонією, діабетом і іншими захворю- Прозапальні цитокіни беруть участь у запа- ваннями, зниження маси тіла і припинення куріння, ленні. Цитокін інтерлейкін 18 (1-18) спочатку був так само як і регулярні фізичні вправи для поліп- описаний як фактор, що індукує інтерферон-у (ІЕМ- шення стану серця і кровообігу. | | У) ІВ). Він являє собою ранній сигнал розвитку від-

Запальний процес присутній на різних стадіях повіді лімфоцитів Т-хелперів типу 1 (ТП1). І--18 діє атеросклерозу (1). Активація ендотелію за допомо- разом з 1І--12, І/-2, антигенами, мітогенами і мож- гою ряду факторів, що включають невелике доти- ливо іншими факторами, індукуючи продукцію ІЕМ- чне напруження, модифіковані ліпопротеїни і про- у. 1-18 також посилює продукцію СМ-С5Е і 1-2, запальні цитокіни, вважається першою стадією посилює проліферацію Т-клітин, викликану анти- атеросклерозу і знаходиться під запальним конт- СОЗ3, і підвищує РЕаз-опосередковану загибель ролем (1). Багато нещодавніх досліджень показа- природних кілерів. Зріла форма ІІ -18 утворюється ли, що взаємодії між клітинами судини і клітинами з його попередника за допомогою 1І-1рД- запалення є вирішальними в атерогенезі (1). Зок- перетворюючого ферменту (ІСЕ, каспаза-1). Реце- рема, інгібування окремих прозапальних шляхів птор 1-18 складається, принаймні, з двох компо- уповільнює розвиток атеросклерозу ПІ. нентів, що беруть участь в скріпленні ліганду. Ви- соко- і низькоафінні сайти скріплення 1-18 були знайдені на мишачих Т-клітинах, стимульованих для запобігання і/або лікування атеросклерозу.

І--12 І9Ї, передбачаючи існування багатоланцюго- Винахід, крім того, відноситься до способів ліку- вого рецепторного комплексу. Дві рецепторні вання з генним терапевтичним підходом лікування субодиниці ідентифіковані в даний момент, які і/або запобігання атеросклерозу. обидві належать до сімейства рецептора 1І--1 10). Короткий опис фігур

Передача сигналу 1-18 включає активацію МЕ-кВ На Фіг.1 представлена гістограма, що відо-

ПТ. бражає процентне значення виживаності ендоте-

Нещодавно був виділений розчинний білок, що ліальних клітин пупкової вени людини після інку- володіє високою афінністю до ІІ--18, з сечі людини бації тільки з окисленими ліпопротеїнами або і були клоновані кДНК миші і людини, так само як і інкубації разом з комбінацією окислених ліпопроте- ген людини (12; УМО 99/09063|. Білок був названий Тнів з антитілами до 1І--18 або ІІ -18ВР відповідно.

І/-18-зв'язуючий білок (ІІ -188Р). На Фіг.2 представлений Вестерн-блот, прове-

І/-18ВР не є позаклітинним доменом одного з дений для білкових екстрактів з атеросклеротич- відомих рецепторів 1-18, а секретованим природ- них артерій в порівнянні з контрольними артерія- но циркулюючим білком. Він належить до нового ми. У Вестерн-блоті застосовували антитіла проти сімейства секретованих білків, крім того, включає І--18ВР (ПІ-188Р), о-субодиницю рецептора 1-18 різні білки, що кодуються Рохміги5 (12). І-188вР (п -188БРо), 11-18 (ПІІ/-18) і каспазу-1 (Сазразе-1 постійно експресується в селезінці (12|Ї. Сечовий р10).

І/-128Р, так само як і рекомбінантний, специфічно На Ффіг.3 представлений агарозний гель, заба- зв'язує 1-18 з високою афінністю і модулює біоло- рвлений бромистий етидієм, що показує результат гічну афінність 1-18. ОТ-ПЛР-аналізу мРНК 1-18 і І/-18В8Р в клітинах

Ген ІШ-18ВР розташований на хромосомі лю- атеросклеротичної бляшки. дини 11413, і в геномній послідовності розміром На Фіг.4 представлені результати ОТ-ПЛР для 8,3т.п.н. не було знайдено екзону, що кодує тран- І--128Р ії 1--18 в атеросклеротичній бляшці в порі- смембранний домен. Чотири варіанти сплайсингу внянні з експресією по-актину (контроль) в симп- або ізоформи І--188Р. були знайдені у людини і томатичних і асимптоматичних бляшках. позначені як І--18ВРа, Б, с і д, які всі несуть одна- На Фіг.5 представлена карта експресувального кові М-кінцеві послідовності і відмінні С-кінцевими вектора, використаного для внутрішньом'язового послідовностями (121. електроперенесення у мишей.

Чотири ізоформи 1І--18ВР людини і дві мишачі На Фіг.б представлена гістограма, що відо- ізоформи, одержані в результаті сплайсингу МРНК бражає площу ліпідних плям в атеросклеротичних і знайдені в різних бібліотеках КДНК, експресували, артеріях. Кількісний комп'ютерний аналіз зобра- очищали і оцінювали на скріплення і нейтралізацію ження ліпідного відкладення. Дані представлені у біологічної активності 1-18 (23). Ізоформа І -18ВР вигляді середніх величин зі станд. помилкою, людини (І--188Ра) виявила найбільшу афінність (п-19 для вільної плазміди, п-14 для плазміди, що до 1-18 з швидкою активацією (гарій оп-гаїе), по- містить І-418ВР). Чотирма зірочками відмічене вільною інактивацією (5іом/ ой-гаїе) і константою р«0,0001. дисоціації (К(а)) 399пМ. 1І--18ВРС містить Ід-домен На Фіг.7 представлена гістограма, що відо-

І/-18ВРа за винятком 29 С-кінцевих амінокислот; бражає площу ураження синуса аорти після обро-

К(а) для 1І-18ВРС в 10 разів менше (2,94нМ). Про- бки за допомогою ІІ-18ВР в порівнянні з контро- те, І.-18ВРа і І--188РС нейтралізують 1-18 59595 лем (вільна плазміда). Кількісний комп'ютерний при подвійному мольному надлишку. В ізоформах аналіз зображення площі ураження. Дані предста-

П.-18ВРБ ї Т--18вРа відсутній повний Ід-домен і влені у вигляді середніх величин зі станд. помил- відсутня здатність зв'язувати або нейтралізувати кою, (п-19 для вільної плазміди, п--14 для плазмі-

І/-18. Мишачі ізоформи І--І5ВРс і 1/-188вРа, що ди, що містить 1-18ВР). Двома зірочками володіють ідентичним Ід-доменом, також нейтралі- відмічене р«е0,01. зують 29595 мишачого 11-18 при подвійному мо- На Фіг.8 представлений вплив обробки за до- льному надлишку. Однак мишачий І--188Ра, що помогою ІІ-18В8Р на вміст клітин запалення в об- містить загальну С-кінцеву послідовність з ІЇІ- ласті ураження. Кількісний комп'ютерний аналіз 18ВРа людини, також нейтралізує 1-18 людини. зображення застосовували для визначення про-

Молекулярне моделювання виявило великий змі- центної величини площ, позитивних за вмістом шаний електростатичний і гідрофобний сайт скріп- макрофагів (чорні стовпчики) і кількості інфільтру- лення на Ід-домені І--18ВР, який може бути пояс- ючих Т-лімфоцитів на мм: (сірі стовпчики) в зонах ненням його високою афінністю скріплення ліганду уражень синуса аорти контрольних (п-12 для фа- (231. рбування макрофагів, п-15 для фарбування Т-

Винахід заснований на даних, що інгібітор ІЇ-- лімфоцитів) або оброблених за допомогою І! - 18 володіє вираженим благотворним впливом на 18ВР. мишей (п-13 для макрофагів, п-12 для Т- утворення бляшки, розвиток бляшки і стабільність лімфоцитів). Дані представлені у вигляді середніх бляшки на мишачій моделі атеросклерозу. Інгібі- величин зі станд. помилкою. Трьома зірочками тор І--18 не тільки запобігає утворенню ураження відмічене р«е0,005; і чотирма зірочками відмічене грудної аорти, але також і індукує перемикання на р«0,0001. фенотип стабільної бляшки для атеросклеротич- На Ффіг.9 представлений вплив обробки І/- них бляшок, що вже сформувалися. 188ВР на вміст гладком'язових клітин і колагену в

Тому, винахід відноситься до застосування ін- області ураження. Кількісний комп'ютерний аналіз гібітору І--18 для одержання лікарських засобів зображення застосовували для визначення про-

центної величини площ, позитивних за вмістом Інгібітор функціонування 1-18 може являти гладком'язових клітин (чорні стовпчики), і накопи- собою, наприклад, антагоніст 1-18. Антагоністи чення колагену (сірі стовпчики) в зонах ураження можуть як зв'язувати, так і секвестувати саму мо- синуса аорти контрольних (п-б для гладком'язових лекулу 1-18 з достатньою афінністю і специфічні- клітин, п-11 для колагену) або оброблених за до- стю для часткової або істотної нейтралізації 1-18 помогою І--188Р мишей (п-б для гладком'язових або сайтів скріплення 1-18, відповідальних за клітин, п-13 для колагену). Дані представлені у скріплення 1-18 з його лігандами (такими як, на- вигляді середніх величин зі станд. помилкою. Од- приклад, його рецепторами). Антагоніст також мо- нією зірочкою відмічене ре0,05; і двома зірочками же інгібувати шлях передачі сигналу 1-18, що ак- відмічене р«е0,01. тивується в клітинах при скріпленні 1-

Винахід заснований на даних про підвищені 18/рецептор. рівні циркулюючого ІЇ/-18 у пацієнтів з гострими Інгібітори функціонування 1І/-13 можуть також коронарними синдромами і підвищеною продукці- являти собою розчинні рецептори ІІ-18 або моле- єю І--18 в нестабільних атеросклеротичних бляш- кули, що імітують рецептори, або речовини, що ках сонної артерії, відповідальних за інсульт. Крім блокують рецептори 1-18, антитіла проти 1-18, того, показано, що електроперенесення іп мімо такі як, наприклад, моноклональні антитіла, або експресуючої плазмідної ДНК, що кодує 1І--188Р, будь-яку іншу речовину або молекулу, що запобі- запобігає розвитку жирових смужок в грудній аорті гає скріпленню 1-18 зі своїми мішенями, таким і уповільнює прогресію сформованих атеросклеро- чином ослабляючи або запобігаючи запуску все- тичних бляшок в синусі аорти на добре вивченій редині - або позаклітинних реакцій, опосередкова- мишачій моделі атеросклерозу. Більш важливо, них І--18. перенесення плазміди, що містить ІІ -188Р, індукує Атеросклерозом також називають артеріоск- сильні зміни в складі бляшки (зменшення змісту лероз або ущільнення артерій. Згідно з контекстом макрофагів, Т-клітин, загибелі клітин і змісту ліпідів даного винаходу термін атеросклероз включає в і збільшення вмісту гладком'язових клітин і колаге- себе всі захворювання або хворобливі стани арте- ну), що приводить до стабільного фенотипу бляш- рій, що звичайно описуються як атеросклероз, в ки. Дані результати вперше показують важливу ході яких ліпідна речовина відкладається на су- роль інгібіторів І--18 в зниженні формування динній стінці, в результаті приводячи до звуження і бляшки/прогресії і в стимулюванні стабільності погіршення току крові, так само як і до розриву бляшки. і/або ерозії з формуванням тромбу.

Винахід також відноситься до застосування ін- Згідно з даним винаходом атеросклероз озна- гібітору І--18 для одержання лікарського засобу чає як ущільнення, так і втрату еластичності арте- для лікування і/або запобігання атеросклерозу. рій в результаті атероми (атеросклероз) і внаслі-

Термін «запобігання» в контексті даному вина- док будь-якої іншої причини (артеріосклероз). ходу відноситься не тільки до повного запобігання Патологічні фактори атеросклерозу, так само як і основному наслідку, але також і до будь-якого час- ускладнення або наслідки, які мається на увазі ткового або досить істотного запобігання, ослаб- включити в застосовний в описі винаходу термін лення, зменшення, зниження або скорочення нас- «атеросклероз», детально описані вище в «рівні лідку перед або на ранній стадії початку техніки». захворювання. Прогресування атеросклерозу включає утво-

Термін «лікування» в контексті даного винахо- рення атеросклеротичних бляшок і їх перехід у все ду відноситься до будь-якого сприятливого впливу більш і більш нестабільні форми. Тому винахід на розвиток захворювання, включаючи ослаблен- також відноситься до застосування інгібітору 1-18 ня, зменшення, зниження або скорочення патоло- для одержання лікарського засобу, що знижує або гічного процесу після початку захворювання. попереджає прогресування атеросклерозу.

Термін «інгібітор І--18» в контексті даного ви- Оклюзія судини тромбом, що сформувався на находу відноситься до будь-якої молекули, що атеросклеротичній бляшці, є вирішальною подією модулює продукцію і/або функціонування 11-18 для інфарктів серця або мозку, які знаходяться в таким чином, що продукція і/або функціонування числі найбільш серйозних наслідків атеросклеро- ослабляються, зменшуються або частково, істотно зу. Тому винахід також відноситься до застосуван- або повністю запобігаються або блокуються. ня інгібітору І--18 для одержання лікарського за-

Інгібітор продукції може являти собою будь-яку собу для лікування і/або запобігання тромбозу на молекулу, що негативно впливає на синтез, про- атеросклеротичній бляшці. цесинг або дозрівання 1-18. Інгібітори, що розгля- Стабільність бляшки впливає на перетворення даються згідно з винаходом, можуть бути, напри- атеросклеротичної бляшки в несприятливу або клад, супресорами експресії гена 1-18, вразливу бляшку, яка схильна до ініціювання тро- антисмисловими мРНК, що зменшують або що мбозу. Тому винахід, крім того, відноситься до за- запобігають транскрипції мРНК 1-18 або що при- стосування інгібітору І--18 для одержання лікар- водять до деградації мРНК, білками, що порушу- ського засобу для запобігання і/або лікування ють правильне укладання або частково або істот- нестабільності атеросклеротичної бляшки. но запобігають дозріванню або секреції 1-18, Нестабільна бляшка схильна до розпаду, і ро- протеазами, що руйнують 1-18 відразу після його зпад бляшки може привести до тромбозу. Тому синтезу, і подібними. Інгібітор продукції може яв- винахід, крім того, відноситься до застосування ляти собою інгібітор каспази-1 або інгібітор ІСЕ, інгібітору 1-18 для одержання лікарського засобу наприклад, який запобігає дозріванню 1І--18.

для запобігання ерозії або розпаду атеросклеро- тних залишків додані до нативної послідовності 1І-- тичної бляшки. 188Р або вірусного І/-18ВР без значної зміни ак-

Нестабільність бляшки і тромбоз, наприклад, тивності одержаних продуктів в порівнянні з вихід- можуть бути результатом апоптотичної загибелі ним типом І -18ВР або вірусним І--188ВР. Дані клітин, яка приводить до високої прокоагулянтної мутеїни одержують за допомогою відомих способів активності і може бути ключовою подією, що при- синтезу і/або сайт-специфічного мутагенезу або водить до тромбозу ерозованих або бляшок, що будь-яких відомих способів, придатних для засто- розпалися, так само як і до емболічних процесів сування в даному винаході. (13, 14Ї. Показано, що окислені ліпопротеїни Будь-який подібний мутеїн переважно має (ох 0) індукують апоптоз макрофагів і ендотеліа- амінокислотну послідовність, що достатньо повто- льних клітин в культурі (15). Як показано на прик- рює послідовність І.-138ВР або достатньо повто- ладах нижче, в цей час встановлено, що інгібітор рює вірусну І--18ВР, такий, щоб володіти значною

І/-18 здатний значно знижувати загибель клітин, мірою схожою активністю з І-18В8Р. Одним виявом індуковану охі 0. активності І--18ВР є його здатність скріплення ІЇ--

Згідно з даним винаходом несподівано було 18. Наскільки мутеїн володіє достатньою зв'язую- встановлено, що рівні І--18 в крові були значно чою активністю по відношенню до 1І--188Р, насті- підвищені у пацієнтів з серцевою недостатністю, льки він може застосовуватися для очищення І - страждаючих від рецидивних явищ, таких як, на- 18, наприклад, за допомогою афінної хроматогра- приклад, смерть, рекурентна ішемія, реваскуляри- фії, і, таким чином, можна вважати володіє досить зація, прогресування атеросклерозу або госпіталі- схожою активністю з ІІ -188Р. Таким чином, можна зація, що періодично повторюється з приводу визначити у будь-якого даного мутеїну наявність серцевої недостатності, в порівнянні з пацієнтами, досить схожої активності з І--18В8Р за допомогою що не потребують повторної госпіталізації. Дане звичайного експериментування, піддаючи подіб- підвищення рівня І/-183 особливо характерне для ний мутеїн, наприклад, простому конкурентному пацієнтів, які померли через деякий час, в порів- сендвіч-аналізу для встановлення здатності скріп- нянні з хворими, що вижили. Підвищені рівні 1-18 лення відповідним чином міченого 1-18, напри- в крові спостерігалися як у пацієнтів з ішемією, так клад, радіоїмуноаналізу або аналізу ЕГІ5А. і у пацієнтів без ішемії. Мутеїнові поліпептиди І-18ВР або мутеїни ві-

Тому винахід також відноситься до застосу- русних 1--188Р, які можуть застосовуватися згідно вання інгібітору І--18 для одержання лікарського з даним винаходом, або кодуюча їх нуклеїнова засобу для лікування і/або запобігання рецидив- кислота включають обмежений набір значно спів- ним випадкам серцевої недостатності. Рецидивні падаючих послідовностей як заміщуючих пептидів випадки можуть являти собою будь-які випадки або полінуклеотидів, які можуть бути просто одер- серцевої недостатності, такі як смерть, рекурентна жані фахівцем в даній області без великої кількості ішемія, реваскуляризація, прогресування атеро- експериментів, засновуючись на принципах і кері- склерозу або госпіталізація, що періодично повто- вництві, представлених в описі винаходу. рюється з приводу серцевої недостатності. Переважні модифікації мутеїнів згідно з даним

Згідно з переважним втіленням винаходу сер- винаходом являють собою заміни, відомі як «кон- цева недостатність є ішемічною, тобто результа- сервативні». Консервативні амінокислотні замісни- том ішемії міокарда. ки поліпептидів І--188Р або білків або вірусних ІЇІ-

Згідно з іншим переважним втіленням серцева 18ВР можуть включати синонімічні амінокислоти в недостатність є не ішемічною, наприклад, внаслі- межах групи, що володіє досить схожими фізико- док системної гіпертензії, пороку клапана серця хімічними властивостями, так що при заміщенні або захворювання легень, що приводять до правої одного члена групи іншим буде зберігатися біоло- і потім застійної серцевої недостатності. гічна функція молекули (16Ї. Зрозуміло, що також

Згідно з переважним втіленням винаходу інгі- можна здійснити вставки і делеції амінокислот у бітор І/-183 вибраний з групи, що включає ІСЕ- вищезгаданих послідовностях без зміни їх функції, інгібітори, антитіла проти І/-18, антитіла проти особливо якщо вставки або делеції містять тільки будь-якої з субодиниць рецептора 1-18, інгібітори невелику кількість амінокислот, наприклад, менше передачі сигналу від рецептора 1-18, антагоністи тридцяти і переважно менше десяти, і без вида-

І/-16, які конкурують з 1-18 і блокують рецептор лення або переміщення амінокислот, що є що ви-

І--18, і білки, які зв'язують 1-18, ізоформи, мутеї- рішальними у функціональній структурі, напри- ни, гібридні білки, функціональні похідні, активні клад, залишків цистеїну. Білки і мутеїни, одержані фракції або їх похідні з круговою перестановкою, за допомогою подібних делецій і/або вставок, вхо- що володіють такою ж активністю. дять в об'єм даного винаходу.

Термін «мутеїни», що застосовується тут, від- Переважно синонімічні амінокислотні групи носиться до аналогів ІІ-18ВР або аналогів вірусно- являють собою вказані в Таблиці І. Більш перева- го І--18ВР, в якому один або декілька амінокисло- жно синонімічні амінокислотні групи вказані в Таб- тних залишків нативного І/-18ВР або вірусна ІІ- лиці ІІ; і найбільш переважні синонімічні амінокис- 18ВР заміщені різними амінокислотними залишка- лотні групи вказані в Таблиці ІІ. ми або відсутні, або один або декілька амінокисло-

Аа Аа

Таблиця | мМаї мМаї супу супу

Переважні групи синонімічних амінокислот Пе Пе, Меї, Гей

Рпе Рпе

Амінокислота Синонімічна група Туг Туг зЗег Зег, ТАг, слу, Авп Сув Сув, 5ег

Ага Ага, Сп, Гуз, Спи, Нів Нів Нів

Ї еи Не, Рне, Туг, Меї, Ма), І еи Сип Сип

Рго Су, Ага, ТНг, Ро Авп Авп

ТНг Рго, Зег, Аа, С1у, Нів, Сп, ТАг І ув І ув

Аа слу, ТНг, Рго, Аа Азр Азр маї Меї, Туг, Ре, Іе, Геи, Ма! си си су Аа, Тнг, Ріо, 5ег, Спу Меї Меї, Пе, Гей

Пе Меї, Туг, Ре, Маї, І еи, Пе Тр Меї

Рпе Тер, Меї, Туг, Пе, Маї, Геи, Рпе

Туг Тер, Меї, Ре, Іе, маї, І еи, Туг Приклади проведення заміщень амінокислот в

Сувз Зег, ТНг, Суз білках, які можуть застосовуватися для одержання

Ніб Стпм, Гув, Сп, ТНг, Ага, Ніб мутеїнових поліпептидів або білків І--18ВР, або

Сп сип, Г ув, Авп, Нів, ТАг, Аго, Сп мутеїнових вірусних І--188Р для застосування

Авп Сп, Авр, Зег, Авп згідно з даним винаходом, включають будь-які ув спи, Сп, Нів, Аго, Гуз відомі стадії способів, таких як представлені в (па-

Ар спи, Азп, Азр тентах США 4959314, 4588585 і 4737462 Маггк еї аї; сп Авр, Гуз, Авп, Сп, Нів, Агу, Спи 5116943 Коїйв еї аї; 4965195 Матеп еї аїЇ.;

Меї Ре, Іє, мМаї, Гей, Меї 4879111 Спопо еї аї.; і 5017691 ГІ ее еї аї!.|, і білки,

Тр Тр заміщені за лізином, представлені в (патенті США

Ме4904584 (Зпаму еї ай).

Таблиця ІЇ Термін «гібридний білок» відноситься до полі- пептиду, що містить І--18ВР або вірусний І--188Р,

Більш переважні або їх мутеїн, злиті з іншим білком, який, напри- групи синонімічних амінокислот клад, володіє тривалим періодом перебування в рідких середовищах організму. І--18ВР і вірусний

Амінокислота Синонімічна група І-188Р. може подібним чином бути приєднаний до бег бег іншого білка, поліпептиду або подібного, напри-

Ага Ні, Гув, Ага клад, імуноглобуліну або його фрагменту.

Ї еи Ї ем, Пе, Ріє, Меї Термін «функціональні похідні», що застосову-

Рго Аа, Рго ється, включає похідні І/-18В8Р або вірусного ІІ-

Ти ТНг 188Р і їх мутеїнів і гібридних білків, які можуть бу-

Аа Рго, АІа ти одержані з функціональних груп, які розташо- чаї Уаї, Меї, Пе вуються у вигляді бічних ланцюгів на залишках спу сту або М-, або С-кінцевих груп, за допомогою відомих

Пе Пе, Меї, Рне, маї, І єи в даній області способів, і включені у винахід, поки

Рпе Меї, Туг, Пе, Геи, Рпе вони залишаються фармацевтично прийнятними,

Туг РПе, Туг тобто вони не порушують активності білка, яка

Суб Суз, Зег досить схожа з активністю ІІ-18ВР або вірусними

Нів Ні, Сп, Ага І/-18ВР, і не додають токсичних властивостей

Сіп Спи, Сп, Нів утримуючої їх композиції. Дані похідні можуть, на-

Авп Авр, Авп приклад, включати поліетиленглікольні бічні лан-

Гуз Гуз, Ага цюги, які можуть маскувати антигенні сайти і збі-

Азр Ар, Авп льшувати перебування І/-188Р або вірусну І-- сп Сп, сп 18ВР в рідких середовищах організму. Інші похідні

Меї Меї, Ре, Пе, маї, І еи включають аліфатичні складні ефіри карбоксиль-

Тр Тір них груп, аміди карбоксильних груп, одержані вза- ємодією аміаку з первинними або вторинними амі-

Таблиця ІІ! нами, М-ацильні похідні вільних аміногруп амінокислотних залишків, одержані за допомогою

Найбільш переважні ацильних груп (наприклад, алканоїл або карбоцик- групи синонімічних амінокислот лічні ароїльні групи), або О-ацильні похідні вільних гідроксильних груп (наприклад, гідроксильні групи

Амінокислота Синонімічна група залишків серину або треонілу), одержані за допо-

Феї Зег могою ацильних груп.

Ага Ага Під терміном «активні фракції» І--18ВР або ві-

Ї еи І ем, Ме, Меї русного І--18ВР, мутеїнів і гібридних білків даний

Рго Рго винахід має на увазі будь-який фрагмент або по-

Тиг Тт передники поліпептидного ланцюга білкової моле-

кули окремо або разом з пов'язаними молекулами льне похідне, активну фракцію або похідне з кру- або залишками, приєднаними до них, наприклад, говою перестановкою. Дані ізоформи, мутеїни, залишками цукрів або фосфатними залишками, гібридні білки або функціональні похідні зберігають або агрегатами самої білкової молекули або за- біологічну активність І--18ВР, особливо скріплення лишків цукрів, забезпечуючи щоб вказана фракція з ІС-18, і переважно володіють, принаймні, істот- володіла досить схожою активністю з ІІ -188Р. ною активністю, схожою з ІІ-188ВР. Ідеально, поді-

Згідно з іншим переважним втіленням винахо- бні білки володіють біологічною активністю, яка ду інгібітор І--18 являє собою антитіло проти 1-18. навіть підвищена в порівнянні з незміненим І1--

Антитіла проти 1-18 можуть бути поліклональними 18ВР. Переважні активні фракції володіють актив- або моноклональними, химерними, гуманізовани- ністю, більш високою, ніж активність ІІ-188ВР, або ми або навіть повністю людськими. Рекомбінантні що має додаткові переваги, подібні більш високій антитіла або їх фрагменти характеризуються ви- стабільності або більш низькій токсичності або сокою афінністю скріплення з 1-18 іп мімо і низь- імуногенності, або їх легше одержати у великій кою токсичністю. Антитіла, які можуть застосову- кількості або легше очистити. ватися згідно з винаходом, характеризуються за їх Послідовності І--188ВР і його варіантів/зоформ здатністю лікування пацієнтів протягом періоду, сплайсингу можуть бути взяті з (МИМО 99/090631| або достатнього для досягнення від хорошої до чудо- з 121 так само як і з (231. вої міри регресії або ослаблення патогенного ста- Функціональні похідні І -18В8Р можуть бути ну або будь-якого симптому або групи симптомів, приєднані до полімерів для поліпшення властиво- пов'язаної з патогенним станом, і низькою токсич- стей білка, таких як стабільність, півперіод існу- ністю. вання, біодоступність, толерантність відносно ор-

Нейтралізуючі антитіла легко одержують від ганізму людини або імуногенність. Для виконання тварин, таких як кролики, коза або миші, шляхом даної мети І--18ВР. може бути приєднаний, напри- імунізації за допомогою 1-18. Імунізовані миші є клад, до поліетиленгліколю (РЕС). Приєднання особливо придатними для забезпечення джерел РЕб може проводитись за допомогою відомих

В-клітин для одержання гібридом, які по черзі ку- способів, описаних, наприклад, в (МО 92/130951. льтивують для одержання великих кількостей мо- Тому, згідно з переважним втіленням даного ноклональних антитіл проти 1-18. винаходу, І--18ВР приєднаний до РЕб.

Химерні антитіла являють собою молекули Згідно з іншим переважним втіленням винахо- імуноглобуліну, що характеризуються двома або ду інгібітор І--18 являє собою гібридний білок, що декількома сегментами або частинами, одержани- містить цілком І--18-зв'язуючий білок або його ча- ми від різних видів тварин. Звичайно варіабельну стину, яка приєднана до цілого імуноглобуліну або область химерного антитіла одержують з антитіла його частини. Фахівцеві в даній області буде зро- ссавця, не людини, такого як мишаче моноклона- зуміло, що одержаний гібридний білок зберігає льне антитіло, і константну область імуноглобуліну біологічну активність ІІ-18ВР, зокрема, скріплення одержують з молекули імуноглобуліну людини. з 1--18. Злиття може бути прямим або за допомо-

Переважно обидві області і комбінація володіють гою короткого лінкерного білка, який може бути низькою імуногенністю, що визначається звичай- коротким довжиною від 1 до З амінокислотних за- ним чином (24). Гуманізовані антитіла являють лишків або довше, наприклад, довжиною 13 аміно- собою молекули імуноглобуліну, створені за допо- кислотних залишків. Вказаний лінкер може бути могою генно-інженерних технологій, в яких конста- трипептидом з послідовністю, наприклад, Е-Е-М нтна область миші заміщена еквівалентною об6- (Сіи-Рпе-Меї), або з лінкерною послідовністю в 13 ластю людини, при цьому зберігаючи антиген- амінокислот, що включає Сіш-РПпе-Спу-АІа-Спу-І еи- зв'язуючі регіони миші. Одержане химерне антиті- Ма!І-Гец-Спу-Сіу-сІп, вбудованою між послідовніс- ло миша-людина переважно володіє зниженою тю ІС--18ВР і послідовністю імуноглобуліну. Одер- імуногенністю і поліпшеними фармакокінетичними жаний гібридний білок володіє поліпшеними влас- властивостями у людини (25). тивостями, такими як збільшений період

Таким чином, згідно з іншим переважним вті- перебування в рідких середовищах організму (пів- ленням антитіло проти І--18 являє собою гумані- період існування), підвищена специфічна актив- зоване антитіло проти 1-18. Переважні приклади ність, підвищений рівень експресії або полегшення гуманізованих антитіл проти 1-18 описані, напри- очищення гібридного білка. клад, в (заявці на видачу Європейського патенту Згідно з переважним втіленням І/-18ВР приє-

ЕР 09746001. днують до константної області молекули Ід. Пере-

Згідно з ще іншим переважним втіленням ан- важно, проводять приєднання до області важких титіло проти І--18 є повністю людським. Техноло- ланцюгів, наприклад, подібно СНго і СНз-доменам гія одержання антитіл людини описана детально, Іс! людини. Одержання специфічних гібридних наприклад, в ІММО 00/76310, УУО 99/53049, 5 білків, що містять ІІ-18ВР і частину імуноглобулі- 6162963 або А) 5336100). Повністю людські анти- ну, наприклад, описані в (прикладі 11 УуУР тіла є переважно рекомбінантними антитілами, 99/090631|. Інші ізоформи молекули Ід також прида- продукованими трансгенними тваринами, напри- тні для одержання гібридних білків згідно з даним клад, химерними мишами, що містять повністю винаходом, такі як ізоформи Ідс2 або Ідса, або або частини функціональних локусів Ід людини. інші класи Ід, наприклад, подібно (ДМ або ІдА. Гіб-

Згідно з дуже переважним втіленням даного ридні білюи можуть бути мономерними або муль- винаходу інгібітор 1-18 являє собою 1І-18В8Р або тимерними, гетеро- або гомомультимерними. його ізоформу, мутеїн, гібридний білок, функціона-

Інтерферони переважно відомі за ефектами Усічені форми рецепторів ТМЕ розчинні і ви- інгібування вірусної реплікації і клітинної проліфе- значаються в сечі і сироватці як ЗОкДа і 40кДа інгі- рації. Інтерферон-у, наприклад, відіграє важливу біторні білки, що зв'язують ТМЕ, які позначаються роль у розвитку імунної і запальної відповідей. ТВРІ ї ТВРІЇ відповідно (27). Згідно з винаходом

Вказують, що інтерферон-у (ІЕМ-Д, інтерферон переважне одночасне, послідовне або окреме за- типу І) відіграє протизапальну роль. стосування інгібітору 1-18 з антагоністом ТМЕ

Винахід також відноситься до застосування і/або інтерфероном. комбінації інгібітору 1-18 і інтерферону для одер- Згідно з винаходом ТВРІ і ТВРІ! є переважни- жання лікарського засобу для лікування атеро- ми антагоністами ТМЕ, що застосовуються в поєд- склерозу. нанні з інгібітором 1І--18. Похідні, фрагменти, обла-

Інтерферони також можуть бути приєднані до сті ії біологічно активні ділянки молекули полімерів для поліпшення стабільності білків. рецепторів функціонально мають схожість з моле-

Кон'югат інтерферону Д і поліолу поліетиленгліко- кулами рецепторів і також можуть застосовуватися лю (РЕС), наприклад, описаний в М/О 99/55377|. в даному винаході. Подібний біологічно активний

Згідно з іншим переважним втіленням винахо- еквівалент або похідне молекули рецептора відно- ду інтерферон являє собою інтерферон-в (ІЕМ-Д) і ситься до ділянки поліпептиду або послідовності, більш переважно ІЕМ-В 14. що кодує молекулу рецептора, який має істотний

Інгібітор продукції і/або функції ІІ -18 переваж- розмір і здатний зв'язувати ТМЕ з такою афінністю, но застосовують одночасно, послідовно або окре- що взаємодіє з мембранозв'язаним рецептором мо з інтерфероном. ТМЕ інгібується або блокується.

Згідно з ще іншим втіленням винаходу інгібітор Згідно з додатковим переважним втіленням

П/-18 застосовують в поєднанні з антагоністом розчинний ТМЕ-КІ (ТВРІ) людини являє собою

ТМЕ. Антагоністи ТМЕ виявляють свою активність антагоніст ТМР, що застосовується згідно з вина- різними шляхами. Перший, антагоністи можуть ходом. Нативні і рекомбінантні молекули розчин- зв'язувати або секвестувати саму молекулу ТМЕ з ного рецептора ТМЕ їі способи їх одержання опи- достатньою афінністю і специфічністю для частко- сані в (Європейських патентах ЕР 308378, ЕР вої або значної нейтралізації епітопу ТМЕ або епі- 398327 І ЕР 433900). топів, відповідальних за скріплення з рецептором Інгібітор 1-18 може застосовуватися одночас-

ТМЕ (тут і далі названі «секвестуючі антагоністи»). но, послідовно або окремо від інгібітору ТМР. Пе-

Секвестуючі антагоністи можуть, наприклад, бути реважно застосовується комбінація антитіла проти антитілом проти ТМЕ. І/-18 або антисироватка і розчинний рецептор

Альтернативно, антагоністи ТМЕ можуть інгі- ТМЕ, що володіє інгібуючою активністю по відно- бувати шлях передачі сигналу ТМЕ, що активуєть- шенню до ТМЕР. ся за допомогою рецептора на поверхні клітини Згідно з іншим переважним втіленням винахо- після скріплення ТМЕ (тут і далі названі «сигнальні ду лікарський засіб додатково включає інгібітор антагоністи»). Обидві групи антагоністів є прийня- СОХ, переважне інгібітор СОХ-2. Інгібітори СОХ тнимМи як окремо, так і разом, в поєднанні 3 інгібі- відомі в даній області. Конкретні інгібітори СОоХх-2 тором ІЇ--18 при лікуванні атеросклерозу. описані, наприклад, в МО 01/00229).

Антагоністи ТМЕ легко розпізнаються і оціню- Інгібітори тромбоксану, зокрема тромбоксану ються за допомогою звичайного відбору кандида- Аг, в цей час широко застосовуються для ліку- тів за їх впливом на активність нативного ТМЕ на вання атеросклерозу. Отже, згідно з іншим пере- чутливих клітинних лініях іп міго, наприклад, В- важним втіленням винаходу лікарський засіб до- клітинах людини, в яких ТМЕ викликає проліфера- датково включає інгібітор тромбоксану, і зокрема, цію і секрецію імуноглобулінів. Аналіз включає інгібітор тромбоксану Аг, для одночасного, послі- склад ТМЕ при різному розведенні кандидата- довного або окремого застосування. Згідно з вина- антагоніста, наприклад, від 01 до 100-кратної Ммо- ходом особливо переважним Є застосування аспі- льної кількості ТМЕ, що застосовується для аналі- рину в поєднанні з інгібітором 1І--18. зу, і контролі з відсутністю ТМЕ або тільки антаго- Однією з причин атеросклерозу стає наявність ністом (261. високої концентрації ліпідів в крові. Отже, згідно з

Секвестуючими антагоністами є переважні ан- іншим переважним втіленням лікарський засіб до- тагоністи ТМЕ, що застосовуються згідно з даним датково включає агент, що знижує рівень ліпідів, винаходом. Серед секвестуючих антагоністів пе- для одночасного, послідовного або окремого за- реважними є такі поліпептиди, які зв'язують ТМЕ з стосування. Будь-який агент, що знижує рівень високою афінністю і володіють низькою імуноген- ліпідів, відомий в даній області, може застосовува- ністю. Розчинні молекули рецептора ТМЕ і нейтра- тися згідно з винаходом, такий як наступні агенти, лізуючі антитіла проти ТМЕ є особливо переваж- що знижують рівень ліпідів, що включають лікар- ними. Наприклад, розчинний ТМЕ-ВБІ і ТМЕ-ВІЇ є СЬКІ засоби, такі як холестирамін, колестипол, нікОо- придатними згідно з даним винаходом. Усічені тинова кислота, гемфіброзил, пробукол та інші. форми даних рецепторів, що включають позаклі- Особливо переважними є інгібітори НМО СодА- тинні домени рецепторів або їх функціональні час- редуктази і переважно так звані статини. Багато тини, являють собою особливо переважні антаго- які статини є відомими в даній області, такі як сим- ністи згідно з даним винаходом. Усічені розчинні вастатин або ловастатин. рецептори ТМЕ типу І ії ТМЕ типу Ії, наприклад, Для поліпшення запобігання і/або лікування описані в (ЕРО144311. атеросклерозу переважне втілення винаходу від- носиться до застосування інгібітору І--18 в поєд-

нанні з дієтою з низьким вмістом жиру і/або холес- Винахід, крім того, відноситься до фармацев- терину і/або солі. тичних композицій, особливо придатних для запо-

Згідно з переважним втіленням даного вина- бігання і/або лікування атеросклерозу, які включа- ходу інгібітор І-18 застосовують в дозі приблизно ють терапевтично ефективну кількість інгібітору І-- від 0,0001 до 10мг/кг маси тіла або приблизно від 18 і терапевтично ефективну кількість інтерферо- 0,01 до 5мг/кг маси тіла, або приблизно від 0,1 до ну. Як інгібітор І--18 композиція може включати

Змг/кг маси тіла, або приблизно від 1 до 2мг/кг ма- інгібітори каспази-1, антитіла проти 1-18, антитіла си тіла. Згідно з ще одним переважним втіленням проти будь-якої з субодиниць рецептора 11-18, інгібітор І--18 застосовують в дозі приблизно від інгібітори шляху передачі сигналу ІІ--18, антагоніс- 0,1 до 1000Омкг/кг маси тіла або від 1 до 10Омкг/кг ти 1-18, які конкурують з 1-18 і блокують рецеп- маси тіла, або від 10 до 5оОмкг/кг маси тіла. тор 1-18, і білки, що зв'язують 1-18, їх ізоформи,

Винахід, крім того, відноситься до застосуван- мутеїни, гібридні білки, функціональні похідні, ак- ня експресуючого вектора, що містить послідов- тивні фракції або похідні з круговою перестанов- ність, яка кодує інгібітор І--18, для одержання лі- кою, що володіють такою ж активністю. карського засобу для запобігання і/або лікуванню І/-188Р і їх ізоформи, мутеїни, гібридні білки, атеросклерозу. Таким чином, для лікування і/або функціональні похідні, активні фракції і похідні з запобігання захворюванню застосовуються підхо- круговою перестановкою, описані вище, є перева- ди генної терапії. Переважно, експресія інгібітору жними активними складовими фармацевтичних

І/-18 далі буде проходити іп 5йи, таким чином композицій. ефективно блокуючи ІІ-18 безпосередньо в ткани- Інтерферон, що входить в фармацевтичну ні(ах) або клітинах, схильних до цього захворю- композицію, переважно являє собою ІЕМ-Д. вання. Згідно з ще іншим переважним втіленням фа-

Як детально викладено в прикладах нижче, рмацевтична композиція включає терапевтично показано, що ефективна експресія І/-188Р. може ефективну кількість інгібітору І--18, необов'язково бути представлена на мишачій моделі захворю- інтерферон і антагоніст ТМЕ. Антагоністи ТМЕ мо- вання після електроперенесення експресуючого жуть бути антитілами, нейтралізуючими активність вектора, що містить послідовність, що кодує ІІ - ТМЕ або розчинними усіченими фрагментами ре- 188Р. цептора ТМЕ, що також позначаються ТРВІ і ТРВІЇ.

Отже, згідно з переважним втіленням експре- Фармацевтична композиція згідно з винаходом суючий вектор вводять за допомогою електропе- може додатково містити один або декілька інгібі- ренесення, переважно внутрішньом'язово. торів СОХ, переважно інгібітори СОХ-2. Фармаце-

Застосування вектора для індукції і/або поси- втична композиція згідно з винаходом може додат- лення ендогенної продукції інгібітору 1-18 в кліти- ково містити інгібітор тромбоксану, такий як ні, яка звичайно не експресу є інгібітор І--18 або в аспірин, і/або речовина, що знижує рівень ліпідів, якій кількість експресованого інгібітору не суттєва, така як статин. також розглядається згідно з винаходом. Вектор Визначення «фармацевтично прийнятний» може містити регуляторні послідовності, що функ- означає включення будь-якого носія, який не пе- ціонують в клітинах, в яких бажана експресія інгібі- решкоджає ефективності біологічної активності тору І--18. Подібні регуляторні послідовності мо- активного компонента, і не є токсичним по відно- жуть, наприклад, містити промотори або шенню до хазяїна, якому він вводиться. Напри- енхансери. Регуляторна послідовність далі може клад, для парентерального введення активні білки бути вбудована в правильний локус генома шля- можуть бути сформовані в стандартну дозовану хом гомологічної рекомбінації, таким чином реаль- форму для ін'єкцій разом з носіями, такими як со- но зв'язуючи регуляторну послідовність з геном, льовий розчин, розчин декстрози, сироватковий експресію якого необхідно індукувати або посили- альбумін і розчин Рінгера. ти. Технологію звичайно відносять до «ендогенної Активні компоненти фармацевтичної компози- активації гена» (ЕСА), і вона описана, наприклад, ції згідно з винаходом можуть вводитися індивіду- в МУО 91/099551І. ально різними шляхами. Шляхи введення включа-

Фахівцеві в даній області буде зрозуміло, що ють внутрішньошкірний, черезшкірний (наприклад, також можливо припинити експресію 1-18, засто- при складах, що повільно вивільняються), внутрі- совуючи такі ж способи, тобто за допомогою вбу- шньом'язовий, внутрішньочеревинний, внутріш- довування негативно регулюючого елемента, на- ньовенний, підшкірний, пероральний, епідураль- приклад, сайленсера, в локус гена 1-18, таким ний, місцевий і інтраназальний шлях. Може чином, приводячи до негативної регуляції або при- застосовуватися будь-який інший терапевтично пинення експресії І-18. Фахівцеві в даній області ефективний шлях введення, наприклад, абсорбція буде зрозуміло, що подібна негативна регуляція через епітеліальні або ендотеліальні тканини, або або придушення експресії І/-18 має такий же шляхом генної терапії, при якому молекула ДНК, ефект, що і застосування інгібітору 1-18 для запо- що кодує активний компонент, вводиться пацієнту бігання і/або лікування захворювання. (наприклад, за допомогою вектора), що приводить

Винахід, крім того, відноситься до застосуван- до експресії активного компонента і секреції іп ня клітини, генетично модифікованої, для продук- мімо. Крім того, білок (білки) згідно з винаходом ції інгібітору І--18 для одержання лікарського за- можуть вводитися разом з іншими компонентами собу для лікування імабо запобігання біологічно активних препаратів, такими як фарма- атеросклерозу. цевтично прийнятні сурфактанти, ексципієнти, наповнювачі, розріджувачі і носії.

Для парентерального введення (наприклад, Згідно з винаходом інгібітор І--18 може вводи- внутрішньовенного, підшкірного, внутрішньом'язо- тися профілактично або терапевтично пацієнту вого) активний білок (білки) може бути представ- перед, одночасно або послідовно з іншими тера- лений у формі розчину, суспензії, емульсії або певтичними схемами або препаратами (напри- ліофілізованого порошку в поєднанні з фармацев- клад, схема, що включає декілька ліків) в терапев- тично прийнятним парентеральним носієм (напри- тично ефективній кількості. Активні речовини, що клад, водою, сольовим розчином, розчином дек- вводяться одночасно з іншими терапевтичними стрози) і добавками, які підтримують ізотонічність препаратами, можуть вводитися в одній або різних (наприклад, маніт) або хімічну стабільність (напри- композиціях. клад, консерванти або буфери). Форму стерилізу- Винахід, крім того, відноситься до способу лі- ють за допомогою способів, що звичайно застосо- кування і/або запобігання атеросклерозу, що вуються. включає введення потребуючому цього хазяїну

Біодоступність активного білка (білків) згідно з ефективної інгібуючої кількості інгібітору 1І--18. винаходом також можна поліпшити за допомогою Винахід, крім того, відноситься до способу за- способів приєднання, які збільшують півперіод побігання і/або лікування атеросклерозу, що вклю- існування молекули в організмі людини, напри- чає введення потребуючому цього хазяїну експре- клад, приєднанням молекули до поліетиленгліко- суючого вектора, що містить послідовність, що лю, як описано в (РСТ-заявці на видачу патенту кодує інгібітор 1-18.

МО 92/13095). Згідно з переважним втіленням винаходу екс-

Терапевтично ефективна кількість активного пресуючий вектор вводять системно і більш пере- білка (білків) може бути функцією багатьох змін- важно за допомогою внутрішньом'язових ін'єкцій. них, включаючи тип антагоніста, афінність антаго- Винахід, крім того, відноситься до застосуван- ніста до І--18, яка-небудь залишкова цитотоксична ня 1І--18 як діагностичного маркера поганого кліні- активність, що виявляється антагоністом, шлях чного прогнозу серцевої недостатності. Поганий введення, клінічний стан пацієнта (включаючи ба- клінічний прогноз включає будь-яке погіршення жаність підтримки нетоксичного рівня активності стану пацієнта, подібно рецидивним явищам або ендогенного 1--18). навіть смерті, що слідує за першим інфарктом міо- «Терапевтично ефективна кількість» є такою, карда. що при введенні інгібітору І/-18 спостерігається Переважно 1-18 застосовують як діагностич- інгібування біологічної активності ІЇ-18. Доза, що ний маркер рецидивних випадків після першого вводиться у вигляді однієї або багаторазової дози вияву серцевої недостатності. Рецидивні випадки пацієнту, буде змінюватися в залежності від ряду включають, але не обмежуються, смерть, рекурен- факторів, що включають фармакокінетичні влас- тну ішемію, реваскуляризацію, прогресію атеро- тивості інгібітору І--18, шлях введення, стан паціє- склерозу або госпіталізацію, що періодично повто- нта і характеристики (стать, вік, маса тіла, стан рюється з приводу серцевої недостатності. здоров'я, розмір), наявність симптомів, супутня Щойно описаний винахід буде більш легко терапія, частота лікування і бажаний ефект. Підбір зрозуміло за допомогою посилання на подальші ії маніпулювання встановленими межами дозуван- приклади, які представлені для ілюстрації і не при- ня входить в компетенцію фахівця в даній області, значені для обмеження даного винаходу. так само як і способами визначення іп міго і іп мімо Приклади інгібування 1І--18 у пацієнта. Матеріали і методи

Згідно з винаходом інгібітор ІЇ/-18 застосову- Зразки ють в кількості приблизно від 0,0001 до 10мг/кг або Збирали сорок одну атеросклеротичну бляшку приблизно від 0,01 до 5мг/кг маси тіла, або приб- людини, видалені у 36 пацієнтів, що зазнали ен- лизно від 0,1 до Змг/кг маси тіла, або приблизно дартеректомії сонної артерії. Для контролю 2 сонні від 1 до 2мг/кг маси тіла. Інша переважна кількість артерії і З внутрішні грудні артерії, не уражені ате- інгібіторів І/-18 складає приблизно від 0,1 до росклерозом (2 з мінімальними фібром'язовими 100Омкг/кг маси тіла або приблизно від 1 до ущільненнями), одержували шляхом аутопсії або в 100мкг/кг маси тіла, або від 10 до 5Омкг/кг маси ході операції коронарного шунтування. їх швидко тіла. занурювали в рідкий азот і зберігали при -807С.

Шлях введення, що є переважним згідно з ви- Бляшки, які застосовували для екстракції білка і находом, являє собою введення підшкірним шля- РНК, швидко промивали, занурювали в рідкий азот хом. Внутрішньом'язове введення є іншим пере- перед приміщенням на зберігання при -80"С. Для важним шляхом згідно з винаходом. імуногістохімічних досліджень бляшки вміщували

Згідно з іншими переважними втіленнями інгі- на 2 години в свіжоприготований 496 параформа- бітор І--18 вводиться щодня або через день. льдегід, далі переносили в 3095 розчин сахароза -

Добові дози звичайно даються в розділених РВ5 перед швидким заморожуванням в оптималь- дозах або в формі з уповільненим вивільненням ному середовищі обробки тканини до температури для досягнення бажаних результатів. Другі або різання (О0.С.Т. Сотроцпа, Міїез Іпс, Оіадповіїс5 подальші введення можуть проводитись в такій же Оімізіоп) за допомогою рідкого азоту і зберігали дозованій формі в меншій або більшій дозі в порі- при -80"С для кріостатного секціонування. Декіль- внянні з початковою або попередньою дозою, що ка зрізів від 8 до 10мкм одержували з кожного зра- вводиться пацієнту. Друге або подальше введення зка для гістологічного аналізу і імуногістохімічного може проводитись в ході або перед початком за- дослідження. хворювання.

Класифікація пацієнтів 140мМмМ масі, 0,595 Тритон-Х-100 (Ріка), 0,590

Для вивчення можливого зв'язку між експресі- дезоксихлоратом, потім 50мММ Тріс рН 8, 200мМмМ єю ІС--18/І-188Р і ознаками нестабільності бляшки масі, 0,0595 ТХ100, 0,0595 попідеї РАО (Ріка), 2М автори збирали клінічні дані іп ргозресіїме і сліпим СНАРБЗ (Воепгіпдег, Мапппеїт), з подальшим способом у 23 наступних один за одним пацієнтів останнім промиванням 50мМ Тріс рн 8. Далі смолу (з 36), що зазнали процедури ендартеректомії між центрифугували, ресуспендували в буфері для квітнем і травнем 2000. Наявність або відсутність зразків в приведених умовах, кип'ятили протягом 5 покриття виразками всередині бляшки при макрос- хвилин і, нарешті, наносили на 1095 505- копічному дослідженні систематично відмічалася поліакриламідний гель МИРАСЕ (Іпмийгодеп). хірургом, що проводив процедуру ендартеректомії. Зразки електрофоретично переносили з поліа-

Це давало можливість авторам класифікувати криламідних гелів на нітроцелюлозу. Нітроцелю- бляшки як покриті або непокриті виразками бляш- лозні мембрани просочували протягом 2 годин при ки. Крім того, пацієнтів систематизували згідно з кімнатній температурі в ТВ5Т (ЗОммоль/л трис-НСЇІ клінічними симптомами на дві окремі групи. Паціє- (рн 7,5), 250ммоль/л Масі і 0,190 сольовий розчин нтів, у яких були присутніми клінічні симптоми Туеепі, що містить 595 безліпідного сухого молока. ішемічного порушення мозкового кровообігу, що Далі мембрани інкубували з козячими поліклона- відносяться до стенозу сонної артерії, класифіку- льними антитілами проти 1-18 і 1--188 (с-ланцюг) вали як симптоматичних. Ендартеректомію прово- людини (1мкг/мл) (КО Зузіетв5), мишачими моно- дили через 2-66 днів (17,625,3 днів) після появи клональними антитілами проти І--188Р людини клінічних симптомів у даних пацієнтів. Пацієнтів, (Мар 657,27 5мкг/мл) ІСогра? еї аї., 2000, рукопис які ніколи не відчували симптоми ішемічного по- друкується|, кролячими поліклональними антиті- рушення мозкового кровообігу в області сонної лами проти каспази-ї людини (мкг/мл) (А-19, артерії, класифікували як асимптоматичних. Асим- запіа Сги7). Специфічність Мар 657,27 аналізува- птоматичний стеноз сонної артерії визначали на ли на смужці мембрани шляхом конкурентного основі систематичної клінічної оцінки пацієнтів із аналізу за допомогою 200-молярного надлишку захворюванням серця або периферичних судин, і "І -18РВ-6пі5 (виділеного з клітин яєчника китай- його важкість встановлювали за допомогою по- ського хом'ячка, Зегопо РПаптасешіса! Кезеагсп вторної Допплер-ехографії дійсно досвідченим Іпзійше), спільно інкубованого з Мар 657.27 в кон- ехографістом. Навіть якщо асимптоматичні пацієн- центрації мкг/мл протягом 1 години. Подальшу ти ніколи не мали ішемічного епізоду в області інкубацію з НЕР, пов'язаним з відповідними анти- стенозу сонної артерії, ендартеректомія сонної тілами, хемілюмінесцентними речовинами (ЕСІ, артерії була показана корисною даним пацієнтам, Умевіегтп ріоніпуд; Атегзпат Согр) проводили для як показано дослідниками асимптоматичного ате- виявлення позитивних смуг згідно з інструкціями росклерозу сонної артерії (АСАБ) (281. виробників, і смуги візуалізували після експозиції з

Вестерн-блот-аналіз фотоплівкою Нурегпицїйт ЕС. (Атегзпат Согр).

Білки екстрагували з 12 атеросклеротичних Імуногістохімія бляшок і 5 контрольних нормальних артерій. За- Заморожені зрізи 6 атеросклеротичних бляшок морожені зразки розтирали в присутності рідкого інкубували з нормальною кінською сироваткою азоту. Порошкоподібну масу ресуспендували в 110 або нормальною козячою сироваткою 1:10 крижаному лізуючому буфері (20ммоль/л Трис- протягом 30 хвилин при кімнатній температурі,

НОСІ, рН 7,5, 5ммоль/л ЕСТА, 150ммоль/л Масі, однократно промивали РВ, далі інкубували або з 20ммоль/л гліцерофосфату, Оммоль/л Мак, першими мишачими моноклональними антитілами 1ммоль/л ортованадату натрію, 195 Тритон Х-100, проти СО68 для розпізнавання макрофагів (АКО- 0,195 Тмееп 20, мкг/мл апротиніну, Іммоль/л СО68, КРІТ), або з першими мишачими моноклона-

РМ5Е, О,5ммоль/л М-тозил-ї - льними антитілами проти с-актину гладком'язової фенілаланінхлорметилкетону (ТРСК), 0,5ммоль/л тканини людини (144, САКО) для розпізнавання

М(а)-п-тозил-І--лізинхлорметилкетону (ТСК))| у гладком'язових клітин. Для розпізнавання ІІ-18 і співвідношенні 0,Змл/1Омг за масою. Екстракти рецептора 1-18 в атеросклеротичних бляшках інкубували на льоду протягом 15 хвилин і далі застосовували специфічні козячі поліклональні центрифугували (120009, 15 хвилин, 4"С). Детер- антитіла (БО Бузіетв) в розведенні 5мкг/мл. ІІ- гент-розчинні супернатантні фракції зберігали, і 18ВР. визначали за допомогою специфічних моно- концентрації білка в зразках визначали за допомо- клональних антитіл проти рекомбінантної ізофор- гою білкового аналізу Віо-Наай. ми І--158Р. людини (НегО) ІСогбра? еї аї., 2000, ру-

Для проведення Вестерн-блотингу для 1-18 і копис друкується). Після промивання в РВ5 скло

І--18К білкові екстракти кип'ятили протягом 5 хви- інкубують з наступними другими пов'язаними з лин і наносили на 7,595 або 1595 505- біотином антитілами: пов'язані з біотином кінські поліакриламідний гель. Для І--18ВР ПІІ-18, виді- ІЧО проти імуноглобуліну миші (Месіог І арогайогієв, лений з Е. Соїї (Зегопо Рпаптасецшіїса! Кезеагсп Іпс| в розведенні 1:200 для визначення місць при-

Іпзійше, Сепема) з'єднували з Айіде! 15 (Віогай) на єднань антитіл проти СОб68, о-актину гладком'язо- 1мг/мл смоли згідно з протоколом виробників. Біл- вих клітин і І/-188Р і пов'язані з біотином кінські ковий екстракт (бОмкг) інкубували протягом ночі ЧО проти імуноглобуліну кози (Месіог) в розведен- при 4"7С з мішалкою разом з 20мкл смоли, доведе- ні 1:200 для визначення антитіл проти ІІ--18 і реце- ної до 5б0бмкл РВЗ 0,0596 Тмееп. Для видалення птора 1-18. Імунозабарвлення візуалізували за будь-якого неспецифічного скріплення смолу допомогою авідин-біотинової НЕР системи візуалі- центрифугували і промивали 10мМ Тріс рН 8, зації (Месіазіаіп АВС Кії РК-6100 Месіог). Для нега-

тивних контролів паралельні зрізи витримували з пряма 5-ССАСССАТОССАААТТОСС-3; интрон- відповідними за ізотипом сторонніми антитілами САРОН, обернена 5- замість перших антитіл. СсСсТАатоСсСАСаастТТТадатт-з; пряма 5-

Виділення РНК СстТатастосССАСТОСТОАТТТО-3". Оцінювали

Сумарну РНК екстрагували з 29 атеросклеро- специфічність і оптимальну концентрацію прайме- тичних бляшок в кислому гуанідинтіоціанатному ра. Можливе забруднення геномної ДНК виключа- розчині і екстрагували фенолом і хлороформом, ли за допомогою проведення ПЛР-реакцій за спе- згідно зі способом Спотслуп5Ккі апа Засспі (291. цифічними праймерами інтрон-САРОН.

Виділену РНК розчиняли у воді і концентрацію Відсутність неспецифічної ампліфікації встанов- виміряли поглинанням при 26бОнм. Міру деградації лювали за аналізом ПЛР-продуктів за допомогою

РНК оцінювали за допомогою електрофорезу на електрофорезу в 3,595 агарозному гелі. ПЛР 5УВК 196: агарозних гелях кКДНК синтезували з 1мкг су- Сгееп Кеаі Тіте проводили із застосуванням марної РНК, застосовуючи систему оберненої тра- 5мкл/ямку ОТ-продуктів (0,5нг сумарної РНК), некрипції Рготеда згідно з протоколом виробників. 25мкл/'ямку УВК ОСтееп РСК тавіег тіх (РЕ

Напівкількісна ПЛР 1-18 і І-18В8Р людини з Віозубіет, СА, ИОБА) з урацил-М-глікозилазою атеросклеротичних бляшок людини, що прово- АтрЕгазе (МО) (0,5Од/ямку) і 20мкл праймерів диться в режимі реального часу (з300нМ). ПЛР проводили при 50"С протягом 2хв.

Напівкількісні реакції ПЛР проводили в повно- (для інкубації з АтрЕгазе МО для видалення му об'ємі 5Омкл в присутності ЛОД ДНК- всього урацилу, вбудованого в кКДНК), 957С протя- полімерази АтріїТад (РегКіп ЕІтег, Коспе, О.5.А.), гом 10хв. (для активації АтріїТад сої) і далі про- 2,5мММ актеР (Атег5пат, Ц.5.А.) і ЗХопмоль прямих і ходження 40 циклів при 957"С протягом 15сек., обернених ПЛР-праймерів. Реакційні суміші інку- 60"С протягом їхв. на АВІ РКІЗМ 7700 Оеїесііоп бували в РТО-200 РеШег ЕМесі ТПегтаї! Сусієг (МО 5узіет. Обернено транскрибовані зразки кДНК

Кезеагсп, 0.5.А.) при наступних умовах: денату- таким чином ампліфікували і визначали значення рація їхв. при 94"С, відпалювання протягом 1хв. їх СІ (граничного значення циклів). Всі Сі-величини при 55"7С і елонгація протягом хв. при 7270. Для нормалізували по відношенню до контрольно- переконання наявності відповідної кількості ПЛР- диспетчерського гена САРОН. Окремі специфічні продуктів протягом лінійної стадії ПЛР-реакції 1-- смуги ДНК для 1--18, ІІ -188Р ії БАРОН одержували 188Р, 11-18 і р-актин аналізували після 25, 28 і 31 за допомогою гель-електрофорезу. цикли. Встановлювали оптимальну кількість циклів Принцип визначення в режимі реального часу для ІІ/-188ВР, І/-18 і Д-актину до насичення смуг за допомогою «5УВЕ Огееп РСК тавіег тіх» за- (31, 28 ії 25 відповідно). ПЛР;-праймери підбирали снований на безпосередньому визначенні ПЛР- на основі описаних послідовностей ІАЕ110799, продуктів за допомогою вимірювання збільшення 049950, Х00351|, що є наступними: 1І--18, оберне- флуоресценції внаслідок скріплення барвника на 5-СССТСАСТАСАСТСАССТАА-3; пряма 5-- ЗУВК Огееп з подвійним ланцюгом ДНК.

СССТАСАСОТАТОССТОТАА-3; І -18ВР, пряма Статистичний аналіз 5-АССТОТСТАССТОСАСТОАА-3; обернена 5- Дані представлені у вигляді середніх величин

ССАССААСАТАСИААИтТСтТа-3 р-актин, оберне- ї станд. помилка. на 5-САССАССААТСАТСТТОАТСТТО-3"; пряма Рівні 1-18 порівнювали між групами за допо- 5-ССТСАССАТОСАТОСАТОАТАТСОС-3. Для ви- могою тесту Манна-Уїтні. Значення р 0,05 розгля- ключення ампліфікації можливої геномної ДНК, що дали як статистично значуще. присутня у зразках, реакції ПЛР проводили у від- Приклад 1: Запобігання інгібіторами І--18 за- сутності матриці КДНК. ПЛР-продукти (1Омкл) ана- гибелі ендотеліальних клітин, індукованій окисле- лізували на 195 агарозних гелях, проводячи елект- ними ліпопротеїнами (охі-ОІ-) рофорез в 1-кратному буфері ТАЕ. Розмір ПЛР- Культивовані ендотеліальні клітини пупкової продуктов визначали порівнянням з послідовно вени людини (НОМЕС) інкубували протягом 16 розташованими у вигляді драбини забарвленими годин разом з охі-0і. в присутності або у відсутно- смугами в 1т.п.н. на гелях. (сірсо). Відносну кількі- сті П.-18-зв'язуючого білка або антитіл проти ІС-18. сну оцінку смуг, забарвлених бромистим етидієм, Як представлено на Ффіг.1, 8390 НОМЕС гинуть піс- проводили під впливом Уф-світла за допомогою ля інкубації з охі-0і.. Спільна інкубація з І--188Р

Кодак Оідйа! Зсіепсев апа/уїіса! зоймаге, і відміча- або антитілами проти 1-18 майже повністю обері- ли як співвідношення шуканого гена (ПІ--188Р, ПІЇ - гає клітини від загибелі. При застосуванні І--188Р 18) до контрольно-диспетчерського гена (пПр- не було відмічено загибелі. При застосуванні анти- актин). тіл проти І1--18 8995 клітин вижили.

Праймери 5УВЕ Огееп Веаї! Тіте РСВ для ІІ- Даний експеримент ясно показує захисний 18, І-18ВР ї САРОН (контрольний контрольно- ефект двох різних інгібіторів 1-18, направлений диспетчерський ген) підбирали за допомогою проти загибелі клітин в результаті апоптозу в ате-

Ргітег Ехрге55 зоймаге їгот РЕ Віозувзіетв згідно з росклеротичній бляшці. ще опублікованими послідовностями |АР110799, Приклад 2: Експресія білка 1-18 ії його ендо- р49950, ММ 002046), які є наступними: ІІ -18, обе- генного інгібітору І--188Р в атеросклеротичних рнена 5-САВССОСТТТАССАСССА-3; пряма 5'- бляшках

СААДССААТТОТСТОССАСТОС-3; П-188Р, обер- Вестерн-блотинг проводили для білкових екс- нена 5-ААССАСОСТТОАСССстТтТоО-3; пряма 5- трактів, одержаних з 12 атеросклеротичних сонних

ТОССАТОТСТСТОСТСАТТТАСТО-3;; САРОН, артерій і 5 нормальних контролів. Білок 1-18, обернена 58-ЗАТОССАТТТССАТТОАТОАСА-3; включаючи активну форму, високо експресувався у всіх атеросклеротичних бляшках, незважаючи на ендотеліальних клітинах бляшки мікросудин і в їх виявлення невеликої експресії або її відсутність в поверхні з боку просвіту, хоча експресію у всіх су- нормальних артеріях (Фіг.2). Лінії 1-4 містять зраз- динах не виявили. Відносно низьку і більш гетеро- ки з атеросклеротичних бляшок, лінії 5-7 з норма- генну експресію І/-188Р також виявили, в основ- льних артерій. Цікаво, визначення активної форми ному екстрацелюлярно, в деяких багатих

І/-18 можливо корелює з експресією активної фо- макрофагами областях. рми каспази-1, яка бере участь в процесінгу 1-18 Приклад 4: Експресія транскриптів мРНК 1-18 (Фіг2 четвертий ряд). Значна експресія білка ре- і І--188Р в атеросклеротичних бляшках і взаємоз- цептора 1--18 (с-ланцюг) також виявлена у всіх в'язок з нестабільністю бляшки атеросклеротичних бляшках в порівнянні з дуже Для встановлення наявності експресії мРНК низьким рівнем експресії в нормальних артеріях І/-18 ї І-18ВР в атеросклеротичних бляшках сон- (Фіг.2 другий ряд). Крім того, більшість атероскле- ної артерії людини проводили напівкількісну ОТ- ротичних бляшок експресує І-18ВР, хоча рівень ПЛР на шести атеросклеротичних бляшках (Ффіг.3). експресії гетерогенний (фіг.2 перший ряд). МРНК 1-18 ї І--188Р виявили у всіх атеросклеро-

Приклад 3: Клітинна локалізація білка 1-18 і тичних бляшках, хоча кількість мРНК 11-18 і - його ендогенного інгібітору ІІ-18ВР в атеросклеро- 188Р була гетерогенною. Тому, для точного кількі- тичних бляшках сного визначення рівнів експресії мРНК 1-18 і 1--

Для встановлення клітинної локалізації ІІ -18 і 188Р. додатково аналізували 23 атеросклеротичні

І/-18ВР. проводили імуногістохімічні дослідження бляшки за допомогою методу 5УВК ОСгееп Кеаї!- на 6 атеросклеротичних бляшках сонних артерій. Тіте РОК (Фіг.4). Бляшки характеризували за до-

Як представлено на Ффіг.2, І/-18 в основному екс- помогою клінічних і патологічних ознак як симпто- пресується в макрофагах, дані клітини, можливо, є матичні (нестабільні) або асимптоматичні (стабі- головним джерелом 1-18 в бляшці (не показано). льні) бляшки, що містять макроскопічно визначені

Дані області також багаті СОЗ-позитивними лім- покриття виразками або не містять. Клінічні харак- фоцитами. Однак не видно, що Т-лімфоцити без- теристики пацієнтів підсумовані в Таблиці 4. Про- посередньо беруть участь в продукуванні ІІ--18. ІІ - центне значення зменшення діаметра сонної ар- 18 також експресується в деяких гладком'язових терії (6095-9595) і фактори ризику, що включають клітинах інтими і в рідкісних ендотеліальних кліти- вік, діабет, гіперхолестеринемію, гіпертензію і ку- нах. Навпаки, значну експресію І--18ВР виявили в ріння, не відрізнялися для двох груп.

Таблиця 4

Характеристики пацієнтів 11111101 Асимптоматичні///////// | Симптоматичні 1111111100|111111пацієнти(пн9уї/////// | пацієнтит(п-1

Вк 77777771 бвбемо777777777171 11111111 702539

Ппертензіяй////////7777111111111Ї11111111111111111811111111111111Ї11111111111981 (Гіперхолестеринемя?.//-/:///Ї 7777777777111111714111111111111Ї1111111111181

Куріннявцейчас./////7777711111111111171111111111111Ї11111111118 1 Представлені пацієнти з транзиторним або скороминущим ішемічним порушенням мозкового кровоо- бігу за 2-66 днів до еднартеректомії. 2 Кількість пацієнтів з клінічно вираженою гіпертензією перед початком лікування антигіпертензивними препаратами.

З Кількість пацієнтів з клінічно вираженою гіперхолестеринемією перед початком лікування препарата- ми, що знижують рівень ліпідів.

Виявили, що кількість І--18 схильна до пози- на група: кут нахилу 1,16 (0,19-2,141, 12-50,36 проти тивної регуляції в симптоматичних в порівнянні з асимптоматичної групи: кут нахилу 4,79 (2,39-7,20), асимптоматичними бляшками (2,03240,5 проти 2-0,76; р«0,05). Тому передбачається, що віднос- 0,6720,17 відповідно) (Фіг.4А). Статистичний ана- не збільшення експресії І-18ВР в симптоматичній ліз показав, що дане збільшення продукції 1-18, групі не є достатнім для компенсації збільшення що спостерігається в симптоматичних бляшках, є експресії І--18. Більш того при розгляді наявності високо значущим (р«е0,0074), в той час як знижена покриття виразками як ознаки нестабільності кількість І--18ВР, що виявляється в симптоматич- бляшки статистичний аналіз додатково проводили них бляшках в порівнянні з асимптоматичними, не для бляшок без покриття виразками або з покрит- є значущою (4,6420,98 проти 2,5:20,92 відповідно) тям виразками всередині бляшки і показали істот- (Фіг.А4В). Іншими словами, хоча обидві симптома- ну позитивну регуляцію ІІ -18 для бляшок з наявні- тична і асимптоматична групи виявляють позитив- стю покриття виразками (р«е0,018) (Фіг.4 С). ну кореляцію між мРНК 1-18 і І--188Р, кути нахилу значно відрізняються між 2 групами (симптоматич-

Одержані дані показують, що збільшення екс- Аналіз мишей пресії І--18, що спостерігається в атеросклеротич- Кріостатні зрізи (Змкм) одержували з синуса них бляшках, корелює з нестабільністю бляшки. аорти і застосовували для визначення ліпідних

Приклад 5: Регуляція ІІ -18ВР. розвитку і стабі- відкладень за допомогою ОЇ червоного, визначен- льності атеросклеротичного ураження на моделі ня колагену за допомогою зіги5 червоного і для захворювання іп мімо імуногістохімічного аналізу, як описано раніше (131.

Методи Зрізи витримували зі специфічними першими ан-

Характеристика пацієнтів титілами: проти макрофагів миші, клон МОМА?2

Зразки плазми одержували від пацієнтів з гос- (Віобошгзе), проти о-актину, кон'юговані з лужною трим ішемічним коронарним синдромом (нестабі- фосфатазою, для гладком'язових клітин і проти льна стенокардія і інфаркт міокарда), менше ніж 7 СОЗ для Т-лімфоцитів (Оако), як описано раніше днів опісля після появи симптомів. Нестабільну І13Ї. Визначення загибелі клітин проводили за до- стенокардію встановлювали за асоціацією типово- помогою методу ТОМЕГ. (13). СОЗ-позитивні кліти- го загрудинного болю разом з або ішемічними змі- ни підраховували мікроскопічно сліпим способом. нами на електрокардіограмі, або присутністю за- Атеросклеротичні бляшки в синусі аорти і облас- хворювання коронарних артерій. Інфаркт міокарда тях, що забарвлюються позитивно на наявність діагностували на основі типових ішемічних змін на макрофагів, гладком'язових клітин, колагену або електрокардіограмі, асоційованих зі значним під- ТОМЕГ, вимірювали за допомогою кількісного ком- вищенням ферментів міокарда (креатинфосфокі- п'ютерного аналізу зображення /|М515000, нази і тропоніну І) в крові. Пацієнти без ішемії були Місгомізіоп|, як описано раніше (13). Інксубуванням набрані в це ж кардіологічне відділення і зовсім не з неїмунними відповідними за ізотипом імуногло- виявляли ознак ішемії. Рівні І--18 людини в плазмі булінами оцінювали специфічність імунозабарв- визначали за допомогою комерційно доступного лення. Специфічність ТОМЕГ оцінювали за допо- набору (МВІ., дарап). могою опущення ферменту термінальної

Внутрішньом'язове електропереносення іп мімо дезоксинуклеотидилтрансферази. Грудні аорти, мишам плазміди, що експресує ІІ. -188Р. розташовані від лівої підключичної артерії до нир-

Чотирнадцять мишей самців С57ВІ /6 ароЕ КО коподібних артерій, фіксували за допомогою 10905 14-тижневого віку одержували з З-тижневим інтер- буферного розчину формаліну і забарвлювали на валом З ін'єкції плазміди, що експресує ІІ-188ВР, відкладення ліпідів за допомогою ОЇ червоного. рерМАЗ-І18ВР. Контрольні миші (п-19) одержу- Далі їх розрізали в подовжньому напрямі і процен- вали ін'єкції контрольної пустої плазміди. КДНК тну кількість ліпідних відкладень обчислювали за ізоформи а І/-188Р, виділену як описано (номер допомогою кількісного комп'ютерного аналізу зо0- доступу Ж 292ОМО9) (23Ї, субклонували за сайтами браження ІМ515000, Місгомівіоп|.

ЕсокІ/МоїЇ в експресуючий вектор клітин ссавців Результати росОМАЗ під контролем цитомегаловірусного про- У ході даного дослідження перевіряли гіпотезу мотора (Іпмігодеп). Конструкція, позначена 334.уй, про те, що регуляція І-18/І -18ВР. грає вирішаль- представлена на Фіг.5. Контрольна плазміда явля- ну роль як в атерогенезі, так і в стабільності бляш- ла собою подібну конструкцію, позбавлену тера- ки. Визначали рівні 1І--18 в плазмі пацієнтів з гост- певтичної КДНК. Плазміду, що експресує 1І-188ВР, рими коронарними синдромами (30 чоловіків, 18 або контрольну плазміду (бОмкг) вводили ін'єкцій- жінок, середній вік 66,251,8 років, з яких 14 мають но в обидва великогомілкові краніальні м'язи миші нестабільну стенокардію і 34 мають інфаркт міока- під анестезією, як описано раніше (13). Стисло, рда) і у контрольних пацієнтів без ішемії, що зна- черезшкірні електричні імпульси (3 електричних ходяться в тому ж кардіологічному відділенні (10 сигналів прямокутної форми 200В/см, тривалістю чоловіків, З жінки, середній вік 60,0ж5,2 років). Рівні 20мсек. при 2Гц) посилали за допомогою електро- І--18 в плазмі були значно підвищені у пацієнтів з імпульсатора РБ-15 (Сепеїгопіс5, Егапсе), засто- гострими коронарними синдромами в порівнянні з совуючи два плоских електроди з неіржавіючої контролем (146,9217,1 проти 73,052412 2пг/мл відпо- сталі, розташовані один від одного на 4,2-5,3мм на відно, р«е0,05) на відміну від рівнів циркулюючих ІЇ-- кожній стороні ноги. 188Р, які були трохи підвищеними (20,122,7 проти

ЕПЗА ті! -188Р 7,522,5нг/мл відповідно, р-0,06). Крім того, рівні ІІ--

Плашки покривали протягом ночі г-ті! -ї3вВРа- 18 корелювали з важкістю захворювання, оскільки афінними кролячими поліклональними антитілами найбільш підвищені рівні були знайдені у пацієнтів (5мкг/ямку). Розчинний ті/-18В8Р визначали за з важким ішемічним порушенням серцевої діяль- допомогою пов'язаних з біотином кролячих полік- ності і клінічними ознаками набряку легких лональних антитіл (0,Змкг/мл), направлених проти (224,03539 пг/мл, р«е0,001 при порівнянні з конт- г-пІ/-188Р Е.Соїї (Рергоїес) з подальшим дода- ролем). Дані результати, одержані для пацієнтів з ванням пероксидази ехігамідіп (1/1000) (Зідта). гострим коронарним захворюванням, разом з по-

Скріплення кролячих поліклональних антитіл оці- передніми спостереженнями, що 1-18 підвищений нювали за допомогою Вестерн-блоту для визна- в атеросклеротичних бляшках пацієнтів з інсуль- чення специфічності ті! -18ВР. Рекомбінантний тами (Маїїа!, 2001|, відводять можливу важливу ті -188Ра, продукований клітинами НЕК 293, за- роль регуляції І--18/І-18ВР в атеросклеротичному стосовували як стандарт. Чутливість ЕГІЗА стано- процесі. вила 5нг/мл. Тому автори перевірили дану гіпотезу із засто- суванням мишей КпосКкоці (КО) ароЕ, у яких спон- танно утворюються атеросклеротичні ураження,

подібні людським. Чотирнадцять 14-тижневих ми- помогою фарбування б5ігіи5 червоним, і зі знижен- шей самців одержували додавання І/-188Р. шля- ням загального вмісту ліпідів. хом внутрішньом'язового електроперенесення іп Тому обробка за допомогою І/-188Р. значно мімо експресуючою плазмідною ДНК, що кодує ослабляє запальний процес в межах атеросклеро- мишачий ІС-18ВРа, при цьому 19 відповідних за тичного ураження і індукує ознаки процесу віднов- віком контрольних мишей одержували пусту плаз- лення стабільності атеросклеротичних бляшок. міду. Електроперенесення плазміди повторювали Більш того помітне зменшення запального компо- кожні З тижні і мишей забивали в 23-тижневому нента в ураженнях у мишей, оброблених за допо- віці після 9 тижнів обробки. Рівні мишачого ІІ -188Р. могою І--18ВР, було асоційоване з істотним зни- в плазмі були нижчими, ніж граничне значення женням загибелі клітин в бляшках (2,920,995. у (бнг/мл), що визначається у мишей ароЕєЕ КО, що оброблених І/-188Р мишей проти 10,553,6905 в одержували пусту плазміду. Однак окрема ін'єкція контролі, р«е0,05), отже обмежуючи зростання і плазміди, що містить ІІ -18ВР, приводила до висо- тромбогенність безклітинного ліпідного ядра ких рівнів І--18ВР в крові з максимумом через 2 ІМаїІаї, 1999). дні після ін'єкції (323,52-100,9нг/мл) і Висновки: 127,4535 4нг/мл через 2 тижні. Після 9 тижнів об- Застосовуючи добре вивчену мишачу модель робки плазмідою, що містить ІІ-18ВР, або пустою атеросклерозу, подібного людському, представле- плазмідою сироваткові рівні загального холесте- ні вище результати ясно встановили безперечну і рину (489,4234,6 проти 480,85236,Змг/дл відповід- вирішальну роль регуляції 1-18 і І-18ВР в утво- но) і ліпопротеїнів високої щільності (52,329,4 про- ренні атеросклеротичної бляшки, розвитку і стабі- ти 48,825,1мг/дл відповідно) не відрізнялися між льності. Незважаючи на запобігання початковій двома групами. Помірне, але достовірне збіль- стадії утворення ураження в грудній аорті, інгібу- шення маси тварин одержували в ІІ/-18ВР. групі, вання активності І--18 за допомогою додавання 1-- що обробляється в порівнянні з контрольною гру- 18ВР також сильно впливає на склад сформовано- пою (31,8:20,9 проти 28,60, 8г відповідно, р«е0,05). го ураження в синусі аорти, індукуючи перемикан-

Результат впливу додавання 1І/-18ВР на ате- ня на стабільний фенотип бляшки. росклероз оцінювали в 2 різних локалізаціях: низ- Клінічний прогноз пацієнта з атеросклерозом хідній грудній аорті і синусі аорти. Грудна аорта тільки частково залежить від розміру уражень. У була вибрана для визначення ролі І--18ВР в утво- цей час широко визнано, що якість (склад бляшки) ренні жирових смужок (атерогенез), оскільки ате- ураження може бути навіть кращим показником росклеротичні ураження грудної аорти завжди від- розвитку ішемічних явищ, ніж її розмір. Дійсно важ- сутні у віці 14 тижнів (дані не представлені), коли кі клінічні вияви атеросклерозу (інфаркти серця і починали перенесення І/-18ВР. Синус аорти, де мозку) є в основному результатом оклюзії просвіту атеросклеротичні ураження вже присутні у віці 14 судини тромбом, що утворився при взаємодії з тижнів (дані не представлені), оцінювали відносно атеросклеротичною бляшкою, що розпадається розвитку сформованої бляшки і складу, важливого 191. Патологічні дослідження показали, що враз- визначального фактора стабільності бляшки. Об- ливі або нестабільні бляшки, які схильні до розпа- робка за допомогою ІІ -188Р. мишей ароєЕ Ко дос- ду або що розпалися, багаті клітинами запалення і товірно впливає на розвиток атеросклеротичного виявляють істотну нестачу вмісту гладком'язових ураження і розвитку. Оцінка грудної аорти показа- клітин і колагену (20, 21). Більш того в подібних ла помітне зменшення ліпідного відкладення у бляшках показане значне збільшення апоптотич- мишей, що обробляються плазмідою ІІ/-18ВР, в ної загибелі клітин, що приводить до утворення порівнянні з пустою плазмідою (Ффіг.б). Кількісний високо тромбогенного ліпідного ядра (13, 221. Чу- комп'ютерний аналіз зображення показав 69905 дово, що всі дані ознаки підвищення нестабільнос- зменшення розміру атеросклеротичних уражень ті бляшки помітно ослаблялися у мишей, оброб- (р«е0,0001) (Фіг.б), вказуючи на вирішальну сприя- лених І--18ВР, вказуючи, що передача сигналу ІІ - ючу роль 1І--18 в атерогенезі. Крім того, обробка за 18 є основним визначальним фактором нестабіль- допомогою плазміди, що включає ІІ -188ВР, тільки ності бляшки. протягом 9 тижнів достовірно обмежила розвиток Значущість результатів, одержаних на мишах сформованої бляшки в синусі аорти (2495 змен- ароє Ко, для захворювання людини посилюється шення розміру бляшки, р-0,01) в порівнянні з об- виявленням авторами підвищених рівнів цирку- робкою пустою плазмідою (Ффіг.7). люючого 1ІІ--18 у пацієнтів з гострими коронарними

Більш важливо, що склад сформованого ура- синдромами і підвищеної продукції І/-18 в неста- ження, важливий визначальний фактор стабільно- більних атеросклеротичних бляшках сонної арте- сті бляшки, виявився сильно схильний до впливу рії, відповідальних за інсульт. Дані знахідки в суку- обробки І--18ВР. Атеросклеротичні ураження ми- пності визначили інгібітори активності 1-18 як шей, що обробляються за допомогою плазміди, новий важливий терапевтичний спосіб запобігання що включає І/-18В8Р, виявили дуже значне 50905 і лікування розвитку атеросклеротичних бляшок і зменшення інфільтрації макрофагами (р«0,0001) обмеження ускладнень бляшок. (Фіг.8), зміст менше 6795 Т-лімфоцитів (р«е0,005) Приклад 6: Підвищені рівні І--18 корелюють з (Фіг.8) і показали 2-кратне збільшення накопичен- рецидивними явищами у пацієнтів з серцевою не- ня гладком'язових клітин (р«е0,05) (Фіг.9). Крім того, достатністю дані важливі зміни в клітинному складі ураження Рівні І--18 визначали в сироватці кров пацієн- були асоційовані з достовірним 8595 збільшенням тів за допомогою ЕГІЗА зі специфічними антитіла- вмісту колагену (р«е0,0005), що встановили за до- ми проти 1-18.

Загалом обстежували 56 ішемічних або не- 9. Мозпітоїю Т, Такеда, К, Тапака, Т, ОпкКиви, ішемічних пацієнтів з ознаками серцевої недостат- К, Кавзпіжатига, 5, ОКатига, Н, АКіга, 5 апа ності або без неї. МакКапівні, К (1998). У. Іттипої. 161, 3400-3407.

У пацієнтів, що померли пізніше, рівні 1-18 10. Ратеї, Р, Саїка, К Е, Воппеп, Т Р, ЮОомег, становили 216,0341,5пг/мл проти 112,2:212 2пг/мл ЗК, апа 5бітв, УЕ. (1996). У. Віої. Спет. 271, 3967- у пацієнтів без летального виходу (р-0,0018). 3970.

У пацієнтів з будь-яким рецидивним випадком, 11. Оібопаю, 9А, НауаКамжа, М, Ноїпжа!, ОМ, таким як смерть, рекурентна ішемія, реваскуляри- 7апаї, Е апа Каїїйп, М. (1997). Майте 388, 16514- зація, прогресія атеросклерозу або госпіталізація, 16517. що періодично повторюється з приводу серцевої 12. Моміск, 0, Кігп, 5-Н, Бапішалі, с, Вегпіком, недостатності, визначали наступні рівні 1-18: І, ОіпагеїПо, С, апа Вибіпвієїп, М (1999). Іттипу 165,82-23,8 проти 107,7214,6 у пацієнтів з відсутні- 10, 127-136. стю будь-якого рецидивного випадку (р-0,03). 13. Майакг 7, Ниде! В, ОНап у, Гезеспе а,

Дані результати показують, що рівні І--18 дос- Егеуззіпеї ОМ, Тейдциі А. Зпей тетргапе товірно підвищені у пацієнтів, що мають поганий тісторапісіез м/п ргосоадшапі рогепіа!І іп питап клінічний прогноз, подібний рецидивним випадкам ашШегозсієгоїїс ріадиез. А гоЇеє г ароріозіз іп ріаадие або навіть смерті. Іготродепісйу. Сігсшайноп 1999; 99:348-353.

У зразках крові 16 неішемічних пацієнтів з 14. Тиісої О, МаїІаї 7, Неутез С, Веїтіп /, ознаками серцевої недостатності або без неї ви- І езеспе С, Теддиі А. Веїайоп Веїжмеєп Епаоіїпеїїа! значали рівень 1--18. У пацієнтів, які пізніше поме- Сеї! Ароріовіз апа Віоой Ріом/ Оігесіоп іп Нитап рли, рівень становив 199,02534,8пг/мл проти А пегозсієгоїїс Ріадиє. Сігесшайоп 2000; іп ргев5. 95,32520,4пг/мл у пацієнтів, що вижили (р-:0,09). 15. Оіттеїег 5, Наєпаєїег У, СаПе У, 2еіпег АМ.

Пацієнти з будь-яким рецидивним випадком: Охіаїгеа Іом/-депвіїу Іроргоївїп іпдисез ароріовів ої 146,6534 4пг/мл 1І--18 проти 95,4223,9пг/мл у паці- питап епадоїпеїїа! сеї Бу асіїмайоп ої СРРЗ2-ЇКе єнтів з відсутністю будь-якого рецидивного випад- ргоїеазе5. А тесПапівіїс сіпе 0 Ше тезропбе ю ку (р-0,03). Хоча відмінність в рівнях 1І--18 не дося- іпішгу" пуроїНевів. Сігоцайноп 1997; 95:1760-3. гала статистично значущої величини внаслідок 16. Стапіпат, Осієпсе, МоІ. 185, рр. 862-864 невеликої кількості пацієнтів, можна побачити ясну (1974). тенденцію до підвищення рівня ІІ -18. 17. Оіттеїег 5, Наєпавєї!ег У, Саїпе У, 7еїпег АМ.

У ішемічних пацієнтів рівень І--18 становив Охіаїгеа Іом/-депвіїу Іроргоївїп іпдисез ароріовів ої 214,2145 9пг/мл для пацієнтів, що померли проти питап епадоїпеїїа! сеї Бу асіїмайоп ої СРРЗ2-ЇКе 118,4512,8пг/мл для пацієнтів, що вижили ргоїеазе5. А тесПапівіїс сіпе о Ше тезропбе ю (р-0,007). іпішгу" пуроїНевів. Сігоцайноп 1997; 95:1760-3. 162,85-24,7пг/мл І/-18 визначали у пацієнтів, 18. Міг Г.М, Вигеаи МЕ, Сей! у, Вапдага В, Ноцу що мають будь-який рецидивний випадок, проти О, Сашаца Ом, ОеїІеге Р, ВгапейПес 0, Зспулапя В, 116,2216,0 у пацієнтів з відсутністю будь-яких ре- Зспептап ОО. Нідн ейісієпсу депе ігапвіег іпо цидивних випадків. взКеївїа! тизсіє тедіагеа Бу еїІесітіс риїзе5. Ргос Маї!

Посилання Асай 5сі ЮБЗА 1999; 96:4262-7. 1. НХоб55 ВА. АШегозсіеговзіз-ап іпіаттаюгу 19. Гее, А.Т. 5 Пірру, Р. Тне ипеїабіє аяшегота. дізеазе. М Епої У Мей 1999; 340:115-126. Апегозсієгї Тиготбр Мавзе Віо! 17,1859-1867(1997). 2. мап дег Маї АС, ВескКег АЕ, мап дег І ооз СМ, 20. Оаміеєв, М.У. Те сотрозйіоп ої согопагу- баз РК. Зйе ої іпіїта! гиріште ог еговіопо ої апегу ріаднев Іеайогіа!; соттепЦ. М Епд! У Мей

ІШготрозей согопагу ашегозсієгоїїс ріадиев ів 336, 1312-1314(1997). спагасієгігей ру ап іпїтаттайкюгу ргосезз ітезресіїме 21. Мігтапі, В., Коіоддіє, Р.О., ВигїКе, А.Р., Рагр, ої Ше дотіпапі ріадие тогрпоіоду. Сігоціайноп 1994; А. й Зспумапя, 5.М. Гевзб5оп5 їот з5цадеп согопагу 89:36-44. деат: а сотргеНпепзіме тогрпоіодіса! сіавзвійсайноп

З. Ривієг М, Вадітоп ГІ, Вадітоп 9), Спезерго вспете г ашШегозсіегоїїс Іевіопе. Апепгозсіег

УЗН. Тне раїйодепезвів ої согопагу апегу аізеавзе апа Тиготь Мазе Віої! 20, 1262-1275. (2000).

Ше асше согопагу зупдготев (1). М Епо! У Мей 22. КоІоаддіє, Р.О. еї аї. Госаїїганоп ої ароріоїїіс 1992; 326:242-250. тасгторнадез аї Ше 5і(е ої ріадне гиршге іп зидаєп 4. Еивієг М, Вадітоп І, Вадітоп 9), Спезерго согопагу аєайй (п Ргосез5 Сїанйоп| Ат . Раїної

УЗН. Тне раійодепевів ої согопагу апегу дізеазе апа 157, 1259-1268 (2000).

Ше асшціе согопагу зупаготев (2). М Епад! У Мей 23. Кіт, 5.Н. еї аі. Зішсшгаї гедиігетепів ої віх 1992; 326:310-318. паштапу оссигтіпуд ізоїопте ої Ше 1-18 бБіпаїпд 5. ее АТ, Прру Р. Тпе иппвіарбіє ашйегота. ргоїєїп Фо іппірії І -18. Ргос Маї! Асай 5сі ОБ5А 97,

Апегіозсіег Тнготь Мазе Віо! 1997; 17:1859-1867. 1190-1195 (2000). 6. Відкег РМ, Сизптап М, біатрієг МУ, Тгасу 24. ЕПой, М.)., Маїпі, А.М., Реідтапп, М., Гопод-

ВАР, НеппеКепз СН. Іппаттаїйоп, агзрігіп, апа (Ше Еох, А., Спапез, Р., Ві)), Н., апа УУосау, .).М., 1994, вк ої сагаіомазсшіаг дізеазе іп аррагепцу Пеау Ї апсеї 344, 1125-1127. теп. М Епаї У Меа 1997; 336:973-979. 25. Кпідні ОМ, Типи Н, Ге У, бієде! 5, Зпеау 0, 7. Прру Р. МоіІесшціаг разез ої Те асше согопагу МеОопоцай М, бсайоп В. Мооге МА, Місек У, вупаготев. Сігсцайоп 1995; 91:2844-2850. ОСаддопа Р, єї аі. СопвзігтсМйоп апа -іпійа! 8. МаКатига, К, ОКатига, Н, Мадайїа, К апа спагасіегігайноп ої а тоизе-питап спітетгіс апі-ТМЕ

Татига, Т. (1989). Іпгесі. Іттип. 57, 590-595. апіїроду. Мої Іттипої! 1993 Мом 30:16 1443-53.

26. Тиссі, А., УЧатев, Н., СПісперогііспе, В., «а (а

Воппеїсу, 9.У., Оауег, 9У.М., апа 2!ибріег. А.Н., 1992, у. зах»

Іттипої!. 148,2778-2784. «мой 27. Епаєїтапп, Н., 0. Моміск, апа 0. У/аМасн. реосравна: вниз . 1990. Тим Штог песговів Тасіог-Біпаіїпд ргоїеїпв5 зо риса йот Питап игіпе. Емідепсе г «ХЕ» іттипоіодіса! сгов5-геасіїмну мій сеї! зибасе шШтог «тії песговів Тасіог гесеріогв. ). Віої. Снет. 265:1531- «мо» лНЕ 1536. «1 Нота харігйв 28. Мооге МУ/5, Ватей Ну, Веере НО, 6ї аї. дохох І сиідеїї пез Тог сагона епдапегесюту. А «лу» жюриений прдймеробківю актину тийаївсіріїпагу сопзепвиз 5іаїєетепі йот Ше да симво)

Нос Соттіцеє, Атегпсап Неапй Авзосіайоп. ши

Сігсшайоп 1995; 91:566-79. т 29. Спотслупекі Р, Засспі М. Віпдіє-5ієр ша тешой ої ВАМА ізоїайоп бу асій диапідіит нн ни ни

Шіосуапайе-рпепоІ-спіогоїогт ехігасйоп. /- Апаї! м

Віоснет 1987; 162:156-9. же : «рел гІНСоК пос ОоВНОСтВ | «зу» ДНК

ІНК людно Кауєасі; пух АВ НОМ Тл х. Е «ВІЗ» Мк веріснх

ПІЖУ Заопхоукаимх івипуєр Б-ЇХ дно сімувханя Бщю сзшеххижама хицкюклюрох | Ех «пе» мі жо і хтаі» прямий праймер бегеактнну

РН ВТ ЕИВЬОІ | ке «Ре ЖЕу В Е «у» «яке КРІКВОВООКЯ Е «внк 5 «НЕ МЖК ОХ ВХ і сік Е шебпасемія воїна КЕ «ЕМ Баелоп ою ! хаЦцю У «Еркої | «Ме 1 дерев | ка» ДИК рий як й | «дих Вот хвріеях «му хну ! хаДУе ПК дум чаш дн: | «ансскеці прозеся довмолке хека | ІВ «мо дях | «Му: ДНК «ВТ то харижка | ДЕ. Ноую карії «ВИ Е «ЛІ: й т ренні вройнютв ПОТ | «ДЖ» примий приймен Ян де | кове епох | «Яке 8 тил | сазиузаци влогсаці с «и» да з «зу» ДВК «ог 9 «13» Ногокухеня сврр» 19 чІЖи «ву: ДНК «ВІ» прамий праймер ЦЕ яму -Р1Хе Неото варіснх «І» я, клан . сджеи ст» и праймер ЗВ ессірісає сіврвалива 20 І я «Мох СУ» «мій ване кара ДИЖК зсеВовсі паревцюс «арк Моє карієов 15

Баки «Ме в «31» сборвежні позймер Н-АЗ8Ве ие м

«3123 ЯНЕ «ЯМ Моп харігя» «ЖМК- л1Х» Вито хоріон: -

ЖИ» прин нохймер ЗАКОН «ЕМ «ТВ

ЖИВ причий праймер ЗР НЕ «поз» в еЦНКОЄІ «ах 1 ха севоспА во дос «НУ Ні ів ; хан З

КУЩ еуряцх ає янв - чай Оз й єм ДНК хі Зі да є «ПАХ Биопо ге «м» хх

МЕ ДВК «ЛУ обернений праймер інтроку ЗАВ хаї3» Новою харіснх а Не хаДе вени яр ще й кабін

Ех оопрцевни праймер САРОН ди о сстецюсгя ДЕКО: «ау 2) ша: «вій» 14

КеЕ су Ж

ВОВНИ «М ДНК

ЕОВЕМИ сепйріра ся «М3х Нети вир

Ж «2» «де |З «лі» прямий пряймеср грипу ЗАКОНИ, «ТАЖ ЛАВІ «йрІх її АЖ МАК ярі В «хі» са» ДНЕ запо» м

Інв до ці

У

Ка 1 ? 1 4 5 57

ТТ вою воно я спе МНН ех «уми чи Мене - юки ВИН . МеВ р Ек ся Її КО ОВ ОВ

ВПР мохом киро вав й ши : г Ч Крит У а нео мКнь їх пе нн КН НО де З з т м: ОВ ЯБНя ВВ вух б 5 ни до ЬШлАвка ВК КН нні сви ! Же що Кок 4 а й -, сх виш ни ни щи ши ши - д іт ов и В В а г пн а нь З ЕЕ в ) ул В ж Ки Кт рих ТИ

КИ М нь я с НА я , : ОДА е мл нн и У В спазатрів КУДИ КА дек тт контроль оху. охВі. охо ж бюд АК Тит ант» ц-івае па на НН ши я и и ши

Фіг. 1 Фіг. З

А па в яз яхаохе 8. 8Ве ж 15 Й 7 ЕВ -

Ей а. ЕХ в

ЕКО х ке КЕ 25:11 5 35 ; ї я ЗЕ

ВЕ чк м Е ЕК т- й

В ой « ЕЕ к ї хв, їх ГежкеЯ Зк що | ІЗ м е - в ві А Я ---- ве Да для

Алеросклеретичні блятки схмомомагатнх зекилптоматична сомитомихчої мотмтоматички. і 4 3 45 6 ще ак ВХ ла но ш-ІЯБ» Фор що на ду ИН Б. я пет о Дан НЕ

ДО одні ей и вве ЕЕ е х ЕН рі

Кк лок БВ и З я ами сіно Ні ся ШЕ 5 й

МОНО Ех ком сс 5-Х «г и ЩЕ т о є фр вав т ли шешше Я гої

ВК ЕК охо х Н Н з, в е що їв оку кра пн мед - паща і;

Ре пев ек ов И н я й є в ик акти пократия без покритих соктитст ба вокрнття

ГО вена КА ВВ Я вирккама взрахками нирезкомх 0 пероками фіг. З Фа чу ню вої ; дою в-пактамаза І рому М вволіяма вот т - и їкка об плац ! се ст з34 ув - . 5 8 8019 пк. БРВ шк. ВВ; Е з3

ВЕНА НААЩЕНЯ я - з їх

В вд ; А лм вам 5 З г. Масй ВУЧОВВ Е

З й змодені. Зала дорожня плазміда плазміда, ще вссе П.-1ЯВР

Фіг. 5 Чиг. 6 - Тв 202 00

ЕВ ; ж Ши до ; ва о о з шо х ВО рас 2790 5 яке б х Код Ж: ще Ж | й Ес г5 4 - - ши ще Е ах й і Ра шо

М 25 ск: ші ся 5 НА ррогомтя

Е | В ! ОА МДж п в - в ря Я

І 85. й поети нн перожотя плазміда нинзміда, щи кесе П.-1АВРЕ хонтроль ПАТ контромя ШАТВВЕ фі «Фіг. 8 тв і : рої Е й 183 21 ів ся 150 Є

З Бі зе :

У ; ! УРА Била "7

ШІ 1 її

І роя МИС ев |. контроль П-1ЯБР ховіроль НАТЯВАЕ

Фіг о

Комп'ютерна верстка М. Ломалова Підписне Тираж 26 прим.

Міністерство освіти і науки України

Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна

ДП "Український інститут промислової власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ - 42, 01601