CZ20023644A3 - Farmaceutický prostředek - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká použiti inhibitorů IL-18 pro výrobu farmaceutického prostředku, určeného k léčeni a/nebo prevenci atherosklerózy.

Dosavadní stav techniky

Atheroskleróza je nejběžnšjší a nejzávažnější cévní onemocnění, přestože je známa celá řada dalších cévních poruch. Atheroskleróza postihuje převážně velké a středně velké tepny a změny přitom zahrnují ukládání tuku, fibrolytické plaky a složitější poškození cév.

Atheroskleróza je chronické zánětlivé onemocnění stěny tepen, které je charakterizováno progresivním hromaděním lipidů, například cholesterolu, dále buněk, jako jsou makrofágy, T-lymfocyty, buňky hladkých svalů a také hromaděním extracelulární matrice (1). Větší nahromadění uvedených materiálů se označuje jako atherom nebo plak, tyto útvary často obsahují vápník. Tuková tkáň může poškozovat stěnu tepny, snižovat její elastičnost a interferovat s krevním průtokem. Kolem plaků mohou vznikat krevní sraženiny, což dále interferuje s průtokem krve a popřípadě může vést až k úplnému uzávěru cévy. Atheroskleróza je obvykle spojena se zvýšenou koncentrací LDL-cholesterolu, Lp(a)-fibrinogenu a faktoru VII a také se sníženou koncentrací HDL-cholesterolu. Rizikovými faktory jsou zejména zvyšující se věk, mužské pohlaví, kouření, cukrovka, obezita, vysoká koncentrace cholesterolu v krví, strava bohatá na tuky a rodové • · zatížení. Atheroskleróza je hlavní příčinou ischemie různých orgánů, například infarktu myokardu.

Atherom je nejběžnější poškození tepny, které může být dále komplikováno thromboembolickými poruchami. Atheromatozní plaky často zužují průsvit tepny, což způsobuje nedostatečné zásobení krví a někdy až atrofii tkání v oblasti s nedostatečným krevním zásobením.

Závažné důsledky tohoto jevu zahrnují angínu pectoris vzhledem k nedostatečnému zásobení srdečního svalu kyslíkem, srdeční selhání a další poruchy a také zvýšený krevní tlak v důsledku zúžení ledvinové tepny, na tento jev odpovídá ledvina fyziologickým zvýšením sekrece renínu, čímž dochází ke zvýšení tlaku.

Atheroskleróza a arterioskleróza se někdy označují jako odlišné patologické stavy. V tomto případě je atheroskleróza definována jako ztuhnutí nebo ztráta elastičnosti tepen v důsledku vzniku atheromů, kdežto arterioskleróza se označuje jako ztráta elastičnosti tepen z jakýchkoliv důvodů.

Komplikace nebo důsledky atherosklerózy zahrnují koronární srdeční onemocnění, to znamená atherosklerózu koronárních tepen, nedostatečné krevní zásobení vzhledem k uzávěru tepny (ischemie/angina), akutní infarkt myokardu, přechodnou ischemii (TIA) nebo také mrtvici a další poškození krevních cév, svalů nebo tělesných orgánů.

Aneurysma je stálé abnormní rozšíření krevních cév a je také běžným důsledkem atherosklerózy. U starých nemocných se většinou běžně vyvíjí atherosklerotické aneurysma břišní aorty. Toto aneurysma může prasknout do retroperitoneálního prostoru. V případě aneurysmatu jde obvykle o ztrátu elastické tkáně a o fibrózu mediální vrstvy cévy, převážně v důsledku ischémie svaloviny v této vrstvě s následnou fragmentací elastických vláken působením enzymů, uvolňovaných makrofágy.

Při prevenci nebo léčení atherosklerózy se doporučuje snížení koncentrace tuků a cholesterolu v krvi. Zejména se široce používá léčení, které zajistí snížení koncentrace LDL-cholesterolu. V současné době jsou široce používány statiny, které jsou specifickými inhibitory reduktázy HMG CoA. Dále je možno ke snížení koncentrace cholesterolu použít další látky, jako cholestyramin, colestipol, kyselinu nikotinovou, gemifibrozil, probucol, lovastatin a podobné.

Dalším možným přístupem je snížit na nejmenší možnou míru riziko tvorby thrombů na již vytvořených atheromatických poškozeních. Aspirin, který je zřejmě specifickým inhibitorem shlukování destiček, vyvolané thromboxanem A2 nebo další antikoagulační látky, je možno využít ke snížení rizika tvorby krevních sraženin.

Perkutánní angioplastika, při níž se používá cévka s kulovitým rozšířením na konci ke zploštění plaku a ke zvýšení krevního průtoku za uzávěrem je technika, podobná té, která se běžně užívá ke zprůchodnění tepen v srdci, je však možno jej využít u řady dalších tepen. V případě zúžení koronárních tepen je možno vytvořit bypass pomocí segmentu v.saphena nebo tak, že se ze stěny hrudníku uvolní tepna, zásobující mléčnou žlázu a propojí se svým distálním koncem do tepny na přední srdeční stěně.

• 0 · 0 00 0· · 0 0 ·· 0 0« • · 0 0 0 0 · • 00 · · 0 · · · · • · · 0 0 0 ·· ··· «·· 00 0000

V některých případech je možno doporučit chirurgické odstranění uložených materiálů (endarterektomie), například v případě zúžení krkavice.

Hlavní doporučení se však stále ještě týká potlačení rizikových faktorů nebo jejich léčení. To znamená, že je zapotřebí udržovat stravu s nízkým obsahem tuků, cholesterolu a chloridu sodného, udržovat normální krevní tlak, léčit cukrovku a další onemocnění, snížit tělesnou hmotnost, odstranit kouření a cvičit pro zachování dobrého stavu srdečního stavu a celého oběhu.

Zánětlivé pochody se účastní ve všech stupních atherosklerózy (1). Endothelíální aktivace různými faktory včetně modifikovaných lipoproteinů a cytokinů, podporujících zánět, je patrně prvním stupněm atherosklerózy, který je již zánětlivým stavem (1). Řada studií v poslední době prokázala, že interakce mezi cévními a zánětlivými buňkami mají zásadní význam pro vznik atherosklerózy (1). Při základních pokusech docházelo při inhibici faktorů, podporujících zánět, také ke snížení vývoje atherosklerózy (1) .

Zánětlivé stavy hrají také hlavní úlohu při rozrušení atherosklerotických plaků a při vzniku thrombózy (2-5), a tím ovlivňují výskyt akutních ischemických stavů a s ním spojené úmrtnosti (6). Je zřejmé, že závažné klinické projevy atherosklerózy, jako jsou infarkt srdeční tkáně, mozkové tkáně a dalších orgánů v důsledku atherosklerózy jsou vyvolány převážně uzávěrem průsvitu cév thrombem, který se vytvoří na rozrušeném atherosklerotickém plaku (3, 4). Sledování

prokázalo, že zranitelné a nestálé plaky, to znamená plaky, které mohou prasknout nebo již praskly, se značně liší buněčným složením i složením matrice ve srovnání se stálými plaky, které nepraskají (7). Zranitelné plaky jsou bohaté na zánětlivé buňky, to znamená makrofágy a T-lymfocyty, obsahují lipidové jádro a jsou charakterizovány tenkým vláknitým povlakem se značnou ztrátou extracelulární matrice (7).

Snížení syntézy kolagenu, které je zprostředkováno cytokinem IFNy, podporujícím zánět a zvýšená účinnost metalloproteináz, odvozených od makrofágů a degradujících matrici vyvolávají zeslabení vláknitého povlaku a jeho lomivost (7). Prasknutí této křehké vláknité vrstvy exponuje vysoce thrombogenní lipidové jádro krvi v krevním oběhu a v důsledku toho vzniká okluzivní thrombus (1, 7). Z tohoto důvodu je hustota zánětlivých buněk v daném atherosklerotickém poškození dobrým indikátorem nestability tohoto poškození.

Klinická prognóza nemocných s atherosklerózou závisí pouze z části na rozměrech poškození (19, 20). Nyní se uznává, že důležitější je kvalita, to znamená složení plaků než jejich rozměr a podle této kvality je možno lépe předvídat výskyt ischemických příhod. Jak již bylo uvedeno, jsou závažné klinické projevy, jako infarkt srdce a mozkové tkáně vyvolány především uzávěrem průsvitu cév thrombem, který se vytvoří na rozrušeném atherosklerotickém plaku (19). Patologické studie prokázaly, že zranitelné a nestálé plaky, které mohou prasknout nebo již praskly, jsou bohaté na zánětlivé buňky a je možno v nich prokázat podstatný úbytek buněk hladké svaloviny a kolegenu (20, 21). Mimoto takové plaky • ·· ·· · · • · · ·· »♦ • 4 4

9 4 • 4 9 9

494 4 4 44 9 4 vykazují podstatné zvýšení množství apoptotických buněk, které uhynou a pomáhají vytvářet vysoce thr.ombogenní lipidové jádro (13, 22) .

Vzniku zánětu se účastní cytokiny, podporující zánět. Cytokin interleukin 18 (IL-18) byl původně popsán jako faktor, vyvolávající tvorbu interferonu γ, (IFN-γ) (8) . Jde o časný signál vzniku pomocných buněk 1 T-lymfocytů (Thl). IL-18 působí spolu s IL-12, IL-2, s antigeny, mitogeny a pravděpodobně ještě dalšími faktory tak, že dochází k indukci tvorby IFN-γ. IL-18 také podporuje produkci GM-CSF a IL-2, zesiluje proliferaci T-buněk, vyvolanou anti-CD3 a zvyšuje uhynutí přirozených buněk zabíječů, zprostředkované Fas. Úplný IL-18 je produkován ze svého prekurzoru působením specifického enzymu pro přeměnu IL-Ιβ (ICE, kaspáza-1). IL-18-receptor je tvořen nejméně dvěma složkami, které spolupracují pří vazbě ligandu. U myších T-buněk, stimulovaných IL-12 byla nalezena místa pro IL-18 s vysokou a nízkou afinitou (9), což napovídá, že jde o receptorový komplex s větším počtem řetězců. Až dosud byly identifikovány dvě podjednotky receptoru, obě náleží do skupiny receptorů IL-1 (10). Převod signálu IL-18 zahrnuje aktivaci NK-kB (11).

V poslední době byl z lidské moči izolován rozpustný protein s vysokou afinitou pro IL-18, cDNA pro tento protein u člověka a u myši a celý lidský gen pro tento protein pak byly klonovány (12, WO 99/09063). Tento protein byl označen jako protein, schopný vázat IL-18 (IL-18BP).

• Φ φφ # « φ

IL-18BP není extracelulární oblastí jednoho ze známých receptorů IL-18, nýbrž vylučovaným přírodním proteinem v oběhu. Náleží do nové skupiny vylučovaných proteinů, tato skupina dále zahrnuje několik proteinů, kódovaných virem neštovic (12). K expresi IL-18BP konstitutivně dochází ve slezině (12). IL-18BP z moči i rekombinantní IL-18BP mají schopnost specifické vazby IL-18 s vysokou afinitou a se schopností modulovat biologickou afinitu IL-18.

Gen pro IL-18BP byl lokalizován do lidského chromosomu llql3, přičemž nebyl nalezen žádný kódující exon pro transmembránovou oblast v sekvenci genomu o 8,3 kb. U člověka byly identifikovány 4 sestřihové varianty nebo isoformy IL-18BP a tyto varianty byly označeny IL-18BP a, b, c a d. Všem těmto variantám je společné N-zakončení, přičemž varianty mají odlišné C-zakončení (12).

Čtyři lidské a dvě myší izoformy IL-18BP, které jsou důsledkem sestřihu mRNA, byly nalezeny v různých bankách cDNA, bylo dosaženo jejich exprese, látky byly čištěny a sledovány na vazbu a neutralizaci IL-18 v biologickém materiálu (23). Lidské izoformy IL-18BP a IL-18BPa měly nejvyšší afinitu pro IL-18 s rychlým nástupem, dlouhodobým účinkem a disociační konstantou (K(d))399 pM. IL-18BPC má společnou oblast Ig s IL-18BPa až na 29 C-terminálních zbytků aminokyselin. Konstanta K(d) pro IL-18BPc je lOkrát nižší (2,94 nM). Přesto IL-18BPa a IL-18BPC neutralizují IL-18 z více než 95 % při dvojnásobném molárním přebytku. IL-18BPb a IL-18BPd isoformám chybí úplná oblast Ig a tyto isoformy nemají schopnost vázat nebo neutralizovat IL-18. Myší IL-18BPc a ·* #*» • fcfc •9 ·« fl »· * * ·· fl flflfl fl • ··· · · * * · · flflfl ··· ·· *^r* ··· ·« ·*·· isoforma IL-18BPd, které mají totožnou oblast Ig také neutralizují na více než 95 % myší IL-18 při dvojnásobném molárním přebytku. Avšak myší IL-18BPd, který má stejnou C-terminální skupinu jako lidský IL-18BPa také neutralizuje lidský IL-18. Molekulární analýza identifikovala velké elektrostatické a hydrofobní místo vazby v oblasti Ig proteinu IL-18BP, což by mohlo vysvětlovat vysokou afinitu této látky pro vazbu ligandu (23).

Podstata vynálezu

Vynález je založen na zjištění, že určitý inhibitor IL-18 má vyjádřeně příznivý vliv na vývoj plaků, na jejich vznik a na jejich stálost na myším modelu atherosklerózy tento inhibitor nejen zabránil vzniku poškození hrudní aorty, nýbrž také zajistil změnu fenotypu plaků na stálé plaky v případě již vytvořených atherosklerotických plaků.

Podstatu vynálezu tedy tvoří použití inhibitoru IL-18 pro výrobu farmaceutického prostředku pro prevenci a/nebo léčení atherosklerózy.

Vynález bude dále podrobněji popsán v souvislosti s přiloženými výkresy.

Přehled obrázků na výkresech

Na obr. 1 je znázorněn histogram, znázorňující procento přežívání endotheliálních buněk lidské pupečníkové žíly po inkubaci s oxidovanými lipoproteiny

nebo po inkubaci s kombinací oxidovaných lipoproteinu a protilátky proti IL-18 nebo IL-18BP.

Na obr. 2 je znázorněn výsledek Western blot na proteinových extraktech z atherosklerotických arterií ve srovnání s kontrolními arteriemi. Při provádění této zkoušky byly použity protilátky proti IL-18BP (hIL-18BP), podjednotka cc receptoru IL-18 (hIL-18Ra), IL-18 (hIL-18) a kaspáza-1 (kaspáza-1 plO).

Na obr. 3 je znázorněn agarózový gel, barvený ethidiumbromidem a znázorňující výsledek analýzy RT-PCR pro IL-18 a IL-18BP mRNA pro buňky v atherosklerotickém plaku.

Na obr. 4 jsou znázorněny reprezentativní výsledky pro RT-PCR pro IL-18BP a IL-18 v atherosklerotických plácích ve srovnání s expresí ha-actinu (kontrola) u symptomatických i asymptomatických plaků.

Na obr. 5 je znázorněna mapa vektoru pro expresi při použití svalového elektrotransferu u myši.

Na obr. 6 je znázorněn histogram pro oblasti atherosklerotických tepen, v nichž byly barveny lipidy. Pak byla provedena kvantitativní analýza ukládání tuků pomocí zobrazení počítačem. Údaje znamenají průměry s s.e.m. (n = 19 pro prázdný plasmid, n = 14 pro

IL-18BP plasmid). **** znamenají P < 0,0001.

Na obr. 7 je znázorněn histogram, který uvádí oblast poškození aorty po léčení IL-18BP nebo kontrolním prázdným plasmidem. Opět byla provedena kvantitativní analýza ukládání tuků pomocí počítače. Údaje jsou průměrné hodnoty s s.e.m. (n = 19 pro prázdný plasmid, n = 14 pro IL-18BP plasmid). ** znamenají P < 0,01.

Obr. 8 uvádí vliv léčení IL-18BP na obsah zánětlivých buněk v ložiscích poškození. Ke stanovení procentuálního množství oblastí, pozitivních na makrofágy (černé sloupce), byla užita počítačová analýza stejně jako pro stanovení počtu infiltrujících T-lymfocytů na mm² (šedé sloupce) v aortě u kontrol (n = 12 pro barvení makrofágů, n = 15 pro barvení T-lymfocytů) nebo u myší, léčených IL-18BP (n = 13 pro makrofágy, n = 12 pro T-lymfocyty). Údaje jsou průměrné hodnoty s s.e.m.

*** znamenají P < 0,005, **** znamenají P < 0,0001.

Obr. 9 uvádí vliv léčení IL-18BP na poškození buněk hladkých svalů a na obsah kolagenu. Počítačová analýza byla použita pro stanovení oblastí, pozitivních na přítomnost buněk hladkých svalů (černé sloupce) a na hromadění kolagenu (šedé sloupce) v případě poškození aorty u kontrol (n = 6 pro buňky hladkých svalů, n = 11 pro kolagen) a u myší, léčených IL-18BP (η = β pro buňky hladkých svalů, n = 13 pro kolagen). Údaje jsou průměrné hodnoty s s.e.m. * znamená P < 0,05, ** znamenají P<0,01.

Vynález je založen na zjištění, že zvýšená koncentrace IL-18 v krevním oběhu u nemocných s akutním koronárním syndromem a zvýšená produkce této látky v případě nestálých atherosklerotických plaků v krkavici může vést ke vzniku mrtvíce. Mimo to bylo prokázáno, že in vivo elektrotransfer a exprese DNA, která kóduje IL-18BP, může zabránit vývoji tukových ložisek v hrudní aortě a zpomaluje progresi atherosklerotických plaků v aortálním oblouku na myším modelu atherosklerózy.

Důležité je, že transfekce pomocí plasmidů IL-18BP vyvolává zásadní změny ve složení plaku (pokles počtu makrofágů, T-buněk, snížené uhynutí buněk a současně snížení obsahu lipidů a vzestup počtu svalových buněk a obsahu kolagenu), což vede ke vzniku stálého plaku. Tyto výsledky poprvé prokazují důležitou úlohu inhibitorů IL18 při snížení vývoje a progrese plaků, současně inhibitor napomáhá stabilizaci plaků.

Vynález se tedy týká použití inhibitoru IL-18 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení a/nebo prevenci atherosklerózy.

Pod pojmem „prevence se v průběhu přihlášky vynálezu rozumí nejen úplná prevence úplných jevů, nýbrž také částečná nebo podstatná prevence, zmírnění nebo zpomalení účinku při časném podání na začátku vznikajícího onemocnění.

Pod pojmem „léčení se v průběhu přihlášky vynálezu rozumí jakýkoliv příznivý vliv na postup choroby, včetně zmírnění nebo snížení počtu patologických jevů u již probíhajícího onemocnění.

Pod pojmem „inhibitor IL-18 se v průběhu přihlášky vynálezu rozumí jakákoliv molekula, která moduluje produkci IL-18 a/nebo působí takovým způsobem, že dochází ke snížení produkce IL-18 nebo ke zmírnění jeho účinku nebo k částečné, podstatné nebo úplné prevenci vzniku takového účinku.

• ·

Inhibitorem produkce může být jakákoliv molekula, která nepříznivě ovlivní syntézu, zpracování nebo úplnost IL-18. Inhibitorem ve smyslu vynálezu mohou být například látky, potlačující expresi genu pro interleukin-IL-18, protismyslná mRNA, která snižuje nebo brání transkripci mRNA pro IL-18 nebo vede k degradaci této mRNA, dále může jít o proteiny, které narušují úplnost nebo sekreci IL-18, o proteázy, degradující IL-18 po jeho syntéze a podobně. Inhibitorem produkce může být také inhibitor kaspázy-1 nebo inhibitor ICE, který může například bránit vzniku úplného IL-18.

Inhibitorem působení IL-18 může být antagonizující látka. Antagonistická látka se může vázat na molekulu IL-18 s dostatečnou afinitou a specifičností pro částečnou nebo úplnou neutralizaci IL-18 nebo míst jeho vazby na jeho ligandy, například na jeho receptory. Antagonistická látka může také vyvolat inhibici dráhy signálu IL-18, která je aktivována po vazbě IL-18 na jeho receptor.

Inhibitory působení IL-18 mohou být také rozpustné receptory IL-18 nebo molekuly, napodobující takové receptory nebo látky, blokující receptory IL-18, nebo protilátky proti IL-18, například mohoklonální protilátky nebo jakékoliv jiné látky nebo molekuly, které brání vazbě IL-18 na cílové struktury a tak snižují nebo brání intracelulárním nebo extracelulárním reakcím, které jsou zprostředkovány IL-18.

Atheroskleróza je také označována jako arterioskleróza. V průběhu přihlášky vynálezu zahrnuje pojem atherosklerózy všechna onemocnění nebo chorobné • · stavy tepen, které se obvykle popisují jako.

atheroskleróza. Jde o stavy, při nichž se do stěn cév ukládají tukovité materiály, které mohou vést ke zúžení a narušení krevního průtoku nebo k prasklinám a/nebo erosím s tvorbou thrombů.

V průběhu přihlášky vynálezu zahrnuje atheroskleróza jak sklerózu nebo ztrátu elastičnosti tepen v důsledku vzniku atheromů, tak ztrátu elastičnosti, způsobenou jakýmkoliv jiným způsobem (arterioskleróza). Patologické stavy při atherosklerózy, případné komplikace a také důsledky již byly popsány svrchu.

Progrese atherosklerózy zahrnuje tvorbu atherosklerotíckých plaků a jejich vývoj na stále nestálejší formy. Vynález se proto také týká použití inhibitoru IL-18 pro výrobu farmaceutického prostředku pro snížení nebo prevenci progrese atherosklerózy.

Uzávěr cévy thrombem, vytvořeným na atherosklerotickém plaku je kritický pro vznik srdečního infarktu nebo mozkového infarktu, které jsou neškodlivějšími důsledky atherosklerózy. Vynález se tedy týká zejména použití inhibitoru IL-18 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení a/nebo prevencí thrombózy na atherosklerotickém plaku.

Stabilita plaku ovlivňuje jeho vývoj na zranitelný plak, na němž může snáze vzniknout thrombóza. Z tohoto důvodu se vynález také týká použití inhibitoru IL-18 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení a/nebo prevenci nestability atherosklerotického plaku.

• 0

Nestálý plak může snadno prasknout a toto prasknutí může vést ke vzniku thrombózy. Vynález se proto týká také použití inhibitoru IL-18 pro výrobu farmaceutického prostředku pro prevenci erose nebo prasknutí atherosklerotického plaku.

Nestabilita plaku a thrombóza mohou vzniknout také v důsledku apoptotického uhynutí buněk, což znamená vysokou prokoagulační účinnost a může být klíčovým faktorem, který vede k thrombóze na erodovaném nebo prasklém atherosklerotickém plaku nebo k embolickým příhodám (13, 14). Bylo prokázáno, že oxidované lipoproteiny (oxLDL) indukují apoptózu makrofágů a endotheliálních buněk v kultuře (15). Jak bude dále popsáno v příkladové části, bylo prokázáno, že inhibitor IL-18 může podstatně snížit uhynutí buněk, vyvolané oxLDL.

V souvislosti s vynálezem bylo neočekávaně zjištěno, že koncentrace IL-18 v krevním oběhu byly podstatně zvýšeny při srdečním selhání u nemocných, kteří trpěli opakujícími se příhodami, například opakující se ischemií s následnou revaskularizací, progresí atherosklerózy nebo opakovanou hospitalizací pro srdeční selhání ve srovnání s nemocnými, u nichž opětná hospitalizace nebyla nutná. Toto zvýšení koncentrace IL-18 bylo zvláště vyjádřeno u těch nemocných, kteří později zemřeli ve srovnání s nemocnými, kteří přežili. Zvýšenou koncentraci IL-18 v krevním oběhu bylo možno pozorovat u ischemických i neischemických nemocných.

Vynález se proto rovněž týká použití inhibitorů IL-18 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení a/nebo prevenci srdečního selhání při opakujících se ·· ·♦

příhodách. Opakující se příhodou může být jakákoliv příhoda, která může následovat po srdečním selhání, například opakující se ischemie, revaskularizace, progrese atherosklerózy nebo nutnost opětné hospitalizace pro srdeční selhání. Ve výhodném provedení jde o farmaceutický prostředek proti ischemickým stavům, například ischemii myokardu, podle dalšího výhodného provedení jde o prostředek pro léčení neischemických stavů, například v případě systemického zvýšeného krevního tlaku, onemocnění srdečních chlopní nebo plicní onemocnění, které vede k selhání pravého srdce a pak ke kongestivnímu srdečnímu selhání.

Ve výhodném provedení vynálezu se inhibitor IL-18 volí ze skupiny inhibitorů ICE, protilátek proti IL-18, protilátek proti podjednotkám receptoru pro IL-18, inhibitorů signální dráhy receptoru IL-18, antagonistů IL-18, které se dostávají do kompetice s IL-18 a blokují jeho receptor, může jít také o proteiny, schopné vázat IL-18, isoformy, muteiny, složené bílkoviny, funkční deriváty, účinné frakce nebo oběhově permutované deriváty se stejnou účinností.

Pod pojmem „muteiny se rozumí analogy IL-18BP nebo analogy virového IL-18BP, v nichž byly jeden nebo větší počet zbytků aminokyselin přírodního nebo vírového IL-18BP nahrazeny odlišnými zbytky aminokyselin nebo vypuštěny nebo byl naopak přidán jeden nebo větší počet zbytků aminokyselin do přírodní sekvence IL-18BP nebo virového IL-18BP, aniž by přitom došlo k podstatným změnám účinnosti výsledných produktů ve srovnání s divokým nebo virovým typem IL-18BP. Tyto muteiny je možno • · připravit známým způsobem syntézou a/nebo cílenou tvorbou mutace nebo jakýmkoliv jiným známým způsobem.

Jakýkoliv z těchto muteinů má s výhodou sekvenci aminokyselin, která je obdobná sekvenci IL-18BP nebo sekvenci virového IL-18BP k dosažení obdobného účinku. Jedním z účinků těchto látek je schopnost vázat IL-18. Pokud má mutein dostatečnou vaznou účinnost pro IL-18, je možno jej využít při čištění IL-18, například při afinitní chromatografií a je tedy možno předpokládat v podstatě stejnou účinnost jako v případě IL-18BP. Skutečnost, zda daný mutein má v podstatě stejnou účinnost jako IL-18BP je možno prokázat běžnými pokusy, při nichž se takový mutein podrobí zkoušce na kompetici, která stanoví, zda se mutein váže nebo neváže na příslušně značený IL-18, například při radioimunologické zkoušce nebo zkoušce ELISA.

Muteiny polypeptidů IL-18BP nebo muteiny virového IL-18BP, které je možno využít pro účely vynálezu nebo příslušné kódové nukleové kyseliny zahrnují určitý počet v podstatě obdobných sekvencí, například peptidů nebo polynukleotidů, které je možno snadno připravit běžným způsobem bez velkého množství dalších pokusů.

Výhodnými změnami v muteinech podle vynálezu jsou změny, které jsou známé jako „konservativní substituce. Konservativní substituce zbytků aminokyselin v polypeptidech nebo proteinech IL-18BP nebo ve virovém IL-18BP zahrnují obdobné zbytky aminokyselin ze skupiny s dostatečně podobnými fyzikálněchemickými vlastnostmi, takže substituce mezi jednotlivými členy takové skupiny uchová biologickou funkci molekuly (16). Je zřejmé, že ve • · · · ·

· ·

999 «99 • 9 99 9 9 svrchu uvedených sekvencích je možno přidávat nebo vypouštět zbytky aminokyselin beze změny výsledné funkce, zvláště v případě, kdy půjde o malý počet zbytků aminokyselin, například nižší než 30 a s výhodou nižší než 10, přičemž nesmí jít o odstranění nebo přemístění zbytků aminokyselin, které jsou kritické pro funkci, například jde o cysteinové zbytky. Proteiny a muteiny, získané vypuštěním a/nebo zařazením takových zbytků tvoří rovněž součást podstaty vynálezu.

Skupiny synonymních aminokyselin jsou dále uvedeny v tabulce I. Výhodné zbytky jsou uvedeny v tabulce II a zvláště výhodné zbytky v tabulce III.

Tabulka I

Výhodné skupiny synonymních aminokyselin

Aminokyselina	Synonymní	skupina
Ser	Ser, Thr,	Gly, Asn
Arg	Arg, Gin,	Lys, Glu, His
Leu	Ile, Phe,	Tyr, Met, Val, Leu
Pro	Gly, Ala,	Thr, Pro
Thr	Pro, Ser,	Ala, Gly,His, Gin, Thr
Ala	Gly, Thr,	Pro, Ala
Val	Met, Tyr,	Phe, Ile, Leu, Val
Gly	Ala, Thr,	Pro, Ser, Gly
Ile	Met, Tyr,	Phe, Val, Leu, Ile
Phe	Trp, Met,	Tyr, Ile, Val, Leu, Phe
Tyr	Trp, Met,	Phe, Ile, Val, Leu, Tyr
Cys	Ser, Thr,	Cys
His	Glu, Lys,	Gin, Thr, Arg, His
Gin	Glu, Lys,	Asn, His, Thr, Arg, Gin
Asn	Gin, Asp,	Ser, Asn

« 9

« 4* » · *>	• ·	• *
« · ·	•
» ·*· ·	v •
	fc tf ·	4«

Lys	Glu,	Gin,	His,	Arg,	Lys
Asp	Glu,	Asn,	Asp
Glu	Asp,	Lys,	Asn,	Gin,	His, Arg, Glu
Met	Phe,	Tle,	Val,	Leu,	Met

Trp Trp

Tabulka II
Výhodnější zbytky	synonymních	aminokyselin
Aminokyselina	Synonymní	skupina
Ser	Ser
Arg	His, Lys,	Arg
Leu	Leu, Ile,	Phe, Met
Pro	Ala, Pro
Thr	Thr
Ala	Pro, Ala
Val	Val, Met,	Ile
Gly	Gly
Ile	Ile, Met,	Phe, Val, Leu
Phe	Met, Tyr,	Ile, Leu, Phe
Tyr	Phe, Tyr
Cys	Cys, Ser
His	His, Gin,	Arg
Gin	Glu, Gin,	His
Asn	Asp, Asn
Lys	Lys, Arg
Asp	Asp, Asn
Glu	Glu, Gin
Met	Met, Phe,	Ile, Val, Leu
Trp	Trp

Tabulka III

Zvláště výhodné zbytky synonymních aminokyselin «« »·

1» ··· ·· ♦ * *»· » · • · • · «· «

*<·

Aminokyselina

Ser

Arg

Leu

Pro

Thr

Ala

Val

Gly

Ile

Phe

Tyr

Cys

His

Gin

Asn

Lys

Asp

Glu

Met

Trp

Synonymní skupina

Ser

Arg

Leu, Ile, Met Pro

Thr

Ala

Val

Gly

Ile, Met, Leu

Phe

Tyr

Cys, Ser His

Gin

Asn

Lys

Asp

Glu

Met, Ile, Leu Met

Příkladem substitucí aminokyselin v proteinech pro muteiny polypeptidů nebo proteinů IL-18BP nebo pro muteiny virového IL-18BP mohou být jakékoliv známé substituce, tak jak jsou uvedeny například v US 4959314, US 4558585 a US 4737462 (Mark a další), US 5116943 (Koths a další), US 4965195 (Namen a další), US 4879111 (Chong a další) a US 5017691 (Lee a další), proteiny, v nichž jsou • · • · · · · · · ··· ·· ··· ··· ·· ···· substituovány lysinové zbytky jsou uvedeny v US 4904584 (Shaw a další).

Pod pojmem „složený protein se rozumí polypeptid, který obsahuje IL-18BP nebo virový IL-18BP nebo jeho mutein spojený s dalším proteinem, například takovým, který má schopnost déle přetrvávat v tělesných tekutinách. To znamená, že IL-18BP nebo virový IL-18BP může být spojen s jiným proteinem, polypeptidem a podobně, například s imunoglobulinem nebo jeho fragmentem.

Pod pojmem „funkční deriváty jsou zahrnuty deriváty IL-18BP nebo deriváty virového IL-18BP a muteiny a složené proteiny těchto látek, které je možno připravit při použití funkčních skupin na vedlejších řetězcích zbytků nebo pří použití N- nebo C-koncových skupin známým způsobem. Všechny tyto látky tvoří součást podstaty vynálezu, pokud jsou farmaceuticky přijatelné, to znamená, pokud nenarušují účinnost proteinu, jehož účinek je v podstatě obdobný účinku IL-18BP nebo účinku virového IL-18BP a pokud nejsou při použití ve farmaceutickém prostředku toxické. Takové deriváty mohou například zahrnovat vedlejší řetězce polyethylenglykolu, které mohou maskovat antigenní místa a prodlužují přítomnost IL-18BP nebo virového IL-18BP v tělesných tekutinách. Dalšími použitelnými deriváty jsou alifatické estery, vytvořené na karboxylových skupinách, amidy, vytvořené na karboxylových skupinách reakcí s amoniakem nebo s primárními nebo sekundárními aminy, N-acylové deriváty volných aminoskupin zbytků aminokyselin, vytvořené s acylovými zbytky, například alkanoylovými zbytky nebo aroylovými skupinami s uhlíkovým kruhem, nebo může jít o

O-acylové deriváty volných hydroxylových skupin, například v případě serylových nebo threonylových zbytků, vytvořené s použitím acylových skupin.

Pod pojmem „účinné frakce IL-18BP nebo vírového IL-18BP, muteinů a složených bílkovin se v průběhu přihlášky vynálezu rozumí jakýkoliv fragment nebo prekursor polypeptidového řetězce molekuly proteinu jako takové nebo spolu s přidruženými molekulami, například zbytky cukru nebo fosfátovými zbytky, nebo agregáty molekuly proteinu nebo zbytku cukru mezi sebou za předpokladu, že výsledná frakce má v podstatě obdobnou účinnost jako IL-18BP.

Podle dalšího výhodného provedení vynálezu může být inhibitorem IL-18 protilátka proti IL-18. Taková protilátka může být polyklonální nebo monoklonální, chimérní, humanizovaná nebo výlučně lidská. Rekombinantní protilátky a jejich fragmenty jsou charakterizovány vysokou afinitou vazby pro IL-18 in vivo a nízkou toxicitou. Protilátky, které je možno pro účely vynálezu využít, jsou charakterizovány svou schopností léčit nemocné po dobu dostatečně dlouhou pro dosažení dobré regrese chorobného stavu nebo alespoň dostatečné úlevy nebo potlačení příznaků nebo skupiny příznaků při nízké toxicitě.

Neutralizační protilátky je možno produkovat u různých živočichů, jako jsou králíci, kozy nebo myši tak, že se uskuteční imunizace IL-18. Imunizované myši jsou zvláště vhodným zdrojem B-buněk pro přípravu hybridomů, které se pak pěstují pro získání velkého množství monoklonálních protilátek proti IL-18.

Chimérní protilátky jsou molekuly imunoglobulinu, které jsou charakterizovány dvěma nebo větším počtem segmentů nebo části, odvozených od odlišných živočišných druhů. Obecně se variabilní oblast chimérní protilátky odvozuje ze savčí protilátky jiného než lidského původu, například z myší monoklonální protilátky a konstantní oblast se odvozuje od lidské molekuly imunoglobulinu.

S výhodou mají obě oblasti i jejich kombinace nízkou imunogenitu, jak je možno prokázat běžnými pokusy (24). Humanizované protilátky jsou molekuly imunoglobulinu, vytvořené genetickým inženýrstvím, v nichž jsou konstantní oblasti v myší protilátce nahrazeny částmi z lidské protilátky, přičemž jsou uchovány myší oblasti pro vazbu antigenu. Výsledná chimérní protilátka má s výhodou sníženou imunogenitu a zlepšené farmakokinetické vlastnosti u člověka (25).

Podle dalšího výhodného provedení je tedy protilátkou proti IL-18 humanizovaná protilátka proti IL-18. Výhodné příklady humanizovaných protilátek proti IL-18 byly popsány naříklad v dokumentu EP 974600. Podle ještě dalšího výhodného provedení jde o lidskou protilátku proti IL-18. Technologie produkce lidských protilátek je podrobně popsána například v dokumentech WO 00/76310, WO 99/53049, US 6162963 nebo AU 5336100. Lidské protilátky jsou s výhodou rekombinantní protilátky, produkované v transgenických zvířatech, například myších, přičemž tyto protilátky obsahují celý nebo částečný funkční lidský Ig.

Podle velmi výhodného provedení vynálezu je inhibitorem IL-18 protein IL-18BP nebo jeho isoforma, • ·

·· ·	•	• ·	• ·	• » ·
• ·	•	•	•	• 9 ·
•	• · · ·	•	•	9 9· ·
•	•	•	9	9 9 9
• · ·	• ·	• · ·	• 9 9	9 · 9 9··

mutein, složený protein, funkční derivát, účinná frakce nebo oběhově permutovaný derivát. Takové isoformy, muteiny, složené proteiny nebo funkční deriváty si uchovávají biologickou účinnost IL-18BP, zvláště pokud jde o vazbu na IL-18 a s výhodou mají v podstatě alespoň obdobnou účinnost jako IL-18BP. V ideálním případě mají takové proteiny biologickou účinnost, která je dokonce zvýšena ve srovnání s nemodifikovaným IL-18BP. Výhodné účinné frakce mají účinnost, která je lepší než účinnost IL-18BP nebo mají další výhody, například vyšší stálost nebo nižší toxicitu nebo imunogenitu nebo je možno snáze získat větší množství takových látek nebo se tyto látky snáze čistí.

Sekvence pro IL-18BP a jeho sestřihové varianty nebo isoformy je možno nalézt v dokumentu WO 99/09063 nebo z dalších publikací, například (12) nebo (23).

Funkční deriváty IL-18BP je možno konjugovat na polymery ke zlepšení vlastností proteinu, například ke zvýšení jeho stability, poločasu, biologické dostupnosti, tolerance lidským organismem nebo imunogenity. K dosažení tohoto cíle je možno IL-18BP navázat například na polyethylenglykol PEG. Tento postup je možno uskutečnit známým způsobem, popsaným například ve WO 92/13095.

Ve výhodném provedení vynálezu se tedy užívá polyethylenglykolovaný IL-18BP.

Podle dalšího výhodného provedení vynálezu je inhibitorem IL-18 složený protein, který obsahuje úplný protein pro vazbu IL-18 nebo jeho část, spojené s imunoglobulinem nebo jeho částí. Odborníkům bude zřejmé, • · • Φ · φφφφ že výsledný složený protein si uchová biologickou účinnost IL-18BP, zvláště schopnost vázat IL-18. Spojení proteinů může být přímé nebo přes krátký peptid jako linker. Tento peptid může mít pouze jeden až tři zbytky aminokyselin nebo může být delší a může obsahovat například 13 zbytků aminokyselin. Linkerem může být také tripeptid se sekvencí E-F-M (Glu-Phe-Met), nebo peptid se 13 zbytky aminokyselin se sekvencí Glu-Phe-Gly-Ala-GlyLeu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met, uložený mezi sekvencí IL-18BP a mezi sekvencí imunoglobulinu. Výsledný složený protein má zlepšené vlastnosti, například prodlouženou dobu pobytu v tělesných tekutinách (poločas), zvýšenou specifickou účinnost, vyšší úroveň exprese nebo může být usnadněno čištění složeného proteinu.

Ve výhodném provedení je IL-18BP spojen s konstantní oblastí molekuly imunoglobulinu lg. S výhodou je spojen s oblastmi těžkého řetězce, například s doménami CH2 a CH3 lidského IgGl. Tvorba specifického složeného proteinu, obsahujícího IL-18BP a část imunoglobulinu je popsána v příkladu 11 dokumentu WO 99/09063. Pro tvorbu složených proteinů podle vynálezu je možno použít také jiné isoformy molekul lg, například isoformy IgG2 nebo IgG₄ nebo jiné skupiny molekul lg, například IgM nebo IgA. Složené proteiny mohou být monomerní nebo multimerní, heteromultimerní nebo homomultimerní.

Je známo, že interferony mají inhibiční účinek na replikaci virů a na proliferaci buněk. Například interferon gamma hraje důležitou úlohu při vzniku imunitní odpovědi a zánětlivé odpovědi. Interferon beta (IFN-β, interferon typu I) hraje svou úlohu při protizánětlivých reakcích.

fc • · • · · fcfcfcfc

Vynález se týká také použití kombinace inhibitoru IL-18 a interferonu pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení atherosklerózy.

Interferony je možno konjugovat s polymery ke zlepšení stability proteinů. Konjugát interferonu beta a polyethylenglykolu PEG byl například popsán v dokumentu WO 99/55377.

Podle dalšího výhodného provedení vynálezu se jako interferon použije interferon beta, IFN-β a zvláště interferon IFN-β la.

Inhibitor produkce IL-18 a/nebo jeho účinku je možno použít současně, následně nebo odděleně vzhledem k použitému interferonu.

Podle dalšího možného provedení vynálezu se inhibitor IL-18 užije v kombinaci s antagonistou TNF. Látky, antagonizující TNF vykonávají svou účinnost v několika směrech. Především se antagonistické látky mohou vázat na molekulu TNF nebo ji sekvestrovat při vazbě s dostatečnou afinitou a specifičností, čímž dochází k částečné nebo podstatné neutralizaci epitopu nebo epitopu TNF, zodpovědných za vazbu, takové látky budou dále označovány jako sekvestrující antagonistické látky. Sekvestrující antagonistickou látkou může být například protilátka proti TNF.

Antagonista TNF může také vyvolávat inhibici signální dráhy TNF, aktivované receptorem na povrchu buněk po vazbě TNF (dále budou takové látky označovány jako látky, antagonizující signál). Obě skupiny antagonistů jsou použitelné jednotlivě nebo společně v kombinaci s inhibitorem IL-18 při léčení atherosklerózy.

Látky, antagonizující TNF je možno snadno identifikovat a vyhodnotit na jejich účinek na nativní TNF nebo na buněčné linie in vitro. K tomuto účelu je možno použít například lidské B-buňky, u nichž TNF vyvolává proliferaci a sekreci imunoglobulinu. Při zkoušce se používá TNF a různá ředění antagonistů, například v množství 0,1 až lOOnásobku molárního množství TNF, použitého při zkoušce, kontroly neobsahují TNF nebo obsahují pouze antagonistickou látku (26).

Sekvestrující antagonistické látky jsou výhodnými látkami pro použití pro účely vynálezu. Ze sekvestrujících antagonistů jsou výhodné zvláště polypeptidy, které jsou schopné se s vysokou afinitou vázat na TNF a současně mají nízkou imunogenitu. Zvláště výhodné jsou rozpustné molekuly, účinkující jako receptor TNF a neutralizační protilátky proti TNF. Pro účely vynálezu je možno využít například rozpustný TNF-RI a TNF-RII. Zvláště výhodné jsou zkrácené formy těchto receptorů, které obsahují extracelulární domény receptorů nebo jejich funkční části. Z těchto látek je možno uvést například zkrácený rozpustný receptor TNF typu I a typu II, tak jak jsou popsány v EP914431.

Zkrácené formy receptorů TNF jsou rozpustné a je možno je prokázat v moči a v krevním séru jako proteiny s molekulovou hmotností 30 000 a 40 000, schopné se vázat na TNF a tím vyvolat jeho inhibici. Tyto zkrácené formy byly označeny TBPI a TBPII (27). Podle vynálezu je možno * · • · · 0 ·

0 • 0 0 0 0 předpokládat současné, následné nebo oddělené použití inhibitoru IL-18 a antagonisty TNF a/nebo interferonu.

Pro použití pro účely vynálezu jsou v kombinaci s inhibitorem IL-18 výhodné zejména TBPI a TBPII jako látky, antagonizující TNF. Pro účely vynálezu je možno použít také deriváty, fragmenty, některé oblasti a biologicky účinné části receptorových molekul, které úplnou molekulu funkčně napodobují. Takovými biologicky účinnými ekvivalenty nebo deriváty molekul receptoru mohou byt části polypeptidů nebo části kódové sekvence pro molekulu receptoru při dostatečném rozměru a při schopnosti vázat TNF s takovou afinitou, aby došlo k inhibici nebo blokování interakce s receptorem TNF, vázaným na membrány.

Podle dalšího výhodného provedení se jako antagonizující látka využije rozpustný lidský TNF-RI (TBPI). Přírodní a rekombinantní molekuly rozpustného receptoru TNF a způsoby jejich výroby byly popsány v dokumentech EP 308378, EP 398327 a EP 433900.

Inhibitor IL-18 je možno užít současně, následně nebo odděleně vzhledem k inhibitoru TNF. S výhodou se užije směs protilátky nebo antiséra proti IL-18 a rozpustného receptoru TNF s inhibiční účinností proti TNF.

Podle dalšího výhodného provedení vynálezu obsahuje takto připravený farmaceutický prostředek ještě inhibitor COX, s výhodou inhibitor COX-2. Tyto inhibitory jsou známé, specifické inhibitory COX-2 jsou například popsány v dokumentu WO 01/00229.

• φ· ♦ 4 4 4 ·

4 ·

444 ·

4 4 4 4 4 4 • 44 44 444 444 44 4444

Pro léčení atherosklerózy jsou v současné době široce využívány inhibitory thromboxanu, zvláště thromboxanu A2. Podle dalšího výhodného provedení vynálezu tedy výsledný farmaceutický prostředek může dále obsahovat inhibitor thromboxanu, zvláště inhibitor thromboxanu A2 pro současné, následné nebo oddělené použití. Zvláště výhodnou látkou pro použití spolu s inhibitorem IL-18 je aspirin.

Jednou z příčin vzniku atherosklerózy je patrně vysoká koncentrace lipidů v krevním oběhu. Z tohoto důvodu může podle dalšího výhodného provedení výsledný farmaceutický prostředek dále obsahovat látku, snižující koncentraci tuků v krevním oběhu pro současné, následné nebo oddělené použití. K tomuto účelu je možno použít jakoukoliv známou látku, snižující koncentraci tuků. Z látek, snižujících koncentraci tuků, je možno uvést například cholestyramin, colestipol, kyselinu nikotinovou, gemfibrozil, probucol a podobně. Zvláště výhodné jsou inhibitory HMG CoA reduktázy a specificky tak zvané statiny. V oboru je známá celá řada statinů, například simvastatin nebo lovastatin.

Aby bylo možno ještě účinněji dosáhnout prevence a/nebo léčení atherosklerózy, předpokládá vynález použití inhibitoru IL-18 v kombinaci se stravou s nízkým obsahem tuků a/nebo nízkým obsahem cholesterolu a/nebo nízkým obsahem chloridu sodného.

Ve výhodném provedení vynálezu se inhibitor IL-18 užije v množství 0,0001 až 10 mg/kg tělesné hmotnosti nebo 0,1 až 5 mg/kg nebo 0,1 až 3 mg/kg nebo 1 až

4

44 ·· 94 • 9 4

9 · • · ·

4 4

9944 mg/kg. Podle dalšího výhodného provedení se inhibitor IL-18 použije v množství 0,1 až 1000 gg/kg tělesné hmotnosti nebo 1 až 100 pg/kg nebo 10 až 50 pg/kg.

Vynález se dále týká použití vektoru pro expresi, obsahujícího kódovou sekvenci pro inhibitor IL-18 pro výrobu farmaceutického prostředku pro prevenci a/nebo léčení atherosklerózy. S výhodou se pak dosahuje exprese inhibitoru IL-18 přímo v organismu, čímž dochází k účinnému blokování IL-18 přímo ve tkáních nebo v buňkách, v nichž dochází k onemocnění.

Jak bude dále podrobněji vysvětleno v příkladové části přihlášky, bylo prokázáno, že účinnou expresi IL-18BP je možno prokázat na myším modelu atherosklerózy po elektrotransferu vektoru pro expresi s obsahem kódové sekvence pro IL-18BP.

Ve výhodném provedení vynálezu se vektor pro expresi podává elektrotransferem, s výhodou nitrosvalově.

Použití vektoru pro indukci a/nebo zvýšení endogenní produkce inhibitoru IL-18 v buňce, u níž k takové expresi obvykle nedochází nebo u níž dochází k expresi příliš malého množství inhibitoru, je podle vynálezu rovněž možno předpokládat. Vektor může obsahovat řídící sekvence, které jsou funkční v buňkách, v nichž má být dosaženo exprese inhibitoru IL-18. Takové řídící sekvence mohou být promotory nebo zesilovače. Řídící sekvenci je pak možno uložit do správného místa genomu homologní rekombinaci a tak operativně vázat řídící sekvenci na gen jehož exprese má být dosaženo nebo jehož exprese má být zesílena. Technologie tohoto typu se obvykle označuje • * • 99 9

99 • · 9 • 9 9

9 9 «99 • 9 ·-♦» jako endogenní aktivace genu EGA a byla popsána v dokumentu WO 91/09955.

Odborníkům bude zřejmé, že je zásadně rovněž možné dosáhnout snížení exprese IL-18 při použití obdobné techniky, například při uložení negativně řídícího prvku do příslušného místa v genu pro IL-18, čímž se dosáhne snížení nebo prevence exprese IL-18. Je zřejmé, že tento postup, při němž dochází ke snížení nebo zástavě exprese IL-18, má tentýž účinek jako použití inhibitoru IL-18 pro prevenci a/nebo léčení choroby.

Vynález se dále týká použití buněk, které byly geneticky modifikovány tak, že u nich dochází k produkci inhibitoru IL-18 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení a/nebo prevenci atherosklerózy.

Vynález se dále týká farmaceutických prostředků, vhodných pro prevenci a/nebo léčení atherosklerózy. Tyto prostředky obsahují účinné množství inhibitoru IL-18 a účinné množství interferonu. Jako inhibitor IL-18 mohou tyto prostředky obsahovat inhibitory kaspázy-1, protilátky proti IL-18, protilátky proti kterékoliv podjednotce receptoru IL-18, inhibitory signální dráhy IL-18, látky, antagonizující IL-18 kompeticí s IL-18 a blokováním receptoru IL-18, proteiny, schopné se vázat na IL-18, jejich isoformy, muteiny, složené proteiny, funkční deriváty, účinné frakce nebo oběhově permutované deriváty se stejnou účinností.

Výhodnými účinnými složkami farmaceutických prostředků podle vynálezu jsou zvláště IL-18BP a jeho isoformy, muteiny, složené proteiny, funkční deriváty, • 9*

9» « · · 9 « ··» • 9

999 II • 9 1 »9

9 « 9 9 »9 * • 9 9 » 9 • 9 9 9 « 411 «9 <*·» účinné frakce nebo oběhově permutované deriváty, tak jak byly popsány svrchu.

Interferonem, obsaženým ve farmaceutickém prostředku podle vynálezu je s výhodou IFN-β.

Podle jiného výhodného provedení obsahuje farmaceutický prostředek účinné množství inhibitoru IL-18, popřípadě interferon a látku, antagonizující TNF. Látkou, antagonizující TNF může být protilátka, neutralizující účinnost TNF nebo rozpustné zkrácené fragmenty receptoru TNF, označované TBPI a TBPII. Farmaceutický prostředek podle vynálezu může dále obsahovat jeden nebo větší počet inhibitorů COX, s výhodou COX-2. Mimoto může farmaceutický prostředek podle vynálezu dále obsahovat inhibitor thromboxanu, například aspirin a/nebo látku, snižující koncentraci lipidů v krevním oběhu, například statin.

Pod pojmem „farmaceuticky přijatelný se rozumí jakýkoliv nosič, který neinterferuje s biologickým účinkem účinné složky a který není toxický pro nemocného. Například v případě parenterálního podání je možno účinné proteiny zpracovat na lékovou formu pro injekční podání v různých nosičích, například ve fyziologickém roztoku chloridu sodného, roztoku dextrózy, roztoku sérového albuminu nebo v Ringerově roztoku.

Účinné složky farmaceutického prostředku podle vynálezu je možno podávat různým způsobem. Předpokládá se možnost intradermálního, transdermálního (například se zpomaleným uvolňováním účinné látky), nitrosvalového, intraperitoneálního, nitrožilního, podkožního, « ·· ·· · * • · 1 • ··· · • · ··· t« w * «· • · « · 9 9> ί>

• · · · · • 9 9*9 9 • · · · · ··< »9t 99 9999 perorálního, epidurálního, místního podání a také podání nosní sliznicí. Je však možno použít i jiné účinné způsoby podávání, například vstřebávání epitheliálními nebo endotheliálními tkáněmi nebo při použití genu, při němž se kódová molekula DNA pro účinnou látku podává nemocným ve vektoru, při jehož expresi dochází ke vzniku účinné látky, která je pak vylučována in vivo. Mimoto je možno proteiny podle vynálezu podávat společně s dalšími složkami, jako jsou farmaceuticky přijatelná smáčedla, běžně užívané pomocné látky, ředidla a další nosná prostředí.

Pro parenterální podání, například pro nitrožilní, podkožní nebo nitrosvalové podání je možno účinné proteiny zpracovat na roztoky, suspenze, emulze nebo lyofilizované prášky spolu s farmaceuticky přijatelnými nosiči pro parenterální podání, jako jsou voda, fyziologický roztok chloridu sodného nebo roztok dextrózy. Prostředek může obsahovat další přísady, například přísady pro úpravu osmotického tlaku, jako mannitol nebo látky, zajišťující chemickou stabilitu, například konzervační prostředky a pufry. Farmaceutický prostředek je možno sterilizovat běžným způsobem.

Biologickou dostupnost účinných proteinů podle vynálezu je možno zlepšit použitím konjugačních postupů, které prodlužují poločas pobytu příslušné molekuly v lidském organismu. Je například možno molekulu vázat na polyethylenglykol, jak bylo popsáno ve zveřejněné PCT patentové přihlášce WO 92/13095.

Účinné množství proteinu nebo proteinů bude funkcí řady faktorů, rozhodující je například typ použité • · to · to · · ·· ·· · · ·· ·· · · ♦ ··· to · ·· * • ··· · · · · · · · • · · · · · · ··· ·· toéto ··· ·· ···· antagonizující látky, afinita antagonisty pro IL-18, jakákoliv cytotoxická účinnost antagonisty, způsob podání, klinický stav nemocného včetně nutnosti udržet netoxíckou úroveň endogenní účinnosti IL-18.

Pod pojmem „léčebně účinné množství se rozumí takové množství, při jehož použití dochází v případě inhibitoru IL-18 k inhibici biologické účinnosti IL-18. Podávaná dávka jednotlivě nebo rozděleně bude záviset na řadě faktorů, například na farmakokinetických vlastnostech inhibitoru IL-18, na způsobu podání, na celkovém stavu nemocného, na jeho pohlaví, věku, tělesné hmotnosti a podobně, na rozsahu příznaků, na dalším současném léčení a na požadovaném výsledku léčení. Konečnou dávku pro jednotlivého nemocného určí na základě pokusů in vitro a in vivo vždy ošetřující lékař.

Podle vynálezu se inhibitor IL-18 užije v množství 0,0001 až 10 mg/kg tělesné hmotnosti nebo 0,1 až 5 mg/kg nebo 0,1 až 3 mg/kg nebo 1 až 2 mg/kg. Podle dalšího výhodného provedení se inhibitor IL-18 použije v množství 0,1 až 1000 gg/kg tělesné hmotnosti nebo 1 až 100 μς/kg nebo 10 až 50 μς/kg.

Výhodným způsobem podání farmaceutického prostředku podle vynálezu je podkožní podání. Dalším výhodným způsobem podání je nitrosvalové podání.

Podle dalšího výhodného provedení vynálezu se inhibitor IL-18 podává denně nebo obden.

Denní dávka se obvykle podává rozděleně v několika jednotlivých dávkách nebo se farmaceutický prostředek upraví na formu s prodlouženým uvolňováním účinných látek pro dosažení požadovaných výsledků. Další dávky mohou být stejné jako první dávka, mohou však být také vyšší nebo nižší.

Podle vynálezu je možno inhibitor IL-18 podávat preventivně nebo k léčebným účelům před, současné s nebo po jiných účinných látkách v léčebně účinném množství. Účinné látky, které jsou podávány současně, je možno podávat ve stejném farmaceutickém prostředku nebo v odlišných prostředcích.

Farmaceutický prostředek podle vynálezu je tedy možno využít k léčení a/nebo prevenci atherosklerózy tak, že se pomocí tohoto prostředku podává účinné inhibiční množství inhibitoru IL-18.

Ke stejnému účelu se může podávat také farmaceutický prostředek, který obsahuje vektor pro expresi s obsahem kódové sekvence inhibitoru IL-18.

Podle výhodného provedení vynálezu se tento vektor pro expresi podává systemicky a s výhodou nitrosvalově.

Vynález se dále týká použití IL-18 jako diagnostického markéru pro nepříznivou klinickou prognózu srdečních chorob. Pod tímto pojmem se rozumí jakékoliv zhoršení celkového stavu nemocného, například opakující se záchvaty choroby po prvním infarktu myokardu včetně případného úmrtí.

S výhodou se IL-18 užije jako‘diagnostický markér pro opakující se záchvaty po první srdeční příhodě. Může • · ··· ·· ··· ··· ·· ···· jít například o opakované záchvaty ischemie, revaskularizaci, progresi atherosklerózy nebo nutnost opakované hospitalizace.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Materiály a metody

Vzorky

Bylo odebráno 41 lidských atherosklerotických plaků od 36 nemocných při endarterektomii krkávíc. Pro kontrolu byly použity dvě krkavice a tři tepny, zásobující mléčnou žlázu bez atherosklerózy (2 tepny s minimálním fibromuskulárním zesílením), kontrolní vzorky byly odebrány v průběhu chirurgického zákroku pro koronární bypass nebo při autopsii. Vzorky byly rychle ponořeny do kapalného dusíku a uchovávány při teplotě -80 °C. Plaky, které byly použity pro extrakci proteinu a RNA byly rychle omyty a ponořeny do kapalného dusíku a pak uloženy při -80 °C. Pro imunohistochemické sledování byly plaky uloženy na 2 hodiny do čerstvého 4% roztoku paraformaldehydu, pak byly přeneseny do 30% roztoku sacharózy-PBS a pak byly zmrazený na optimální teplotu pro provedení řezů v běžném prostředí (O.C.T. Compound, Miles Inc., Diagnostics Division) s kapalným dusíkem a uloženy při -80 °C pro příští řezy kryostatem. Z každého vzorku bylo pro histologickou analýzu a imunohistochemické studie získáno několik řezů s tloušťkou 8 až 10 pm.

• · ··· ·· 444 444 44 4444

Klasifikace nemocných

Aby bylo možno sledovat potenciální vztah mezi expresí IL-18/IL-18BP a známkami nestability plaků, byly odebrány klinické údaje od 23 nemocných (z 36 nemocných) při endarterektomii v průběhu května až srpna 2000. Chirurg uváděl přítomnost nebo nepřítomnost zvředovatělých plaků při makroskopickém sledování. To umožnilo klasifikovat plaky jako zvředovatělé nebo nezvředovatělé. Mimoto byli nemocní podle klinických příznaků rozděleni do dvou skupin. Nemocní s klinickými příznaky mozkového ischemického záchvatu v důsledku zúžení krkavice byli klasifikováni jako nemocní s příslušnými příznaky. U těchto nemocných byla provedena endarterektomie v průběhu 2 až 66 dnů (17,6 ± 5,3 dny) po nástupu klinických příznaků. Nemocní, u nichž nedošlo k příznakům mozkové ischemie v oblasti, zásobené krkavicemí byli klasifikováni jako nemocní bez příznaků. Zúžení krkavice bez příznaků bylo zjištění systematickým klinickým vyšetřením nemocných s koronárním nebo periferním onemocněním a závažnost onemocnění byla určena opakovaným vyšetřením ultrazvukem podle Dopplera tímtéž odborníkem. I když u nemocných bez příznaků nikdy nedošlo k ischemické příhodě v oblasti zásobení mozku zúženou krkavicí, byla endarterektomie u těchto nemocných velmi příznivá, jak je možno prokázat v příslušné studii ACAS (28) .

Analýza Western blot

Z 12 atherosklerotických plaků a 5 kontrolních normálních tepen byly extrahovány proteiny. Zmrazené • · • · « · · ·· ·

Q-7 · ♦·· ♦ · · · · · · □ / · · · · · · · ··· ·· ··· ··· ·· ···· vzorky byly pod kapalným dusíkem rozdrceny na prášek. Práškové materiály byly uvedeny do suspenze ve vychlzeném pufru pro rozrušení (20 mmol/1 Tris-HCl o pH 7,5, mmol/1 EGTA, 150 mmol/1 NaCl, 20 mmol/L glycerofosfátu, 10 mmol/1 NaF, 1 mmol/1 orthovanadičnanu sodného, % Triton X-100, 0,1 % Tween 20, 1 gg/ml aprotininu, mmol/1 PMSF, 0,5 mmol/1 N-tosyl-L-fenylalaninchlormethylketonu TPCK, 0,5 mmol/1 N(a)-p-tosyl-L-lysinchlormethylketonu TLCK), použije se 0,3 ml pufru na 10 mg vlhké hmotnosti prášku. Extrakty se ínkubují 15 minut v ledu a pak se 15 minut odstředí při 12 000 g a při teplotě 4 °C. Frakce supernatantu, rozpustné ve smáčedle se uchovají a stanoví se koncentrace proteinu ve vzorcích při použití zkušebního balíčku Bio-Rad.

Aby bylo možno uskutečnit zkoušky Western blot pro IL-18 a IL-18R, byly extrakty proteinu 5 minut povařeny a pak byly naneseny na 7,5% nebo 15% SDS-polyakrylamidový gel. V případě IL-18BP byl navázán rhIL-18, čištěný z E. Coli (Serono Pharmaceutical Research Institute,

Geneva) na Affligel 15 (Bíorad) v množství 1 mg/ml pryskyřice podle návodu výrobce. Extrakt proteinu (60 μς) byl inkubován přes noc při teplotě 4 °C spolu s 20 μΐ pryskyřice, 500 μΐ PBS obsahovalo 0,05 % Tween. Aby bylo možno odstranit jakoukoliv nespecifickou vazbu, byla pryskyřice odstředěna a promyta směsí 10 mM Tris pH 8,

140 mM NaCl, 0,5 % Tritonu X-100 (Fluka), 0,5 % deoxycholátu a pak směsí 50 mM Tris pH 8, 200 mM NaCl, 0,05 % TX100, 0,05 % nonidet P40 (Fluka), 2 mM CHAPS (Boehringer, Mannheim) a nakonec 50 mM Tris pH 8. Pak byla pryskyřice odstředěna, znovu uvedena do suspenze v tomtéž pufru za redukčních podmínek, povařena 5 minut a * · • · · · fcfc · * ♦· · • fcfc fc • fcfcfcfc fc • · · · · · · ··· ·« ··· fcfcfc fcfc fcfcfcfc nakonec nanesena na 10% SDS-polyakrylamidový gel NuPAGE (Invitrogen).

Vzorky byly elektroforeticky přeneseny z polyakrylamidového gelu na nitrocelulózu. Nitrocelulózové membrány byly syceny 2 hodiny při teplotě místnosti směsí TBST, obsahující 50 mmol/1 Tris-HCl o pH 7,5, 250 mmol/1 NaCl a 0,1 % Tween ve fyzilogickém roztoku chloridu sodného. Mimoto směs obsahovala 5 % odtučněného sušeného mléka. Membrány pak byly inkubovány s kozími polyklonálními protilátkami proti lidskému IL-18 a IL-18R (α-řetězec) v množství 1 pg/ml (R and D Systems), s myší monoklonální protilátkou proti lidskému IL-18 Mab 657,27 v množství 5 pg/ml (Corbaz a další, 2000, v rukopisu), s králičí polyklonální protilátkou proti lidské kaspáze-1 v množství 1 pg/ml (A-19, Santa Cruz). Specifičnost protilátky Mab 657,27 byla analyzována na stripované membráně kompeticí při použití 200násobného molárního přebytku rhIL-18BP-6his, čištěného z vaječníkových buněk čínského křečka (Serono Pharmaceutical Research

Institute), společná inkubace s Mab 657,27 při množství 5 gg/ml trvala 1 hodinu. Po inkubaci s odpovídajícími protilátkami, konjugovanými s HRP byly použity chemiluminiscenční substráty (ECL, Western blotting, Amersham Corp) ke zjištění pozitivních pásů podle návodu výrobce a tyto pásy pak byly vizualizovány po expozici Hyperfilm ECL (Amersham Corp).

Immunohistochemie

Zmrazené řezy ze 6 atherosklerotických plaků byly inkubovány s normálním koňským sérem nebo normálním kozím • · · • · fcfc fcfcfcfc sérem v poměru 1:10 celkem 30 minut pří teplotě místnosti, pak byly jednou omyty PBS a pak inkubovány pro identifikaci makrofágů s primární myší monoklonální protilátkou proti CD68 (DAKO-CD68, KP1) nebo s primární myší monoklonální protilátkou proti lidskému α-actinu z hladkého svalu (1A4, DAKO) pro identifikaci buněk hladkých svalů. Aby bylo možno identifikovat v atherosklerotickém plaku receptor IL-18 a molekulu IL-18, byly použity specifické kozí polyklonální protilátky (R and D Systems) v ředění 5 gg/ml. Molekula IL-18BP byla prokazována použitím specifické monoklonální protilátky proti rekombinantní lidské isoformě a IL-18BP (H20), (Corbaz a další, 2000 v rukopisu). Po promytí PBS byla podložní sklíčka inkubována s následujícími sekundárními biotinylovanými protilátkami: s biotinylovanou koňskou protilátkou proti myšímu IgG (Vector Laboratories, Inc) v ředění 1:200 pro detekci skvrn s protilátkami proti CD68, α-actinu z hladkých svalů a IL-18BP a s biotinylovaným koňským IgG proti kozím tkáním (Vector) v ředění 1:200 pro detekci protilátek proti IL-18 a proti receptorů IL-18. Příslušné zbarvení bylo zviditelněno při použití systému avidin-biotin HRP (Vectastain ABC balíček PK-6100 Vector). V případě negativních kontrol byly přilehlé úseky zbarveny irrelevantními protilátkami, odpovídajícími izotypu místo primárními protilátkami.

Příprava RNA

Celková RNA byla extrahována z 29 atherosklerotických plaků do okyseleného roztoku guanidiumthiokyanátu a pak extrahována fenolem a chloroformem metodou podle publikace Chomczynski a Sacchi (29). Čištěná RNA byla rozpuštěna ve vodě a koncentrace ·

• · ·

• · · · * ·«· ··· *· ···· byla určena absorbancí při 260 nm. Integrita RNA byla sledována elektroforézou na 1% agarózovém gelu. Pak byla syntetizována cDNA z jednoho mikrogramu celkové RNA při použití systému pro reverzní transkripci (Promega) podle návodu výrobce.

Semikvantitativní PCR a Real-time PCR lidského IL-18 a IL-18BP v lidských atherosklerotických plácích.

Semikvantitativní PCR byla provedena v celkovém objemu 10 μΐ v přítomnosti 1 U DNA-polymerázy AmpliTaq (Perkin Elmer, Roche, USA), 2,5 mM dNTPs (Amersham, USA) a 50 pmol přímých i reverzních PCR primerů. Reakční směs byla inkubována v zařízení pro teplotní změny PTC-200 Peltier Effect Thermal Cycler (MJ Research, USA) za následujících podmínek: denaturace 1 minuta při 94 °C, vazba 1 minuta při 55 °C a prodloužení 1 minuta při 72 °C. Aby bylo možno srovnávat množství PCR produktů v průběhu lineární fáze PCR reakce byly po 25, 28 a 31 cyklech izolovány a analyzovány IL-18BP, IL-18 a β-actin. Byl stanoven optimální počet cyklů pro IL-18BP, IL-18 a β-actin před nasycením pásů (31, 28 a 25) . PCR primery byly zkonstruovány na základě zveřejněných sekvencí (AF110799, D49950, X00351) následujícím způsobem:

IL-18 reverzní 5'-GCGTCACTACACTCAGCTAA-3', přímý 5'-GCCTAGAGGTATGGCTGTAA-3',

IL-18BP přímý 5'-ACCTGTCTACCTGGAGTGAA-3', reverzní 5'-GCACGAAGATAGGAAGTCTG-3' , β-actin, reverzní 5'-GGAGGAGCAATGATCTTGATCTTC-3', přímý 5'-GCTCACCATGGATGATGATATCGC-3'. Aby bylo možno vyloučit amplifikaci DNA genomu, kontaminující vzorky, byla PCR prováděna v nepřítomnosti matrice cDNA. Pak bylo • · · · μΐ produktu PCR analyzováno na 1% agarózovém gelu elektroforézou v lx TAE pufru. Velikost produktů PCR byla ověřena srovnáním se standardem o velikosti 1 kb (Gibco) po zbarvení gelů. Relativní kvantifikace pásů, zbarvených ethidiumbromidem, byla prováděna ve světle při použití analytického programu Kodak Digital Sciences a byla uváděna jako poměr cílového genu (hIL-18BP, hIL-18) ke genu pro hp-actin.

SYBR Green Reál Time PCR primery pro IL-18, IL-18BP a GAPDH (kontrola) byly konstruovány pomocí programu (Primer Express PE Biosystems) podle zveřejněných sekvencí (AF 110799, D 49950, NM 002046) následujícím způsobem: IL-18, reverzní 5'-CAGCCGCTTTAGCAGCCA-3' , přímý 5'-CAAGGAATTGTCTCCCAGTGC-3^ř ,

IL-18BP, reverzní 5'-AACCAGGCTTGAGCGTTCC-3', přímý 5'-TCCCATGTCTCTGCTCATTTAGTC-3' ,

GAPDH, reverzní 5'-GATGGGATTTCCATTGATGACA-3', přímý 5'-CCACCCATGGCAAATTCC-3', intron-GAPDH, reverzní 5'-CCTAGTCCCAGGGCTTTGATT-3', přímý 5'-CTGTGCTCCCACTCCTGATTTC-3'. Specifičnost a optimální koncentrace primeru byly podrobně sledovány. Potenciální kontaminace DNA genomu byla vyloučena tak, že PCR byla prováděna při použití specifických primerů intronu GAPDH. Nepřítomnost nespecifické amplifikace byla potvrzena analýzou produktů PCR na 3,5% agarozovém gelu pomocí elektroforézy. SYBR Green Real-Time PCR byla prováděna při použití 5 μΐ produktu RT na jedno vyhloubení, 0,5 mg celkové RNA v přítomnosti 25 μΐ SYBR Green PCR master mix/vyhloubení (PEBiosystem, CA, USA), s 0,5 jednotky AmpErase Uráčil N-Glycosylase (UNG)/vyhloubení a 20 μΐ primerů, 300 nM. PCR byla • · · prováděna 2 minuty při teplotě 50 °C (pro inkubaci prostředku AmpErase UNG k odstranění jakéhokoliv uracilu, zařazeného do cDNA, 10 minut při teplotě 95 °C pro aktivaci AmpliTaq Gold, pak bylo provedeno 40 cyklů 15 sekund při 95 °C a 1 minuta při 60 °C na zařízení ABI PRISM 7700 Detection System. Tímto způsobem byly amplifikovány vzorky cDNA po reverzní transkripci a byly stanoveny jejich prahové hodnoty pro cyklus Ct. Všechny hodnoty Ct byly upraveny s ohledem na kontrolní gen GAPDH. Při elektroforéze na gelu bylo možno pozorovat jediný specifický pás DNA pro IL-18, IL-18BP a GAPDH.

Princip detekce při použití SYBR Green PCR master mix je založen na přímé detekci produktu PCR měřením vzestupu fluorescence, které je způsobeno vazbou barviva SYBR Green na DNA s dvojitým řetězcem.

Statistická analýza

Údaje jsou vyjádřeny jako průměr ± SEM. Koncentrace IL-18 mezi jednotlivými skupinami byly srovnávány pomocí Mann-Whitneyova testu. Hodnota p 0,05 byla považována za statisticky významnou.

Příklad 1

Ochrana před uhynutím endothelíálních buněk působením oxidovaných lipoproteinů oxLDL pomocí inhibitorů IL-18

Pěstované endothelíální buňky lidské pupeční žíly (HUVEC) byly vystaveny na 16 hodin působení oxLDL v přítomnosti nebo nepřítomnosti proteinu, schopného vázat IL-18 nebo v přítomnosti nebo nepřítomnosti protilátky ··· · · · · · · • · · · ·· · · · ·· • · · · · · · · • · · · · · ···· · • · · · * · · ··· ·· ··· ··· ·· ···· proti IL-18. Jak je zřejmé z obr. 1, 83 % buněk HUVEC uhynulo po působeni oxLDL. Při současné inkubaci s IL-18BP nebo s protilátkou proti IL-18 bylo možno téměř všechny buňky zachránit. Žádné uhynutí nebylo možno pozorovat při působení IL-18BP, při použití protilátky proti IL-18 přežilo 89 % buněk.

Výsledky tohoto pokusu jasně prokazují ochranný účinek dvou odlišných inhibitorů IL-18 proti uhynutí buněk apoptózou v atherosklerotickém plaku.

Příklad 2

Exprese proteinu IL-18 a jeho endogenního inhibitoru IL-18BP v atherosklerotickém plaku

Zkoušky metodou Western blot byly provedeny na extraktech proteinů z 12 atherosklerotických krkavic a z 5 normálních kontrolních tepen. V atherosklerotických plácích docházelo k vysoké expresi proteinu IL-18 včetně jeho účinné formy, kdežto u normálních arterií bylo možno pozorovat jen malou expresi této látky nebo vůbec žádnou expresi (obr. 2). Dráhy 1 až 4 obsahují vzorky z atherosklerotických plaků, dráhy 5 až 7 vzorky z normálních arterií. Je zajímavé, že detekce účinné formy IL-18 je zřejmě v korelaci s expresí aktivní formy kaspázy-1, která se účastní zpracování IL-18 (obr. 2), čtvrtá dráha. U všech atherosklerotických plaků bylo možno pozorovat také významnou expresi receptorů IL-18, řetězce a ve srovnání s velmi nízkou úrovní exprese v normálních arteriích (obr. 2), druhá dráha. Mimoto docházelo u většiny atherosklerotických plaků k expresi IL-18BP, přestože úroveň této exprese byla heterogenní (obr. 2), první dráha.

··» · · · * · · • · « · · · · · · ·· ··· · · · · · • ···· · ···· · • · · · · · · ··· ·· ··· ··· ·· ····

Příklad 3

Buněčná lokalizace proteinu IL-18 a jeho endogenního inhibitoru IL-18BP v atherosklerotických plácích

Aby bylo možno určit buněčnou lokalizaci IL-18 a IL-18BP, byly provedeny imunohistochemické studie na 6 atherosklerotických plácích z krkavic. Jak je zřejmé z obr. 2, docházelo k expresi IL-18 převážně u makrofágů a tyto buňky byly pravděpodobně hlavním zdrojem IL-18 v plaku. Tyto oblasti byly také bohaté na CD3-pozitívní lymfocyty. Lymfocyty T se však pravděpodobně přímo neúčastní produkce IL-18. K expresi IL-18 docházelo také v některých buňkách hladkých svalů intimy a v endoteliálních buňkách. Naopak bylo možno pozorovat významnou expresi IL-18BP v endoteliálních buňkách malých cév plaků a v buňkách na povrchu průsvitu cévy, přestože tento jev nebylo možno pozorovat ve všech cévách. Mimoto bylo možno pozorovat nízkou a heterogenní expresi IL-18BP převážně extracelulárně v některých oblastech, bohatých na makrofágy.

Příklad 4

Exprese transkriptů mRNA pro IL-18 a IL-18BP v atherosklerotických plácích a vztah této exprese k nestabilitě plaků

Aby bylo možno určit, zda dochází v atherosklerotických plácích lidských krkavic k expresi mRNA pro IL-18 a IL-18BP, byla na 6 atherosklerotických plácích provedena semikvantitativní RT-PCR (obr. 3). Byla provedena detekce mRNA pro IL-18 a IL-18BP u všech atherosklerotických plaků, přestože množství mRNA pro ·· 44

4

4

4

4 4

4444

IL-18 a IL-18BP bylo heterogenní. Aby bylo možno přesně kvantitativně stanovit expresi mRNA pro IL-18 a IL-18BP, bylo dále analyzováno 23 atherosklerotických plaků při použití metody SYBR Green Real-Time PCR (obr. 4). Plaky byly analyzovány klinicky a patologicky jako plaky, které jsou bez příznaků (stálé) a plaky, které vyvolávají příznaky a jsou nestabilní. Mimoto bylo sledováno, zda jsou nebo nejsou plaky makroskopicky zvředovatělé. Klinické charakteristiky nemocných jsou shrnuty v tabulce 4. Procentuální snížení průměru krkavice na 60 až 95 % a rizikové faktory jako věk, onemocnění cukrovkou, hypercholesterolemie, zvýšený krevní tlak a kouření se mezi oběma skupinami nelišily.

Tabulka 4

Charakteristika nemocných

bez	příznaků	s příznaky
počet pac. 9	počet pac.1 14
věk 66,	9 ± 4,0	70,2 ± 3,9
pohlaví 8 mužů	9 mužů .
zvýšený krevní tlak1 2	8	9
hypercholesterolemie3	4	8
cukrovka	3	1
kuřáci	7	8
koronární onemocnění	5	4

¹nemocní s přechodnou nebo trvalou ischemickou mozkovou příhodou 2 až 66 dnů před endartrektomií ²počet nemocných s klinickou hypertenzí, léčených antihypertenzivními látkami ³počet nemocných s klinickou hypercholesterolemií, léčených látkami pro snížení koncentrace lipidů.

• · » φ

I · ··· · • t

9 9999

Bylo zjištěno, že množství IL-18 bylo podstatně vyšší u atherosklerotických plaků, které vyvolávaly příznaky ve srovnání s plaky, které příznaky nevyvolávaly, (2,03 ± 0,5 ve srovnání 0,67 ± 0,17). Výsledky jsou znázorněny na obr. 4A. Statistická analýza prokázala, že tento vzestup produkce IL-18, pozorovaný u plaků vyvolávajících příznaky, byl vysoce statisticky významný (p < 0,0074), kdežto zvýšené množství IL-18BP, pozorované u plaků, vyvolávajících příznaky ve srovnání s plaky, které příznaky nevyvolávaly, nebylo statisticky významné (4,64 ± 0,98 ve srovnání s 2,5 ± 0,92). Výsledky jsou znázorněny na obr. 4B. Jinak uvedeno, přestože obě skupiny měly pozitivní korelaci mezi mRNA pro IL-18 a IL-18BP, sklon křivky byl statisticky významně odlišný mezi oběma skupinami (skupina s projevy choroby: sklon 1,16 (0,19-2,14), r² = 0,36, skupina bez příznaků: sklon 4,7'9 (2,39-7,20), r² = 0,76, p<0,05). Z tohoto důvodu je pravděpodobné, že relativní zvýšení exprese IL-18BP u skupiny bez příznaků není dostatečné pro kompenzaci zvýšení exprese IL-18. Mimoto vzhledem k tomu, že přítomnost zvředovatění je považována za průkaz nestability plaků, byla provedena statistická analýza plaků bez vředů a s přítomností vředů a bylo prokázáno podstatné zvýšení IL-18 u plaků, které byly zvředovatělé (p<0,018). Výsledky jsou znázorněny na obr. 4C.

Uvedené údaje prokazují, že zvýšení exprese IL-18 v atherosklerotických plácích je v korelaci s nestabilitou těchto plaků.

Příklad 5

Modulace vývoje a stability atherosklerotických poškození působením IL-18BP na modelu in vivo ··

I · » · ··· ·

Metody

Charakteristika nemocných

Nemocným s akutním ischemickým koronárním syndromem (infarkt myokardu a angína) byly odebrány vzorky plasmy do 7 dnů po vzniku příznaků. Nestálá angína byla definována jako spojení typické bolesti na hrudi s ischemickými změnami na elektrokardiogramu nebo s přítomností onemocnění koronárních tepen. Infarkt myokardu byl diagnostikován podle typických ischemických změn na elektrokardiogramu spolu s významným zvýšením myokardiálních enzymů, kreatinfosfokinázy a troponinu I v krevním oběhu. Jako kontrola byly zařazeni neischemičtí nemocní, kteří byli zcela prostí příznaků ischemie. Byly stanoveny koncentrace IL-18 v krevní plasmě při použití běžně dodávaného zkušebního balíčku (MBL, Japonsko).

Intramuskulární elektrotransfer plasmidu pro expresi myšího IL-18BP in vivo myším samcům C57BL/6 apoE KO ve stáří 14 týdnů byly v intervalech 3 týdnů podány 3 injekce plasmidu pro expresi IL-18BP, pcDNA3-IL-18BP. Kontrolním myším (n=19) byl podán pouze prázdný plasmid. Isoforma d cDNA myšího IL-18BP, izolovaná svrchu popsaným způsobem (přírůstkové číslo Q9ZOM9) (23) byla subklonována v místě EcoRl/Notl v savčím vektoru pro expresi pcDNA3 pod řízením promotoru z cytomegaloviru (Invitrogen). Konstrukt, označovaný 334.yh je znázorněn na obr. 5. Kontrolní plasmid byl zkonstruován obdobně, avšak bez uvedené cDNA. Pak bylo 60 gg zkoumaného plasmidu nebo kontrolního plasmidu vstříknuto do obou tibiálních svalů anestetizovaných myší • 9 · 9

99 « 9 9 • 9 ·

9 9 9

9 9 »999 svrchu popsaným způsobem (13). Transkutánní elektrické pulzy (8 elektrických pulsů 200 V/cm v trvání 20 msec při 2 Hz se čtvercovým průběhem vln) byly aplikovány pomocí zařízení PS-15 (Genetronics, Francie) při použití dvou nerezových destičkových elektrod, uložených 4,2 až 5,3 mm od sebe na každé straně končetiny.

Elisa pro mIL-18BP

Plotny byly přes noc opatřeny povlakem čištěné polyklonální protilátky králíka proti r-mIL-18BPd (5 pg/vyhloubení). Rozpustný mIL-18BP byl prokazován při použití biotinylované králičí polyklonální protilátky v množství 0,3 pg/ml proti E. coli r-mIL-18BP (Peprotec) a pak peroxídázou extravidinu 1/1000 (Sigma). Zachycená králičí polyklonální protilátka byla sledována pomocí Western blot k potvrzení specifičnosti mIL-18BP. Jako standard byl použit rekombinantní mIL-18BPd, produkovaný buňkami HEK 293. Citlivost zkoušky ELISA byla 5 ng/ml.

Analýza myší

Kryostatické řezy v tloušťce 8 pm byly připraveny z aortálního oblouku a byly použity pro detekci ukládání lipidů při použití červeného barviva (Oil red), detekce kolagenu byla prováděna pomocí červeného barviva Sirius red, mimoto byla prováděna imunohistochemická analýza svrchu popsaným způsobem (13). Řezy byly barveny pomocí specifických primárních protilátek: makrofágy proti myším tkáním, klon M0MA2 (BioSource), anti-a-actin konjugovaný s alkalickou fosfatázou v případě hladkých svalových buněk a anti-CD3 pro T-lymfocyty (Dako), jak již bylo

99 • · • · · ·· « · • 9 · • 99» «

9 99

9 9 9

9 ·

• ·

999 999

9999 svrchu popsáno (13). Detekce uhynutí buněk byla prováděna při použití techniky TUNEL (13). CD3-pozitivní buňky byly mikroskopicky spočítány jako slepá zkouška.

Atherosklerotické plaky v aortálním oblouku a v oblastech, které byly pozitivně zbarveny na makrofágy, buňky hladkých svalů, kolagen nebo TUNEL byly měřeny při použití počítačového programu (NS15000, Microvision) jak již bylo svrchu popsáno (13). Specifičnost imunologického barvení byla stanovena srovnáváním s barvením obdobných imunoglobulinů neimunního isotypu. Specifičnost zkoušky TUNEL byla ověřena vynecháním terminální deoxynukleotidyl tranferázy enzymu. Hrudní aorty od odstupu levé podklíčkové tepny až k ledvinové tepně byly fixovány v 10% formaldehydu s přísadou pufru a barveny na ukládání tuků pomocí červeného barviva Oil red. Pak byly tepny podélně rozstřiženy a ukládání tuků bylo vypočítáno v procentech při použití počítačového programu (NS15000, Microvision).

Výsledky

V popsaných pokusech byla ověřována hypotéza, že regulace IL-18/IL-18BP hraje kritickou úlohu jak při vzniku atherosklerózy, tak pokud jde o stabilitu plaků. Byly měřeny koncentrace IL-18 u nemocných s akutním koronárním syndromem (30 mužů, 18 žen v průměrném věku 66,2 ±1,8, z nichž 14 trpělo nestabilní angínou a 34 infarktem myokardu) a u neischemických kontrolních nemocných na tomtéž oddělení (10 mužů, 3 ženy v průměrném věku 60,0 ±5,2 let). Koncentrace IL-18 v krevní plasmě byly statisticky významně vyšší u nemocných s akutními koronárními příznaky ve srovnání s kontrolami (146,9 ± 17,1 ve srovnání s 73,0 ± 12,2 pg/ml, p < 0,05), na • * · * 9 9 « ··· · « 99999 « 9 9 · < 9

444 99 999 «99 99 9999 rozdíl od těchto hodnot byly koncentrace IL-18BP v oběhu poněkud zvýšeny (20,1 ± 2,7 ve srovnání s 7,5 ± 2,5 ng/ml, p = 0,06). Mimoto byly koncentrace IL-18 v korelaci se závažností onemocnění vzhledem k tomu, že nejvyšší koncentrace bylo možno pozorovat u nemocných se závažnou ischemickou srdeční disfunkcí a s klinickými příznaky plicního otoku (224,03 ± 39,1 pg/ml, p < 0,001 při srovnání s kontrolami). Tyto výsledky, získané u nemocných s akutním srdečním onemocněním spolu s předchozím pozorováním, že koncentrace IL-18 je zvýšena u aterotických plaků nemocných po mrtvici (Mallat, 2001) prokazují důležitou úlohu regulace IL-18/IL-18BP při vývoji atherosklerózy.

Tato hypotéza byla dále zkoumána při použití apoE knockoutovaných myší (KO), u nichž se samovolně vyvíjejí athěrosklerotická poškození, obdobná poškozením u člověka. Myším samcům ve stáří 14 týdnů byl podán IL-18BP nitrosvalovým elektrotransferem in vivo, byl použit plasmid pro expresi kódové DNA pro myší IL-18BPd. 19 kontrolním zvířatům byl podán pouze prázdný plasmid. Elektrotransfer plasmidubyl opakován každé tři týdny, myši byly usmrceny ve stáří 23 týdnů po 9 týdnech trvání pokusu. Koncentrace myšího IL-18BP v krevní plasmě byly nižší než práh detekce 5 mg/ml u myší apoE KO, kterým byl vstřiknut prázdný plasmid. Avšak po jediné injekci plasmidu IL-18BP došlo k významnému zvýšení koncentrace IL-18BP v krevním oběhu, maximální koncentraci bylo možno prokázat 2 dny po injekci, 323,5 ± 100,9 ng/ml, po dvou týdnech byla koncentrace stále ještě 127,4 ± 35,4 mg/ml. Po devíti týdnech podávání IL-18BP nebo prázdného plasmidu byly koncentrace celkového cholesterolu 489,4 ± 34,6 ve srovnání s 480,8 + 36,3 mg/dl a koncentrace

lipoproteinu s vysokou hustotou byly 52,3 ± 9,4 ve srovnání s 48,8 ±5,1 mg/dl, to znamená, že mezi oběma skupinami nebyl v podstatě žádný rozdíl. Mírný, avšak statisticky významný vzestup hmotnosti zvířat bylo možno pozorovat u myší, jímž byl podáván plasmid pro IL-18BP ve srovnání s kontrolní skupinou, odpovídající hodnoty byly 31,8 ± 0,9 ve srovnání s 28,6 ± 0,8 g, p < 0,05.

Důsledky podávání IL-18BP u atherosklerotických poškození byly sledovány ve dvou odlišných lokalizacích. Na hrudním úseku aorty a v jejím oblouku. Hrudní aorta byla zvolena ke stanovení úlohy IL-18BP při vývoji míst s ukládáním tuků (atherogenese) vzhledem k tomu, že atherosklerotická poškození v tomto úseku se ve stáří 14 týdnů téměř nevyskytují, pak byla zahájena transfekce IL-18BP. V aortálním oblouku jsou obvykle atherosklerotické změny ve stáří 14 týdnů již přítomny (údaje nejsou uvedeny), oblouk byl tedy podroben zkouškám na složení plaků a jejich další vývoj, který je důležitý pro stabilitu plaku. Bylo prokázáno, že při léčení IL18BP u myší apoE KO došlo ke statisticky významnému ovlivnění atherosklerotických poškození, pokud jde o jejich vývoj a progresi. Při analýze hrudního úseku aorty bylo možno prokázat značné snížení ukládání tuků u myší, léčených plasmidem IL-18BP ve srovnání se stavem u myší, jímž byl podáván prázdný plasmid (obr. 6) . Kvantitativní počítačová analýza prokázala 69% snížení rozsahu atherosklerotických změn při p < 0,0001 (obr. 6), což prokazuje kritickou úlohu IL-18 při vzniku atherosklerózy. Mimoto léčení plasmidem IL-18BP po dobu pouze 9 týdnů statisticky významně omezilo progresi již vyvinutých atherosklerotických plaků v aortálním oblouku

(24% snížení rozměru plaků, p = 0,01) ve srovnání se stavem u myší, jimž byl podáván prázdný plasmid (obr. 7).

Velmi důležité je složení již vytvořených poškození, které určuje nestabilitu plaků, tento jev byl léčením pomocí IL-18BP podstatně ovlivněn. U atherosklerotických poškození myší, léčených plasmidem IL-18BP, došlo ke statisticky významné 50% redukci infiltrace makrofágy při p < 0,0001 (obr. 8), atherosklerotická poškození obsahovala o 67 % méně T-lymfocytů při p < 0,005 (obr.8), naopak došlo ke dvojnásobnému zvýšení počtu buněk hladkých svalů při p < 0,05 (obr. 9). Mimoto byly tyto důležité změny doprovázeny statisticky významným 85% zvýšením obsahu kolagenu při p < 0,0005, jak bylo prokázáno barvením červených barvivém Sirius red, mimoto došlo ke snížení celkového obsahu lipidů.

Z těchto výsledků je zřejmé, že při léčení IL-18BP dochází ke statisticky významnému zmírnění zánětlivých pochodů v atherosklerotických poškozeních a dochází k hojení, které se projevuje vznikem stabilních atherosklerotických plaků. Mimoto byla nejen snížena zánětlivá složka v atherosklerotických poškozeních u léčených myší, nýbrž došlo také k podstatně nižším hodnotám uhynutí buněk uvnitř plaků (2,9 ± 0,9 % u myší, léčených IL-18BP ve srovnání s 10,5 ± 3,6 % u kontrol při p < 0,05), takže se omezuje expanze a thrombogenita acelulárního lipidového jádra (Mallat, 1999).

Závěry

Při použití dobře propracovaného živočišného modelu atherosklerózy na myších, u nichž dochází ke vzniku poškození, obdobných poškození u člověka, bylo možno prokázat, že zásadní úlohu při řízení uvedených pochodů hrají IL-18 a IL-18BP pokud jde o vývoj, progresi a stabilitu atherosklerotických plaků. Při podávání IL-18BP dochází k prevenci vzniku časného poškození hrudní aorty a k inhibici účinnosti IL-18 a tím i k ovlivnění již vyvinutých poškození v aortálním oblouku, což znamená přesun ke stabilním plakům.

Klinická prognóza atherosklerotických nemocných závisí jen zčásti na rozměrech poškození. V současné době se uznává, že pro předpověď dalšího výskytu ischemických příhod je důležitější složení plaku než jeho rozměr. Závažné klinické projevy atherosklerózy, jako jsou infarkty srdeční a mozkové tkáně, jsou převážně vyvolány uzávěrem průsvitu cév thrombem, vytvořeným na rozrušeném atherosklerotickém plaku (19). Patologické studie prokázaly, že zranitelné nebo nestabilní plaky, které mohou prasknout nebo již praskly, jsou bohaté na zánětlivé buňky a dochází u nich., k významné ztrátě buněk hladkých svalů a ke snížení obsahu kolagenu (20, 21). Mimoto se v takových plácích statisticky významně zvyšuje množství apoptoticky uhynulých buněk, což vede ke tvorbě vysoce thrombogenního lipidového jádra (13, 22). Je nutno uvést, že všechny tyto znaky zvýšené nestability plaků byly podstatně zmírněny u myší, léčených IL-18BP, což také prokazuje, že IL-18 je hlavním určujícím faktorem nestability plaků.

Významnost výsledků, získaných u myší apoE KO pro hodnocení získaných poznatků pro lidské onemocnění je značná vzhledem k tomu, že u nemocných s akutním koronárním syndromem byla nalezena zvýšená koncentrace ·

IL-18 v krevním oběhu, zvýšený výskyt této látky byl prokázán také v případě nestabilních atherosklerotických plaků v krkavicích. Z výsledků je zřejmé, že inhibitory účinnosti IL-18 mohou být důležitými léčebnými látkami pro prevenci vzniku atherosklerotických plaků i pro léčení již vzniklých plaků a zejména k omezení vzniku komplikací.

Příklad 6

Zvýšená koncentrace IL-18 je v souladu s opakujícím se srdečním selháním nemocných

V krevním séru nemocných byla měřena koncentrace IL-18 zkouškou ELISA při použití protilátek, specifických proti IL-18.

Zkoušky byly prováděny u 56 ischemických nebo neischemických nemocných se srdečním selháním nebo bez těchto klinických projevů.

U nemocných, kteří později zemřeli byla koncentrace IL-18 216,0 ± 41,5 pg/ml ve srovnání s hodnotami 112,2 ± 12,2 pg/ml u nemocných, u nichž k úmrtí nedošlo při p=0,0018.

U nemocných s jakoukoliv opakující se příhodou, například s opakující se ischemii, revaskularizací, progresí atherosklerózy, nutností opakované hospitalizace pro srdeční selhání až smrtí bylo možno prokázat následující koncentrace IL-18: 165,8 ± 23,8 ve srovnání s hodnotami 107,7 ± 14,6 u nemocných bez opakovaných příhod při p = 0,03.

Tyto výsledky prokazují, že koncentrace IL-18 je statisticky významně zvýšena u nemocných s nepříznivou klinickou předpovědí, například s opakujícími se příhodami nebo dokonce smrtí.

V krevních vzorcích 16 neischemických nemocných se srdečními potížemi nebo bez nich byla měřena koncentrace IL-18. U těch nemocných, kteří později zemřeli, byla naměřena koncentrace 199,0 ± 34,8 pg/ml ve srovnání s hodnotami 95,3 ± 20,4 pg/ml u nemocných, kteří přežili při p = 0,09.

U nemocných bez opakujících se příhod byla koncentrace IL-18 146,6 ± 34,4 pg/ml ve srovnání s 95,4 ± 23,9 pg/ml u nemocných bez opakujících se příhod při p = 0,03. Přestože v tomto případě rozdíly v koncentraci nebyly statisticky významné vzhledem k malému počtu nemocných, je možno pozorovat stejný zřejmý trend.

U ischemických nemocných byla koncentrace IL-18 214,2 ± .45,9 pg/ml u nemocných, kteří zemřeli proti 118,4 ± 12,8 pg/ml u nemocných, kteří přežili, p = 0,007.

U nemocných, u nichž došlo k opakující se příhodě, byla koncentrace IL-18 162,8 ± 24,7 pg/ml proti 116,2 + 16,0 pg/ml u nemocných, u nichž k dalším příhodám nedošlo.

• · · · 0 0 0 0 • · * 0 00 00 0 0 0

0000 0 0 00 0 0

0 0 0 0 0

0 00 000 000 0 0 000 0

Literatura:

.1-, Ross R. Atherosclerosis-an infiammatory disease. N Engi J Med 1999;340:115-126.

2. van der Wal AC, Becker AE, van der Loos CM, Das PK. Sile of intimal rupture or erosion of thrombosed coronary atherosclerotic plaques is characíerized by an infiammatory process irrespective of the dominant plaque morphology. Circulation 1994;89:36-44.

3. Fuster V, Badimon L, Badimon JJ, Chesebro JH. The pathogenesis of coronary artery disease and the acute coronary syndromes (1). N Engi J Med 1992;326:242-250.

4. Fuster V, Badimon L, Badimon JJ, Chesebro JH. The pathogenesis of coronary artery disease and the acute coronary syndromes (2). N Engi J Med 1992;326:3 1 0-318.

5. Lee RT, Libby P. The unstable atheroma. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1997;17:1859-1867.

• 6. Ridker PM, Cushman M, Stampfer MJ, Tracy RP, Hennekens CH. Inflammation, aspirin, and the risk of cardiovascular disease in apparentiy healthy men.

N Engi J Med 1997;336:973-979.

7. Libby P. Molecular bases of the acute coronary syndromes. Circulation 1995;91:2844-2850.

8. Nakamura, K, Okamura, H, Nagata, K and Tamura, T. (1989). Infect. Immun. 57, 590-595.

9. Yoshímoto T, Takeda, K, Tanaka, T, Ohkusu, K, Kashiwamura, S, Okamura, H, Akira, S and Nakanishi, K (1998). J. Immunol. 161, 3400-3407.

10. Pamet, P, Garka, K E, Bonnert, T P, Dower, S K, and Sims, J E. (1996). J-.

Biol. Chem. 271, 3967-3970.

11. DiDonato, J A, Hayakawa, M, Rothwarf, D M, Zandi, E and Karin, M.

(1997). Nátuře 388, 16514-16517.

12. Novick, D, Kim, S-H, Fantuzzi, G, Reznikov, L, Dinarello, C, and Rubinstein, M (1999). Immunity 10, 127-136.

13. Mallat Z, Hugel B, Ohan J, Lesěche G, Freyssinet JM, Tedgui A. Shed membrane microparticles with procoagulant potential in human atherosclerotic plaques.

A role for apoptosis in plaque thrombogenicity. Circulation 1999;99:348-353.

fc ·

14. Tricot O, Mallat Z, Heymes C, Belmin J, Lesěche G, Tedgui A. Relation Between Endothelial Cell Apoptosis and Blood Flow Direction in Human Atheroscierotic Plaque.Circulation 2000;in press.

15. Dimmeler S, Haendeler J, Galle J, Zeiher AM. Oxidized low-density lipoprotein induces apoptosis of human endothelial celíš by activation of CPP32-like proteases. A mechanistic clue to the 'response to injury' hypothesis. Circulation 1997;95:1760-3.

16. Grantham, Science, Vol. 185, pp. 862-864 (1974).

17. Dimmeler S, Haendeler J, Galle J, Zeiher AM. Oxidized low-density lipoprotein induces apoptosis of human endothelial celíš by activation of CPP32-Iike proteases. A mechanistic clue to the 'response to injury' hypothesis. Circulation 1997;95:1760-3.

18. Mir LM, Bureau MF, Gehl J, Rangara R, Rouy D, Caiiiaud JM, Deliere P, Braneilec D, Schwartz B, Scherman D. High efficiency gene transfer into skeletal muscie mediated by electric pulses. Proč Nati Acad Sci USA 1999; 96:4262-7.

19. Lee, R.T. & Libby, P. The unstable atheroma. Arteríoscler Thromb Vasc 6/0/17,1859-1867(1997).

20. Davies, M.J. The composition of coronary-artery plaques [editorial; comment]. N Engl J Med 336,1312-1314 (1997).

21. Virmani, R., Kolodgie, F.D., Burke, A.P., Farb, A. & Schwartz, S.M. Lessons from sudden coronary death: a comprehensive morphological classification scheme for atheroscierotic lesions. Arteríoscler Thromb Vasc Biol 20,1262-1275. (2000).

22. Kolodgie, F.D. et al. Localization of apoptotic macrophages at the site of plaque rupture in sudden coronary death [In Process Citationj. Am J Pathol 157, 12591268 (2000).

23. Kim, S.H. et al. Structural requirements of six naturally occurring isoforms of the IL- 18 binding protein to inhibit IL-18. Proč Natí Acad Sci U S A 97, 1190-1195 (2000).

24. Elliott, M.J., Maini, R.N., Feldmann, M., Long-Fox, A., Charles, P., Biji, H., and Woody, J.N., 1994, Lancet 344, 1125-1127.

25. Knight DM, Trinh H, Le J, Siegei S, Shealy D, McDonough M, Scailon B, Moore MA, Viicek J, Daddona P, et ai. Construction and initial characterization of a mouse-human chimeric anti-TNF antibody.Moi Immunol 1993 Nov 30:16 1443-53 •4 44 : r .

4 4 « 4 ·

4· 4444

26. Tucci, A., James, H., Chicheportiche, R., Bonnefoy, J.Y., Dayer, J.M., and Zubler, R.H., 1992, J.lmmunol. 148,2778-2784.

27; Engelmann, H., D. Novick, and D. Wallach. 1990. Two tumor necrosis factor-binding proteins purified from human urine. Evidence for immunoiogical crossreactivity with cell surface tumor necrosis factor receptors. J. Biol. Chem. 265:15311536.

28. Moore WS, Barnett HJ, Beebe HG, et al. Guidelines for carotid endarterectomy. A multidisciplinary consensus statement from the Ad Hoc Committee, American Heart Association. Circulation 1995;91:566-79.

29. Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 1987;162:156-9.

Claims (32)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použití inhibitoru IL-18 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení a/nebo prevenci atherosklerózy.
2. 2. Použití inhibitoru IL-18 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení a/nebo prevenci trombózy na atherosklerotickém plaku.
3. 3. Použití inhibitoru IL-18 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení a/nebo prevenci zvředovatšní atherosklerotického plaku.
4. 4. Použití inhibitoru IL-18 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení a/nebo prevenci destabilizace atherosklerotického plaku.
5. 5. Použití inhibitoru IL-18 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení a/nebo prevenci ischemických syndromů, vyvolaných destabilizací plaku.
6. 6. Použití inhibitoru IL-18 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení a/nebo prevenci prasknutí atherosklerotického plaku.
7. 7. Použití inhibitoru IL-18 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení a/nebo prevenci opakujících se příhod srdečního selhání.
8. 8. Použití podle nároku 7, při němž srdečním selháním je ischemická srdeční příhoda.

   0· *0 ί · • 0
9. 9. Použití podle nároku 7, při němž srdečním selháním je neischemická srdeční příhoda.
10. 10. Použití podle některého z nároku 1 až 9, při němž se inhibitor IL-18 volí ze skupiny tvořené inhibitory ICE, protilátkami proti IL-18, protilátkami proti kterékoliv podskupině receptoru IL-18, inhibitorů signální dráhy receptoru IL-18, antagonistů IL-18, kteří jsou v kompetici s IL-18 a blokují receptor IL-18 a proteinů, schopných vázat IL-18, jejich isoforem, muteinů, složených proteinů, funkčních derivátů, účinných frakcí nebo oběhově permutovaných derivátů těchto látek.
11. 11. Použití podle nároku 10, při němž inhibitorem IL-18 je protilátka proti IL-18.
12. 12. Použití podle nároku 11, při němž je protilátkou humanisovaná protilátka.
13. 13. Použití podle nároku 11, při němž je protilátkou lidská protilátka.
14. 14. Použití podle nároku 10, při němž je inhibitorem účinnosti IL-18 protein IL-18BP nebo jeho isoforma, mutein, derivát nebo fragment.
15. 15. Použití podle některého z nároků 10 až 14, při němž je protein, schopný vázat IL-18 polyethylenglykolován.
16. 16. Použití podle některého z nároků 10 až 15, při němž je inhibitorem IL-18 složený protein, který obsahuje celý protein pro vazbu IL-18 nebo jeho část a celý • ·« * · *· ·· «·♦ · ·· ·· * « « ««· · · ·· · • «··» » » · · · 4 • 4 » « · · « ··· ·· ··· ·<· ·· ···· imunoglobulin nebo jeho část, přičemž složený protein je schopný se vázat na IL-18.
17. 17. Použití podle nároku 16, při němž složený protein obsahuje celou konstantní oblast imunoglobulinu nebo její část.
18. 18. Použití podle nároku 17, při němž imunoglobulin má isotyp IgGl nebo IgG2.
19. 19. Použití podle některého z nároků 1 až 18, při němž farmaceutický prostředek dále obsahuje interferon, určený pro současné, následné nebo oddělené použití.
20. 20. Použití podle nároku 19, při němž je interferonem interferon-β.
21. 21. Použití podle některého z nároků 1 až 20, při němž farmaceutický prostředek dále obsahuje látku, antagonizující faktor nekrózy nádorů, TNF pro současné, následné nebo oddělené použití.
22. 22. Použití podle nároku 21, při němž látkou antagonizující TNF je TBPI a/nebo TBPII.
23. 23. Použití podle některého z nároků 1 až 22, při němž farmaceutický prostředek dále obsahuje inhibitor COX pro současné, následné nebo oddělené použití.
24. 24. Použití podle nároku 23, při němž je inhibitorem COX inhibitor COX-2.

    ·* » » 0» ·· • ♦ ** ·♦ Λ * « » · · » * « * • · · · · · · a · «
25. 25. Použití podle některého z nároků 1 až 24, při němž farmaceutický prostředek dále obsahuje inhibitor thromboxanu pro současné, následné nebo oddělené použití.
26. 26. Použití podle nároku 25, při němž je inhibitorem thromboxanu aspirin.
27. 27. Použití podle některého z nároků 1 až 26, vyznačující se tím, že farmaceutický prostředek dále obsahuje látku, snižující koncentraci lipidů pro současné, následné nebo oddělené použití.
28. 28. Použití podle nároku 27, při němž látkou, snižující koncentraci lipidů je inhibitor HMG CoA.
29. 29. Použití podle nároku 28, při němž je inhibitorem HMG CoA statin.
30. 30. Použití podle některého z nároků 1 až 29, při němž se farmaceutický prostředek použije v kombinaci s dietou se sníženým obsahem tuků a/nebo cholesterolu a/nebo chloridu sodného.
31. 31. Použití podle některého z nároků 1 až 30, při němž se inhibitor IL-18 použije v množství 0,0001 až 10 mg/kg tělesné hmotnosti nebo v množství 0,01 až 5 mg/kg nebo v množství 0,1 až 3 mg/kg nebo v množství 1 až 2 mg/kg.
32. 32. Použití podle některého z nároků 1 až 31, při němž se inhibitor IL-18 užije v množství 0,1 až 1000 pg/kg tělesné hmotnosti nebo 1 až 100 pg/kg tělesné hmotnosti nebo 10 až 50 pg/kg tělesné hmotnosti.

    » ·

    33. se Použití podle některého z nároků 1 podává podkožně. až 32, při němž inhibitor IL-18 34 . Použití podle některého z nároků 1 až 32, při němž se inhibitor IL-18 podává nitrosvalové. 35. Použití podle některého z nároků 1 až 34, při němž se inhibitor IL-18 podává denně. 36. Použití podle některého z nároků 1 až 34, při němž se inhibitor IL-18 podává obden. 37 . Použití vektoru pro expresi, obsahujícího kódovou sekvenci pro inhibitor IL-18 pro výrobu farmaceutického

    prostředku pro léčení a/nebo prevenci atherosklerózy.

    38. Použití podle nároku 37, pří němž se vektor pro expresi podává pomocí elektrotransferu.

    39. Použití podle nároku 37 nebo 38, při němž se vektor pro expresi podává systemicky.

    40. Použití podle některého z nároků 37 až 39, při němž se vektor pro expresi podává nitrosvalové.

    41. Použití vektoru pro indukci a/nebo zesílení endogenní produkce inhibitoru IL-18 v buňce pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení a/nebo prevenci atherosklerózy.

    ··

    9 · ·

    9 9 · • * · • · · ·· ♦

    42. Použití geneticky modifikované buňky, produkující inhibitor IL-18 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení a/nebo prevenci atherosklerózy.

    43. Způsob léčení a/nebo prevence atherosklerózy, vyznačující se tím, že se podává účinné inhibiční množství inhibitoru IL-18.

    44. Způsob léčení a/nebo prevence atherosklerózy, vyznačující se tím, že se podává vektor pro expresi, obsahující kódovou sekvenci inhibitoru IL-18.

    45. Způsob podle nároku 44, vyznačující se tím, že se vektor pro expresi podává systemicky.

    46. Způsob podle nároku 44 nebo 45, vyznačující se tím, že se vektor pro expresi podává nitrosvalově.

    47. Použití IL-18 jako diagnostického markéru pro nepříznivou klinickou prognózu u srdečních příhod.

    48. Použití IL-18 jako diagnostického markéru pro opakování příhod po první srdeční příhodě.