PL209371B1 - Zastosowanie inhibitora IL-18, zastosowanie wektora ekspresyjnego zawierającego sekwencję kodującą inhibitor IL-18, zastosowanie genetycznie modyfikowanych komórek wytwarzających inhibitor IL-18 oraz zastosowanie IL-18 - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie inhibitora IL-18, zastosowanie wektora ekspresyjnego zawierającego sekwencję kodującą inhibitor IL-18, zastosowanie genetycznie modyfikowanych komórek wytwarzających inhibitor IL-18 oraz zastosowanie IL-18. Niniejszy wynalazek dotyczy chorób naczyniowych, a w szczególności leczenia i/lub zapobiegania miażdżycy tętnic.

Miażdżyca tętnic jest najpopularniejszą i najpoważniejszą z chorób naczyniowych, mimo że rozpoznanych jest także wiele innych chorób naczyniowych. Miażdżyca tętnic jest chorobą przede wszystkim atakującą tętnice średniej i dużej wielkości, a uszkodzenia obejmują powstanie pasm tłuszczowych, blaszki miażdżycowej oraz inne bardziej złożone uszkodzenia. Miażdżyca tętnic jest przewlekłą chorobą zapalną błon wewnętrznych tętnic, charakteryzującą się postępującym odkładaniem się lipidów, takich jak cholesterol, komórek, takich jak makrofagi, limfocyty T lub komórek mięśni gładkich oraz matrycy zewnątrzkomórkowej [1]. Większe nagromadzenia są określane jako ogniska miażdżycowe bądź blaszki miażdżycowe, które zazwyczaj zawierają wapń. Tkanka tłuszczowa może uszkadzać ścianę naczynia, zmniejszać jego elastyczność oraz zmieniać przepływ krwi. Ewentualnie, wokół osadzających się blaszek miażdżycowych mogą formować się zakrzepy oddziaływujące później z przepływającą krwią co może doprowadzić do całkowitej okluzji naczyń krwionośnych. Zazwyczaj, miażdżyca tętnic jest związana z podwyższonymi poziomami stężenia we krwi cholesterolu LDL, fibrynogenu Lp(a) oraz czynnika VII, jak też z obniżonym poziomem cholesterolu HDL. Czynniki ryzyka obejmują wiek, płeć, palenie papierosów, cukrzycę, otyłość, wysoki poziom cholesterolu, dietę wysokotłuszczową oraz posiadanie w rodzinie przypadków chorób serca. Jest to główną przyczyną niedokrwienia organów wewnętrznych, takiego jak na przykład niedokrwienie mięśnia sercowego.

Zakrzep zazwyczaj jest uszkodzeniem tętnic, które może ulegać dalszym komplikacjom prowadzącym do powstania zakrzepu z zatorami. Blaszki miażdżycowe zwężają zazwyczaj światło tętnic powodując niedokrwienie oraz czasami zanik tkanek w niedotlenionym obszarze. Poważne konsekwencje takiego stanu obejmują dusznicę bolesną wynikającą z niedokrwienia mięśnia sercowego, zawał serca wynikający z niedokrwistości bądź innych niezwiązanych przyczyn oraz nadciśnienie wynikające ze zwężenia tętnicy nerkowej i hipoperfuzji nerek, które fizjologicznie odpowiadają zwiększonym wydzielnictwem reniny.

Czasami, miażdżyca i stwardnienie są opisywane jako rozróżnialne oddzielne przypadki zmian patologicznych, i wówczas miażdżyca tętnic jest definiowana jako twardnienie oraz utrata elastyczności przez tętnice na skutek specyficznego ogniska miażdżycowego, podczas gdy stwardnienie miażdżycowe jest to stwardnienie oraz utrata elastyczności tętnic z wszelkich innych przyczyn.

Komplikacje i konsekwencje miażdżycy tętnic obejmują chorobę wieńcową (miażdżycę tętnic wieńcowych), niedobór w dostarczaniu krwi na skutek przeszkody (niedokrwienie/dusznica bolesna), ostre MI (zapalenie mięśnia sercowego, zawał serca), przejściowy atak niedokrwistości (TIA), bądź udar oraz zniszczenie naczyń krwionośnych, mięśni oraz innych narządów.

Tętniaki, które są permanentnymi anormalnymi dylatacjami naczyń krwionośnych są także jedną z powszechnych konsekwencji miażdżycy tętnic. U starszych pacjentów zazwyczaj powstają odmiażdżycowe tętniaki aorty brzusznej. Mogą one ulec pęknięciu do przestrzeni zaotrzewnowej. W przypadku tętniaków odmiażdżycowych obserwowana jest zazwyczaj wyraź na utrata tkanki sprężystej oraz zwłóknienie mięśniówki przede wszystkim na skutek niedokrwienia mięśni mięśniówki tętnicy, powodującego uwalnianie enzymów makrofagów wywołujących fragmentację włókien sprężystych.

Zalecenia w leczeniu i zapobieganiu miażdżycy tętnic obejmują obniżenie poziomu tłuszczu/cholesterolu we krwi. W szczególności, szeroko jest stosowane leczenie prowadzące do obniżenia poziomu cholesterolu LDL. Obecnie najpowszechniej wykorzystuje się specyficzne inhibitory reduktazy HMG-CoA. Inne obniżające poziom tłuszczu czynniki obejmują takie leki, jak cholestyramina, kolestypol, kwas nikotynowy, gemfibrozyl, probukol, lowastatynę oraz inne.

Innym podejściem jest zminimalizowanie ryzyka powstania zatorów w uszkodzonych naczyniach miażdżycowych. Do zredukowania ryzyka powstawania skrzepu może być także wykorzystana aspiryna, która wydaje się być specyficznym inhibitorem agregacji płytek krwi, w której pośredniczy tromboksan A2, bądź inne środki przeciwkrzepliwe.

Przezskórna angioplastyka balonikowa stosuje zakończony balonikiem cewnik w celu wyrównania płytki i zwiększenia przepływu krwi przez zwężenie w naczyniu. Technika ta jest podobna do techniki wykorzystywanej do otwierania tętnic serca, lecz może być stosowana do udrażniania licznych tętnic w innych częściach ciała. Zwężenia tętnicy wieńcowej są omijane przez wszycie fragmentów żyły

PL 209 371 B1 odpiszczelowej do bliższej aorty lub przez nacinanie wewnętrznej tętnicy piersiowej z klatki piersiowej i zespolenie jej dystalnego końca z tętnicą na przednim płacie serca.

W niektórych przypadkach może być zalecane chirurgiczne usunięcie złogów (endarterektomia, na przykład, endarterektomia tętnicy szyjnej).

Jednak, przede wszystkim zalecane jest stosowanie leczenia bądź kontroli czynników ryzyka, takie jak stosowanie niskotłuszczowej, ubogiej w cholesterol i sól diety popartej opieką medyczną dostarczającą zaleceń w leczeniu i kontroli nadciśnienia, cukrzycy oraz innych chorób, redukcja masy ciała, zaprzestanie palenia, jak też regularne ćwiczenia mające na celu poprawę kondycji serca i krążenia.

Stan zapalny towarzyszy różnym etapom miażdżycy tętnic [1]. Uszkodzenie śródbłonka będące wynikiem działania licznych czynników, takich jak niewielki ucisk, działanie zmodyfikowanych cząsteczek lipoprotein oraz zapalnych cytokinez jest pierwszym etapem miażdżycy tętnic i jest pod kontrolą stanów zapalnych [1]. Liczne z ostatnich badań ukazują że oddziaływania pomiędzy komórkami naczyniowymi a komórkami wywołującymi zapalenie są decydujące dla rozwoju miażdżycy tętnic [1]. W szczególności blokowanie zdefiniowanych szlaków zakażenia redukuje rozwój miażdżycy tętnic [1].

Zapalenie odgrywa także istotną rolę w pękaniu blaszki miażdżycowej oraz powstawaniu zakrzepicy [2-5] i dlatego też wywiera wpływ na występowanie zespołu ostrej niedokrwistości i związanej z tym umieralnoś ci [6]. W rzeczywistoś ci, ostre objawy kliniczne, takie jak zawał serca, niedokrwienie mózgu bądź innych organów zaatakowanych przez miażdżycę tętnic są przede wszystkim wynikiem zamykania światła naczynia poprzez skrzeplinę powstającą w kontakcie z uszkodzoną blaszką miażdżycową [3,4]. Badania patologiczne wskazują że naruszone lub niestabilne blaszki, tj. blaszki mające tendencję do pękania, bądź już pęknięte, znacznie się różnią zarówno budową komórki jak i składem płynu międzykomórkowego w porównaniu do stabilnych blaszek niewykazujących tendencji do pękania [7]. Liczne blaszki miażdżycowe są bogate w komórki zapalne (makrofagi oraz komórki T), zawierają tworzące skrzepliny jądro lipidowe i są otoczone poprzez włóknisty płaszcz tracący na masie w matrycy zewnątrzkomórkowej [7].

Zmniejszający się poziom syntezy kolagenu, czemu pośredniczą wywołujące stan zapalny cytokiny IFNy, oraz zwiększona aktywność niszczących macierz mataloproteinaz pochodzących z makrofagów, są odpowiedzialne za zmniejszanie grubości i kruszenie włóknistego płaszcza [7]. Pęknięcie kruchego włóknistego płaszcza odsłania łatwo tworzące skrzepliny jądro lipidowe na kontakt z krwią w krwioobiegu, co prowadzi do powstawania skrzepliny [1,7]. Dlatego też, gęstość komórek zapalnych w uszkodzonej miażdżyca tętnicy wydaje się być dobrym wskaźnikiem jej niestabilności.

Rokowanie kliniczne u pacjenta z miażdżycą tętnic jedynie w części zależy od rozmiaru skrzepliny [19,20]. Obecnie powszechnie wiadomo, że raczej jakość (skład blaszki), a nie wielkość skrzepliny, może być czynnikiem wskazującym na występowanie incydentów niedokrwiennych. W rzeczywistości poważne objawy kliniczne miażdżycy tętnic (zawał serca lub niedokrwienie mózgu) są przede wszystkim wynikiem zamknięcia światła naczynia poprzez skrzeplinę powstającą w miejscu, gdzie została uszkodzona blaszka miażdżycowa [19]. Badania patologiczne ukazują że naruszone lub niestabilne blaszki, tj. blaszki mające tendencję do pękania bądź też już pęknięte, są bogate w komórki zapalne i wykazują znaczną utratę komórek gładkich mięśni oraz zmniejszenie zawartości kolagenu [20,21]. Co więcej, blaszki takie wykazują zwiększoną zdolność apoptozy komórkowej prowadzącą do formowania się jądra lipidowego o wysokiej zdolności tworzenia skrzeplin [13,22].

W proces zapalny zaangażowane są pro-zapalne cytokiny. Cytokina, interleukina 18 (IL-18) była opisana początkowo jako czynnik indukujący interferon-γ (IFN-γ) [8]. Jest to wczesny sygnał w rozwijaniu odpowiedzi limfocytów-T pomocniczych typu 1 (Th1). IL-18 działa wspólnie z IL-12, IL-2, antygenami, mitogenami oraz potencjalnie z innymi czynnikami aby wywołać wytwarzanie IFN-γ. IL-18 wzmacnia wytwarzanie GM-CSF oraz IL-2, wzmaga proliferację komórek T wywołaną przez anty-CD3, oraz potęguje proces unicestwiania prowadzony przez komórki - naturalni zabójcy, któremu pośredniczy Fas. Dojrzały IL-18 jest wytwarzany ze swojego prekursora ll-1 β poprzez enzym konwertujący (ICE, kaspaza-1). Receptor IL-18 składa się z co najmniej dwóch składowych współpracujących w wiązaniu ligandu. Miejsca wiążące IL-18 o wysokim i niskim powinowactwie odnaleziono w komórkach stymulowanych mysim IL-12 T [9], co sugeruje występowanie wielołańcuchowego kompleksu receptorowego. Jak dotąd zidentyfikowano dwie podjednostki receptora, obie należące do grupy receptorów IL-1 [10]. Sygnał transdukcji IL-18 obejmuje aktywację NF-kB [11].

PL 209 371 B1

Ostatnio wyizolowano z ludzkiego moczu rozpuszczalne białko o silnym powinowactwie wobec IL-18 i sklonowano zarówno mysie jak i ludzkie cDNA [12; WO 99/09063]. Białko to oznaczono jako białko wiążące IL-18 (IL-18BP).

IL-18BP nie jest żadną z zewnątrzkomórkowych domen białkowych jakiegokolwiek ze znanych receptorów IL-18, a wydzielonym, naturalnie występującym w krwioobiegu białkiem. Należy ono do nowej rodziny wydzielonych białek zawierającej dodatkowo kilka białek kodowanych przez wirus ospy [12]. IL-18BP jest konstytutywnie poddawane ekspresji w śledzionie [12]. Zarówno IL-18BP z moczu jak i rekombinowane IL-18BP wiąże się specyficznie IL-18 z dużym powinowactwem i moduluje biologiczne właściwości IL-18.

Gen IL-18BP zlokalizowano w ludzkim chromosomie 11q13 i nie odnaleziono eksonu kodującego transmembranową domenę w 8,3 kb sekwencji genomu. U ludzi odkryto cztery warianty izoformy IL-18BP i oznaczono jako IL-18BP a, b, c, oraz d, wszystkie charakteryzujące się taką samą N-końcową grupą i różnymi grupami C-końcowymi [12].

Cztery ludzkie i dwie mysie izoformy IL-18BP uzyskane przez składanie mRNA i odnalezione w różnych bibliotekach cDNA poddano ekspresji, a następnie oczyszczono i oceniono ich aktywność biologiczną względem wiązania i neutralizacji IL-18 [23]. Izoforma a ludzkiego IL-18BP (IL-18BPa) wykazywała największe powinowactwo wobec IL-18, ze znaczną szybkością wiązania i wolną uwalniania, o stałej dysocjacji (K(d)) wynoszącej 399 pM. IL-18BPc powiela domenę Ig IL-18BPa za wyjątkiem 29 C-końcowych aminokwasów; stała K(d) IL-18BPc jest dziesięciokrotnie mniejsza (2,94 nM). Niemniej jednak, IL-18BPa oraz IL-18BPc neutralizują w dwukrotnym nadmiarze molowym IL-18 w > 95%. Izoforma IL-18BPd nie posiada całej domeny Ig oraz zdolności wiązania i neutralizacji IL-18. Mysie izoformy IL-18BPc oraz IL-18BPd posiadające identyczne domeny Ig także w > 95% neutralizują mysią IL-18 w dwukrotnym nadmiarze molarnym. Jednak, mysia IL-18BPd, która posiada identyczny C-końcowy motyw, co ludzki IL-18BPa także neutralizuje ludzki IL-18. Modelowanie molekularne zidentyfikowało liczne mieszane elektrostatyczne oraz hydrofobowe miejsca wiążące w domenie Ig IL-18BP, które to mogą być odpowiedzialne za wysokie powinowactwo wiążące ligand [23].

Niniejszy wynalazek jest oparty na ujawnieniu, że inhibitor IL-18 posiada wyraźnie korzystny wpływ na rozwój blaszki miażdżycowej, postęp blaszki i jej stabilność w mysim modelu miażdżycy tętnic. Inhibitor IL-18 nie tylko zapobiega formowaniu się uszkodzenia w tętnicy piersiowej, lecz także wywołuje przekształcenie w stabilną blaszkę fenotypu z już ustabilizowaną blaszką miażdżycową

Dlatego też, wynalazek dotyczy zastosowania inhibitora IL-18 do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania miażdżycy tętnic, przy czym inhibitor IL-18 jest wybrany z grupy składającej się z przeciwciał przeciwko IL-18, przeciwciał przeciwko dowolnej z podjednostek receptora IL-18 oraz białek wiążących IL-18 (IL-18BP), mutein IL-18BP obejmujących konserwatywne podstawienia aminokwasowe, białek fuzyjnych IL-18BP z regionami łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, IL-18BP modyfikowanych PEG, a muteina, białko fuzyjne lub IL-18BP modyfikowane PEG zachowuje aktywność biologiczną wiązania IL-18. Korzystnie lek otrzymany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest przeznaczony do leczenia i/lub zapobiegania zakrzepicy blaszki miażdżycowej, do leczenia i/lub zapobiegania owrzodzeniu blaszki miażdżycowej, do leczenia i/lub zapobiegania destabilizacji blaszki miażdżycowej, do leczenia i/lub zapobiegania objawom niedokrwienia wynikającego z destabilizacji blaszki lub do leczenia i/lub zapobiegania pękaniu blaszki miażdżycowej.

Korzystnie inhibitorem IL-18 stosowanym zgodnie z wynalazkiem jest przeciwciało przeciwko IL-18, korzystniej przeciwciało humanizowane, a najkorzystniej przeciwciało ludzkie.

Również korzystnie inhibitorem IL-18 jest IL-18BP, muteina IL-18BP obejmująca konserwatywne podstawienia aminokwasowe, białko fuzyjne IL-18BP z regionami łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, korzystniej immunoglobuliny izotypu IgG1 albo IgG2, lub IL-18BP modyfikowane PEG, przy czym muteina, białko fuzyjne lub IL-18BP modyfikowane PEG zachowuje aktywność biologiczną wiązania IL-18.

Lek otrzymywany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku korzystnie obejmuje ponadto inny czynnik do jednoczesnego, kolejnego albo oddzielnego zastosowania wybrany z grupy obejmującej interferon, np. interferon β, antagonistę czynnika martwicy nowotworu (TNF), np. TBPI i/lub TBPII, inhibitor-COX, np. inhibitor COX-2, inhibitor tromboksanu, np. aspirynę, czynnik zmniejszający stężenie lipidów, np. inhibitor HMG CoA, a korzystniej statynę.

Korzystnie lek otrzymywany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest stosowany w kombinacji z niskotł uszczową i/lub ubogą w cholesterol i/lub ubogą w sól diet ą.

PL 209 371 B1

Zgodnie z wynalazkiem inhibitor IL-18 jest korzystnie stosowany w ilościach od około 0,0001 do mg/kg wagi ciała, albo od około 0,01 do 5 mg/kg wagi ciała albo od około 0,1 do 3 mg/kg wagi ciała albo od około 1 do 2 mg/kg masy ciała, a korzystniej w ilości od około 0,1 do 1000 μg/kg wagi ciała albo od 1 do 100 μg/kg wagi ciała albo od około 10 do 50 μg/kg wagi ciała.

Korzystnie lek otrzymywany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest przeznaczony do podawania podskórnie lub domięśniowo, codziennie lub co drugi dzień.

Wynalazek dotyczy także terapii genowej. Zatem przedmiotem wynalazku jest zastosowanie wektora ekspresyjnego zawierającego sekwencję kodującą inhibitor IL-18 do wytwarzania leku do leczenia i/albo zapobiegania miażdżycy tętnic, przy czym inhibitor IL-18 jest wybrany z grupy składającej się z przeciwciał przeciwko IL-18, przeciwciał przeciwko dowolnej z podjednostek receptora IL-18 oraz IL-18BP, mutein IL-18BP obejmujących konserwatywne podstawienia aminokwasowe, białek fuzyjnych IL-18BP z regionami łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, IL-18BP modyfikowanych PEG, a muteina, białko fuzyjne lub IL-18BP modyfikowane PEG zachowuje aktywność biologiczną wiązania IL-18.

Zgodnie z zastosowaniem według wynalazku wektor ekspresyjny jest podawany przez elektrotransfer, korzystnie ogólnoustrojowo, a najkorzystniej domięśniowo.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie komórek genetycznie modyfikowanych tak, aby wytwarzały określony powyżej inhibitor IL-18 do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania miażdżycy tętnic.

Wynalazek dotyczy także zastosowania IL-18 jako markera diagnostycznego postępu miażdżycy tętnic.

Krótki opis figur

Figura 1 przedstawia histogram opisujący procent przeżycia ludzkich komórek śródbłonka żyły pępkowej po inkubacji z samymi utlenionymi lipoproteinami lub też po inkubacji z kombinacją utlenionych lipoprotein oraz odpowiednio przeciwciała IL-18 i IL18-BP.

Figura 2 przedstawia Western Biot przeprowadzony na ekstrakcie białek z tętnic objętych miażdżycą w porównaniu do tętnicy kontrolnej. W Western-Blottingu stosowano przeciwciała skierowane przeciwko IL-18BP (hIL18BP), podjednostce a receptora IL-18 (hIL18Ra), IL18 (hlL18) oraz kaspazie-1 (Kaspaza-1 p10).

Figura 3 przedstawia wybarwiony bromkiem etydyny żel agarozowy ukazujący wyniki analizy RT-PCR mRNA IL-18 oraz IL-18BP w komórkach blaszki miażdżycowej.

Figura 4 Reprezentatywne wyniki RT-PCR dla IL-18BP oraz IL-18 w blaszkach miażdżycowych w porównaniu do ekspresji ha-aktyny (kontroli) w objawowych i bezobjawowych blaszkach.

Figura 5 przedstawia mapę wektora ekspresyjnego wykorzystywanego do domięśniowego elektrotransferu u myszy.

Figura 6 przedstawia histogram obrazujący lipidowy wybarwiony obszar w objętych miażdżycą tętnicach. Wspomagana przez komputer ilościowa analiza obrazu rozmieszczenia lipidów. Dane reprezentują średnie wartości z s.e.m. (n=19 dla pustych plazmidów, n=14 dla plazmidu IL-18BP). Poczwórne gwiazdki oznacza P > 0,0001.

Figura 7 przedstawia histogram obrazujący uszkodzenie zatoki aortalnej po leczeniu IL-18BP w porównaniu z kontrolą (pusty plazmid). Wspomagana przez komputer ilościowa analiza obrazu uszkodzonego obszaru. Dane reprezentują średnie wartości z s.e.m. (n=19 dla pustych plazmidów, n=14 dla plazmidu IL-18BP). Podwójna gwiazdka oznacza P < 0,01.

Figura 8 przedstawia wpływ traktowania IL-18BP zawartość komórek zapalnych zmiany chorobowej. Wspomaganą przez komputer analizę ilościową obrazu wykorzystano w celu oznaczenia procentu obszaru dodatniego względem makrofagów (słupki czarne) oraz liczby infiltrujących limfocytów T na mm² (słupki szare) w uszkodzonej zatoce aortalnej kontrolnej (n=12 dla wybarwienia makrofagów, n=15 dla wybarwienia limfocytów T) lub leczonej IL-18BP myszy (n=13 dla makrofagów, n=12 dla limfocytów T). Dane reprezentują średnie wartości z s.e.m. Potrójne gwiazdki oznaczają P < 0,005; a poczwórne gwiazdki oznaczają P < 0,0001.

Figura 9 przedstawia wpływ leczenia IL-18BP na zmiany chorobowe komórek mięśni gładkich i zawartość kolagenu. Wspomaganą przez komputer analizę ilościową obrazu wykorzystano w celu oznaczenia procentu obszarów dodatnich względem komórek mięśni gładkich (czarne słupki) oraz obszarów akumulacji kolagenu (szare słupki) w zmianach chorobowych zatoki aortalnej u kontrolnych (n=6 dla komórek mięśni gładkich, n=11 dla kolagenu) oraz poddanych leczeniu IL-18BP myszy (n=6

PL 209 371 B1 dla komórek mięśni gładkich, n=13 dla kolagenu). Dane reprezentują średnie wartości z s.e.m. Pojedyncze gwiazdki oznaczają P < 0,05; a podwójne gwiazdki oznaczają P < 0,01.

Szczegółowy opis wynalazku

Wynalazek jest oparty o ujawnienie zwiększonych poziomów znajdującego się w krwioobiegu IL-18 u pacjentów z ostrymi objawami choroby wieńcowej oraz zwiększone wytwarzanie IL-18 przez odpowiedzialne za udar niestabilne blaszki miażdżycowe w tętnicach szyjnych. Dodatkowo, wykazano, że elektrotransfer in vivo ekspresyjnego plazmidu DNA kodującego IL-18BP zapobiega rozwojowi włókien tłuszczowych w tętnicy piersiowej oraz spowalnia postęp zaawansowanej blaszki miażdżycowej w zatoce aortalnej w przyjętym mysim modelu miażdżycy tętnic. Co ważniejsze, transfekcja plazmidu IL-18BP wywołuje poważne zmiany w składzie blaszki (maleje liczba makrofagów, komórek T, komórek ulegających śmierci komórkowej oraz zawartość lipidów oraz zwiększa się zawartość komórek mięśni gładkich oraz zawartość kolagenu) prowadzące do wytworzenia stabilnego fenotypu blaszki. Wyniki te prezentują po raz pierwszy niezwykle ważną rolę inhibitora IL-18 w redukcji rozwoju/postępowania blaszki oraz w propagacji stabilnej blaszki.

Tak, więc wynalazek dotyczy zastosowania inhibitora IL-18 do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania miażdżycy tętnic.

W kontekście niniejszego wynalazku termin „zapobieganie” odnosi się nie tylko do całkowitego zapobiegania określonym skutkom, lecz także do częściowego bądź znacznego zapobiegania, osłabiania, redukcji, obniżenia lub zmniejszenia skutków przed lub we wczesnym stadium choroby.

Termin „leczenie” w kontekście niniejszego wynalazku odnosi się do każdego korzystnego wpływu na rozwój choroby, obejmującego osłabienie, redukcję, obniżenie lub zmniejszenie patologicznego rozwoju po początku choroby.

Określenie „inhibitor IL-18” w kontekście niniejszego wynalazku odnosi się do dowolnej cząsteczki modulującej wytwarzanie i/lub działanie IL-18 w taki sposób, że wytwarzanie i/lub działanie IL-18 jest osłabione, zredukowane, lub częściowo, znacząco lub całkowicie zniesione lub zablokowane.

Inhibitor wytwarzania może być dowolną cząsteczką wpływającą negatywnie na syntezę, przetwarzanie i dojrzewanie IL-18. Rozważanymi inhibitorami według wynalazku mogą być, na przykład supresory ekspresji genu interleukiny IL-18, antysensowne mRNA redukujące lub zapobiegające transkrypcji IL-18 mRNA, bądź prowadzące do degradacji mRNA, białka osłabiające prawidłowe składanie, lub częściowo bądź znacząco zapobiegającymi dojrzewaniu i wydzielaniu IL-18, proteazy degradujące IL-18 po jego zsyntetyzowaniu i im podobne. Inhibitorem wytwarzania może być inhibitor kaspaza-1 lub inhibitor ICE, na przykład zapobiegający dojrzewaniu IL-18.

Inhibitor działania IL-18 może być, na przykład, antagonistą IL-18. Antagoniści mogą zarówno wiązać się albo sekwestrować same cząsteczki IL-18 z dostateczną specyficznością i powinowactwem, aby częściowo lub w sposób znaczący zneutralizować IL-18 lub miejsca wiążące IL-18 odpowiedzialne za wiązanie IL-18 do jego ligandu (przykładowo do receptorów). Antagonista może także blokować drogę sygnalizacji IL-18 aktywowaną przez komórki po związaniu się układu IL-18/receptor.

Inhibitorami działania IL-18 mogą być zarówno rozpuszczalne receptory IL-18, jak też cząsteczki naśladujące receptory, bądź czynniki blokujące receptory IL-18, przeciwciała IL-18, takie jak na przykład przeciwciała monoklonalne lub dowolne inne czynniki lub cząsteczki zapobiegające wiązaniu IL-18 do jego celu, zmniejszające i zapobiegające tym samym zachodzeniu wewnątrz i zewnątrzkomórkowych reakcji, w których pośredniczy IL-18.

Miażdżyca tętnic jest określana także mianem arteriosklerozy lub stwardnienia naczyń. W kontekście niniejszego wynalazku termin miażdżyca tętnic obejmuje wszelkie choroby lub stany chorobowe naczyń zazwyczaj opisywane jako miażdżyca tętnic, w których materiał tłuszczowy jest odkładany w ściankach naczyń , ewentualnie choroby wynikające z zawężenia i osłabienia przepływu krwi, jak też pęknięcia i/lub erozji związanej z formowaniem się zakrzepów.

Według niniejszego wynalazku miażdżyca tętnicza obejmuje zarówno stwardnienie jak i utratę elastyczności naczyń w wyniku miażdżycy (miażdżyca tętnic) oraz w wyniku innych przyczyn (stwardnienie tętnic). Zarówno warunki patologiczne towarzyszące miażdżycy tętnic, jak też komplikacje i konsekwencje miażdżycy tętnic, które w niniejszym użyciu obejmuje termin „miażdżyca tętnic” opisano szczegółowo w zamieszczonej powyżej części określonej jako „tło wynalazku”.

Postęp miażdżycy tętnic obejmuje formowanie się blaszki miażdżycowej oraz jej przekształcanie się w coraz to bardziej niestabilne formy. Tak, więc wynalazek dotyczy także zastosowania inhibitora IL-18 do wytwarzania leku mającego na celu zmniejszenie i przeciwdziałanie rozwojowi miażdżycy tętnic.

PL 209 371 B1

Okluzja naczyń przez skrzepy formujące się na blaszce miażdżycowej jest zjawiskiem poważnym w zawałach serca i udarach mózgu, które są najbardziej szkodliwymi konsekwencjami miażdżycy tętnic. Stąd też, wynalazek dotyczy także zastosowania inhibitora IL-18 do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania tworzeniu się skrzepów na blaszce miażdżycowej.

Stabilność blaszki wpływa na przekształcanie się blaszki miażdżycowej w szkodliwą i wrażliwą blaszkę, która posiada skłonności do inicjowania powstawania skrzepów. Tak więc wynalazek dotyczy ponadto zastosowania inhibitora IL-18 do wytwarzania leku do zapobiegania i/lub leczenia niestabilności blaszki miażdżycowej.

Niestabilna blaszka miażdżycowa jest podatna na pękanie, a pęknięta blaszka może wywołać powstanie skrzepu. Dlatego też niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania inhibitora IL-18 do wytwarzania leku do zapobiegania erozji i pękania blaszki miażdżycowej.

Niestabilność blaszki oraz zakrzepica mogą być wynikiem np. apoptozy komórek, która wiąże się z wysoką aktywnością prokoagulacyjną i może być zjawiskiem kluczowym prowadzącym zarówno do tworzenia się skrzepów i zerodowanych bądź popękanych blaszek miażdżycowych, jak też zjawiska zatorów [13,14]. Pokazano, iż utlenione lipoproteiny (oxLDL) wywołują apoptozę komórek makrofagów oraz śródbłonka w hodowli [15]. Jak pokazano w zamieszczonych niżej przykładach ujawniono teraz, że inhibitor IL-18 jest zdolny do znacznej redukcji liczby komórek ulegających śmierci komórkowej wywoływanej przez oxLDL.

Niniejszym ujawniano w sposób zaskakujący, że poziom IL-18 we krwi jest znacznie wyższy u pacjentów z niewydolnoś cią krążenia doś wiadczonych róż nymi nawracają cymi zdarzeniami takimi, jak np. śmierć, nawracająca niedokrwistość, rewaskularyzacja, rozwój miażdżycy tętnic bądź powtórna hospitalizacja po niewydolności krążenia w stosunku do pacjentów niepowracających do szpitala. Wzrost poziomu IL-18 był znacznie wyraźniejszy u pacjentów, u których wkrótce stwierdzono zgon w porównaniu do tych, którzy przeż yli. Podwyż szone poziomy IL-18 we krwi zaobserwowano zarówno w przypadku pacjentów z niedokrwistoś cią jak też u pacjentów niedotknię tych tą dolegliwoś cią .

W korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku inhibitor IL-18 jest wybrany z grupy skł adającej się z przeciwciał przeciwko IL-18, przeciwciał przeciwko dowolnej z podjednostek IL-18, białek wiążących IL-18 (IL-18BP), mutein IL-18BP obejmujących konserwatywne podstawienia aminokwasowe, białek fuzyjnych IL-18BP z regionami łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, IL-18BP modyfikowanych PEG, przy czym muteina, białko fuzyjne lub IL-18BP modyfikowane PEG zachowuje aktywność biologiczną wiązania IL-18.

Stosowane tu określenie „luteina” odnosi się do analogów IL-18BP, w których jedna lub więcej reszt aminokwasowych naturalnego IL-18BP została zastąpiona przez różne reszty aminokwasowe. Muteiny są wytwarzane dobrze znanym sposobem syntezy i/lub techniką ukierunkowanej miejscowo mutagenezy, bądź dowolną inną znaną odpowiednią techniką.

Korzystnie, każda z tych mutein posiada sekwencję aminokwasów dostatecznie powielającą sekwencję IL-18BP, tak aby posiadać zasadniczo podobną aktywność do IL-18BP. Jedną z aktywności IL-18 BP jest zdolność wiązania IL-18. Tak długo, jak muteina posiada zasadniczą zdolność wiązania IL-18 może być stosowana w procesie oczyszczania IL-18, takim jak oczyszczanie z zastosowaniem chromatografii powinowactwa i dlatego może być istotnym posiadanie zasadniczo podobnej aktywności, co IL-18BP. Dlatego też może być określone czy dowolna dana muteina posiada zasadniczo taką samą aktywność co IL-18BP poprzez przeprowadzenie rutynowych eksperymentów obejmujących zastosowanie takich mutein np. w prostym teście kanapkowym, takim jak test radioimmunologiczny ELISA w celu oznaczenia czy dana muteina wiąże się do odpowiedniego znakowanego IL-18.

Muteiny polipeptydów IL-18BP, które mogą być zastosowane zgodnie z niniejszym wynalazkiem, bądź też kwasy nukleinowe je kodujące, obejmują skończony zbiór zasadniczo zgodnych sekwencji jak podstawione białka lub polinukleotydy, które mogą być rutynowo otrzymane przez specjalistę w dziedzinie bez dodatkowych eksperymentów w oparciu o nauki i porady zaprezentowane w niniejszym wynalazku.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem korzystnymi zmianami mutein są te znane jako „konserwatywne” podstawienia. Konserwatywne podstawienia aminokwasów polipeptydów IL-18BP lub białek wirusowych IL-18BP mogą obejmować podstawienie synonimicznymi aminokwasami w obrębie grupy posiadającymi dostatecznie podobne właściwości fizykochemiczne, tak, że podstawienie pomiędzy elementami grupy będzie zachowywało biologiczną funkcję cząsteczki [16]. Jest bezsporne, że może również nastąpić insercja lub delecja aminokwasów w wymienionych powyżej sekwencjach bez zmiany ich funkcji, szczególnie, gdy insercja lub delecja obejmuje zaledwie kilka aminokwasów, np. poniżej

PL 209 371 B1 trzydziestu, korzystnie poniżej dziesięciu i nie usuwa i nie zmienia położenia aminokwasów istotnych dla funkcjonalnej konformacji, np. reszt cysteinowych. Białka i muteiny otrzymane przez taką delecję i/lub insercję są zgodne z rozwiązaniami według niniejszego wynalazku.

Korzystnie, grupy synonimicznych aminokwasów są takie, jak zdefiniowano w Tabeli I. Korzystniej, grupy równoznacznych aminokwasów są takie, jak zdefiniowano w Tabeli II; i najkorzystniej, grupy równoznacznych aminokwasów są takie, jak zdefiniowano w Tabeli III.

T a b e l a I

Korzystne grupy synonimicznych aminokwasów

Aminokwas Ser Arg Leu Pro Thr Ala Val Gly Ile Phe Tyr Cys His Gln Asn Lys Asp Glu Met Trp

Grupa aminokwasów synonimicznych Ser, Thr, Gly, Asn Arg, Gln, Lys, Glu, His Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu Gly, Ala, Thr, Pro Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr Gly, Thr, Pro, Ala Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val Ala, Thr, Pro, Ser, Gly Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr Ser, Thr, Cys Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln Gln, Asp, Ser, Asn Glu, Gln, His, Arg, Lys Glu, Asn, Asp Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu Phe, Ile, Val, Leu, Met Trp

T a b e l a II

Korzystniejsze grupy synonimicznych aminokwasów

Aminokwas Ser Arg Leu Pro Thr Ala Val Gly Ile Phe Tyr Cys His Gln Asn Lys Asp Glu Met Trp

Grupa aminokwasów synonimicznych Ser His, Lys, Arg Leu, Ile, Phe, Met Ala, Pro Thr Pro, Ala Val, Met, Ile Gly Ile, Met, Phe, Val, Leu Met, Phe, Val, Leu Phe, Tyr Cys, Ser His, Gln, Arg Glu, Gln, His Asp, Asn Lys, Arg Asp, Asn Glu, Gln Met, Phe, Ile, Val, Leu Trp

PL 209 371 B1

T a b e l a III

Najkorzystniejsze grupy synonimicznych aminokwasów Aminokwas Grupa aminokwasów synonimicznych

Ser

Arg

Leu

Pro

Thr

Ala

Val

Gly

Ile

Phe

Tyr

Cys

His

Gln

Asn

Ser

Arg

Leu, Ile, Met

Pro

Thr

Ala

Val

Gly

Ile, Met, Leu

Phe

Tyr

Cys, Ser

His

Gln

Asn

Lys

Asp

Glu

Met

Trp

Lys

Asp

Glu

Met, Ile, Leu Met

Przykłady substytucji aminokwasów w białkach, które mogą być zastosowane w celu uzyskania mutein polipeptydów bądź białek IL-18BP do zastosowania w niniejszym wynalazku obejmują dowolne znane sposoby, takie jak przedstawione w patentach USA 4959314, 4588585 oraz 4737462 Mark'a i wsp.; w 5116943 Koths'a i wsp., w 4965195 Namen'a i wsp.; 4879111 Chong'a i wsp.; i w 5017691 Lee i wsp; oraz podstawienie lizyny w białkach opisane w patencie USA Nr 4904584 (Show i wsp.).

Termin „białka fuzyjne” odnosi się do polipeptydów obejmujących IL-18BP połączonych z innym białkiem, które np. posiada wydłużony okres półtrwania w płynach ustrojowych. Tak, więc IL-18BP mogą być połączone z innym białkiem, polipeptydem i tym podobnymi, np. immunoglobinami bądź ich fragmentami.

„Funkcjonalne pochodne” jak użyto w niniejszym wynalazku obejmują pochodne IL-18BP zawierające wprowadzenie glikolu polietylenowego do łańcucha bocznego, który może zakrywać miejsca antygenowe i wydłużać obecność IL-18BP w płynach ustrojowych.

W bardziej korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku inhibitor IL-18 jest przeciwciałem IL-18. Przeciwciała anty-IL-18 mogą być przeciwciałami poliklonalnymi, monoklonalnymi, chimerycznymi, zhumanizowanymi lub całkowicie ludzkimi. Rekombinowane przeciwciała lub ich fragmenty charakteryzują się wysokim powinowactwem wiązania in vivo IL-18 oraz niską toksycznością. Przeciwciała, które mogą być zastosowane w niniejszym wynalazku charakteryzują się niską toksycznością oraz możliwością zastosowania w leczeniu pacjentów przez okres wystarczający do osiągnięcia od dobrej do doskonałej poprawy lub złagodzenia stanu patogenicznego lub dowolnego symptomu bądź grupy symptomów związanych ze stanem patogenicznym.

Przeciwciała neutralizujące są wywoływane u zwierząt takich jak króliki, kozy lub myszy przez immunizację IL-18. Immunizowane myszy są szczególnie użyteczne w dostarczaniu komórek B do wytwarzania hybrydom, które to są przekształcane w hodowle do wytwarzania znacznych ilości przeciwciał monoklonalnych anty-IL-18.

Przeciwciałami chimerycznymi są cząsteczki immunoglobulin charakteryzujące się dwoma lub więcej segmentami bądź partiami pochodzącymi od innych gatunków zwierząt. Zasadniczo, zmienny region przeciwciała chimerycznego pochodzi z przeciwciał ssaków innych niż ludzie, takich jak mysie przeciwciała monoklonalne, a stały region immunoglobuliny pochodzi z cząsteczki ludzkiej immunoglobuliny. Korzystnie, oba regiony i ich kombinacja posiadają jak rutynowo określono niską immunogenność [24]. Humanizowane przeciwciała są cząsteczkami immunoglobulin wytworzonymi technikami inżynierii genetycznej, w których stały mysi region jest zastąpiony ludzkim odpowiednikiem zachowującym

PL 209 371 B1 mysi region wiążący antygenu. Uzyskane chimeryczne mysio-ludzkie przeciwciało korzystnie posiada zmniejszoną immunogenność i zwiększoną farmokinetykę u ludzi [25].

Dlatego też, w bardziej korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku przeciwciało IL-18 jest humanizowanym przeciwciałem IL-18. Korzystne przykłady humanizowanych przeciwciał anty-IL-18 opisano na przykład w Europejskim Zgłoszeniu Patentowym EP 0 974 600.

W jeszcze korzystniejszym wykonaniu niniejszego wynalazku przeciwcia ło IL-18 jest całkowicie ludzkim przeciwciałem. Technologię wytwarzania ludzkich przeciwciał opisano szczegółowo np. WO00/76310, WO99/53049, US 6162963 lub Au 5336100. Całkowicie ludzkie przeciwciała korzystnie są rekombinowanymi przeciwciałami wytworzonymi przez zwierzęta transgeniczne, np. ksenomyszy, obejmującymi wszystkie części loci funkcjonalnego ludzkiego Ig.

W najkorzystniejszym wykonaniu niniejszego wynalazku, inhibitorem IL-18 jest IL-18BP, muteina IL-18BP obejmująca konserwatywne podstawienia aminokwasowe, białka fuzyjne IL-18BP z regionami łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, IL-18BP modyfikowane PEG. Te muteiny, białka fuzyjne lub funkcjonalne pochodne zachowują aktywność biologiczną IL-18BP, w szczególności zdolność wiązania IL-18 oraz korzystnie posiadają aktywność zasadniczo przynajmniej podobną do IL-18BP. Idealnie, białka takie posiadają aktywność biologiczną która jest nawet większa od aktywności niezmodyfikowanego IL-18BP.

Sekwencje IL-18BP oraz ich mieszane warianty/izoformy mogą być wzięte z WO99/09063 lub z [12] jak też z [23].

Funkcjonalne pochodne IL-18BP są przyłączone do polimerów w celu poprawy właściwości białka, takich jak jego stabilność, okres półtrwania, biodostępność, tolerancja przez ludzki organizm lub immunogenność. W celu osiągnięcia tego celu IL-18BP jest łączone np. z glikolem polietylenowym (PEG). Modyfikacja PEG może być prowadzona na przykład znanymi sposobami opisanymi w WO 92/13095.

Tak, więc w korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku IL-18BP jest modyfikowane PEG.

Wynalazek dotyczy także inhibitora IL-18 będącego białkiem fuzyjnym zawierającym białko wiążące IL-18, które jest połączone z częścią immunoglobuliny. Specjalista w dziedzinie zrozumie, że ostatecznie uzyskane białko zachowuje aktywność biologiczną IL-18BP, w szczególności wiązanie IL-18. Połączenie może być bezpośrednie, bądź poprzez krótki łączący peptyd (linker), który może być tak krótki jak 1-3 reszty aminokwasowe, lub dłuższy, na przykład 13 reszt aminokwasowych. Omawiany łącznik może być na przykład trójpeptydem o sekwencji E-F-M (Glu-Phe-Met) lub łącznikiem o 13 grupach aminokwasowych o sekwencji Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met umieszczonym pomiędzy sekwencją aminokwasów IL-18BP a sekwencją immunoglobuliny. Uzyskane białko fuzyjne charakteryzuje się poprawionymi właściwościami, takimi jak wydłużony czas trwania w płynach ustrojowych (okres półtrwania), zwiększona specyficzna aktywność, podwyższony poziom ekspresji lub ułatwiony jest proces oczyszczania białka fuzyjnego.

IL-18BP jest połączony do regionów łańcucha ciężkiego, na przykład domen CH2 i CH3 ludzkiego IgG1. Tworzenie specyficznych białek fuzyjnych zawierających IL-18BP oraz część immunoglobuliny opisano na przykład w przykładzie 11 WO 99/09063. Inne izoformy cząsteczek Ig, takie jak izoformy IgG2 czy IgG4, lub innych klas, takich jak IgM czy IgA są również odpowiednie do wytwarzania białek fuzyjnych według niniejszego wynalazku. Białka fuzyjne mogą być monomeryczne, multimeryczne, hetero- lub homomultimeryczne.

Interferony są znane przeważnie ze swego blokującego wpływu na replikację wirusa i proliferację komórek. Na przykład, interferon-γ odgrywa ważną rolę w wywoływaniu odpowiedzi immunologicznej i zapalnej. Przyjmuje się, że interferon β (IFN-β, interferon typu I) odgrywa rolę przeciwzapalną.

Niniejszy wynalazek dotyczy również zastosowania kombinacji inhibitora IL-18 i interferonu do wytwarzania leku do leczenia miażdżycy tętnic.

Interferony mogą być również przyłączone do polimerów w celu poprawy stabilności białek. Na przykład, połączenie interferonu β z alkoholem wielowodorotlenowym, takim jak glikol polietylenowy (PEG) było opisane w WO 99/55377.

W innym korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku interferon jest i interferonem β, a korzystniej interferonem β 1a.

Wytwarzanie i/lub działanie inhibitora IL-18 korzystnie jest prowadzone/stosowane jednocześnie, następczo lub oddzielnie z interferonem.

W jeszcze innym wykonaniu wynalazku, inhibitor IL-18 jest stosowany w połączeniu z antagonistą TNF. Antagoniści TNF wywierają swoją aktywność wieloma sposobami. Po pierwsze, antagoniści

PL 209 371 B1 mogą się wiązać albo sekwestrować cząsteczki TNF z dostatecznym powinowactwem i specyficznością, aby częściowo lub w sposób znaczący zneutralizować epitop lub epitopy TNF odpowiedzialne za wiązanie receptora TNF (określanych tutaj terminem „antagonistów sekwestrujących”). Antagonistą sekwestrującym może być, na przykład, przeciwciało działające przeciw TNF.

Alternatywnie, antagoniści TNF mogą hamować szlak sygnalizowania TNF aktywowany przez powierzchniowe receptory komórkowe po związaniu TNF (określane tutaj terminem „antagonistów sygnalizacyjnych”). Obie grupy antagonistów są użyteczne zarówno same, jak i razem, w kombinacji z inhibitorem IL-18 w leczeniu miażdżycy tętnic.

Antagoniści TNF są łatwo identyfikowani i oznaczani przez standardowe badania przesiewowe na wrażliwych liniach komórkowych in vitro, na przykład ludzkich komórek B, w których TNF powoduje proliferację i wydzielanie immunoglobulin. Test obejmuje preparat TNF przy różnych rozcieńczeniach kandydujących antagonistów np. od 0,1 do 100-krotnego w stosunku do molowej ilości TNF zastosowanej w teście oraz kontrole niezawierające TNF lub jedynie zawierające antagonistę [26].

Do zastosowania zgodnie z niniejszym wynalazkiem antagoniści sekwestrujący są korzystnie antagonistami TNF. Wśród antagonistów sekwestrujących preferowane są te polipeptydy, które wiążą TNF z dużym powinowactwem i posiadają niską immunogenność. Szczególnie korzystne są rozpuszczalne cząsteczki receptora TNF i przeciwciała zobojętniające TNF. Dla przykładu, użyteczne w niniejszym wynalazku są rozpuszczalne TNF-RI oraz TNF-RII. W szczególności korzystnymi antagonistami według niniejszego wynalazku są skrócone formy tych receptorów obejmujące zewnątrzkomórkowe domeny receptorów lub ich części funkcjonalnych. Skrócone rozpuszczalne receptory TNF typu I i typu II opisano na przykład w zgłoszeniu EP914431.

Skrócone formy receptorów TNF są rozpuszczalne i zostały oznaczone w moczu oraz osoczu jako białka wiążące inhibitor TNF o masie 30 kDa i 40 kDa, które nazwano odpowiednio TBPI oraz TBPII [27]. Ich jednoczesne, następcze oraz rozdzielne zastosowanie inhibitora IL-18 z antagonistą TNF i/lub interferonem zgodnie z niniejszym wynalazkiem jest korzystne.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem TBPI oraz TBPII są korzystnymi antagonistami TNF stosowanymi w połączeniu z inhibitorem IL-18. Pochodne, ich fragmenty, obszary i aktywne biologicznie porcje cząsteczek receptora są podobne do cząsteczek receptora także mogą być zastosowane w niniejszym wynalazku. Taki aktywny biologicznie odpowiednik lub pochodna cząsteczki receptora odnosi się do części polipeptydu, lub sekwencji kodującej cząsteczkę receptora, która jest wystarczających rozmiarów i jest zdolna do wiązania TNF z takim powinowactwem, że oddziaływanie ze związanym z błoną receptorem TNF jest inhibitowane lub zablokowane.

W jeszcze bardziej korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku ludzki rozpuszczalny TNF-RI (TBPI) jest antagonistą TNF do zastosowania według niniejszego wynalazku. Naturalne oraz rekombinowane cząsteczki rozpuszczalnych receptorów TNF oraz sposoby ich wytwarzania opisano w europejskich zgłoszeniach patentowych EP 308378, EP 398327 oraz EP 433900.

Inhibitor IL-18 może być stosowany jednocześnie, następczo lub oddzielnie z inhibitorem TNF. Korzystnie jest stosowane połączenie przeciwciała IL-18 lub surowicy odpornościowej i rozpuszczalnego receptora TNF posiadającego aktywność blokowania TNF.

W jeszcze bardziej korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku lek dodatkowo zawiera inhibitor COX, korzystnie inhibitor COX-2. Inhibitory COX są znane w dziedzinie. Specyficzne inhibitory COX-2 ujawniono na przykład w zgłoszeniu WO 01/00229.

Inhibitory tromboksanu, w szczególności tromboksanu A2 są obecnie powszechnie używane w leczeniu miażdżycy tętnic. Dlatego też, w jeszcze korzystniejszym wykonaniu wynalazku lek dodatkowo zawiera inhibitor tromboksanu, a w szczególności inhibitor tromboksanu A2 w celu jednoczesnego, następczego i oddzielnego zastosowania. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem szczególnie korzystnym jest użycie kombinacji inhibitora IL-18 i aspiryny.

Jednym z powodów powstawania miażdżycy tętnic wydaje się być wysokie stężenie lipidów we krwi. Dlatego też, w dalszym korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku lek ponadto zawiera czynnik zmniejszający stężenie lipidów do jednoczesnego, kolejnego bądź oddzielnego zastosowania. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem może być stosowany dowolny znany w dziedzinie czynnik zmniejszający stężenie lipidów we krwi. Dalsze czynniki obniżające poziom tłuszczu obejmują kolestyraminę, kolestypol, kwas nikotynowy, gemfibrozil, probukol oraz inne. Szczególnie korzystny jest inhibitor HMG CoA reduktazy, a korzystniej tak zwane statyny. Wiele statyn jest znanych w dziedzinie, takich jak symwastatyna lub lowastatyna.

PL 209 371 B1

Korzystne wykonanie niniejszego wynalazku w celu jeszcze lepszego zapobiegania i/lub leczenia miażdżycy tętnic, odnosi się do zastosowania inhibitora IL-18 w połączeniu z dietą niskotłuszczową i/lub dietą niskocholesterolową i/lub ubogą w sól.

W korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku inhibitor IL-18 jest stosowany w ilości około 0,0001 do 10 mg/kg masy ciała lub około 0,01 do 5 mg/kg masy ciała bądź około 0,1 do 3 mg/kg masy ciała czy około 1 do 2 mg/kg masy ciała. W jeszcze korzystniejszym wykonaniu inhibitor IL-18 jest używany w ilości około 0,1 do 1000 μg/kg masy ciała lub 1 do 100 μg/kg masy ciała bądź około 10 do 50 μg/kg masy ciała.

Niniejszy wynalazek dotyczy ponadto zastosowania wektora ekspresyjnego zawierającego sekwencją kodującą inhibitor IL-18 do wytwarzania leku do zapobiegania i/lub leczenia miażdżycy tętnic. Podejście terapii genowej jest też wykorzystywane do leczenia i/lub zapobiegania chorobie. Korzystnie, ekspresja inhibitora IL-18 będzie następowała in situ, blokując skutecznie w ten sposób Il-18 bezpośrednio w tkance(kach) lub komórkach dotkniętych chorobom.

Jak opisano szczegółowo w przykładach zamieszczonych poniżej wykazano, że wydajna ekspresja IL-18BP może być pokazana na mysim modelu choroby po elektrotransferze wektora ekspresyjnego zawierającego sekwencję kodującą IL-18BP.

Dlatego też, w korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku wektor ekspresyjny jest podawany poprzez elektrotransfer, korzystniej domięśniowo.

Zastosowanie wektora w celu wywołania i/lub wspomagania endogennego wytwarzania inhibitora IL-18 w komórkach normalnie niewykazujących ekspresji inhibitora IL-18, lub, w których ilości wyrażanego inhibitora są niewystarczające, są również rozważane zgodnie z wynalazkiem. Wektor może zawierać sekwencje kontrolne użyteczne w komórkach wymagających ekspresji inhibitora IL-18. Takie kontrolne sekwencje mogą być na przykład promotorami bądź wzmacniaczami. Kontrolne sekwencja może być wprowadzona do właściwego locus genomu poprzez rekombinację homologiczną funkcjonalnie łącząc sekwencje kontrolną z genem, dla którego pożądane jest wywołanie lub wzmocnienie ekspresji. Technologia ta jest zazwyczaj określana jako „endogenna aktywacja genowa” (EGA, ang. endogenous gem activation) i jest opisana w np. zgłoszeniu WO 91/09955.

Będzie to zrozumianym przez specjalistów w dziedzinie, że stosując tą samą technikę istnieje możliwość przerwania ekspresji IL-18, tj. poprzez wprowadzenie elementu wyciszacza, takiego jak np. element wyciszający, w locus genu IL-18 prowadząc tym samym do obniżenia lub uniemożliwienia ekspresji IL-18. Specjalista w dziedzinie zrozumie, że takie obniżenie lub wyciszenie ekspresji IL-18 wykazuje taki sam efekt jak zastosowanie inhibitora IL-18 do zapobiegania i/lub leczenia choroby.

Wynalazek ponadto dotyczy zastosowania zmodyfikowanych genetycznie komórek do wytwarzania inhibitora IL-18 do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania miażdżycy tętnic.

Kompozycje farmaceutyczne użyteczne w szczególności do zapobiegania i/lub leczenia miażdżycy tętnic, zawierają efektywne terapeutycznie dawki inhibitora IL-18 oraz efektywne terapeutycznie dawki interferonu. Jako inhibitor IL-18 kompozycja może zawierać przeciwciała przeciwko IL-18, przeciwciała przeciwko dowolnej z podjednostek receptora IL-18 oraz białka wiążące IL-18, muteiny IL-18BP obejmujące konserwatywne podstawienia aminokwasowe, białka fuzyjne IL-18BP z regionami łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, IL-18BP modyfikowane PEG, przy czym muteiny, białka fuzyjne lub IL-18BP modyfikowane PEG zachowują aktywność biologiczną wiązania IL-18.

IL-18BP, muteiny, białka fuzyjne, funkcjonalne pochodne jak opisano powyżej są korzystnymi składnikami aktywnymi kompozycji farmaceutycznych.

Interferonem zawartym w kompozycji farmaceutycznej jest korzystnie IFN-p. W jeszcze korzystniejszym wykonaniu kompozycja farmaceutyczna zawiera efektywne terapeutycznie dawki inhibitora IL-18, ewentualnie interferonu i antagonisty TNF. Antagoniści TNF mogą być przeciwciałami neutralizującymi aktywność TNF, lub rozpuszczalnymi skróconymi fragmentami receptora TNF, nazywanymi także TBPI i TBPII. Kompozycja farmaceutyczna może dodatkowo zawierać jeden lub więcej inhibitorów COX, korzystnie inhibitory COX-2. Dodatkowo, kompozycja farmaceutyczna może zawierać inhibitor tromboksanu, taki jak aspiryna i/lub czynnik zmniejszający stężenie tłuszczu taki jak statyna.

Definicja „dopuszczalny farmaceutycznie” obejmuje dowolny nośnik, który nie zakłóca efektywnie aktywności biologicznej składnika aktywnego i który nie jest toksyczny dla gospodarza, któremu jest podawany. Dla przykładu, do podawania pozajelitowego aktywne białko może być przygotowane w postaci jednostkowej dawki do iniekcji w nośnikach, takich jak roztwór soli, roztwór dekstrozy, albumina osocza krwi i roztwór Ringer'a.

PL 209 371 B1

Aktywne składniki kompozycji farmaceutycznej mogą być podawane osobnikom na rozmaite sposoby. Drogi podawania obejmują podawanie śródskórne, przezskórne, (np. wolno uwalniające preparaty), domięśniowe, śródotrzewnowe, dożylne, podskórne, doustne, nadtwardówkowe, miejscowe i donosowe. Dowolne inne efektywne terapeutycznie drogi podawania mogą być użyteczne, na przykład, absorpcja przez tkankę nabłonkową lub śródbłonkową lub na drodze terapii genowej, w której pacjentowi podawana jest czą steczka DNA kodująca czynnik aktywny (np. w postaci wektora), która dostarcza czynnika aktywnego na drodze ekspresji i wydzielania in vivo. Ponadto, zgodnie z niniejszym wynalazkiem biał ka mogą być podawane wraz z innymi skł adnikami czynników aktywnych biologicznie takimi jak dopuszczalne farmaceutycznie środki powierzchniowo czynne, zaróbki, nośniki, rozcieńczalniki oraz podłoża.

Do podawania pozajelitowego (np. dożylnego, podskórnego, domięśniowego) białka aktywne mogą być podawane jako roztwory, zawiesiny, emulsje bądź liofilizowany proszek w połączeniu dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem do podawania pozajelitowego (np. woda, roztwór soli, roztwór dekstrozy) oraz dodatkami zapewniającymi izotoniczność (np. mannitem) lub chemiczną stabilność (np. środkami ochronnymi i buforami).

Dostępność biologiczna aktywnego białka zgodnie z niniejszym wynalazkiem może być poprawiana przez zastosowanie procedur koniugacji, które zwiększają okres półtrwania cząsteczki w ludzkim organizmie, na przykł ad łączą c czą steczkę z polietylenoglikolem jak ujawniono w zgł oszeniu patentowym PCT WO 92/13095.

Skuteczne terapeutycznie dawki aktywnego białka zależą od wielu czynników, obejmujących typ antagonisty, powinowactwo antagonisty wobec IL-18, jakąkolwiek pozostałą aktywność cytotoksyczną wykazywaną przez antagonistów, drogę podawania, stan i cechy pacjenta (płeć, wiek, masa ciała, stan zdrowia, wielkość), zakres objawów, jednoczesne leczenie, częstotliwość leczenia i pożądany efekt. Zarówno regulacja jak i manipulacja ustalonych przedział ów dawek, jak też sposoby określania hamowania IL-18 u osobników in vivo i in vitro mieści się w zakresie umiejętności specjalistów w dziedzinie.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem inhibitor IL-18 jest stosowany w ilości około 0,0001 do 10 mg/kg masy ciała lub około 0,01 do 5 mg/kg masy ciała bądź około 0,01 do 5 mg/kg masy ciała lub około 0,1 do 3 mg/kg masy ciała bądź około 1 do 2 mg/kg masy ciała. Jeszcze korzystniej używana ilość inhibitora IL-18 jest ilością około 0,1 do 1000 μg/kg masy ciała lub 1 do 100 μg/kg masy ciała bądź około 10 do 50 μg/kg masy ciała.

Drogą podawania, która jest korzystna zgodnie z niniejszym wynalazkiem jest droga podawania podskórnego. Zgodnie z wynalazkiem podawanie domięśniowe jest jeszcze korzystniejsze.

W jeszcze korzystniejszym wykonaniu inhibitor IL-18 jest podawany codziennie lub co drugi dzień.

Dzienne dawki są zazwyczaj podawane w dawkach dzielonych lub w postaci o przedłożonym uwalnianiu skutecznych w uzyskiwaniu pożądanych rezultatów. Za drugim lub kolejnym razem podawania podawana dawka może być taka sama, mniejsza lub większa niż pierwsza lub poprzednia dawka podawana pacjentowi. Pierwsza lub kolejne dawki mogą być podawane przed początkiem lub podczas choroby.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem inhibitor IL-18 może być podawany w skutecznych terapeutycznie dawkach zapobiegawczo lub leczniczo pacjentowi przed, podczas lub następczo z innymi reżimami leczenia i czynnikami (np. w trybie wielolekowym). Aktywne czynniki podawane jednocześnie z innymi czynnikami leczniczymi mogą być podawane w tej samej, jak i różnych kompozycjach.

Niniejszym opisano sposoby leczenia i/lub zapobiegania miażdżycy tętnic obejmujące podawanie wymagającemu tego gospodarzowi skutecznej hamującej dawki inhibitora IL-18 i podawanie wymagającemu tego gospodarzowi wektora ekspresyjnego zawierającego sekwencję kodującą inhibitor IL-18.

Wektor ekspresyjny może być podawany ogólnoustrojowo, a korzystniej, na drodze wstrzyknięcia domięśniowego.

Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania IL-18 jako markera diagnostycznego postępu miażdżycy tętnic.

Posiadając opisany wynalazek będzie łatwiejszym do zrozumienia poprzez odniesienie się do następujących przykładów.

PL 209 371 B1

Przykłady

Materiały i sposoby

Próbki

Zebrano czterdzieści jeden ludzkich blaszek miażdżycowych pochodzących od 36 pacjentów poddanych endarterektomii tętnicy szyjnej. Jako kontrolę pobrano bądź w czasie autopsji, bądź w czasie operacji wszczepienia pomostów wieńcowych 2 tętnice szyjne i 3 wewnętrzne tętnice piersiowe wolne od zmian miażdżycowych (2 z niewielkim zgrubieniami fibromuskularnymi). Tętnice bardzo szybko zanurzono w ciekłym azocie i przechowywano w temperaturze -80°C. Blaszki, które wykorzystano do ekstrakcji białka oraz RNA bardzo szybko przemyto, zanurzono w ciekłym azocie przed umieszczeniem w -80°C. Do badań immunohistochemicznych blaszki umieszczono na dwie godziny w świeżo przygotowanym 4% roztworze paraformaldehydu, a następnie przeniesiono do 30% roztworu sacharozy w PBS, po czym gwałtownie zamrożono w optymalnej temperaturze w środowisku do obróbki tkankowej (O.C.T. Compound Miles Inc, Diagnostic Division) ciekłym azotem oraz przechowywano do podzielenia na skrawki kriostatyczne. Do badań histologicznych oraz immunohistochemicznych z każdej próbki otrzymano liczne skrawki o wielkości od 8 do 10 μm.

Klasyfikacja pacjentów

W celu przeprowadzenia badań potencjalnego związku pomiędzy ekspresją IL-18/IL-18BP oraz oznaką niestabilności blaszki zebrano w ślepej i potencjalnej próbie dane kliniczne kolejno od 23 pacjentów (z wybranych 36) przechodzących zabieg endarterektomii pomiędzy majem i sierpniem 2000 roku. O obecności bądź brak wrzodu wewnątrz blaszki w badaniach makroskopowych systematycznie donosił chirurg, który przeprowadzał zabieg endarterektomii. To umożliwiło sklasyfikowanie blaszek jako owrzodziałe lub nieowrzodziałe blaszki. Ponadto, pacjentów sklasyfikowano na podstawie objawów klinicznych na dwie rozdzielne grupy. Jako objawowych sklasyfikowano pacjentów z objawami klinicznymi ataku niedokrwienia mózgu związanego z zwężeniem ujścia tętnic szyjnej. Endarterektomię przeprowadzono w ciągu 2 - 66 dni (17,6 ± 5,3 dnia) od pojawienia się objawów klinicznych u tych pacjentów. Pacjentów, u których nigdy nie zaobserwowano objawów niedokrwienia mózgu na obszarze tętnicy szyjnej sklasyfikowano jako bezobjawowych. Bezobjawowe zwężenie tętnicy szyjnej stwierdzono na podstawie systematycznych badań klinicznych pacjentów z chorobą wieńcową oraz chorobą obwodową, a ostrość tych chorób określono wykorzystując ultrasonograf Dopplera obsługiwany przez doświadczonego ultrasonografistę. Niezależnie od tego, że u bezobjawowych pacjentów nigdy nie zaobserwowano zjawiska niedokrwienia w obrębie zwężenia tętnicy szyjnej wykazano, że endarterektomia tętnicy szyjnej jest korzystna u tych pacjentów, jak opisano przez naukowców w badaniu Asymptomatic Carotid Atherosclerosis Study (ACAS) [28].

Analiza Western blot

Białka ekstrahowano z 12 blaszek miażdżycowych i 5 kontrolnych tętnic niedotkniętych chorobą. Zamrożone próbki sproszkowano ciekłym azotem. Proszek zawieszono ponownie w chłodzonym lodem buforze do lizy [20 mmol/l Tris-HCl, pH 7,5, 5 mmol/l EGTA, 150 mmol/l NaCl, 20 mmol/l gliceryno fosforan, 10 mmol/l NaF, 1 mmol/l ortowanadian sodowy, 1% Triton X-100, 0,1% Tween 20, 1 μg /ml aprotynina, 1 mmol/l PMSF, 0,5 mmol/l chlorometyloketon N-tosylo-L-fenyloalaniny (TLCK)] w stosunku 0,3 ml/10 mg mokrej masy. Ekstrakty inkubowano w lodzie przez 15 minut, a następnie odwirowano (12000 g, 15 minut, 4°C). Zachowano rozpuszczalne w roztworze detergentu frakcje supernatantu i stężenie białka w próbkach wyrównano przy pomocy testu białka Bio-Rad.

W celu przeprowadzenia analizy western biot dla białek IL-18 i IL-18R ekstrakty białek gotowano przez 5 minut i nanoszono na 7,5% lub 15% żel poliakryloamidowy w obecności siarczanu dodecylu sodu. Dla IL-18BP, oczyszczony rhIL-18 z E. Coli (Serono Pharmacutical Research Institute, Geneva) związano z żelem Affligel 15 (Biorad) w ilości 1 mg/ml żywicy zgodnie z protokołem producenta. Ekstrakt białka (60 μg) inkubowano całą noc w temperaturze 4°C na rolerze z 20 μl żywicy dopełnionej do 500 μl roztworem PBS w 0,005% Tween. W celu usunięcia substancji niezwiązanych specyficznie żywicę odwirowano i przemyto 10 mM Tris o pH 8, 140 mM NaCl, 0,5% Triton-X-100 (Fluka), 0.5% deoksycholatu, a następnie 50 mM Tris pH 8, 200 mM NaCl, 0,05% TX100 (Fluka), 0,05% nonidet P40 (Fluka), 2 mM CHAPS (Boehringer, Monachium), a kolejno przemyto 50 mM Tris, pH 8. Żywicę odwirowano, zawieszono ponownie w buforze do próbek w zredukowanych warunkach, gotowano przez 5 minut i ostatecznie nałożono na żel 10% SDS-poliakryloamid NuPAGE (Invitrogen).

Próbki przeniesiono elektroforetycznie z żeli poliakryloamidowych na nitrocelulozę. Membrany nitrocelulozowe nasycano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej TBST [50 mmmol/l Tris-HCl (pH 7,5), 250 mmol/l NaCl, i 0,1% Tween w roztworze soli] zawierającym 5% wolnego od tłuszczu

PL 209 371 B1 chudego mleka. Membrany inkubowano następnie z kozimi przeciwciałami poliklonalnymi anty-ludzkie

IL-18 oraz IL-18R (łańcuchem α) (1 μg/ml) (R&D Systems), mysim przeciwciałem monoklonalnym anty-ludzkie IL-18 (Mab 657,27 o stężeniu 5 μg/ml) (Corbaz i wsp., 2000, wysłane do druku), króliczym przeciwciałem poliklonalnym anty-ludzka kaspaza-1 (1 μg/ml) (A-19 Santa Cruz). Specyficzność Mab 657,27 zbadano na pasku membrany poprzez test kompetycyjny stosując 200 krotny nadmiar molowy rhIL-18BP-6his (oczyszczonego z komórek jajnika chomika chińskiego, Serono Pharmaceutical Research Institute) inkubowany razem z Mab 657,27 w ilości 5 μg/ml przez 1 godz. Po inkubacji z odpowiednimi przeciwciałami skoniugowanymi z HRP, substancje chemiluminescencyjne (ECL, Western blotting; Amersham Corp) wykorzystano w celu ujawnienia dodatnich pasm zgodnie z instrukcją producenta, a pasma zobrazowano po naświetleniu Hyperfilmem ECL (Amersham Corp).

Immunohistochemia

Mrożone skrawki kriostatyczne z 6 blaszek miażdżycowych inkubowano z roztworem 1:10 normalnej końskiej surowicy krwi lub 1:10 normalnej koziej surowicy krwi przez 30 minut w temperaturze pokojowej, przemyto raz PBS, a następnie inkubowano albo z pierwotnym mysim przeciwciałem monoklonalnym przeciwko CD68 stosowanym do identyfikacji makrofagów (DAKO-CD68, KP1) lub z pierwotnym mysim przeciwciałem monoklonalnymi przeciw ludzkiej α-aktynie mięśni gładkich (1A4, DAKO) stosowanym do identyfikowania komórek mięśni gładkich. W celu oznaczenia IL-18 oraz receptora IL-18 w blaszkach miażdżycowych wykorzystano specyficzne kozie przeciwciała poliklonalne (R & D Systems) w rozcieńczeniu 5 μg /ml. IL-18BP oznaczono przy użyciu specyficznych przeciwciał monoklonalnch przeciwko izoformie rekombinowanego ludzkiego IL-18BP (H2O) (Corbaz i wsp., 2000, rękopis wysłany do druku). Po przemyciu PBS, preparaty histologiczne inkubowano z następującymi drugorzędnymi biotynylowanymi przeciwciałami: biotynylowanym końskim anty-mysie IgG (Vector Laboratories, Inc.) w rozcieńczeniu 1:200 w celu wykrycia odbarwień z przeciwciałem przeciwko CD68, ludzką α-aktyną mięśni gładkich lub IL-18BP, oraz biotynylowanym końskim anty-kozie IgG (Vector) w rozcieńczeniu 1:200 w celu wykrycia przeciwciał przeciwko IL-18 oraz przeciwko receptorowi IL-18. Odbarwione plamy zobrazowano przy użyciu metody wizualizacji HRP układu awidynabiotyna (zestaw Vesctastain ABC PK-6100 Vector). Jako kontrolę ujemną sąsiadujące skrawki histologiczne zamiast pierwotnymi przeciwciałami odbarwiono przeciwciałami obojętnymi pasującymi do izotypów.

Przygotowanie RNA

Całe RNA ekstrahowano z 29 blaszek miażdżycowych roztworem tiocyjanianu kwasu guanidynowego i ekstrahowano fenolem i chloroformem zgodnie ze sposobem Chomczyńskiego i Sacchi'ego [29]. Oczyszczone RNA rozpuszczono w wodzie, a stężenie określono na podstawie pomiaru adsorbancji przy długości fali 260 nm. Całość RNA oszacowano poprzez elektroforezę na 1% żelu agarozowym, cDNA zsyntetyzowano z 1 μg RNA stosując metodę odwrotnej transkrypcji Promega zgodnie z protokołem producenta. Półilościowe PCR i PCR w czasie rzeczywistym ludzkiego IL-18 oraz IL-18BP w ludzkich blaszkach miażdżycowych

Półilościowe reakcje PCR przeprowadzono w całkowitej objętości 50 μl w obecności 1U Polimerazy AmpliTaq DNA (Perkin Elmer, Roche, U.S.A.), 2,5 mM dNTPs (Amersham, U.S.A.) i 50 pM 3' >5' oraz 5' >3' starterów PCR. Mieszaninę reakcyjną inkubowano w inkubatorze cyklicznej polimeryzacji PTC-200 Pelitier Effect Thermal Cycler (MJ Research, U.S.A.) w następujących warunkach: denaturacja powielanego DNA w 94°C przez 1 minutę, wyżarzanie w 55°C przez 1 minutę i polimeryzacja w 72°C przez 1 minutę. Aby zapewnić możliwość porównywania ilości powstającego produktu PCR podczas liniowej fazy reakcji PCR IL-18BP, IL-18 oraz β-aktynę badano po 25, 28 oraz 31 cyklach polimeryzacji. Określono optymalną liczbę cykli przed wystąpieniem wysycenia pasm (odpowiednio 31, 28 i 25). Wybrano następujące startery PCR w oparciu o opublikowaną sekwencję (AF110799, D49950, X00351):

IL-18, do tyłu 5'-GCGTCACTACACTCAGCTAA-3'; do przodu 5'-GCCTAGAGGTATGGCTGTAA-3';

IL-18BP, do przodu 5'-ACCTGTCTACCTGGAGTGAA-3'; do tyłu 5'-GCACGAAGATAGGAAGTCTG-3'; β-aktyny, do tyłu 5'-GGAGGAGCAATGATCTTGATCTTC-3', do przodu 5'-GCTCACCATGGATGATGATATCGC-3'.

By wykluczyć wzmocnienie ewentualnej kontaminacji genomowego DNA próbek reakcje PCR przeprowadzano przy braku szablonu cDNA. Produkty PCR (10 μθ zanalizowano metodą elektroforezy na 1% żelu agarozowym w buforze 1xTA. Wielkość produktów PCR zweryfikowano poprzez

PL 209 371 B1 porównanie z 1 kb ciągiem (Gibco) następującym po wybarwieniu żeli. Względne oznaczenie ilościowe odbarwionych bromkiem etydyny pasm przeprowadzono po aktywacji światłem UV przy użyciu oprogramowania Kodak Digital Science i przedstawiono jako stosunek będącego podmiotem badań genu (hIL-18BP, hIL-18) do genu gospodarza(he-aktyna).

Startery PCR SYBR Green Real Time dla IL-18, IL-18BP oraz GAPDH (gospodarzem kontroli) zaprojektowano przy zastosowaniu oprogramowania Primer Express z PE Biosystems zgodnie z opublikowanymi sekwencjami (AF110799, D49950, NM 002046) jak następuje:

IL-18, do tyłu 5'-CAGCCGCTTTAGCAGCCA-3'; do przodu 5'-CAAGGAATTGTCTCCCAGTGC-3';

IL-18BP, do tyłu 5'-AACCAGGCTTGAGCGTTCC-3'; do przodu 5'-TCCCATGTCTCTGCTCATTTAGTC-3';

GAPDH, do tyłu 5'-GATGGGATTTCCATTGATGACA-3'; do przodu 5'-CCACCCATGGCAAATTCC-3'; intron-GAPDH, do tyłu 5'-CCTAGTCCCAGGGCTTTGATT-3'; do przodu 5'-CTGTGCTCCCACTCCTGATTTC-3'.

Przebadano specyficzność i optymalne stężenie startera. Ewentualne zanieczyszczenie genowe wykluczono przeprowadzając reakcje PCR ze specyficznym starterem intronu-GAPDH. Brak niespecyficznego wzmocnienia potwierdzono poprzez analizę produktów PCR na drodze elektroforezy w 3,5% żelu agarozowym. PCR SYBR Green Real-Time przeprowadzono z 5 μΐ/dołek produktów RT (0,5 ng całkowitego RNA), 25 μl/dołek mieszaniny SYBR Green PCR master (PE Biosystem, CA, USA) z uracylem N-glukozylazy AmpErase (UNG) (0,5 jednostki/dołek) oraz 20 μl startera (300 nM). PCR prowadzono przez 2 min w 50°C (w celu inkubacji AmpErase UNG, aby usunąć uracyl zawarty w cDNA), w 95°C przez 10 min (w celu aktywacji AmpliTaq Gold), a następnie przeprowadzono 40 cykli po 15 sec w 95°C i 1 min w 60°C w ABI PRISM 7700 Detection System. Tak więc, próbki odwrotnie transkrybowanego cDNA wzmocniono i określono ich wartości Ct (próg cyklu). Wszystkie wartości Ct znormalizowano wobec genu zgodnego z gospodarzem GAPDH. Pojedyncze specyficzne pasmo DNA dla IL-18, IL-18BP oraz GAPDH obserwowano stosując elektroforezę żelową.

Zasada oznaczania w czasie rzeczywistym z zastosowaniem „SYBR Green PCR master mix” jest oparta na bezpośrednim oznaczaniu produktu PCR poprzez pomiar wzrostu fluorescencji związanej z wiązaniem się barwnika SYBR Green do podwójnej nici DNA.

Analiza statystyczna

Dane wyrażono poprzez ± SEM. Poziomy IL-18 porównano pomiędzy grupami przy użyciu testu Mann-Whitney'a. Za statystycznie wystarczającą uznano wartość p równą 0,005.

P r z y k ł a d 1:

Dostarczana przez inhibitory IL-18 ochrona przed śmiercią komórkową komórek śródbłonka wywoływaną przez utlenione lipoproteiny (oxLDL)

Hodowlę komórek śródbłonka ludzkiej pępowiny (HUVEC) wystawiono przez 16 godzin na działanie oxLDL w obecności i w nieobecności białek wiążących IL-18 lub przeciwciał anty-IL-18. Jak pokazano na Fig. 1, 83% HUVEC umierało po wystawieniu na działanie oxLDL. Inkubacja wspólnie z IL-18BP lub przeciwciałem anty-IL-18 niemal całkowicie chroniła komórki od śmierci. Nie zaobserwowano śmierci komórkowej przy zastosowaniu IL-18BP. W przypadku stosowania przeciwciał antyIL-18 śmierci uniknęło 89% komórek.

Eksperyment jawnie przedstawia efekt ochronny dwóch różnych inhibitorów IL-18 przeciwko śmierci komórkowej będącej wynikiem apoptozy w obrębie blaszki miażdżycowej.

P r z y k ł a d 2:

Ekspresja białka IL-18 oraz jego endogennego inhibitora IL-18BP w obrębie blaszek miażdżycowych

Przeprowadzono analizę Western biot białek na ekstrakcie białkowym z 12 tętnic szyjnych objętych miażdżyca tętnic i 5 prawidłowych kontroli. Białko IL-18, włączając w to formę aktywną, ulegało znacznej ekspresji w obrębie blaszek miażdżycowych, podczas gdy brak jakiejkolwiek, bądź jedynie niewielką ekspresję obserwowano w prawidłowych tętnicach (Fig. 2). Linie od 1 do 4 obejmują próbki z blaszek miażdżycowych, linie od 5 do 7 próbki z prawidłowych naczyń. Interesującą jest obserwacja, iż oznaczenie aktywnej formy IL-18 wygląda na skorelowane z ekspresją aktywnej formy kaspazy-1, która jest zaangażowana w wytwarzanie IL-18 (Fig. 2, czwarty rząd). Zaobserwowano również istotną ekspresję białka receptora IL-18 (łańcucha α) w naczyniach objętych miażdżycą w porównaniu do niezwykle niskiego poziomu ekspresji w prawidłowych tętnicach (Fig. 2, drugi rząd). Dodatkowo,

PL 209 371 B1 w większości blaszek miażdżycowych następowała ekspresja IL-18BP, mimo, że ekspresja ta była heterogeniczna.

P r z y k ł a d 3:

Lokalizacja komórkowa białka IL-18 oraz jego endogenicznego inhibitora IL-18BP w blaszkach miażdżycowych.

Aby ustalić lokalizację komórkową IL-18 oraz IL-18BP przeprowadzono badania immunohistochemiczne na 6 szyjnych blaszkach miażdżycowych. Jak pokazano na figurze 2, IL-18 ulegał ekspresji przede wszystkim w makrofagach, co sprawia, że komórki te są najprawdopodobniej głównym źródłem IL-18 w blaszkach (niepokalane). Obszary te były także bogate w CD-3 pozytywne limfocyty. Jednakże, limfocyty T nie wydają się być bezpośrednio zaangażowane w wytwarzanie IL-18. IL-18 był wytwarzany w niektórych komórkach wewnętrznych mięśni gładkich i sporadycznie komórkach śródbłonka. Dla odróżnienia, istotną ekspresję IL-18BP zaobserwowano w śródbłonkowych komórkach naczyń włosowatych blaszki oraz znajdujących się na powierzchni przepływu, choć ekspresji nie stwierdzono we wszystkich naczyniach. Stwierdzono także porównywalnie niską i bardziej heterogeniczną ekspresję IL-18BP, głównie zewnątrzkomórkową, w niektórych bogatych w makrofagi obszarach.

P r z y k ł a d 4:

Ekspresja transkryptów mRNA IL-18 i IL-18BP w blaszkach miażdżycowych i związek z niestabilnością blaszki.

W celu oznaczenia, czy ludzkie mRNA IL-18 i IL-18BP ulega ekspresji w blaszkach miażdżycowych ludzkich tętnic szyjnych przeprowadzono półilościowe RT-PCR na sześciu blaszkach miażdżycowych (Fig. 3). mRNA IL-18 i IL-18BP wykryto we wszystkich blaszkach miażdżycowych, mimo, iż ilość mRNA zarówno IL-18 jak i IL-18BP była heterogenna. Dlatego też, w celu dokładnego obliczenia poziomów ekspresji mRNA IL-18 i IL-18BP poddano dalszym badaniom 23 blaszki miażdżycowe metodą SYBR Green Real-Time PCR (Fig. 4). Blaszki scharakteryzowano na podstawie badań klinicznych i patologicznych jako blaszki symptomatyczne (niestabilne), bądź niesymptomatyczne (stabilne), zawierające, bądź wolne od makroskopowego wrzodu. Charakterystykę kliniczną pacjentów zebrano w Tabeli 4. Zwężenie procentowe średnicy tętnicy szyjnej (60-95%) oraz czynniki ryzyka obejmujące wiek, cukrzycę, hipercholesterolemię, nadciśnienie oraz palenie papierosów były nierozróżnialne pomiędzy dwoma grupami.

Charakterystyki pacjentów

Wiek

Płeć ₂

Nadciśnienie^{1 2} ₃

Hipercholesterolemia³ Cukrzyca Obecnie palący Choroba wieńcowa

T a b e l a 4

Niesymptomatyczni Pacjenci (n = 9)

66,9 ± 4,0

Mężczyźni (8)

Symptomatyczni Pacjenci¹ (n = 14)

70,2 ± 3,9

Mężczyźni (8) ¹ Pacjenci Ci przeszli przejściowy bądź bezustanny atak niedokrwienia mózgu na 2-66 dni przed endarterektomią ² Liczba pacjentów z klinicznym nadciśnieniem poddanych leczeniu lekami przeciw nadciśnieniu. Liczba pacjentów z kliniczną hipercholestrolemią poddanych leczeniu lekami zmniejszającymi stężenie lipidów

Ujawniono, że ilość IL-18 jest zwiększona w przypadku symptomatycznych w porównaniu do niesymptomatycznych blaszek miażdżycowych (odpowiednio 2,03 ± 0,5 w stosunku do 0,67 ± 0,17) (Fig. 4A). Analiza statystyczna wykazała, że wzrost wytwarzania IL-18 zaobserwowany w symptomatycznych blaszkach miażdżycowych był wysoce znaczący (p < 0,0074), podczas gdy wzrost ilości IL-18BP zaobserwowany w symptomatycznych wobec niesymptomatycznych blaszek nie był tak znaczący (odpowiednio 4,64 ± 0,98 wobec 2,5 ± 0,92) (Fig. 4B). Innymi słowy, mimo, iż obie grupy symptomatyczna i niesymptomatyczna - wykazują pozytywną zależność pomiędzy mRNA IL-18 oraz IL-18BP stopnie nachylenia różnią się istotnie pomiędzy tymi dwoma grupami (grupa symptomatyczna: nachylenie 1,16 (0,19-2,14), r² = 0,36 w stosunku do grupy niesymptomatycznej: nachylenie 4,79 (2,39-7,20), r² = 0,76; p < 0,05). Dlatego też wydaje się, że stosunkowy wzrost ekspresji IL-18BP w grupie symptomatycznej jest niewystarczający do skompensowania wzrostu ekspresji IL-18.

PL 209 371 B1

Co więcej, wówczas, gdy stwierdzono owrzodzenie jako cechę niestabilności blaszek analizę statystyczną poprowadzono dalej na blaszkach wolnych od i posiadających wewnątrz blaszki wrzody i wykazano istotny wzrost IL-18 w blaszkach posiadających wrzody (p < 0,018) (Fig. 4C).

Dane te pokazują, że wzrost ekspresji IL-18 obserwowany w blaszkach jest powiązany z niestabilnością blaszki.

P r z y k ł a d 5:

IL-18BP modyfikuje rozwój miażdżycowego uszkodzenia i stabilności w modelu choroby in vivo.

Sposoby

Charakterystyka pacjentów

Próbki osocza otrzymano od pacjentów z ostrymi objawami niedokrwistości wieńcowej (niestabilna dusznica bolesna i zawał serca) na mniej niż 7 dni od rozpoznania pierwszych objawów. Niestabilną dusznicę bolesną zdefiniowano jako połączenie typowego bólu w klatce piersiowej z dowolnymi zmianami niedokrwienia na elektrokardiogramie, bądź z obecnością choroby wieńcowej. Zawał serca zdiagnozowano w oparciu o typowe zmiany niedokrwienia na elektrokardiogramie połączone z istotnym wzrostem enzymów mięśnia sercowego (fosfokinazy kreatyny i troponiny I) w krwioobiegu. Pacjentów niewykazujących objawów niedokrwienia wybrano na tym samym oddziale kardiologicznym i byli oni całkowicie wolni od objawów niedokrwienia. Poziomy ludzkiego IL-18 w osoczu określono przy użyciu zestawu dostępnego komercyjnie (MBL, Japonia).

Domięśniowy elektrotransfer in vivo plazmidu ekspresji mysiego IL-18BP

Czternaście 14-sto miesięcznych samców myszy C57BL/6 apoE KO otrzymało w odstępach 3-tygodniowych 3 iniekcje plazmidu ekspresyjnego IL-18BP pcDNA3-IL-18BP. Myszy stanowiące kontrolę (n=19) zaszczepiono kontrolnie pustym plazmidem. Wyizolowane jak opisano [23] cDNA mysich izoform d IL-18BP (numer dostępu #Q9ZOM9) poddano subklonowaniu w EcoR1/Not1 miejscach ekspresji wektora komórek ssaków pcDNA3 pod kontrolą startera cytomegalowirusa (Invitrogen). Produkt, określony jako 334.yh przedstawiono na Fig. 5. Plazmid kontrolny był podobnym produktem pozbawionym leczniczego cDNA. Kontrolny plazmid ekspresji lub IL-18BP (60 μg) wszczepiono w oba mięśnie piszczelowy i czaszkowy znieczulonych myszy, jak wcześniej opisano [13]. Pokrótce, przezskórne pulsy elektryczne (8 pulsów elektrycznych fali prostokątnej o natężeniu 200 V/cm, czas trwania 20 msec przy 2 Hz) generowane przez elektropulsator PS-15 (Genetronics, France) dostarczano pomiędzy dwie płaskie elektrody ze stali nierdzewnej umieszczone w odległościach 4,2 i 5,3 mm po obu stronach nogi.

Test Elisa mIL-18BP

Płytki przez noc opłaszczono oczyszczonym króliczym przeciwciałem poliklonalnym o powinowactwie do r-mIL-18BPd (5 μg/dołek). Rozpuszczalny mIL-18BP wykryto używając biotynylowane królicze przeciwciało poliklonalne (0,3 μg/ml) hodowane przeciw r-mIL-18BP E. Coli (Peprotec), a następnie peroksydazę ekstrawidyny (1/1000) (Sigma). Wychwycone królicze przeciwciało poliklonalne przetestowano metodą Western blot w celu potwierdzenia specyficzności mIL-18BP. Jako standardu użyto wytworzony w komórkach HEK293 rekombinowany mIL-18BPd. Czułość testu ELISA wynosiła 5 ng/ml.

Badanie myszy

Skrawki kriostatyczne (8 μm) uzyskane z zatoki aorty wykorzystano do i wykrywania odkładania się lipidów za pomocą czerwieni Oil, wykrywania kolagenu za pomocą czerwieni Sirius oraz do badań immunohistochemicznych jak opisano wcześniej [13]. Skrawki odbarwiono specyficznymi pierwotnymi przeciwciałami: przeciwko-mysim makrofagom, klonem MOMA2 (BioSource), koniugatem zasadowej fosfatazy z anty-a-aktyną dla komórek mięśni gładkich oraz przeciwko CD3 w celu oznaczania limfocytów T (Dako) jak opisano wcześniej [13]. Komórki pozytywne względem CD3 policzono pod mikroskopem w ślepej próbie. Blaszki miażdżycowe w zatokach aorty oraz obszarach oznaczonych jako pozytywne wobec makrofagów, komórek mięśni gładkich, kolagenu lub TUNEL policzono jak opisano [13] przy użyciu komputera wyposażonego we wspomagająco-obrazujący kwantyfikator (NS15000, Microvision). Barwiąc nieodpornymi pasującymi do izotypów immunoglobulinami oszacowano specyficzność barwienia immunocytochemicznego. Specyficzność TUNEL-u oszacowano poprzez pominięcie zakończenia enzymu dwunukleodtydu transferazy. Tętnice piersiowe, łączące lewą tętnicę podobojczykową z tętnicą nerkową zalano 10% buforowaną formaliną i wybawiono w celu określenia odkładania się lipidów czerwienią Oil. Wówczas otwarto je wzdłuż tętnicy i obliczono procent odkładających się lipidów przy użyciu komputera wyposażonego w wspomagająco-obrazujący kwantyfikator (NS15000, Microvision).

PL 209 371 B1

Wyniki

W niniejszych badaniach przetestowano hipotezę, że regulacja stosunku IL-18/IL-18BP odgrywa krytyczną rolę zarówno w powstawaniu miażdżycy jak i stabilności blaszki. Zmierzono poziomy IL-18 w osoczu u pacjentów z ostrymi objawami choroby wieńcowej (30 mężczyzn, 18 kobiet, średnia wieku 66,2 ± 1,8 lat, 14-stu z nich dolega niestabilna dusznica bolesna i 34 z nich przeszło zawał serca) oraz u pacjentów stanowiących kontrolę niewykazujących objawów niedokrwienia wybranych na tym samym oddziale kardiologicznym (10 mężczyzn, 3 kobiety, średnia wieku 60,0 ± 5,2 lat). Poziomy IL-18 we krwi pacjentów, u których zaobserwowano ostre objawy choroby wieńcowej były wyższe w porównaniu z grupa kontrolną (odpowiednio 146,9 ± 17,1 wobec 73,0 ± 12,2 pg/ml, p< 0,05) w odróżnieniu do nieznacznie zwiększonych poziomów w krwioobiegu IL-18BP (odpowiednio 20,1 ± 2,7 wobec 7,5 ± 2,5 ng/ml, p < 0,06). Ponadto, zaobserwowano współzależność poziomów IL-18 z nasileniem choroby w przypadku najwyższych poziomów u pacjentów z ostrą dysfunkcją niedokrwienia mięśnia sercowego i objawami klinicznymi odmy płuc (224,03 ± 39,1 pg/ml, p < 0,001 w porównaniu z kontrolą). Wyniki te uzyskano od pacjentów z ostrą chorobą wieńcową, wraz z wcześniejszymi obserwacjami, że poziom IL-18 jest podwyższony w blaszkach miażdżycowych u pacjentów po udarze [Mallat, 2001] sugerują potencjalną ważną rolę regulacji stosunku IL-18/IL-18BP w procesie miażdżycowym.

Dlatego też przetestowano tę hipotezę poddając badaniu myszy z inaktywacją genu (KO) apoE, u których nastąpił spontaniczny rozwój przypominających ludzkie uszkodzeń miażdżycowych. Czternaście 14-sto miesięcznych samców myszy otrzymywało uzupełnienie IL-18BP poprzez in vivo domięśniowy elektrotransfer plazmidu ekspresji DNA kodującego mysie IL-18BPd, podczas 19 myszy w tym samym wieku stanowiących grupę kontrolną otrzymało puste plazmidy. Elektrotransfer plazmidu powtórzono co 3 tygodnie i po 9 tygodniach leczenia w wieku 23 tygodni myszy uśmiercono. U myszy apoE KO zaszczepionych pustym plazmidem poziomy mysiego IL-18BP w osoczu były niższe niż poziom detekcji (5 ng/ml). Jednak, pojedyncze zaszczepienie plazmidem IL-18BP skutkuje wysokim poziomem IL-18BP we krwi przy czym maksymalny wzrost następuje po 2 dniach po zaszczepieniu (323,5 ± 100, 9 ng/ml) oraz 127,4 + 35,4 ng/ml mierzonymi po dwóch tygodniach. Po 9 tygodniach leczenia zarówno zawierającymi IL-18BP jak i pustymi plazmidami całkowity cholesterol (odpowiednio 489,4 ± 34,6 wobec 480,8 ± 36,3 mg/ml) i poziomy lipoprotein o wysokiej gęstości (odpowiednio 52,3 ± 9,4 wobec 48,8 ± 5,1) nie różniły się w sposób istotny pomiędzy tymi dwoma grupami. Zaobserwowano nieznaczny, lecz istotny wzrost masy ciała zwierząt w grupie leczonej IL-18BP w stosunku do grupy kontrolnej (odpowiednio 31,8 ± 0,9 wobec 28,6 ± 0,8 g, p < 0,05).

Przebadano wpływ na miażdżycę tętnic dodawania IL-18BP w 2 różnych lokalizacjach: zstępującej tętnicy piersiowej oraz zatoce aorty. Tętnica piersiowa została wybrana do określenia roli IL18BP w rozwoju włókien tłuszczowych (powstawania miażdżycy), ponieważ uszkodzenia miażdżycowe tętnicy piersiowej są niemal nieobecne u 14-sto tygodniowych osobników (dane niepokazane), u których rozpoczęto transfekcję IL-18BP. Zatoka aorty, gdzie zmiany miażdżycowe są już obecne w 14-stym tygodniu życia osobnika (dane niepokazane) przebadano w celu określenia progresji i składu zaawansowanej blaszki, istotnych determinant stabilności blaszki. Leczenie myszy apoE KO IL-18BP istotnie wpływa na rozwój i postęp uszkodzenia miażdżycowego. Badanie tętnic piersiowych przedstawia wyraźną redukcję złogów lipidowych u myszy leczonych plazmidem IL-18BP w porównaniu do leczonych pustym plazmidem (Fig. 6). Ilościowa analiza wspomaganego komputerowo obrazu ukazała 69% redukcję rozmiarów uszkodzeń miażdżycowych (p < 0,0001) (Fig. 6), potwierdzając tym samym krytyczną rolę IL-18 w powstawaniu miażdżycy. Co więcej, leczenie plazmidem IL-18BOP przez jedynie 9 tygodni znacząco ograniczyło rozrost zaawansowanych blaszek miażdżycowych w zatoce aorty (24% zmniejszenie rozmiaru blaszki, p=0,01) w porównaniu do leczenia pustym plazmidem (Fig. 7).

Co ważniejsze, leczenie IL-18BP wywierało znaczący wpływ na skład zaawansowanych uszkodzeń, główny wyznacznik niestabilności blaszki. Uszkodzenia miażdżycowe u myszy poddanych leczeniu plazmidem IL-18BP wykazywały niezwykle istotną 50% redukcję w infiltracji makrofagów (p < 0,0001) (Fig. 8), zawierając 67% mniej limfocytów T (p < 0,005) (Fig. 8), oraz wykazując dwukrotny wzrost akumulacji komórek mięśni gładkich (p < 0,05) (Fig. 9). Ponadto, te istotne zmiany w składzie komórek uszkodzenia, jak określono poprzez wybarwienie czerwienią Sirius, były powiązane z istotnym 85% wzrostem zawartości kolagenu (p < 0,0005) oraz zmniejszeniem całkowitej zawartości tłuszczy.

PL 209 371 B1

Toteż, leczenie IL-18BP znacznie wpływa na stan zapalny w miejscach uszkodzeń miażdżycowych i wywołuje proces gojenia się charakterystyczny dla stabilnych blaszek miażdżycowych. Ponadto, znaczna redukcja składników wywołujących zakażenie w uszkodzeniu u myszy leczonych IL-18BP była powiązana ze znacznym spadkiem występowania śmierci komórkowej w obrębie blaszki (2,9 ± 0,9% u myszy leczonych IL-18BP wobec 10,5 ± 3,6% w grupie kontrolnej, p < 0,05) ograniczając tym samym ekspansję i tworzenie skrzeplin poprzez bezkomórkowe jądro lipidowe [Mallat, 1999].

Wnioski

Stosując dobrze zdefiniowany mysi model ludzkiej miażdżycy tętnic przedstawione wyżej wyniki jasno ustalają nieoczekiwaną i zasadniczą rolę regulacji IL-18 oraz IL-18BP w rozwoju, postępie i stabilności blaszki miażdżycowej. Podczas, gdy blokowanie aktywności IL-18 poprzez dodanie IL-18BP chroni przed wczesnym tworzeniem się uszkodzeń w tętnicy piersiowej istotnie wpływa także na skład zaawansowanych zmian miażdżycowych w zatoce aorty wywołując przekształcenie w stabilny fenotyp blaszki.

Prognozy kliniczne pacjenta z miażdżycą tętnic zależą jedynie w części od rozmiaru uszkodzeń. Obecnie jest łatwo rozpoznawalnym, że raczej jakość (skład blaszki) niż rozmiar uszkodzenia może być znacznie lepszą prognozą występowania oznak niedokrwienia. W rzeczywistości, liczne kliniczne objawy miażdżycy tętnic (zawały serca i mózgu) są wynikiem zwężenia światła naczynia poprzez powstawanie skrzeplin na styku z uszkodzona blaszką miażdżycową [19]. Badania patologiczne ukazały, że niestabilne i wrażliwe blaszki, które są podatne na pękanie bądź uległy pęknięciu są bogate w komórki zapalne i wykazują istotną utratę zawartości komórek mięśni gładkich i kolagenu [20, 21]. Co więcej, blaszki takie wykazują znaczny wzrost komórek programowanej śmierci komórek prowadzącej do powstawania wysoce zdolnego do tworzenia skrzeplin jądra lipidowego [13, 22]. Jest godnym uwagi, iż wszystkie te objawy zwiększonej niestabilności blaszki były znacząco zniesione u myszy poddanych leczeniu IL-18BP, dowodząc, że poziom IL-18 jest głównym determinantem niestabilności blaszki.

Znaczenie wyników uzyskanych na myszach apoE KO dla ludzkiego wariantu choroby jest wzmożone poprzez nasze ujawnienie zwiększonych poziomów krążącego IL-18 u pacjentów z ostrymi objawami choroby wieńcowej oraz wzmożoną produkcję IL-18 w niestabilnych wieńcowych blaszkach miażdżycowych odpowiedzialnych za wylew. Ujawnienia te wzięte razem utożsamią aktywność inhibitorów IL-18 z nowymi istotnymi terapeutycznie środkami w celu zapobiegania i leczenia rozwoju blaszki miażdżycowej oraz aby ograniczyć złożoność blaszki.

P r z y k ł a d 6:

Podwyższone poziomy IL-18 są powiązane z powracającymi zdarzeniami u pacjentów po niewydolności serca

Poziomy IL-18 w surowicy krwi mierzono u pacjentów metodą ELISA ze specyficznym przeciwciałem IL-18.

Przebadano 56 pacjentów zarówno z objawami jak i bez objawów stanu zapalnego, po przejściu oraz bez stwierdzenia u nich przebytego zawału serca.

U pacjentów, u których następnie stwierdzono zgon poziom IL-18 wynosił 216,0 ± i 41,5 pg/ml w stosunku do 112,2 ± 12,2 pg/ml u pacjentów, u których zgon nie nastąpił (p = 0,0018).

U pacjentów z jakimikolwiek nawracającymi zdarzeniami takimi jak śmierć, nawracająca niedokrwistość, rewaskularyzacja, rozwój miażdżycy tętnic lub rehospitalizacja po ataku serca zmierzono następujące poziomy IL-18: 165,8 ± 23,8 w stosunku do 107,7 ± 14,6 u pacjentów bez jakichkolwiek nawracających zdarzeń (p = 0,03).

Wyniki te w prosty sposób ukazują, że poziomy IL-18 są istotnie podwyższone u pacjentów ze złą prognozą kliniczną, taką jak nawracające dolegliwości lub śmierć.

Przebadano próbki krwi 16 pacjentów bez objawów niedokrwienia, po przejściu bądź nieprzechodzących zawału serca ze względu na poziom IL-18. U tych pacjentów, którzy później umarli, poziomy te wynosiły 199, 0 ± 34,8 pg/ml w stosunku do 95,3 ± 20,4 pg/ml u pacjentów, u których nie nastąpił zgon (p = 0,09).

Poziom IL-18 u pacjentów z jakimikolwiek nawracającymi dolegliwościami wynosił 146,6 ± 34,4 pg/ml, podczas gdy u pacjentów bez jakichkolwiek dolegliwości 95,4 ± 23,9 (p = 0,03). Pomimo, że różnice w poziomach IL-18 nie posiadają istotności statystycznej, gdyż dane obejmują małą grupę pacjentów jasno mogą być zaobserwowane trendy podwyższonych poziomów IL-18.

U tych pacjentów z niedokrwieniem, którzy umarli poziomy IL-18 wynosiły 214,2 ± 45,9 pg/ml w stosunku do 118,4 ± 12,8 u tych, którzy przeżyli (p = 0,007).

PL 209 371 B1

Zmierzono poziom IL-18 wynoszący 162,8 ± 24,7 u tych pacjentów, u których wystąpiły jakiekolwiek nawracające dolegliwości w stosunku do 116,2 ± 16,0 u pacjentów, u których takich dolegliwości nie stwierdzono.

Literatura

1. Ross R., Atherosclerosis-an inflammatory disease, N Engl. J. med., (1999), 340, 115-126.

2. van der Wal A.C., Becker A.E., van der Loos C.M., Das P.K., Site of intimal rupture or erosion of thrombosed coronary atherosclerotic plaques is charcterized by an inflammatory process irrespective of the dominant plaque morphology, Circulation, (1994), 89,36-44.

3. Fuster V, Badimon L., Badimon J.J., Chesebro J.H., The pathogenesis of coronary artery disease and the acute coronary syndromes (1), N. Engl. J. Med., (1992); 326, 242-250.

4. Fuster V, Badimon L., Badimon J.J., Chesebro J.H., The pathogenesis of coronary artery disease and the acute coronary syndromes (2), N. Engl. J. Med., (1992); 326, 310-318.

5. Lee R.T., Libby P., The unstable atheroma. Arterioscler Thromb Vasc Biol., (1997), 17, 1859-1867.

6. Ridker P.M., Cushman M., Stampfer M.J., Tracy R.P. Hennekens C.H., Inflamation aspirin, and the risk of cardiovascular disease in apparently healthy men., N. Engl. J. Med., (1997), 336, 973-979.

7. Libby P., Molecular bases of the acute coronary syndromes., Circulation, 1995, 91, 2844

-2850.

8. Nakamura K., Okamura H., Nagata K., Tamura T., (1989), Infect. Immun, 57, 590-595.

9. Yoshimoto T, Takeda K., Tanaka T., Ohkusu K., Kashiwamura S., Okamura H., Akira S., Nakanishi K., (1998), J. Immunol., 161, 3400-3407.

10. Parnet P., Garka K.E., Bonnert T.P., Dower S.K., Sims J.E., (1996), J. Biol. Chem., 271,

3967-3970.

11. DiDonato J.A., Hayakawa M., Rothwarf D.M., Zandi E., Karin M., (1997), Nature, 388, 16514-16517.

12. Novick D., Kim S. H., Fantuzzi G., Reznikov L., Dinarello C, Rubinstein M., (1999), Immunity, 10, 127-136.

13. Mallat Z., Hugel B., Ohan J., Leseche G., Freyssinet J.M., Tedgui A., Shed membrane microparticles with procoagulant potential in human atherosclerotic plaques. A role for apoptosis inplaqe throbogenicity., Circulation (1999), 99, 348-353.

14. Tricot O., Mallat Z., Heymes C, Belmin J., Leseche G., Tedgui A., Relation between endothelial cell apoptosis and blood flow direction in human atherosclerotic plaque., Circulation, (2000), w druku

15. Dimmeler S., Haendler J., Galle J., Zeiher A.M., Oxidized low-density lipoprotein induces apoptosis of human endothelial cells by activation of CPP32-like proteases. A mechanistic clue to the response to injury hypothesis., Circulation, (1997), 95, 1760-1763.

16. Grantham, Science, (1974), 185, 862-864.

17. Dimmeler S., Haendler J., Galle J., Zeiher A.M., Oxidized low-density lipoprotein induces apoptosis of human endothelial cells by activation of CPP32-like proteases. A mechanistic clue to the response to injury hypothesis., Circulation, (1997), 95, 1760-1763.

18. Mir L.M., Bureau M.F., Gehl J., Rangara R., Rouy D., Caillaud J.M., Dellere P., Branellec D., Schwartz B., Scherman D., High efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1999), 96, 4262-4267.

19. Lee R.T., Libby P., The unstable atheroma, Arterioscler Thromb Vasc Biol, (1997), 17, 1859-1867.

20. Davies M.J., The composition of coronary-artery plaques (editorial comment), N. Engl. J. Med., (1997), 336, 1312-1314.

21. Virmani R., Kolodgie F.D., Burke A.P., Farb A., Schwartz S.M., Lessons from sudden coronary death: a comprehensive morphological classification scheme for atherosclerotic lesions., Arterioscler Thromb Vasc Biol, (2000), 20, 1262-1275.

22. Kolodgie F.D. i wsp., Localization of apoptotic macrophages at the site of plaque rupture in sudden coronary death (In process Citation), Am. J. Pathol., (2000), 157, 1259-1268.

23. Kim S. H. i wsp. Structural requirements of six naturally occurring isoforms of the IL-18 binding protein to inhibit IL-18., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2000), 97, 1190-1195.

24. Elliott M.J., Maini R.N., Feldmann M., Long-Fox A., Charles P., Bijl H, Woody J.N., Lancet, (1994), 334, 1125-1127.

PL 209 371 B1

25. Knight D.M., Trinh H, Le J, Siegel S., Shealy D., McDonough M., Scallon B., Moore M.A., Vilcek J., Daddona P. i wsp., Construction and initial characterization of a mouse-human chimeric anti-TNF antibody, Mol. Immunol., (1993), Nov 30, 16, 1443-1453.

26. Tucci A., James H., Chicheportiche R., Bonnefoy J.Y., Dayer J.M., Zubler R.H., J. Immunol., (1992), 2778-2784.

27. Engelmann H., Novick D., Wallach D., Two tumor necrosis factor-binding proteins purified from human urine. Evidence for immunological cross-reactivity with cell surface tumor necrosis factor receptors., J. Biol. Chem., (1990), 265, 1531-1536.

28. Moore W.S., Barnett H.J., Beebe H.G., et al. Guidelines for carotid endarterectomy. A multidisciplinary consensus statement from the Ad Hoc Committee, American Heart Association. Circulation 1995; 91: 566-79 29.

29. Chomczynski P., Sacchi N., Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction., Anal Biochem, (1987), 162, 156-159.

PL 209 371 B1

Lista sekwencji

<110>	Applied Research Systems	ARS	Holding N.V.
<120>	Zastosowanie inhibitorów tętnic	11-	18 do leczenia i/lub zapobiegania miażdżycy
<130>	44 3 WO
<140>	PCT/EP01/04843
<141>	2001-04-30
<150>	EP 00109606.4
<151>	2000-05-05
<160>	14
<170>	Patentln wersja 3.1
<210>	1
<211>	20
e212>	DNA
<213>	Homo sapiens
<220> <221>	IL- 18 starter „do tyłu
<222> <223>	(1) · · (20)

<400>	1
gcgtcactac actcagctaa	20
<210>	2
<211>	20
<212>	DNA
<213>	Homo sapiens
<220>
<221>	IL-18 starter „do przodu
<222>	(1) · - (20)
<223>

<400> 2 gcctagaggt atggctgtaa <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> IL-18BP starter „do przodu <222> (1)..(20) <223>

PL 209 371 B1 <400> 3 acctgtctac ctggagtgaa <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> IL-18BP starter „do tyłu <222> (1) . . (20) <223>

<400> 4 gcacgaagat aggaagtctg

<210> <211> <212> <213>	5 24 DNA Homo	sapiens
<220>
<221>	beta	aktyna starter „do tyłu
<222>	(1) .	. (24)
<223>

<400> 5 ggaggagcaa tgatcttgat cttc

<210>	6
c211>	24
<212>	DNA
<213>	Homo	sapiens
<220>
<221>	beta	aktyna starter „do przodu
<222>	(1)	. (24)
<223>

<400> 6 gctcaccatg gatgatgata tcgc <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> IL-18 starter „do tyłu 2 <222> (1)..(18) <223>

<400> 7

PL 209 371 B1 cagccgcttt agcagcca <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> IL-18 starter „do przodu 2 <222> (1) . .(21) <223>

<400> 8 caaggaattg tctcccagtg c <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> IL-18BP starter „do tyłu 2 <222> (1) . . (19) <223>

<400> 9 aaccaggctt gagcgttcc <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> IL-18BP starter „do przodu 2 <222> (1)..(24) <223>

<400> 10 tcccatgtct ctgctcattt agtc <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> GAPDH starter „do tyłu <222> (1) . . (22) <223>

<400> 11 gatgggattt ccattgatga ca

PL 209 371 B1 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> GAPDH starter „do przodu <222> (1) . . (18) <223>

<400> 12 ccacccatgg caaattcc <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> intron GAPDH starter „do tyłu <222> (1)..(21) <223>

<400> 13 cctagtccca gggctttgat t <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> intron GAPDH starter „do przodu <222> (1)..(22) <223>

<400> 14 ctgtgctccc actcctgatt tc

PL 209 371 B1

Claims (35)

1. Zastosowanie inhibitora IL-18 do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania miażdżycy tętnic, przy czym inhibitor IL-18 jest wybrany z grupy składającej się z przeciwciał przeciwko IL-18, przeciwciał przeciwko dowolnej z podjednostek receptora IL-18 oraz białek wiążących IL-18 (IL-18BP), mutein IL-18BP obejmujących konserwatywne podstawienia aminokwasowe, białek fuzyjnych IL-18BP z regionami łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, IL-18BP modyfikowanych PEG, a muteina, białko fuzyjne lub IL-18BP modyfikowane PEG zachowuje aktywność biologiczną wiązania IL-18.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do leczenia i/lub zapobiegania zakrzepicy blaszki miażdżycowej.

3. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do leczenia i/lub zapobiegania owrzodzeniu blaszki miażdżycowej.

4. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1 - 3, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do leczenia i/lub zapobiegania destabilizacji blaszki miażdżycowej.

5. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1 - 4, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do leczenia i/lub zapobiegania objawom niedokrwienia wynikającego z destabilizacji blaszki.

6. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1 - 5, znamienne tym, że lek jest przeznaczony do leczenia i/lub zapobiegania pękaniu blaszki miażdżycowej.

7. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1 - 6, znamienne tym, że inhibitorem IL-18 jest przeciwciało przeciwko IL-18.

8. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1 - 7, znamienne tym, że przeciwciało jest przeciwciałem humanizowanym.

9. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1 - 8, znamienne tym, że przeciwciało jest ludzkim przeciwciałem.

10. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1 - 6, znamienne tym, że inhibitorem IL-18 jest IL-18BP, muteina IL-18BP obejmująca konserwatywne podstawienia aminokwasowe, białko fuzyjne IL-18BP z regionami łańcucha ciężkiego immunoglobuliny lub IL-18BP modyfikowane PEG, przy czym muteina, białko fuzyjne lub IL-18BP modyfikowane PEG zachowuje aktywność biologiczną wiązania IL-18.

11. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że immunoglobulina jest izotypu IgG1 albo IgG2.

12. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1 - 12, znamienne tym, że lek ponadto obejmuje interferon do jednoczesnego, kolejnego albo oddzielnego zastosowania.

13. Zastosowanie według zastrz. 12, znamienne tym, że interferon jest interferonem β.

14. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1 - 13, znamienne tym, że lek ponadto obejmuje antagonistę czynnika martwicy nowotworu (TNF) do jednoczesnego, kolejnego albo oddzielnego zastosowania.

15. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienne tym, że antagonistą TNF jest TBPI i/lub TBPII.

16. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1 - 15, znamienne tym, że lek ponadto obejmuje inhibitor-COX do jednoczesnego, kolejnego lub oddzielnego zastosowania.

17. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że inhibitorem-COX jest inhibitor COX-2.

18. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1 - 17, znamienne tym, że lek ponadto obejmuje inhibitor tromboksanu do jednoczesnego, kolejnego lub oddzielnego zastosowania.

19. Zastosowanie według zastrz. 18, znamienne tym, że inhibitorem tromboksanu jest aspiryna.

20. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1-19, znamienne tym, że lek ponadto obejmuje czynnik zmniejszający stężenie lipidów do jednoczesnego, kolejnego lub oddzielnego zastosowania.

21. Zastosowanie według zastrz. 20, znamienne tym, że czynnikiem zmniejszającym stężenie lipidów jest inhibitor HMG CoA.

22. Zastosowanie według zastrz. 21, znamienne tym, że inhibitorem HMG CoA jest statyna.

23. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1 - 22, znamienne tym, że lek jest stosowany w kombinacji z niskotłuszczową i/lub ubogą w cholesterol i/lub ubogą w sól dietą.

24. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1 - 23, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest stosowany w ilościach od około 0,0001 do 10 mg/kg wagi ciała, albo od około 0,01 do 5 mg/kg wagi ciała albo od około 0,1 do 3 mg/kg wagi ciała albo od około 1 do 2 mg/kg masy ciała.

PL 209 371 B1

25. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1 - 24, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest stosowany w ilości od około 0,1 do 1000 μg/kg wagi ciała albo od 1 do 100 μg/kg wagi ciała albo od około 10 do 50 μg/kg wagi ciała.

26. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1 - 25, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest podawany podskórnie.

27. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1 - 25, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest podawany domięśniowo.

28. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1 - 27, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest podawany codziennie.

29. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1 - 27, znamienne tym, że inhibitor IL-18 jest podawany co drugi dzień.

30. Zastosowanie wektora ekspresyjnego zawierającego sekwencję kodującą inhibitor IL-18 do wytwarzania leku do leczenia i/albo zapobiegania miażdżycy tętnic, przy czym inhibitor IL-18 jest wybrany z grupy składającej się z przeciwciał przeciwko IL-18, przeciwciał przeciwko dowolnej z podjednostek receptora IL-18 oraz IL-18BP, mutein IL-18BP obejmujących konserwatywne podstawienia aminokwasowe, białek fuzyjnych IL-18BP z regionami łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, IL-18BP modyfikowanych PEG, a muteina, białko fuzyjne lub IL-18BP modyfikowane PEG zachowuje aktywność biologiczną wiązania IL-18.

31. Zastosowanie według zastrz. 30, znamienne tym, że wektor ekspresyjny jest podawany przez elektrotransfer.

32. Zastosowanie według zastrz. 30 albo 31, znamienne tym, że wektor ekspresyjny jest podawany ogólnoustrojowo.

33. Zastosowanie według jednego z zastrz. 30 - 32, znamienne tym, że wektor ekspresyjny jest podawany domięśniowo.

34. Zastosowanie komórek genetycznie modyfikowanych tak, aby wytwarzały inhibitor IL-18 do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania miażdżycy tętnic, przy czym inhibitor IL-18 jest wybrany z grupy składającej się z przeciwciał przeciwko IL-18, przeciwciał przeciwko dowolnej z podjednostek receptora IL-18 oraz IL-18BP, mutein IL-18BP obejmujących konserwatywne podstawienia aminokwasowe, białek fuzyjnych IL-18BP z regionami łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, IL-18BP modyfikowanych PEG, a muteina, białko fuzyjne lub IL-18BP modyfikowane PEG zachowuje aktywność biologiczną wiązania IL-18. i

35. Zastosowanie IL-18 jako markera diagnostycznego postępu miażdżycy tętnic.