KR101975778B1 - Ptp4a1 단백질 또는 이를 암호화 하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 혈관염증질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Ptp4a1 단백질 또는 이를 암호화 하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 혈관염증질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 PTP4A1(protein tyrosine phosphatase type Ⅳ A1) 단백질 또는 이를 암호화 하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 하는 혈관질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 PTP4A1 단백질은 IL-1β, TNF-α 또는 LPS로 염증반응을 유도한 혈관내피세포에서 세포부착단백질 ICAM-1 및 VCAM-1의 발현을 억제하고, IL-1β 또는 TNF-α로 염증을 유발한 혈관내피세포 표면에 면역세포의 부착을 억제하며, 혈관내피세포에 특이적으로 과발현시킨 마우스(TG)에서 TNF-α에 의한 동맥혈관 및 폐혈관에서 세포부착단백질 ICAM-1 및 VCAM-1의 발현이 대조군(WT)에 비해서 현저히 억제됨을 확인하였고, 고지질 식이 후 PTP4A1을 과발현하는 ApoE 결핍 마우스 동맥경화 병변에 염증세포 침착 및 염증성 사이토카인 발현이 대조군에 비해 감소하였고 이는 동맥경화 병변의 안정성을 증진시키는 효과를 나타냈다. 또한, 상기 세포부착분자의 발현 억제는, PTP4A1이 A20 단백질의 발현을 증가시켜서 TRAF2 및 RIP1 단백질의 분해를 증가시키고, NF-κB 활성을 억제함으로써 최종적으로 ICAM-1 및 VCAM-1의 발현을 억제하는 것을 확인하여, 본 발명의 PTP4A1 단백질 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 혈관염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로써 유용하게 사용될 수 있다.

Description

PTP4A1 단백질 또는 이를 암호화 하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 혈관염증질환 예방 또는 치료용 조성물{Composition comprising PTP4A1 protein or polynucleotide encoding the PTP4A1 for the prevention or treatment of vascular-inflammatory disease}
본 발명은 PTP4A1(Protein tyrosine phosphate type Ⅳ A1) 단백질 또는 이를 암호화하는 뉴클레오티드를 유효성분으로 하는 동맥경화를 포함한 혈관염증질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
혈관내피세포(Vascular endothelial cell)는 혈관의 안쪽을 구성하는 단층의 세포를 말하며, 혈관의 이완과 수축을 조절하는 다양한 혈관 활성 조절인자를 생산하거나 혈액 내의 면역세포와 반응하여 이들의 이동을 돕는 역할을 한다. 조직의 손상 또는 외부 박테리아의 감염 등, 체내 염증이 발생하면 Tumor necrosis factor alpha(TNF-α) 또는 interleukin 1 beta(IL-1β) 등의 다양한 사이토카인들이 혈관 내피세포를 활성화 시키고, 혈관 염증을 유발한다. 이때, 혈관내피세포 표면에는 ICAM-1, VCAM-1, e-selectin 또는 integrin등의 세포부착단백질들의 발현이 증가되어, 혈액을 부유하고 있는 면역세포 (leukocytes, monocytes)들을 혈관벽에 부착시키거나 주변조직으로 이동을 유도함으로써, 사멸된 세포 또는 감염된 박테리아의 제거를 돕는다. 이러한 국소적인 염증 반응뿐만 아니라, 패혈증, 폐렴, 바이러스 감염, 염증성 장질환, 알러지, 천식, 관절염, 심혈관 질환, 알츠하이머 등 많은 급성/만성 염증 질환에서, 혈관내피세포가 활성화 되어 혈액 내를 부유하는 백혈구 및 림프구의 이동을 유도하여 염증반응의 개시자로서 역할한다.
최근 혈관내피세포의 염증이 동맥경화 및 심혈관질환의 주요한 원인으로 보고되었는데(Libby, P. et al., Inflammation and atherosclerosis. 2002, Circulation, 105, 1135-1143), 동맥경화증의 초기 원인으로 혈관손상 등에 의해 동맥벽에 염증이 생겨 혈관 내피세포가 활성화 되고, 혈액에 존재하는 면역세포와 혈소판, 피브린(fibrin)등이 혈관내피세포와 반응하여 동맥벽에 부착함으로써 혈관을 좁아지게 하는 것이 주 원인으로 생각되어 진다. 동맥경화증은 동맥의 탄력이 감소되고 동맥이 좁아지는 질병으로, 이로 인해 조직내의 혈류량이 감소되어 뇌에서는 뇌졸중, 심장에는 협심증 및 심근경색등의 원인이 된다.
동맥경화가 원인이 되어 나타나는 대표적인 혈관질환인 뇌혈관질환과 심장질환의 국내 사망 원인 순위는 2013년 각각 2위 및 3위로 인구 10만명당 사망율이 50.3(전체 사망원인의 9.6%)와 50.2(전체 사망원인의 9.5%)를 차지할 정도로 심각한 질환이다. 동맥경화는 서서히 진행되므로 증상이 나타나지 않다가 동맥의 내경이 70%이상 막혀 혈류장애를 일으켰을 때 증상이 나타난다. 동맥경화의 치료로는 협착이 심하지 않을 경우 약물로 혈관 협착의 진행을 막는 예방적 치료와, 협착이 심한 경우 혈관성형술, 스텐트 삽입술 등의 중재적 시술 및 동맥내막절제술, 동맥우회로수술등의 수술적 치료방법이 있다. 초기 동맥경화의 치료 약물로는 질산염, 베타차단제, 아스피린, 콜레스테롤 저하제 및 항혈소판제제등의 약물이 이용되고 있으며 이들은 질병의 진행을 더디게 하거나 증상을 완화하는 효과가 있을 뿐, 근본적인 치료는 되지 않는다. 따라서 혈관내피세포의 면역세포 부착 억제 기술은 향후 혈관염증질환의 예방과 치료에 중요한 표적이 될 것으로 생각된다.
PTP4A1(protein tyrosine phosphatase type Ⅳ A1)은 세포 성장, 증식, 이동을 매개하는 세포내 신호전달에 있어 중요한 역할을 하며, 암의 진행과 전이에 연관되어 있는 것으로 알려져 있다(Neel, B.G. et al., 1997, Curr. Opin. Cell Biol. 9, 193-204; Zhang, Z.-Y. 2002, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 41, 209-234, Jing D. et al., 2014, Mol. Med. Rep. 10, 1426-1432). Luo Y.등은 PTP4A1이 MMP2, MMP9, Src, ERK1/2를 조절하여 암세포의 이동과 침윤을 증진시키고(Luo et al., 2009, Biochem, 3, 1838-1846), Mir-339-5P는 PTP4A1 신호를 표적으로 하여 대장암의 성장과 전이를 억제하는 것이 보고되어 있다(Zhou C. et al, 2013, PLoS One, 16, e63142). 이같은 보고들은 PTP4A1이 세포의 이동에 중요한 역할을 담당함을 시사하고 있다. 그러나 PTP4A1의 혈관내피세포 활성화 및 염증조절, 또는 혈관질환에 관련한 보고는 전무하다.
이러한 배경 하에 본 발명자들은 동맥경화와 같은 혈관염증질환의 예방 또는 치료법을 개발하기 위하여, 세포부착단백질 발현 억제를 통한 혈관염증질환 예방 및 치료를 위한 새로운 물질로 PTP4A1 단백질을 제시하고자 하며, 혈관내피세포에 PTP4A1을 과발현시켰을 경우 TNF-α, IL-1β 또는 LPS에 의해 유도되는 ICAM-1 및 VCAM-1등 세포부착단백질들의 발현이 억제되는데, PTP4A1은 세포부착단백질들의 발현을 촉진하는 NF-κB 전사인자의 활성 억제 단백질인 A20의 발현을 증가시켜 NF-κB의 활성을 억제함을 확인하였으며, 결국 PTP4A1 단백질은 ICAM-1 및 VCAM-1등 세포부착단백질들의 발현 억제를 통해서 IL-1β 및 TNF-α에 의해 유도되는 면역세포의 혈관내피세포 표면 부착을 감소시킴을 확인하였다. 또한, PTP4A1을 혈관특이적으로 과발현시킨 마우스 제작을 통해서 실제 혈관염증 동물모델에서 mouseTNF-α에 의해 유도되는 ICAM-1 및 VCAM-1의 발현이 대조군에 비해서 현저히 억제됨과 혈관내피세포에 특이적으로 PTP4A1이 과발현하는 C57BL/6N 및 Apolipoprotein E (ApoE, 고지혈증 마우스 모델) 결핍 마우스를 제작하여, 고지질 식이 후 PTP4A1을 과발현하는 ApoE 결핍 마우스 동맥경화 병변에 염증세포 침착 및 염증성 사이토카인 발현이 대조군에 비해 감소하였고 이는 동맥경화 병변의 안정성을 증진시키는 효과를 확인함으로써, PTP4A1 단백질이 염증반응에 기초한 혈관질환의 발달을 억제하는 효과가 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 PTP4A1(protein tyrosine phosphatase type Ⅳ A1) 단백질 또는 이를 암호화 하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 혈관염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 PTP4A1(protein tyrosine phosphatase type Ⅳ A1) 단백질을 유효성분으로 함유하는 혈관염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 PTP4A1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 혈관염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 PTP4A1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 혈관염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 실험군으로서 피검체 유래 시료에서 PTP4A1의 발현 수준을 측정하는 단계;
2) 단계 1)의 PTP4A1의 발현 수준과 대조군 유래 시료의 PTP4A1의 발현 수준을 비교하는 단계; 및
3) 단계 2)의 PTP4A1 발현 수준이 대조군에 비해 감소하는 경우 혈관질환에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 혈관염증질환 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은
1) PTP4A1 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 처리된 세포주에서 PTP4A1 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 PTP4A1 단백질의 발현 또는 활성 수준이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 혈관염증질환 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 PTP4A1(protein tyrosine phosphatase type Ⅳ A1) 단백질은 TNF-α, IL-1β 또는 LPS 등과 같은 염증유도 물질에 의해 활성화된 혈관내피세포에서 A20 단백질의 발현을 더욱더 증가시켜 NF-κB 전사인자의 활성을 억제함으로써, 세포부착단백질 ICAM-1 및 VCAM-1의 발현을 억제하는 것을 확인하였고, 또한, IL-1β, TNF-α로 염증을 유도한 혈관내피세포 표면에 면역세포의 부착을 억제하고, 혈관내피세포 특이적으로 PTP4A1을 과발현 시킨 마우스에서는 염증유도물질에 의한 세포부착단백질 ICAM-1 및 VCAM-1의 발현이 억제됨을 확인함과 함께 혈관내피세포에 특이적으로 PTP4A1이 과발현하는 C57BL/6N 및 Apolipoprotein E (ApoE, 고지혈증 마우스 모델) 결핍 마우스를 제작하여, 고지질 식이 후 PTP4A1을 과발현하는 ApoE 결핍 마우스 동맥경화 병변에 염증세포 침착 및 염증성 사이토카인 발현이 대조군에 비해 감소하였고 이는 동맥경화 병변의 안정성을 증진시키는 효과 확인을 통해서 혈관내피세포의 염증 유발 억제 조절효과를 확인하여, 상기 PTP4A1 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 혈관염증질환의 예방 또는 치료용 조성물로써 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 혈관내피세포에서 PTP4A1(protein tyrosine phosphatase type Ⅳ A1) 단백질의 발현을 면역형광염색을 이용하여 나타낸 도이다.
도 2는 PTP4A1 단백질 발현 조절에 따른 세포부착단백질의 발현 변화를 나타낸 도이다:
도 2a, shPTP4A1에 의한 PTP4A1 발현 억제 확인;
도 2b, PTP4A1 발현 억제 세포주에서 IL-1β로 유도한 ICAM-1 및 VCAM-1 발현 증가 확인;
도 2c, PTP4A1 발현 억제 세포주에서 TNF-α로 유도한 ICAM-1 및 VCAM-1 발현 증가 확인;
도 2d, PTP4A1 발현 억제 세포주에서 LPS로 유도한 ICAM-1 및 VCAM-1 발현 증가 확인;
도 2e, PTP4A1 과발현 벡터에 의한 PTP4A1 과발현 확인;
도 2f, PTP4A1 발현 증가 세포주에서 IL-1β로 유도한 ICAM-1 및 VCAM-1 발현 감소 확인;
도 2g, PTP4A1 발현 증가 세포주에서 TNF-α로 유도한 ICAM-1 및 VCAM-1 발현 감소 확인; 및
도 2h, PTP4A1 발현 증가 세포주에서 LPS로 유도한 ICAM-1 및 VCAM-1 발현 감소 확인.
도 3은 PTP4A1 단백질 발현 조절에 따른 면역세포의 혈관내피세포 부착 변화를 나타낸 도이다:
도 3a, shPTP4A1에 의한 면역세포의 혈관내피세포 부착 증가 확인;
도 3b, PTP4A1 과발현에 의한 면역세포의 혈관내피세포 부착 감소 확인,
도 3c, shPTP4A1에 의한 면역세포의 혈관내피세포 부착 증가의 정량화 그래프; 및
도 3d, PTP4A1 과발현에 의한 면역세포의 혈관내피세포 부착 감소의 정량화 그래프.
도 4는 C57BL/6N (wild type) 및 Apolipoprotein E 결핍 마우스(고지혈증 마우스 모델)에서 혈관 특이적인 PTP4A1 단백질 발현 증가에 의해 세포부착단백질 발현 및 염증세포 침착 억제 효과를 나타낸 도이다:
도 4a, C57BL/6N 마우스 동맥혈관에서 세포부착단백질의 유전자 발현 감소;
도 4b 및 4c, C57BL/6N 마우스 폐동맥에서 세포부착단백질의 유전자 발현 감소;
도 4d, Apolipoprotein E 결핍 마우스의 동맥경화 병변에서 혈관 특이적 PTP4A1 과발현에 의한 염증세포 침착 및 염증성 사이토카인 발현 감소;
도 4e, 동맥경화 병변에서 necrotic area 감소; 및
도 4f, 동맥경화 병변에서 collagen 침착 증가.
도 5는 PTP4A1 단백질 발현 증가에 따른 A20 단백질의 발현 변화와 NF-κB 및 상위 신호전달인자의 활성이 억제된 효과를 나타낸 도이다.
도 5a, PTP4A1 과발현에 의한 A20 발현 증가;
도 5b, PTP4A1 과발현에 의한 TRAF2 및 RIP1 분해 증가;
도 5c, PTP4A1 과발현에 의한 IKKα/β, IκBα, NF-κB 서브유닛 p65의 인산화 억제; 및
도 5d, A20 siRNA에 의한 ICAM-1 및 VCAM-1 발현 증가.
도 6은 PTP4A1의 탈인산화 효소 활성에 의한 세포부착단백질의 및 NF-κB 전사인자 활성 변화를 나타낸 도이다.
도 6a, PTP4A1의 인산화효소 활성 억제(DN-PTP4A1-over)에 의한 ICAM-1, VCAM-1 증가 및 NF-κB 서브유닛 p65의 인산화 증가; 및
도 6b, PTP4A1의 인산화효소 활성 억제(DN-PTP4A1-over)에 의한 ICAM-1, VCAM-1 발현 증가 및 NF-κB 서브유닛 p65의 인산화 증가의 정량화 그래프.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 PTP4A1(protein tyrosine phosphatase type Ⅳ A1) 단백질을 유효성분으로 함유하는 혈관염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 PTP4A1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 혈관염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 PTP4A1 단백질은 하기 1) 내지 3)의 아미노산 서열로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하다:
1) 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열(NCBI Accession number: NM_03463.4);
2) 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열의 일부 아미노산 서열; 및
3) 서열번호 1과 95% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열.
상기 PTP4A1 단백질은 ICAM-1(intercellular Adhesion Molecule-1) 또는 VCAM-1(vascular cell adhesion molecule-1)의 발현을 억제하는 것을 특징으로 한다.
상기 PTP4A1 단백질은 A20의 발현을 증가, TRAF2 또는 RIP1 단백질의 분해를 촉진, 또는 NF-κB 활성을 억제하는 것을 특징으로 한다.
상기 혈관염증질환은 동맥경화, 류마티스 관절염, 급성 폐혈증, 대동맥류, 및 당뇨병성 말초혈관질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 PTP4A1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 혈관염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 PTP4A1 단백질은 하기 1) 내지 3)의 아미노산 서열로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하다:
1) 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열;
2) 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열의 일부 아미노산 서열; 및
3) 서열번호 1과 95% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열.
상기 PTP4A1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 인체 또는 동물세포에서 발현되는 선형 DNA, 플라스미드 벡터, 바이러스성 발현벡터를 포함하는 벡터 또는 재조합 레트로바이러스(retrovirus) 벡터, 재조합 아데노바이러스(adenovirus) 벡터, 또는 재조합 렌티바이러스(lentivirus) 벡터를 포함하는 재조합 바이러스 벡터인 것이 바람직하고, 재조합 아데노 부속 바이러스(adeno-associated virus, AAV) 벡터 및 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus) 벡터인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 혈관염증질환은 동맥경화, 류마티스 관절염, 급성 폐혈증, 대동맥류, 및 당뇨병성 말초혈관질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 면역형광염색을 실시하여 혈관내피세포에서 PTP4A1 단백질이 발현되는 것을 확인하였다(도 1 참조). 또한, 혈관내피세포주에서 PTP4A1 발현 변화에 따른 세포부착단백질의 발현 변화를 확인하기 위하여, 혈관내피세포주에 shRNA 또는 과발현 벡터를 도입한 뒤, western blot분석을 실시하여 ICAM-1 및 VCAM-1의 단백질 발현량을 비교한 결과, IL-1β, TNF-α 또는 LPS로 염증을 유도한 혈관내피세포에서, shPTP4A1 도입으로 PTP4A1을 knockdown한 경우 ICAM-1 및 VCAM-1 단백질이 증가하고(도 2b 내지 도 2d 참조) 혈관내피세포의 면역세포 부착이 증가 되었으며(도 3a 및 도 3c 참조), 반대로, PTP4A1 과발현벡터(PTP4A1 Over) 도입으로 PTP4A1 단백질 발현을 증가시킨 경우, ICAM-1 및 VCAM-1 발현이 감소하며(도 2f 내지 도 2h 참조), 면역세포 부착이 감소되는 것을 확인하였다(도 3b 및 d 참조).
또한, 본 발명자들은 동물모델에서 PTP4A1의 혈관내피 염증제어 효과를 확인하기 위하여, 혈관내피세포에 특이적으로 PTP4A1이 과발현하는 C57BL/6N 및 Apolipoprotein E (ApoE, 고지혈증 마우스 모델) 결핍 마우스를 제작하였으며, mouseTNF-α를 처리하여 동맥혈관 및 폐혈관에서 ICAM-1 및 VCAM-1의 발현량이 대조군 비해 현저히 감소된 것을 확인하였고, 고지질 식이 후 PTP4A1을 과발현하는 ApoE 결핍 마우스 동맥경화 병변에 염증세포 침착 및 염증성 사이토카인 발현이 대조군에 비해 감소하였고 이는 동맥경화 병변의 안정성을 증진시키는 효과를 나타냈다(도 4 참조). 또한 PTP4A1이 세포부착단백질의 발현을 조절하는 전사인자인 NF-κB의 활성을 조절하는 A20 단백질의 발현 및 A20 단백질과 NF-κB 신호경로의 중간 신호전달자인 TRAF2 및 RIP1의 단백질 분해 조절기능을 확인하기 위하여 western blot을 분석을 실시한 결과, PTP4A1은 A20 단백질의 발현을 증가시켜서, TRAF2 및 RIP1의 단백질의 분해를 촉진시킴으로써 NF-κB 서브유닛 p65의 인산화를 억제한다는 것을 확인하였다(도 5 참조).
또한, A20 유전자의 siRNA를 PTP4A1 과발현 혈관내피세포에 도입하여 염증유도 물질을 처리한 후 세포부착단백질 발현과 p65의 인산화를 확인한 결과, PTP4A1 과발현에 의한 ICAM-1 및 VCAM-1의 발현저해능력을 복구하고 p65의 인산화를 복구함으로써(도 5d 참조), 상기 결과로부터 PTP4A1이 A20 발현증가에 의해 세포부착단백질의 발현을 억제 할 수 있음을 확인하였다. 또한 본 발명자들은 PTP4A1의 탈인산화 조절 활성부위의 아미노산 잔기의 변이를 유도하여(DN-PTP4A1-Over) PTP4A1 단백질의 탈인산화 효소 활성을 억제하여 세포부착단백질 및 NF-κB 발현 변화를 분석한 결과, PTP4A1에 의해 감소되었던 세포부착단백질의 발현과, NF-κB 서브유닛 p65의 인산화가 PTP4A1 단백질의 탈인산화 효소 활성 억제에 의해 회복되는 것을 확인하였다(도 6 참조).
따라서, 상기의 결과로부터 PTP4A1 유전자, 단백질의 발현 및 활성을 증가시켰을 때, 혈관내피세포의 세포부착단백질 발현이 억제되고, 면역세포의 혈관내벽 부착이 억제됨을 확인함으로써, PTP4A1 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 혈관염증질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's ThePharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed.(2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington'sPharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.
본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주입용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 단백질을 0.0001 내지 10 중량%로, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량%를 포함한다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 조성물의 일일 투여량은 0.0001 ~ 10 ㎎/㎖이며, 바람직하게는 0.0001 ~ 5 ㎎/㎖이며, 하루 일 회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 PTP4A1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터의 경우 0.05 내지 500 ㎎을 함유하는 것이 바람직하고, 0.1 내지 300 ㎎을 함유하는 것이 더욱 바람직하며, PTP4A1 단백질을 암호화는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 바이러스의 경우, 103~1012IU (10 내지 1010 PFU)를 함유하는 것이 바람직하고, 105내지 1010IU를 함유하는 것이 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명의 PTP4A1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 조성물의 유효 용량은 체중 1 ㎏당 벡터의 경우에는 0.05 내지 12.5 ㎎/㎏, 재조합 바이러스의 경우에는 107내지 1011 바이러스 입자(105 내지 109 IU)/㎏이고, 바람직하게는 벡터의 경우에는 0.1 내지 10 ㎎/㎏, 재조합 바이러스의 경우에는 108 내지 1010 입자(106 내지 108 IU)/㎏이며, 하루 2 내지 3회 투여될 수 있다. 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 발병 정도에 따라 변할 수 있다.
또한, 본 발명은 혈관질환 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법을 제공한다.
상기 검출방법은 하기 단계를 포함하는 것이 바람직하다:
1) 실험군으로서 피검체 유래 시료에서 PTP4A1의 발현 수준을 측정하는 단계;
2) 단계 1)의 PTP4A1의 발현 수준과 대조군 유래 시료의 PTP4A1의 발현 수준을 비교하는 단계; 및
3) 단계 2)의 PTP4A1 발현 수준이 대조군에 비해 감소하는 경우 혈관염증질환에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정하는 단계.
상기 검출 방법에 있어 단계 1)의 PTP4A1의 발현 수준은 웨스턴 블랏(Western blotting), 효소-면역화학 검출법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining, IHC), 면역침강(immunoprecipitation) 및 면역형광법(immunofluorescence)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 혈관염증질환은 동맥경화, 류마티스 관절염, 급성 폐혈증, 대동맥류, 및 당뇨병성 말초혈관질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 혈관질환 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 혈관질환 치료제 후보물질의 스크리닝 방법은 하기 단계를 포함하는 것이 바람직하다:
1) PTP4A1 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 처리된 세포주에서 PTP4A1 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 PTP4A1 단백질의 발현 또는 활성 수준이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가된 피검물질을 선별하는 단계.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 단계 1)의 피검물질은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사산물 및 생합성 분자로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
상기 단계 2)의 단백질의 발현 수준은 면역침강법, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학염색법(IHC), RT-PCR, Western Blotting 및 유세포 분석법(FACS)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 2)의 단백질의 활성 수준은 SDS-PAGE, 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 질량분석 및 단백질 칩으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 혈관염증질환은 동맥경화, 류마티스 관절염, 급성 폐혈증, 대동맥류, 및 당뇨병성 말초혈관질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
따라서, 본 발명에서는 PTP4A1 유전자 또는 단백질의 발현 및 활성을 증가시켰을 때, 혈관내피세포의 세포부착단백질 발현이 억제되고, 면역세포의 혈관내벽 부착이 억제됨을 확인하였으므로, PTP4A1 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 혈관염증질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용할 수 있으며, 상기 PTP4A1 유전자 또는 단백질의 발현 및 활성 분석을 통해 혈관질환 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법 및 혈관질환 치료제 후보물질의 스크리닝 방법에 활용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실험예에 의해서 상세히 설명한다.
단 하기 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실험예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
< 실험예 1> 혈관내피세포에서 PTP4A1 단백질 분석 및 PTP4A1 발현 조절에 따른 혈관내피세포의 세포부착 단백질 발현 변화 확인
<1-1> PTP4A1의 혈관내피세포에서의 변화 확인
본 발명자들은 PTP4A1 단백질의 발현 조절에 따른 혈관내피세포의 세포부착 단백질 발현 변화를 확인하였다.
구체적으로, 먼저 혈관내피세포에서 PTP4A1의 발현을 면역형광염색을 이용하여 확인하였다. 면역형광염색은 마우스(C57BL/6N)의 대동맥을 분리하고 이를 4% 포름알데히드 수용액에 48시간 고정하였다. 이후 통상적인 파라핀 임베딩을 통하여 블록을 제작한 후 4㎛ 두께로 슬라이드를 제작하였다. 항원 복원을 위하여 10 mM sodium citrate 수용액(pH 6.0)에 97도로 20분간 처리한 후 PBS(phosphate buffered saline)으로 3번 워싱하고, 0.2% trition X-100 용액으로 상온에서 20분간 처리하였다. 단계적으로 비특이적 항원결합을 막기 위해 1% BSA(bovine serum albumin)를 상온에서 1시간 처리한 다음 워싱 후 anti-mouse CD31(AF3628, R&D systems), anti-mouse PTP4A1(제작) 항체를 16시간 동안 4℃에서 처리하였다. 다음으로 2차 항체인 AlexaFluor 488(A11001, Life Technologies), tetramethylrhodamin B siothicyanate(TRITC) conjugated(ab6786, Abcam)를 상온에서 2시간 처리하고 워싱 후 DAPI를 1:1000으로 희석하여 2분간 처리하였다. 이후 현광형미경(Olympus, IX81-ZDC)을 사용하여 확인하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 PTP4A1 단백질이 혈관내피세포 특이적 표지자 CD31과 같은 위치에서 발현되고 있음을 확인하였다(도 1 참조).
<1-2> PTP4A1의 발현 조절에 따른 혈관내피세포의 세포부착 단백질 변화
본 발명자들은 혈관내피세포에 발현하는 PTP4A1의 염증관련 기능을 확인하고자 PTP4A1의 Knock-down 및 과발현 혈관내피세포주를 제작하였다.
구체적으로, 서열번호 6으로 기재되는 염기서열을 가지고 있는 PTP4A1 shRNA 벡터를 구매하였으며(SHCLNG-NM_003463,sigma Aldrich), 대조군으로는 PLKO.1 벡터(SHC001, sigma aldhrich)를 사용하였다. PTP4A1 과발현 벡터를 제작하기 위하여 Human Umbilical Artery Endothelial cell(HUAEC)을 trizol reagent(15596018, Life Technology)를 사용하여 total mRNA를 분리하고, reverse transcriptase(M170B, Promega)와 RNase inhibitor(N2518, Promega)를 사용하여 cDNA를 만들어, 이를 소스로 하여 PTP4A1 유전자(NM_03463.4)를 PCR 방법으로 증폭하여 pLVX-EF1α-IRES-Puro 벡터(631988, Clontech)에 클로닝하였다. 이들 벡터를 Lenti-X 293T cell(632180, Clontech)에 lentiviral envelop protein making 벡터인 psPAX2(#12260, addgene)와pMD2.G(#12259, addgene)를 transfection reagent인 Lipofectamine 2000(11668-019, invitrogen)을 사용하여 transfection을 수행하였고, 24시간과 48시간에 상등액을 수거하여 Ultra-centrifugation(25,000 rpm, 4℃, 2hr)을 실시하여 농축된 virus를 얻어 혈관내피세포에 polybrene(sc-134220, santa cruz)을 최종농도 5 μg/ml로 맞추어 처리한 후에, puromycin(P8833, sigma Aldrich)을 이용하여 2 μg/ml농도의 배양액으로 감염된 세포주들만을 선택 및 분리 배양하였다. 이후 완성된 세포주에서 cDNA를 추출하여 PTP4A1의 발현을 RT-PCR(GoTaq Green Master Mix, M7823, Promega)과 Realtime-PCR(SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix, 172-5270, BIO-RAD)방법을 사용하여 확인하였다. 이렇게 완성된 PTP4A1 유전자 발현 조절 세포주에 염증유도 물질인 IL-1β, TNF-α 또는 LPS를 투여 하여, 염증시 PTP4A1 단백질의 기능을 알아보았다.
서열
PTP4A1 primer
 F : TTG GCC TTT TGA TGA TGG TG (서열번호 2)
R : TGG AAT CTT TGA AAC GCA GC (서열번호 3)
GAPDH primer
 F : ACA CGT TGG CAG TGG GGA CA (서열번호 4)
R : TGC CTC CTG CAC CAC CAA CT (서열번호 5)
PTP4A1 shRNA CCGGATTGTTGATGACTGGTTAAGTCTCGAGACTTAACCAGTCATCAACAATTTTTTG (서열번호 6)
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 PTP4A1 shRNA 및 PTP4A1 과발현 벡터에 의해 PTP4A1의 발현 정도가 변하는 것을 확인하였다(도 2a 및 도 2e). 또한, IL-1β, TNF-α 또는 LPS를 처리하였을 때 ICAM-1과 VCAM-1의 발현이 시간 의존적으로 증가하는데, shRNA로 PTP4A1의 발현을 억제하면 IL-1β, TNF-α또는 LPS에 의한 ICAM-1 및 VCAM-1의 발현이 더욱 증진되는 것을 확인하였다(도 2b 내지 도 2d). 반면, PTP4A1의 과발현 세포주에서는 IL-1β, TNF-α 또는 LPS에 의한 ICAM-1 및 VCAM의 발현증가가 현저하게 억제되는 것을 확인하였다(도 2f 내지 도 2h).
< 실험예 2> PTP4A1의 발현조절에 따른 혈관내피세포의 면역세포 부착 변화 확인
본 발명자들은 상기 <실험예 1>에서 PTP4A1 유전자 발현조절에 의해서 세포부착 단백질이 조절됨을 확인하였다. 이후 면역세포 부착을 확인함으로써 PTP4A1에 의한 염증 억제 활성을 알아보고자 하였다.
구체적으로, 35 mm plate(81156, Ibidi)에 상기 실험예 <1-2>에서 제작한 PTP4A1 knock-down 및 과발현 세포주를 각각 2 x 105 cell/plate로 이틀간 배양한 후 1% FBS M199 with antibiotics배지로 6시간 동안 세포단식을 수행하였고, 이후 IL-1β 또는 TNF-α를 최종 농도 10 ng/ml로 6시간 처리한 이후 단핵구 세포주인 U937 세포를 Cell-Tracker Green CMFDA(C2925, Invitrogen)로 1시간 30분 동안 세포염색을 실시하였다. 염색된 U937 세포를 3 x 105cell/plate로 단식을 수행했던 각각의 세포주 위에 뿌려주었다. 2시간 공동배양 후 PBS로 4번 워싱을 수행하고, 4% 포름알데히드로 상온에서 20분간 고정한 후 형광현미경으로 16부분을 나누어 찍은 다음 염색된 각각의 U937 세포 수를 계산하여 결과를 도출하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 PTP4A1 발현을 억제시킨 혈관내피세포주에서는 PTP4A1 발현을 억제하지 않은 대조군에 비하여 염증유도 물질인 IL-1β 또는 TNF-α를 처리하였을 때 면역세포 부착이 크게 증가되었고(도 3a 및 도 3c), PTP4A1를 과발현시킨 혈관내피세포주(PTP4A1-Over+IL-1β, PTP4A1-Over+TNF-α)에서는 과발현 시키지 않고 혈관염증만 유도한 대조군(Mock+IL-1β, Mock+TNF-α)에 비하여 면역세포 부착이 현저히 억제되는 것을 확인하였다(도 3b 및 도 3d).
< 실험예 3> 혈관 특이적 PTP4A1 유전자 발현 증가시킨 동물모델에서 세포부착단백 질 발현 억제 효과 확인
본 발명자들은 PTP4A1의 혈관염증 억제 효능을 동물 질환 모델에서 검증하기 위해서 혈관 특이적 PTP4A1 유전자 발현을 증가시킨 마우스를 제작하였다.
구체적으로, 동물모델의 제작은 MARCROGEN(Korea, Daejeon)사에 의뢰를 하였으며, 사용한 벡터는 혈관특이적 발현 프로모터인 mouseTie2 promoter를 가진 벡터를 이용하였다. 실험을 위한 마우스의 선택은 일반적인 C57BL/6N 계통을 이용하였다. 혈관특이적 PTP4A1 유전자 발현증가 마우스만을 구별하기 위하여 벡터 특이적 프라이머를 이용하여 direct PCR 방법을 사용하였다. 자세한 방법은 마우스의 꼬리 일부분을 잘라 proteinase K(10910000, roche)와 Direct PCR tail solution(102-T, vivagen)을 1:25 비율로 섞은 수용액 100 ㎕에 담가 57℃에서 16시간 처리한다. 이후 vortexing을 한 후 centrifugation(14000 rpm, 4℃, 10 min)을 수행한 후, 상등액만을 추출하여 DNA 양을 측정한다. 각각의 DNA 200 ng씩을 사용하여 통상적인 PCR 방법을 통해 확인한다. 확인용 프라이머는 표 2의 서열번호 7 및 8을 이용하였다.
이렇게 제작된 혈관 특이적 PTP4A1 유전자 발현증가 마우스에서 mouseTNF-α 약물을 2 μg/20 g 농도로 8시간 동안 투여하여 혈관내피세포에 급성염증을 유도하였다. 급성 염증을 유도한 그룹과 PBS만을 투여한 그룹으로 분리하고, 각각 대조군(일반적인 C57BL/6N 마우스, WT)과 실험군(혈관특이적 PTP4A1 유전자 발현증가 마우스, TG)을 포함시켰다. 이후 각각의 마우스를 마취시키고 해파린화 염용액으로 경심 관류(transcardiac perfusion) 후 의과적 수술을 통하여 척추대동맥과 폐를 적출하였다. cDNA를 얻기 위하여 trizol reagent 800 ㎕를 넣어 균질화기기(FastPrep-24, Millipore)기기를 이용하여 20초 동안 균질화를 3번 실시하였다. 이후 Chloroform(c2432 sigma Aldrich) 200 ㎕를 넣고 15초 동안 흔들어주고 14000 rpm 4℃로 15분 원심분리를 실시하고, 투명한 상등액만을 350 ~ 400 ㎕ 얻어 새로운 tube에 옮긴 후 isopropanol(merck)을 동량으로 처리 후 15초 동안 흔들어주고 상온에서 10분 대기 후 14000 rpm 4℃로 10분 윈심분리하였다. 상등액은 전부 버리고 75% ethanol 1ml을 처리 후 14000 rpm 4℃로 5분 윈심분리를 실시하였다. 이후 상등액을 버리고 건조 후에 적정량의 DEPC water을 이용하여 total mRNA를 녹인다. RT-PCR을 위한 cDNA를 만들기 위해 Nanodrop(ND-1000, Thermo scientific)을 이용하여 total mRNA의 양을 확인하고 2 ㎍의 total mRNA를 9 ㎕의 DEPC water에 희석하고 1 ㎕의 oligo DT(C110A, Promega)를 같이 처리하여 70℃에서 10분간 유지한다. 이후 4℃에서 5분을 유지하고, 단계적으로 reverse transcriptase buffer(M531A, Promega)와 DNTP(U151B, Promega)를 각각 4 ㎕씩 넣고 reverse transcriptase(M170B, Promega)와 RNase inhibitor(N2518, Promega)를 각각 1 ㎕씩 넣은 후 42℃ 1시간 처리하였다. 마지막으로 효소 활성을 억제하기 위하여 70℃, 10분간 처리 후 냉동보관 하였다. 특이적 유전자(세포부착 단백질인 ICAM-1 및 VCAM-1 유전자)의 전사 정도를 확인하기 위하여 하기 표 2의 프라이머를 이용하여 RT-PCR(GoTaq Green Master Mix, M7823, Promega)과 Realtime-PCR(SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix, 172-5270, BIO-RAD)을 수행하였으며, 통상적인 방법을 사용하여 결과를 도출하였다.
서열
mouseTie2 promoter
 Forward: CCAAATGCACCCCAGAGAACA (서열번호 7)
Reverse:GGTCGCATTGGTTGGATTGTG (서열번호 8)
mICAM-1
 F:TGG AGA CGC AGA GGA CCT TA (서열번호 9)
R:AGG CCT GGC ATT TCA GAG TC (서열번호 10)
mVCAM-1
F:CTG GGA AGC TGG AAC GAA GT (서열번호 11)
R:CCT CGC TGG AAC AGG TCA TT (서열번호 12)
mGAPDH
 F:TGA AGT CGC AGG AGA CAA CC (서열번호 13)
R:CTA CCC CCA ATG TGT CCG TC (서열번호 14)
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 혈관 특이적 PTP4A1 유전자 발현증가 마우스인 실험군(TG)과 대조군(WT)의 염증유도 반응을 비교한 결과, 대조군(WT)의 경우 세포부착 단백질인 ICAM-1 및 VCAM-1 유전자 전사정도가 mouseTNF-α를 투여한 군에서 급격하게 증가하는 하는 반면 실험군(TG)의 경우 현저히 감소된 것을 동맥혈관(도 4a)과 폐동맥(도 4b 및 도 4c)에서 확인하였다.
아울러, 동맥경화증과 같은 만성질환에서의 혈관 특이적 PTP4A1 과발현의 혈관 염증 억제 효능을 검증하기 위하여 고지질 마우스 모델인 ApoE 결핍 마우스와 혈관 특이적 PTP4A1 과발현 마우스를 교배하여 ApoE-/- PTP4A1 마우스를 생성하여 대조군 (ApoE-/- 마우스)과 함께 고지질 식이(high fat high cholesterol, HFHC)를 8주간 실시한 후 마우스를 희생하여 심장을 획득한 후 10% 중성 포르말린에 고정 후 동결블록을 제작하여 대동맥궁 (aortic sinus) 절편을 획득한 후 면역형광염색을 실시하였다. 동맥경화 병변에서 염증세포 침착을 분석하기 위하여 anti-CD45 (550539, BD bioscience) 및 anti-F4/80 (sc-26643-R, Santa Cruz) 염색을 실시하였고 염증성 사이토카인 분석을 위해 anti-TNFalpha (sc-1351, Santa Cruz) 염색을 한 결과 PTP4A1을 혈관 특이적으로 과발현하는 ApoE 결핍 마우스(ApoE-/- PTP4A1)에서 대조군 (ApoE-/-)에 비해 현저히 감소된 것을 확인하였다(도 4d). 동맥경화 병변 내에 감소된 염증반응은 병변 내 괴사 면적 감소와 연관되는 결과를 보였다(도 4e). 또한 ApoE-/- PTP4A1 마우스 동맥경화 병변 내에 감소된 염증세포 침착은 염증세포 유래의 콜라겐 분해 효소인 matrix metalloproteinase-2 (anti-MMP-2; sc-10736, Santa Cruz), -9 (anti-MMP-9; sc-6840, Santa Cruz)의 발현을 감소시켰고 이는 콜라겐 침착 증가를 야기 시켜 동맥경화 병변의 안정성을 증가시킴을 확인하였다(도 4f).
상기 결과로부터 In vivo 및 In vitro 에서 PTP4A1 유전자의 발현 조절을 통해서 급성 및 만성 혈관내피염증의 치료 및 예방효과가 있음을 확인하였다.
< 실험예 4> PTP4A1 단백질의 A20 유전자 발현 조절을 통한 NF - κB 신호전달 체계 억제 확인 및 세포부착단백질 발현 억제 효과 확인
<4-1> PTP4A1 과발현에 의한 A20 발현 증가 확인
본 발명자들은 염증을 유도한 혈관내피세포에서 과발현된 PTP4A1 단백질이 세포부착단백질의 발현을 억제하는 메커니즘을 자세히 확인하기 위하여, 상기 실험예 <1-2>에서 제작한 PTP4A1 단백질을 과발현시킨 혈관내피세포에서 세포부착단백질의 발현을 조절하는 전사인자인 NF-κB와 관련된 신호전달 단백질의 발현 정도를 확인하였고, NF-κB의 활성억제를 담당하는 A20 단백질의 발현 및 A20 단백질과 NF-κB 신호경로의 중간 신호전달자인 TRAF2 및 RIP1의 발현 변화와 IκBα 및 IKKα/β 인산화를 western blot을 이용하여 분석하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 IL-1β로 염증을 유도한 혈관내피세포에서 PTP4A1의 과발현군(PTP4A1-Over)이 대조군(Mock)에 비해 A20 단백질의 발현이 증가됨을 확인하였으며(도 5a), 이로 인해 TRAF2 및 RIP1의 단백질의 분해가 촉진되어(도 5b) IκBα 및 IKKα/β 인산화를 억제하고 최종적으로, NF-κB 서브유닛 p65의 인산화를 현저히 억제하는 것을 확인하였다(도 5c).
<4-2> PTP4A1 과발현 세포주에서 A20 억제에 의한 세포부착단백질 발현 회복 확인
A20 단백질은 염증유도 물질에 의하여 발현이 유도되는 유전자로서, 네거티브 피드백(negative feedback) 기능으로써, TRAF2 및 RIP1 단백질의 분해를 증가시키며, NF-κB의 인산화를 저해하는 것으로 알려져있다(Catrysse, L. et al., A20 in inflammation and autoimmunity. 2014, trends in immunology, vol.35, No.1). 본 발명자들은 PTP4A1 유전자와 A20 단백질의 관계를 좀 더 알아보고자 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, PTP4A1 과발현 세포주에 A20 siRNA(sc-37655, santa cruz)를 electrophoresis transfection method를 이용하여 A20 유전자 발현을 억제하였다. 1x106 cell/100 ㎕ 당 A20 siRNA를 최종 농도가 1 μM이 되도록 처리하고 Neon(Thermo Fisher scientific)기기를 1300 v, 30 ms 1(pulse number)로 설정 후 electroporation하였다. 이후 특수배양배지(without antibiotics)에 24hr 동안 배양 후 정상배양배지로 바꿔주며 유지하였다. 상기 세포주에 염증유도 물질을 처리한 후 세포부착단백질의 별현을 확인하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 PTP4A1 과발현 세포주와 PTP4A1 과발현에 의한 A20의 발현증가를 억제한 세포주에 염증유도 물질을 처리하였을 때, PTP4A1 유전자에 의해 억제된 ICAM-1 및 VCAM-1의 단백질 발현이 복구되었으며, 이 세포부착단백질의 전사를 조절하는 NF-κB의 서브유닛 p65의 인산화도 복구되는 것을 확인하였다(도 5d).
이 같은 결과는 PTP4A1 유전자는 A20 단백질 발현을 증가시킴으로써 TRAF2 및 RIP1 단백질의 분해를 유도하여 NF-κB의 활성을 억제함으로써 결과적으로 세포부착단백질인 ICAM-1 및 VCAM-1의 단백질 발현을 억제함을 의미한다. 상기 결과로부터, PTP4A1 단백질이 염증반응을 억제하는 기능이 있음을 확인하였다.
< 실험예 5> PTP4A1 탈인산화 효소 활성 조절에 의한 세포부착단백질 발현 억제 효과 확인
본 발명자들은 PTP4A1 단백질에 의한 세포부착단백질의 발현 억제에 있어서 PTP4A1의 탈인산화 효소의 활성이 요구되는지를 알아보기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, PTP4A1 활성부위의 아미노산 잔기의 변이를 유도하여 PTP4A1 단백질의 탈인산화 효소 활성을 억제한 세포 주(Dominant negative PTP4A1-Over, DN-PTP4A1-Over)를 제작하였다. PTP4A1의 탈인산화 효소 활성은 국제 생물정보학 홈페이지인 www.uniport.org 에서 Q93096으로 PTP4A1을 검색하여 이 유전자의 활성을 나타내는 아미노산 염기서열을 확인하였으며, 72번째 아미노산인 aspartic acid를 alanine으로 치환하고, 104번째 아미노산인 cysteine을 serine으로 치환하여 PTP4A1의 활성을 완전히 제거 하였다. 이를 위하여 Point mutation PCR을 수행하였으며, pfu Taq 중합효소와 변이 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하고 DPN1 효소를 처리하여 메틸화된 DNA 사슬을 제거하였다. 이후 transformation을 통하여 변이된 아미노산 잔기를 가진 PTP4A1 벡터를 얻어내어 사용하였다. 사용된 프라이머는 하기 표 3과 같다. PTP4A1 과발현 세포주(PTP4A1-Over)와 PTP4A1 탈인산화 효소 활성이 억제된 과발현 세포주(DN-PTP4A1-Over)를 이용하여 IL-1β에 의한 세포부착단백질 및 NF-κB 발현 변화를 western blot으로 분석하였다.
서열
정상 (72번)
 F:ATT GCT GTT CAT TGC GTT GCA GGC CTT (서열번호 15)
R:AAG GCC TGC AAC GCA ATG AAC AGC AAT (서열번호 16)
변이 (72번) primer
F:ATT GCT GTT CAT A GC GTT GCA GGC CTT (서열번호 17)
R:AAG GCC TGC AAC GC T ATG AAC AGC AAT (서열번호 18)
정상 (104번)
 F:TGG CCT TTT GAT GAT GGT GCA CCA CCA (서열번호 19)
R:TGG TGG TGC ACC ATC ATC AAA AGG CCA (서열번호 20)
변이 (104번) primer
F:TGG CCT TTT GAT G C T GGT GCA CCA CCA (서열번호 21)
R:TGG TGG TGC ACC A G C ATC AAA AGG CCA (서열번호 22)
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 PTP4A1 과발현에 의해 감소되었던 세포부착단백질의 발현 및 NF-κB의 활성이 PTP4A1 단백질 탈인산화 활성 억제에 의해 회복되는 것을 확인하였다(도 6). 따라서, 세포부착단백질의 발현억제는 PTP4A1 단백질의 발현 증가뿐 아니라, PTP4A1 단백질의 활성 증가 또한 유효성이 있음을 확인하였다.
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> Composition comprising PTP4A1 protein or polynucleotide encoding the PTP4A1 for the prevention or treatment of vascular-inflammatory disease <130> 2016P-03-016 <160> 22 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 173 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Arg Met Asn Arg Pro Ala Pro Val Glu Val Thr Tyr Lys Asn 1 5 10 15 Met Arg Phe Leu Ile Thr His Asn Pro Thr Asn Ala Thr Leu Asn Lys 20 25 30 Phe Ile Glu Glu Leu Lys Lys Tyr Gly Val Thr Thr Ile Val Arg Val 35 40 45 Cys Glu Ala Thr Tyr Asp Thr Thr Leu Val Glu Lys Glu Gly Ile His 50 55 60 Val Leu Asp Trp Pro Phe Asp Asp Gly Ala Pro Pro Ser Asn Gln Ile 65 70 75 80 Val Asp Asp Trp Leu Ser Leu Val Lys Ile Lys Phe Arg Glu Glu Pro 85 90 95 Gly Cys Cys Ile Ala Val His Cys Val Ala Gly Leu Gly Arg Ala Pro 100 105 110 Val Leu Val Ala Leu Ala Leu Ile Glu Gly Gly Met Lys Tyr Glu Asp 115 120 125 Ala Val Gln Phe Ile Arg Gln Lys Arg Arg Gly Ala Phe Asn Ser Lys 130 135 140 Gln Leu Leu Tyr Leu Glu Lys Tyr Arg Pro Lys Met Arg Leu Arg Phe 145 150 155 160 Lys Asp Ser Asn Gly His Arg Asn Asn Cys Cys Ile Gln 165 170 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTP4A1 primer F <400> 2 ttggcctttt gatgatggtg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTP4A1 primer R <400> 3 tggaatcttt gaaacgcagc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH primer F <400> 4 acacgttggc agtggggaca 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH primer R <400> 5 tgcctcctgc accaccaact 20 <210> 6 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTP4A1 shRNA <400> 6 ccggattgtt gatgactggt taagtctcga gacttaacca gtcatcaaca attttttg 58 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouseTie2 promoter F <400> 7 ccaaatgcac cccagagaac a 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouseTie2 promoter R <400> 8 ggtcgcattg gttggattgt g 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mICAM-1 F <400> 9 tggagacgca gaggacctta 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mICAM-1 R <400> 10 aggcctggca tttcagagtc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mVCAM-1 F <400> 11 ctgggaagct ggaacgaagt 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mVCAM-1 R <400> 12 cctcgctgga acaggtcatt 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mGAPDH F <400> 13 tgaagtcgca ggagacaacc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mGAPDH R <400> 14 ctacccccaa tgtgtccgtc 20 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Normal 72 F <400> 15 attgctgttc attgcgttgc aggcctt 27 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Normal 72 R <400> 16 aaggcctgca acgcaatgaa cagcaat 27 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutation 72 F <400> 17 attgctgttc atagcgttgc aggcctt 27 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutation 72 R <400> 18 aaggcctgca acgctatgaa cagcaat 27 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Normal 104 F <400> 19 tggccttttg atgatggtgc accacca 27 <210> 20 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Normal 104 R <400> 20 tggtggtgca ccatcatcaa aaggcca 27 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutation 104 F <400> 21 tggccttttg atgctggtgc accacca 27 <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutation 104 R <400> 22 tggtggtgca ccagcatcaa aaggcca 27

Claims (17)

  1. PTP4A1(protein tyrosine phosphatase type Ⅳ A1) 단백질을 유효성분으로 함유하는 혈관염증질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 PTP4A1 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 PTP4A1 단백질은 ICAM-1(intercellular Adhesion Molecule-1) 또는 VCAM-1(vascular cell adhesion molecule-1)의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 PTP4A1 단백질은 A20 단백질의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 PTP4A1 단백질은 TRAF2 또는 RIP1 단백질의 분해를 촉진, 또는 NF-κB 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  6. PTP4A1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 혈관염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 벡터는 선형 DNA 플라스미드 DNA 및 재조합 바이러스성 벡터로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 부속 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 렌티바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  9. 제 1항 또는 6항에 있어서, 상기 혈관염증질환은 동맥경화, 류마티스 관절염, 급성 폐혈증, 대동맥류, 및 당뇨병성 말초혈관질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  10. 1) 실험군으로서 피검체 유래 시료에서 PTP4A1의 발현 수준을 측정하는 단계;
    2) 단계 1)의 PTP4A1의 발현 수준과 대조군 유래 시료의 PTP4A1의 발현 수준을 비교하는 단계; 및
    3) 단계 2)의 PTP4A1 발현 수준이 대조군에 비해 감소하는 경우 혈관염증질환에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정하는 단계;
    를 포함하는 혈관염증질환 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 단계 1)의 PTP4A1의 발현 수준은 웨스턴블랏(Western blotting), 효소-면역화학 검출법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining, IHC), 면역침강(immunoprecipitation) 및 면역형광법(immunofluorescence)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 측정하는 것을 특징으로 하는 단백질 검출 방법.
  12. 제 10항에 있어서, 상기 혈관염증질환은 동맥경화, 류마티스 관절염, 급성 폐혈증, 대동맥류, 및 당뇨병성 말초혈관질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 단백질 검출 방법.
  13. 1) PTP4A1 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;
    2) 단계 1)의 처리된 세포주에서 PTP4A1 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및
    3) 단계 2)의 PTP4A1 단백질의 발현 또는 활성 수준이 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가된 피검물질을 선별하는 단계;
    를 포함하는 혈관염증질환 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 단계 1)의 피검물질은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사산물 및 생활성 분자로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  15. 제 13항에 있어서, 단계 2)의 단백질의 발현 수준은 면역침강법(immunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학염색법(IHC), RT-PCR, 웨스턴 블롯(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 측정하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  16. 제 13항에 있어서, 단계 2)의 단백질의 활성 수준은 SDS-PAGE, 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 질량분석 및 단백질 칩으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 측정하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  17. 제 13항에 있어서, 상기 혈관염증질환은 동맥경화, 류마티스 관절염, 급성 폐혈증, 대동맥류, 및 당뇨병성 말초혈관질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
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