SK15562002A3 - Použitie IL-18 inhibítora, použitie expresného vektora obsahujúceho sekvenciu kódujúcu IL-18 inhibítor, použitie vektora na indukciu a/alebo zosilnenie endogénnej produkcie IL-18 inhibítora v bunke a použitie bunky s produkciou IL-18 inhibítora - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález spadá do oblasti cievnych ochorení. Konkrétnejšie, vynález sa týka použitia IL-18 inhibítorov na liečenie a/alebo prevenciu aterosklerózy.

Doterajší stav techniky

Ateroskleróza je najbežnejším a najdôležitejším cievnym ochorením, ale známe sú aj mnphé iné cievne poruchy. Ateroskleróza postihuje najmä veľké a stredne veľké cievy a jej lézie zahŕňajú tukové pásy, fobrolytické plaky a komplikované lézie. Ateroskleróza je chronické zápalové ochorenie cievnej steny, ktoré je charakteristické progresívnou akumuláciou lipidov, ako cholesterolu, buniek, ako makrofágov, T lymfocytov alebo buniek hladkých svalov a extracelulárnej matrice (1). Veľké akumulácie sa nazývajú aterómy alebo plaky a často obsahujú vápnik. Tukovité tkanivo môže erodovať stenu cievy, zmenšovať elasticitu cievy a interferovať s prúdom krvi. Eventuálne sa môžu vytvárať zrazeniny okolo plakových depozitov ešte viac interferujúce s prúdom krvi, ktoré môžu viesť k úplnému upchatiu krvnej cievy. Ateroskleróza sa zvyčajne spája so zvýšenými hladinami LDL-cholesterolu, Lp(a) fibrinogénu a faktora VII, ako aj so zníženými hladinami HDL-cholesterolu. Rizikové faktory zahŕňajú vyšší vek, mužské pohlavie, fajčenie, cukrovku, obezitu, vysokú hladinu cholesterolu v krvi, vysoký obsah tukov v strave a osobnú alebo rodinnú anamnézu, v ktorej sa vyskytuje srdcové ochorenie. Je hlavnou príčinou organickej ischémie, ako napr. infarktu myokardu.

Ateróm je najbežnejšia lézia v cievach, ktorá sa môže ešte skomplikovať trombo-embolizmom. Ateromatózne plaky často zužujú lumen ciev, čím spôsobujú ischémiu a niekedy atrofiu tkanív v hypoperfúznej oblasti. Vážne následky zahŕňajú symptóm angíny v dôsledku myokardiálnej ischémie, zlyhanie srdca v dôsledku

-2ischémie alebo neischemických dejov, a vysoký krvný tlak v dôsledku zúženia obličkovej cievy a hypoperfúzie obličky, ktorá fyziologicky reaguje zvýšením vylučovania renínu.

Niekedy sa ateroskleróza a artérioskleróza používajú na označenie patologických stavov oddelene. V tomto prípade je ateroskleróza definovaná ako ochorenie spôsobujúce tuhnutie (sklerózu) alebo stratu elasticity ciev špecificky v dôsledku aterómov, zatiaľ čo artérioskleróza je tuhnutie alebo strata elasticity ciev z akejkoľvek príčiny.

Komplikácie alebo následky aterosklerózy zahŕňajú cievne ochorenie (aterosklerózu koronárnych ciev), nedostatočné zásobovanie krvou v dôsledku obštrukcie (ischémia/angína), akútny Ml (infarkt myokardu, srdcový záchvat), prechodný ischemický záchvat (TIA) alebo mŕtvicu a poškodenie krvných ciev, svalov alebo telesných orgánov.

Obvyklými konsekvenciami aterosklerózy sú aj aneuryzmy, čo sú vlastne permanentné abnormálne dilatácie krvných ciev. U starších pacientov sa bežne vyvinú aterosklerotické abdominálne aortické aneuryzmy. Môžu prasknúť do retroperitoneálneho priestoru. Pri aterosklerotických aneuryzmách sa zvyčajne vyslovene stráca elasticita tkaniva a obvyklá je fibróza médie, najmä v dôsledku ischémie svalu aortickej médie, po ktorej nasleduje uvoľňovanie makrofágových enzýmov spôsobujúcich fragmentáciu elastických vlákien.

Terapeutické postupy odporúčané na liečenie alebo prevenciu aterosklerózy zahŕňajú redukciu tukov/cholesterolu v krvi. Vo veľkej miere sa používa najmä terapia znižujúca LDL-cholesterol. V súčasnosti sa najviac používajú statíny, čo sú špecifické inhibítory HMG CoA reduktázy. Ďalšie činidlá znižujúce tuky zahŕňajú liečivá ako napríklad cholestyramín, kolestipol, kyselinu nikotínovú, gemfibrozil, probukol, lovastatín a iné.

Iným prístupom je minimalizácia rizika tvorby trombov vo vzniknutých ateromatóznych léziách. Na redukciu rizika vytvorenia zrazeniny sa môže použiť aspirín, ktorý sa zdá byť špecifickým inhibítorom agregovania krvných doštičiek sprostredkovaného tromboxánom A2, alebo antikoagulanty.

Perkutánna balónová angioplastika využíva katéter s balónikom na jeho konci na uhladenie plaku na zvýšenie prúdenia krvi za oklúziou. Technika je

-3podobná technike používanej na otváranie srdcových artérií, ale môže sa aplikovať pri mnohých iných artériách v tele. Koronárne cievne zúženia sa obchádzajú segmentami safenózneho cievneho šitia do proximálnej aorty alebo desekovaním vnútornej prsnej artérie z hrudnej steny a pripojením jej distálneho konca prostredníctvom anastomózy na artériu na zadnom povrchu srdca.

V niektorých prípadoch sa môže odporúčať chirurgické odstránenie depozitov (endarterektómia, napríklad karotídová endarterektómia).

Avšak hlavným odporúčaním ostáva liečenie alebo kontrola rizikových faktorov ako strava s nízkym obsahom tukov, cholesterolu a soli a dodržiavanie odporúčaní poskytovateľa zdravotníckej starostlivosti na liečenie a kontrolu vysokého krvného tlaku, cukrovky a iných ochorení, redukcia telesnej hmotnosti, ukončenie fajčenia, ako aj pravidelné cvičenie na zlepšenie kondície srdca a obehu.

Zápalový proces sa podieľa na rôznych štádiách aterosklerózy (1). Endoteliálna aktivácia, prostredníctvom rôznych faktorov vrátane stresu s nízkou intenzitou, modifikovaných lipoproteínov a prozápalových cytokínov, sa považuje za prvý krok v ateroskleróze a je pod zápalovou kontrolou (1). Mnohé súčasné štúdie ukázali, že interakcie medzi cievnymi a zápalovými bunkami sú kritické pri aterogenéze (1). Konkrétne, inhibícia definovaných prozápalových dráh redukuje vývoj aterosklerózy (1).

Zápal hrá hlavnú úlohu aj pri narušovaní aterosklerotických plakov a trombóze (2-5), a preto ovplyvňuje výskyt akútnych ischemických syndrómov a s nimi súvisiacu úmrtnosť (6). V skutočnosti, závažné klinické prejavy aterosklerózy zahŕňajú infarkty srdca, mozgu a iných orgánov postihnutých aterosklerózou a sú spôsobené najmä oklúziou lumenu ciev trombusom vytvoreným pri kontakte s porušeným aterosklerotickým plakom (3, 4). Patologické štúdie ukázali, že zraniteľné alebo nestabilné plaky, tzn. plaky, ktoré sú náchylné na prasknutie alebo prasknuté, sa veľmi líšia bunkovým a matricovým zložením od stabilných plakov, ktoré nie sú náchylné na prasknutie (7). Zraniteľné plaky sú bohaté na zápalové bunky (makrofágy a T lymfocyty), obsahujú trombogénne lipidové jadro a sú charakteristické tenkou fibróznou čiapočkou s podstatnou stratou v extracelulámej matrici (7).

-4Znížená syntéza kolagénu, sprostredkovaná prozápalovým cytokínom IFNy, a zvýšená aktivita makrofágovú matricu degradujúcich metaloproteináz sú zodpovedné za stenčovanie a krehkosť fibróznej čiapočky (7). Prasknutím krehkej »

fibróznej čiapočky sa vysoko trombogénne lipidové jadro vystaví cirkulujúcej krvi čoho výsledkom je vytvorenie okluzívneho trombusu (1, 7). Preto je hustota zápalových buniek v danej aterosklerotickej lézii považovaná za dobrý indikátor jej nestability.

Klinická prognóza pacienta s aterosklerózou len čiastočne závisí na veľkosti lézii (19, 20). V súčasnosti sa vo všeobecnosti akceptuje, že kvalita (zloženie plaku), a nie veľkosť, lézie by mohol byť fakt, na základe ktorého sa dá lepšie predpovedať výskyt ischemických prípadov. V skutočnosti, ťažké klinické manifestácie aterosklerózy (infarkty srdca a mozgu) sú spôsobené najmä oklúziou lumenu cievy trombusom vytvoreným v kontakte s prasknutým aterosklerotickým plakom (19). Patologické štúdie ukázali, že zraniteľné alebo nestabilné plaky, ktoré sú náchylné na prasknutie alebo sú prasknuté, sú bohaté na zápalové bunky a vykazujú podstatnú stratu hladkých svalových buniek a obsahu kolagénu (20, 21). Navyše, takéto plaky vykazujú významné zvýšenie apoptickej bunkovej smrti vedúcej k formovaniu vysoko trombogénneho lipidového jadra.

Na zápale sa podieľajú prozápalové cytokíny. Cytokín interleukín 18 (IL-18) bol najprv opísaný ako faktor indukujúci interferón-γ (IFN-γ) (8). Je to skorý signál pri vývoji T-lymfocytových pomocných bunkových odpovedí typu 1 (Th1). IL-18 slúži spolu s IL-12, IL2, antigénmi, mitogénmi a možno ďalšími faktormi na indukciu produkcie IFN-γ. IL-18 posiľňuje aj produkciu GM-CSF a IL-2, umocňuje T bunkovú proliferáciu indukovanú s anti-CD3 a zvyšuje Fas-sprostredkované usmrcovanie prirodzenýčh zabíjačských buniek. Zrelý IL-18 sa produkuje zo svojho prekurzora prostredníctvom IL-Ιβ konvertujúceho enzýmu (ICO, kaspáza-1). IL-18 receptor pozostáva aspoň z dvoch zložiek spolupracujúcich na viazaní ligandu. V myšacích IL-12 stimulovaných T bunkách sa našlo vysoko- a nízko-afinitné väzobné miesto pre IL-18 (9), čo naznačuje prítomnosť viacreťazcového receptorového komplexu. Doteraz sa identifikovali dve receptorové podjednotky, pričom obe patria do IL-1 receptorovej rodiny (10). IL-18 prenos signálu zahŕňa aktiváciu NF-kB (11).

-5Nedávno sa z ľudského moču izoloval rozpustný proteín s vysokou afinitou voči IL-18 a klonovali sa ľudská a myšacia cDNA, ako aj ľudský gén (12; WO 99/09063). Proteín sa označil ako IL-18 viažuci proteín (IL-18BP).

IL-18BP nie je extracelulárnou doménou jedného zo známych IL-18 receptorov, ale je to vylučovaný, prirodzene cirkulujúci proteín. Patrí do novej rodiny vylučovaných proteínov, ktorá okrem toho zahŕňa niekoľko Poxvírusom kódovaných proteínov (12). IL-18BP sa konštitutívne exprimuje v slezine (12). Močový, ako aj rekombinantný IL-18BP sa špecificky viažu na IL-18 s vysokou afinitou a modulujú biologickú afinitu IL-18.

IL-18BP gén bol lokalizovaný na ľudský chromozóm 11q13 a nenašiel sa žiadny exón kódujúci transmembránovú doménu v 8,3kb genomickej sekvencii. U ľudí sa našli štyri zostrihové IL-18BP varianty alebo izoformy a označili sa ako IL18BP a, b, c a d, pričom všetky zdieľajú rovnaký N-koniec a líšia sa C-koncom (12).

Štyri ľudské a dve myšacie IL-18BP izoformy, ktoré sú výsledkom mRNA zostrihu, sa našli v rôznych cDNA knižniciach a exprimovali sa, purifikovali a hodnotili sa z hľadiska väzobných a neutralizačných IL-18 biologických aktivít (23). Ľudská IL-18BP izoforma a (IL-18Bpa) vykazuje najvyššiu afinitu voči IL-18 s rýchlym pripájaním a pomalým odpájaním a disociačnou konštantou (K(d)) 399 pM. IL-18BPc zdieľa lg doménu IL-18BPa s výnimkou 29 C-koncových aminokyselín; k(d) IL-18BPc je 10-násobne nižšia (2,94 nM). Napriek tomu IL-18Bpa a IL-18BPc neutralizujú IL-18 na viac ako 95 % v dvojnásobnom molovom nadbytku. IL-18BPb a 11-18BPd izoformám chýba kompletná lg doména a nemajú schopnosť viazať alebo neutralizovať IL-18. Myšacie IL-18BPc a 11-18BPd izoformy, majúce identickú lg doménu, tiež neutralizujú na viac ako 95 % myšací IL-18 v dvojnásobnom molovom nadbytku. Avšak myšacia IL-18BPd, ktorá zdieľa spoločný C-koncový motív s ľudskou IL-18BPa, neutralizuje aj ľudský IL-18. Molekulovým modelovaním sa identifikovalo veľké zmiešané elektrostatické a hydrofóbne väzobné miesto v lg doméne IL-18BP, ktoré by mohlo byť zodpovedné za jeho vysoko afinitné viazanie ligandu (23).

-6Podstata vynálezu

Vynález je založený na zistení, že IL-18 inhibítor má vyslovene kladný vplyv na vývoj plakov, progresiu plakov a stabilitu plakov v myšacom modeli aterosklerózy. IL-18 inhibítor nie len že predchádza vytvoreniu lézií v hrudnej aorte, ale aj indukuje prepnutie smerom k stabilnému plakovému fenotypu v už existujúcich aterosklerotických plakoch.

Podstatou vynálezu je teda použitie IL-18 inhibítora na výrobu lieku na prevenciu a/alebo liečenie aterosklerózy.

Vynález sa ďalej týka spôsobov liečby génovým terapeutickým prístupom a/alebo prevencie aterosklerózy.

Opis vynálezu

Vynález je založený na zistení zvýšených hladín cirkulujúceho IL-18 u pacientov s akútnymi koronárnymi syndrómami a zvýšenej produkcie IL-18 v nestabilných karotidových aterosklerotických plakoch zodpovedných za mŕtvicu. Okrem toho sa ukázalo, že elektrotransfer expresnej plazmidovej DNA, kódujúcej IL-18BP, zabraňuje vývoju tukových pásov v hrudnej aorte a spomaľuje progresiu pokročilých aterosklerotických plakov v aortickom sinuse v dobre zavedenom myšacom modeli aterosklerózy. Dôležitejšie je, že transfekcia s IL-18BP indukuje zásadné zmeny v zložení plaku (zníženie počtu makrofágov, T buniek, zníženie bunkovej smrti a obsahu lipidov a zvýšenie počtu buniek hladkej svaloviny a zvýšenie obsahu kolagénu), čo vedie k stabilnému plakovému fenotypu. Tieto výsledky po prvýkrát demonštrujú dôležitú úlohu IL-18 inhibítorov pri redukcii vývoja/progresie plakov a pri podpore stability plakov.

Vynález sa preto týka použitia IL-18 inhibítora na výrobu lieku na liečenie a/alebo prevenciu aterosklerózy.

Výraz prevencia znamená v kontexte tohto vynálezu nie len kompletnú prevenciu určitého účinku, ale aj akúkoľvek čiastočnú alebo podstatnú prevenciu, oslabenie, redukciu, pokles alebo rušenie účinku pred alebo na začiatku nástupu ochorenia.

-Ί Výraz liečenie znamená v kontexte tohto vynálezu akýkoľvek užitočný vplyv na progresiu ochorenia, vrátanie oslabenia, redukcie, poklesu alebo rušenia patologického vývoja po nástupe ochorenia.

Výraz IL-18 inhibítor znamená v kontexte tohto vynálezu akúkoľvek molekulu modulujúcu produkciu a/alebo funkciu IL-18 takým spôsobom, že produkcia a/alebo funkcia IL-18 je oslabená, redukovaná alebo sa jej čiastočne, podstatne alebo úplne predchádza, alebo je čiastočne, podstatne alebo úplne blokovaná.

Inhibítorom produkcie môže byť akákoľvek molekula negatívne ovplyvňujúca syntézu, spracovanie alebo zretie IL-18. Inhibítory prichádzajúce do úvahy podľa vynálezu zahŕňajú napríklad supresory génovej expresie interleukínu IL-18, antisense mRNAs redukujúce transkripciu alebo zabraňujúce transkripcii IL-18. mRNA alebo vedúce k degradácii mRNA, proteíny poškodzujúce správne skladanie alebo čiastočne alebo podstatne zabraňujúce zretiu alebo vylučovaniu IL-18, proteázy degradujúce už syntetizovaný IL-18 a podobne. Inhibítorom produkcie by mohli byť napríklad inhibítor kaspázy-1 alebo ICE inhibítor, ktoré zabraňujú zretiu IL-18.

Inhibítorom IL-18 funkcie by mohol byť napríklad IL-18 antagonista. Antagonisty sa môžu buď viazať na IL-18 molekulu, alebo môžu sekvestrovať samotnú molekulu s dostatočnou afinitou a špecificitou na čiastočnú alebo podstatnú neutralizáciu IL-18 alebo IL-18 väzobného miesta (miest) zodpovedného za viazanie sa IL-18 na jeho ligandy (podobne napr. na jeho receptory). Antagonista môže tiež inhibovať IL-18 signalizačnú dráhu aktivovanú v bunke po väzbe IL18/receptor.

Inhibítormi IL-18 funkcie môžu byť aj rozpustné IL-18 receptory alebo molekuly napodobujúce receptory alebo činidlá blokujúce IL-18 receptory, IL-18 protilátky, ako napríklad monoklonálne protilátky, alebo akékoľvek iné činidlo alebo molekula zabraňujúce väzbe IL-18 na jeho ciele, a tým rušiace alebo zabraňujúce spusteniu vnútrobunkových alebo extracelulárnych reakcií sprostredkovaných IL-18.

Ateroskleróza sa nazýva aj artérioskleróza alebo kôrnatenie ciev. V kontexte predloženého vynálezu zahŕňa výraz ateroskleróza všetky ochorenia alebo chorobné stavy ciev, zvyčajne opisované ako ateroskleróza, pri ktorých sa ukladá v

-8stenách ciev tukovitý materiál, čo eventuálne vedie k zúženiu a zhoršeniu prúdenia krvi, ako aj k praskaniu a/alebo erózii s vytváraním trombusov.

Podľa predloženého vynálezu je ateroskleróza mienená ako zahŕňajúca tak sklerózu alebo stratu elasticity artérií v dôsledku aterómov (ateroskleróza), ako aj v dôsledku akejkoľvek inej príčiny (artérioskleróza). Patologické aterosklerotické stavy, ako aj komplikácie a konzekvencie aterosklerózy, ktoré sú zahrnuté výrazom ateroskleróza, tak ako sa tu používa, sú podrobne opísané vyššie, v časti Doterajší stav techniky.

Progresia aterosklerózy zahŕňa vytváranie aterosklerotických plakov a ich vývoj na stále viac nestabilné formy. Vynález sa preto týka aj použitia IL-18 inhibítora na výrobu lieku na redukciu alebo prevenciu progresie aterosklerózy.

Cievna oklúzia spôsobená trombusom vytvoreným na aterosklerotickom plaku je kritickou udalosťou pri infarktoch srdca a mozgu, ktoré patria medzi najzhubnejšie následky aterosklerózy. Preto sa vynález týka aj použitia IL-18 inhibítora na výrobu lieku na liečenie a/alebo prevenciu trombózy aterosklerotického plaku.

Stabilita plaku ovplyvňuje vývoj aterosklerotického plaku na zhubný a krehký plak, ktorý je náchylný na iniciáciu trombózy. Preto sa vynález ďalej týka použitia IL18 inhibítora na výrobu lieku na prevenciu a/alebo liečenie nestability aterosklerotického plaku.

Nestabilný plak je náchylný na prasknutie a prasknutie plaku môže viesť k trombóze. Vynález sa preto ďalej týka použitia IL-18 inhibítora na výrobu lieku na prevenciu erózie alebo prasknutia aterosklerotického plaku.

Nestabilita plaku a trombóza môžu byť spôsobené napr. apoptickou bunkovou smrťou, ktorá zapríčiňuje vysokú prokoagulačnú aktivitu a môže byť kľúčovou udalosťou vedúcou k trombóze erodovaných alebo prasknutých aterosklerotických plakov, ako aj k embóliám (13, 14). Ukázalo sa, že oxidované lipoproteíny (oxLDL) indukujú apoptózu makrofágov a endoteliálnych buniek v kultúre (15). Ako je ukázané v príkladoch, nižšie, teraz sa zistilo, že IL-18 inhibítor je schopný značne redukovať oxLDL indukovanú bunkovú smrť.

V súlade s predloženým vynálezom sa prekvapujúco zistilo, že hladiny IL-18 v krvi boli významne zvýšené u pacientom so zlyhaním srdca trpiacich na

-9opakovanie prípadov, napr. smrť, rekurentnú ischémiu, revaskularizáciu, progresiu aterosklerózy alebo opätovnú hospitalizáciu v dôsledku zlyhania srdca, v porovnaní s pacientmi, ktorý sa nevrátili do nemocnice. Toto zvýšenie IL-18 hladín bolo výnimočné najmä u tých pacientov, ktorí neskôr zomreli, v porovnaní s pacientmi, ktorí prežívali. Zvýšené IL-18 hladiny v krvnom obehu sa pozorovali tak u ischemických pacientov, ako aj u neischemických pacientov.

Preto sa vynález týka aj použitia IL-18 inhibítorov na výrobu lieku na liečenie a/alebo prevenciu opakovaných prípadov zlyhania srdca. Opakovanými prípadmi môžu byť akékoľvek prípady po zlyhaní srdca, ako napríklad smrť, opakovaná ischémia, re-vaskularizácia, progresia aterosklerózy alebo opätovná hospitalizácia v dôsledku zlyhania srdca.

Vo výhodnom uskutočnení je zlyhanie srdca ischemické, tzn. v dôsledku myokardickej ischémie.

V ďalšom výhodnom uskutočnení je zlyhanie srdca neischemické, ako napríklad v dôsledku systémovej hypertenzie, ochorenia srdcových chlopní alebo pľúcneho ochorenia vedúceho k zlyhaniu pravej strany srdca a potom ku kogestívnemu zlyhaniu srdca.

Vo výhodnom uskutočnení vynálezu je IL-18 inhibítor vybraný zo skupiny, ktorá obsahuje ICE-inhibítory, protilátky proti IL-18, protilátky proti ktorejkoľvek z IL18 receptorových podjednotiek, inhibítory IL-18 receptorovej signalizačnej dráhy, antagonisty IL-18, ktoré súťažia s IL-18 a blokujú IL-18 receptor, a IL-18 viažuce proteíny, ich izoformy, muteíny, fúzované proteíny, funkčné deriváty, aktívne frakcie alebo cirkulárne permutované deriváty majúce rovnakú aktivitu.

Tak ako sa používa tu, označuje výraz muteíny analógy IL-18BP alebo analógy vírusového IL-18BP, v ktorých je jeden alebo viacero aminokyselinových zvyškov prirodzeného IL-18BP alebo vírusového IL-18BP nahradených inými aminokyselinovými zvyškami, alebo sú deletované, alebo je jeden alebo viacero aminokyselinových zvyškov pridaných do prirodzenej sekvencie IL-18BP alebo do sekvencie vírusového IL-18BP, bez toho, aby sa významne zmenila aktivita výsledných produktov v porovnaní so štandardným IL-18BP alebo vírusovým IL18BP. Tieto muteíny sa pripravujú známou syntézou a/alebo technikami miestne špecifickej mutagenézy, alebo akoukoľvek inou vhodnou známou technikou.

-10Ktorýkoľvek takýto muteín má výhodne aminokyselinovú sekvenciu dostatočne podobnú s aminokyselinovou sekvenciou IL-18BP alebo aminokyselinovou sekvenciou vírusového IL-18BP, tak aby mal v podstate podobnú aktivitu ako IL-18BP. Jednou aktivitou IL-18BP je schopnosť viazať IL-18. Pokiaľ má muteín väčšinu väzobnej aktivitu voči IL-18, môže sa použiť na purifikáciu IL-18, ako napríklad prostredníctvom afinitnej chromatografie, a teda sa môže považovať za majúci v podstate podobnú aktivitu ako IL-18BP. Takže to, či má daný muteín v podstate rovnakú aktivitu ako IL-18BP sa môže určiť rutinným experimentovaním zahŕňajúcim podrobenie takéhoto muteínu napr. jednoduchému sendvičovému kompetičnému testu, aby sa stanovilo, či sa viaže alebo neviaže na vhodne značený IL-18, ako napríklad rádioimunologickému testu alebo ELISA testu.

Muteíny IL-18BP polypeptidov alebo muteíny vírusových IL-18BPs, ktoré sa môžu použiť v súlade s predloženým vynálezom, alebo nukleová kyselina, ktorá ich kóduje, zahŕňajú konečnú sadu v podstate zodpovedajúcich sekvencií, ako napríklad substitučných peptidov alebo polynukleotidov, ktoré môže rutinne získať priemerný odborník v oblasti bez nadmerného experimentovania, na základe tu uvedeného opisu a návodu.

Výhodnými zmenami v muteínoch podľa predloženého vynálezu sú takzvané konzervatívne substitúcie. Konzervatívne aminokyselinové substitúcie IL-18BP polypeptidov alebo proteínov alebo vírusových IL-18BPs môžu zahŕňať synonymné aminokyseliny v rámci skupiny, ktorá má dostatočne podobné fyzikálno-chemické vlastnosti na to, aby substitúcia medzi členmi danej skupiny zachovala biologickú funkciu molekuly (16). Je zrejmé, že vo vyššie definovaných sekvenciách môžu byť urobené aj inzercie a delécie aminokyselín bez toho, aby sa zmenila ich funkcia, najmä ak inzercie alebo delécie zahŕňajú len niekoľko aminokyselín, napr. menej ako tridsať, a výhodne menej ako desať, a neodstraňujú alebo nepremiestňujú aminokyseliny, ktoré sú nevyhnutné pre funkčnú konformáciu, napr. cysteínové zvyšky. Proteíny a muteíny produkované takýmito deléciami a/alebo inzerciami spadajú do rozsahu predloženého vynálezu.

Výhodne sú synonymnými aminokyselinovými skupinami skupiny uvedené v tabuľke I. Výhodnejšie sú synonymnými aminokyselinovými skupinami skupiny

- 11 uvedené v tabuľke II; a najvýhodnejšie sú synonymnými aminokyselinovými skupinami skupiny uvedené v tabuľke III.

Tabuľka I

Výhodné skupiny synonymných aminokyselín

Aminokyselina	Synonymná skupina
Ser	Ser, Thr, Gly, Asn
Arg	Arg, Gin, Lys, Glu, His
Leu	lle, Phe, Tyr, Met, Val, Leu
Pro	Gly, Ala, Thr, Pro
Thr	Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gin, Thr
Ala	Gly, Thr, Pro, Ala
Val	Met, Tyr, Phe, lle, Leu, Val
Gly	Ala, Thr, Pro, Ser, Gly
lle	Met, Tyr, Phe, Val, Leu, lle
Phe	Trp, Met, Tyr, lle, Val, Leu, Phe
Tyr	Trp, Met, Phe, lle, Val, Leu, Tyr
Cys	Ser, Thr, Cys
His	Glu, Lys, Gin, Thr, Arg, His
Gin	Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gin
Asn	Gin, Asp, Ser, Asn
Lys	Glu, Gin, His, Arg, Lys
Asp	Glu, Asn, Asp
Glu	Asp, Lys, Asn, Gin, His, Arg, Glu
Met	Phe, lle, Val, Leu, Met
Trp	Trp

Tabuľka II

Výhodnejšie skupiny synonymných aminokyselín

Aminokyselina Synonymná skupina

Ser Ser

Arg His, Lys, Arg

Leu	Leu, lle, Phe, Met
Pro	Ala, Pro
Thr	Thr
Ala	Pro, Ala
Val	Val, Met, lle
Gly	Gly
lle	lle, Met, Phe, Val, Leu
Phe	Met, Tyr, lle, Leu, Phe
Tyr	Phe, Tyr
Cys	Cys, Ser
His	His, Gin, Arg
Gin	Glu, Gin, His
Asn	Asp, Asn
Lys	Lys, Arg
Asp	Asp, Asn
Glu	Glu, Gin
Met	Met, Phe, lle, Val, Leu
Trp	Trp
Tabuľka III
Najvýhodnejšie skupiny synonymných aminokyselín
Aminokyselina	Synonymná skupina
Ser	Ser
Arg	Arg
Leu	Leu, lle, Met
Pro	Pro
Thr	Thr
Ala	Ala
Val	Val
Gly	Gly
lle	lle, Met, Leu
Phe	Phe

Tyr	Tyr
Cys	Cys, Ser
His	His
Gin	Gin
Asn	Asn
Lys	Lys
Asp	Asp
Glu	Glu
Met	Met, lle, Leu
Trp	Met

Príklady produkcie aminokyselinových substitúcií v proteínoch, ktoré môžu byť použité ria získanie muteínov IL-18BP polypeptídov alebo proteínov alebo muteínov vírusových IL-18BPs, na použitie v predloženom vynáleze, ktorýkoľvek zo známych spôsobových krokov, ktoré sú opísané napríklad v US patentoch 4959314, 4588585 a 4737462 v mene Mark a ďalší; 5116943 v mene Koths a ďalší, 4965195 v mene Namen a ďalší; 4879111 v mene Chong a ďalší; a 5017691 v mene Lee a ďalší; a aj lyzínové substituované proteíny prezentované v US patente č. 4904584 (Shaw a ďalší).

Výraz fúzovaný proteín označuje polypeptid obsahujúci IL-18BP, vírusový IL-18BP alebo ich muteín, fúzovaný s iným proteínom, ktorý má napr. dlhší rezidenčný čas v telesných tekutinách. IL-18BP alebo vírusový IL-18BP sa tak môžu fúzovať s iným proteínom, polypeptidom alebo podobne, napr. imunoglobulínom alebo jeho fragmentom.

Funkčné deriváty, tak ako sa používajú tu, zahŕňajú deriváty IL-18BPS alebo vírusového IL-18BP a ich muteíny a fúzované proteíny, ktoré môžu byť pripravené z funkčných skupín, ktoré sa vyskytujú ako bočné reťazce na zvyškoch alebo ako N- alebo C-koncové skupiny, prostredníctvom spôsobov známych v oblasti a sú zahrnuté vynálezom, pokiaľ ostávajú farmaceutický prijateľné, tzn. nepoškodzujú aktivitu proteínu, ktorá je v podstate podobná s aktivitou IL-18BP alebo vírusových IL-18BPs a neudeľujú toxické vlastnosti prostriedkom, ktoré ich obsahujú. Tieto deriváty môžu napríklad zahŕňať polyetylénglykolové bočné

-14reťazce, ktoré môžu maskovať antigénne miesta a predlžovať zotrvávanie IL-18BP alebo vírusového IL-18BP v telesných tekutinách. Iné deriváty zahŕňajú alifatické estery karboxylových skupín, amidy karboxylových skupín prostredníctvom reakcie s amoniakom alebo s primárnymi alebo sekundárnymi amínmi, /V-acyl deriváty voľných aminoskupín aminokyselinových zvyškov tvorené s acylovými skupinami (napr. alkanoylovými alebo karbocyklickými aroylovými skupinami) alebo O-acyl deriváty voľných hydroxylových skupín (napríklad serylových alebo treonylových zvyškov) vytvorené s acylovými skupinami.

Ako aktívne frakcie IL-18BP alebo vírusového IL-18BP, muteínov a fúzovaných proteínov predložený vynález zahŕňa akýkoľvek fragment alebo prekurzor polypeptidového reťazca proteínovej molekuly, samostatne alebo spolu s asociovanými molekulami alebo zvyškami, ktoré sú naň pripojené, napr. sacháridové alebo fosfátové zvyšky alebo agregáty proteínovej molekuly a sacharidových zvyškov, za predpokladu, že frakcia má v podstate podobnú aktivitu ako IL-18BP.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je IL-18 inhibítorom IL-18 protilátka. Anti-IL-18 protilátky môžu byť polyklonálne alebo monoklonálne, chimérne, humanizované alebo aj úplne humánne. Rekombinantné protilátky a ich fragmenty sa vyznačujú vysoko afinitným viazaním IL-18 in vivo a nízkou toxicitou. Protilátky, ktoré sa môžu použiť vo vynáleze sa vyznačujú ich schopnosťou liečiť pacientov dostatočne dlhý čas na to, aby sa dosiahla dobrá až vynikajúca regresia alebo zlepšenie patogénneho stavu alebo akéhokoľvek symptómu alebo skupiny symptómov majúcej súvis s patogénnym stavom; a nízkou toxicitou.

Neutralizačné protilátky sa jednoducho vyvolávajú u zvierat, ako napríklad králikov, kôz alebo myší, imunizáciou s IL-18. Imunizované myši sú výnimočne užitočné na poskytovanie zdrojov B buniek na výrobu hybridómov, ktoré sa môžu na druhej strane kultivovať, aby produkovali veľké množstvá anti-ll-18 monoklonálnych protilátok.

Chimérne protilátky sú imunoglobulínové molekuly vyznačujúce sa dvoma alebo viacerými segmentami alebo časťami odvodenými od rôznych živočíšnych druhov. Vo všeobecnosti je variabilná oblasť chimérnej protilátky odvodená od nehumánnej cicavčej protilátky, ako napríklad myšacej monoklonálnej protilátky, a

-15imunoglobulínová konštantná oblasť je odvodená od ľudskej imunoglobulínovej molekuly. Výhodne majú obe oblasti aj ich kombinácia nízku imunogénnosť, ako sa rutinne stanovuje (24). Humanizované protilátky sú imunoglobulínové molekuly vytvorené technikami genetického inžinierstva, v ktorých sú myšacie konštantné oblasti nahradené ľudskými náprotivkami, pričom si zachovávajú myšacie antigén viažuce oblasti. Výsledná myšaco-ľudská chimérna protilátka má výhodne zníženú imunogénnosť a zlepšené farmakokinetiky u ľudí (25).

Takže v ďalšom výhodnom uskutočnení je IL-18 protilátkou humanizovaná IL-18 protilátka. Výhodné príklady humanizovaných anti-lL-18 protilátok sú opísané napríklad v európskej prihláške vynálezu EP0974600.

V ešte ďalšom výhodnom uskutočnení je IL-18 protilátka úplne humánna. Technológia na produkciu ľudských protilátok je podrobne opísaná napr. vo WO 00/76310, WO 99/53049, US 6162963 alebo AU 5336100. Kompletne humánne protilátky sú výhodne humánne protilátky produkované v transgénnych zvieratách, napr. xenomyšiach, ktoré obsahujú všetky alebo časti funkčných ľudských Ig lokusov.

Vo veľmi výhodnom uskutočnení predloženého vynálezu je IL-18 inhibítorom IL-18BP, alebo jeho izoforma, muteín, fúzovaný proteín, funkčný derivát, aktívna frakcia alebo cirkulárne permutovaný derivát. Tieto izoformy, muteíny, fúzované proteíny alebo funkčné deriváty si zachovávajú IL-18BP biologickú aktivitu, najmä viazanie sa na IL-18, a výhodne majú nevyhnutne aspoň aktivitu podobnú s aktivitou IL-18BP. Ideálne majú takéto proteíny biologickú aktivity, ktorá je ešte zvýšená v porovnaní s nemodifikovaným IL-18BP. Výhodné aktívne frakcie majú aktivitu; ktorá je lepšia ako IL-18BP aktivita, alebo majú ďalšie výhody, ako napríklad lepšiu stabilitu a nižšiu toxicitu alebo imunogénnosť, alebo sa ľahšie produkujú vo veľkých množstvách alebo sa ľahšie purifikujú.

Sekvencie IL-18BP a jeho zostrihových variantov/izoforiem sa nachádzajú vo WO 99/09063 alebo v (12), ako aj v (23).

Funkčné deriváty IL-18BP môžu byť konjugované s polymérmi, aby sa zlepšili vlastnosti proteínu, ako napríklad stabilita, polčas rozpadu, biologická dostupnosť, tolerancia ľudským telom alebo imunogénnosť. Na dosiahnutie tohto cieľa sa

-16IL-18BP môže spojiť napr. s polyetylénglykolom (PEG). PEGylácia sa môže uskutočňovať známymi spôsobmi, opísanými napríklad vo WO 92/13095.

Preto je vo výhodnom uskutočnení predloženého vynálezu IL-18BP PEGylovaný.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je IL-18 inhibítorom fúzovaný proteín obsahujúci celý alebo časť IL-18 viažuceho proteínu, ktorý je fúzovaný s celým alebo časťou imunoglobulínu. Priemernému odborníkovi v oblasti bude zrejmé, že výsledný fúzovaný proteín si zachováva biologickú aktivitu IL-18BP, najmä viazanie IL-18. Fúzia môže byť priama, alebo prostredníctvom krátkeho spojovníkového peptidu, ktorý môže obsahovať 1 až 3 aminokyselinové zvyšky alebo môže byť dlhší, napríklad môže obsahovať 13 aminokyselinových zvyškov. Uvedeným spojovníkom môže byť napríklad tripeptid so sekvenciou E-F-M (GluPhe-Met) alebo 13-aminokyselinová spojovníková sekvencia zahŕňajúca Glu-PheGly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-GIy-GIn-Phe-Met, ktorá je začlenená medzi IL-18BP sekvenciu a imunoglobulínovú sekvenciu. Výsledný fúzovaný proteín má zlepšené vlastnosti, ako napríklad dlhšie zotrvávanie v telesných tekutinách (polčas rozpadu), zvýšenú špecifickú aktivitu, zvýšenú hladinu expresie alebo je uľahčená purifikácia fúzovaného proteínu.

Vo výhodnom uskutočnení je IL-18BP fúzovaný s konštantnou oblasťou Ig molekuly. Výhodne je fúzovaný s oblasťami ťažkého reťazca, ako napríklad CH2 a CH3 doménami ľudského lgG1. Generovanie špecifických fúzovaných proteínov obsahujúcich IL-18BP a časť imunoglobulínu je opísané napríklad v príklade 11 vo WO 99/09063. Aj iné izoformy Ig molekúl sú vhodné na generovanie fúzovaných proteínov podľa predloženého vynálezu, ako napríklad izoformy lgG₂ alebo lgG₄ alebo iné Ig triedy, ako napríklad IgM alebo IgA. Fúzované proteíny môžu byť monomérne alebo multimérne, heteromultimérne alebo homomultimérne.

Interferóny sú známe najmä svojimi inhibičnými účinkami na vírusovú replikáciu a bunkovú proliferáciu. Interferón-γ hrá napríklad dôležitú úlohu pri podpore imunitnej a zápalovej odpovede. O interferóne β (IFN-β, interferón typu I) sa hovorí, že hrá protizápalovú úlohu.

Vynález sa týka aj použitia kombinácie IL-18 inhibítora a interferónu na výrobu lieku na liečenie aterosklerózy.

-17Interferóny sa môžu aj konjugovať s polymérmi, aby sa zlepšila stabilita proteínov. Konjugát medzi interferónom β a polyolom polyetylénglykolom (PEG) bol opísaný napríklad vo WO99/55377.

V inom výhodnom uskutočnení vynálezu je interferónom interferón-β (IFN-β) a výhodnejšie IFN-β 1a. .

Inhibítor IL-18 produkcie a/alebo funkcie je výhodne používaný s interferónom zároveň, postupne alebo oddelene.

V ešte ďalšom uskutočnení vynálezu sa IL-18 inhibítor používa v kombinácii s TNF antagonistom. TNF antagonisty sú aktívne niekoľkými spôsobmi. Po prvé, antagonisty sa môžu viazať na alebo sekvestrovať TNF molekulu samotné, s dostatočnou afinitou a špecificitou na to, aby čiastočne alebo podstatne neutralizovali TNF epitop alebo epitopy zodpovedné za TNF receptorové viazanie (tu označované ako sekvestračné antagonisty). Sekvestračným antagonistom môže byť napríklad protilátka nasmerovaná proti TNF.

Alternatívne, TNF antagonisty môžu inhibovať TNF signalizačnú dráhu aktivovanú prostredníctvom bunkového povrchového receptora po naviazaní TNF (tu nazývané signalizačné antagonisty. Obe skupiny antagonistov sú užitočné, buď samostatne, alebo spolu, v kombinácii s IL-18 inhibitorom na liečenie aterosklerózy.

TNF antagonisty sa jednoducho identifikujú a hodnotia rutinným skríningom kandidátov na ich účinok na aktivitu prirodzeného TNF v citlivých bunkových líniách in vitro, napríklad v humánnych B bunkách, v ktorých TNF spôsobuje proliferáciu a vylučovanie imunoglobulínu. Test zahŕňa TNF formuláciu v rôznych riedeniach kandidátskeho antagonistu, napr. od 0,1 do 100 násobku molového množstva TNF použitého v teste, a kontroly bez TNF alebo len s antagonistom (26).

Sekvestračné antagonisty sú výhodnými TNF antagonistami na použitie podľa predloženého vynálezu. Spomedzi sekvestračných antagonistov sú výhodné tie polypeptidy, ktoré viažu TNF s vysokou afinitou a majú nízku imunogénnosť. Výhodné sú najmä rozpustné TNF receptorové molekuly a TNF neutralizačné protilátky. V predloženom vynáleze sú užitočné napríklad rozpustné TNF-RI a TNFRI I. Skrátené formy týchto receptorov obsahujúce extracelulárne domény receptorov alebo ich funkčné časti sú ešte výhodnejšími antagonistami podľa

-18predloženého vynálezu. Skrátené rozpustné TNF receptory typu I a typu II sú opísané napríklad v EP914431.

Skrátené formy TNF receptorov sú rozpustné a boli detegované v moči a sére ako 30kDa a 40kDa TNF inhibičné viažuce proteíny, ktoré sa označujú ako TBPI, respektíve TBPII (27). Podľa vynálezu je výhodné súčasné, postupné alebo oddelené používanie IL-18 inhibítora spolu s TNF antagonistom a/alebo interferónom.

Podľa vynálezu sú TBPI a TBPII výhodné TNF antagonisty na použitie v kombinácii s IL-18 inhibítorom. V predloženom vynáleze môžu byť použité aj deriváty, fragmenty, oblasti a biologicky aktívne časti receptorových molekúl, ktoré sú funkčne'podobné s receptorovými molekulami. Takýto biologicky aktívny ekvivalent alebo derivát receptorovej molekuly označuje časť polypeptidu alebo sekvenciu kódujúcu receptorovú molekulu, ktoré majú dostatočnú veľkosť na to, aby boli schopné viazať TNF s takou afinitou, aby bola interakcia s membránovo viazaným TNF receptorom inhibovaná alebo blokovaná.

V ďalšom výhodnom uskutočnení sa v súlade s vynálezom používa ako TNF antagonista ľudský rozpustný TNF-RI (TBPI). Prirodzené a rekombinantné rozpustné TNF receptorové molekuly a spôsoby ich produkcie boli opísané v európskych patentoch EP 308378, EP 398327 a EP 433900.

IL-18 inhibítor sa môže používať s TNF inhibítorom súčasne, postupne alebo oddelene. Výhodne sa používa kombinácia IL-18 protilátky alebo antiséra a rozpustného TNF receptora s TNF inhibičnou aktivitou.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu liečivo obsahuje ešte COXinhibítor, výhodne COX-2 inhibítor. COX inhibítory sú v oblasti známe. Konkrétne COX-2 inhibítory sú opísané napríklad vo W0 01/00229.

Na liečenie aterosklerózy sa v súčasnosti najviac používajú inhibítory tromboxánu, najmä tromboxánu A2. Preto v ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu liečivo ďalej obsahuje inhibítor tromboxánu, a najmä inhibítor tromboxánu A2 na simultánne, postupné alebo oddelené použitie. Aspirín je výnimočne výhodný na použitie v kombinácii s IL-18 inhibítorom podľa vynálezu.

Jednou z príčin aterosklerózy sa zdá byť vysoká koncentrácia lipidov v krvi.

Preto v ďalšom výhodnom uskutočnení liečivo obsahuje aj činidlo na znižovanie

-19lipidov, na súčasné, postupné alebo oddelené použitie. Podľa vynálezu môže byť použité akékoľvek činidlo na znižovanie lipidov. Ďalšie činidlá na znižovanie tukov zahŕňajú liečivá ako napríklad cholestyramín, kolestipol, kyselinu nikotínovú, gemfibrozil, probukol a iné. Výnimočne výhodnými sú inhibítory HMG CoA reduktázy, a výhodne takzvané statíny. V oblasti sú známe mnohé statíny, ako napríklad simvastatín alebo lovastatín.

Na ešte lepšiu prevenciu a/alebo liečenie aterosklerózy sa výhodné uskutočnenie vynálezu týka použitia IL-18 inhibítora v kombinácii so stravou s nízkym obsahom tukov a/alebo cholesterolu a/alebo soli.

Vo výhodnom uskutočnení predloženého vynálezu sa IL-18 inhibítor používa v množstve približne 0,0001 až 10 mg/kg telesnej hmotnosti, alebo približne 0,01 až 5 mg/kg telesnej hmotnosti alebo približne 0,1 až 3 mg/kg telesnej hmotnosti alebo približne 1 až 2 mg/kg telesnej hmotnosti. V ešte výhodnejšom uskutočnení sa IL-18 inhibítor používa v množstve 0,1 až 1000 pg/kg telesnej hmotnosti alebo 1 až 10 pg/kg telesnej hmotnosti alebo 10 až 50 pg/kg telesnej hmotnosti.

Vynález sa ďalej týka použitia expresného vektora obsahujúceho kódujúcu sekvenciu IL-18 inhibítora na prípravu lieku na prevenciu a/alebo liečenie aterosklerózy. Takže na liečenie a/alebo prevenciu ochorenia sa používa génový terapeutický prístup. Výhodne sa tak bude expresia IL-18 inhibítora uskutočňovať in situ, čím sa bude IL-18 účinne blokovať priamo v tkanive (tkanivách) alebo bunkách postihnutých chorobou.

Ako bude podrobnejšie vysvetlené v príkladoch, ukázalo sa, že účinná expresia 11-18BP je možná v myšacom, modeli ochorenia po elektrotransfere expresného vektora obsahujúceho IL-18BP kódujúcu sekvenciu.

¹ ' * ¹

Preto sa vo výhodnom uskutočnení podáva expresný vektor elektrotrasferom, výhodne intramuskulárne.

Použitie vektora na indukciu a/alebo zosilnenie endogénnej produkcie IL-18 inhibítora v bunke, v ktorej sa IL-18 inhibítor normálne neexprimuje, alebo v ktorej sa exprimuje také množstvo inhibítora, ktoré nie je dostatočné, je tiež obsiahnuté predloženým vynálezom. Vektor môže obsahovať regulačné sekvencie funkčné v bunkách, v ktorých je želateľná expresia IL-18 inhibítora. Takýmito regulačnými sekvenciami môžu byť napríklad promotory alebo zosilňovače. Regulačná

-20sekvencia sa potom môže zaviesť do správneho lokusu v genóme homologickou rekombináciou, a tak môže operatívne spojiť regulačnú sekvenciu s génom, ktorého expresiu je potrebné indukovať alebo oslabiť. Táto technológia sa zvyčajne označuje ako endogénna génová aktivácia (EGA) a je opísaná napr. vo WO 91/09955. ¹

Pre priemerného odborníka v oblasti bude zrejmé, že použitím rovnakej techniky je možné aj zastaviť expresiu IL-18, tzn. zaviesť negatívny regulačný element, ako napr. utlmovací element, do IL-18 génového lokusu, čo vedie k zníženiu alebo zastaveniu IL-18 expresie. Pre priemerného odborníka v oblasti bude zrejmé, že takéto zníženie alebo zastavenie IL-18 expresie má rovnaký účinok ako použitie IL-18 inhibítora na prevenciu a/alebo liečenie ochorenia.

Vynález sa ďalej týka použitia bunky, ktorá bola geneticky modifikovaná, na produkciu IL-18 inhibítora na výrobu lieku na liečenie a/alebo prevenciu aterosklerózy.

Vynález sa ďalej týka farmaceutických prostriedkov, užitočných najmä na prevenciu a/alebo liečenie aterosklerózy, ktoré obsahujú terapeuticky účinné množstvo IL-18 inhibítora a terapeuticky účinné množstvo interferónu. Ako IL-18 inhibítor môže prostriedok obsahovať inhibítory kaspázy-1, protilátky proti IL-18, protilátky proti ktorejkoľvek z IL-18 receptorových podjednotiek, inhibítory IL-18 signalizačnej dráhy, IL-18 antagonisty, ktoré súťažia s IL-18 a blokujú IL-18 receptor, a IL-18 viažuce proteíny, ich izoformy, muteíny, fúzované proteíny, funkčné deriváty, aktívne frakcie alebo cirkulárne permutované deriváty majúce rovnakú aktivitu.

Výhodnými aktívnymi zložkami farmaceutických prostriedkov sú IL-18BP a jeho izoformy, muteíny, fúzované proteíny, funkčné deriváty, aktívne frakcie alebo cirkulárne permutované deriváty, ako je opísané vyššie.

Interferónom nachádzajúcim sa vo farmaceutickom prostriedku je výhodne

IFN-β.

V ešte inom výhodnom uskutočnení farmaceutický prostriedok obsahuje terapeuticky účinné množstvá IL-18 inhibítora, voliteľne interferónu a TNF antagonistu. TNF antagonistami môžu byť protilátky neutralizujúce TNF aktivitu, alebo rozpustné skrátené TNF receptorové fragmenty, nazývané aj TBPI a TBPII.

-21 Farmaceutický prostriedok podľa vynálezu môže ďalej obsahovať jeden alebo viacero COX inhibítorov, výhodne COX-2 inhibítory. Farmaceutický prostriedok podľa vynálezu môže ďalej obsahovať inhibítor tromboxánu, ako napríklad aspirín, a/alebo činidlo na znižovanie lipidov, ako napríklad statín.

Definícia farmaceutický prijateľný je mienená ako, zahŕňajúca akýkoľvek nosič, ktorý neinterferuje s účinnosťou biologickej aktivity aktívnej zložky, a ktorý nie je toxický voči hostiteľovi, ktorému sa podáva. Napríklad, na parenterálne podávanie môže byť aktívny proteín (proteíny) formulovaný v jednotkovej dávkovej forme pre injekciu vo vehikulách akými sú napríklad fyziologický roztok, dextrózový roztok, sérový albumín a Ringerov roztok.

Aktívne zložky farmaceutického prostriedku podľa vynálezu sa môžu podávať jedincovi rôznymi spôsobmi. Spôsoby podávania zahŕňajú intradermálne, transdermálne (napr. formulácie s pomalým uvoľňovaním), intramuskulárne, intraperitoneálne, intravenózne, subkutánne, orálne, epidurálne, topické a intranazálne spôsoby. Použiť sa môže aj akýkoľvek iný terapeuticky účinný spôsob podávania, napríklad absorpcia cez epiteliálne alebo endoteliálne tkanivá alebo génová terapia, pri ktorej sa DNA molekula kódujúca aktívne činidlo podáva pacientovi (napr. prostredníctvom vektora), čo spôsobuje, že aktívne činidlo sa exprimuje a vylučuje in vivo. Okrem toho, proteín (proteíny) podľa vynálezu sa môže podávať spolu s inými zložkami biologicky aktívnych činidiel, ako napríklad farmaceutický prijateľnými povrchovo aktívnymi činidlami, excipientami, nosičmi, riedidlami a vehikulami.

Na parenterálne (napr. intravenózne, subkutánne, intramuskulárne) podanie, môže byť aktívny proteín (proteíny) formulovaný ako roztok, suspenzia, emulzia i

alebo lyofilizovaný prášok spolu s farmaceutický prijateľným parenterálnym vehikulom (napr. vodou, fyziologickým roztokom, dextrózovým roztokom) a aditívami, ktoré udržiavajú izotonicitu (napr. manitol) alebo chemickú stabilitu (napr. konzervačné látky alebo tlmivé roztoky). Formulácia sa sterilizuje obvykle používanými technikami.

Biologická dostupnosť aktívneho proteínu (proteínov) podľa vynálezu sa môže zlepšiť aj použitím konjugačných postupov, ktoré predlžujú polčas rozpadu

-22molekuly v ľudskom tele, napríklad spojením molekuly s polyetylénglykolom, ako je opísané v PCT prihláške vynálezu č. WO 92/13095.

Terapeuticky účinné množstvá aktívneho proteínu (proteínov) budú funkciou mnohých premenných, vrátane typu antagonistu, afinity antagonistu voči IL-18, akejkoľvek zvyškovej cytotoxickej aktivity vykazovanej antagonistami, spôsobu podania, klinického stavu pacienta (vrátane vhodnosti udržiavania netoxickej hladiny endogénnej IL-18 aktivity).

Terapeuticky účinným množstvom je také množstvo, v ktorom, keď sa podáva IL-18 inhibítor, vedie k inhibícii biologickej aktivity IL-18. Množstvo podávané jedincovi, vo forme jednej alebo viacerých dávok, sa bude meniť v závislosti na rôznych faktoroch, vrátane farmakokinetických vlastností IL-18, spôsobu podávania, pacientovho stavu a vlastností (pohlavie, vek, telesná hmotnosť, zdravotný stav, výška), rozsahu symptómov, súčasne prebiehajúcej liečby, frekvencie liečby a požadovaného účinku. Nastavenie a manipulácie so stanovenými dávkovými rozsahmi dobre spadá do schopností priemerného odborníka v oblasti, ako aj in vitro a in vivo spôsoby určenia inhibície IL-18 u jedinca.

V súlade s vynálezom sa IL-18 inhibítor používa v množstve približne 0,0001 až 10 mg/kg alebo približne 0,001 až 5 mg/kg telesnej hmotnosti, alebo približne 0,01 až 5 mg/kg telesnej hmotnosti alebo približne 0,1 až 3 mg/kg telesnej hmotnosti alebo približne 1 až 2 mg/kg telesnej hmotnosti. Výhodnejšími množstvami IL-18 inhibítorov sú množstvá približne 0,1 až 1000 pg/kg telesnej hmotnosti alebo približne 1 až 100 pg/kg telesnej hmotnosti alebo približne 10 až 50 pg/kg telesnej hmotnosti.

Výhodným spôsobom podávania podľa vynálezu je podávanie subkutánnym spôsobom. Ďalším výhodným spôsobom podávania podľa vynálezu je intramuskulárne podávanie.

V ďalších výhodných uskutočneniach sa IL-18 inhibítor podáva denne alebo každý druhý deň.

Denné dávky sa zvyčajne podávajú v rozdelených dávkach alebo vo forme s nepretržitým uvoľňovaním, aby sa získali požadované výsledky. Druhé a následné

-23podania sa môžu jedincovi podávať v dávke, ktorá je rovnaká, menšia alebo väčšia ako počiatočná alebo predtým podaná dávka.

Podľa vynálezu sa IL-18 inhibítor môže podávať jedincovi profylaktický alebo terapeuticky pred, zároveň alebo postupne s inými terapeutickými režimami alebo činidlami (napr. viacnásobné liekové režimy) v terapeuticky účinnom množstve. Aktívne činidlá, ktoré sa podávajú zároveň s inými terapeutickými činidlami, sa môžu podávať v rovnakom alebo v inom prostriedku.

Vynález sa ďalej týka spôsobu liečenia a/alebo prevencie aterosklerózy, ktorý zahŕňa podávanie účinného inhibičného množstva IL-18 inhibítora príjemcovi, ktorý to potrebuje.

Vynález ďalej zahŕňa spôsob prevencie a/alebo liečenia aterosklerózy, ktorý zahŕňa podávanie expresného vektora obsahujúceho kódujúcu sekvenciu pre IL-18 inhibítor príjemcovi, ktorý to potrebuje.

Vo výhodných uskutočneniach vynálezu sa expresný vektor podáva systémovo a výhodnejšie intramuskulárnou injekciou.

Vynález sa ďalej týka použitia IL-18 ako diagnostického markera zlej klinickej prognózy pri zlyhaní srdca. Zlá klinická prognóza zahŕňa akékoľvek zhoršenie pacientovho stavu, ako napríklad opakované prípady, alebo aj smrť, po prvom infarkte myokardu.

Výhodne sa IL-18 používa ako diagnostický marker opakovaných prípadov po prvom prípade zlyhania srdca. Opakované prípady zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na smrť, opakovanú ischémiu, revaskularizáciu, progresiu aterosklerózy alebo opätovnú hospitalizáciu v dôsledku zlyhania srdca.

Po vyššie uvedenom opise vynálezu, bude tento teraz jednoduchšie pochopiteľný prostredníctvom odvolania sa na nasledujúce príklady, ktoré sú poskytnuté ako ilustrácia a nie sú mienené ako obmedzujúce predložený vynález.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 znázorňuje histogram zobrazujúci percento prežívania ľudských endoteliálnych buniek z pupočníkovej žily po inkubovaní len s oxidovanými

-24lipoproteínmi, alebo po inkubovaní s kombináciou oxidovaných lipoproteínov a IL-18 protilátky alebo kombináciou oxidovaných lipoproteínov a IL-18BP.

Obrázok 2 znázorňuje Western blot uskutočňovaný s proteínovými extraktami z ateroskierotických artérií v porovnaní s kontrolnými artériami. Vo Western blote sa použili protilátky nasmerované proti IL-18BP (hlL18BP), IL-18 receptorová a podjednotka (hlL18Ra), IL-18 (hlL18) a kaspáza-1 (Kaspáza-1 p10).

Obrázok 3 znázorňuje agarózový gél farbený etídiumbromidom ukazujúci výsledok RT-PCR analýzy IL-18 a IL-18BP mRNA v bunkách aterosklerotického plaku.

Obrázok 4 znázorňuje výsledky RT-PCR IL-18BP a IL-18 v ateroskierotických plakoch v porovnaní s expresiou ha-aktínu (kontrola) v symptomatický a asymptomatických plakoch.

Obrázok 5 znázorňuje mapu expresného vektora používaného na intramuskulárny elektrotransfer do myší.

Obrázok 6 znázorňuje histogram zobrazujúci lipidovú farbiacu oblasť v aterosklerotických artériách. Kvantitatívna počítačová zobrazovacia analýza ukladania lipidov. Údaje predstavujú priemerné hodnoty so SEM (n=19 pre prázdny plazmid, n=14 pre IL-18BP plazmid). Štvorité hviezdičky označujú P < 0,0001.

Obrázok 7 znázorňuje histogram zobrazujúci oblasť aortickej sínusovej lézie po pôsobení s IL-18BP v porovnaní s kontrolou (prázdny plazmid). Kvantitatívna počítačová zobrazovacia analýza oblasti lézií. Údaje predstavujú priemerné hodnoty so SEM (n=19 pre prázdny plazmid, n=14 pre IL-18BP plazmid). Dvojité hviezdičky označujú P < 0,01.

Obrázok 8 znázorňuje vplyv IL-18BP pôsobenia na obsah zápalových buniek v léziách. Kvantitatívna počítačová zobrazovacia analýza bola použitá na stanovenie percenta makrofágovo pozitívnych oblastí (čierne stĺpce) a počet infiltrujúcich T lymfocytov na mm² (sivé stĺpce) v aortických sínusových léziách v kontrolných myšiach (n=12 na makrofágové farbenie, n=15 na T lymfocytové farbenie) alebo v myšiach ošetrených s IL-18BP (n=13 pre makrofágy, n=15 pre T lymfocyty). Údaje predstavujú priemerné hodnoty so SEM. Trojité hviezdičky označujú P < 0,005; a štvorité hviezdičky označujú P < 0,0001.

-25Obrázok 9 znázorňuje vplyv ošetrenia s IL-18BP na bunky v lézii hladkej svaloviny a na obsah kolagénu. Na stanovene percenta oblastí s pozitívnymi hladkými svalovými bunkami (čierne stĺpce) a na stanovenie akumulácie kolagénu (sivé stĺpce) v aortických sínusových léziách kontrolných myší (n=6 pre bunky hladkej svaloviny, n=11 pre kolagén) a v myšiach ošetrených s IL-18BP (n=6 pre bunky hladkej svaloviny, n=13 pre kolagén) sa použila kvantitatívna počítačová analýza. Údaje predstavujú priemerné hodnoty so SEM. Jedna hviezdička označuje P < 0,05; a dve hviezdičky označujú P < 0,01.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Materiál a metódy

Vzorky

Izolovalo sa štyridsaťjeden humánnych aterosklerotických plakov odobratých od 36 pacientov, ktorí sa podrobili karotidovej endarterektómii. Ako kontroly sa odobrali 2 karotídové a 3 vnútorné prsné artérie bez aterosklerózy (2 s minimálnym fibromuskulárnym zhrubnutím) pri autopsii alebo v priebehu koronárneho bypassového chirurgického zákroku. Rýchlo sa ponorili do kvapalného dusíka a uskladnili sa pri -80 °C. Plaky, ktoré sa použili na proteínovú a RNA extrakciu, sa rýchlo umyli, ponorili sa do kvapalného dusíka pred tým, ako boli uskladnené pri -80 °C. Na imunohistochemické štúdie sa plaky umiestnili na 2 hodiny do čerstvého 4% paraformaldehydu, potom sa preniesli do 30% sachorózového PBS roztoku a potom sa rýchlo zmrazili v optimálnom médiu na znižovanie teploty tkaniva (O.C.T. Compound, Miles Inc, Diagnostics Division) s kvapalným dusíkom a uskladnili sa pri -80 °C, aby sa z nich vytvorili rezy stabilné pri veľmi nízkych teplotách. Na histologickú analýzu a imunohistochemické štúdie sa z každej vzorky urobilo niekoľko δμιτι až 10μηι rezov.

Klasifikácia pacientov

Na štúdium potenciálneho vzťahu medzi IL-18/IL-18BP expresiou a známkami nestability plaku, sme zozbierali prospektívnym a slepím spôsobom

-26klinické údaje od 23 po sebe idúcich pacientov (z 36), ktorí sa podrobili endarterektómii medzi májom a augustom v roku 2000. Prítomnosť alebo neprítomnosť vnútroplakového vredu pri makroskopickom preskúmaní systematicky uviedol chirurg, ktorý uskutočnil endarterektómiu. To nám umožnilo klasifikovať plaky ako ulcerózne alebo neulcerózne plaky. Okrem toho sa pacienti rozdelili podľa klinických symptómov do dvoch separátnych skupín. Pacienti, ktorí sa prezentovali klinickými symptómami mozgového ischemického záchvatu súvisiaceho so zúžením karotídy, sa klasifikovali ako symptomatickí. Endarterektómia sa u týchto pacientov uskutočňovala 2 až 66 dní (17,6 ± 5,3 dňa) po nástupe klinických symptómov. Pacienti, ktorí nikdy nemali symptómy mozgovej ischémie v oblasti karotídovej artérie sa klasifikovali ako asymptomatickí. Asymptomatické zúženie karotídy sa detegovalo na základe systematického klinického vyšetrenia pacientov s koronárnym alebo periférnym ochorením a jej závažnosť sa určila použitím opakovanej Dopplerovej echografie skúseným overeným echografistom. Hoci asymptomatickí pacienti nikdy nemali ischemickú epizódu v oblasti zúženia karotídy, ukázalo sa, že u týchto pacientov je užitočná karotídová endarterektómia, ako bolo dokázané výskumníkmi v štúdii asymptomatickej karotídovej aterosklerózy (ACAS) (28).

Western blot analýza

Proteíny sa extrahovali z 12 aterosklerotických plakov a 5 kontrolných normálnych artérií. Zmrazené vzorky sa rozdrvili v kvapalnom dusíku. Prášky sa resuspendovali v ľadovo studenom lyzačnom tlmivom roztoku [20 mmol/l Tris-HCI, pH 7,5, 5 mmol/l EGTA, 150 mmol/l NaCl, 20 mmol/l glycerofosfát, 10 mmol/l NaF, 1 mmol/l ortovanadan sodný, 1% Triton X-100, 0,1% Tween 20, 1 pg/ml aprotinín, 1 mmol/l PMSF, 0,5 mmol/l /V-tozyl-L-fenylalanínchlórmetylketón (TPCK), 0,5 mmol/l A/-(a)-p-tozyl-L-lyzínchlórmetylketón (TLCK)] v pomere 0,3 ml/10 mg suchej hmotnosti. Extrakty sa inkubovali na ľade 15 minút a potom sa centrifugovali (12000 ot./min., 15 minút, 4 °C). Zachovali sa supernatantové frakcie rozpustné v detergente, a použitím Bio-Rad proteínového testu sa vyrovnali proteínové koncentrácie vo vzorkách.

-27Na uskutočňovanie Western blot testov pre IL-18 a IL-18R sa proteínové extrakty 5 minút povarili a naniesli sa na 7,5% alebo 15% SDS-polyakrylamidový gél. Pre IL-18BP sa rhlL-18, purifikovaný z E. coli (Serono Pharmaceutical Research Inštitúte, Ženeva) pripojil na Affligel 15 (Biorad) v množstve 1 mg/ml živice v súlade s protokolom výrobcu. Proteínový extrakt (60 pg) sa inkuboval cez noc pri 4 °C na valci s 20 μΙ živice nastavenej na 500 μΙ PBS 0,05% Tween. Na odstránenie akéhokoľvek nešpecifického viazania sa živica centrifugovala a premyla s 10mM Tris pH 8, 140mM NaCl, 0,5% Triton-X-100 (Fluka), 0,5% deoxycholát, potom s 50mM Tris pH 8, 200mM NaCl, 0,05% TX100, 0,05% nonidet P40 (Fluka), 2mM CHAPS (Boehringer, Mannheim) a nasledovalo posledné premývanie s 50mM Tris pH 8. Živica sa potom centrifugovala, resuspendovala sa vo vzorkovom tlmivom roztoku v redukčných podmienkach, 5 minút sa povarila a nakoniec sa naniesla na 10% SDS-polyakrylamidový NuPAGE gél (Invitrogen).

Vzorky sa elektroforeticky preniesli z polyakrylamidových gélov na nitrocelulózu. Nitrocelulózové membrány sa nasycovali 2 hodiny pri laboratórnej teplote v TBST [50 mmol/l Tris-HCl (pH 7,5), 250 mmol/l NaCl a 0,1% Tween fyziologický roztok] obsahujúcom 5% odtučnené sušené mlieko. Membrány sa potom inkubovali s kozou anti-humánnou IL-18 polyklonálnou protilátkou a kozou anti-humánnou IL18R (α-reťazec) polyklonálnou protilátkou (1 pg/ml) (R&D Systems), myšacou antihumánnou IL-18 BP monoklonálnou protilátkou (Mab 657.27 v množstve 5 pg/ml) (Corbaz a ďalší, 2000 rukopis), králičou anti-humánnou polyklonálnou protilátkou proti kaspáze-1 (1 pg/ml) (A-19, Santa Cruz).

Špecificita Mab 657.27 sa analyzovala na pásoch membrány prostredníctvom kompetície použitím 200-násobného molového nadbytku,,rhlL18BP-6his (purifikovaný z vaječníkových buniek čínskeho škrečka, Serono Pharmaceutical Research Inštitúte) spoločne inkubovaným s Mab 657.27 v množstve 5 pg/ml v priebehu 1 hodiny. Po inkubovaní s HRP konjugovanými zodpovedajúcim protilátkami sa použili chemiluminiscenčné substráty (ECL, Western blotting; Amersham Corp) na odhalenie pozitívnych pásov, v súlade s inštrukciami výrobcu, a pásy sa vizualizovali po expozícii s Hyperfilm ECL (Amersham Corp).

-28Imunohistochémia

Zmrazené rezy zo 6 aterosklerotických plakov sa inkubovali v pomere 1:10 s normálnym konským sérom alebo v pomere 1:10 s normálnym kozím sérom, 30 minút pri laboratórnej teplote, raz sa premyli v PBS, potom sa inkubovali buď s primárnou myšacou monoklonálnou protilátkou proti CD68 na identifikáciu makrofágov (DAKO-CD68, KP1), alebo s primárnou myšacou monoklonálnou protilátkou proti α-aktívnu ľudskej hladkej svaloviny (1A4, DÁKO) na identifikáciu hladkých svalových buniek. Na identifikáciu IL-18 a IL-18 receptora v vnútri aterosklerotických plakov sa použili špecifické kozie polyklonálne protilátky (R & D Systems) v riedení 5 pg/ml. IL-18BP sa detegoval použitím špecifickej monoklonálnej protilátky proti rekombinantnej ľudskej IL-18BP izoforme (H20) (Corbaz a ďalší, 2000, rukopis). Po premytí v PBS sa rezy inkubovali s nasledujúcimi sekundárnymi biotinylovanými protilátkami: s biotinylovanou konskou anti-myšacou IgG (Vector Laboratories, Inc) v riedení 1:200 na detekciu škvŕn s protilátkami proti CD68, proti α-aktínu hladkej svaloviny a proti IL-18BP, a biotinylovanou konskou anti-kozou IgG (Vector) v riedení 1:200 na detekciu anti-IL-18 a anti-IL-18 receptorových protilátok. Imunofarbenie sa vizualizovalo použitím avidín-biotín HRP vizualizačných systémov (Vectastain ABC kit PK-6100 Vector). Ako negatívne kontroly sa vedľajšie rezy farbili s izotypovo rovnakými ale irelevantnými protilátkami namiesto primárnych protilátok.

Príprava RNA

Celková RNA sa extrahovala z 29 aterosklerotických plakov v kyslom guanídiumtiokyanátovom roztoku a extrahovala sa s fenolom a chloroformom v súlade so spôsobom podľa Chomczynskeho a Sacchiho (29). Purifikovaná RNA sa rozpustila vo vode a koncentrácia sa merala prostredníctvom absorbancie pri 260 nm. Integrita RNA sa hodnotila prostredníctvom elektroforézy na 1% agarózovom géli. cDNA sa syntetizovala z 1 pg celkovej RNA použitím Promega reverzného transkripčného systému v súlade s protokolom výrobcu.

Semikvantitatívna a veľmi rýchla PCR ľudského IL-18 a IL-18BP v ľudských aterosklerotických plakoch

-29Semikvantitatívne PCR reakcie sa uskutočňovali v celkovom objeme 50 μΙ v prítomnosti 1U AmpliTaq DNA polymerázy (Perkin Elmer, Roche, USA), 2,5mM dNTPs (Amersham, USA) a 50 pmol priameho a reverzného PCR primeru. Reakčné zmesi sa inkubovali v PTC-200 Peltier Effect termálnom cykleri (MJ Research, U.S.A) v nasledujúcich podmienkach: denaturácia 1 min. pri 94 °G, anelovanie 1 min. pri 55 °C a predlžovanie 1 min. pri 72 °C. Na zaistenie porovnávania množstva PCR produktov v priebehu lineárnej fázy PCR reakcie sa IL-18BP, IL-18 a β-aktín analyzovali po 25, 28 a 31 cykloch. Optimálny počet cyklov pre IL-18BP, IL-18 a β-aktín pred nasýtením pásov sa stanovil na 31,28, respektíve 25. PCR primery sa navrhli na základe publikovaných sekvencii (AF110799, D49950, X00351) nasledovne:

IL-18:	reverzný: priamy:
IL18BP:	priamy: reverzný:
β-aktín:	reverzný: priamy:

5-GCGTCACTACACTCAGCTAA-3’;

5-GCCTAGAGGTATGGCTGTAA-3’;

5’-ACCTGTCTACCTGGAGTGAA-3’;

5’-GCACG AAGATAGGAAGTCTG-3’;

5’-GGAGGAGCAATGATCTTGATCTTC-3’;

5’-GCTCACCATGGATGATGATATCGC-3’.

Na vylúčenie amplifikácie potenciálnej genomickej DNA kontaminujúcej vzorky sa PCR reakcie uskutočňovali bez prítomnosti cDNA templátu. PCR produkty (10 μΙ) sa analyzovali na 1% agarózových géloch elektroforezovaných v 1xTAE tlmivom roztoku. Veľkosť PCR produktov sa overila porovnaním s 1 kb rebríkom (Gibco) po vyfarbení gélov. Relatívna kvantifikácia etídium-bromidom farbených pásov sa uskutočňovala pod UV svetlom použitím Kodak Digital Sciences analytického softwaru a uvádzala sa ako pomer cieľového génu (hlL-18BP, hlL-18) ku udržiavaciemu génu (hp-aktín).

SYBR Green Reál Time PCR primery pre IL-18, IL-18BP a GAPDH (udržiavacia kontrola) sa navrhli použitím Primér Express softwaru od PE Biosystems v súlade s publikovanými sekvenciami (AF110799, D49950, NM 002046) nasledovne:

IL-18: reverzný: 5’-CAGCCGCTTTAGCAGCCA-3’;

priamy: 5’-CAAGGAATTGTCTCCCAGTGC-3’;

IL18BP:	reverzný: priamy:	5’-AACCAGGCTTGAGCGTTCC-3’; 5’-TCCCATGTCTCTGCTCATTTAGTC-3’;
GAPDH:	reverzný:	5'-GATGGGATTTCCATTGATGACA-3’;
	priamy:	5’-CCACCCATGGCAAATTCC-3’;
Intrón-GAPDH:	reverzný:	5’-CCTAGTCCCAGGGCTTTGATT-3’;
	priamy:	5’-CTGTGCTCCCACTCCTGATTTC-3’.
Testovala sa	špecificita a	optimálna koncentrácia primerov. Potenciálna

kontaminácia genomickou DNA sa vylúčila uskutočňovaním PCR reakcií so špecifickými intrón-GAPDH primermi. Neprítomnosť nešpecifickej amplifikácie sa potvrdila analyzovaním PCR produktov prostredníctvom elektroforézy na 3,5% agarózovom géli. SYBR Green Real-Time PCR sa uskutočňovala s 5 μΙ/jamku RTproduktov (0,5 ng celkovej RNA), 25 pL/jamku SYBR Green PCR master mix (PE Biosystem, CA, USA) s AmpErase uracil ΛΖ-glykozylázou (UNG) (0,5 jednotiek/jamku) a 20 μΙ primerov (300nM). PCR sa uskutočňovala pri 50 °C 2 minúty (na AmpErase UNG inkubovanie, aby sa odstránil uracil inkorporovaný do cDNA), pri 95 °C 10 minút (na AmpliTaq Gold aktiváciu) a potom bežalo 40 cyklov pri 95 °C 15 sekúnd, pri 60 °C 1 minútu na ABI PRISM 7700 Detekčnom Systéme. Tým sa amplifikovali vzorky reverzne transkribovanej cDNA a determinovali sa ich Ct (prah cyklu) hodnoty. Všetky Ct hodnoty sa normalizovali vo vzťahu k udržiavaciemu génu GAPDH. Použitím gélovej elektroforetickej analýzy sa pozorovali jednotlivé špecifické DNA pásy pre IL-18, IL-18BP a GAPDH.

Princíp veľmi rýchlej detekcie použitím “SYBR Green PCR master mix” je založený na priamej detekcii PCR produktu meraním zvýšenia fluorescencie spôsobenej naviazaním SYBR Green farbičky na dvojvláknovú DNA.

Štatistická analýza

Údaje sú vyjadrené ako priemer ± SEM. Hladiny IL-18 sa medzi skupinami porovnávali použitím Mann-Whitney testu. Hodnota p<0,05 sa považuje za štatisticky významnú.

-31 Príklad 1

Ochrana pred smrťou endoteliálnych buniek indukovanou oxidovanými lipoproteínmi (oxLDL) prostredníctvom IL-18 inhibítorov i

Kultivované ľudské endoteliálne bunky pupočníkovej žily (HUVECs) sa vystavili na 16 hodín oxLDL, v prítomnosti alebo neprítomnosti IL-18 viažuceho proteínu alebo anti-IL-18 protilátky. Ako je znázornené na obrázku 1, 83 % HUVECs zomrelo po vystavení oxLDL. Spoločné inkubovanie s IL-18BP alebo anti-IL-18 protilátkou takmer úplne zachránilo bunky pred smrťou. Žiadna smrť nebola pozorovaná, keď sa použil IL-18BP. 89% buniek prežilo, keď sa použila anti-IL-18 protilátka.

Tento experiment jasne dokazuje ochranný účinok dvoch rozličných IL-18 inhibítorov pred bunkovou smrťou v dôsledku apoptózy v aterosklerotickom plaku.

Príklad 2

Expresia IL-18 proteínu a jeho endogénneho inhibítora IL-18BP v aterosklerotických plakoch

Western blot testy sa uskutočňovali na proteínových extraktoch z 12 karotídových aterosklerotických artérií a 5 normálnych kontrol. IL-18 proteín, vrátene jeho aktívnej formy, sa silno exprimuje vo všetkých aterosklerotických plakoch, zatiaľ čo sa nedetegovala žiadna alebo len slabá expresia v normálnych artériách (obrázok 2). Dráhy 1 až 4 obsahujú vzorky z aterosklerotických plakov, dráhy 5 až 7 z normálnych artérií. Je zaujímavé, že sa zdá, že detekcia aktívnej formy IL-18 koreluje s expresiou aktívnej formy kaspázy-1, ktorá sa podieľa na spracovaní IL-18 (obrázok 2, štvrtý rad). Vo všetkých aterosklerotických plakoch sa detegovala aj významná expresia IL-18 receptorového proteínu (a reťazca) v porovnaní s veľmi nízkou úrovňou expresie v normálnych artériách (obrázok 2, druhý rad). Okrem toho, väčšina aterosklerotických plakov exprimovala IL-18BP, hoci úroveň expresie bola heterogénna (obrázok 2, prvý rad).

-32Príklad 3

Bunková lokalizácia IL-18 proteínu a jeho endogénneho inhibítora IL-18BP v aterosklerotických plakoch

Na určenie bunkovej lokalizácie IL-18 a IL-18BP sa uskutočňovali imunohistochemické štúdie na 6 karotídových aterosklerotických plakoch. Ako je znázornené na obrázku 2, IL-18 sa exprimoval najmä v makrofágoch, pričom tieto bunky sú pravdepodobne hlavným zdrojom IL-18 v plaku (nie je znázornené). Tieto oblasti boli bohaté aj na CD3-pozitívne lymfocyty. Avšak nezdalo sa, že by sa T lymfocyty priamo podieľali na IL-18 produkcii. IL-18 sa exprimoval aj v niektorých hladkých svalových bunkách intimy a v niektorých endoteliálnych bunkách. Naopak, významná expresia IL-18BP sa detegovala v endoteliálnych bunkách plakových mikrociev a bunkách luminálneho povrchu, hoci expresia sa nezistila vo všetkých cievach. Relatívne nízka a heterogénnejšia expresia IL-18BP sa detegovala, najmä extracelulárna, v niektorých oblastiach bohatých na makrofágy.

Príklad 4

Expresia IL-18 a IL-18BP mRNA transkriptov v aterosklerotických plakoch a súvis s nestabilitou plakov

Na stanovenie toho, či sa IL-18 a IL-18BP mRNA exprimujú v ľudských karotídových aterosklerotických plakoch, uskutočňovala sa semi-kvantitatívna RTPCR na šiestich aterosklerotických plakoch (obrázok 3). IL-18 a IL-18BP mRNA sa detegovali vo všetkých aterosklerotických plakoch, hoci množstvo IL-18 mRNA a IL18BP mRNA bolo heterogénne. Preto sa za účelom presnej kvantifikácie úrovne IL18 a IL-18BP mRNA expresie ďalej analyzovalo 23 aterosklerotických plakov prostredníctvom SYBR Green okamžitej PCR metódy (obrázok 4). Plaky sa prostredníctvom klinickej a patologickej prehliadky charakterizovali ako symptomatické (nestabilné) alebo asymptomatické (stabilné) plaky, ktoré buď obsahovali alebo neobsahovali makroskopický vred. Klinické charakteristiky pacientov sú sumarizované v tabuľke 4. Percento redukcie priemeru karotídy (60 %

-33až 95 %) a rizikové faktory zahŕňajúce vek, cukrovku, hypercholesterolémiu, hypertenziu a fajčenie cigariet nie sú rozdielne v týchto dvoch skupinách.

Tabuľka 4

Charakteristiky pacientov	Asvrnotomatickí pacienti (n = 9)	Svrnotomatickí pacienti1 (n = 14)
Vek	66,9 ±4,0	70,2 ± 3,9
Pohlavie	muži (8)	muži (9)
Hypertenzia2	8	9
Hypercholesterolémia3	4	8
Cukrovka	3	1
V tom čase fajčiaci	7	8
Koronárne cievne ochorenie	5	4

¹U týchto pacientov sa vyskytol prechodný alebo pretrvávajúci ischemický mozgový záchvat 2 až 66 dní pred endarterektómiou.

²Počet pacientov s klinickou hypertenziou, ktorá sa liečila antihypertenzívnymi činidlami.

³Počet pacientov s hypercholesterolémiou, ktorá sa liečila liekmi na znižovanie lipidov.

Zistilo sa, že množstvo IL-18 je nadregulované v symptomatických aterosklerotických plakoch v porovnaní s asymptomatickými aterosklerotickými plakmi (2,03 ± 0,5 vs 0,67 ±0,17) (obrázok 4A). Štatistická analýza demonštrovala, že toto zvýšenie v produkcii IL-18, pozorované v symptomatických plakoch, bolo vysoko signifikantné (p < 0,0074), zatiaľ čo pozorované zvýšenie množstva IL-18BP v symptomatických plakoch oproti asymptomatickým plakom nebolo signifikantné (4,64 ± 0,98 vs 2,5 ± 0,92) (obrázok 4B). Inými slovami, hoci tak symptomatická, ako aj asymptomatická skupina, vykazovali pozitívnu koreláciu medzi IL-18 a IL18BP mRNA, medzi týmito dvoma skupinami boli významne rozdielne sklony

-34(symptomatická skupina: sklon 1,16 [0,19-2,14], r² = 0,36 vs asymptomatická skupina: sklon 4,79 [2,39-7,20], r² = 0,76; p < 0,05). Preto sa zdá, že relatívne zvýšenie IL-18BP expresie v symptomatickej skupine nie je dostatočné na kompenzáciu zvýšenia IL-18 expresie. Okrem toho, keďže prítomnosť ulcerácie sa považuje za znak nestability plakov, uskutočňovala sa ďalšia štatistická analýza na plakoch bez vredov alebo s vnútronými vredmi a demonštrovala sa významná nadregulácia IL-18 v plakoch s vredmi (p < 0,018) (obrázok 4C).

Tieto údaje dokazujú, že zvýšenie IL-18 expresie, pozorované vaterosklerotických plakoch, koreluje s nestabilitou plaku.

Príklad 5

IL-18BP moduluje vývoj aterosklerotických lézií a stabilitu v in vivo modeli ochorenia

Spôsoby

Charakteristiky pacientov

Vzorky plazmy sa odobrali pacientom s akútnymi ischemickými koronárnymi syndrómami (nestabilná angína a infarkt myokardu), menej ako 7 dní po začiatku symptómov. Nestabilná angína bola definovaná ako spojenie typickej bolesti v hrudi buď s ischemickými zmenami na elektrokardiograme, alebo s prítomnosťou koronárneho cievneho ochorenia. Infarkt myokardu sa diagnostikoval na základe typických ischemických zmien na elektorkardiograme spojených s významným zvýšením myokardiálnych enzýmov (kreatín fosfokinázy a troponínu I) v krvnom obehu. Neischemický pacienti sa vyberali na rovnakom kardiologickom oddelení a boli úplne bez ischemických známok. Plazmatické hladiny ľudského IL-18 sa determinovali použitím komerčne dostupného kitu (MBL, Japan).

In vivo intramuskulárny elektrotransfer myšacieho IL-18 expresného plazmidu

Štrnásť samčekov C57BL/6 apoE KO myší, vo veku 14 týždňov, dostalo v 3týždňových intervaloch 3 injekcie s IL-18BP expresným plazmidom pcDNA3IL18BP. Kontrolným myšiam (n=9) sa dávali injekcie s kontrolným prázdnym plazmidom. cDNA myšacej IL-18BP izoformy d, izolovaná ako už bolo opísané

-35(prístupové číslo # Q9ZOM9) (23), sa subklonovala do EcoR1/Not1 miest cicavčieho bunkového expresného vektora pcDNA3 pod kontrolou cytomegalovírusového promótora (Invitrogen). Konštrukt, označený 334.yh, je znázornený na obrázku 5. Kontrolným plazmidom bol podobný konštrukt bez terapeutickej cDNA. IL-18BP alebo kontrolný expresný plazmid (60 pg) sa injektovali do oboch tibiálnych kraniálnych svalov anestetizovanej myši, ako už bolo opísané (13). Stručne, transkutánne elektrické impulzy (8 obdĺžnikových vlnových elektrických impulzov, 200 V/cm, v trvaní 20 msec., 2 Hz) sa dodávali PS-15 elektropulzátorom (Genetronics, Francúzsko) použitím nefarbených oceľových platňových elektród umiestnených 4,2 až 5,3 mm od seba, na každej strane nohy.

ELISA mlL-18BP

Platne sa cez noc pokryli s r-mlL-18BPd afinitne purifikovanou králičou polyklonálnou protilátkou (5 pg/jamku). Rozpustný mll_-18BP sa detegoval použitím biotinylovanej králičej polyklonálnej protilátky (0,3 pg/ml) vyvolanej proti E. coli rmlL-18BP (Peprotec) nasledovanej extravidín peroxidázou (1/1000) (Sigma). Zachytenie polyklonálnej protilátky sa testovalo Western blotom, aby sa potvrdila špecificita mll_-18BP. Ako štandard sa použil rekombinantný mll_-18BPd produkovaný HEK 293 bunkami. Citlivosť ELISA bola 5 ng/ml.

Analýza myší

Kryostatické rezy (8 pm) sa získali z aoritického sínusu a použili sa na detekciu ukladania lipidov použitím olejovej červene, na detekciu kolagénu použitím sírius červene a na imunohistochemickú analýzu, ako už bolo opísané (13). Rezy sa farbili špecifickými primárnymi protilátkami: proti myšacím makrofágom, kloň MOMA2 (BioSource), protilátkou proti α-aktínu hladkých svalových buniek konjugovanou s alkalickou fosfatázou a anti-CD3 protilátkou pre T lymfocyty (Dáko), ako už bolo opísané (13). Detekcia bunkovej smrti sa uskutočňovala použitím TUNEL techniky (13). CD3 pozitívne bunky sa mikroskopicky počítali slepým spôsobom. Aterosklerotické plaky v aortickom sínuse a oblasti, ktoré sa pozitívne farbili na makrofágy, hladké svalové bunky, kolagén alebo TUNEL, sa merali

-36použitím počítačovej obrazovej kvantifikácie (NS15000, Microvision), ako už bolo opísané (13). Farbením prostredníctvom neimúnnych izotypovo zodpovedajúcich imunoglobulínov sa hodnotila špecificita imunofarbenia. Špecificita TUNEL techniky sa hodnotila prostredníctvom vynechania enzýmu terminálnej deoxynuklqotidyl transferázy. Hrudné aorty, v rozsahu od ľavej subklaviálnej artérie po obličkové artérie, sa fixovali v 10% tlmenom formalíne a farbili sa na detekciu ukladania lipidov s olejovou červeňou. Potom sa pozdĺžne otvorili a vypočítalo sa percento uloženia lipidov použitím počítačovej obrazovej kvantifikácie (NS15000, Microvision).

Výsledky

V tejto štúdii sa testovala hypotéza, že IL-18/IL-18BP regulácia hrá kritickú úlohu tak pri aterogenéze, ako aj pri stabilite plakov. Merali sa plazmatické hladiny IL-18 u pacientov s akútnymi koronárnymi syndrómami (30 mužov, 18 žien, priemerný vek 66,2 ± 1,8 rokov, z ktorých 14 malo nestabilnú angínu a 34 infarkt myokardu) a u neischemických kontrolných pacientov získaných na rovnakom kardiologickom oddelení (10 mužov, 3 ženy, priemerný vek 60,0 ± 5,2 rokov). V porovnaní s kontrolami boli plazmatické hladiny IL-18 významne zvýšené u akútnych koronárnych pacientov (146,9 ± 17,1 vs 73,0 ± 12,2 pg/ml, p < 0.05), na rozdiel od cirkulujúcich hladín IL-18BP, ktoré boli mierne zvýšené (20,1 ± 2,7 vs 7,5 ± 2,5 ng/ml, p = 0,06). Okrem toho, IL-18 hladiny korelovali so závažnosťou ochorenia, keďže najvyššie hladiny boli pozorované u pacientov so závažnou ischemickou srdcovou dysfunkciou a klinickými známkami pľúcneho opuchu (224,03 ± 39,1 pg/ml, p < 0.001 v porovnaní s kontrolami). Tieto výsledky, získané od pacientov s akútnym koronárnym ochorením, spolu s predchádzajúcimi pozorovaniami, že IL-18 je zvýšené v aterosklerotických plakoch od pacientov s mŕtvicami [Mallat, 2001], naznačujú potenciálne dôležitú úlohu IL-18/IL-18BP regulácie v aterosklerotickom procese.

Preto sme testovali túto hypotézu použitím apoE knockoutových (KO) myší, u ktorých sa spontánne vyvíjajú aterosklerotické lézie podobné ľudským. Štrnásť 14týždňových samčekov myší obdržalo IL-18BP prostredníctvom in vivo intra-37muskulárneho elektrotransferu DNA expresného plazmidu, ktorá kóduje IL-18BPd, zatiaľ čo 19 rovnako starých kontrolných myší obdržalo prázdny plazmid. Elektrotransfer plazmidu sa opakoval každé 3 týždne a myši sa usmrtili vo veku 23 týždňov po 9 týždňoch liečenia. Plazmatické hladiny IL-18BP boli nižšie ako detekčné limity (5 ng/ml) u apoE KO myší, ktorým sa injektoval prázdny plazmid. Avšak jediná injekcia IL-18BP plazmidu viedla k vysokým hladinám IL-18BP v krvi s maximálnym vzostupom 2 dni po injekcii (323,5 ± 100,9 ng/ml) a po 2 týždňoch sa namerali hodnoty 127,4 ± 35,4 ng/ml. Po 9 týždňoch liečenia buď s IL-18BP, alebo s prázdnym plazmidom, sa hladiny celkového cholesterolu (489,4 ± 34,6 vs 480,8 ± 36,3 mg/dl) a sérové hladiny lipoproteínu s vysokou hustotou (52,3 ± 9,4 vs 48,8 ± 5,1 mg/dl) nelíšili medzi týmito dvoma skupinami. V porovnaní s kontrolnou skupinou sa pozorovalo mierne, ale významné zvýšenie hmotnosti v skupine ošetrovanej s IL-18BP (31,8 ± 0,9 vs 28,6 ± 0,8 g, p < 0.05).

Vplyv podávania IL-18BP na aterosklerózu sa skúmal v 2 rozličných lokalitách: v zostupujúcej hrudnej aorte a v aortickom sínuse. Hrudná aorta sa vybrala na determináciu úlohy IL-18BP pri vývoji tukových pásov (aterogenéze), keďže hrudné aterosklerotické lézie boli takmer neprítomné vo veku 14 týždňov (údaje nie sú uvedené), kedy sa začala transfekcia s IL-18BP. Aoritcký sínus, v ktorom boli aterosklerotické lézie prítomné už vo veku 14 týždňov (údaje nie sú uvedené), sa skúmal z hľadiska progresie a zloženia pokročilých plakov, čo je dôležitým determinantom plakovej stability. Ošetrenie apoE KO myší s IL-18BP významne ovplyvňovalo vývoj a progresiu aterosklerotických lézií. Skúmaním hrudnej aorty sa dokázala značná redukcia ukladania lipidov u myší ošetrených s IL-18BP plazmidom, v porovnaní s myšami ošetrovanými prázdnym plazmidom (obrázok 6). Kvantitatívnou počítačovou obrazovou analýzou sa dokázala 69% redukcia rozsahu aterosklerotických lézií (p<0,0001) (obrázok 6), z čoho vyplýva kritická permisívna úloha IL-18 pri aterogenéze. Okrem toho, liečenie s IL-18BP plazmidom v priebehu len 9 týždňov významne obmedzovala progresiu pokročilých aterosklerotických plakoch v aortickom sínuse (24% redukcia veľkosti plaku, p = 0,01) v porovnaní s liečením prázdnym plazmidom (obrázok 7).

Čo je dôležitejšie, zloženie pokročilých lézií - hlavný determinant plakovej nestability, bolo zásadne ovplyvnené IL-18BP liečením. Aterosklerotické lézie u

-38myší liečených s IL-18BP plazmidom vykazovali veľmi významnú, 50%, redukciu v infiltrácii makrofágov (p < 0,0001) (obrázok 8), obsahovali o 67% menej T lymfocytov (p < 0,005) (obrázok 8) a vykazovali dvojnásobný nárast akumulácie hladkých svalových buniek (p < 0,05) (obrázok 9). Okrem toho, tieto dôležité zmeny v bunkovom zložení lézii boli spojené s významným, 85% nárastom obsahu kolagénu (p < 0,0005), čo sa stanovilo farbením so sírius červeňou, a pokles celkového obsahu lipidov.

Preto liečenie s IL-18BP významne oslabuje zápalový proces vo vnútri aterosklerotických lézii a indukuje hojivý proces, ktorý je charakteristický pre stabilné aterosklerotické plaky. Okrem toho, bola redukcia v zápalovej zložke lézii u myší liečených s IL-18BP spojená s podstatnou redukciu vo výskyte bunkovej smrti vo vnútri plakov (2,9 ± 0,9 % u IL-18BP ošetrených myší vs. 10,5 ± 3,6 % u kontrolných myší, p < 0,05), čím sa obmedzia expanzia a trombogénnosť bezbunkového lipidového jadra [Mallat, 1999].

Závery

Použitím dobre hodnoteného myšacieho modelu ľudskej aterosklerózy vyššie uvedené výsledky jasne demonštrovali neočakávanú a kritickú úlohu IL-18 a IL18BP regulácie vo vývoji, progresii a stabilite aterosklerotických plakov. Inhibícia IL18 aktivity prostredníctvom dodania IL-18BP nie len že predchádzala vytváraniu skorých lézii v hrudnej aorte, ale aj zásadne ovplyvňovala zloženie pokročilých lézii v aortickom sínuse, vrátane prepnutia na stabilný plakový fenotyp.

Klinická prognóza pacienta s aterosklerózou len sčasti závisí na veľkosti lézii. Vo všeobecnosti sa teraz prijíma, že kvalita (zloženie plaku), a nie veľkosť, lézie by mohla byť lepším znamením výskytu ischemických prípadov. V skutočnosti, závažné klinické prejavy aterosklerózy (srdcové a mozgové infarkty) sú spôsobené najmä oklúziou cievneho lumenu trombusom vytvoreným pri kontakte prasknutého aterosklerotického plaku (19). Patologické štúdie ukázali, že krehké a nestabilné plaky, ktoré sú náchylné na prasknutie alebo prasknuté, sú bohaté na zápalové bunky, ktoré vykazujú podstatnú stratu hladkých svalových buniek a zníženie obsahu kolagénu (20, 21). Okrem toho takéto plaky vykazujú významné zvýšenie apoptickej bunkovej smrti, ktorá vedie k vytvoreniu vysoko trombogénneho

-39lipidového jadra (13, 22). Je pozoruhodné, že všetky tieto známky zvýšenej plakovej nestability sú značne oslabené u myší liečených s IL-18BP, z čoho vyplýva, že IL-18 signalizácia je hlavným determinantom plakovej nestability.

Relevantnosť výsledkov získaných u apoE KO myší pre humánne ochorenie sa posilnila naším zistením výskytu zvýšených hladín cirkulujúceho IL-18' u pacientov s akútnymi koronárnymi syndrómami a zvýšenej produkcie IL-18 v nestabilných karotídových aterosklerotických plakoch zodpovedných za mŕtvicu. Spojenie týchto zistení identifikuje inhibítory IL-18 aktivity ako nové dôležité terapeutické nástroje na prevenciu a liečenie vývoja aterosklerotických plakov a na obmedzenie platových komplikácií.

Príklad 6

Zvýšené hladiny IL-18 korelujú s opakovanými prípadmi zlyhania srdca u pacientov

Hladiny IL-18 sa merali v krvnom sére pacientov prostredníctvom ELISA s IL18 špecifickou protilátkou.

Celkovo sa testovalo 56 ischemických alebo neischemických pacientov, s alebo bez zlyhania srdca.

U pacientov, ktorí neskôr zomreli, boli hladiny IL-18 216 ± 41,5 pg/ml oproti 112,2 ± 12,2 pg/ml u pacientov, ktorí prežívali (p = 0,0018).

U pacientov s akýmkoľvek opakovaným prípadom, ako napríklad smrťou, opakovanou ischémiou, revaskularizáciou, progresiou aterosklerózy alebo opätovnou hospitalizáciou v dôsledku zlyhania srdca, sa namerali nasledujúce hodnoty IL-18: 165,8 ± 23,8 versus 107,7 ± 14,6 u pacientov bez akéhokoľvek opakovaného prípadu (p = 0,03).

Tieto výsledky demonštrujú, že IL-18 hladiny sú významne zvýšené u pacientov, ktorí majú zlú klinickú prognózu, akou je napríklad opakovaný prípad alebo aj smrť.

Vzorky krvi od 16 neischemických pacientov, s alebo bez zlyhania srdca, sa testovali z hľadiska hladín IL-18. U všetkých pacientov, ktorí neskôr zomreli, boli hladiny 199,0 ± 34,8 pg/ml versus 95,3 ± 20,4 pg/ml u tých pacientov, ktorí prežívali (P = 0,09).

-40Pacienti s akýmkoľvek opakovaným prípadom: 146,6 ± 34,4 pg/ml IL-18 versus 95,4 ± 23,9 pg/ml u pacientov bez opakovaného prípadu (p=0,03). Hoci rozdiely v IL-18 hladinách nedosiahli štatistickú významnosť kvôli malému počtu pacientov, bolo možné pozorovať jasný trend smerom k zvýšeným IL-18 hladinám.

U ischemických pacientov boli IL-18 hladiny 214^2 ± 45,9 pg/ml u pacientov, ktorí zomreli, oproti 118,4 ± 12,8 pg/ml u pacientov, ktorí prežívali (p = 0,007).

IL-18 v množstve 162,8 ± 24,7 pg/ml sa nameral u tých pacientov, ktorí mali akýkoľvek opakovaný prípad, oproti 116,2 ± 16,0 u pacientov bez opakovaného prípadu.

-41Použitá literatúra

1. Ross R., Atherosclerosis - an inflammatory disease., N. Engl. J. Med. 1999; 340: 115-126.

2. Van der Wal AC, Becker AE, Van der Loos CM, Das PK., Site of intimal ruptuŕe or erosion of thrombosed coronary atherosclerotic plaques is characterized by an inflammatory process irrespective of the dominánt plaque morphology., Circulation 1994;,89:,36-44.

3. Fuster V, Badimon L, Badimon JJ, Chesebro JH., The pathogenesis of coronary artery disease and the acute coronary syndromes (1). N. Engl. J. Med. 1992; 326: 242-250.

4. Fuster V, Badimon L, Badimon JJ, Chesebro JH., The pathogenesis of coronary artery disease and the acute coronary syndromes (2). N. Engl. J. Med. 1992; 326: 310-318.

5. Lee RT, Libby P. The unstable atheroma. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1997;17:1859-1867.

6. Ridker PM, Cushman M, Stampfer MJ, Tracy RP, Hennekens CH. Inflammation, aspirín, and the risk of cardiovascular disease in apparently healthy men. N. Engl. J. Med. 1997; 336:973-979.

7. Libby P. Molecular bases of the acute coronary syndromes. Circulation 1995; 91: 2844-2850.

8. Nakamura, K, Okamura, H, Nagata, K a Tamura, T. (1989). Infect. Immun. 57, 590-595.

9. Yoshimoto T, Takeda, K, Tanaka, T, Ohkusu, K, Kashiwamura, S, Okamura, H, Akira, S a Nakanishi, K (1998). J. Immunol. 161,3400-3407.

10. Parnet, P, Garka, K E, Bonnert, T P, Dower, S K, a Sims, J E. (1996). J. Biol. Chem. 271,3967-3970.

11. DiDonato, J A, Hayakawa, M, Rothwarf, D M, Zandi, E a Karin, M. (1997). Náture 388, 16514-16517.

12. Novick, D, Kim, S-H, Fantuzzi, G, Rezníkov, L, Dinarello, C a Rubinstein, M (1999). Immunity 10, 127-136.

-4213. Mallat Z, Hugel B, Ohan J, Leséche G, Freyssinet JM, Tedgui A. Shed membráne microparticles with procoagulant potential in human atherosclerotic plaques. A role for apoptosis in plaque thrombogenicity. Circulation 1999; 99:348353.

14. Tricot O, Mallat Z, Heymes C, Belmin J, Leséche G, Tedgui A. Relation Between Endothelial Celí Apoptosis and Blood Flow Direction in Human Atherosclerotic Plaque. Circulation 2000; v tlači.

15. Dimmeler S, Haendeler J, Galie J, Zeiher AM. Oxidized low-density lipoprotein induces apoptosis of human endothelial cells by activation of CPP32-like proteases. A mechanistic clue to the 'response to injury' hypothesis. Circulation 1997; 95:17603.

16. Grantham, Science, zv. 185, str. 862-864 (1974).

17. Dimmeler S, Haendeler J, Galie J, Zeiher AM. Oxidized low-density lipoprotein induces apoptosis of human endothelial cells by activation of CPP32-like proteases. A mechanistic clue to the 'response to injury' hypothesis. Circulation 1997; 95:17603.

18. Mir LM, Bureau MF, Gehl J, Rangara R, Rouy D, Caillaud JM, Dellere P, Branellec D, Schwartz B, Scherman D. High efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96:4262-7.

19. Lee, R.T. & Libby, P. The unstable atheroma. Arterioscler Thromb Vasc Biol 17, 1859-1867(1997).

20. Davies, M.J. The composition of coronary-artery plaques [editorial; comment], N Engl J Med 336, 1312-1314 (1997).

21. Virmani, R., Kolodgie, F.D., Búrke, A.P., Farb, A. & Schwartz, S.M. Lessons from sudden coronary death: a comprehensive morphological classification scheme for atherosclerotic lesions. Arterioscler Thromb Vasc Biol 20,1262-1275. (2000).

22. Kolodgie, F.D. a ďalší, Localization of apoptotic macrophages at the site of plaque rupture in sudden coronary death [In Process Citationj. Am J Pathol 157, 1259-1268 (2000).

23. Kim, S.H. a ďalší, Structural requirements of six naturally occurring isoforms of the IL- 18 binding protein to inhibit IL-18. Proc Natl Acad Sci U S A 97, 1190-1195 (2000).

-4324. Elliott, M.J., Maini, R.N., Feldmann, M., Long-Fox, A., Charles, P., Bijl, H., and Woody, J.N., 1994, Lancet 344, 1125-1127.

25. Knight DM, Trinh H, Le J, Siegel S, Shealy D, McDonough M, Scallon B, Moore MA, Vilcek J, Daddona P, a ďalší, Construction and initial characterization of a mouse-human chimeric anti-TNF antibody.Mol Immunol 1993 Nov 30:16 1443-53

26. Tucci, A., James, H., Chicheportiche, R., Bonnefoy, J.Y., Dayer, J.M. a Zubler, R.H., 1992, J.lmmunol. 148, 2778-2784.

27. Engelmann, H., D. Novick a D. Wallach. 1990. Two tumor necrosis factorbinding proteins purified from human urine. Evidence for immunological crossreactivity with celí surface tumor necrosis factor receptors. J. Biol. Chem. 265:15311536.

28. Moore WS, Barnett HJ, Beebe HG, a ďalší. Guidelines for carotid endarterectomy. A multidisciplinary consensus statement from the Ad Hoc Committee, American Heart Association. Circulation 1995; 91:566-79.

29. Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anál Biochem 1987; 162:156-

Claims (46)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použitie IL-18 inhibítora na výrobu lieku na liečenie a/alebo prevenciu aterosklerózy.
2. 2. Použitie IL-18 inhibítora na výrobu lieku na liečenie a/alebo prevenciu trombózy aterosklerotického plaku.
3. 3. Použitie IL-18 inhibítora na výrobu lieku na liečenie a/alebo prevenciu aterosklerotického plakového vredu.
4. 4. Použitie IL-18 inhibítora na výrobu lieku na liečenie a/alebo prevenciu destabilizácie aterosklerotického plaku.
5. 5. Použitie IL-18 inhibítora na výrobu lieku na liečenie a/alebo prevenciu ischemických syndrómov v dôsledku destabilizácie plaku.
6. 6. Použitie IL-18 inhibítora na výrobu lieku na liečenie a/alebo prevenciu prasknutia aterosklerotického plaku.
7. 7. Použitie IL-18 inhibítora na výrobu lieku na liečenie a/alebo prevenciu opakovaných prípadov zlyhania srdca.
8. 8. Použitie podľa nároku 7, kde zlyhanie srdca je ischemické.
9. 9. Použitie podľa nároku 7, kde zlyhanie srdca je neischemické.
10. 10. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 9, kde IL-18 inhibítor je vybraný zo skupiny, ktorá zahrnuje ICE-inhibítory, protilátky proti IL-18, protilátky proti ktorejkoľvek z IL-18 receptorových podjednotiek, inhibítory IL-18 receptorovej signalizačnej dráhy, antagonisty IL-18, ktoré súťažia s IL-18 a blokujú IL-18

    -45receptor, a IL-18 viažuce proteíny, ich izoformy, muteíny, fúzované proteíny, funkčné deriváty, aktívne frakcie alebo cirkulárne permutované deriváty.
11. 11. Použitie podľa nároku 10, kde IL-18 inhibítorom je protilátka nasmerovaná proti IL-18.
12. 12. Použitie podľa nároku 11, kde protilátkou je humanizovaná protilátka.
13. 13. Použitie podľa nároku 11, kde protilátkou je ľudská protilátka.
14. 14. Použitie podľa nároku 10, kde inhibítorom funkcie IL-18 je IL-18BP alebo jeho izoforma, muteín, derivát alebo fragment.
15. 15. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 10 až 14, kde IL-18 viažuci proteín je PEGylovaný.
16. 16. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 10 až 15, kde IL-18 inhibítor je fúzovaný proteín, ktorý obsahuje celý alebo časť IL-18 viažuceho proteinu fúzovanú s celým alebo časťou imunoglobulínu a viaže sa na IL-18.
17. 17. Použitie podľa nároku 16, kde fúzovaný proteín obsahuje celú alebo časť konštantnej oblasti imunoglobulínu.
18. 18. Použitie podľa nároku 17, kde imunoglobulín má izotyp lgG1 alebo lgG2.
19. 19. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde liek ďalej obsahuje interferón na súčasné, postupné alebo oddelené použitie.
20. 20. Použitie podľa nároku 19, kde interferónom je interferón-β.

    -4621. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde liek ďalej obsahuje antagonistu tumorového nekrotického faktora - TNF, na súčasné, postupné alebo oddelené použitie.
21. 22. Použitie podľa nároku 21, kde TNF antagonistom je TBPI a/alebo TBPII.
22. 23. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde liek ďalej obsahuje COX-inhibítor na súčasné, postupné alebo oddelené použitie.
23. 24. Použitie podľa nároku 23, kde COX-inhibítorom je COX-2 inhibítor.
24. 25. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde liek ďalej obsahuje inhibítor tromboxánu na súčasné^ postupné alebo oddelené použitie.
25. 26. Použitie podľa nároku 25, kde inhibítorom tromboxánu je aspirín.
26. 27. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde liek ďalej obsahuje činidlo na znižovanie lipidov, na súčasné, postupné alebo oddelené použitie.
27. 28. Použitie podľa nároku 27, kde činidlom na znižovanie lipidov je HMG CoA inhibítor.
28. 29. Použitie podľa nároku 28, kde HMG CoA inhibítorom je statín.
29. 30. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde sa liek používa v kombinácii so stravou s nízkym obsahom tukov a/alebo nízkym obsahom cholesterolu a/alebo nízkym obsahom soli.
30. 31. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde sa IL-18 inhibítor používa v množstve približne 0,0001 až 10 mg/kg telesnej hmotnosti, alebo

    -45približne 0,01 až 5 mg/kg telesnej hmotnosti, alebo približne 0,1 až 3 mg/kg telesnej hmotnosti alebo približne 1 až 2 mg/kg telesnej hmotnosti.
31. 32. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde sa IL-18 inhibítor používa v množstve približne 0,1 až 1000 pg/kg telesnej hmotnosti, alebo 1 až 100 pg/kg telesnej hmotnosti, alebo približne 10 až 50 pg/kg telesnej hmotnosti.
32. 33. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde sa IL-18 inhibítor podáva subkutánne.
33. 34. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde sa IL-18 inhibítor podáva intramuskulárne.
34. 35. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde sa IL-18 inhibítor podáva denne.
35. 36. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde sa IL-18 inhibítor podáva každý druhý deň.
36. 37. Použitie expresného vektora, ktorý obsahuje sekvenciu kódujúcu IL-18 inhibítor, na výrobu lieku na liečenie a/alebo prevenciu aterosklerózy.
37. 38. Použitie podľa nároku 37, kde sa expresný vektor podáva elektrotransferom.
38. 39. Použitie podľa nároku 37 alebo 38, kde sa expresný vektor podáva systémovo.
39. 40. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde sa expresný vektor podáva intramuskulárne.

    -4841. Použitie vektora na indukciu a/alebo zosilnenie endogénnej produkcie IL18 inhibítora v bunke na výrobu lieku na liečenie a/alebo prevenciu aterosklerózy.
40. 42. Použitie bunky, ktorá bola geneticky modifikovaná tak, aby produkovala IL-18 inhibítor, na výrobu lieku na liečenie a/alebo prevenciu aterosklerózy.
41. 43. Spôsob liečenia a/alebo prevencie aterosklerózy, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podávanie účinného inhibičného množstva IL-18 inhibítora príjemcovi, ktorý to potrebuje.
42. 44. Spôsob prevencie a/alebo liečenia aterosklerózy, vyznačujúci sa t ý m , že zahŕňa podávanie expresného vektora obsahujúceho sekvenciu kódujúcu IL-18 inhibítor príjemcovi, ktorý to potrebuje.
43. 45. Spôsob podľa nároku 44, vyznačujúci sa tým, že expresný vektor sa podáva systémovo.
44. 46. Spôsob podľa nároku 44 alebo 45, vyznačujúci sa tým, že expresný vektor sa podáva intramuskulárnou injekciou.
45. 47. Použitie IL-18 ako diagnostického markera zlej klinickej prognózy pri zlyhaní srdca.
46. 48. Použitie IL-18 diagnostického markera opakovaných prípadov po prvom prípade zlyhania srdca.