-
Querbezug
zu verwandten Anmeldungen
-
Diese
reguläre
Anmeldung beansprucht die Priorität der vorläufigen U.S. Anmeldung Nr. 60/063
634, eingereicht am 27.10.1997, und der vorläufigen U.S. Anmeldung Nr. 60/063
666, eingereicht am 28.10.1997.
-
Gebiet der
Erfindung
-
Diese
Erfindung betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen, die Aminothiazolverbindungen
zur Inhibierung von Zyklin-abhängigen
Kinasen (CDKs), wie CDK1, CDK2, CDK4 und CDK6, enthalten. Die Erfindung
betrifft auch die therapeutische oder prophylaktische Verwendung
von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die derartige Verbindungen
enthalten, und Verfahren zur Behandlung von Malignitäten und
anderen Störungen
durch Verabreichung von wirksamen Mengen derartiger Verbindungen.
-
Hintergrund
der Erfindung
-
Unkontrollierte
Zellproliferation ist ein Anzeichen für Krebs. Zellproliferation
als Antwort auf verschiedene Stimuli manifestiert sich durch eine
Deregulierung des Zellteilungszyklus, dem Prozess, bei dem sich
Zellen vermehren und teilen. Tumorzellen haben typischerweise Schäden an den
Genen, die direkt oder indirekt das Fortschreiten durch den Zellteilungszyklus
regulieren.
-
CDKs
stellen eine Klasse von Enzymen dar, die eine wichtige Rolle bei
der Regulierung der Übergänge zwischen
verschiedenen Phasen des Zellzyklus spielen, wie dem Fortschreiten
von einem ruhenden Stadium G1 (der Lücke zwischen der Mitose und
dem Beginn der DNA-Replikation
für eine
neue Runde der Zellteilung) nach S (der Periode der aktiven DNA-Synthese), oder dem
Fortschreiten von der G2- zur M-Phase, in welcher aktive Mitose
und Zellteilung auftreten. Siehe, z. B. die in Science, Vol. 274
(1996), 1643–1677;
und Ann. Rev. Cell Dev. Biol., Vol. 13 (1997), 261–291 zusammengefassten
Artikel. CDK-Komplexe werden durch Assoziierung einer regulierenden
Zyklin-Untereinheit (z.B., Zyklin A, B1, B2, D1, D2, D3 und E) und
einer katalytischen Kinase-Unterheinheit (z.B., cdc2 (CDK1), CDK2,
CDK4, CDK5 und CDK6) gebildet. Wie der Name impliziert, zeigen CDKs
eine absolute Abhängigkeit
von der Zyklineinheit, um ihre Zielsubstrate zu phosphorylieren,
und unterschiedliche Kinase/Zyklin-Paare dienen der Regulierung des Fortschreitens
durch spezifische Teile des Zellzyklus.
-
Die
D-Zykline sind empfindlich für
extrazelluläre
Wachstumssignale und werden als Antwort auf Mitogene während der
G1-Phase des Zellzyklus aktiviert. CDK4/Zyklin D spielt eine wichtige
Rolle beim Fortschreiten des Zellzyklus durch Phosphorylierung und
dadurch bei der Inaktivierung des Retinoblastom-Proteins (Rb). Hypophosphoryliertes
Rb bindet an eine Familie von Transkriptionsregulatoren, aber bei
Hyperphosphorylierung von Rb durch CDK4/Zyklin D werden diese Transkriptionsfaktoren
freigesetzt, um Gene zu aktivieren, deren Produkte für das Fortschreiten
in die S-Phase verantwortlich sind. Rb-Phosphorylierung und Inaktivierung durch
CDK4/Zyklin D ermöglichen
den Übergang
der Zelle über
den Restriktionspunkt der G1-Phase hinaus, wobei die Empfindlichkeit
gegenüber
extrazellulärem
Wachstum und Inhibitorsignalen verloren geht und die Zelle der Zellteilung
unterworfen wird. Während
der späten
G1-Phase wird Rb auch phosphoryliert und durch CDK2/Zyklin E inaktiviert,
und neuere Nachweise deuten darauf hin, dass CDK2/Zyklin E auch
das Fortschreiten in die S-Phase durch einen parallelen Stoffwechselweg,
der von der Rb-Phosphorylierung unabhängig ist (siehe Lukas et al., "Cyclin E-induced
S Phase without Activation of the pRb/E2F Pathway," Genes and Dev., Vol.
11 (1997), 1479–1492),
regulieren kann.
-
Das
Fortschreiten von der G1- zur S-Phase, die durch die Wirkung von
CDK4/Zyklin D und CDK2/Zyklin E vollzogen wird, unterliegt einer
Vielzahl von wachstumsregulierenden Mecha nismen, sowohl negativen wie
auch positiven. Wachstumsstimuli wie Mitogene verursachen eine vermehrte
Synthese von Zyklin D1 und vermehren so funktionelles CDK4. Im Gegensatz
dazu können
dem Wachstum „Zügel angelegt" werden, als Reaktion
auf DNA-Schädigungen
oder negative Wachstumsstimuli durch die Induktion von endogenen
Inhibitorproteinen. Diese natürlich
vorkommenden Proteininhibitoren umfassen p21WAF1/CIPI,
p27KIPI und die p16INK4 Familien,
deren letztere ausschließlich
CDK4 inhibiert (siehe Harper, "Cyclin
Dependent Kinase Inhibitors," Cancer
Surv., Vol. 29 (1997), 91–107).
Abweichungen in diesem Kontrollsystem, insbesondere solche, welche die
Funktion von CDK4 und CDK2 betreffen, sind in das Fortschreiten
von Zellen zu hochproliferativen Zustandseigenschaften von Malignitäten verwickelt,
wie hereditären
Melanomen, Ösophaguskarzinomen
und Pankreaskarzinomen (siehe, z. B., Hall and Peters, "Genetic Alterations
of Cyclins, Cyclin-Dependent Kinases, and CDK Inhibitors in Human
Cancer," Adv. Cancer
Res., Vol. 68 (1996), 67–108;
und Kamb et al., "A
Cell Cycle Regulator Potentially Involved in Genesis of Many Tumor
Types," Science,
Vol. 264 (1994), 436–440). Überexpression
von Zyklin D1 ist mit Ösophagus-,
Brust- und Plattenepithelkarzinomen verbunden (siehe, z.B., DelSal
et al., "Cell Cycle
and Cancer: Critical Events at the G1 Restriction Point," Critical Rev. Oncogenesis,
Vol. 71 (1996), 127–142).
Gene, kodierend die CDK4- spezifischen
Inhibitoren der p16-Familie, weisen häufig Deletionen und Mutationen
bei hereditären
Melanomen, Gliomen, Leukämien,
Sarkomen und Pankreas-, nicht-kleinzellige Lungen- sowie Kopf- und
Halskarzinomen auf (siehe Nobori et al., "Deletions of the Cyclin-Dependent Kinase-4
Inhibitor Gene in Multiple Human Cancers," Nature, Vol. 368 (1994), 753–756). Amplifikation
und/oder Überexpression
von Zyklin E wurde auch bei einer breiten Vielzahl von festen Tumoren
beobachtet und erhöhte
Zyklin E-Spiegel wurden mit einer schlechten Prognose korreliert.
Außerdem
sind die zellulären
Spiegel des CDK-Inhibitors p27, der sowohl als Substrat wie auch
als Inhibitor von CDK2/Zyklin E wirkt, bei Brust-, Darm- und Prostatakrebs
abnorm niedrig, und die Expressionsspiegel von p27 sind mit dem Stadium
der Krankheit invers korreliert (siehe Loda et al., "Increased Proteasome-dependent
Degradation of the Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor p27 in Aggressive
Colorectal Carcinomas," Nature
Medicine, Vol. 3 (1997), 231–234).
Das p21-Protein scheint auch das p53-Tumorsuppressorsignal an die
CDKs zu übermitteln; so
kann die Mutation von p53 in etwa 50 % aller humanen Karzinome indirekt
aus der Deregulierung der CDK-Aktivität resultieren.
-
Die
sich abzeichnenden Daten liefern eine deutliche Bestätigung für die Verwendung
von CDK, und insbesondere CDK4 und CDK2 inhibierende Verbindungen,
als antiproliferative therapeutische Mittel. Bestimmte Biomoleküle wurden
für diesen
Zweck vorgeschlagen. Zum Beispiel beschreibt das U.S.-Patent Nr.
5 621 082 von Xiong et al. Nukleinsäuren, welche einen CDK6-Inhibitor kodieren,
und die Europäische
Patentveröffentlichung
Nr. 0 666 270 A2 beschreibt Peptide und Peptidmimetika, welche als
Inhibitoren von CDK1 und CDK2 wirken. Einige kleine Moleküle wurden
als CDK-Inhibitoren identifiziert (für eine aktuelle Rezension siehe
Webster, "The Therapeutic
Potential of Targeting the Cell Cycle," Exp. Opin. Invest. Drugs, Vol. 7 (1998), 865–887). Das
Flavon Flavopyridol zeigt eine bescheidene Selektivität für die Inhibierung
von CDKs gegenüber
anderen Kinasen, inhibiert jedoch CDK4, CDK2 und CDK1 gleichermaßen, mit
einem IC50S im Bereich von 0,1–0,3 μM. Flavopyridol
wird derzeit in klinischen Phase-II-Studien als onkologisches Chemotherapeutikum getestet
(Sedlacek et al., "Flavopiridol
(L86-8275; NSC 649890), A New Kinase Inhibitor for Tumor Therapy," Int. J. Oncol, Vol.
9 (1996), 1143–1168).
Analoga von Flavopyridol sind Gegenstand von anderen Publikationen,
zum Beispiel dem U.S.-Patent Nr. 5 733 920 von Mansuri et al. (Internationale
Veröffentlichung
Nr. WO 97/16447) und den Internationalen Veröffentlichungen Nr. WO 97/42949
und WO 98/17662. Ergebnisse mit auf Purin basierenden Derivaten
werden beschrieben bei Schow et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., Vol.
7 (1997), 2697–2702;
Grant et al., Proc. Amer. Assoc. Cancer Res„ Vol. 39 (1998), Abst. 1207;
Legravend et al., Bioorg. Med. Chem. Lett, Vol. 8 (1998), 793–798; Gray
et al., Science, Vol. 281 (1998), 533–538; und Furet et al., 216th ACS
Natl. Mtg. (Aug 23–27,
1998, Boston), Abst MEDI-218. Außerdem beschreiben die folgenden
Publikationen bestimmte Pyrimidine, welche die Zyklin-abhängigen Kinasen
und Wachstumsfaktor-vermittelte Kinasen inhibieren; Internationale
Veröffentlichung
Nr. WO 98/33798; Ruetz et al., Proc. Amer. Assoc. Cancer Res., Vol. 39
(1998), Abst. 3796; und Meyer et al., Proc. Amer. Assoc. Cancer
Res., Vol. 39 (1998), Abst. 3794.
-
Es
besteht jedoch noch immer Bedarf an kleinmoleküligen Verbindungen, welche
einfach hergestellt werden können
und wirkungsvolle Inhibitoren für
eine oder mehrere CDKs oder CDK/Zyklin-Komplexe darstellen. Da CDK4
als ein allgemeiner Aktivator für
die Zellteilung in den meisten Zellen wirkt, und da Komplexe aus CDK4/Zyklin
D und CDK2/Zyklin E die frühe G1-Phase
des Zellzyklus steuern, besteht Bedarf an wirksamen und spezifischen
Inhibitoren von CDK4 und/oder CDK2 zur Behandlung von einer oder
mehreren Arten von Tumoren.
-
Zusammenfassung
der Erfindung
-
Demzufolge
ist ein Gegenstand der Erfindung, Verbindungen und Wirkstoffzusammensetzungen
zu erhalten, welche die Aktivität
von einer oder mehreren CDKs, wie CDK2, CDK4, und/oder CDK6, oder
deren Zyklin-Komplexen inhibieren. Ein weiterer Gegenstand ist die
Bereitstellung eines wirksamen Verfahrens zur Behandlung von Krebsindikationen
durch CDK-Inhibierung, vorzugsweise durch Inhibierung von CDK4 oder CDK4/Zyklin
D-Komplexen und/oder CDK2 oder CDK2/Zyklin E-Komplexen. Ein anderer
Gegenstand ist die Erlangung von pharmazeutischen Zusammensetzungen,
welche Verbindungen enthalten, die wirksam den Übergang von Krebszellen in
ihre proliferative Phase blockieren. Diese und andere Gegenstände und
Vorteile der Erfindung, welche im Licht der unten folgenden detaillierten
Beschreibung deutlich werden, werden durch Zellzyklussteuerungsagenzien
der unten beschriebenen Erfindung erreicht.
-
In
einem allgemeinen Aspekt, betrifft die Erfindung pharmazeutische
Zusammensetzungen, umfassend:
- (a) ein Zellzyklussteuerungsagens,
ausgewählt
aus:
- (i) Verbindungen der Formel I: wobei:
R1 ausgewählt ist
aus: R2 eine substituierte oder unsubstituierte,
carbozyklische oder heterozyklische, monozyklische oder anellierte
oder nicht-anellierte polyzyklische Ringstruktur ist, wobei jeder
optionale Substituent für
R2 unabhängig
ein Halogen (z. B. Chlor, Iod, Brom oder Fluor); Sauerstoff (=O);
Halogenalkyl (z. B. Trifluormethyl); C1-6-Alkyl;
C1-6-Alkenyl; C1-6-Alkinyl;
Hydroxyl; C1-6-Alkoxyl; carbozyklisches
Cycloalkyl, welches monozyklisch oder anelliert oder nicht-anelliert
polyzyklisch (z. B. Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl oder Cyclohexyl)
sein kann, oder ein Heterocycloalkyl, welches monozyklisch oder
anelliert oder nicht-anelliert polyzyklisch (z. B. Pyrrolidinyl,
Piperidinyl, Piperazinyl, Morpholinyl oder Thiazinyl) sein kann;
ein carbozyklisches oder heterozyklisches, monozyklisches oder anelliertes
oder nicht-anelliertes polyzyklisches Aryl (z. B. Phenyl, Naphthyl,
Pyrrolyl, Indolyl, Furanyl, Thiophenyl, Imidazolyl, Oxazolyl, Isoxazolyl,
Thiazolyl, Triazolyl, Tetrazolyl, Pyrazolyl, Pyridinyl, Chinolinyl,
Isochinolinyl, Acridinyl, Pyrazinyl, Pyridazinyl, Pyrimidinyl, Benzimidazolyl,
Benzothiophenyl oder Benzofuranyl); Amino (primär, sekundär oder tertiär); Nitro;
Thiol; Thioether; Imin; Cyano; Amido; Phosphonato; Phosphin; Carboxyl;
Thiocarbonyl; Sulfonyl; Sulfonamid; Keton; Aldehyd; oder Ester ist;
- (ii) pharmazeutisch akzeptablen Salzen der Verbindungen mit
der Formel I; und
- (iii) Pro-pharmaka und pharmazeutisch aktiven Metaboliten der
Verbindungen mit der Formel I oder pharmazeutisch akzeptablen Salzen
davon; und
- (b) einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
-
Derartige
Zusammensetzungen sind als Inhibitoren für CDK/Zyklin-Komplexe von Säugern, für Insekten-CDK
oder CDK-Komplexen aus Pilzen nützlich.
Derartige Zusammensetzungen sind auch für die Kontrolle bzw. Steuerung
der Proliferation, Differenzierung und/oder Apoptose nützlich.
So ist in einem allgemeinen Aspekt die Erfindung auf pharmazeutische
Zusammensetzungen gerichtet, die pharmazeutisch wirksame Menge an
Zellzyklussteuerungsagenzien enthalten.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist die Erfindung auf wirksame Zellzyklussteuerungsagenzien gerichtet,
bei denen R2 in der Formel I eine ortho-substituierte
Arylringstruktur ist (z. B. ein ortho-substituiertes Phenyl). Insbesondere
sind unter den Mitteln solche bevorzugt, in welchen R2 ein
ortho-disubstituiertes Phenyl ist.
-
Die
Erfindung betrifft weiterhin Verfahren unter Verwendung von Zellzyklussteuerungsagenzien
für die Behandlung
von durch CDK-Inhibierung vermittelten Krankheiten und Störungen,
insbesondere solche durch CDK4 und/oder CDK2-Inhibierung vermittelte.
Spezieller betrifft die Erfindung Verfahren zur Behandlung von Malignitäten oder
krebsartigen Störungen,
durch die Verabreichung einer pharmazeutischen, ein Zellzyklussteuerungsagens
enthaltenden Zusammensetzung. Außerdem betrifft die Erfindung
die Verwendung von Zellzyklussteuerungsagenzien, um Pilzinfektionen
vorzubeugen und sie zu behandeln.
-
Andere
Aspekte, Vorteile und bevorzugte Merkmale der Erfindung werden in
der unten folgenden detaillierten Beschreibung deutlich werden.
-
Detaillierte
Beschreibung und bevorzugte Ausführungsformen
der Erfindung
-
In
einer allgemeinen Ausführungsform
betrifft die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, jeweils
umfassend:
- (a) eine Menge an Zellzyklussteuerungsagens,
wirksam um eine CDK zu inhibieren, wobei das Zellzyklussteuerungsagens
folgendes ist:
- (i) eine Verbindung mit der Formel I: wobei:
R1 eine
substituierte oder unsubstituierte Gruppe ist, ausgewählt aus:
Sulfonyl; und
R2 eine substituierte
oder unsubstituierte, carbozyklische oder heterozyklische, monozyklische
oder anellierte oder nicht-anellierte polyzyklische Ringstruktur
ist;
wobei jeder mögliche
Substituent für
R1 und R2 unabhängig voneinander
ein Halogen, Halogenalkyl, C1-6-Alkyl; C1-6-Alkenyl; C1-6-Alkinyl;
Hydroxyl; C1-6-Alkoxyl; Amino; Nitro; Thiol;
Thioether; Imin; Cyano; Amido; Phosphonato; Phosphin; Carboxyl;
Thiocarbonyl; Sulfonyl; Sulfonamid; Keton; Aldehyd oder Ester ist;
- (ii) ein pharmazeutisch akzeptables Salz einer Verbindung der
Formel I; oder
- (iii) ein Pro-pharmakon oder pharmazeutisch aktiver Metabolit
einer Verbindung der Formel I oder ein pharmazeutisch akzeptables
Salz davon; und
- (b) einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
-
In
einer anderen allgemeinen Ausführungsform
kann jeder mögliche
Substituent für
R1 und R2 unabhängig voneinander,
zusätzlich
zu den oben identifizierten Gruppen, aus den folgenden Gruppen gewählt werden:
Sauerstoff, carbozyklisches oder heterocyclisches, monozyklisches
oder anelliertes oder nicht-anelliertes polyzyklisches Cycloalkyl,
und carbozyklisches oder heterozyklisches, monozyklisches oder anelliertes
oder nicht-anelliertes polyzyklisches Aryl. Derartige Substituenten
können
gegebenenfalls weiter mit einem Substituenten, ausgewählt aus
solchen Gruppen, substituiert sein.
-
Andere
besonders bevorzugte R
1-Gruppen umfassen
Phenylgruppen, die Carbonyl- oder Sulfonamideinheiten substituiert
sind, wobei der Carbonylkohlenstoff und der Sulfonamidstickstoff
gegebenenfalls weiter substituiert sind. Die Folgenden sind Beispiele
für bevorzugte
R
1-Gruppen:
wobei
R
3 ausgewählt ist aus C
1-C
6-Alkyl, C
1-C
6-Alkoxy, Aryl, Aryloxy und Amin.
-
In
bevorzugten Ausführungsformen
ist R2 in der Formel I eine voluminöse Gruppe
wie ein substituierter oder unsubstituierter, carbozyklischer oder
heterozyklischer Monozyklus oder ein substituierter oder unsubstituierter
anellierter oder nicht-anellierter carbozyklischer oder heterozyklischer
Polyzyklus. Mehr bevorzugt ist R2 ein substituierter
(carbo- oder poly)-(Monozyklus oder Polyzyklus); noch mehr bevorzugt
ist R2 solch eine zyklische Ringstruktur,
die einen Substituenten an der Position benachbart oder vicinal
zum Verknüpfungspunkt
(zur Kernstruktur) trägt.
-
Zum
Beispiel umfassen bevorzugte Spezies für R2 eine
ortho-substituierte aromatische Ringstruktur wie ein o-substituiertes
Phenyl oder Thienyl, oder eine 1,2-substituierte Cycloalkyl- oder
Cycloalkenylringstruktur wie ein 2-substituiertes Cyclopent-1-enyl.
Insbesondere bevorzugte Beispiele für die R2-Einheit
umfassen substituiertes oder unsubstituiertes: o-Halogenphenyl (z.
B. o-Fluorphenyl, o-Chlorphenyl, o-Iodphenyl, oder o-Bromphenyl),
o-Nitrophenyl, o-Aminophenyl,
o-C1-6-Alkylphenyl, o-C1-6-Alkoxyphenyl
(z. B. o-Methoxyphenyl oder o-Ethoxyphenyl),
o-C1-6-Alkoxybenzothiophenyl, o-Methylthiophenyl,
Benzonitril und Carboxybenzyl. Insbesondere bevorzugte Beispiele
für die
R2-Einheit umfassen auch orthodisubstituierte
Aryle, zum Beispiel, 2,6-Dihalogenphenyl (z. B. 2,6-Difluorphenyl)
und 2-Halogen-6-trifluormethylphenyl
(z. B., 2-Fluor-6-trifluormethylphenyl). Verbindungen mit der Formel
I, in welchen R2 eine 1,2-substituierte
zyklische Ringstruktur ist, die gegebenenfalls einen oder mehrere
zusätzliche
Substituenten hat, wie ein ortho-substituiertes Aryl mit einem anderen
Substituenten in para-Position, erwiesen sich überraschenderweise als wirksame
CDK-Inhibitoren.
-
Besonders
bevorzugte Beispiele von Verbindungen mit der Formel I umfassen:
-
Erfindungsgemäße pharmazeutische
Zusammensetzungen können,
alternativ oder zusätzlich
zu einer Verbindung mit der Formel I, als einen aktiven Bestandteil
ein pharmazeutisch akzeptables Salz einer Verbindung mit der Formel
I oder ein Propharmakon bzw. Prodrug oder einen pharmazeutisch aktiven
Metaboliten einer derartigen Verbindung oder eines derartigen Salzes
umfassen. Derartige Verbindungen, Salze, Prodrugs und Metaboliten
werden hier manchmal kollektiv als „Zellzyklussteuerungsagenzien" bezeichnet.
-
Zusammensetzungen
in Übereinstimmung
mit der Erfindung inhibieren die Kinaseaktivität von CDK/Zyklin-Komplexen
wie solchen, die in der G0- oder G1-Phase des Zellzyklus aktiv sind,
z. B. CDK2-, CDK4- und/oder CDK6-Komplexe. Bevorzugte Zusammensetzungen
der Erfindung enthalten Zellzyklussteuerungsagenzien mit einer Inhibierungskonstante
gegenüber
CDK4 oder einem CDK4/Zyklin D-Komplex von etwa 1 μM oder weniger,
mehr bevorzugt von etwa 500 nM oder weniger, noch mehr bevorzugt
von etwa 200 nM oder weniger und am meisten bevorzugt von etwa 100
nM oder weniger. Besonders bevorzugte erfindungsgemäße Verbindungen
umfassen solche, die eine CDK4/Zyklin D3-Inhibierungskonstante (K;
CDK4/D3) von etwa 100 nM oder weniger aufweisen. Andere bevorzugte
erfindungsgemäße Zusammensetzungen
enthalten Zellzyklussteuerungsagenzien mit einer Inhibierungskonstante
gegenüber
CDK2 oder einem CDK2/Zyklin E-Komplex von etwa 1 μM oder weniger,
mehr bevorzugt von etwa 500 nM oder weniger, noch mehr bevorzugt von
etwa 200 nM oder weniger und am meisten bevorzugt von etwa 100 nM
oder weniger.
-
Bestimmte
Verbindungen mit der Formel I können
in verschiedenen stereoisomeren oder tautomeren Formen vorliegen.
Die vorliegende Erfindung umfasst all solche CDK-inhibierenden Verbindungen,
einschließlich
aktiver Verbindungen in Form von im Wesentlichen reinen Enantiomeren,
racemischen Mischungen und Tautomeren.
-
Der
Begriff „pharmazeutisch
akzeptabel" bedeutet
pharmazeutisch akzeptabel und im Wesentlichen nicht-toxisch für das Subjekt,
welchem das Zellzyklussteuerungsagens verabreicht wird.
-
Pharmazeutisch
akzeptable Salze umfassen herkömmliche
Säure-Additionssalze
oder Basen-Additionssalze,
die aus geeigneten nicht-toxischen organischen oder anorganischen
Säuren
oder anorganischen Basen gebildet werden. Beispiele für Säure-Additionssalze
umfassen solche, die von anorganischen Säuren stammen, wie Salzsäure, Bromsäure, Iodsäure, Schwefelsäure, Sulfaminsäure, Phosphorsäure und
Salpetersäure,
und solche, die von organischen Säuren stammen, wie p-Toluolsulfonsäure, Methansulfonsäure, Ethan-disulfonsäure, Isethionsäure, Oxalsäure, p-Bromphenylsulfonsäure, Kohlensäure, Bernsteinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, 2-Acetoxybenzoesäure, Essigsäure, Phenylessigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Stearinsäure, Milchsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Ascorbinsäure, Maleinsäure, Hydroxymaleinsäure, Gluta minsäure, Salicylsäure, Sulfanilsäure und
Fumarsäure.
Beispiele für
Basen-Additionssalze umfassen solche, die von Ammoniumhydroxiden
(z. B. einem quartären
Ammoniumhydroxid wie Tetramethylammoniumhydroxid) stammen, solche,
die von anorganischen Basen stammen wie Alkali- oder Erdalkalimetall-
(z. B. Natrium-, Kalium-, Lithium-, Calcium- oder Magnesium-) Hydroxiden,
und solchen, die von organischen Basen wie Carbonaten, Bicarbonaten,
Aminen, Benzylaminen, Piperidinen und Pyrrolidinen abstammen.
-
Der
Begriff „Prodrug" bzw. "Propharmakon" bezieht sich auf
einen metabolischen Vorläufer
einer Verbindung mit der Formel I (oder einem Salz davon), der pharmazeutisch
akzeptabel ist. Ein Prodrug kann, wenn es einem Patienten verabreicht
wird, inaktiv sein, wird aber in vivo in eine aktive Verbindung
mit der Formel I umgewandelt. Der Begriff „aktiver Metabolit" bezieht sich auf
ein metabolisches Produkt einer Verbindung mit der Formel I, welches
pharmazeutisch akzeptabel und wirksam ist. Prodrugs und aktive Metabolite
von Verbindungen mit der Formel I können unter Verwendung von auf
dem Fachgebiet wohlbekannten Techniken bestimmt werden.
-
Erfindungsgemäße Zellzyklussteuerungsagenzien
sind nützlich
als Pharmazeutika für
die Behandlung von proliferativen Störungen bei Säugern, insbesondere
bei Menschen, die durch eine unerwünschte Proliferation von endogenem
Gewebe gekennzeichnet sind. Verbindungen mit der Formel I können für die Behandlung
von Patienten verwendet werden, die eine Störung haben, die mit einer übermäßigen Zellproliferation
verbunden sind, wie z. B. Krebsarten, Psoriasis, immunologische
Störungen,
welche unerwünschte
Proliferation von Leukozyten beinhalten, und Restenose und andere
Störungen
der glatten Muskulatur. Weiterhin können derartige Verbindungen
verwendet werden, um die Entdifferenzierung von postmitotischem
Gewebe und/oder Zellen zu verhindern.
-
Erfindungsgemäße pharmazeutische
Zusammensetzungen oder Präparate
umfassen einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und eine wirksame Menge
von mindestens einem Zellzyklussteuerungsagens. Der Begriff „wirksame
Menge" bedeutet
eine Menge, welche die Proliferation signifikant inhibiert und/oder
Entdifferenzierung einer eukaryotischen Zelle, z. B. bei einer Säugetier-,
einer Insekten-, einer Pflanzen- oder Pilzzelle, verhindert und
für den
indizierten Nutzen, z. B. für
eine spezifische therapeutische Behandlung, wirksam ist.
-
Die
spezifische Dosierungsmenge eines Zellzyklussteuerungsagens, das
verabreicht wird, um therapeutische oder inhibitorische Wirkungen
zu erzielen, kann selbstverständlich
auf eine im Fachgebiet bekannte Weise bestimmt werden, gemäß den speziellen,
dem Fall zugehörigen
Umständen,
einschließlich,
z. B. dem verabreichten spezifischen Mittel, dem Verabreichungsweg,
dem behandelten Zustand und dem behandelten Subjekt oder Wirt. Eine
beispielhafte Gesamttagesdosis eines Zellzyklussteuerungsagens,
welche in einer einzigen oder in einer Vielzahl von Dosen verabreicht
werden kann, enthält
einen Dosierungsspiegel von etwa 0,01 mg/kg Körpergewicht bis etwa 50 mg/kg
Körpergewicht.
-
Das
erfindungsgemäße Zellzyklussteuerungsagens
kann über
eine Vielzahl von geeigneten Wegen verabreicht werden, wie oral,
rektal, transdermal, subkutan, intravenös, intramuskulär oder intranasal.
Die Zellzyklussteuerungsagenzien werden vorzugsweise vor ihrer Verabreichung
in Zusammensetzungen formuliert, die für die gewünschten Wege geeignet sind.
-
Eine
erfindungsgemäße pharmazeutische
Zusammensetzung oder ein Präparat
umfasst eine wirksame Menge an Zellzyklussteuerungsagens und einen
pharmazeutisch akzeptablen Träger
wie ein Verdünnungsmittel
oder einen Hilfsstoff für
das Mittel. Wenn der Träger
als ein Verdünnungsmittel
fungiert, kann er ein festes, halbfestes oder flüssiges Material sein, welches
sich als ein Vehikel, ein Hilfsmittel oder ein Medium für den aktiven
Bestandteil/die aktiven Bestandteile verhält. Erfindungsgemäße Zusammensetzungen
können hergestellt
werden durch Zusammenmischen des aktiven Bestandteils/der aktiven
Bestandteile mit einem Träger
oder durch Verdünnen
desselben mit einem Träger,
oder durch Einschließen
oder Verkapseln desselben in einem Träger, welcher zu einer Kapsel,
einem Sachet, einem Papierkontainer oder dergleichen geformt werden
kann. Beispielhafte Bestandteile zusätzlich zu einem oder mehreren
Zellzyklussteuerungsagenzien und anderen aktiven Bestandteilen umfassen
Avicel (mikrokristalline Cellulose), Stärke, Lactose, Calciumsulfatdihydrat,
Kaolin, Saccharose, Talkum, Gelatine, Agar, Pektin, Gummi arabicum,
Magnesiumstearat, Stearinsäure,
Erdnussöl,
Olivenöl,
Glycerolmonostearat, Tween 80 (Polysorbat 80), 1,3-Butandiol, Kakaobutter,
Bienenwachs, Polyethylenglykol, Propylenglykol, Sorbitanmonostearat,
Polysorbat 60, 2-Octyldodecanol, Benzylalkohol, Glycin, Sorbinsäure, Kaliumsorbat,
Dinatriumhydrogenphosphat, Natriumchlorid und Wasser.
-
Die
Zusammensetzungen können
in jeder einer Vielzahl von Formen hergestellt werden, die für die gewünschte Art
der Verabreichung geeignet sind. Zum Beispiel können pharmazeutische Zusammensetzungen
in Form von Tabletten, Pillen, Pulvern, Pastillen, Sachets, Cachets,
Elixieren, Suspensionen, Emulsionen, Lösungen, Sirups, Aerosolen (als
Feststoffe oder in flüssigem
Medium), Salben (z. b. enthaltend bis zu 10 Gew.-% an Zellzyklussteuerungsagens),
Softgel- und Hartgel-Kapseln,
Suppositorien, sterilen injizierbaren Lösungen, steril verpackten Pulvern
und dergleichen, hergestellt werden.
-
Eine
erfindungsgemäße pharmazeutische
Zusammensetzung umfasst ein Zellzyklussteuerungsagens und, gegebenenfalls,
einen oder mehrere andere aktive Bestandteile wie bekannte antiproliferative
Mittel, die mit dem Zellzyklussteuerungsagens verträglich und
für die
zu behandelnde Indikation geeignet sind. In einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst eine erfindungsgemäße pharmazeutische
Zusammensetzung eine wirksame Menge an Zellzyklussteuerungsagens
der Formel I als aktiven Bestandteil.
-
Verbindungen
in Übereinstimmung
mit der Erfindung können
auf solche Weisen hergestellt werden, analog zu denen, die unten
besonders beschrieben werden, wobei die mit Buchstabenpräfixen versehenen Beispiele
(d.h., A, B, C, D, E, F, G, H, J, K, L, M und N) die allgemeinen
Syntheseschemata bezeichnen.
-
Beispiele
-
Beispiel
C(33): 4-[4-Amino-5-(2,4-dimethoxybenzoyl)-thiazol-2-ylamino]-benzolsulfonamid
-
Die
Titelverbindung wurde im Wesentlichen wie in Beispiel C(1) beschrieben
hergestellt. 4-Isothiocyanatobenzolsulfonamid
und 2-Brom-2',4'-dimethoxyacetophenon
lieferten 75 % Ausbeute eines gelben Pulvers; Smp. 249–250°C.
- 1H-NMR (DMSO-d6): δ 10,93 (1H,
bs), 7,93 (2H, bs), 7,75 (4H, bs), 7,25 (2H, bs), 7,21 (1H, d, J
= 8,1 Hz), 6,61 (1H, d, J = 1,9 Hz), 6,55 (1H, dd, J = 8,1, 1,9
Hz), 3,79 (3H, s), 3,76 (3H, s).
- FABMS (MH+): 435.
- Anal. ber. für
C18H18N4O5S2: C, 49,76; H,
4,18; N, 12,89; S, 14,76. Gef.: C, 49,66; H, 4,15; N, 12,77; S,
14,86.
-
Beispiel
C(34): 4-[4-Amino-2-(4-sulfamoylphenylamino)-thiazol-5-carbonyl]-benzoesäureethylester
-
Die
Titelverbindung wurde wie im Wesentlichen in Beispiel C(1) beschrieben
hergestellt. 4-Isothiocyanatobenzolsulfonamid
und 4-Bromacetylbenzoesäureethylester
lieferten 95 % Ausbeute eines gelben Pulvers; Smp. 225–227°C.
- 1H-NMR (DMSO-d6): δ 11,16 (1H,
s), 8,32 (2H, bs), 8,04 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,80 (2H, d, J = 8,4
Hz), 7,78 (4H, bs), 7,26 (2H, bs), 4,33 (2H, q, J = 7,2 Hz), 1,33
(3H, t, J = 7,2 Hz).
- FABMS (MH+): 447.
- Anal. ber. für
C19H18N4O5S2·0,4 H2O: C, 50,30; H, 4,18; N, 12,38; S, 14,13.
Gef.: C, 50,11; H, 3,97; N, 12,26; S, 14,14.
-
Beispiel
C(35): 4-[4-Amino-5-(2,4-dimethylbenzoyl)-thiazol-2-ylamino]-benzolsulfonamid
-
Die
Titelverbindung wurde im Wesentlichen wie in Beispiel C(1) beschrieben
hergestellt. 4-Isothiocyanatobenzolsulfonamid
und 2-Brom-2',4'-dimethylacetophenon
lieferten einen gelben Feststoff in 75 % Ausbeute; Smp. 242–244°C.
- 1H-NMR (DMSO-d6): δ 10,97 (1H,
bs), 8,00 (2H, bs), 7,76 (2H, d, J = 9,7 Hz), 7,72 (2H, d, J = 9,7
Hz), 7,24 (2H, bs), 7,22 (1H, d, J = 7,5 Hz), 7,07 (1H, s), 7,03
(1H, d, J = 7,5 Hz), 2,29 (3H, s), 2,23 (3H, s).
- FABMS (MH+): 403.
- Anal. ber. für
C18H18N4O3S2 : C, 53,71; H,
4,51; N, 13,92; S, 15,93. Gef.: C, 53,47; H, 4,54; N, 13,69; S,
15,83.
-
Beispiel
C(38): 4-[4-Amino-5-(2,6-dichlor-4-trifluormethylbenzoyl)-thiazol-2-ylamino]-benzolsulfonamid
-
Die
Titelverbindung wurde im Wesentlichen wie in Beispiel C(1) beschrieben
hergestellt. 4-Isothiocyanatobenzolsulfonamid
und 2-Brom-2',6-dichlor-4-(trifluormethyl)-acetophenon
lieferten nach Umkristallisieren aus EtOH/H2O
und Trocken über
ein Benzolazeotrop einen gelben Feststoff in 46 % Ausbeute; Smp. 294–296°C.
- 1H-NMR (DMSO-d6): δ 8,10 (1H,
s), 8,05 (2H, s) 7,77 (4H, dd, J = 9,0, 14,0 Hz). HRFABMS: ber.
für C7H12Cl2F3N4O3S2 (MH+): 510,9680.
Gef.: 510,9697.
- Anal. ber. für
C17H11Cl2F3N4O3S2·0,1 H2O·C6H6: C, 40,28; H,
2,51; N, 10,30; S, 11,97; C1, 13,51. Gef.: C, 40,58; H, 2,28; N,
10,75; S, 12,31; C1, 13,61.
-
Beispiel
C(39): 4-[4-Amino-2-(4-sulfamoylphenylamino)-thiazol-5-carbonyl]-phenylbenzoat
-
Die
Titelverbindung wurde auf analoge Weise wie der in Beispiel C(1)
beschriebenen hergestellt. 4-Isothiocyanatobenzolsulfonamid und
Benzoesäure-(4-Bromacetyl)-phenylester
lieferten einen gelben Feststoff in 77 % Ausbeute; Smp. > 300°C.
- 1H-NMR (DMSO-d6): δ 11,13 (1H,
s), 8,26 (2H, bs), 8,15 (2H, dd, J = 7,2, 1,6 Hz), 7,83–7,73 (7H,
m), 7,66–7,59 (2H,
m), 7,41 (2H, d, J = 6,9 Hz), 7,27 (2H, s).
- HRFABMS (MH+): ber.: 495,0797. Gef.:
495,0812.
- Anal. ber. für
C23H18N4O5S·0,2
H2O: C, 55,45; H, 3,72; N, 11,25; S, 12,87.
Gef.: C, 55,34; H, 3,592; N, 11,01; S, 12,88.
-
Beispiel
C(47): 4-[4-Amino-5-(4-methylthiazol-5-carbonyl)-thiazol-2-ylamino]-benzolsulfonamid
-
5-Bromacetyl-4-methylthiazol,
welches die Strukturformel
hat, wurde herestellt, wie
bei Sych et al., J. Gen. Chem. USSR, Vol. 32 (1962), 970–975 beschrieben.
Brom (0,75 ml, 7,77 mmol) wurde tropfenweise zu einer Lösung aus
1-(4-Methylthiazol-5-yl)-ethanon (2,05 g, 14,5 mmol; Ganapathi et
al., Proc. Indian Acad. ScL Sect. A, vol. 22 (1945), 362–378) in
HOAc (3 ml) gegeben. Die Mischung wurde 1,5 Stunden bei 85°C gerührt und
verwandelte sich in einen gelben Kuchen. Es wurde HOAc (3 ml) zugegeben
und nach 1,5 Stunden ließ man
abkühlen.
Das HOAc wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand mit CH
2Cl
2 und gesätt.
wäss. NaHCO
3 ausgeschüttelt. Die organische Schicht
wurde mit Kochsalzlösung
gewaschen, über
Na
2SO
4 getrocknet
und eingedampft, um einen schwarzen Feststoff zu ergeben, 1,3 g
(41 % Ausbeute), welcher ohne weitere Reinigung verwendet wurde.
- 1H-NMR (CDCl3): δ 8,85 (1H,
s), 4,28 (2H, s), 2,81 (3H, s).
-
Die
Titelverbindung wurde auf analoge Weise wie der in Beispiel C(1)
beschriebenen hergestellt. 4-Isothiocyanatobenzolsulfonamid und
5-Bromacetyl-4-methylthiazol lieferten einen braunen Feststoff in
31 % Ausbeute; Smp. 265–266°C.
- 1H-NMR (DMSO-d6): δ 11,18 (1H,
s), 9,08 (1H, s), 8,30 (2H, bs), 7,78 (4H, bs), 7,72 (2H, bs), 2,55
(3H, s).
- Anal. ber. für
C16H13N5O3S3: C, 42,52; H,
3,31; N, 17,11; S, 24,32. Gef.: C, 42,28; H, 3,33; N, 17,15; S,
24,52.
-
Beispiel
C(48): 4-[4-Amino-5-(3-methylthiophen-2-carbonyl)-thiazol-2-ylamino]-benzolsulfonamid
-
Die
Titelverbindung wurde auf analoge Weise wie der in Beispiel C(1)
beschriebenen hergestellt. 4-Isothiocyanatobenzolsulfonamid und
2-Bromacetyl-3-methylthiophen (aus Beispiel C(19)) lieferten einen gelben
Feststoff in 69 % Ausbeute; Smp. 284,5–286,0°C.
- 1H-NMR
(DMSO-d6): δ 11,11 (1H, s), 8,20 (2H, bs),
7,80 (2H, d, J = 10,7 Hz), 7,76 (2H, d, J = 10,7 Hz), 7,61 (1H,
d, J = 5,0 Hz), 7,26 (2H, s), 6,90 (1H, d, J = 5,0 Hz), 2,38 (3H,
s).
- Anal. ber. für
C15H14N4O3S3 : C, 45,67; H,
3,58; N, 14,20; S, 24,39. Gef.: C, 45,52; H, 3,58; N, 14,04; S,
24,36.
-
Beispiel
C(49): 4-[4-Amino-5-(3-methylbenzo[b]thiophen-2-carbonyl)-thiazol-2-yl-amino]-benzolsulfonamid
-
Die
Titelverbindung wurde auf analoge Weise wie der in Beispiel C(1)
beschriebenen hergestellt. 4-Isothiocyanatobenzolsulfonamid und
2-(2-Bromacetyl)-3-methylbenzo[b]thiophen lieferten ein gelbes Pulver in
73 % Ausbeute; Smp. 274,0–275,5°C.
-
- 1H-NMR (DMSO-d6): δ 11,17 (1H,
bs), 8,33 (2H, bs), 8,04–7,97
(1H, m), 7,90–7,84
(1H, m), 7,78 (4H, bs), 7,51–7,44
(2H, m), 7,27 (2H, s), 2,52 (3H, s).
- Anal. ber. für
C19H16NO3S3: C, 51,33; H,
3,63; N, 12,60; S, 21,64. Gef.: C, 51,19; H, 3,67; N, 12,31; S,
21,37.
-
Beispiel
C(50): 4-[4-Amino-5-(2,5-dimethylthiophen-3-carbonyl)-thiazol-2-ylamino]-benzolsulfonamid
-
3-Bromacetyl-2,5-dimethylthiophen,
welches die Strukturformel
hat, wurde auf eine analoge
Weise zu 2-Brom-2'-iodacetophenon
aus Beispiel C(12) hergestellt. 3-Acetyl-2,5-dimethylthiophen (6,83 g, 44,3 mmol)
ergab 10,1 g (98 % Ausbeute) eines gelben Öls, das ohne weitere Reinigung
verwendet wurde.
- 1H-NMR (CDCl3): δ 7,22
(1H, s), 4,64 (2H, s), 2,58 (3H, s), 2,36 (3H, s).
-
Die
Titelverbindung wurde auf analoge Weise wie der in Beispiel C(1)
beschriebenen hergestellt. 4-Isothiocyanatobenzolsulfonamid und
3-Bromacetyl-2,5-dimethylthiophen lieferten ein gelbes Pulver in
69 % Ausbeute; Smp. 263–5°C.
- 1H-NMR (DMSO-d6): δ 11,02 (1H,
s), 8,05 (2H, bs), 7,76 (4H, s), 7,25 (2H, s), 6,87 (1H, s), 2,43
(3H, s), 2,38 (3H, s).
- Anal. ber. für
C16H16N4O3S3: C, 47,04; H,
3,95; N, 13,71; S, 23,55. Gef.: C, 47,01; H, 3,92; N, 13,62; S,
23,47.
-
Beispiel
C(51): 4-[4-Amino-5-(2-oxo-1,2,3,4-tetrahydrochinolin-6-carbonyl)-thiazol-2-ylamino)-benzolsulfonamid
-
Die
Titelverbindung wurde im Wesentlichen wie in Beispiel C(1) beschrieben
hergestellt. 4-Isothiocyanatobenzolsulfonamid
und 6-(Bromacetyl)-2-oxo-1,2,3,4-tetrahydrochinolin ergaben einen
grau-gelben Feststoff in 48 % Ausbeute; Smp. 300–305°C (d).
- 1H-NMR
(DMSO-d6): δ 11,08 (1H, s), 10,32 (1H, s),
8,17 (2H, bs), 7,82–7,70
(4H, m), 7,58–7,45
(3H, m), 7,27 (1H, s), 6,90 (1H, d, J = 8,1 Hz), 2,93 (4H, t, J
= 7,7 Hz).
- IR (KBr): 3266, 3193, 3069, 1679, 1597, 1525, 1434, 1365, 1317,
1153 cm–1.
HRFABMS: ber. für
C19H18N5O4S2 (MH+):
444,0800. Gef.: 444,0816.
- Anal. ber. für
C19H17N5O4S2·0,6 MeOH:
C, 50,88; H, 4,23; N, 15,13; S, 13,86. Gef.: C, 51,02; H, 4,00;
N, 15,00; S, 13,60.
-
Beispiel
C(59): [4-Amino-2-(4-sulfamoylphenylamino)-thiazol-5-yl]-(3,5-dimethylpyridin-4-yl)-methanon
-
4-(Bromacetyl)-3,5-dimethylpyridin-hydrobromid,
das die Strukturformel
hat, wurde zunächst wie
folgt herstellt. 4-Acetyl-3,5-dimethylpyridin (500 mg, 3,36 mmol;
Kutney et al., Can. J. Chem., Vol. 41 (1963), 695–702) wurde
in 30 %iger HBr in Essigsäure
(1 ml) gelöst,
auf 70°C
erhitzt und mit einer Mischung aus Brom (0,17 ml, 3,36 mmol) in
30 %iger HBr in Essigsäure
(0,5 ml) behandelt. Nach 2 Stunden ließ man die Mischung auf Raumtemperatur
abkühlen
und es wurde Ether (8 ml) zugegeben. Der resultierende Niederschlag
wurde abfiltriert, mit Ether gewaschen (2x) und getrocknet, um 1,03
g (100 %) eines purpurfarbenen Feststoffs zu ergeben, Smp. 222–225°C, der ohne
weitere Reinigung verwendet wurde.
-
Die
Titelverbindung wurde im Wesentlichen wie in Beispiel C(1) beschrieben
hergestellt. 4-Isothiocyanatobenzolsulfonamid
und 4-(Bromacetyl)-3,5-dimethylpyridin-hydrobromid lieferten einen
gelbbraunen Feststoff, der mittels Säulenchromatographie mit 10
% MeOH/CHCl3 gereinigt und aus MeOH umkristallisiert
wurde, um 35 mg (51 %) eines amorphen gelben Feststoffs zu erhalten.
- 1H-NMR (DMSO-d6): δ 11,09 (1H,
s), 8,32 (2H, s), 8,18 (2H, bs), 7,74 (4H, dd, J = 11,5, 9,3 Hz),
7,27 (2H, s), 2,15 (6H, s).
- IR (KBr): 3378, 3342, 3260, 3160, 1625, 1594, 1560, 1518, 1443,
1342, 1160 cm–1.
HRFABMS: ber. für C17H18N5O3S2 (MH+):
404,0851. Gef.: 404,0840.
- Anal. ber. für
C17H17N5O3S2:·0,4 H2O·0,5
MeOH: C, 49,44; H, 4,56; N, 16,66; S, 15,26. Gef.: C, 49,13; H,
4,31; N, 16,61; S, 15,10.
-
Beispiel
C(65): 2S-[4-Amino-2-(4-sulfamoylphenylamino)-thiazol-5-carbonyl]-N-benzyloxycarbonyl-pyrrolidin
-
Die
Titelverbindung wurde im Wesentlichen wie in Beispiel C(1) beschrieben
hergestellt. 4-Isothiocyanatobenzolsulfonamid
und 2-S-Bromacetyl-N-benzyloxycarbonyl-pyrrolidin (siehe Beispiel
C(64)) lieferten einen Feststoff, der mittels Säulenchromatographie mit 5 %
MeOH/CHCl3 als Eluierungsmittel gereinigt
wurde, um einen gelben amorphen Feststoff zu ergeben, 140 mg (46
%), Smp. 150–160° (d).
- 1H-NMR (DMSO-d6): δ 11,05 (1H,
d, J = 10,0 Hz), 7,98 (2H, bd, J = 17,1 Hz), 7,79 (4H, dd, J = 12,1,
9,7 Hz), 7,41–7,11
(5H, m), 5,15–4,89
(2H, m), 4,32–4,21
(1H, bm), 3,51–3,40
(2H, bm), 2,35–2,13
(1H, bm), 1,93–1,75 (3H,
bm).
- IR (KBr): 3288, 1686, 1598, 1550, 1527, 1420, 1157 cm–1.
- HRFABMS: ber. für
C22H23N5O5S2Cs (M+Cs+: 634,0195. Gef.: 634,0215.
- Anal. ber. für
C22H23N5O5S2·0,3 H2O·0,1
CHCl3: C, 51,15; H, 4,60; N, 13,50; S, 12,36.
Gef.: C, 51,36; H, 4,63; N, 13,31; S, 12,47.
-
Beispiel
C(73): 4-[4-Amino-5-(3,5-dibromthiophen-2-carbonyl)-thiazol-2-ylamino]-benzolsulfonamid
-
Die
Titelverbindung wurde auf analoge Weise wie der in Beispiel C(1)
beschriebenen hergestellt. 4-Isothiocyanatobenzolsulfonamid und
2-Bromacetyl-3,5-dibromthiophen (aus Beispiel C(72)) ergaben ein gelbes
Pulver in 41 % Ausbeute; Smp. 254–255°C.
- 1H-NMR
(DMSO-d6): δ 11,24 (1H, s), 8,31 (2H, bs),
7,77 (4H, s), 7,40 (1H, s), 7,28 (2H, s).
- FABMS (MH+): 536/538/540.
- Anal. ber. für
C14H10N4O3S3Br3:
C, 31,24; H, 1,87; N, 10,41; S, 17,87; Br, 29,69. Gef.: C, 31,08;
H, 1,90; N, 10,16; S, 17,69; Br, 29,96.
-
Beispiel
C(76): 4-[4-Amino-5-(1,5-dimethyl-1H-imidazol-4-carbonyl)-thiazol-2-ylamino]-benzolsulfonamid
-
Die
Titelverbindung wurde auf analoge Weise wie der in Beispiel C(1)
beschriebenen hergestellt. 4-Isothiocyanatobenzolsulfonamid und
5-Bromacetyl-1,5-dimethyl-1H-imidazol (aus Beispiel C(74)) lieferten einen
gelben Feststoff in 8 % Ausbeute; Smp. 293–294°C.
- 1H-NMR
(DMSO-d6): δ 10,80 (1H, s), 7,81 (2H, d,
J = 9,0 Hz), 7,75 (2H, d, J = 9,0 Hz), 7,62 (1H, s), 7,24 (2H, s),
3,56 (3H, s), 2,52 (3H, s).
- HRFABMS (M + Na+): ber.: 415,0623. Gef.:
415,0609.
- Anal. ber. für
C15H16N6O3S2·1,0 CH3OH·1,0
CHCl3: C, 42,53; H, 4,45; N, 18,26; S, 13,93.
Gef.: C, 42,57; H, 4,41; N, 18,18; S, 14,07.
-
Beispiel
C(85): 4-[4-Amino-5-(2,6-difluorbenzoyl)-thiazol-2-ylamino]-benzolsulfonamid
-
Die
Titelverbindung wurde auf analoge Weise wie der in Beispiel C(1)
beschriebenen hergestellt. 4-Isothiocyanatobenzolsulfonamid und
2-Brom-2',6'-difluoracetophenon
(aus Beispiel C(79)) lieferten hellgelbe Kristalle in 69 % Ausbeute;
Smp. 258–260°C.
- 1H-NMR (DMSO-d6): δ 11,20 (1H,
s), 8,20 (2H, bs), 7,79 (2H, d, J = 9,0 Hz), 7,74 (2H, d, J = 9,0
Hz), 7,61–7,49 (1H,
m), 7,26 (2H, s), 7,22 (1H, d, J = 7,9 Hz), 7,19 (1H, d, J = 8,0
Hz).
- IR (KBr): 3310, 1622, 1599, 1547, 1525, 1467, 1425, 1410, 1318,
1156 cm–1.
- HRFABMS (MH+): ber.: 411,0397. Gef.:
411,0410.
- Anal. ber. für
C16H12N4O3S2F3·0,7 CH3OH: C, 46,34; H, 3,45; N, 12,94; S, 14,82.
Gef.: C, 46,19; H, 3,12; N, 12,83; S, 14,94.
-
Beispiel
C(92): 4-[4-Amino-5-(2,5-dichlorthiophen-3-carbonyl)-thiazol-2-ylamino]-benzolsulfonamid
-
3-Bromacetyl-2,5-dichlorthiophen,
welches die Strukturformel
hat, wurde auf eine analoge
Weise zu 2-Brom-2'-iodacetophenon,
siehe Beispiel C(12) hergestellt: 3-Acetyl-2,5-dichlorthiophen (2,0 g, 10,2 mmol)
lieferte 2,9 g (100 % Ausbeute) eines gelben Öls, welches ohne weitere Reinigung
verwendet wurde.
- 1H-NMR (CDCl3): δ 7,25
(1H, s), 4,40 (2H, s).
-
Die
Titelverbindung wurde auf analoge Weise wie der in Beispiel C(1)
beschriebenen hergestellt. 4-Isothiocyanatobenzolsulfonamid und
3-Bromacetyl-2,5-dichlorthiophen lieferten einen gelben Feststoff
in 65 % Ausbeute; Smp. 274–276°C.
- 1H-NMR (DMSO-d6): δ 11,20 (1H,
s), 8,24 (2H, bs), 7,80 (4H, s), 7,33 (1H, s), 7,31 (2H, s).
- FABMS (MH+): 449/451.
- Anal. ber. für
C14H10N4O3S3Cl2 :
C, 37,42; H, 2,24; N, 12,47; S, 21,41; C1, 15,78. Gef.: C, C, 37,56;
H, 2,19; N, 12,39; S, 21,29, C1, 15,71.
-
Beispiel
C(95): 4-[4-Amino-5-(3-methyl-5-nitrothiophen-2-carbonyl)-thiazol-2-ylamino]-benzolsulfonamid
-
Die
Titelverbindung wurde auf analoge Weise wie der in Beispiel C(1)
beschriebenen hergestellt. 4-Isothiocyanatobenzolsulfonamid und
2-Bromacetyl-3-methyl-5-nitrothiophen (aus Beispiel C(78)) lieferten einen
dunkelbraunen Feststoff in 38 % Ausbeute; Smp.. 268–269°C.
- 1H-NMR (DMSO-d6): δ 11,31 (1H,
s), 8,46 (2H, bs), 8,08 (1H, s), 7,81 (4H, s), 7,32 (2H, s), 2,38
(3H, s).
- Anal. ber. für
C15H13N5O5S3: C, 40,99; H,
2,98; N, 15,94; S, 21,89. Gef.: C, 41,11; H, H, 2,95; N, 15,66;
S, 21,70.
-
Beispiel
C(99): 4-[4-Amino-5-(2-fluor-6-trifluormethylbenzoyl)-thiazol-2-ylamino]-benzolsulfonamid
-
2-Brom-2'-fluor-6'-trifluormethylacetophenon,
welches die Strukturformel
hat, wurde auf eine analoge
Weise zu 2-Brom-2'-iodacetophenon,
siehe Beispiel C(12), hergestellt. 2'-Fluor-6'-trifluormethylacetophenon (745 mg,
3,61 mmol) lieferte 1,05 g eines gelben Öls, welches ohne weitere Reinigung
verwendet wurde.
- 1H-NMR (CDCl3): δ 7,69–7,52 (2H,
m), 7,44–7,35
(1H, m), 4,42 (3H, s).
-
Die
Titelverbindung wurde auf analoge Weise wie der in Beispiel C(1)
beschriebenen hergestellt. 4-Isothiocyanatobenzolsulfonamid und
rohes 2-Brom-2'-fluor-6'-trifluormethylacetophenon lieferten
einen hellgelben Feststoff in 21 % Ausbeute; Smp. 290–292°C.
- 1H-NMR (DMSO-d6): δ 11,15 (1H,
s), 8,20 (2H, bs), 7,83–7,68
(7H, m), 7,31 (2H, s).
- Anal. ber. für
C17H12N4O3S2F4:
C, 44,35; H, 2,63; N, 12,17; S, 13,93. Gef.: C, 44,42; H, 2,64;
N, 12,13; S, 13,94.
-
Beispiel
C(107): 4-[4-Amino-5-(2,4,6-trichlorbenzoyl)-thiazol-2-ylamino]-benzolsulfonamid
-
2,4,6-Trichloracetophenon,
das die Strukturformel
hat, wurde zunächst wie
folgt hergestellt. Adaptiert von einem Verfahren von Reynolds et
al. Org. Syn. Coll., Vol. IV 30 (1963), 708–710. Zu Mg-Spänen (283
mg, 11,3 mmol) und EtOH (0,25 ml) wurde CCl
4 (11 μL) gegeben.
Die daraus folgende Reaktion klang ab, bevor eine Lösung von
Malonsäurediethylester
(1,71 ml, 11,33 mmol) in EtOH (0,91 ml) in einer Geschwindigkeit,
um die Reaktion aufrecht zu erhalten, zugegeben wurde. Nach 30 min
wurde die Mischung auf Rückfluss
erhitzt, um eine Stunde lang Mg zu verbrauchen, dann ließ man abkühlen. Die
feste Masse wurde in Ether (25 ml) suspendiert und eine Lösung von
2,4,6-Trichlorbenzoylchlorid (2,50 g, 10,3 ml) in Ether (5 ml) wurde
vorsichtig zugegeben. Nach 3 Tagen, wurde eine Lösung aus H
2SO
4 (0,6 ml) in Wasser (10 ml) vorsichtig zugegeben,
um jeglichen Feststoff zu lösen,
und es wurde mit Ether extrahiert (2 × 10 ml). Die Extrakte wurden über MgSO
4 getrocknet und zu einem trüben Öl eingedampft,
das in HOAc (3 ml), H
2O (2 ml) und H
2SO
4 (0,33 ml) gegeben
und auf Rückfluss
erhitzt wurde. Nach 7,5 Stunden ließ man die Mischung über Nacht
abkühlen.
Die Mischung wurde mit 1N NaOH (35 ml) alkalisch gemacht und mit
Ether (3 × 10
ml) extrahiert. Die vereinigten etherischen Schichten wurden über MgSO
4 getrocknet und eingedampft, um 1,80 g (78
%) eines weißen
Feststoffs zu ergeben, welcher ohne weitere Reinigung verwendet wurde
(früher
beschrieben bei Baker et al., J. Chem. Soc. (1941), 796–802).
-
2-Brom-2',4',6'-trichloracetophenon,
welches die Strukturformel
hat, wurde auf eine analoge
Weise zu 2-Brom-2'-iodacetophenon,
siehe Beispiel C(12) hergestellt. Rohes 2',4',6'-Trichloracetophenon
erbrachte 1,27 g (94 %) goldfarbener Kristalle, welche ohne weitere
Reinigung verwendet wurden (früher
beschrieben bei Baker et al., J. Chem. Soc. (1941), 796–802).
- 1H-NMR: δ 7,42
(2H, s), 4,42 (s, 2H).
-
Die
Titelverbindung wurde wie im Wesentlichen in Beispiel C(1) beschrieben
hergestellt, außer
dass überschüssiges Kalium-tert.-butoxid
(2,2 Äquivalente)
eingesetzt wurden. 4-Isothiocyanatobenzolsulfonamid und
2-Brom-2',4',6'-trichloracetophenon
lieferten ein dunkelbraunes Gummi, das mittels Säulenchromatographie mit 10
% MeOH/CHCl3 gereinigt und aus MeOH/CHCl3 ausgefällt
wurde, um 96 mg (21 %) eines amorphen blass gelben Feststoffs zu
erhalten.
- 1H-NMR (CD3OD): δ 7,87 (4H,
dd, J = 14,6, 9,0 Hz), 7,60 (2H, s).
- IR (KBr): 3312, 1593, 1545, 1459, 1421, 1161 cm–1.
- ESIMS (MH+): 477/479/481. (M–):
475/477/479.
- Anal. ber. für
C16H11Cl3N4O3S2 : C, 40,22; H, 2,32; N, 11,73; Cl, 22,26;
S, 13,42. Gef.: C, 40,12; H, 2,34; N, 11,56; Cl, 22,41; S, 13,43.
-
Beispiel
C(108): 4-[4-Amino-5-(2,6-difluorbenzoyl)-thiazol-2-ylamino]-N-methylbenzolsulfonamid
-
4-Amino-N-methylbenzolsulfonamid,
das die Strukturformel
hat, wurde zunächst wie
folgt hergestellt. N-Methyl-4-nitrobenzolsulfonamid (2,58 g, 11,9
mmol; Khanna et al., J. Med. Chem., Vol. 40 (1997), 1619–1633) und
10 % Pd/C (250 mg) in MeOH (60 ml) wurden 2 Stunden unter einer
Wasserstoffatmosphäre
gerührt
und darin abfiltriert. Das Filtrat wurde im Vakuum eingeengt, um
2,17 g (98 % Ausbeute) farbloser kristalliner Flocken zu ergeben,
deren
1H-NMR-Spektrum dem in der Literatur
berichteten entsprach (Khanna et al., J. Med. Chem., vol. 40 (1997),
1619–1633)
und die ohne weitere Reinigung verwendet wurden.
-
4-Isothiocyanato-N-methylbenzolsulfonamid,
welches die Strukturformel
hat wurde auf eine analoge
Weise zu 4-Isothiocyanatobenzimid aus Beispiel C(102) hergestellt.
4-Amino-N-methylbenzolsulfonamid (2,17 g, 11,7 mmol) ergab 2,10
g (79 % Ausbeute) an einem weißen
flockigen Pulver, das ohne weitere Reinigung verwendet wurde.
- 1H-NMR (DMSO-d6): δ 7,83 (2H,
d, J = 8,4 Hz), 7,65 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,61 (1H, q, J = 4,9 Hz),
2,43 (3H, d, J = 4,9 Hz).
-
Die
Titelverbindung wurde auf analoge Weise wie der in Beispiel C(1)
beschriebenen hergestellt. 4-Isothiocyanato-N-methylbenzolsulfonamid
und 2-Brom-2',6'-difluoracetophenon
(aus Beispiel C(79)) lieferten ein Rohprodukt, das mit 10 %igem
i-PrOH/CHCl3 extrahiert und mittels Säulenchromatographie
mit 5 % MeOH/CHCl3 gereinigt wurde, um ein
amorphes gelbes Pulver in 41 % Ausbeute zu ergeben, das sich oberhalb
von 200°C
zersetzte.
- 1H-NMR (DMSO-d6): δ 11,23
(1H, s), 8,33 (2H, bs), 7,81 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,54 (2H, d, J
= 8,5 Hz), 7,63–7,41 (1H,
m), 7,39 (1H, q, J = 5,0 Hz), 7,23 (2H, t, J = 7,1 Hz), 2,41 (3H,
d, J = 5,0 25 Hz).
- HRFABMS (MH+): ber.: 425,0554. Gef.:
425,0566.
- Anal. ber. für
C17H14N4O3S2F2·0,5 CH3OH: C, 47,72; H, 3,66; N, 12,72; S, 14,56.
Gef.: C, 47,56; H, 3,52; N, 12,72; S, 14,77.
-
Beispiel
C(109): 4-[4-Amino-5-(2,6-difluorbenzoyl)-thiazol-2-ylamino]-N,N-dimethylbenzolsulfonamid
-
Als
nächstes
wurde 4-Amino-N,N-dimethylbenzolsulfonamid, das die Strukturformel
hat, wie folgt hergestellt.
Rohes N,N-Dimethyl-4-nitrobenzolsulfonamid (3,89 g, 16,9 mmol; Khanna
et al., J. Med. Chem., Vol. 40 (1997), 1619–1633), 10 % Pd/C (800 mg),
MeOH (80 ml) und THF (200 ml) wurden in einer Wasserstoffatmosphäre 6 Stunden
gerührt
und abfiltriert. Das Filtrat wurde im Vakuum eingeengt, um 3,68
g eines gelben Feststoffs zu ergeben, dessen
1H-NMR-Spektrum
dem in der Beschreibung bei Khanna et al., J. Med. Chem., vol. 40
(1997), 1619–1633
entsprach und der ohne weitere Reinigung verwendet wurde.
-
Als
nächstes
wurde 4-Isothiocyanato-N,N-dimethylbenzolsulfonamid, das die Strukturformel
hat, wie folgt herestellt.
Zu einer Lösung
von 4-Amino-N,N-dimethylbenzolsulfonamid
(2,0 g, 10 mmol) in Aceton (50 ml) wurden bei 5–10°C gleichzeitig eine Lösung von
Thiophosgen (0,91 ml, 12 mmol) in Aceton (20 ml) und 25 %iges wäss. Na
2CO
3 (10 ml) gegeben.
Nach 5 min bei 5–8°C ließ man die
Mischung warm werden und rührte
eine halbe Stunde bei Raumtemperatur. Das Lösungsmittel wurde abgedampft
und Wasser (70 ml) wurde zugegeben. Der resultierende hellgelbe
Niederschlag wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum
getrocknet, um 2,35 g (97 % Ausbeute) eines weißen Pulvers zu erbringen, welches
ohne weitere Reinigung verwendet wurde.
- 1H-NMR
(DMSO-d6): δ 7,82 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,69
(2H, d, J = 8,4 Hz), 2,63 (6H, s).
-
Die
Titelverbindung wurde auf analoge Weise wie der in Beispiel C(1)
beschriebenen hergestellt. 4-Isothiocyanato-N,N-dimethylbenzolsulfonamid
und 2-Brom-2',6'-difluoracetophenon
(aus Beispiel C(79)) lieferten einen rohen braunen Feststoff, der
aus EtOH umkristallisiert wurde, um hellbraune Kristalle in 52 %
Ausbeute, Smp. 240–242°C zu ergeben.
- 1H-NMR (DMSO-d6): δ 11,24 (1H,
s), 8,14 (2H, bs), 7,84 (2H, d, J = 8,8 Hz), 7,72 (2H, d, J = 8,8
Hz), 7,62–7,49 (1H,
m), 7,23 (1H, d, J = 7,9 Hz), 7,20 (1H, d, J = 8,0 Hz), 2,59 (6H,
s).
- Anal. ber. für
C18H16N4O3S2F2:
C, 49,31; H, 3,68; N, 12,78; S, 14,63. Gef.: C, 49,29; H, 3,71;
N, 12,68; S, 14,50.
-
Beispiel
C(114): 4-[4-Amino-5-(3-methylthiophen-2-carbonyl)-thiazol-2-ylamino]-N-methylbenzolsulfonamid
-
Die
Titelverbindung wurde auf analoge Weise wie der in Beispiel C(1)
beschriebenen hergestellt. 4-Isothiocyanato-N-methylbenzolsulfonamid
(aus Beispiel C(108)) und 2-Bromacetyl-3-methylthiophen (aus Beispiel C(19))
lieferten einen gelben Feststoff in 57 % Ausbeute; Smp.. 197,0–199,5°C.
-
- 1H-NMR (DMSO-d6): δ 11,19 (1H,
s), 8,24 (2H, bs), 7,86 (2H, d, J = 8,7 Hz), 7,75 (2H, d, J = 8,7
Hz), 7,65 (1H, d, J = 5,0 Hz), 7,36 (1H, q, J = 6,1 Hz), 7,03 (1H,
d, J = 5,0 Hz), 2,42 (3H, S), 2,41 (3H, d, J = 6,1 Hz).
- HRFABMS (MH+): ber.: 409,0463. Gef.:
409,0474.
- Anal. ber. für
C16H16N4O3S3·0,4 H2O: C, 46,23; H, 4,07; N, 13,48; S, 23,14.
Gef.: C, 46,28; H, 3,98; N, 13,38; S, 23,08.
-
Beispiel
C(115): 4-[4-Amino-5-(2,4,6-trifluorbenzoyl)-thiazol-2-yl-amino]-benzolsulfonamid
-
2-Chlor-2',4',6'-trifluoracetophenon
das die Strukturformel
hat, wurde zunächst wie
folgt hergestellt. Zu einer mechanisch gerührten Lösung aus 1,3,5-Trifluorbenzol
(5,17 ml, 50,0 mmol) in Dichlorethan (12,5 ml) wurde allmählich über einen
Zeitraum von 15 min vorsichtig AlCl
3 (13,4
g, 115 mmol) gegeben. Es wurde ein heftiges Brodeln und HCl-Gasentwicklung beobachtet.
Die Mischung wurde vorsichtig auf Rückfluss erhitzt und es wurde
tropfenweise über
einen Zeitraum von 45 min Chloracetylchlorid (6,20 g, 4,37 ml, 55,0
mmol) zugegeben. Nach 6 Stunden Erhitzen auf Rückfluss ließ man die Mischung über 12 Stunden
abkühlen,
goss sie dann vorsichtig auf Eis/Wasser, wusch mit 10 %iger wäss. HCl (2 × 30 ml),
1N wäss.
NaOH (3 × 30
ml) und Kochsalzlösung
(25 ml), trocknete über
MgSO
4 und dampfte ein, um 5,28 g (51 %)
eines gelben Feststoffs zu ergeben, der ohne weitere Reinigung verwendet
wurde. (Eine analytische Probe kristallisierte aus Ether/Hexan,
um gelbe Mikrokristalle zu ergeben, Smp. 43–45°C.)
- 1H-NMR
(CDCl3): δ 6,81
(2H, t, J = 8,4 Hz), 4,54 (2H, s).
- IR (KBr): 1721, 1637,1 616, 1447, 1201, 1128, 1045 cm–1.
- Anal. ber. für
C8H4ClF3O:
C, 46,07; H, 1,93; Cl, 17,00. Gef.: C, 45,92; H, 1,95; Cl, 16,97.
-
Die
Titelverbindung wurde wie im Wesentlichen in Beispiel C(1) beschrieben
hergestellt, außer
dass überschüssiges Kalium-tert.-butoxid
(2,2 Äquivalente)
eingesetzt wurden. 4-Isothiocyanatobenzolsulfonamid und
2-Chlor-2',4',6'-trifluoracetophenon
ergaben einen rotbraunen Feststoff, der mittels Säulenchromatographie
mit 5 % MeOH/CH2Cl2 als
Eluierungsmittel gereinigt wurde. Ausfällen mit einer Spur Hexan in
MeOH/CH2Cl2 ergab
70 mg (33%) eines gelben amorphen Pulver, dass sich oberhalb von
148°C zersetzte.
- 1H-NMR (CD3OD): δ 7,91 (1H,
s), 7,86 (4H, dd, J = 14,9, 6,9 Hz), 6,99 (2H, dd, J = 9,0, 7,5
Hz).
- IR (KBr): 3278, 1602, 1549, 1425, 1155 cm–1.
- HRFABMS: ber. für
C16H12F3N4O3S2 (MH+): 429,0303. Gef.: 429,0315.
- Anal. ber. für
C16H11F3N4O3S2·1,1 H2O: C, 42,87; H, 2,97; N, 12,50; S, 14,31.
Gef.: C, 42,98; H, 2,73; N, 12,12; S, 14,48.
-
Beispiel
C(116): {4-Amino-2-[4-(4-methylpiperazin-1-sulfonyl)-phenylamino]-thiazol-5-yl}-(2,6-difluorphenyl)-methanon
-
1-Methyl-4-(4-nitrobenzolsulfonyl)-piperazin,
welches die Strukturformel
hat, wurde auf eine analoge
Weise wie der für
N-Methyl-4-nitrobenzolsulfonamid
für Beispiel
C(108) (Khanna et al., J. Med. Chem., Vol. 40 (1997), 1619–1633) verwendeten
hergestellt. 4-Nitrobenzolsulfonylchlorid und 1-Methylpiperazin
ergaben 5,1 g (88 % Ausbeute) eines gelben Feststoffs, der ohne
weitere Reinigung verwendet wurde.
-
4-(4-Methylpiperazin-1-sulfonyl)-anilin,
welches die Strukturformel
hat, wurde auf eine analoge
Weise zu N-Methyl-4-aminobenzolsulfonamid
aus Beispiel C(108) hergestellt. 1-Methyl-4-(4-nitrobenzolsulfonyl)-piperazin ergab einen
grauen Feststoff in 99 % Ausbeute, der im nächsten Schritt ohne weitere
Reinigung verwendet wurde.
- 1H-NMR
(DMSO-d6): δ 7,37 (2H, d, J = 8,8 Hz), 6,67
(2H, d, J = 8,8 Hz), 6,16 (2H, bs), 3,30 (4H, bs), 3,03 (4H, bs),
2,58 (3H, s).
-
1-(4-Isothiocyanatobenzolsulfonyl)-4-methylpiperazin,
welches die Strukturformel
hat, wurde auf eine analoge
Weise zu 4-Isothiocyanatobenzamid
aus Beispiel C(102) hergestellt. 4-(4-Methylpiperazin-1-sulfonyl)-anilin
ergab 1,1 g (94 % Ausbeute) weißer
Kristalle, welche ohne weitere Reinigung verwendet wurden.
- 1H-NMR (CDCl3): δ 7,74 (2H,
d, J = 8,6 Hz), 7,35 (2H, d, J = 8,6 Hz), 3,27 (4H, bs), 2,77 (4H,
bs), 2,47 (3H, s).
-
Die
Titelverbindung wurde auf analoge Weise wie der in Beispiel C(1)
beschriebenen hergestellt. 1-(4-Isothiocyanatobenzolsulfonyl)-4-methylpiperazin
und 2-Brom-2',6'-difluoracetophenon (aus Beispiel C(79)
lieferten einen gelben Feststoff in 69 % Ausbeute; Smp. 172–174°C.
- 1H-NMR (DMSO-d6): δ 11,23 (1H,
bs), 8,21 (2H, bs), 7,84 (2H, d, J = 8,8 Hz), 7,69 (2H, d, J = 8,8
Hz), 7,62–7,49 (1H,
m), 7,22 (1H, d, J = 7,8 Hz), 7,19 (1H, d, J = 8,1 Hz), 2,87 (4H,
t, J = 4,5 Hz), 2,35 (4H, t, J = 4,5 Hz), 2,13 (3H, s).
- HRFABMS (MH+): ber.: 494,1132. Gef.:
494,1120.
- Anal. ber. für
C21H21N5O3S2F2·0,1 H2O·0,5
CH3OH: C, 50,50; H, 4,57; N, 13,70; S, 12,54.
Gef.: C, 50,34; H, 4,39; N, 13,51; S, 12,63.
-
Beispiel
D(5): 4-[4-Amino-5-(3-amino-5-aminothiophen-2-carbonyl)-thiazol-2-ylamino]-benzolsulfonamid
-
Die
Titelverbindung wurde auf analoge Weise wie der in Beispiel D(1)
beschriebenen hergestellt. Die Titelverbindung aus Beispiel C(95)
wurde hydriert und aus EtOH umkristallisiert, um ein braunes Pulver
in 96 % Ausbeute zu liefern, Smp. 268–271°C.
- 1H-NMR
(DMSO-d6): δ 10,97 (1H, s), 7,91 (2H, s),
7,82 (2H, d, J = 9,1 Hz), 7,78 (2H, d, J = 9,1 Hz), 7,28 (2H, s),
6,43 (2H, s), 5,81 (1H, s), 2,34 (3H, s).
- FABMS (MH+): 410.
- Anal. ber. für
C15H15N5O3S3.·0,1 H2O·0,3
EtOH: C, 44,07; H, 4,03; N, 16,47; S, 22,63. Gef.: C, 44,23; H,
3,93; N, 16,07; S, 23,01.
-
Beispiel
E(2): 4-[4-Amino-2-(4-sulfamoylphenylamino)-thiazol-5-carbonyl]-benzoesäure
-
Zu
einer Lösung
aus 4-[4-Amino-2-(4-sulfamoylphenylamino)-thiazol-5-carbonylbenzoesäureethylester
(500 mg, 1,12 mmol; Beispiel C(34)) in MeOH (10 ml) wurde 1N wäss. NaOH
(3,4 ml, 3,4 mmol) gegeben. Nach 4 Stunden wurde die resultierende
Mischung mit 1N wäss
HCl auf einen pH-Wert von 3 angesäuert und abfiltriert. Der isolierte
braune Feststoff kristallisierte in EtOH, um 330 mg (70 % Ausbeute)
hellbrauner Kristalle zu liefern, Smp. 298,5–300°C.
- 1H-NMR
(DMSO-d6): δ 13,15 (1H, s), 11,14 (1H, s),
8,31 (2H, bs), 8,02 (2H, d, J = 8,1 Hz), 7,78 (4H, s), 7,77 (2H,
d, J = 8,1 Hz), 7,26 (2H, s).
- HRFABMS (M + Na+): ber.: 441,0303. Gef.:
441,0320.
- Anal. ber. für
C17H14N4O5S2·0,4 H2O: C, 47,97; H, 3,50; N, 13,16; S, 15,07.
Gef.: C, 48,04; H, 3,48; N, 12,98; S, 15,18.
-
Beispiel
J(4): 4-[4-Amino-5-(2,6-difluorbenzoyl)-thiazol-2-ylamino]-N-piperidin-4-ylmethylbenzolsulfonamid
-
N-tert.-Butoxycarbonyl-4-carbamoylpiperidin,
das die Strukturformel
hat, wurde wie folgt hergestellt.
Zu Isonipecotinsäureamid
(5,00 g, 39,0 mmol) in Dioxan (100 ml) wurden Di-tert.-butyldicarbonat
(8,51 g, 39,0 mmol) und N,N-Diisopropylethylamin (6,0 ml, 42,9 mmol)
gegeben. Die Mischung wurde über
Nacht gerührt
und dann unter vermindertem Druck bis zur Trockene eingedampft.
Der Rückstand
wurde mit CHCl
3 und 1N HCl ausgeschüttelt. Die
organische Schicht wurde mit Wasser und Kochsalzlösung gewaschen, über Na
2SO
4 getrocknet und
eingedampft, um 8,3 g (93 % Ausbeute) eines weißen Feststoffs zu ergeben,
welcher ohne weitere Reinigung verwendet wurde.
- 1H-NMR (CDCl3): δ 5,53 (2H,
bs), 4,03 (2H, d, J = 13,7 Hz), 2,33 (2H, tt, J = 11,8, 3,7 Hz),
2,08 10 (2H, bs), 1,89 (2H, dd, J = 13,7, 3,7 Hz), 1,69 (1H, dd,
J = 11,8, 4,4 Hz), 1,65–1,57
(1H, m), 1,44 (9H, s).
-
4-Aminomethyl-N-tert.-butoxycarbonylpiperidin,
das die Strukturformel
hat, wurde wie folgt hergestellt.
Zu N-tert.-Butoxycarbonyl-4-carbamoylpiperidin
(15,6 mmol) in THF (40 ml) wurde bei –78°C unter Argon LiAlH
4 (592
mg, 15,6 mmol) gegeben. Man ließ die
Mischung langsam auf Raumtemperatur kommen und nach einer Stunde
wurde sie wieder auf –78°C abgekühlt, mit
Ethylacetat gequenched und mit EtOAc und 2N NaOH ausgeschüttelt. Die
organische Schicht wurde abgetrennt, über K
2CO
3 getrocknet und eingeengt, um 1,98 g (59
% Ausbeute) einer gelben Aufschlämmung
zu ergeben, welche ohne weitere Reinigung verwendet wurde.
-
N-tert.-Butoxycarbonyl-4-[(4-nitrobenzolsulfonylamino)-methyl]-piperidin,
das die Strukturformel
hat, wurde zunächst wie
folgt hergestellt. 4- Nitrobenzolsulfonylchlorid
(2,05 g, 9,24 mmol) wurde bei Raumtemperatur zu einer Lösung von
4-Aminomethyl-N-tert.-butoxycarbonylpiperidin (1,98 g, 9,24 mmol)
in THF (20 ml) gegeben. Die Mischung wurde 1 Stunde auf Rückfluss
erhitzt, im Vakuum eingeengt und mit CH
2Cl
2 und 1N HCl ausgeschüttelt. Die organische Schicht
wurde mit Kochsalzlösung
gewaschen, über
Na
2SO
4 getrocknet,
durch ein Filterkissen aus Silicagel passiert und eingeengt, um
1,71 g (46 % Ausbeute) eines gelben Feststoffs zu ergeben, welcher
ohne weitere Reinigung verwendet wurde.
-
4-[(4-Aminobenzolsulfonylamino)-methyl]-N-tert.-butoxycarbonylpiperidin,
das die Strukturformel
hat, wurde zunächst wie
folgt hergestellt. N-tert.-Butoxycarbonyl-4-[(4-nitrobenzolsulfonylamino)-methyl]-piperidin
(1,70 g, 4,26 mmol), 10 % Pd/C (250 mg), MeOH (10 ml) und THF (10
ml) wurden 2 Stunden in einer Wasserstoffatmosphäre gerührt und dann abfiltriert. Das
Filtrat wurde zu einem Rückstand
eingeengt, der mittels Säulenchromatographie
mit 5 % MeOH/CHCl
3 als Eluierungsmittel
gereinigt wurde, um 1,39 g (88 % Ausbeute) eines weißen Feststoffs
zu ergeben, welcher ohne weitere Reinigung verwendet wurde.
-
N-tert.-Butoxycarbonyl-4-[(4-isothiocyanatobenzolsulfonylamino)-methyl]-piperidin,
welches die Strukturformel
hat, wurde auf eine analoge
Weise zu 1-(4-Isothiocyanatophenyl)-morpholin aus Beispiel C(54)
hergestellt. 4-[(4-Aminobenzolsulfonylamino)-methyl]-N-tert.-butoxycarbonylpiperdin
lieferte einen gelben Feststoff in 39 % Ausbeute, der ohne weitere
Reinigung verwendet wurde.
-
4-{[4-(5-Acetyl-4-aminothiazol-2-ylamino)-benzolsulfonylamino]-methyl}-N-tert.-butoxycarbonylpiperidin,
welches die Strukturformel
hat, wurde auf eine analoge
Weise zu der in Beispiel C(1) verwendeten hergestellt. N-tert.-Butoxycarbonyl-4-[(4-isothiocyanatobenzolsulfonylamino)-methyl]-piperidin
und 2-Brom-2',6'-difluoracetophenon
(aus Beispiel C(79)) lieferten einen gelben Feststoff in 50 % Ausbeute.
- 1H-NMR (DMSO-d6): δ 11,22 (1H,
s), 8,20 (2H, bs), 7,84–7,73
(3H, m), 7,62–7,54
(2H, m), 7,24 (2H, dd, J = 7,8, 7,7 Hz), 3,89 (2H, d, J = 12,8 Hz),
3,35 (2H, s), 2,52 (2H, d, J = 1,2 Hz), 1,60 (2H, d, J = 10,1 Hz),
1,56–1,42 (1H,
m), 1,39 (9H, s), 0,91 (2H, d, J = 12,8 Hz).
-
Die
Titelverbindung wurde auf analoge Weise wie der in Beispiel J(1)
verwendeten hergestellt. 4-{[4-(5-Acetyl-4-aminothiazol-2-ylamino)-benzolsulfonylamino]-methyl}-N-tert.-butoxycarbonylpiperidin
lieferte einen braunen Feststoff in 28 % Ausbeute.
- 1H-NMR (DMSO-d6): δ 8,11 (2H,
bs), 7,70 (4H, bs), 7,58–7,42
(1H, m), 7,20 (1H, d, J = 7,8 Hz), 7,15 (1H, d, J = 7,8 Hz), 3,80
(2H, bs), 3,05 (2H, d, J = 10,0 Hz), 2,60 (2H, d, J = 6,8 Hz), 1,65
(2H, d, J = 12,2 Hz), 1,52 (1H, bs), 1,07 (2H, d, J = 10,0 Hz).
- HRFABMS (MH+): ber.: 50.7,1210. Gef.:
507,1206.
- Anal. ber. für
C22H23N5O3S2F2·0,1 CH3OH·0,2
CF3COOH: C, 50,65; H, 4,73; N, 13,12; S,
12,02. Gef.: C, 50,92; H, 4,46; N, 12,87; S, 12,18.
-
Andere
Verbindungen können
in Übereinstmmung
mit der Erfindung auf Arten hergestellt werden, die den oben beschriebenen
gleichwertig sind. Zusätzliche
beispielhafte erfindungsgemäße Verbindungen
werden in den unten folgenden Tabellen I, II und III identifiziert,
welche Ergebnisse von biochemischen und biologischen Untersuchungen
bereitstellen.
-
Biochemische und biologische
Evaluierung:
-
Die
Aktivität
der Zyklin-abhängigen
Kinase wurde durch die Quantifizierung des Enzymkatalysierten, zeitabhängigen Einbaus
von radioaktivem Phosphat aus [32P]ATP oder
[33P]ATP in ein Proteinsubstrat gemessen.
Wenn nicht anders angegeben, wurden die Untersuchungen in 96-Lochplatten
mit einem Gesamtvolumen von 50 μL,
in Gegenwart von 10 mM HEPES (N-[2-hydroxyethyl]-piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure]) (pH
7,4), 10 mM MgCl2, 25 μM Adenosintriphosphat (ATP),
1 mg/mL Ovalbumin, 5 μg/mL
Leupeptin, 1 mM Dithiothreitol, 10 mM ⎕-Glycerinphosphat 0,1 mM Natriumvanadat,
1 mM Natriumfluorid, 2,5 mM 1,2-Bis-(2-aminoethoxyethan)-N,N,N'N'-tetraessigsäure (EGTA), 2 Vol.-% Dimethylsulfoxid
und 0,03–0,4 μCi [32/33P]ATP pro Reaktion ausgeführt. Reaktionen
wurden mit Enzym gestartet, bei 30°C inkubiert und nach 20 Minuten
zur Zugabe von Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) zu 250 mM beendet.
Die phosphorylierten Substrate wurden dann auf einer Nitrocellulose-
oder Phosphocellulosemembran unter Verwendung eines 96-Lochfiltrationsverteilers
gefangen und nichteingebaute Radioaktivität wurde durch wiederholtes
Waschen mit 0,85 %iger Phosphorsäure entfernt.
Die Radioaktivität
wurde quantifiziert, indem die getrockneten Membranen einem Phosphorimager ausgesetzt
wurden.
-
Auftretende
K1-Werte wurden gemessen, in dem die Enzymaktivität in Gegenwart
von verschiedenen Inhibitorverbindungskonzentrationen untersucht
und die Hintergrundradioaktivität,
die in Abwesenheit von Enzym gemessen wurde, abgezogen wurde. Die
kinetischen Parameter (kcat, Km für ATP) wurden für jedes
Enzym unter den üblichen
Untersuchungsbedingungen gemessen, indem die Abhängigkeit der Anfangsgeschwindigkeiten
von der ATP-Konzentration bestimmt wurde. Die Inhibierungsdaten
wurden an eine Gleichung für
kompetitive Inhibierung unter Verwendung von Kaleidagraph (Synergy
Software) angepasst, oder wurden an eine Gleichung für kompetitive „tight-binding"-Inhibierung unter
Verwendung der Software KineTic (BioKin, Ltd.) angepasst.
-
Inhibierung von CDK4/Zyklin
D-Retinoblastom-Kinaseaktivität:
-
Ein
Komplex aus humaner CDK4 und Zyklin D3, oder ein Komplex aus Zyklin
D1 und einem Fusionsprotein von humaner CDK4 und Glutathion-S-Transferase
(GST-CDK4), oder ein Komplex aus humaner CDK4 und genetisch verkürztem (1–264) Zyklin
D3, wurde unter Verwendung herkömmlicher
biochemischer Chromatographietechniken aus Insektenzellen, die mit
den entsprechenden Baculovirus-Expressionsvektoren koinfiziert wurden
(siehe z. B. Meijer und Kim, "Chemical
inhibitors of Cyclin-Dependent Kinases," Methods in Enzymol,. Vol. 283 (1997),
113–128)
gereinigt. Der Enzymkomplex (5 oder 50 nM) wurde mit 0,3–0,5 μg von gereinigtem
rekombinantem Retinoblastom-Proteinfragment (Rb) als Substrat analysiert.
Das gentechnisch hergestellte Rb-Fragment (Reste 386–928 des
nativen Retinoblastom-Proteins; 62,3 kDa) enthält die Mehrheit der Phosphorylierungsstellen,
die auf dem nativen 106-kDa-Protein gefunden werden, wie auch eine
Markierung aus sechs Histidinresten zur Erleichterung der Reinigung.
Phosphoryliertes Rb-Substrat wurde mittels Mikrofiltration auf einer
Nitrocellulosemembran gefangen und unter Verwendung eines Phosphorimagers
wie oben beschrieben quantifiziert. Zur Messung der „Tight-binding"-Inhibitoren wurde
die Enzymkomplexkonzentration auf 5 nM vermindert und die Dauer
der Untersuchung auf 60 Minuten verlängert, und in dieser Zeit war die
Zeitabhängigkeit
der Produktbildung linear.
-
Inhibierung von CDK2/Zyklin
A-Retinoblastom-Kinaseaktivität:
-
CDK2
wurde unter Verwendung von veröffentlichten
Methoden (Rosenblatt et al., "Purification
and Crystallization of Human Cyclin-dependent Kinase 2," J. Mol. Biol, Vol.
230, 1993, 1317–1319)
aus Insektenzellen gereinigt, die mit einem Baculovirus-Expressionsvektor
infiziert wurden. Zyklin A wurde aus E. coli-Zellen gereinigt, die
rekombinantes Zyklin A in voller Länge exprimieren, und ein verkürztes Zyklin
A-Konstrukt wurde durch eingeschränkte Proteolyse erzeugt und
wie früher
beschrieben gereinigt (Jeffrey et al., "Mechanism of CDK activation revealed
by the structure of a cyclin A-CDK2 complex," Nature, Vol. 376 (27.07.1995), 313–320). Gereinigtes,
proteolysiertes Zyklin A wurde in der Untersuchung in einem drei-
bis fünffachen
molaren Überschuss
zu CDK2 eingesetzt. Alternativ wurde ein Komplex aus CDK2 und proteolysiertem
Zyklin A hergestellt und durch Gelfiltration gereinigt. Das Substrat
für diese
Untersuchung war das gleiche Rb-Substratfragment, dass für die CDK4-Untersuchungen
verwendet wurde, und die Methoden für die CDK2/Zyklin A- und die
CDK4/Zyklin D3-Untersuchungen waren im Wesentlichen die gleichen,
außer
dass CDK2 mit 150 nM oder 5 nM anwesend war. K1-Werte
wurden wie oben beschrieben gemessen.
-
Inhibierung von CDK1(cdc2)/Zyklin
B-Histon-H1-Kinaseaktivität:
-
Der
Komplex aus humaner CDK1 (cdc2) und Zyklin B wurde von den New England
Biolabs (Beverly MA) erworben. Alternativ wurde ein CDK1/Glutathion-S-Transferase-Zyklin
B1-Komplex unter
Verwendung von Glutathionaffinitätschromatographie
aus Insektenzellen gereinigt, die mit dem entsprechenden Baculovirus-Expressionsvektoren
infiziert wurden. Die Untersuchung wurde wie oben beschrieben bei
30°C unter
Verwendung von 2,5 Einheiten cdc2/Zyklin B, 10 μg Histon H1-Protein und 0,1–0,3 μCi [32/33P]ATP pro Untersuchung ausgeführt. Phosphoryliertes
Histon-Substrat wurde mittels Mikrofiltration auf einer Phosphocellulosemembran
P81 gefangen und unter Verwendung eines Phosphorimagers wie oben
beschrieben quantifiziert. K1-Werte wurden
unter Verwendung der beschriebenen Kurvenanpassungsprogramme gemessen.
-
Ergebnisse
von Untersuchungen, die an Verbindungen ausgeführt wurden, welche oben beschriebene spezifische
Beispiele wie auch zusätzliche
Beispiele umfassen, die mit dem das Präfix "I" bezeichnet
sind (z. B., Beispiele I(1), I(2), usw.), wobei "*" eine
Verbindung mit einer bekannten Struktur (d.i., die Verbindung an sich
ist bekannt) markiert, sind im Folgenden in den Tabellen I, II und
III aufgeführt.
Wenn in einem bestimmten Eintrag nicht anders angegeben, sind die
verwendeten Einheiten und Untersuchungen wie in der betreffenden Spalte
der Tabelle angegeben. Die Abkürzung "N.I." gibt an, dass bei
der angegebenen Konzentration keine Inhibierung beobachtet wurde. Tabelle
I, K
i mit CDKs
- a
= D-Typ-Zyklin ist D3; b = D-Typ-Zyklin ist D1; c = D-Typ-Zyklin
ist verkürztes
D3 Inhibierung des Zellwachstums: Untersuchung der Zytotoxizität
-
Die
Inhibierung des Zellwachstums wurde unter Verwendung des Tetrazoliumsalz-Assays
gemessen, das auf der Fähigkeit
von lebensfähigen
Zellen basiert, 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-[2H]-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)
zu Formazan zu reduzieren (Mossman, Journal of Immunological Methods,
Vol. 65 (1983), 55–58).
Das wasserunlösliche
purpurfarbene Formazanprodukt wurde anschließend spektrophotometrisch detektiert.
Es wurden verschiedene Zelllinien (HCT-116, Saos-2, U2-OS, SW480,
COLO-205, RXF-393, M14, MDA-MB-468 und MCF7) in 96-Lochplatten gezogen.
Die Zellen wurden in geeignetem Medium mit einem Volumen von 135 μl/Loch, entweder
in McCoy's 5A Medium
(für Saos-2-,
U2-OS-, SW480- und HCT-116-Zellen), in RPMI (für COLO-205-, RXF-393-, M14-Zellen)
oder in Minimum Essential Medium Eagle (für MDA-MB-468- und MCF7-Zellen),
ausplattiert. Die Platten wurde vier Stunden inkubiert, bevor die
Inhibitorverbindungen zugegeben wurden. Es wurden verschiedene Konzentrationen
an Inhibitorverbindungen in 0,5 Vol.-% Dimethylsulfoxid (15 μL/Loch) zugegeben,
und die Zellen wurden bei 37°C
(5 % CO2) für vier bis sechs Tage inkubiert (in
Abhängigkeit
vom Zelltyp). Am Ende jeder Inkubation wurde MTT zu einer Endkonzentration
von 0,2 mg/ml zugegeben, und die Zellen wurden weitere 4 Stunden
bei 37°C
inkubiert. Nach dem Zentrifugieren der Platten und dem Entfernen
von Medium wurde die Extinktion von Formazan (gelöst in Dimethylsulfoxid)
bei 540 nm gemessen. Die Konzentration an Inhibitorverbindung, welche
eine 50 %ige Wachstumsinhibierung verursachte, wurde aus dem linearen
Teil einer halblogarithmischen Auftragung der Inhibitorkonzentration
gegen den prozentualen Anteil der Inhibierung bestimmt. Alle Ergebnisse
wurden mit Kontrollzellen verglichen, die nur mit 0,5 Vol. % Dimethylsulfoxid
behandelt wurden.
-
-
pRb-Immunoblotting:
-
Die
Fähigkeit
von Verbindungen, die Phosphorylierung des Retinoblastom-Proteins
(pRb) zu inhibieren, wurde mittels Western Blot Analyse bestimmt.
Es wurde ein anti-Rb-Antikörper
verwendet, um die Konversion von hyperphosphoryliertem pRb zu hypophosphoryliertem
pRb zu messen. Es wurde ein Anti-phospho-Rb-Antikörper (ser780)
verwendet, um spezifisch die Dephosphorylierung am Serin 780 zu
messen, einer Stelle, die sich früher als von CDK4/Zyklin D phosphorylierte
Stelle erwies. Inhibierung von pRb-Phosphorylierung wird in der
unten folgenden Tabelle III mit einem „+" angegeben, und ein Versagen, pRb-Phosphorylierung zu
inhibieren wird in der Tabelle mit einem „–„ angegeben.
-
Es
wurden menschliche Colon-Tumorzellen (HCT-116-Zellen; 5·106) auf 100 mM-Petrischalen ausplattiert und über Nacht
wachsen gelassen. Es wurden fünf μM jeder Verbindung
für 12
Stunden zugegeben. Die Zellen wurden dann geerntet und zentrifugiert.
Die Zellpellets wurde durch Zugabe von 100 μL Lysepuffer (50 mM HEPES (pH
7,0), 250 mM NaCl, 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure, 0,1 % Nonidet P-40, 1
mM Dithiothreitol, 2 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM Natriumorthovanadat,
1 μg/ml
Aprotonin, 1 μg/ml
Leupeptin, 50 μg/ml
Phenylmethylsulfonylfluorid) lysiert. Vierzig μg Protein wurde mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
(SDS-PAGE) auf einem 6 %igen Gel getrennt. Die Proteine wurden auf
Nitrocellulose übertragen
und mit 5 %igem Blockierungspuffer in Tris-gepufferter Salzlösung über Nacht
blockiert. Die Anti-Rb-Antikörper
(Pharmingen), die Anti-Phospho-Rb-Antikörper (Ser 780) (MBL) und sekundäre Antikörper wurden
1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von drei Waschschritten
in 0,01 %igem Tween-20 in Tris-gepufferter Salzlösung. Das Rb-Protein wurde
unter Verwendung von Chemolumineszenz gemäß den Herstellerangaben (Amersham)
detektiert.
-
Tabelle
III: Inhibierung der pRb-Phosphorylierung
-
Die
oben aufgeführten
Beispiele zeigen Verbindungen gemäß Formel I und Untersuchungen,
die einfach ausgeführt
werden können,
um ihre Aktivitätsniveaus
gegenüber
verschiedenen CDK/Zyklin-Komplexen zu bestimmen. Es ist offensichtlich,
dass derartige Untersuchungen und andere auf dem Fachgebiet bekannte geeignete
Untersuchungen verwendet werden können, um einen Inhibitor mit
dem gewünschten
Niveau an Aktivität
gegenüber
einem gewünschten
Ziel auszuwählen.
-
Während die
Erfindung in Bezug auf spezifische und bevorzugte Ausführungsformen
dargestellt wurde, werden Fachleute auf diesem Gebiet erkennen,
dass Variationen und Modifikationen durch Routineexperimente und
Anwendung der Erfindung gemacht werden können. Zum Beispiel werden solche
mit durchschnittlichen Fähigkeiten
in dem Fachgebiet erkennen, dass Variationen oder Substitutionen
der Verbindungen mit der Formel I gemacht werden können, ohne
auf signifikante Weise ihre Wirksamkeit in den pharmazeutischen Zusammensetzungen
zu beeinflussen. So soll die Erfindung durch die vorhergehende Beschreibung
nicht eingeschränkt
werden, sondern durch die angehängten
Ansprüche
und ihrer Äquivalente
definiert werden.