DE3486139T2

DE3486139T2 - Bacillus, der weder Subtilisin noch neutrale Protease ausscheiden kann.

Info

Publication number: DE3486139T2
Application number: DE87200690T
Authority: DE
Inventors: Richard Ray Bott; David Aaron Estell; Eugenio Ferrari; Dennis James Henner; James Allen Wells
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1983-06-24
Filing date: 1984-06-22
Publication date: 1993-11-11
Anticipated expiration: 2004-06-23
Also published as: EP0247647B1; JPH06315378A; ATE60356T1; EP0246678B1; HK75493A; DE3484019D1; IE841567L; JPH06319534A; EP0130756A1; DK82293A; EP0130756B2; ATE60797T1; DE3484079D1; DK82393D0; EP0247647A1; HK99293A; DE3486139D1; DK175278B1; HK75393A; JPS6070075A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Erzeugung und Manipulation von Proteinen, wobei rekombinante Techniken in geeigneten Wirten verwendet werden. Im spezielleren betrifft die Erfindung die Erzeugung von mutanten prokaryotischen Proteasen wie Subtilisin und neutraler Protease und von heterologen Proteinen durch Bacillus, der nicht fähig ist, enzymatisch wirksames Subtilisin oder neutrale Protease auszuscheiden.
Von verschiedenen Bakterien ist bekannt, daß sie in irgendeinem Stadium in ihrem Lebenszyklus Proteasen ausscheiden. Bacillusspezien erzeugen zwei wesentliche extrazelluläre Proteasen, eine neutrale Protease (eine durch EDTA gehemmte Metalloprotease) und eine alkalische Protease (oder Subtilisin, eine Serinendoprotease). Beide werden im allgemeinen nach der exponentialen Wachstumsphase in der größten Menge erzeugt, wenn die Kultur in die stationäre Phase eintritt und mit dem Sporenbildungsvorgang beginnt. Die physiologische Rolle dieser beiden Proteasen ist nicht klar. Es ist als gegeben angenommen worden, daß sie eine Rolle bei der Sporenbildung spielen (J.Hoch 1976, "Adv.Genet." 18 : 69-98; P.Piggot et al., 1976, "Bact.Rev." 40 : 908-962; und
F. Priest, 1977, "Bact.Rev." 41 : 711-753), daß sie an der Regulierung des Zellwandturnovers beteiligt sind (L.Jolliffe et al., 1980, "J.Bact." 141 : 1199-1208) und daß sie Scavengerenzyme sind (Priest, Id.). Die Regulierung der Expression der Proteasegene ist kompliziert. Sie scheinen in Übereinstimmung mit Sporenbildung koordiniert reguliert zu werden, da in den frühen Stadien der Sporenbildung blockierte Mutanten verringerte Mengen an sowohl alkalischer als auch neutraler Protease aufweisen. Außerdem besteht eine Anzahl an pleiotropischen Mutationen, die das Ausmaß der Expression von Proteasen und anderen ausgeschiedenen Genprodukten beeinflussen, wie Amylase und Levansaccharase (Priest, Id.).
Subtilisin ist in industriellen und kommerziellen Anwendungen in beträchtlichem Ausmaß zum Einsatz gekommen (siehe US-PS-3,623,957 und J. Millet, 1970, "J.Appl.Bact." 33 : 207). Beispielsweise werden Subtilisine und andere Proteasen üblicherweise in Waschmitteln verwendet, um das Entfernen von Flecken auf Proteinbasis zu ermöglichen. Sie werden auch bei der Verarbeitung von Nahrungsmitteln verwendet, um die in den Nahrungsmittelpräparaten vorhandenen eiweißartigen Substanzen an ihre gewünschte Auswirkung auf die Zusammensetzung anzupassen.
Die klassische Mutagenese von Bakterien durch Mittel wie Bestrahlung oder Chemikalien hat eine Vielzahl von Mutantenstämmen geschaffen, die bezogen auf die Wachstumsphase, bei der Proteaseausscheidung auftritt, sowie den Zeitpunkt und den Wirksamkeitsausmaßen ausgeschiedener Protease unterschiedliche Eigenschaften aufweisen. Diese Stämme reichen jedoch nicht an das maximale Potential der Organismen heran, weil der mutagenetische Vorgang im wesentlichen zufällig bzw. statistisch erfolgt, wobei langwierige(s) Selektion und Screenen erforderlich ist, um Organismen zu identifizieren, die den gewünschten Eigenschaften auch nur nahekommen. Des weiteren sind diese Mutanten zur Reversion zum Eltern- oder Wildtypstamm fähig. In diesem Fall geht die wünschenswerte Eigenschaft verloren. Die Wahrscheinlichkeit der Reversion ist unbekannt, wenn es sich um zufällige Mutagenese handelt, da der Typ und die Stelle der Mutation unbekannt oder schlecht charakterisiert ist. Das verleiht dem industriellen Verfahren, das auf dem enzymsynthetisierenden Bakterium basiert, beträchtliche Unsicherheit. Schließlich koppelt die klassische Mutagenese einen wünschenswerten Phänotyp, z. B. niedrige Proteasewerte, mit einem nicht wünschenswerten Merkmal wie übermäßiger vorzeitiger Zelllyse.
Besondere Probleme bestehen bezüglich der Proteasen, die durch Bacillus ausgeschieden werden. Einerseits ist, da zumindest zwei derartige Proteasen existieren, das Screenen bezüglich des Verlusts von nur einer schwierig. Außerdem macht die große Anzahl an pleiotropischen Mutationen, die sowohl die Sporenbildung als auch die Proteaseerzeugung beeinflussen, das Isolieren echter Proteasemutationen schwierig.
Temperaturempfindliche Mutanten des neutralen Proteasegens sind nach herkömmlichen Mutagenesetechniken erzielt worden und wurden verwendet, um die Position des regulierenden und strukturellen Gens im Bacillus subtilis-Gen zu mappen (H.Uehara et al., 1979, "J.Bact." 139 : 583-590). Außerdem ist eine, wie angenommen wird, Nonsensmutation des alkalischen Proteasegens berichtet worden (C. Roitsch et al., 1983, "J.Bact." 155 : 145-152).
Es sind temperaturempfindliche Bacillusmutanten isoliert worden, die inaktive Serinprotease oder stark verringerte Mengen an Serinprotease erzeugen. Diese Mutanten sind jedoch asporogen und weisen eine Reversionshäufigkeit zum Wildtyp von etwa von 10&supmin;&sup7; bis 10&supmin;&sup8; auf (F.Priest, Id. S.719). Diese Mutanten sind für die rekombinante Produktion von heterologen Proteinen nicht zufriedenstellend, weil asporogene Mutanten während früherer Stadien ihres Wachstumszyklus in Minimalmedium zur Lyse neigen als sporenbildende Mutanten, wodurch vorzeitig zellulärer Gehalt (einschließlich intrazellulärer Proteasen) in den Kulturüberstand freigesetzt wird. Die Möglichkeit der Reversion ist ebenfalls unerwünscht, da Wildtypreversionsmutanten den Kulturüberstand mit ausgeschiedenen Proteasen verunreinigen.
Bacillus sp. sind für die Expression von heterologen Proteinen vorgeschlagen worden, aber die Gegenwart von ausgeschiedenen Proteasen und die potentielle resultierende Hydrolyse des gewünschten Produkts hat die kommerzielle Akzeptanz von Bacillus als einen Wirt für die Expression von heterologen Proteinen verzögert. Es sind Bacillus megaterium-Mutanten geoffenbart worden, die zur Sporenbildung fähig sind und die während Wachstumsphasen keine mit Sporenbildung in Verbindung stehende Protease exprimieren. Jedoch schloß das verwendete Assay die Gegenwart anderer Proteasen nicht aus, und die fragliche Protease wird während der Sporenbildungsphase exprimiert (C.Loshon et al., 1982, "J.Bact." 150 : 303-311). Das ist natürlich der Punkt, an dem heterologes Protein sich in der Kultur angesammelt hätte und verletzlich wäre. Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, einen Bacillusstamm zu konstruieren, der während aller Phasen seines Wachstumszyklus im wesentlichen frei von extrazellulären neutralen und alkalischen Proteasen ist und im wesentlichen normale Sporenbildungseigenschaften aufweist. Es besteht eine Notwendigkeit für nicht revertible, ansonsten normale Organismen mit Proteasedefizienz, die mit Plasmiden mit hoher Kopienanzahl für die Expression heterologer oder homologer Proteine transformiert werden können.
Es sind Enzyme erforderlich, die Eigenschaften aufweisen, die vom verfügbaren Bestand abweichen. Insbesondere Enzyme mit verstärkter Oxidationsbeständigkeit sind nützlich beim Verlängern der Lagerbarkeit und Bleichungsverträglichkeit von Proteasen, die in Wäschereiprodukten verwendet werden. Ahnlich wäre verringerte Oxidationsbeständigkeit in industriellen Verfahren nützlich, die das rasche und effiziente Zunichtemachen der enzymatischen Aktivität erfordern.
Das Modifizieren der pH-Aktivitätsprofile eines Enzyms wäre nützlich, um die Enzyme in einer großen Vielzahl von Verfahren effizienter zu machen, z. B. würde durch das Erweitern des pH-Aktivitätsprofils einer Protease ein Enzym erzeugt, das sowohl für alkalische als auch neutrale Wäschereiprodukte besser geeignet ist. Ein Einengen des Profils, besonders in Kombination mit zugeschnittener Substratspezifität, würde Enzyme in einer Mischung besser verträglich machen, wie hierin weiter beschrieben werden wird.
Mutationen von prokaryotischen Carbonylhydrolasen (hauptsächlich Proteasen, aber einschließlich Lipasen) erleichtern die Herstellung einer Vielzahl verschiedener Hydrolasen, insbesondere derjenigen, die andere modifizierte Eigenschaften aufweisen, wie Km, Kcat, Km/Kcat-Verhältnis und Substratspezifität. Diese Enzyme können dann für ein bestimmtes Substrat zugeschnitten werden, dessen Gegenwart vorhergesagt wird, beispielsweise bei der Herstellung von Peptiden oder für hydrolytische Verfahren wie Wäschereianwendungen.
Die chemische Modifizierung von Enzymen ist bekannt. Siehe beispielsweise I. Svendsen, 1976, "Carlsberg Res.Commun." 41(5):237-291. Diese Verfahren haben jedoch die Nachteile, daß sie von der Gegenwart zweckmäßiger Aminosäurereste abhängig sind, sind häufig unspezifisch, insofern als sie alle zugänglichen Reste mit üblichen Seitenketten modifizieren, und sind nicht fähig, ohne weitere Bearbeitung, z. B. Denaturierung, unzugängliche Aminosäurereste zu erreichen, das heißt im allgemeinen in der Wiedereinsetzungswirkung nicht vollständig umkehrbar. In dem Ausmaß, in dem derartige Verfahren das Ziel haben, eine Aminosäurerest-Seitenkette durch eine andere Seitenkette oder äquivalente Funktionalität zu ersetzen, verspricht die Mutagenese, derartige Verfahren zu verdrängen.
Vorherbestimmte, stellengerichtete Mutagenese von tRNA-Synthetase, bei der der cys-Rest in Serin umgewandelt wird, ist berichtet worden (G.Winter et al., 1982, "Nature" 299 : 756-758; A.Wilkinson et al., 1984, "Nature" 307 : 187-188). Dieses Verfahren ist für Mutagenese im großen Maßstab unpraktisch. Gemäß vorliegender Erfindung wird ein zweckmäßiges und rasches Verfahren zum Mutieren von DNA durch Sättigungsmutagenese geoffenbart.
Es wird ein Verfahren zum Erzeugen von prokaryotischer Carbonylhydrolase wie Subtilisin und neutraler Protease in rekombinanten Wirtszellen beschrieben, bei dem Expressionsvektoren, die Sequenzen enthalten, die für gewünschtes Subtilisin oder neutrale Protease kodieren, einschließlich der pro-, pre- oder prepro-Formen dieser Enzyme, zum Transformieren von Wirten verwendet werden, der Wirt kultiviert wird und gewünschte Enzyme gewonnen werden. Die Kodierungssequenz kann Modifikationen enthalten, die die Ausscheidung von enzymatisch wirksamem Subtilisin oder neutraler Protease verhindern, wie unten weiter beschrieben wird.
Die neuen Stämme werden dann mit zumindest einer DNA-Gruppe transformiert, die für ein Polypeptid kodiert, das ansonsten nicht im Wirtsstamm exprimiert wird, die transformierten Stämme kultiviert und das Polypeptid aus der Kultur gewonnen. Üblicherweise ist die DNA-Gruppe ein gerichteter Mutant eines Wirts-Bacillusgens, obwohl sie DNA sein kann, die für ein eukaryotisches (Hefe- oder Säugetier-)Protein kodiert. Die neuen Stämme dienen auch als Wirte für Protein, das aus einem bakteriellen Gen exprimiert wird, das von anderen Quellen als das Wirtsgenom abgeleitet ist, oder für Vektoren, welche diese heterologen Gene exprimieren, oder homologe Gene vom Wirtsgenom. Im letzteren Fall werden Enzyme wie Amylase frei von neutraler Protease oder Subtilisin erhalten. Außerdem ist es jetzt möglich, neutrale Protease in Kultur zu erhalten, die frei von enzymatisch wirksamen Subtilisin ist, und umgekehrt.
Die Stammanmeldung EP-130756-A hiervon betrifft prokaryotische Carbonylhydrolasen und Mutanten davon und ihre Herstellung in transformierten Wirten.
Es wird ein zweckmäßiges Verfahren für Sättigungsmutagenese geschaffen, wodurch die rasche und effiziente Erzeugung einer Vielzahl von Mutationen an jeder Stelle innerhalb des Kodierungsbereiches eines Proteins ermöglicht wird, umfassend:
(a) das Erhalten einer DNA-Gruppe, die zumindest für einen Abschnitt des genannten Vorläuferproteins kodiert;
(b) das Identifizieren eines Bereichs innerhalb der Gruppe;
(c) das Substituieren der innerhalb des Bereichs vorhandenen Nukleotide durch Nukleotide, um zumindest eine für die Gruppe einzigartige Restriktionsenzymstelle zu schaffen, wodurch die einzigartigen Restriktionsstellen 5' und 3' zum identifizierten Bereich verfügbar gemacht werden, sodaß keine die Aminosäuren ändert, für die der Bereich wie exprimiert kodiert;
(d) das Synthetisieren einer Vielzahl von Oligonukleotiden, deren 5'- und 3'-Enden jeweils Sequenzen enthalten, die fähig sind, sich im Ringschluß an die in Schritt (c) eingeführten Restriktionsenzymstellen zu binden, und die, wenn sie an die Gruppe ligiert werden, als Substitutionen, Löschungen und/oder Einfügungen von zumindest einer Aminosäure in oder in das genannte Vorläuferprotein hinein exprimiert werden;
(e) das Digerieren der Gruppe von Schritt (c) mit Restriktionsenzymen, die fähig sind, die einzigartigen Stellen zu spalten; und
(f) das Ligieren eines jeden der Oligonukleotide von Schritt (d) in die digerierte Gruppe von Schritt (e), wodurch eine Vielzahl von mutanten DNA-Gruppen erhalten wird.
Dieses Verfahren bildet den Gegenstand der gleichzeitig anhängigen Teilanmeldung Nr. 87.
Nach dem vorangehenden Verfahren oder anderen nach dem Stand der Technik bekannten wird eine Mutation in isolierte DNA eingeführt, die für eine prokaryotische Carbonylhydrolase kodiert, die nach dem Exprimieren der DNA zur Substitution, Löschung oder Einfügung von zumindest einer Aminosäure an einer vorherbestimmten Stelle in der Hydrolase führt. Dieses Verfahren ist nützlich für das Erzeugen von Mutanten von Wildtypproteinen (worin das "Vorläufer"-Protein der Wildtyp ist) oder das Revertieren von Mutanten zum Wildtyp (worin der "Vorläufer" der Mutant ist).
Es werden mutante Enzyme gewonnen, die Oxidationsbeständigkeit und/oder pH-Aktivitätsprofile aufweisen, die sich von den Vorläuferenzymen unterscheiden. Prokaryotische Carbonylhydrolasen, die unterschiedliche(s) Km, Kcat, Kcat/Km-verhältnis und Substratspezifität aufweisen, werden gemäß vorliegender Erfindung ebenfalls geschaffen.
Die nach den Verfahren gemäß vorliegender Erfindung erhaltenen Enzyme werden auf bekannte Weise mit Tensiden oder Waschmitteln kombiniert, um neue Zusammensetzungen zu schaffen, die beim Wäschewaschen oder anderen Reinigungsvorgängen nützlich sind.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt die Sequenz eines funktionellen B.amyloliquefaciens-Subtilisingens.
In Fig. 1A ist die gesamte funktionelle Sequenz für B.amyloliquefaciens, einschließlich des Promotors und der Ribosombindungsstelle, auf einem 1,5 kb-Fragment des B.amyloliquefaciens-Genoms vorhanden.
Fig. 1B zeigt die Nukleotidsequenz des Kodierungsstrangs in Korrelation mit der Aminosäuresequenz des Proteins. Promotor(p)-Ribosombindungsstelle (rbs) und Terminations(term)-Bereiche der DNA-Sequenz werden ebenfalls gezeigt.
Fig. 2 zeigt die Ergebnisse von Replikanitrozellulosefiltern gereinigter positiver Klone, die mit Pool 1 (Feld A) bzw. Pool 2 (Feld B) sondiert wurden.
Fig. 3 zeigt die Restriktionsanalyse des Subtilisinexpressionsplasmids (pS4). pBS42-Vektorsequenzen (4,5 kb) werden in durchgehenden Linien gezeigt, während die Einfügungssequenz (4,4 kb) in gestrichelten Linien gezeigt wird.
Fig. 4 zeigt die Ergebnisse von SDS-PAGE, durchgeführt an Überständen von mit pBS42 und pS4 transformierten Kulturen.
Fig. 5 zeigt die Konstruktion des Shuttlevektors pBS42.
Fig. 6 zeigt einen Restriktionsplan für eine Sequenz, die das B.subtilis-Subtilisingen einschließt.
Fig. 7 ist die Sequenz eines funktionellen B.subtilis-Subtilisingens.
Fig. 8 zeigt ein Konstruktionsverfahren zum Erhalten eines Löschungsmutanten eines B.subtilis-Subtilisingens.
Fig. 9 offenbart den Restriktionsplan für ein neutrales
B.subtilis-Proteasegen.
Fig. 10 ist die Nukleotidsequenz für ein neutrales B.subtilis-Proteasegen.
Fig. 11 veranschaulicht die Konstruktion eines Vektors, der ein neutrales B.subtilis-Proteasegen enthält.
Die Fig. 12, 13 und 16 offenbaren Ausführungsformen der Mutagenesetechniken, die gemäß vorliegender Erfindung geschaffen werden.
Fig. 14 zeigt die erhöhte Oxidationsbeständigkeit eines Subtilisinmutanten.
Fig. 15 zeigt eine Veränderung des pH-Aktivitätsprofils eines Subtilisinmutanten im Vergleich zum Wildtypenzym.

Detaillierte Beschreibung

Prokaryotische Carbonylhydrolasen sind Enzyme, die Verbindungen hydrolysieren, die
Bindungen enthalten, in denen X Sauerstoff oder Stickstoff ist. Sie umfassen hauptsächlich Hydrolasen, z. B. Lipasen und Peptidhydrolasen, z. B. Subtilisine oder Metalloproteasen. Peptidhydrolasen umfassen α-Aminoacylpeptidhydrolase, Peptidylaminosäurehydrolase, Acylaminohydrolase, Serincarboxypeptidase, Metallocarboxypeptidase, Thiolproteinase, Carboxylproteinase und Metalloproteinase. Serin-, Metallo-, Thiol- und Säureproteasen sind eingeschlossen, ebenso wie Endo- und Exo-Proteasen.
Subtilisine sind Serinproteinasen, die im allgemeinen die Wirkung haben, interne Peptidbindungen von Proteinen oder Peptiden zu spalten. Metalloproteasen sind Exo- oder Endoproteasen, die zur Wirksamkeit einen Metallionenkofaktor erfordern.
Es gibt eine Anzahl natürlich auftretender Mutanten von Subtilisin oder neutraler Protease, und alle können gemäß vorliegender Erfindung mit gleicher Wirkung als Quellen für genetisches Ausgangsmaterial verwendet werden.
Diese Enzyme und ihre Gene können aus vielen prokaryotischen Organismen erhalten werden. Geeignete Beispiele umfassen gramnegative Organismen wie E.coli oder Pseudomonas und grampositive Bakterien wie Mikrococcus oder Bacillus.
Die für die Carbonylhydrolase kodierenden Gene können nach dem allgemeinen Verfahren gemäß vorliegender Erfindung erhalten werden. Wie aus den Beispielen zu erkennen ist, umfaßt dies das Synthetisieren markierter Sonden, die mutmaßliche Sequenzen aufweisen, die für Bereiche der interessierenden Hydrolase kodieren, das Herstellen genomischer Sammlungen aus Organismen, welche die Hydrolase exprimieren, und das Screenen der Sammlungen auf das interessierende Gen durch Hybridisierung mit den Sonden. Positiv hybridisierende Klone werden dann gemappt und sequenziert. Die geklonten Gene werden mit erforderlichen Bereichen zur Replikation im Wirt in einen Expressionsvektor ligiert (der auch der Klonungsvektor sein kann), das Plasmid zur Enzymsynthese in einen Wirt transfiziert und die rekombinanten Wirtszellen unter Enzymsynthese begünstigenden Bedingungen kultiviert, üblicherweise unter Selektionsdruck, wie er durch die Gegenwart eines Antibiotikums geliefert wird, wobei der Vektor für Resistenz dagegen kodiert. Kultivierung unter diesen Bedingungen führt zu Enzymausbeuten, die um ein Vielfaches größer sind als die Wildtypenzymsynthese des Elternorganismus, auch wenn es der Elternorganismus ist, der transformiert wird.
"Expressionsvektor" bezieht sich auf ein DNA-Konstrukt, das eine DNA-Sequenz enthält, die operabel mit einer geeigneten Steuersequenz verbunden ist, die fähig ist, die Expression der genannten DNA in einem geeigneten Wirt zu bewirken. Derartige Steuersequenzen umfassen einen Promotor, um Transkription zu bewirken, wahlweise eine Operatorsequenz, um derartige Transkription zu steuern, eine Sequenz, die für geeignete mRNA-Ribosombindungsstellen kodiert, und Sequenzen, welche die Beendigung der Transkription und Translation steuern. Der Vektor kann ein Plasmid, ein Phagenpartikel oder einfach eine potentielle genomische Einfügung sein. Sobald er in einen geeigneten Wirt transformiert ist, kann der Vektor sich vermehren und unabhängig vom Wirtsgenom funktionieren, oder kann sich in manchen Fällen in das Genom selbst integrieren. In der vorliegenden Beschreibung werden "Plasmid" und "Vektor" manchmal austauschbar verwendet, da das Plasmid zur Zeit die am häufigsten verwendete Vektorform ist. Jedoch soll die Erfindung auch andere Formen von Expressionsvektoren einschließen, die äquivalenten Funktionen dienen und die nach dem Stand der Technik bekannt sind oder werden.
"Rekombinante Wirtszellen" bezieht sich auf Zellen, die mit Vektoren transformiert oder transfiziert worden sind, die unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken konstruiert wurden. Wie für die vorliegende Erfindung relevant, sind rekombinante Wirtszellen diejenigen, die prokaryotische Carbonylhydrolasen in ihren verschiedenen Formen auf Grund der Tatsache erzeugen, daß sie mit Expressionsvektoren transformiert worden sind, die für diese Proteine kodieren. Die rekombinanten Wirtszellen können vor der Transformation eine Form von Carbonylhydrolase erzeugt haben oder nicht.
"Operabel verbunden" bedeutet, wenn damit die Beziehung zwischen zwei DNA-Bereichen beschrieben wird, einfach, daß sie in funktioneller Beziehung zueinander stehen. Beispielsweise ist eine Präsequenz operabel mit einem Peptid verbunden, wenn sie als eine Signalsequenz fungiert und an der Ausscheidung der reifen Form des Proteins teilnimmt, wobei höchstwahrscheinlich die Signalsequenz gespalten wird. Ein Promotor ist operabel mit einer Kodierungssequenz verbunden, wenn er die Transkription der Sequenz steuert; eine Ribosombindungsstelle ist operabel mit einer Kodierungssequenz verbunden, wenn sie so positioniert ist, daß sie Translation zuläßt.
"Prohydrolase" bezieht sich auf eine Hydrolase, die zusätzliche N-terminale Aminosäurereste enthält, die das Enzym inaktiv machen, aber, wenn sie entfernt werden, ein Enzym ergeben. In der Natur sind viele proteolytische Enzyme als translationale Proenzymprodukte zu finden und werden, in der Abwesenheit von posttranslationalen Produkten auf diese Weise exprimiert.
"Präsequenz" bezieht sich auf eine Signalsequenz von Aminosäuren, die an den N-terminalen Abschnitt der Hydrolase gebunden sind, der an der Ausscheidung der Hydrolase teilnehmen kann. Präsequenzen können auch auf die gleiche Weise wie hier beschrieben modifiziert werden, einschließlich des Einführens vorherbestimmter Mutationen. Wenn es an eine Hydrolase gebunden ist, wird das gegenständliche Protein eine "Prähydrolase". Demgemäß sind Präsubtilisin und Präprosubtilisin für die Zwecke gemäß vorliegender Erfindung relevante Prähydrolase. Prähydrolasen werden durch das Löschen der "pro"-Sequenz (oder zumindest des Abschnitts der Prosequenz, der das Enzym in seinem inaktiven Zustand hält) von einem Präprokodierungsbereich und anschließendes Exprimieren der Prähydrolase geschaffen. Auf diese Weise schneidet der Organismus das aktive und nicht das Proenzym aus.
Die geklonte Carbonylhydrolase wird zum Transformieren einer Wirtszelle verwendet, um die Hydrolase zu exprimieren. Das ist von Interesse, wenn die Hydrolase in ihrer unmodifizierten Form kommerziell eingesetzt wird, wie beispielsweise Subtilisin in Wäschereiprodukten wie oben angeführt. In der bevorzugten Ausführungsform ist das Hydrolasegen in ein Plasmid mit hoher Kopienanzahl ligiert. Dieses Plasmid repliziert in Wirten in dem Sinn, daß es wohlbekannte Elemente enthält, die zur Plasmidreplikation notwendig sind: einen Promotor, der operabel mit dem fraglichen Gen verbunden ist (der als der eigene homologe Promotor des Gens zugeführt werden kann, wenn er vom Wirt erkannt, d. h. transkribiert wird), einen Transkriptionsterminations- und Polyadenylierungsbereich (notwendig für die Stabilität der vom Wirt transkribierten mRNA vom Hydrolasegen), die exogen ist oder vom endogenen Terminatorbereich des Hydrolasegens stammt, und, wünschenswert, ein Selektionsgen wie ein Antibiotikaresistenzgen, das die kontinuierliche Kulturaufrechterhaltung von plasmidinfizierten Wirtszellen durch Wachstum in antibiotikumhältigen Medien ermöglicht. Plasmide mit hoher Kopienanzahl enthalten auch einen Replikationsursprung für den Wirt, wodurch sie es ermöglichen, daß große Zahlen an Plasmiden ohne chromosomale Einschränkungen im Zytoplasma erzeugt werden. Jedoch liegt es im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung, Mehrfachkopien des Hydrolasegens in das Wirtsgenom zu integrieren. Das wird durch Bakterienstämme erleichtert, die besonders zur homologen Rekombination neigen. Die resultierenden Wirtszellen werden als rekombinante Wirtszellen bezeichnet.
Sobald das Carbonylhydrolasegen geklont worden ist, wird eine Anzahl an Modifikationen vorgenommen, um die Verwendung des Gens über die Synthese des Wildtyp- oder Vorläuferenzyms hinaus zu verstärken. Ein Vorläuferenzym ist das Enzym vor seiner Modifizierung wie in dieser Anmeldung beschrieben. Üblicherweise ist der Vorläufer das Enzym wie durch den Organismus exprimiert, der die in Übereinstimmung damit modifizierte DNA spendete. Der Begriff "Vorläufer" ist so zu verstehen, daß damit nicht nahegelegt wird, daß das Produktenzym das Ergebnis der Manipulation des Vorläuferenzyms an sich war.
Bei der ersten dieser Modifikationen kann das Gen aus einem rekombinationspositiven (rec&spplus;) Organismus gelöst werden, der ein homologes Gen enthält. Das wird durch die Rekombination einer in vitro Löschungsmutation des geklonten Gens mit dem Genom des Organismus erreicht. Von vielen Stämme von Organismen wie E.coli und Bacillus ist bekannt, daß sie zur Rekombination fähig sind. Es ist lediglich notwendig, daß die Bereiche der verbleibenden DNA vom Löschungsmutanten mit homologen Bereichen des Kandidatenwirts rekombinieren. Die Löschung kann innerhalb des Kodierungsbereiches liegen (wobei enzymatisch inaktive Polypeptide belassen werden) oder den gesamten Kodierungsbereich einschließen, solange homologe Flankierungsbereiche (wie Promotoren oder Terminationsbereiche) im Wirt bestehen. Die Akzeptierbarkeit des Wirts für Rekombinationslöschungsmutanten wird einfach durch Screenen bezüglich der Löschung des transformierten Phänotyps bestimmt. Das wird im Fall der Carbonylhydrolase am einfachsten erreicht, indem Wirtskulturen einem Assay bezüglich des Verlustes der Fähigkeit zur Spaltung eines chromogenen Substrats unterzogen werden, das ansonsten durch die Hydrolase hydrolysiert wird.
Transformierte Wirte, die die Proteaselöschungsmutanten enthalten, sind zur Synthese von Produkten nützlich, die mit proteolytischen Enzymen inkompatibel sind. Diese Wirte sind per definitionem nicht zum Ausscheiden der hierin beschriebenen gelöschten Proteasen fähig, sind aber im wesentlichen normal sporenbildend. Auch die anderen Wachstumseigenschaften der Transformanten sind im wesentlichen gleich jener der Elternorganismen. Derartige Organismen sind insofern nützlich, als erwartet wird, daß sie vergleichsweise weniger Inaktivierung heterologer Proteine aufweisen als ihre Eltern, und diese Wirte haben Wachstumseigenschaften, die bekannten Organismen mit Proteasemangel überlegen sind. Jedoch entfernt die Löschung von neutraler Protease und Subtilisin, wie in dieser Anmeldung beschrieben, nicht die gesamte proteolytische Wirksamkeit von Bacillus. Es wird angenommen, daß intrazelluläre Proteasen, die üblicherweise nicht extrazellulär ausgeschieden werden, während der späten Phasen der Kultur von den Zellen "auslaufen" oder diffundieren. Diese intrazellulären Proteasen können Subtilisin oder neutrale Protease sein, wie diese Enzyme hierin definiert werden, oder auch nicht. Demgemäß sind die neuen Bacillusstämme hierin unfähig, die Subtilisin- und/oder neutralen Proteaseenzyme auszuscheiden, die üblicherweise extrazellulär in den Elternstämmen ausgeschieden werden. "Unfähig" bedeutet nicht zum Wildtyp revertibel. Die Umkehrung ist eine begrenzte Wahrscheinlichkeit, die bei den bisher bekannten natürlich auftretenden Stämmen mit Proteasedefizienz besteht, da es keine Garantie dafür gibt, daß der Phänotyp derartiger Stämme nicht eine Funktion einer leicht revertiblen Mutation, z. B. einer Punktmutation ist. Das steht im Gegensatz zu den extrem großen Löschungen, die gemäß vorliegender Erfindung geschaffen werden.
Die mit Löschungsmutanten transformierten Wirtszellen gemäß vorliegender Erfindung sind frei von Genen, die für enzymatisch aktive neutrale Protease oder Subtilisin kodieren, welche Gene als diejenigen definiert sind, die im wesentlichen mit den in den Fig. 1, 7 oder 10 dargelegten Genen homolog sind. "Homologe" Gene enthalten Kodierungsbereiche, die zum Hybridisieren unter äußerst strengen Bedingungen mit den in den Fig. 1, 7 oder 10 gezeigten Genen fähig sind.
Die Carbonylhydrolaselöschungsmutanten enthaltenden mikrobiellen Stämme sind in zwei wesentlichen Verfahren nützlich. Bei einer Ausführungsform sind sie vorteilhaft bei der fermentativen Erzeugung von Produkten, die üblicherweise von einem Wirt exprimiert werden, der wünschenswerterweise nicht mit dem Protein verunreinigt ist, für welches das Löschungsgen kodiert. Ein Beispiel ist die fermentative Synthese von Amylase, wo verunreinigende Proteasen bei vielen industriellen Anwendungen für Amylase stören. Die neuen Stämme gemäß vorliegender Erfindung erleichtern teilweise die nach dem Stand der Technik bestehende Erschwerung, derartige Produkte von verunreinigenden Carbonylhydrolasen reinigen zu müssen.
Bei einer zweiten wesentlichen Ausführungsform sind Subtilisin- und neutrale Protease-Löschungsmutantenstämme nützlich für die Synthese von Protein, für das der Stamm ansonsten nicht kodiert. Diese Proteine gehören einer von zwei Klassen an. Die erste Klasse besteht aus Proteinen, für die Gene kodieren, die keine wesentliche Prätransformationshomologie mit jenen des Wirts aufweisen. Dabei kann es sich um Proteine von anderen Prokaryoten handeln, es sind aber üblicherweise eukaryotische Proteine von Hefe oder höheren eukaryotischen Organismen, insbesondere Säugetieren. Die neuen Stämme gemäß vorliegender Erfindung dienen als nützliche Wirte für exprimierbare Vektoren, die Gene enthalten, die für derartige Proteine kodieren, da die Wahrscheinlichkeit für proteolytischen Abbau der exprimierten, nicht-homologen Proteine verringert ist.
Die zweite Gruppe besteht aus Mutantwirtsgenen, die wesentliche Prätransformationshomologie mit jenen des Wirts aufweisen. Diese umfassen Mutationen von prokaryotischen Carbonylhydrolasen wie Subtilisin und neutraler Protease, ebenso wie mikrobielle (Rennin bzw. Chymosin, beispielsweise Rennin vom Genus Mucor). Diese Mutanten werden ausgewählt, um die Eigenschaften des Vorläuferenzyms für industrielle Einsätze zu verbessern.
Es wird ein neues Verfahren geschaffen, um die Konstruktion und Identifizierung derartiger Mutanten zu erleichtern. Zuerst wird das für die Hydrolase kodierende Gen gewonnen und ganz oder teilweise sequenziert. Dann wird die Sequenz bezüglich eines Punktes gescannt, an dem es gewünscht wird, eine Mutation (Löschung, Einfügung oder Substitution) einer oder mehrerer Aminosäuren im exprimierten Enzym durchzuführen. Die diesen Punkt flankierenden Sequenzen werden auf die Gegenwart von Restriktionsstellen untersucht, um ein kurzes Segment des Gens mit einem Oligonukleotidpool zu ersetzen, das, wenn es exprimiert ist, für verschiedene Mutanten kodiert. Da einzelne Restriktionsstellen im allgemeinen nicht an Stellen innerhalb eines zweckmäßigen Abstands vom gewählten Punkt (von 10 bis 15 Nukleotide) vorhanden sind, werden derartige Stellen durch das Substituieren von Nukleotiden im Gen auf solche Weise erzeugt, daß weder der Leserahmen noch die Aminosäuren, für die kodiert wird, in der Endkonstruktion verändert sind. Die Aufgabe des Lokalisierens geeigneter Flankierungsbereiche und des Bewertens der erforderlichen Veränderungen, um zu zwei einzelnen Restriktionsstellensequenzen zu gelangen, wird durch die Redundanz des genetischen Codes, einen Restriktionsenzymplan des Gens und die große Anzahl an verschiedenen Restriktionsenzymen zur Routine. Es ist anzumerken, daß, wenn eine zufällige flankierende einzelne Restriktionsstelle verfügbar ist, das obige Verfahren nur in Verbindung mit dem Flankierungsbereich verwendet werden muß, der keine Stelle enthält.
Die Mutation des Gens um seine Sequenz zu verändern, um der gewünschten Sequenz zu entsprechen, wird durch M13-Primerausdehnung nach allgemein bekannten Verfahren erreicht. Sobald das Gen geklont ist, wird es mit den einzelnen Restriktionsenzymen digeriert, und eine Vielzahl von Endtermini-komplementären Oligonukleotidkassetten wird in die einzelnen Stellen ligiert. Die Mutagenese wird durch dieses Verfahren enorm vereinfacht, weil alle Oligonukleotide synthetisiert werden können, sodaß sie die gleichen Restriktionsstellen aufweisen, und keine synthetischen Linker notwendig sind, um die Restriktionsstellen zu erzeugen.
Die Anzahl an kommerziell verfügbaren Restriktionsenzymen, die Stellen aufweisen, die im interessierenden Gen nicht vorhanden sind, ist im allgemeinen groß. Ein geeignetes DNA-Sequenz-Computersuchprogramm vereinfacht die Aufgabe des Findens potentieller einzelner 5'- und 3'-Flankierungsstellen. Eine primäre Einschränkung besteht darin, daß jede Mutation, die bei der Erzeugung der Restriktionsstelle eingeführt wird, für die endgültige konstruierte Aminosäurekodierungssequenz still sein muß. Für eine Kandidaten-Restriktionsstelle 5' zum Zielkodon muß eine Sequenz im Gen vorhanden sein, die zumindest alle Nukleotide mit Ausnahme von einem in der Erkennungssequenz 5' vom Schnitt des Kandidatenenzyms enthält. Beispielsweise wäre das stumpfe Schnittenzym 5mal (CCC/GGG) ein 5'-Kandidat, wenn eine nahe 5'Sequenz NCC, CNC oder CCN enthielte. Wenn des weiteren N auf C geändert werden müßte, muß diese Veränderung die Aminosäurekodierungssequenz intakt lassen. In Fällen, in denen eine permanente stille Mutation notwendig ist, um eine Restriktionsstelle einzuführen, kann gewünscht sein, die Einführung eines kaum verwendeten Kodons zu vermeiden. Eine ähnliche Situation für SmaI würde für 3'-Flankierungsstellen zutreffen, außer daß die Sequenz NGG, GNG oder GGN existieren muß. Die Kriterien zum Lokalisieren von Kandidatenenzymen sind bei stumpfen Schnittenzymen am lockersten und für 4 Basen-Überhang-Enzyme am strengsten. Im allgemeinen sind viele Kandidatenstellen verfügbar. Für das hierin beschriebene Codon-222-Ziel hätte durch Engineering eine BalI-Stelle (TGG/CCA) in einem Basenpaar 5' von der KpnI-Stelle erzeugt werden können. Eine 3' EcoRV-Stelle (GAT/ATC) hätte 11 Basenpaare 5' von der PstI-Stelle eingesetzt werden können. Eine Kassette, die Termini aufweist, die von einem stumpfen Ende bis hin zu einem Vierbasenüberhang reicht, funktioniert ohne Schwierigkeit. Im Rückblick hätte diese hypothetische EcoRV-Stelle die verwendete Oligonukleotidkassette wesentlich verkürzt (9 und 13 Basenpaare), wodurch größere Reinheit und geringere Poolbiasprobleme erzielt würden. Selbstverständlich sollten Flankierungsstellen ausgewählt werden, die nicht selbst ligieren können, sodaß Ligation der Oligonukleotidkassette in einer einzigen Ausrichtung sichergestellt werden kann.
Die Mutation an sich muß nicht vorherbestimmt werden. Beispielsweise wird eine Oligonukleotidkassette oder ein Fragment zufällig mit Nitrosoguanidin oder anderem Mutagen mutiert und dann wiederum an einer vorherbestimmten Stelle in das Hydrolasegen ligiert.
Die bei der Transformation der geeigneten Wirte exprimierten mutanten Carbonylhydrolasen werden auf Enzyme hin gescreent, welche die gewünschten Eigenschaften aufweisen, z. B. Substratspezifität, Oxidationsbeständigkeit, pH-Aktivitätsprofile und ähnliches.
Eine Veränderung der Substratspezifität wird als eine Differenz zwischen dem Kcat/Km-Verhältnis des Vorläuferenzyms und dem des Mutanten definiert. Das Kcat/Km-Verhältnis ist ein Maß für die katalytische Effizienz. Prokaryotische Carbonylhydrolasen mit erhöhten oder verringerten Kcat/Km-Verhältnissen werden in den Beispielen beschrieben. Im- allgemeinen besteht das Ziel darin, einen Mutanten mit einem höheren (numerisch größeren) Kcat/Km-Verhältnis für ein bestimmtes Substrat sicherzustellen, wodurch ermöglicht wird, daß die Verwendung des Enzyms effizienter auf das Zielsubstrat wirkt. Eine Zunahme des Kcat/Km-Verhältnisses bei einem Substrat kann von einer Verkleinerung des Kcat/Km-Verhältnisses eines weiteren Substrats begleitet sein. Das ist eine Verschiebung der Substratspezifität, und derartige Verschiebungen aufweisende Mutanten finden Verwendung, wenn die Vorläufer unerwünscht sind, z. B. um ungewünschte Hydrolyse eines speziellen Substrats in einer Mischung von Substraten zu verhindern.
Kcat und Km werden nach bekannten Verfahren oder wie in Beispiel 18 beschrieben gemessen.
Oxidationsbeständigkeit ist ein weiteres Ziel, das durch in den Beispielen beschriebene Mutanten erreicht wird. Die Beständigkeit kann erhöht oder verringert werden, wie das für verschiedene Anwendungen gewünscht wird. Verstärkte Beständigkeit wird durch das Löschen eines oder mehrerer Methionin-, Tryptophan-, Cystein- oder Lysinreste und wahlweise das Substituieren eines anderen Aminosäurerests durch keinen aus Methionin, Tryptophan, Cystein oder Lysin, bewirkt. Die entgegengesetzten Substitutionen führen zu verringerter Oxidationsbeständigkeit. Der substituierte Rest ist vorzugsweise Alanyl, aber neutrale Reste sind ebenfalls geeignet.
Es werden Mutanten geschaffen, die modifizierte pH-Aktivitätsprofile aufweisen.
Ein pH-Aktivitätsprofil ist ein Diagramm von pH-Wert gegenüber Enzymaktivität und kann wie in Beispiel 19 dargestellt oder nach Verfahren nach dem Stand der Technik konstruiert werden. Es kann gewünscht sein, Mutanten mit breiteren Profilen zu erhalten, d. h. jene, die bei einem bestimmten pH-Wert größere Aktivität aufweisen als der Vorläufer, aber bei jedem beliebigen pH-Wert keine merklich größere Aktivität, oder Mutanten mit spitzeren Profilen, d. h. jene, die an einem bestimmten pH-Wert im Vergleich zum Vorläufer eine stärkere Aktivität aufweisen, aber sonstwo geringere Aktivität.
Die vorangehenden Mutanten werden vorzugsweise innerhalb der aktiven Stelle des Enzyms gebildet, da diese Mutationen die Aktivität am wahrscheinlichsten beeinflussen. Jedoch sind Mutationen an anderen für die Enzymstabilität oder Struktur wichtigen Stellen nützlich. Im Fall von Bacillus subtilisin oder seiner prä- präpro- und pro-Formen erzeugen Mutationen an Tyrosin-1, Aspartat+32, Asparagin+155, Tyrosin+104, Methionin+222, Glycin+166, Histidin+64, Glycin+169, Phenylalanin+189, Serin+33, Serin+221, Tyrosin+217, Glutamat+156 und/oder Alanin+152 Mutanten, die Veränderungen in den oben beschriebenen Eigenschaften oder bei der Verarbeitung des Enzyms aufweisen. Es ist festzustellen, daß diese Aminosäurepositionszahlen diejenigen sind, die B.amyloliquefaciens-Subtilisin wie aus Fig. 7 zu sehen zugeschrieben werden. Es sollte verstanden werden, daß eine Löschung oder Einfügung in der N-terminalen Richtung von einer bestimmten Position die relativen Aminosäurepositionen verschieben wird, sodaß ein Rest nicht seine ursprüngliche oder Wildtyp- numerische Position einnimmt. Auch allelische Unterschiede und die Variation unter verschiedenen prokaryotischen Spezien führt zu Positionsverschiebungen, sodaß Position 169 in derartigen Subtilisinen nicht von Glycin eingenommen wird. In solchen Fällen wird angenommen, daß die neuen Positionen äquivalent zu den und eingeschlossen innerhalb der Bezeichnung Glycin+169 sind. Die neue Position für Glycin+169 wird leicht durch Scannen des fraglichen Subtilisins in bezug auf einen zu Glycin+169 in Fig. 7 homologen Bereich identifiziert.
Einer oder mehrere, üblicherweise bis zu etwa 10, Aminosäurereste können mutiert werden. Jedoch gibt es, abgesehen von der kommerziellen Durchführbarkeit, keine Einschränkung für die Anzahl an Mutationen, die zu machen sind.
Die Enzyme gemäß vorliegender Erfindung können als Salze erhalten werden. Es ist klar, daß der Ionisierungszustand eines Proteins vom pH-Wert des umgebenden Mediums abhängt, wenn es sich in Lösung befindet, oder der Lösung, aus der es hergestellt ist, wenn es in fester Form vorliegt. Saure Proteine werden üblicherweise als beispielsweise Ammonium-, Natrium- oder Kaliumsalze hergestellt; basische Proteine als Chloride, Sulfate oder Phosphate. Demgemäß umfaßt die vorliegende Anmeldung sowohl elektrisch neutrale als auch Salzformen der genannten Carbonylhydrolasen, und der Begriff Carbonylhydrolase bezieht sich auf das organische strukturelle Rückgrat, unabhängig vom Ionisierungszustand.
Die Mutanten sind besonders nützlich auf den Gebieten der Nahrungsmittelverarbeitung und Reinigung. Die Carbonylhydrolasen einschließlich Mutanten werden durch Fermentation wie hierin beschrieben erzeugt und nach geeigneten Techniken gewonnen. Siehe beispielsweise K.Anstrup, 1974, "Industrial Aspects of Biochemistry", Hrsg.B.Spencer S.23-46. Sie werden nach an sich bekannten Verfahren, zur Verwendung in gewerblichen bzw. industriellen Prozessen, insbesondere zum Wäschewaschen, mit Waschmitteln oder anderen Tensiden formuliert. Im Fall des Wäschewaschens werden die Enzyme mit Waschmitteln, Buildern, Bleich- und/oder fluoreszierenden Weißmachern kombiniert, wie nach dem Stand der Technik für proteolytische Enzyme bekannt.
Geeignete Waschmittel umfassen lineare Alkylbenzolsulfonate, alkyläthoxylierte Sulfate, sulfatierten linearen Alkohol oder äthoxylierten linearen Alkohol. Die Zusammensetzungen können als Granulat oder Flüssigkeit formuliert werden. Siehe beispielsweise die US-Patente 3,623,957; 4,404,128; 4,381,247; 4,404,115; 4,318,818; 4,261,868; 4,242,219; 4,142,999; 4,111,855; 4,011,169; 4,090,973; 3,985,686; 3,790,482; 3,749,671; 3,560,392; 3,558,498; und 3,557,002.
Die folgende Offenbarung soll als Darstellung von Ausführungsformen gemäß vorliegender Erfindung dienen und nicht als den Schutzumfang dieser Anmeldung einschränkend betrachtet werden.

Glossar der experimentellen Manipulationen

Um die Beispiele zu vereinfachen, werden bestimmte häufig vorkommende Verfahren mit kürzelhaften Phrasen bezeichnet.
Plasmide werden mit einem kleinen p bezeichnet, dem Großbuchstaben und/oder Zahlen vorangehen und/oder folgen. Die Ausgangsplasmide gemäß vorliegender Erfindung sind im Handel erhältlich, auf uneingeschränkter Basis erhältlich oder können aus derartigen verfügbaren Plasmiden nach veröffentlichten Verfahren konstruiert werden.
"Klenow-Behandlung" bezieht sich auf ein Verfahren, bei dem ein eine Ausnehmung aufweisendes 3'-Ende doppelstrangiger DNA mit Desoxyribonukleotiden gefüllt wird, die zu den Nukleotiden komplementär sind, die das vorragende 5'-Ende des DNA-Stranges bilden. Dieses Verfahren wird üblicherweise verwendet, um ein Ende mit Ausnehmung zu füllen, das aus einer Restriktionsenzymspaltung von DNA resultiert. Das erzeugt ein stumpfes oder ebenes Ende, wie es für weitere Ligierungen erforderlich sein kann. Die Behandlung mit Klenow wird durch das Umsetzen (im allgemeinen für 15 Minuten bei 15ºC) der geeigneten komplementären Desoxyribonukleotide mit der DNA erreicht, die unter der katalytischen Wirksamkeit (üblicherweise 10 Einheiten) des Klenow-Fragments von E.coli DNA-Polymerase I ("Klenow") auszufüllen ist. Klenow und die anderen erforderlichen Reagenzien sind im Handel erhältlich. Das Verfahren ist ausgiebig veröffentlicht worden. Siehe beispielsweise T.Maniatis et al., 1982, "Molecular Cloning", S.107-108.
"Digestion" von DNA bezieht sich auf die katalytische Spaltung der DNA mit einem Enzym, das nur an bestimmten Positionen in der DNA wirkt. Derartige Enzyme werden als Restriktionsenzyme bezeichnet, und die Stellen, für die jedes spezifisch ist, werden Restriktionsstellen genannt. "Teilweise" Digestion bezieht sich auf die unvollständige Digestion durch ein Restriktionsenzym, d. h. es werden Bedingungen gewählt, die zur Spaltung einiger, aber nicht aller der Stellen für eine bestimmte Restriktionsendonuklease in einem DNA-Substrat führen. Die verschiedenen gemäß vorliegender Erfindung verwendeten Restriktionsenzyme sind im Handel erhältlich, und ihre Reaktionsbedingungen, Kofaktoren und anderen Erfordernisse wurden wie von den Enzymzulieferern festgelegt eingesetzt. Restriktionsenzyme werden üblicherweise mit Abkürzungen bezeichnet, die aus einem Großbuchstaben gefolgt von anderen Buchstaben und dann im allgemeinen einer Zahl bestehen, die den Mikroorganismus darstellt, von dem jedes Restriktionsenzym ursprünglich erhalten wurde. Im allgemeinen wird etwa 1 ug Plasmid oder DNA-Fragment mit etwa 1 Einheit Enzym in etwa 20 ul Pufferlösung verwendet. Geeignete Puffer- und Substratmengen für bestimmte Restriktionsenzyme sind vom Hersteller angegeben. Inkubationszeiten von etwa 1 Stunde bei 37ºC werden üblicherweise verwendet, können aber nach den Anweisungen der Zulieferer variieren. Nach der Inkubation wird Protein durch Extraktion mit Phenol und Chloroform entfernt, und die digerierte Nukleinsäure wird von der wässerigen Fraktion durch Ausfällung mit Äthanol gewonnen. Der Digestion mit einem Restriktionsenzym folgt selten Hydrolyse der terminalen 5'-Phosphate mit bakterieller alkalischer Phosphatase, um die beiden restriktionsgespaltenen Enden eines DNA-Fragments am "Zirkularisieren" oder Bilden einer geschlossenen Schleife zu hindern, die die Einfügung eines weiteren DNA-Fragments an der Restriktionsstelle behindern würde. Wenn nicht anders angegeben, folgt der Digestion von Plasmiden keine 5'-terminale Dephosphorylierung. Zur Dephosphorylierung werden herkömmliche Verfahren und Reagenzien eingesetzt (T.Maniatis et al., Id., S.133-134).
Mit "Gewinnung" oder "Isolierung" eines bestimmten Fragments von DNA aus einem Restriktionsdigest ist Trennung des Digests auf 6%-Polyacrylamidgelelektrophorese, Identifizierung des interessierenden Fragments durch das Molekulargewicht (wobei DNA-Fragmente mit bekanntem Molekulargewicht als Markierungen verwendet werden), das Entfernen des Gelabschnitts, der das gewünschte Fragment enthält, und Trennung des Gels von DNA gemeint. Dieses Verfahren ist allgemein bekannt. Siehe beispielsweise R.Lawn et al., 1981, "Nucleic Acids Res." 9 : 6103-6114, und D.Goeddel et al., (1980) "Nucleic Acids Res." 8 : 4057.
"Southern-Analyse" ist ein Verfahren, bei dem die Gegenwart von DNA-Sequenzen in einem Digest oder einer DNA-hältigen Zusammensetzung durch Hybridisierung mit einem bekannten, markierten Oligonukleotid oder DNA-Fragment bestätigt wird. Für den Zweck der vorliegenden Erfindung soll mit Southern-Analyse die Trennung von Digesten auf 1%-Agarose und die Reinigung wie von G. Wahl et al., 1979, "Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A." 76 : 3683-3687 beschrieben, Übertragung auf Nitrozellulose nach dem Verfahren von E.Southern, 1975, "J.Mol.Biol." 98 : 503-517, und Hybridisierung, wie von T.Maniatis et al., 1978, "Cell" 15 : 687-701 beschrieben, gemeint sein.
"Transformation" bedeutet das Einführen von DNA in einen Organismus, sodaß die DNA replizierbar ist, entweder als extrachromosomales Element oder chromosomaler Integrant. Wenn nicht anders angegeben, ist das hierin zur Transformation von E.coli verwendete Verfahren das CaCl&sub2;-Verfahren von Mandel et al., 1970, "J.Mol.Biol." 53 : 154, und für Bacillus das Verfahren von Anagnostopolous et al., 1961, "J.Bact." 81 : 791-746.
"Ligation" bezieht sich auf ein Verfahren zum Bilden von Phosphodiesterbindungen zwischen zwei doppelstrangigen Nukleinsäurefragmenten (T.Maniatis et al., Id., S.146). Wenn nicht anders angegeben, wurde Ligation unter Verwendung bekannter Puffer und Bedingungen mit 10 Einheiten T4-DNA-Ligase ("Ligase") pro 0,5 ug etwa äquimolarer Mengen der zu ligierenden DNA-Fragmente erreicht. Plasmide von den Transformanten wurden hergestellt, durch Restriktionsmapping analysiert und/oder nach dem Verfahren von Messing et al., 1981 "Nucleic Acids Res.", 9 : 309 sequenziert.
"Herstellung" von DNA aus Transformanten bedeutet das Isolieren von Plasmid-DNA von mikrobieller Kultur. Wenn nicht anders angegeben, wurde das alkalische/SDS-Verfahren von Maniatis et al., Id. S.90 verwendet.
"Oligonukleotide" sind ein- oder doppelstrangige Polydesoxynukleotide mit geringer Länge, die nach dem Verfahren von Crea et al., 1980, "Nucleic Acids Res." 8 : 2331-2348 chemisch synthetisiert wurden (mit der Ausnahme, daß Mesitylennitrotriazol als ein Kondensierungsmittel verwendet wurde), und dann auf Polyacrylamidgels gereinigt wurden.
Alle Literaturzitate sind ausdrücklich durch Verweis eingeschlossen.

Beispiel 1

Herstellung einer genomischen DNA-Sammlung von B.Amyloliquefaciens und Isolierung ihres Subtilisingens

Die bekannte Aminosäuresequenz des extrazellulären B.amyloliquefaciens ermöglicht die Konstruktion einer geeigneten Sondenmischung. Die Sequenz des reifen Subtilisin ist (gemeinsam mit der zusätzlichen Information, welche die vorliegende Arbeit beiträgt) in Fig. 1 enthalten. Jeder Kodondoppelsinn für die Sequenz aus Aminosäuren an den Positionen 117 bis 121 wird durch einen Pool aus acht Oligonukleotiden mit der Sequenz
abgedeckt.
Aus B.amyloliquefaciens (ATCC Nr. 23844) isolierte chromosomale DNA, wie von J.Marmur, "J.Mol.Biol." 3 : 208 beschrieben, wurde teilweise durch Sau 3A digeriert und die Fragmente nach Größe ausgewählt und in die BamH 1-Stelle von dephosphoryliertem pBS42 ligiert (pBS42 ist ein Shuttlevektor, der Replikationsursprünge enthält, die sowohl in E.coli als auch Bacillus wirksam sind. Er wird wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt.) Die Sau3A-Fragment enthaltenden Vektoren wurden nach dem Verfahren von M.Mandel et al., 1970, "J.Mol.Bio." 53 : 154 in E.coli K12-Stamm 294 (ATCC Nr. 31446) transformiert, wobei 80-400 Nanogramm Sammlungs-DNA pro 250 ul kompetenter Zellen verwendet wurden.
Zellen von der Transformationsmischung wurden mit einer Dichte von 1-5 · 10³ Transformanten pro 150 mm Platte, die LB-Medium + 12,5 ug/ml Chloramphenicol enthielt, plattiert und über Nacht bei 37ºC gezüchtet, bis sichtbare Kolonien erschienen. Die Platten wurden dann auf BA85-Nitrozellulosefilter replikaplattiert, die über LB/Chloramphenicolplatten gelegt waren. Die Replikaplatten wurden 10-12 Stunden bei 37ºC gezüchtet und die Filter auf frische Platten übertragen, die LB und 150 ug/ml Spectinomycin enthielten, um den Plasmidpool zu erweitern.
Nach Inkubation über Nacht bei 37ºC wurden die Filter im wesentlichen wie von Grunstein und Hogness, 1975, "Proc.Natl .Acad.Sci.(USA)"72 : 3961 beschrieben bearbeitet. Unter etwa 20 000 erfolgreichen Transformanten wurden 25 positive Kolonien festgestellt. Von acht dieser Positiven wurden Abstriche gemacht, um einzelne Klone zu reinigen. 24 Klone von jedem Abstrich wurden in Mikrotiternäpfchen gezüchtet, auf zwei Replikafilter geprägt und wie oben beschrieben mit entweder
(Pool 1) oder
(Pool 2) sondiert, die sich nur durch ein Nukleotid unterscheiden. Wie in Fig. 2 gezeigt, hybridisierte Pool 1 in einem viel größeren Ausmaß mit allen positiven Klonen als Pool 2, was auf spezifische Hybridisierung hindeutet.
Vier von fünf Miniplasmidpräparaten (Maniatis et al., Id.) von positiven Klonen ergaben identische Restriktionsdigestmuster, wenn sie mit Sau3A oder HincII digeriert wurden. Das von einer dieser vier identischen Kolonien nach dem Verfahren von Maniatis et al., Id., isolierte Plasmid wies die gesamte korrekte Gensequenz auf und wurde als pS4 bezeichnet. Die Eigenschaften dieses Plasmids wie durch Restriktionsanalyse bestimmt werden in Fig. 3 gezeigt.

Beispiel 2

Expression des Subtilisingens

Bacillus subtilis I-168 (Katalognr. 1-A1, Bacillus Genetic Stock Center) wurde mit pS4 transformiert und ein einzelner chloramphenicolresistenter Transformant dann in Minimalmedium gezüchtet. Nach 24 Stunden wurde die Kultur zentrifugiert und sowohl der Überstand (10-200 ul) als auch das Pellet auf proteolytische Wirkung hin untersucht, indem die Veränderung der dekadischen Extinktion pro Minute bei 412 nm unter Verwendung von 1 ml chromogenem Substrat Succinyl-L-ala-ala-pro-phe-p-nitroanilid (0,2 uM) in 0,1M Natriumphosphat (pH 8,0) bei 25ºC gemessen wurde. Eine mit pBS42 transformierte B.subtilis I-168-Kultur, die als eine Kontrolle verwendet wurde, wies weniger als 1/200 der Wirksamkeit auf, die die pS4-transformierte Kultur zeigte. Mehr als 95 Prozent der Proteaseaktivität der pS4-Kultur war im Überstand vorhanden und wurde vollständig durch die Behandlung mit Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), aber nicht durch EDTA gehemmt.
Aliquote der Überstände wurden mit PMSF und EDTA behandelt, um die gesamte Proteasewirksamkeit zu hemmen und durch 12% SDS-PAGE nach dem Verfahren von Laemmli, U.K. 1970 "Nature", 227 : 680 analysiert. Um die Überstände herzustellen, wurden 16 uL Überstand mit ImM PMSF, 10 mM EDTA 10 Minuten lang behandelt und mit 4 uL 5x konzentriertem SDS-Probepuffer minus β-Mercaptoäthanol gekocht. Die Ergebnisse der Coomassie-Färbung auf Versuche unter Verwendung von Überständen von mit pS4, pBS42 transformierten Zellen und untransformiertem B.amyloliquefaciens werden in Fig. 4 gezeigt. Bahn 3 zeigt authentisches Subtilisin von B.amyloliquefaciens. Bahn 2, die der Überstand von pBS42-transformiertem B.subtilis ist, ergibt nicht das Subtilisin zugeordnete 31 000 MW-Band, das Bahn 1 von pS4-transformierten Wirten aufweist. Das etwa 31 000 MW-Band-Ergebnis für Subtilisin ist charakteristisch für die langsamere Mobilität, die bekannte M.W. 27 500 Subtilisinpräparate im allgemeinen zeigen.

Beispiel 3

Sequenzieren des B.amyloliquefaciens Subtilisingens

Die gesamte Sequenz eines EcoRI-BamHI-Fragments (worin die EcoRI-Stelle durch Umwandlung der HincII-Stelle konstruiert wurde) von pS4 wurde nach dem Verfahren von F.Sanger, 1977, "Proc.Natl.Acad.Sci (USA)", 74 : 5463 bestimmt. Auf den in Fig. 3 gezeigten Restriktionsplan Bezug nehmend wurde durch Southern-Analyse festgestellt, daß das BamHI-PvuII-Fragment mit Pool 1 Oligonukleotiden hybridisiert. Durch das Sequenzieren dieses Fragments erhaltene Daten leiteten das Sequenzieren der verbleibenden Fragmente (z. B. PvuII-HincII und AvaI-AvaI). Die Ergebnisse werden in Fig. 1 gezeigt.
Die Untersuchung der Sequenz bestätigt die Gegenwart von Kodonen für das reife Subtilisin, das dem von B.amyloliquefaciens ausgeschiedenen entspricht. Unmittelbar stromaufwärts von dieser Sequenz befindet sich eine Reihe aus 107 Kodonen, die mit dem GTG-Startkodon bei -107 beginnt. Kodon -107 bis etwa Kodon -75 kodiert für eine Aminosäuresequenz, deren Eigenschaften denen bekannter Signalsequenzen entsprechen. (Die meisten derartigen Signalsequenzen sind 18-30 Aminosäuren lang, weisen hydrophobe Kerne auf und enden in einer kleinen hydrophoben Aminosäure.) Demgemäß würde die Untersuchung der Sequenzdaten darauf hinweisen, daß die Kodone -107 bis etwa -75 für die Signalsequenz kodieren; die verbleibenden dazwischenliegenden Kodone zwischen -75 und -1 kodieren vermutlich für eine Prosequenz.

Beispiel 4

Konstruktion von pBS42

pBS42 wird durch Dreiwegligierung von Fragmenten gebildet, die von pUB110, pC194 und pBR322 abgeleitet sind (siehe Fig. 5). Das Fragment von pUB110 ist das etwa 2600 Basenpaar-Fragment zwischen der HpaII-Stelle bei 1900 und der BamH1-Stelle bei 4500 und enthält einen in Bacillus operablen Replikationsursprung: T.Grycztan et al., 1978 "J.Bacteriol." 134 : 318(1978); A.Jalanko et al., 1981 "Gene", 14 : 325. Die BamHI-Stelle wurde mit Klenow getestet. Der pBR322 Abschnitt ist das 1100 Basenpaar-Fragment zwischen der PvuII-Stelle bei 2067 und der Sau3A-Stelle bei u. 3223, das den E.coli Replikationsursprung enthält: F.Bolivar et al., 1977 "Gene", 2: 95; J.Sutcliffe, 1978, "Cold Spring Harbor Symposium"43: I, 77. Das pC194 Fragment ist das 1200 Basenpaarfragment zwischen der HpaII-Stelle bei 973 und der Sau3A-Stelle bei 2006, das das Gen für Chloramphenicolresistenz enthält, das sowohl in E.coli als auch B.subtilis exprimierbar ist: S.Ehrlich, "Proc.Natl.Acad.Sci. (USA)", 74 : 1680; S.Horynuchi et al., 1982, "J.Bacteriol." 150 : 815.
pBS42 enthält somit Replikationsursprünge, die sowohl in E.coli als auch in Bacillus operabel sind, und ein exprimierbares Gen für Chloramphenicolresistenz.

Beispiel 5

Isolieren und Sequenzieren des B.subtilis-Subtilisingens

B.subtilis 1168 chromosomale DNA wurde mit EcoRI digeriert und die Fragmente auf Gelelektrophorese hin wieder gelöst. Ein einzelnes 6 kb-Fragment hybridisierte mit einem [α-³²P]CTP-Kerbentranslations-markiertes Fragment, das vom C-Terminus des strukturellen Subtilisingens in pS4 wie oben beschrieben erhalten wurde. Das 6 kb-Fragment wurde elektroeluiert und in pBS42 ligiert, das mit EcoRI digeriert und mit bakterieller alkalischer Phosphatase behandelt worden war. E.coli ATCC 31446 wurde mit der Ligationsmischung transformiert und Transformanten durch Wachstum auf LB-Agar ausgewählt, das 12,5 ug Chloramphenicol/ml enthielt. Plasmid-DNA wurde aus einer gepoolten Suspension aus 5 000 transformierten Kolonien hergestellt. Diese DNA wurde in B.subtilis BG84 transformiert, einen Stamm mit Proteasemangel, dessen Herstellung in Beispiel 8 unten beschrieben wird. Kolonien, die Protease erzeugten, wurden durch Plattieren auf LB-Agar plus 1,5 Gew.-Prozent Carnation fettfreie Pulvermagermilch und 5 ug Chloramphenicol/ml (in der Folge als Magermilchselektionsplatten bezeichnet) und Beobachtung bezüglich freier Zonen gescreent, die ein Anzeichen für proteolytische Wirksamkeit sind.
Plasmid-DNA wurde aus Protease erzeugenden Kolonien hergestellt, mit EcoRI digeriert und durch Southern-Analyse auf die Gegenwart der 6 kb EcoRI-Einfügung durch Hybridisierung mit dem ³²P-markierten C-Terminusfragment des strukturellen Subtilisingens von B.amyloliquefaciens untersucht. Ein positiver Klon wurde identifiziert, und das Plasmid wurde als pS168.1 bezeichnet. B.subtilis BG84 transformiert mit pS168.1 schied Serinprotease in einem Ausmaß vom Fünffachen gegenüber der in B.subtilis 1168 erzeugten aus. Das Hinzufügen von EDTA zu den Überständen beeinflußte die Assayergebnisse nicht, aber das Hinzufügen von PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) zu den Überständen verringerte die Proteasewirksamkeit auf Ausmaße, die in dem in Beispiel 8 für Stamm BG84 beschriebenen Assay nicht nachweisbar sind.
Ein Restriktionsplan der 6,5 kb EcoRI-Einfügung wird in Fig. 6 gezeigt. Das Subtilisingen wurde durch Subklonen verschiedener Restriktionsenzymdigeste und Testen in bezug auf Expression von Subtilisin in B.subtilis BG84 auf innerhalb des 2,5 kb KpnI-EcoRI-Fragments lokalisiert. Southern-Analyse mit dem markierten Fragment vom C-Terminus des B.amyloliquefaciens Subtilisingens als eine Sonde lokalisierte den C-Terminus des B.subtilis-Gens auf innerhalb des oder einen Teil des 631 bp HincII-Fragments B im Zentrum dieses Subklons (siehe Fig. 6). Die Tandem HincII-Fragmente B, C und D und das HincII-EcoRI-Fragment E (Fig. 6) wurden in die M13-Vektoren mp8 oder mp9 ligiert und auf bekannte Weise sequenziert (J.Messing et al., 1982, "Gene" 19 : 209-276), wobei Didesoxykettentermination verwendet wurde (F.Sanger et al., 1977, "Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A." 74 : 5463-5467). Die Sequenz dieses Bereiches wird in Fig. 7 gezeigt. Es wird angenommen, daß die ersten 23 Aminosäuren ein Signalpeptid sind. Die verbleibenden 83 Aminosäuren zwischen der Signalsequenz und der reifen Kodierungssequenz stellen die mutmaßliche "pro-"Sequenz dar. Es wird angenommen, daß die überstrichenen Nukleotide am 3'-Ende des Gens Transkriptionsterminatorbereiche sind. Zwei mögliche Shine-Dalgarno-Sequenzen sind stromaufwärts vom reifen Startkodon unterstrichen.

Beispiel 6

Herstellung einer inaktivierenden Mutation des B.subtilis-Subtilisingens

Eine in Fig. 8 gezeigte zweistufige Ligierung war erforderlich, um ein Plasmid zu konstruieren, das ein fehlerhaftes Gen trägt, das in das Bacillus-Chromosom integrieren würde. Im ersten Schritt wurde pS168.1, das die 6,5 kb Einfügung enthielt, die ursprünglich von der genomischen B.subtilis-Sammlung gewonnen wurde, wie in Beispiel 5 oben beschrieben, mit EcoRI digeriert, die Reaktionsprodukte mit Klenow behandelt, die DNA mit HincII digeriert, und das 800 bp EcoRI-HincII-Fragment E (siehe Fig. 6) das teilweise das 5'-Ende des B.subtilis-Subtilisingens enthält, wurde gewonnen. Dieses Fragment wurde in pJH101 ligiert (pJH101 ist von J.Hoch (Scripps) erhältlich und wird von F.A.Ferrari et al., 1983, "J.Bact." 134 : 318-329 beschrieben), das mit HincII digeriert und mit bakterieller alkalischer Phosphatase behandelt worden war. Das resultierende Plasmid, pIDV1 enthielt Fragment E in der in Fig. 8 gezeigten Ausrichtung. Im zweiten Schritt wurde pS168.1 mit HincII digeriert, und das 700 bp HincII-Fragment B, das das 3'-Ende des Subtilisingens enthält, wurde gewonnen. pIDV1 wurde an seiner einzigen HincII-Stelle digeriert und Fragment B an das linearisierte Plasmid ligiert, in E.coli ATCC 31,446 transformiert und auf LB-Platten ausgewählt, die 12,5 ug Chloramphenicol/ml oder 20 ug Ampicillin/ml enthielten. Ein resultierendes Plasmid, das als pIDV1.4 bezeichnet wurde, enthielt Fragment B in der korrekten Ausrichtung bezogen auf Fragment E. Dieses in Fig. 8 gezeigte Plasmid pIDV1.4 ist ein Löschungsderivat des Subtilisingens, das auch Abschnitte der 5'- und 3'-Flankierungssequenzen enthält.
B.subtilis BG77, ein in Beispiel 8 unten hergestellter teilweiser proteasedefizienter Mutant (Prt&spplus;/&supmin;)wurde mit pIDV1.4 transformiert. Zwei Klassen Chloramphenicol-resistenter (Cmr) Transformanten wurden erhalten. 75% zeigten das gleiche Ausmaß an Proteasen wie BG77 (Prt&spplus;/&supmin;) und 25 % wiesen fast vollständige Proteasedefizienz (Prt&supmin;) auf, wie durch relative Zonen mit freien Stellen auf Platten beobachtet, die LB-Agar plus Magermilch enthielten. Die Cmr Prt&supmin;-Transformanten konnten nicht auf eine einzelne Kreuzungsintegration des Plasmids an den homologen Bereichen für Fragment E oder B zurückzuführen sein, da das Gen in einem solchen Fall ununterbrochen sein würde und der Phänotyp Prt&spplus;/&supmin; wäre. Tatsächlich wurde der Phänotyp mit Proteasemangel nicht beobachtet, wenn entweder das Fragment E oder B unabhängig in pJH101 ligiert und daraufhin in B.subtilis BG77 transformiert wurde. Der Cmr-Phänotyp von CmrPrt&supmin; pIDV1.4-Transformanten war insofern instabil, als CmsPrt&supmin;-Derivate von CmrPrt&supmin;-Kulturen mit einer Häufigkeit von etwa 0,1% nach 10 Generationen Wachstum in Minimalmedium in der Abwesenheit von antibiotischer Selektion isoliert werden konnten. Ein derartiges Derivat wurde erhalten und als BG2018 bezeichnet. Die Löschung wurde durch PBS1-Transduktion in IA84 (einen BGSC-Stamm, der zwei auxotrophische Mutationen trägt, die das Subtilisingen flankieren) übertragen. Der Derivatorganismus wurde als BG2019 bezeichnet.

Beispiel 7

Herstellung einer genomischen DNA-Sammlung aus B.subtilis und Isolierung ihres neutralen Proteasegens

Die teilweise Aminosäuresequenz einer neutralen Protease von B.subtilis wird von P.Levy et al., 1975, "Proc.Nat.Acad.Sci.USA" 72 : 4341-4345 geoffenbart. Es wurde ein Bereich des Enzyms (Asp Gln Met Ile Tyr Gly) aus dieser veröffentlichten Sequenz ausgewählt, in der die geringste Redundanz in den möglichen Kodonen für die Aminosäuren in dem Bereich existierte. 24 Kombinationen waren notwendig, um alle möglichen Kodierungssequenzen abzudecken, wie unten beschrieben.
Vier Pools wurden wie oben in Beispiel 1 hergestellt, von denen jeder sechs Alternativen enthielt. Die Pools wurden durch Phosphorylierung mit [γ-³²P]ATP markiert.
Der markierte Pool, der Sequenzen enthielt, die einer einzigen Sequenz in einem B.subtilis-Genom am besten entsprachen, wurde ausgewählt durch Digerieren von B.subtilis (1A72, Bacillus Genetic Stock Center)-DNA mit verschiedenen Restriktionsenzymen, Trennen der Digeste auf einem Elektrophoresegel und Hybridisieren eines jeden der vier Sondenpools mit jedem der geblotteten Digeste unter zunehmend strengen Bedingungen, bis zu sehen war, daß ein einzelnes Band hybridisierte. Zunehmend strenge Bedingungen sind solche, die dazu neigen, Hybridisierung zu erschweren, z. B. Zunahmen der Formamidkonzentration, Abnahmen der Salzkonzentration und Temperaturerhöhungen. Bei 37ºC in einer Lösung aus 5X Denhardt's, 50 SSC, 50 mM NaPO&sub4;, pH 6,8 und 20 % Formamid würde nur Pool 4 an ein geblottetes Digest hybridisieren. Diese wurden als die richtigen Hybridisierungsbedingungen ausgewählt, die für das neutrale Proteasegen zu verwenden waren, und Pool 4 wurde als die Sonde verwendet.
Eine Lambda-Sammlung von B.subtilis-Stamm BGSC 1-A72 wurde auf herkömmliche Weise durch teilweises Digerieren der genomischen Bacillus-DNA durch Sau3A, Trennung des teilweisen Digests nach Molekulargewicht auf einem Elektrophoresegel, Eluierung der 15-20 kb-Fragmente (R.Lawn et al., 1981, "Nucleic Acids Res." 9 : 6103-6114) und Ligierung der Fragmente an BamHI-digerierten Charon-30-Phagen unter Verwendung eines Packagene-Sets von Promega Biotec hergestellt.
E.coli DP50supF wurde als der Wirt für die Phagensammlung verwendet, obwohl jeder bekannte Wirt für Charon-Lambda-Phage zufriedenstellend ist. Der E.coli-Wirt wurde mit dem Sammlungsphagen plattiert und kultiviert, und danach wurden die Platten durch Transfer auf Nitrozellulose und Screenen mit Sondenpool 4 auf die Gegenwart des neutralen Proteasegens hin untersucht (Benton und Davis, 1977 "Science" 196 : 180-182). Positive Platten wurden durch zwei Runden Einzelplattenreinigung gereinigt, und zwei Platten, als λNPRG1 und λNPRG2 bezeichnet, wurden für weitere Untersuchung ausgewählt. DNA wurde aus jedem Phagen durch Restriktionsenzymhydrolyse und Trennung auf Elektrophoresegels hergestellt. Die getrennten Fragmente wurden geblottet und an markierte Pool 4-Oligonukleotide hybridisiert. Das offenbarte, daß λNPRG1 ein 2400 bp HindIII-Hybridisierungsfragment, aber kein 4300 EcoRI-Fragment enthielt, während λNPRG2 ein 4300 bp EcoRI-Fragment, aber kein 2400 bp HindIII-Fragment enthielt.
Das 2400 bp λNPRG1-Fragment wurde nach dem folgenden Verfahren in die HindIII-Stelle von pJH101 subgeklont. λNPRG1 wurde durch HindIII digeriert, das Digest durch Elektrophorese fraktioniert und das 2400 bp-Fragment vom Gel gewonnen. Das Fragment wurde an mit alkalischer Phosphatase behandeltes HindIII-digeriertes pJH101 ligiert und die Ligationsmischung verwendet, um E.coli ATCC 31446 nach dem Kalziumchloridschockverfahren von V.Hershfield et al., 1974, "Proc.Nat.Acad.Sci.(U.S.A.)" 79 : 3455-3459 zu transformieren. Transformanten wurden durch Auswählen von Kolonien identifiziert, die zum Wachstum auf Platten fähig sind, die LB-Medium plus 12,5 ug Chloramphenicol/ml enthielten.
Transformantenkolonien ergaben mehrere Plasmide. Die Ausrichtung des 2400 bp-Fragments in jedem Plasmid wurde durch herkömmliche Restriktionsanalyse bestimmt (Ausrichtung im Sinne der Lese- oder transkriptionalen Richtung des Genfragments in Beziehung zur Leserichtung des Expressionsvektors, in den es ligiert ist). Zwei Plasmide mit entgegengesetzten Ausrichtungen wurden erhalten und als pNPRsubH6 und pNPRsubH1 bezeichnet.
Das 4300 bp EcoRI-Fragment von λNPRG2 wurde nach dem oben für das 2400 bp-Fragment beschriebenen Verfahren in pBR325 subgeklont, mit der Ausnahme, daß λNPRG2 mit EcoRI digeriert wurde und das Plasmid mit alkalischer Phosphatase behandelt wurde, EcoRI-digeriertes pBR325. pBR325 wird von F.Bolivar, 1978, "Gene", 4 : 121-136 beschrieben. Es wurden zwei Plasmide identifiziert, in denen die 4300 bp-Einfügung in unterschiedlichen Ausrichtungen vorhanden war. Diese beiden Plasmide wurden als pNPRsubRI und pNPRsubRIb bezeichnet.

Beispiel 8

Charakterisierung von B.subtilis neutralem Proteasegen

Die pNPRsubH1-Einfügung wurde mit verschiedenen Restriktionsendonukleasen sequentiell digeriert und mit markiertem Pool 4 blothybridisiert, um einen Restriktionsplan der Einfügung herzustellen (die allgemeinen Verfahren zum Restriktionsmapping siehe T.Maniatis et al., Id., S.377). Ein 430 bp-RsaI-Fragment war das kleinste Fragment, das an den Sondenpool 4 hybridisierte. Das RsaI-Fragment wurde in die SmaI-Stelle von M13 mp8 ligiert (J.Messing et al., 1982, "Gene" 19 : 269-276 und J.Messing in "Methods in Enzymology" 1983, R.Wu et al., Hrsg., 101 : 20-78) und die Sequenz nach dem Kettenterminationsdidesoxyverfahren (F.Sanger et al., 1977, "Proc.Nat.Acad.Sci. U.S.A." 74 : 5463-5467) bestimmt. Andere Restriktionsfragmente von der pNPRsubH1-Einfügung wurden in geeignete Stellen in M13 mp8 oder M13 mp9-Vektoren ligiert und die Sequenzen bestimmt. Wie erforderlich, wurde dITP verwendet, um Kompressionsartefakte zu verringern (D.Mills et al., 1979, "Proc.Nat.Acad.Sci. (U.S.A.)" 76 : 2232-2235). Der Restriktionsplan für das pNPRsubH1-Fragment wird in Fig. 9 gezeigt. Die Sequenzen der verschiedenen Fragmente von Restriktionsenzymdigesten wurden verglichen, und ein offener Leseraster, der eine Kodonsequenz umspannt, die in die Amino- und Carboxyltermini der Protease umsetzbar ist (P.Levy et al., Id.) wurde bestimmt. Ein offener Leseraster ist eine DNA-Sequenz, die an einem bekannten Punkt beginnt, die im Leseraster (alle drei Nukleotide) keine internen Terminationskodone enthält. Der offene Leseraster erstreckte sich über den Aminoterminus hinaus zum Ende des 2400 bp HindIII-Fragments. Das 1300 bp BglII
- HindIII-Fragment wurde aus dem pNPRsubRIb hergestellt (das das 4300 bp EcoRI-Fragment von λNPRG2 enthielt) und in M13 mp8 geklont. Die Sequenz dieses Fragments, die den Abschnitt des neutralen Proteaseführerbereichs enthielt, für den das 2400 bp-Fragment von pNPRsubH1 nicht kodierte, wurde für 400 Nukleotide stromaufwärts von der HindIII-Stelle bestimmt.
Die gesamte Nukleotidsequenz wie für dieses neutrale Proteasegen bestimmt, einschließlich der mutmaßlichen Sekretionsführer- und präpro-Sequenz, wird in Fig. 10 gezeigt. Die Zahlen über der Zeile beziehen sich auf die Aminosäurepositionen. Es wird angenommen, daß die unterstrichenen Nukleotide in Fig. 10 die Ribosombindungs- (Shine-Dalgarno)-Stelle darstellen, während die überstrichenen Nukleotide eine mögliche Haarnadelstruktur darstellen, von der angenommen wird, daß sie ein Terminator ist. Es wird angenommen, daß die ersten 27 bis 28 der abgeleiteten Aminosäuren das Signal für die neutrale Protease sind, mit einem Spaltungspunkt an ala-27 oder ala-28. Die "pro"-Sequenz einer Proenzymstruktur erstreckt sich bis zur aminoterminalen Aminosäure (ala-222) des reifen, aktiven Enzyms.
Ein Hochkopieplasmid, das das gesamte neutrale Proteasegen trägt, wurde durch (Fig. 11) Ligieren des BglII-Fragments von pNPRsubR1, das 1900 bp enthält (Fig. 9), mit dem PvuII - HindIII-Fragment von pNPRsubH1, das 1400 bp enthält, konstruiert. pBS42 (von Beispiel 4) wurde mit BamHI digeriert und mit bakterieller alkalischer Phosphatase behandelt, um Plasmidrezirkularisierung zu verhindern. pNPRsubR1 wurde mit BglII digeriert, das 1900 bp-Fragment wurde von Gelelektrophorese isoliert und an die offenen BamHI-Stellen von pBS42 ligiert. Das ligierte Plasmid wurde verwendet, um E.coli ATCC 31446 nach dem Kalziumchloridschockverfahren (V.Hershfield et al., Id.) zu transformieren, und transformierte Zellen durch Wachstum auf Platten ausgewählt, die LB-Medium mit 12,5 ug/ml Chloramphenicol enthielten. Ein Plasmid, das das Bgl II-Fragment in der in Fig. 11 gezeigten Ausrichtung aufweist, wurde von den Transformanten isoliert und als pNPRsubB1 bezeichnet. pNPRsubB1 wurde mit EcoRI digeriert (linearisiert), durch Klenowbehandlung repariert, sodaß es ebene Enden aufwies, und dann mit HindIII digeriert. Das größere Fragment von der HindIII-Digestion (das die Sequenz enthielt, die für die aminoterminalen und stromaufwärts gelegenen Bereiche kodiert), wurde gewonnen.
Der carboxylterminale Bereich des Gens wurde durch ein Fragment von pNPRsubH1 gebildet, das durch Digestion von pNPRsubH1 mit PvuII und HindIII und Gewinnung des 1400 bp-Fragments erhalten wurde. Das PvuII mit ebenem Ende und die HindIII-Stelle des 1400 bp-Fragments wurden jeweils an die abgestumpfte EcoRI- und die HindIII-Stelle von pNPRsubB1 ligiert, wie in Fig. 11 gezeigt. Dieses Konstrukt wurde verwendet, um B.subtilis Stamm BG84, der gemäß der oben beschriebenen Assays ansonsten keine proteolytische Wirksubstanz ausschied, zu transformieren. Transformanten wurden auf Platten ausgewählt, die LB-Medium plus 1,5% Carnation fettfreies Milchpulver und 5 ug/ml Chloramphenicol enthielten. Plasmide von Kolonien, die einen großen Halo freimachten, wurden analysiert. Bei Plasmid pNPR10, das das strukturelle Gen und Flankierungsbereiche des neutralen Proteasegens einschloß, wurde durch Restriktionsanalyse bestimmt, daß es die in Fig. 11 gezeigte Struktur aufweist.
B.subtilis-Stamm BG84 wurde durch N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin(NTG)-Mutagenese von B.subtilis 1168 nach der allgemeinen Technik von Adelberg et al, 1965, "Biochem.Biophys.Res.Commun." 18 : 788-795 erzeugt. Der mutierte Stamm 1168 wurde auf Magermilchplatten (ohne Antibiotika) plattiert. Kolonien, die einen kleineren Halo erzeugten, wurden für weitere Analyse ausgewählt. Jede Kolonie wurde bezüglich Proteaseproduktion auf Magermilchplatten und Amylaseproduktion auf Stärkeplatten charakterisiert. Ein derartiges Isolat, das teilweise Proteasemangel aufwies, Amylase-positiv und zur Sporenbildung fähig war, wurde als BG77 bezeichnet. Die Proteasedefizienzmutation wurde als prt-77 bezeichnet. Das prt-77 Allele wurde durch Kongression wie unten beschrieben zu einem spoOA-Hintergrund bewegt, um Stamm BG84, einen Stamm mit Sporenbildungsdefizienz, zu erzeugen. Tabelle A Stamm relevanter Genotyp Ursprung
BG84 fehlte auf Magermilchplatten jegliche Proteasewirksamkeit und erzeugt weder nachweisbare Mengen Subtilisin noch neutraler Protease, wenn es durch Messen der Veränderung der dekadischen Extinktion bei 412 nm pro Minute nach Inkubation mit 0,2 ug/ml Succinyl(-L-ala-L-ala-L-pro-L-phe)p-nitroanilid (Vega) in 0,1 M Natriumphosphat, pH 8, bei 25ºC bestimmt wurde. BG84 wurde bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer 39382 am 21. Juli 1983 hinterlegt.
Proben für Subtilisinbestimmung wurden von Überständen der späten logarithmischen Wachstumsphase von in modifiziertem Schaeffer's Medium gezüchteten Kulturen genommen (T.Leighton et al., 1971, "J.Biol.Chem." 246 : 3189-3195).

Beispiel 9

Expression des neutralen Proteasegens

Mit pNPR10 transformiertes BG84 wurde in minimale Medien geimpft, die mit 0,1% Caseinhydrolysat und 10 ug Chloramphenicol ergänzt waren, und 16 Stunden lang kultiviert. 0,1 ml Kulturüberstand wurden entfernt und zu einer Suspension aus 1,4 mg/ml proteolytischem Azocoll-Substrat (Sigma) in 10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 6,8, hinzugefügt und unter Rühren inkubiert. Undigeriertes Substrat wurde durch Zentrifugieren entfernt, und die optische Dichte bei 505 nm abgelesen. Hintergrundwerte einer Azocoll-Substratsuspension wurden subtrahiert. Die Menge an von einem Standard-proteaseexprimierenden Stamm, BG16, ausgeschiedener Protease wurde verwendet, um einen willkürlichen Wert von 100 festzulegen. Die Ergebnisse mit BG16 und mit BG84, mit Kontroll- und neutralem Proteasegen enthaltenden Plasmiden, werden in Tabelle B in Beispiel 12 unten gezeigt. Die Transformation des ausgeschiedenen B.subtilis Stamm BG84 ohne Protease führt zur Ausscheidung von Proteasewirksubstanz in wesentlich höheren Ausmaßen als in BG16, dem Wildtypstamm.

Beispiel 10

Herstellung einer inaktivierenden Mutation des neutralen Proteasegens

Die beiden RsaI-gebundenen Bereiche in der 2400 bp Einfügung von pNPRsubH1 mit insgesamt 527 bp können gelöscht werden, um ein unvollständiges strukturelles Gen zu erzeugen. Die Translationsprodukte dieses Gens sind enzymatisch inaktiv. Ein Plasmid mit dieser Löschung wurde folgendermaßen konstruiert. pJH101 wurde durch Digestion mit HindIII gespalten und mit bakterieller alkalischer Phosphatase behandelt. Die Fragmente des in linearisierten pJH101 aufzunehmenden neutralen Proteasegens wurden durch Digerieren von pNPRsubH1 mit HindIII und RsaI und Gewinnen des 1200 bp HindIII-RsaI und 680 bp RsaI-HindIII-Fragments durch Gelelektrophorese erhalten. Diese Fragmente wurden in linearisiertes pJH101 ligiert und verwendet, um E.coli ATCC 31446 zu transformieren. Transformanten wurden auf Platten ausgewählt, die LB-Medium und 20 ug Ampicillin/ml enthielten. Plasmide wurden von den Transformanten gewonnen und durch Restriktionsenzymanalyse bestimmt, um ein Plasmid zu identifizieren, das die beiden Fragmente in der gleichen Ausrichtung wie im pNPRsubH1 Ausgangsplasmid aufweist. Das Plasmid, dem die internen RsaI-Fragmente fehlten, wurde als pNPRsubH1Δ bezeichnet.

Beispiel 11

Ersetzen des neutralen Proteasegens durch einen Löschungsmutanten

Plasmid pNPRsubh1Δ wurde in B.subtilis-Stamm BG2019 transformiert (den Mutanten mit Subtilisinlöschung von Beispiel 6) und chromosomale Integranten wurden auf Magermilchplatten ausgewählt. Zwei Arten von Cmr-Transformanten wurden festgestellt, die mit parentalen Ausmaßen an die Kolonie umgebender Proteolyse und die fast ohne Proteolysezone. Die, denen eine Proteolysezone fehlte, wurden ausgewählt, wieder Abstriche gemacht, um einzelne Kolonien zu reinigen, und ihr Protease-Mangel Charakter auf Magermilchplatten bestätigt. Eine der CmR Kolonien mit Proteolysemangel wurde für weitere Untersuchungen ausgewählt (als BG2034 bezeichnet). Spontane Cms-Umkehrungen von BG2034 wurden durch Wachstum über Nacht in LB-Medien, die kein Cm enthielten, Plattieren für einzelne Kolonien und Replikaplattieren auf Medien mit und ohne Cm isoliert. Drei Cms-Umkehrungen wurden isoliert, von denen zwei Protease aufwiesen und eine Mangel an Protease aufwies (als BG2036 bezeichnet). Hybridisierungsanalyse von BG2036 bestätigte, daß das Plasmid von diesem Stamm verlorengegangen war, vermutlich durch Rekombination, und nur die Löschungsfragmente von Subtilisin und neutraler Protease zurückließ.

Beispiel 12

Phänotyp von Stämmen, denen funktionelles Subtilisin und neutrale Protease fehlt

Das Wachstum, die Sporenbildung und die Expression von Proteasen wurden bei Stämmen untersucht, denen ein funktionelles Gen entweder für die neutrale oder die alkalische Protease oder beide fehlt(en). Die Expression der Proteasen wurde durch eine freie Zone untersucht, die eine Kolonie auf einer Magermilchplatte umgibt, und durch Messen der Proteasewerte in flüssigen Kulturüberständen (Tabelle B). Ein Stamm (BG2035), der die Subtilisingenlöschung trägt, zeigte eine 30 %ige Reduktion des Werts an Proteasewirksamkeit und einen normalen Halo auf Milchplatten. Stamm BG2043, der das gelöschte neutrale Proteasegen und aktive Subtilisingen trägt und durch Transformieren von BG16 (Beispiel 8) mit DNA von BG2036 (Beispiel 11) konstruiert wurde, zeigte eine 80-%ige Reduktion der Proteasewirksamkeit und nur einen kleinen Halo auf der Milchplatte. Stamm BG2054, der als BG2036 (Beispiel 11) äquivalent betrachtet wird, insofern als er die vorangehenden Löschungen in beiden Genen trug, zeigte keine nachweisbare Proteasewirksamkeit in diesem Assay und keinen nachweisbaren Halo auf Milchplatten. Die Löschung von einem der oder beiden Proteasegene(n) hatte keine sichtbare Wirkung weder auf Wachstum noch auf Sporenbildung. Diese Löschungen aufweisenden Stämme hatten sowohl auf minimaler Glukose als auch LB-Medien normale Wachstumsraten. Die Stämme bildeten mit Häufigkeiten Sporen, die mit dem Elternstamm BG16 vergleichbar sind. Die Untersuchung der Morphologie dieser Stämme zeigte keine sichtbaren Unterschiede von Stämmen ohne derartige Löschungen. Tabelle B Wirkung von Proteaselöschungen auf Proteaseexpression und Sporenbildung Genotyp a Proteasewirksamkeit b Prozent Sporenbildung a Nur die für den Proteasephänotyp relevanten Loci werden gezeigt. b Proteasewirksamkeit wird in willkürlichen Einheiten ausgedrückt, BG16 wurde ein Wert von 100 zugeordnet. ND gibt an, daß das Ausmaß an Protease beim verwendeten Assay nicht nachweisbar war.

Beispiel 13

Stellenspezifische Sättigungsmutagenese des B.Amyloliquefaciens-Subtilisingens an Position 222; Herstellung des Gens für Kassetteneinfügung

pS4-5, ein nach Wells et al., "Nucleic Acids Res."1983, 11 : 7911-7924 hergestelltes Derivat von pS4 wurde mit EcoRI und BamHI digeriert und das 1,5 kb EcoRI-BamHI-Fragment gewonnen. Dieses Fragment wurde in M-13 mp9 mit replikativer Form ligiert, das mit EcoRI und BamHI digeriert worden war (Sanger et al., 1980, "J.Mol.Biol." 143 161-178. Messing et al, 1981, "Nucleic Acids Research" 9, 304-321. Messing, J. und Vieira, J. (1982) "Gene" 19, 269-276). Die M-13 mp9-Phagenligationen, als M-13 mp9 SUBT bezeichnet, wurden verwendet, um E.coli Stamm JM101 zu transformieren, und einstrangige Phagen-DNA wurde aus einer 2 mL über Nacht-Kultur hergestellt. Es wurde ein Oligonukleotidprimer synthetisiert, der die Sequenz
aufwies. Dieser Primer entspricht der Sequenz des Subtilisgenfragments, das für die Aminosäuren 216-232 kodiert, mit der Ausnahme, daß die 10 bp an Kodonen für die Aminosäuren 222-225 gelöscht wurden und die Kodone für die Aminosäuren 220, 227 und 228 mutiert wurden, um eine KpnI-Stelle 5' vom met-222-Kodon und eine PstI-Stelle 3' vom met+222 Kodon einzuführen. Siehe Fig. 12. Substituierte Nukleotide sind durch Sterne markiert, die unterstrichenen Kodone in Reihe 2 stellen die neuen Restriktionsstellen dar und die strichlierte Sequenz in Reihe 4 stellt die eingefügten Oligonukleotide dar. Der Primer (etwa 15 uM) wurde durch Inkubation mit [γ³²P]-ATP (10 uL in 20 uL Reaktion) (Amersham 5000 Ci/mmol, 10218) und T&sub4;-Polynukleotidkinase (10 Einheiten) mit [³²P] markiert, gefolgt von nichtradioaktivem ATP (100 uM), um vollständige Phosphorylierung des Mutageneseprimers zuzulassen. Die Kinase wurde durch Erwärmen der Phosphorylierungsmischung bei 68ºC für 15 Minuten inaktiviert.
Der Primer wurde mit M-13 mp9 SUBT hybridisiert, wie von Norris et al., 1983 "Nucleic Acids Res." 11, 5103-5112 modifiziert, indem 5 uL des markierten Mutageneseprimers ( 3 uM), 1 ug M-13 mp9 SUBT-Schablone, 1 ul 1 uM M-13 Sequenzierungsprimer (17-mer) und 2,5 uL Puffer (0,3 M Tris pH 8, 40 mM MgCl&sub2;, 12 mM EDTA, 10 mM DTT, 0,5 mg/ml BSA) kombiniert wurden. Die Mischung wurde 10 Minuten lang auf 68ºC erwärmt und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur gekühlt. Zu dem Ringschlußmischung wurden 3,6 uL 0,25 mM dGTP, dCTP, dATP und dTTP, 1,25 uL 10 mM ATP, 1 uL Ligase (4 Einheiten) und 1 uL Klenow (5 Einheiten) hinzugefügt. Die Primerausdehnungs- und Ligierungsreaktion (Gesamtvolumen 25 ul) liefen 2 Stunden lang bei 14ºC ab. Klenow und Ligase wurden durch zwanzigminütiges Erwärmen auf 68ºC inaktiviert. Die erwärmte Reaktionsmischung wurde mit BamH1 und EcoRI digeriert, und ein Aliquot des Digests wurde auf ein 6%-Polyacrylamidgel aufgebracht, und radioaktive Fragmente wurden durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Das zeigte, daß der [³²P]-Mutageneseprimer tatsächlich in das EcoRI-BamH1-Fragment aufgenommen worden war, das das nun mutierte Subtilisingen enthielt.
Der Rest der digerierten Reaktionsmischung wurde mit 10 mM Tris, pH 8, das 1 mM EDTA enthielt, auf 200 uL verdünnt, einmal mit einer 1 : 1 (V/V) Phenol/Chloroform-Mischung extrahiert, dann einmal mit Chloroform, und die wässerige Phase gewonnen. 15 uL 5M Ammoniumacetat (pH 8) wurden gemeinsam mit zwei Volumina Äthanol hinzugefügt, um die DNA von der wässerigen Phase auszufällen. Die DNA wurde durch Zentrifugieren für fünf Minuten in einer Mikrozentrifuge pelletiert und der Überstand wurde verworfen- 300 uL 70%iger Äthanol wurden hinzugefügt, um das DNA-Pellet zu waschen, die Waschflüssigkeit wurde verworfen und das Pellet lyophilisiert.
pBS42 von Beispiel 4 oben wurde mit BamHI und EcoRI digeriert und auf einem Acrylamidgel gereinigt, um den Vektor zu gewinnen. 0,5 ug des digerierten Vektors, 50 uM ATP und 6 Einheiten Ligase wurden in 20 ul Ligierungspuffer aufgelöst. Die Ligierung erfolgte über Nacht bei 14ºC. Die DNA wurde in E.coli 294 rec&spplus; transformiert, und die Transformanten in 4 ml LB-Medium gezüchtet, das 12,5 ug/ml Chloramphenicol enthielt. Plasmid-DNA wurde aus dieser Kultur hergestellt und mit KpnI, EcoRI und BamHI digeriert. Die Analyse der Restriktionsfragmente zeigte, daß 30 bis 50% der Moleküle die erwartete KpnI-Stelle durch den Mutageneseprimer programmiert enthielten. Es wurde die Hypothese aufgestellt, daß die Plasmidpopulation, welche die KpnI-Stelle nicht enthielt, aus der M-13-Replikation vor der baktieriellen Reparatur der Mutagenesestelle resultierte, wodurch eine heterologe Population von KpnI&spplus; und KpnI&supmin;-Plasmiden in einigen der Transformanten erzeugt wurde. Um eine reine Kultur des KpnI&spplus;-Plasmids zu erhalten, wurde die DNA ein zweites Mal in E.coli transformiert, um Plasmide zu klonen, welche die neue KpnI-Stelle enthielten. DNA wurde aus 16 derartigen Transformanten hergestellt, und bei sechs wurde festgestellt, daß sie die erwartete KpnI-Stelle enthalten.
Präparative Mengen an DNA wurden aus einem dieser sechs Transformanten (als pΔ222 bezeichnet) hergestellt, und Restriktionsanalyse bestätigte die Gegenwart und Lage der erwarteten KpnI- und PstI-Stellen. 40 ug pΔ222 wurden in 300 uL KpnI-Puffer plus 30 uL KpnI (300 Einheiten) für 1,5 Stunden bei 37ºC digeriert. Die DNA wurde mit Äthanol ausgefällt, mit 70%igem Äthanol gewaschen und lyophilisiert. Das DNA-Pellet wurde in 200 uL HindIII-Puffer aufgenommen und mit 20 uL (500 Einheiten) PstI 1,5 Stunden lang bei 37ºC digeriert. Die wässerige Phase wurde mit Phenol/CHCl&sub3; extrahiert und die DNA mit Äthanol ausgefällt. Die DNA wurde in Wasser gelöst und durch Polyacrylamidgelelektrophorese gereinigt. Nach der Elektroeluierung des Vektorbandes (120 v für 2 Stunden bei 0ºC im 0,1-fachen an TBE (Maniatis et al., Id.)) wurde die DNA durch Phenol/CHCl&sub3;-Extraktion, Äthanolausfällung und Äthanolwäsche gereinigt.
Obwohl pΔ222 bis zur Vollständigkeit (> 98%) durch entweder KnpI oder PstI getrennt digeriert werden konnte, war ausgiebige Doppeldigestion unvollständig («50%). Das mag aus der Tatsache resultiert haben, daß diese Stellen so nahe waren (10 bp), daß Digestion durch KnpI "atmen" der DNA in der Nachbarschaft der PstI-Stelle zuließ, d. h. Strangtrennung oder Ausfransen. Da PstI nur doppelstrangige DNA spaltet, konnte Strangtrennung darauffolgende PstI-Digestion hemmen.

Beispiel 14

Ligierung von Oligonukleotidkasseten in das Subtilisingen

10 uM von vier komplementären Oligonukleotidpools (A-D) Tabelle C, die nicht 5' phosphoryliert waren, wurden in 20 ul Ligasepuffer ringgeschlossen, indem sie fünf Minuten lang bei 68ºC erwärmt und dann 15 Minuten lang bei Raumtemperatur abgekühlt wurden. 1 uM eines jeden ringgeschlossenen Oligonukleotidpools, 0,2 ug KpnI und PstI-digeriertes pΔ222, das in Beispiel 13 erhalten wurde, 0,5 mM ATP, Ligasepuffer und 6 Einheiten T&sub4;-DNA-Ligase in 20 uL Gesamtvolumen wurden über Nacht bei 14ºC umgesetzt, um die gepoolten Kassetten im Vektor zu ligieren. Ein großer Überschuß an Kassetten ( 300x gegenüber den pΔ222-Enden) wurde bei der Ligierung verwendet, um zum Verhindern der intramolekularen KpnI-KpnI-Ligierung beizutragen. Die Reaktion wurde durch Hinzufügen von 25 uL 10 mM Tris pH 8 verdünnt, der 1 mM EDTA enthielt. Die Mischung wurde, um mögliche Kassettenconcatemer-Bildung zu verhindern, durch Erwärmen auf 68ºC für 5 Minuten und Abkühlen bei Raumtemperatur für 15 Minuten wieder ringgeschlossen. Die Ligationsmischungen von jedem Pool wurden getrennt in E.coli 294 rec&spplus;-Zellen transformiert. Ein kleiner Aliquot von jeder Transformationsmischung wurde plattiert, um die Anzahl an unabhängigen Transformanten zu bestimmen. Die große Anzahl an Transformanten deutete auf eine hohe Wahrscheinlichkeit für Mehrfachmutagenese hin. Die übrigen Transformanten ( 200-400 Transformanten) wurden in 4 ml LB-Medium plus 12,5 ug Chloramphenicol/ml kultiviert. DNA wurde aus jedem Transformationspool (A-D) hergestellt. Diese DNA wurde mit KpnI digeriert, 0,1 ug wurden verwendet, um E.coli rec&spplus; zu retransformieren, und die Mischung wurde plattiert, um einzelne Kolonien von jedem Pool zu isolieren. Ligierung der Kassetten in das Gen und bakterielle Reparatur nach der Transformation zerstörten die KpnI- und PstI-Stellen. So wurde nur pΔ222 geschnitten, wenn die Transformanten-DNA mit KpnI digeriert wurde. Das geschnittene Plasmid transformierte E.coli nicht. Einzelne Transformanten wurden in Kultur gezüchtet und DNA wurde aus 24 bis 26 Transformanten pro Pool zum direkten Plasmidsequenzieren hergestellt. Ein synthetischer Oligonukleotidprimer mit der Sequenz 5'-GAGCTTGATGTCATGGC-3' wurde verwendet, um die Didesoxysequenzierungsreaktion zu primen. Die Mutanten, die erhalten wurden, werden in Tabelle C unten beschrieben.
Zwei Kodon+222-Mutanten (d. h. gln und ile) wurden nach dem beschriebenen Screenen nicht gefunden. Um diese zu erhalten, wurde ein einzelnes 25mer-Oligonukleotid für jeden Mutanten synthetisiert, das dem oberen Oligonukleotidstrang in Fig. 12 entspricht. Jedes wurde phosphoryliert und mit dem unteren Strang seines jeweiligen nichtphosphorylierten Oligonukleotidpools ringgeschlossen (d. h. Pool A für gln und Pool D für ile). Dieses wurde in KpnI- und PstI-digeriertes pΔ222 ligiert und wie für die ursprünglichen Oligonukleotidpools beschrieben bearbeitet. Die Häufigkeit des Auftretens für auf diese Art erhaltene einzelne Mutanten betrug 2/8 und 0/7 für gln bzw. ile. Um diese scheinbare Verzerrung zu verhindern, wurde der obere Strang phosphoryliert und mit seinem unphosphorylierten komplementären Pool ringgeschlossen. Die heterophosphorylierte Kassette wurde in geschnittenes pΔ222 ligiert und wie zuvor bearbeitet. Die Häufigkeit des Auftretens von gln und ile-Mutanten betrug nun 7/7 bzw. 7/7.
Die Daten in Tabelle C zeigen eine Verzerrung in der Häufigkeit der aus den Pools erhaltenen Mutanten. Das war wahrscheinlich das Ergebnis ungleicher Repräsentierung der Oligonukleotide im Pool. Das wurde vielleicht durch das ungleiche Koppeln der speziellen Trimere über das Mutagenesekodon im Pool verursacht. Ein derartiges Verzerrungsproblem könnte durch geeignete Einstellung der Trimermengen während der Synthese gelöst werden, sodaß gleiche Reaktion widerspiegelt wird. In jedem Fall wurden Mutanten, die beim primären Screenen nicht isoliert wurden, durch Synthetisieren eines Einzelstrangoligonukleotids, das die gewünschte Mutation darstellt, Phosphorylieren beider Enden, Ringschließen mit dem Pool nichtphosphorylierter komplementärer Stränge und Ligieren in die Kassettenstelle erhalten. Eine verzerrte Heteroduplexreparatur, die für die komplementäre unphosphorylierte Kassette beobachtet wurde, kann aus der Tatsache resultieren, daß Position 222 dem 5'-Ende des oberen Stranges näher ist als dem 5'-Ende des unteren Stranges (siehe Fig. 12). Da ein Spalt an den unphosphorylierten 5'-Enden und die Fehlpaarungsblase in der doppelstrangigen DNA an Position 222 besteht, würde Exzisionsreparatur des Spalts im oberen Strang leichter ein zur Replikation fähiges zirkular hybridisiertes Duplex erhalten. Im Einklang mit dieser Hypothese steht die Tatsache, daß der obere Strang durch selektive 5'-Phosphorylierung vollständig erhalten bleiben könnte. In diesem Fall enthielt nur der untere Strang einen 5'-Spalt, der Exzisionsreparatur fördern könnte. Dieses Verfahren ist nützlich zum Lenken der verzerrten Aufnahme synthetischer Oligonukleotidstämme, wenn mutagene Oligonukleotidkassetten eingesetzt werden.

Beispiel 15

Stellenspezifische Mutagenese des Subtilisingens an Position 166

Dem Verfahren der Beispiele 13-14 wurde im wesentlichen in Details gefolgt, mit der Ausnahme, daß sich der Mutageneseprimer unterschied (es wurde das in Fig. 13 gezeigte 37mer verwendet), die beiden Restriktionsenzyme SacI und XmaIII und nicht PstI und KpnI waren und sich die resultierenden Konstruktionen unterschieden, wie in Fig. 13 gezeigt.
Bacillus-Stämme, die mutante Subtilisine an Position 166 ausschieden, wurden wie unten in Beispiel 16 beschrieben erhalten. Die mutanten Subtilisine mit Substitutionen von ala, asp, gln, phe, his, lys, asn, arg und val für den Wildtyprest wurden gewonnen.

Beispiel 16

Herstellung von mutanten Subtilisinenzymen

Nach dem Verfahren von Beispiel 11 erhaltener B.subtilis Stamm BG2036 wurde durch die Plasmide von Beispiel 14, 15 oder 20 und durch pS4-5 als eine Kontrolle transformiert. Die Transformanten wurden plattiert oder in Rüttelkolben 16 bis 48 Stunden lang bei 37ºC in LB-Medien plus 12,5 ug/ml Chloramphenicol kultiviert. Mutantes enzymatisch wirksames Subtilisin wurde durch Dialysieren der Zellbrühe gegen 0,01M Natriumphosphatpuffer, pH 6,2, gewonnen. Die dialysierte Brühe wurde dann mit 1N HCl auf pH 6,2 titriert und auf eine 2,5 · 2 cm Säule aus CM-Zellulose (CM-52 Whatman) geladen. Nach dem Waschen mit 0,01 M Natriumphosphat, pH 6,2, wurden dies Subtilisine (mit Ausnahme der Mutanten an Position +222) mit dem gleichen Puffer, der an NaCl 0,08N gemacht wurde, eluiert. Die mutanten Subtilisine an Position +222 wurden jeweils mit 0,1M Natriumphosphat, pH 7,0 eluiert. Der gereinigte Mutant und die Wildtypenzyme wurden dann in Untersuchungen der Oxidationsbeständigkeit, Km, Kcat, Kcat/Km-Verhältnis, pH-Optimum und Veränderungen der Substratspezifität verwendet. Tabelle C Oligonukleotidpoolorganisation und Häufigkeit der erhaltenen Mutanten Pool Aminosäuren Codon-222a Häufigkeit b unerwartete Mutanten a
a Kodone wurden basierend auf der häufigen Verwendung in der geklonten Subtilisingensequenz ausgewählt (Wells et al., 1983, Id.)
b Die Häufigkeit wurde durch direktes Plasmidsequenzieren aus Einzeltrackanalyse bestimmt.
c Unerwartete Mutanten umfaßten im allgemeinen doppelte Mutanten mit Veränderungen bei den Kodonen neben 222 oder an den Ligationspunkten. Es wurde angenommen, daß diese das Ergebnis von Verunreinigungen in den Oligonukleotidpools und/oder fehlerhafter Reparatur der Enden mit Spalt waren.

Beispiel 17

Verbesserte Oxidationsbeständigkeit aufweisendes Mutanten-Subtilisin

Subtilisine, die Wildtypmethionin durch Cystein und Alanin an der 222 Position substituiert aufwiesen (Beispiel 16), wurden auf Oxidationsbeständigkeit untersucht, indem sie mit verschiedenen Konzentrationen von Natriumhypochlorit (Clorox-Bleiche) inkubiert wurden.
Zu einem Gesamtvolumen von 400 ul 0,1M, pH 7, NaPO&sub4;-Puffer, der die angegebenen Bleichekonzentrationen enthielt (Fig. 14), wurde ausreichend Enzym hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 0,016 mg/ml Enzym zu ergeben. Die Lösungen wurden bei 25ºC 10 Minuten lang inkubiert und folgendermaßen auf Enzymwirksamkeit hin untersucht: 120 ul von entweder ala+222 oder Wildtyp, oder 100 ul der Cys+222-Inkubationsmischung wurden mit 890 ul 0,1M Trispuffer bei pH 8,6 und 10 ul einer sAAPFpN(Beispiel 18)-Substratlösung (20 mg/ml in DMSO) kombiniert. Die Zunahmerate der dekadischen Extinktion bei 410 nm aufgrund der Freisetzung von p-Nitroanilin (Del Mar, E.G. et al., 1979 "Anal.Biochem." 99, 316-320) wurde überwacht. Die Ergebnisse werden in Fig. 14 gezeigt. Die Alaninsubstitution erzeugte wesentlich mehr stabiles Enzym als entweder das Wildtypenzym oder ein Mutant, in dem Methionin durch einen labilen Cysteinrest ersetzt wurde. Überraschenderweise störte die Alaninsubstitution die Enzymwirksamkeit gegen das Assaysubstrat nicht wesentlich, verlieh dem Enzym aber relative Oxidationsbeständigkeit. Der Serin+222 Mutant wies ebenfalls verbesserte Oxidationsbeständigkeit auf.

Beispiel 18

Mutante Subtilisine, die modifizierte Kinetik und Substratspezifität aufweisen

Verschiedene Mutanten für Glycin+166 wurden auf modifizierte Kcat, Km und Kcat/Km-Verhältnisse untersucht. Kinetikparameter wurden durch Analyse der Verlaufskurven der Reaktionen erhalten. Die Reaktionsrate wurde als eine Funktion der Substratkonzentration gemessen. Die Daten wurden durch Anpassen an die Michaelis-Menton-Gleichung unter Verwendung des nichtlinearen Regressionsalgorithmus von Marquardt (Marquardt, D.W. 1963, "J.Soc.Ind.Appl.Math." 11, 431-41) analysiert. Alle Reaktionen wurden bei 25ºC in 0,1M Trispuffer, pH 8,6 durchgeführt, der Benzoyl-L-Valyl-Glycyl-L-Arginyl-p-nitroanilid (BVGRpN; Vega Biochemicals) mit Anfangskonzentrationen von 0,0025M bis 0,00026 M enthielt (je nach dem Wert von Km für das interessierende Enzym - die Konzentrationen wurden bei jeder Messung so eingestellt, daß sie Km übertrafen) oder Succinyl-L-Alanyl-L-Alanyl-L-Prolyl-L-Phenylalanyl-p-nitro-anilid (sAAPFpN; Vega Biochemicals) mit Anfangskonzentrationen von 0,0010 M bis 0,00028 M (wie für BVGRpN beschrieben variierend).
Bei diesen Versuchen wurden folgende Ergebnisse erzielt: Tabelle D Substrat Enzym
Das Kcat/Km-Verhältnis für jeden der Mutanten unterschied sich von dem des Wildtypenzyms. Als ein Maß der katalytischen Effizienz zeigen diese Verhältnisse, daß Enzyme mit viel höherer Wirksamkeit gegen ein bestimmtes Substrat durch Screenen gemäß vorliegender Erfindung leicht konstruiert und ausgewählt werden können. Beispielsweise weist A166 mehr als das Zweifache der Wirksamkeit des Wildtyps auf sAAPFpN auf.
Diese Daten zeigen auch Veränderungen in der Substratspezifität bei der Mutation des Wildtypenzyms. Beispielsweise ist das Kcat/Km-Verhältnis für die D166- und E166-Mutanten beim BVGpN-Substrat höher als das Wildtypenzym, aber bei Inkubation mit sAAPFpN wurden qualitativ entgegengesetzte Ergebnisse erzielt. Demgemäß waren die D166 und E166-Mutanten relativ mehr spezifisch für BVGRpN als für sAAPFpN.

Beispiel 19

Mutantes Subtilisin, das modifiziertes pH-Aktivitätsprofil aufweist

Das pH-Profil des in Beispiel 16 erhaltenen Cys+222-Mutanten wurde mit dem des Wildtypenzyms verglichen. 10 ul 60 mg/ml sAAPFpN in DMSO, 10 ul Cys+222 (0,18 mg/ml) oder Wildtyp (0,5 mg/ml) und 980 ul Puffer (für Messungen bei pH 6,6, 7,0 und 7,6, 0,1M NaPO&sub4;-Puffer; bei pH 8,2, 8,6 und 9,2, 0,1M Trispuffer; und bei pH 9,6 und 10,0, 0,1M Glycinpuffer), wonach die Anfangsrate der Veränderung der dekadischen Extinktion bei 410 nm pro Minute bei jedem pH-Wert gemessen und die Daten in Fig 15 aufgetragen wurden. Der Cys+222-Mutant weist ein spitzeres pH-Optimum auf als das Wildtypenzym.

Beispiel 20

Stellenspezifische Mutagenese des Subtilisingens an Position 169

Dem Verfahren der Beispiele 13-14 wurde im Detail im wesentlichen gefolgt, jedoch unterschied sich der Mutageneseprimer (es wurde der in Fig. 16 gezeigte Primer verwendet), waren die beiden Restriktionsenzyme KpnI und EcoRV und nicht PstI und KpnI und unterschieden sich die resultierenden Konstruktionen, wie in Fig. 16 gezeigt.
Mutante Subtilisine an Position 169 ausscheidende Bacillus-Stämme wurden wie oben in Beispiel 16 beschrieben erhalten. Die Substitutionen von ala und ser für den Wildtyprest aufweisenden Mutanten-Subtilisine wurden gewonnen und auf Veränderungen der kinetischen Merkmale hin untersucht. Für das Assay wurde SAAPFpN bei pH 8,6 auf die gleiche Weise wie in Beispiel 18 dargelegt eingesetzt. Es wurden folgende Ergebnisse erzielt: Tabelle E Enzym

Beispiel 21

Veränderungen der spezifischen Wirksamkeit auf ein Proteinsubstrat

Position 166-Mutanten von den Beispielen 15 und 16 wurden auf Veränderung der spezifischen Wirksamkeit auf ein natürlich auftretendes Proteinsubstrat untersucht. Da diese Mutanten-Proteasen veränderte Spezifität sowie veränderte spezifische Wirksamkeit aufweisen konnten, sollte das Substrat ausreichende verschiedene Spaltungsstellen enthalten, d. h. azidische, basische, neutrale und hydrophobe, um die Bestimmung nicht zu einer Protease mit einem Typ Spezifität zu verzerren. Das Substrat sollte auch keine derivatisierten Reste enthalten, die zum Abdecken bestimmter Spaltungsstellen führen. Die weitverbreitet verwendeten Substrate wie Hämoglobin, Azocollagen, Azocasein, Dimethylcasein usw. wurden auf dieser Grundlage abgelehnt. Rindercasein, α- und α&sub2;-Ketten wurde als ein geeignetes Substrat ausgewählt.
Eine 1%-Caseinlösung (G/V) wurde in einem 100 mM Trispuffer, pH 8,0, 10 mM EDTA hergestellt. Die Assayvorschrift ist die folgende:
790 ul 50 mM Tris pH 8,2
100 ul 1% Casein (Sigma)-Lösung
10 ul Testenzym (10-200 ug).
Die Assaymischung wurde gemischt und bei Raumtemperatur 20 Minuten lang inkubieren gelassen. Die Reaktion wurde mit dem Hinzufügen von 100 ul 100%-Trichloressigsäure abgeschlossen, gefolgt von Inkubation für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Das ausgefällte Protein wurde durch Zentrifugieren pelletiert und die optische Dichte des Überstandes wurde spektrophotometrisch bei 280 nm bestimmt. Die optische Dichte spiegelt die Menge an unausgefälltem, d. h. hydrolysiertem Casein in der Reaktionsmischung wider. Die Menge an durch jede mutante Protease hydrolysiertem Casein wurde mit einer Reihe von Normen verglichen, die verschiedene Menge von Wildtypprotease enthielten, und die Wirksamkeit wird als ein Prozentsatz der entsprechenden Wildtypwirksamkeit ausgedrückt. Die Enzymwirksamkeiten wurden durch Dividieren der Caseinhydrolysewirksamkeit durch die 280 nm dekadische Extinktion bei der beim Assay verwendeten Enzymlösung in spezifische Wirksamkeit umgewandelt.
Alle Mutanten, die untersucht wurden, wiesen bei Casein weniger spezifische Wirksamkeit auf als der Wildtyp, mit der Ausnahme von Asn+166, das bei Casein um 26% wirksamer war als der Wildtyp. Der die geringste spezifische Wirksamkeit aufweisende Mutant war ile+166 mit 0,184 der Wildtypwirksamkeit.

Claims

1. Im wesentlichen normal sporenbildender Bacillus- der mutierte Subtilisin- und neutrale Proteasegene enthält, sodaß er nicht fähig ist, enzymatisch wirksames Subtilisin oder neutrale Protease auszuscheiden.

2. Bacillus nach Anspruch 1, worin die Mutationen nicht revertibel sind.

3. Bacillus nach Anspruch 1 oder 2, worin jede Mutation eine Löschung umfaßt, die zu keiner Expression oder, bei Expression, zu einem enzymatisch inaktiven Polypeptid führt.

4. Bacillus nach Anspruch 3, worin jede genannte Löschung eine von natürlich auftretenden Kodonen im jeweiligen Gen ist.

5. Bacillus nach einem der vorhergehenden Ansprüche, der mit zumindest einer DNA-Gruppe transformiert ist, die für ein Polypeptid kodiert, das ansonsten nicht vom Bacillus exprimiert wird.

6. Bacillus nach Anspruch 5, worin die transformierende DNA für einen Subtilisinmutanten oder ein eukaryotisches Protein kodiert.

7. Verfahren, umfassend das Kultivieren des Bacillus nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bis ein Protein sich in der Kultur angesammelt hat, und das Gewinnen des Proteins.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin das genannte Protein nicht Subtilisin oder neutrale Protease ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin das genannte Protein Amylase ist.