DE68913802T2 - Thymosin und TNF-kodierende DNA. - Google Patents
Thymosin und TNF-kodierende DNA.Info
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Description
- Es wird Bezug genommen auf die von den gleichen Anmeldern wie diejenigen der vorliegende Anmeldung eingereichte Patentanmeldung Nr. 86 110 139.2 mit dem Titel "Anti-Tumor Polypeptides and A Method of Preparing The Same" sowie auf die von den gleichen Anmeldern wie diejenigen der vorliegenden Anmeldung eingereichte Patentanmeldung Nr. 87 400 261 mit dem Titel "Novel DNAs and Processes for Their Preparation, Novel Plasmids Possessing Them, Novel Polypeptides and Processes for Their Preparation and Noval Anti-Tumor Agents Comprising Said Polypeptides".
- Diese Erfindung bezieht sich auf DNAs. Sie bezieht sich insbesondere auf DNAs, die sowohl für Thymosin β&sub4; (nachstehend als THβ&sub4; bezeichnet) als auch für TNF codieren, und Verfahren zu ihrer Herstellung, sie enthaltende Plasmide, Polypeptide, welche die Expressionsprodukte der genannten DNAs sind, und Verfahren zur Herstellung der genannten Polypeptide und Antitumor-Agentien, welche die genannten Polypeptide enthalten.
- THβ&sub4; ist ein Thymus-Hormon das, wie angegeben wird, die Immunität wieder herstellt ["Modern Chemistry (Gendai Kagaku)", Dezember, 34-38, l985]. Es wird angenommen, daß es in der Lage ist, die Differenzierung von malignen Knochenmarkszellen, wie z.B. malignen Tumoren, zu Monozyten zu induzieren. Seine Aminosäuresequenz ist, wie gefunden wurde, die folgende:
- Nach den Verfahren des Standes der Technik beträgt die maximale Ausbeute jedoch nur 4,1 ug aus 1 g Rinder- Thymus und die Reinigungsverfahren sind sehr kompliziert ("Annals. New York Academy of Sciences", 249, S. 134, 1975). Die Brauchbarkeit (Nützlichkeit) desselben wurde demzufolge bisher nicht sehr gründlich untersucht, weil es keine Verfahren zur Herstellung von hochreinem THβ&sub4; in einem großen Maßstab gab.
- TNF andererseits ist ein genereller Ausdruck für Tumornekrose-Faktoren und der bekannteste Human-Faktor ist TNF-α, der aus Humanzellen HL-60 (ATCC 240) erhalten wird, wie in "The Journal of Biol. Chem.", 260, S. 2345-2354, 1986, beschrieben. Die Aminosäuresequenz dieses Polypeptids wurde als die folgende ermittelt:
- In der obengenannten Aminosäuresequenz hat das mit der 18. Aminosäure Ala beginnende und mit der letzten Aminosäure Leu endende Segment die gleiche Sequenz wie diejenige, die hergestellt werden kann durch Verbinden von Guanin (G) mit dem Beginn der Basensequenz des vierten Exons von TNF-α. Deshalb wird in der nachstehenden Beschreibung dieses Segment Ala-Leu als "Aminosäuresequenz entsprechend der Aminosäuresequenz, hergestellt durch Verbinden von Guanin mit dem Beginn der Basensequenz des vierten Exons von TNF-α" bezeichnet. TNF-α ist jedoch nur für einige wenige Zellen cytotoxisch ("Science", 230, 943-945, 1985), und außerdem verursacht er, wie angegeben wird, die sogenannte Kachexie, welche die Dissimilation von Fettzellen fördert ("Therapeutic Research", 7, Band 2, 184-190, 1987). Deshalb wurden einige rekombinante TNF geschaffen (nachstehend als rTNF bezeichnet), von denen erwartet wird, daß sie frei von den Defekten des TNF-α sind.
- Ziel der vorliegenden Erfindung ist es daher, neue DNAs, die sowohl für THβ&sub4; als auch für TNF codieren und zum ersten Mal die Herstellung des ersteren in hoher Reinheit in einem großtechnischen Maßstab ermöglichen, sowie Verfahren zu ihrer Herstellung, neue Plasmide, welche die genannten DNAs enthalten, neue Polypeptide, welche die Expressionsprodukte der genannten DNAs sind, und Verfahren zu ihrer Herstellung sowie neue Antitumor-Agentien, welche die genannten Polypeptide enthalten, zur Verfügung zu stellen.
- Fig. 1 zeigt die Basensequenz des XhoI/PstI-Segments des Genom-Gens des Antitumor-Polypeptids aus THP-I-Zellen gemäß Stand der Technik;
- Fig. 2 ist ein Diagramm, welches das Elutionsmuster bei der ersten Chromatographie an einer Pharmacia Mono Q FPLC-Säule des Flüssigkeitsüberstandes der Zentrifugierung in einem Ausführungsbeispiel darstellt, der ein erfindungsgemäßes Polypeptid enthält;
- Fig. 3 ist ein Diagramm, welches das Elutionsmuster von aktiven Fraktionen darstellt, die bei dem in Fig. 2 gezeigten Elutionsmuster gesammelt wurden, wenn sie auf die zweite Chromatographie an der Pharmacia Mono Q FPLC- Säule angewendet wurden;
- Fig. 4 ist ein Diagramm, welches die Antitumor-Aktivität gegenüber Meth A-Fibrosarkoma einiger Polypeptide innerhalb oder außerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung zeigt;
- Fig. 5 ist ein Diagramm, welches die Antitumor-Aktivität gegenüber Lewis-Lungen-Carcinoma (3LL) einiger Polypeptide innerhalb oder außerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung zeigt;
- Fig. 6 ist ein Diagramm, welches die Antitumor-Aktivität gegenüber dem MH134-Tumor einiger Polypeptide innerhalb oder außerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung zeigt;
- Fig. 7 ist ein Diagramm, welches die Antitumor-Aktivität gegenüber B16-Melanoma einiger Polypeptide innerhalb oder außerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung zeigt; und
- Fig. 8 ist ein Diagramm, welches die Effekte einiger Polypeptide innerhalb oder außerdem des Rahmens der vorliegenden Erfindung auf die Bildung von endogenem TNF zeigt.
- Erfindungsgemäß werden neue DNAs bereitgestellt, welche die folgende Aminosäuresequenz codieren:
- (Aminosäuresequenz von THβ&sub4;)-Asp-Pro-x-(Aminosäuresequenz entsprechend der Basensequenz, hergestellt durch Verbinden von Guanin mit dem Beginn der Basensequenz des vierten Exons von TNF-α)
- worin x ein Teil der Bindung ist oder eine der folgenden Aminosäuresequenzen darstellt:
- Die erfindungsgemäßen neuen DNAs können hergestellt werden durch Kombinieren der DNA, welche die Aminosäuresequenz von THβ&sub4; codiert, mit einer anderen DNA, welche die Sequenz x-(Aminosäuresequenz entsprechend der Basensequenz, hergestellt durch Verbinden von Guanin mit dem Beginn der Basensequenz des vierten Exons von TNF-α) über eine Asp-Pro-Bindung codiert. Die so hergestellten erfindungsgemäßen DNAs können exprimiert werden, indem man sie einer geeigneten Vektor-DNA in einer exprimierbaren Weise einverleibt, und anschließend die Wirtsorganismen, die umfassen tierische Zellen, Hefen, B. subtilis, E. coli und dgl., mit den resultierenden rDNAs transformiert.
- Ihre Expressionsprodukt-Polypeptide können zersetzt werden durch 24- bis 48-stündiges Kontaktieren mit einer geeigneten Säure wie Ameisensäure oder Essigsäure, bei 37ºC unter Bildung von THβ&sub4; und x-(Aminosäuresequenz, entsprechend der Basensequenz, hergestellt durch Verbinden von Guanin mit dem Beginn der Basensequenz des vierten Exons von TNF-α), worin x wie oben definiert ist.
- Die erfindungsgemäßen DNAs können auf eine der folgenden drei Arten hergestellt werden:
- 1) die DNA, die codiert für (Aminosäuresequenz von THβ&sub4;)-Asp-Pro wird verbunden mit der DNA, die codiert für x-(Aminosäuresequenz entsprechend der Basensequenz, hergestellt durch Verbinden von Guanin mit dem Beginn der Basensequenz des vierten Exons von TNF-α);
- 2) die DNA, die codiert für die (Aminosäuresequenz von THβ&sub4;) wird verbunden mit Asp-Pro-x-(Aminosäuresequenz entsprechend der Basensequenz, hergestellt durch Verbinden von Guanin mit dem Beginn der Basensequenz des vierten Exons von TNF-α); oder
- 3) die DNA, die codiert für die (Aminosäuresequenz von THβ&sub4;), die DNA, die codiert für Asp-Pro, und die DNA, die codiert für x-(Aminosäuresequenz entsprechend der Basensequenz,hergestellt durch Verbinden von Guanin mit dem Beginn der Basensequenz des vierten Exons von TNF-α) werden in der genannten Reihenfolge gleichzeitig miteinander verbunden.
- Ein Beispiel für das obengenannte Verfahren (1) wird nachstehend erläutert.
- PHH58, bei der es sich um eine cDNA handelt, die komplementär ist zu einer der mRNAs, die im Verlaufe der Differenzierung von malignen Knochenmarkaszellen zu Monozyten durch Stimulierung mit exogenen, die Differenzierung induzierenden Agentien synthetisiert wurden ("Biochemical and Biophysical Research Communication", Band 132, Nr. 1, 100- 109, 1985), wird mit PstI behandelt und anschließend wird das gebildete DNA-Fragment von etwa 530 bp gewonnen (abgetrennt). Dann wird das Fragment mit HinfI behandelt unter Bildung eines PstI/HinfI-Fragments von etwa 220 bp und einem HinfI/PstI-Fragments von etwa 310 bp. Das zuerst genannte PstI/HinfI-Fragment wird mit MnlI gespalten (geschnitten) (Bairabos Inc. New England, USA) unter Bildung eines 127 bp MnlI/HinfI-Fragments, das dann mit dem obengenannten HinfI/PstI-Fragment verbunden wird unter Bildung eines MnlI/PstI-Fragments, das für die Aminosäuresequenz von THβ&sub4; codiert. Die resultierende Konstruktion wird mit dem MnlI/PstI-Fragment des Plasmid-Vektors pUC540 verbunden unter Bildung des Plasmids pUC540THβ&sub4; von etwa 3,5 kbp.
- pUC540 ist ein Produkt der Klonierung des EcoRI/- BamHI-Fragments aus dem Plasmid pDR540, das einen tac Promotor aufweist, in den Plasmid-Vektor pUC8 an der EcoRI/BamHI-Schnittstelle; die beiden Plasmide sind im Handel erhältlich von der Firma Pharmacia. Dann wird das pU540THβ&sub4; Behandlungen unterworfen, die umfassen das Verbinden mit dem BamHI-Linker unter Bildung einer DNA, die sowohl für die Aminosäuresequenz von THβ&sub4; als auch für die Aminosäuresequenz Asp-Pro codiert, welche die Brückenbindung darstellt, welche die erstgenannte Sequenz mit x- (Aminosäuresequenz entsprechend der Basensequenz hergestellt durch Verbinden von Guanin mit dem Beginn der Basensequenz des vierten Exons von TNF-α) darstellt.
- Die DNA, die codiert für x-(Aminosäuresequenz entsprechend der Basensequenz, hergestellt durch Verbinden von Guanin mit dem Beginn der Basensequenz des vierten Exons von TNF-α), kann chemisch synthetisiert werden im wesentlichen nach dem Verfahren, wie es in "Nucleic Acids Res.", 10, 7439-7448, 1981, in "Biochemistry", 17, 1257- 1267, 1978, oder anderswo beschrieben ist. So können beispielsweise pUC54OTNF21/22 (entsprechend dem Fall, bei dem x ein Teil der Bindung ist), pUC540TNF69/70 (entsprechend dem Fall, bei dem x die oben unter (1) angegebene Bedeutung hat) und pUC54OTNF72/73 (entsprechend dem Fall, bei dem x die oben unter (2) angegebene Bedeutung hat) beschrieben im Beispiel 2 der japanischen publizierten Patentanmeldung Nr. 62-282 587 (japanische Patentanmeldung Nr. 61-169 522), pUC540AMCT-1 (entsprechend dem Fall, in dem x die oben unter (3) angegebene Bedeutung hat), beschrieben in Beispiel 3 des gleichen Dokuments wie oben, und pUC540AM1 (entsprechend dem Fall, in dem x die oben unter (4) angegebene Bedeutung hat) und pUC540AM2 (entsprechend dem Fall, in dem x die oben unter (5) angegebene Bedeutung hat), beschrieben in den weiter unten angegebenen Ausführungsbeispielen, mit NcoI (Japan Gene Inc.), Mung-Bean-Nuclease und PstI behandelt werden unter Bildung der erfindungsgemäßen DNAs, die codieren für x- (Aminosäuresequenz entsprechend der Basensequenz, hergestellt durch Verbinden von Guanin mit dem Beginn der Basensequenz des vierten Exons von TNF-α). Dies ist deshalb so, weil in diesen Plasmiden die DNA-Fragmente, die codieren für x-(Aminosäuresequenz entsprechend der Basensequenz, hergestellt durch Verbinden von Guanin mit dem Beginn der Basensequenz des vierten Exons von TNF-α) mit dem Tac-Promotor stromabwärts von der BamHI-Schnittstelle (-Spaltungsstelle) verbunden werden und unmittelbar nach der BamHI-Schnittstelle der Ausgangs-Codon ATG vorliegt, auf den eine Aminosäure folgt, deren erster Kodon G ist. Eine Ausführungsform, bei der pUC540AM1 verwendet wird, wird nachstehend detailliert anhand des weiter unten folgenden Ausführungsbeispiels erläutert.
- Um die erfindungsgemäßen DNAs einer Vektor-DNA in einer exprimierbaren Weise einzuverleiben, werden sie, wie allgemein bekannt, stromabwärts der Schine-Dalgarno-Sequenz (nachstehend als SD-Sequenz bezeichnet) einer Vektor-DNA, die eine Promotorsequenz (die in der Regel stromabwärts einer Operator-Sequenz angeordnet ist) und die SD-Sequenz, die stromabwärts von dem Promotor angeordnet ist, aufweist, einverleibt. Alternativ können zuerst die erfindungsgemäßen DNAs einer Vektor-DNA einverleibt werden und dann werden eine Promotor-Sequenz (in der Regel zusammen mit einer Operator-Sequenz) und die SD-Sequenz stromabwärts von den DNAs inseriert.
- Verfahren zur Expression der genetischen Information eines exogenen Gens unter Anwendung von Methoden, bei denen rekombinante DNAs verwendet werden, sind allgemein beschrieben in "Techniques for utilizing gene recombinant (4)", 1983, Science Forum; "Molecular Cloning", 1982, Cold Spring Harbor Lab.; "Introduction into cells and expression of recombinant genes", 1983, Kyoritsu Shuppan Cor.; und dgl.
- Der Fall, bei dem E. coli als Wirt verwendet wird, wird in dem weiter unten folgenden Ausführungsbeispiel erläutert.
- Alternativ kann in dem Fall, in dem Hefe als Wirt verwendet wird, die genetische Information der erfindungsgemäßen DNAs wie nachstehend angegeben exprimiert werden.
- Der Plasmid-Vektor pMA56 mit einem inserierten Promotor für Alkohol-Dehydrogenase (ADHI) ("Nature", 298, S. 347-350, 1982) weist stromabwärts von dem Promotor eine EcoRI-Stelle auf. Die erfindungsgemäße DNA kann somit als BamHI/PstI-Fragment gewonnen (abgetrennt) werden beispielsweise aus Rekombinanten, wie sie in den weiter unten angegebenen Ausführungsbeispielen beschrieben sind, und sie kann dann in pMA56 an der EcoRI-Stelle stromabwärts von dem ADHI-Promotor desselben unter Verwendung eines EcoRI/BamHI-Linkers und eines PstI/EcoRI-Linkers inseriert werden, so daß sie durch die ADHI kontrolliert wird, um die genetische Information in Hefe zu exprimieren.
- Da ferner die repressible, einen sauren Phosphatase (PHO5)-Promotor aufweisende pAM82 ("Proc. Natl. Acad. Sci. USA", 80, S. 1-5, 1983) eine XhoI-Stelle stromabwärts von dem PHO5-Promotor aufweist, können die erfindungsgemäßen DNAs als ein BamHI/PstI-Fragment gewonnen werden beispielsweise aus Rekombinanten, wie sie in den weiter unten angegebenen Ausführungsbeispielen beschrieben sind, und sie können dann in pMA82 an der XhoI-Stelle stromabwärts von dem PHO5-Promotor desselben inseriert werden unter Verwendung eines BamHI/XhoI-Linkers und eines PstI/XhoI- Linkers, wodurch sie durch den PHO5-Promotor gesteuert (kontrolliert) werden, um die genetische Information in Hefe zu exprimieren.
- B. subtilis kann ebenfalls als Wirt wie folgt verwendet werden. PTUB285, das einen α-Amylase-Promotor aufweist, der ursprünglich aus dem B. subtilis Marburs-Stamm stammt ("Gene", 34, S. 148, 1985) weist eine HincII-Stelle stromabwärts von dem Promotor und ein Signal-Peptid auf. Die erfindungsgemäße DNA kann somit als BamHI/PstI-Fragment gewonnen werden beispielsweise aus Rekombinanten, wie sie in den weiter unten angegebenen Ausführungsbeispielen beschrieben sind, und sie kann dann in pTUB285 an dessen HincII-Stelle inseriert werden unter Verwendung eines HincII/BamHI-Linkers und eines HincII/PstI-Linkers, der in den Aminosäure-Raster des Signalpeptids paßt, um dadurch gesteuert (kontrolliert) zu werden durch den α-Amylase- Promotor, um die genetische Information in B. zu exprimieren.
- Die Wirtszellen werden gesammelt beispielsweise durch Zentrifugieren und dann werden sie durch Behandlung mit Ultraschallwellen oder mit Lysozym zerkleinert (abgebaut). Dabei wird eine hypotonische Lösung verwendet und in einigen Fällen kann durch die gleichzeitige Anwesenheit eines oberflächenaktiven Agens wie SDS oder Guanidin-HCl ein besseres Ergebnis erzielt werden.
- Die die zerkleinerten Zellen enthaltende Lösung wird zentrifugiert, wobei man eine überstehende Flüssigkeit erhält.
- Die so hergestellte überstehende Flüssigkeit, die das Antitumor-Polypeptid enthält, kann nach irgendeiner konventionellen Methode zur Reinigung von Proteinen gereinigt werden.
- Das heißt, die überstehende Flüssigkeit kann einer Reinigung durch Ionenaustauschchromatographie unterzogen werden unter Verwendung eines basischen Anionenaustauschers, durch Aussalzen, Dialyse, Gelfiltration, hydrophobe Chromatographie, Hochleistungs-Molekularsieb-Chromatographie, Elektrophorese und dgl. in der angegebenen oder in einer beliebigen anderen Reihenfolge oder durch Anwendung irgendeiner gewünschten Kombination dieser Methoden.
- So ist beispielsweise der basische Anionenaustauscher vorzugsweise DEAE-Sephadex A-25 oder A-50, Sepharose CL-6B oder DEAE-Sephamil (alle hergestellt von der Firma Pharmacia AB), es kann aber auch irgendein anderer, eine Diethylamino-, Aminoethyl- oder quaternäre Aminoethyl- Gruppe enthaltender Anionenaustauscher verwendet werden.
- Zu bevorzugten Ausführungsformen der verwendbaren Pufferlösung gehören Tris-HCl und eine Phosphatpufferlösung mit pH 6,6 bis 9,0. Jede dieser Pufferlösungen kann bei einer niedrigen Konzentration von etwa 0,05 M verwendet werden zum Verdünnen der Kultur, die das Antitumor-Polypeptid enthält, bis auf eine Salzkonzentration von 0,1 M oder weniger, und dann wird die resultierende Lösung mit einem Anionenaustauscher in Kontakt gebracht, der das Antitumor-Polypeptid adsorbiert.
- Die Elution des Antitumor-Polypeptids erfolgt mit einer Salzlösung, die 0,1 bis 0,2 M NaCl oder KCl enthält. Das Antitumor-Polypeptid wird bei einer Salzkonzentration von etwa 0,2 M eluiert. Der Kontakt mit dem Anionenaustauscher erfolgt vorzugsweise unter Anwendung eines Säulenverfahrens, es kann aber auch ein diskontinuierliches Verfahren angewendet werden, wenn der Kontakt in einem großtechnischen Maßstab durchgeführt wird.
- Vor der Anionenaustausch-Chromatographie wird die Lösung vorzugsweise mit einer Ultrafiltrationsmembran vorbehandelt, um niedermolekulare Materialien zu entfernen, um dadurch den Reinigungswirkungsgrad zu verbessern.
- Die aus der Anionenaustausch-Chromatographie resultierende Lösung wird einer Dialyse und Konzentration (Einengung) unterworfen, woran sich eine Gelfiltration anschließt. Zu Beispielen für Träger für die Gelfiltration gehören Sephadex G-75 und G-100 (hergestellt von der Firma Pharmacia AB), Sephacryl S-200 (hergestellt von der Firma Pharmacia AB), Biogel P-100 (hergestellt von der Firma Biorad) und Toyo Pearl HW-50 und HW-55 (hergestellt von der Firma Toyo Soda Corp.).
- Die Pufferlösung, die bei der Gelfiltration verwendet werden soll, kann eine Tris-HCl- oder Phosphatpuffer-Lösung mit pH 6,0 bis 9,0 sein. Um eine Adsorption zu verhindern, ist es erwünscht, der Lösung 0,2 bis 0,5 M Salz, wie NaCl zuzusetzen.
- Alternativ kann die aktive Antitumor-Polypeptid-Lösung durch hydrophobe Chromatographie gereinigt werden. In diesem Fall kann Butyl-Toyo Pearl 650 (hergestellt von der Firma Toyo Soda Corp.) oder dgl. als Träger verwendet werden, und zum Eluieren des Antitumor-Polypeptids wird eine Salzlösung, beispielsweise eine Lösung von Ammoniumsulfat oder NaCl, verwendet.
- Die durch Gelfiltration oder hydrophobe Chromatographie gereinigte, das Antitumor-Polypeptid enthaltende Lösung wird dann einer schnellen Proteinaustauschchromatographie unterworfen unter Verwendung eines Pharmacia FPLC (Fast Protein-Peptid-Polynucleotid-Flüssigchromatographie)-Systems an einer Mono Q HR5/5-Säule (Hochleistungs- Anionenaustauscher-Säule, hergestellt von der Firma Pharmacia AB), wobei man eine gereinigte Probe erhält.
- Die Bedingungen für die schnelle Protein-Anionenaustausch-Chromatogaphie sind die gleichen wie für die Ionenaustausch-Chromatogaphie, in der ein Träger, wie die obengenannten DESE-Sepharose, verwendet wird.
- Die erfindungsgemäßen neuen DNAs bieten allgemein drei Vorteile.
- Der erste Vorteil besteht darin, daß sie neue Antitumor-Polypeptide codieren. Die Antitumor-Eigenschaften werden bestätigt durch ihre Zytotoxizität gegenüber L-929 ("Procl. Natl. Acad. Sci. USA", 72, 3666-3670, 1983), gegenüber Meth A-Fibrosarcoma ("Science", 230, 944, 1985) und anderen. Außerdem induzieren diese neuen Polypeptide die Bildung von endogenem TNF in einem hohen Ausmaß.
- Der zweite Vorteil besteht darin, daß die Polypeptide mit einer geeigneten Säure, wie Ameisensäure oder Essigsäure, behandelt werden können, um ihre sofortige Spaltung vor und hinter der Bindung Asp-Pro zu bewirken unter Bildung von THβ&sub4; und der Antitumor-Polypeptide: x-(Aminosäuresequenz entsprechend der Basensequenz, hergestellt durch Verbinden von Guanin mit dem Beginn der Basensequenz des vierten Exons von TNF-α). Wie oben angegeben, können die erfindungsgemäßen DNAs in einem großtechnischen Maßstab hergestellt werden, wenn sie in E. coli oder dgl. inseriert (eingearbeitet) werden. So ist heute die Massenproduktion von THβ&sub4; praktisch durchführbar.
- Der dritte Vorteil besteht darin, daß die erfindungsgemäßen DNAs der Wirkung des Restriktionsenzyms NruI (TCGCGA) unterworfen werden kann, um diese Sequenz unmittelbar vor dem Äquivalent zu der Basensequenz des vierten Exons von TNF-α zu schneiden (zu spalten), um eine beliebige Basensequenz an der Schnittstelle einzuführen für den Fall, daß die erste Aminosäure Alanin der Aminosäuresequenz entsprechend der Basensequenz, hergestellt durch Verbinden von Guanin mit dem Beginn der Basensequenz des vierten Exons von TNF-α, durch die Basensequenz GCG dargestellt wird.
- Die Cytotoxizität der neuen Polypeptide, die durch die erfindungsgemäßen neuen DNAs codiert worden sind, gegenüber L929-Zellen kann wie folgt analysiert werden:
- L 929-Zellen werden in einem Eagles' Minimum-Essential-Medium (nachstehend als MEM bezeichnet) kultiviert unter Zugabe von 5 % foetalem Kalbsserum (nachstehend als FCS bezeichnet), das zugegeben wird, bis 100 ul des Mediums 8 x 10&sup4; Zellen enthalten, und dann werden die Zellen auf einer Platte mit ebenem Boden, die 96 Vertiefungen aufweist, wachsen gelassen. Die Wachstumsbedingungen sind 2 h bei 37ºC in Gegenwart von 5 % CO&sub2; und 100 % H&sub2;O und die Verfahren können die gleichen sein wie für eine konventionelle Zellkultur. Dann wird dem Medium Actinomycin D bis zu einer Endkonzentration von 1 ug/ml zugesetzt und das Volumen der Kulturlösung wird auf 150 ul eingestellt. Unmittelbar danach werden 50 ml einer mit MEM-Medium in geeigneter Weise verdünnten Probe der Kulturlösung zugesetzt. In diesem Falle können die ED&sub5;&sub0;-Werte bestimmt werden durch Einstellung der geeigneten Verdünnung.
- Die L 929-Zellen mit einem Endvolumen von 200 ul werden weitere 18 h lang unter den gleichen Bedingungen wie oben angegeben kultiviert.
- Zur Bestimmung der Zellnekrose-Aktivität wird zuerst das gesamte Medium entfernt, danach wird eine 2 %ige Methylalkohol-Lösung, die 0,2 % Kristallviolett zur fixierungsfärbung enthält, zugegeben. Das Kristallviolett färbt alle Eukariotenzellen an, es färbt jedoch nicht diejenigen Zellen an, die am Boden des Kolbens als Folge der Nekrose zurückbleiben; auf diese Weise kann die Zellnekrose-Aktivität direkt bestimmt werden. Der Grad der Färbung wird gemessen auf der Basis der Adsorption bei einer OD590nm, und verglichen mit derjenigen einer Kontrolle zur Bestimmung der Zellnekrose-Aktivität. Diese Aktivität ist wie folgt definiert:
- Die Verdünnung der Probe, die das Überleben von 50 % der L 929-Zellen (N) erlaubt, wird bestimmt. Als Kontrolle wird Kaninchen-TNS verwendet und seine Aktivität n (Einheiten/ml) wird bestimmt unter Verwendung von 2,4 x 10&sup5; Einheiten/mg/ml Human-TNF. Die Verdünnung, welche die ED&sub5;&sub0; von Kaninchen-TNS ergibt, wird bestimmt.
- Die Aktivität der Probe (Einheiten/ml) wird errechnet durch die Gleichung N/C x n.
- Die Cytotoxizität gegenüber Meth A-Fibrosarcoma, Lewis-Lungen-Carcinoma (3LL), MH134-Tumor und B16-Melanoma kann im wesentlichen auf die gleiche Weise wie oben bestimmt werden.
- Die vorliegende Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf Beispiele und Versuche näher erläutert.
- 1) 100 ug pHH58 wurden mit 250 Einheiten PstI bei 37ºC digestiert zur Abtrennung des PstI/PstI-Fragments von 530 bp unter Verwendung eines 1,2 %igen Agarose-Gels. Das Fragment wurde aus dem Gel extrahiert und danach an einer Hydroxyapatit-Säule gereinigt, wobei man 2,7 ug DNA erhielt.
- 2) Dann wurde die DNA mit 12 Einheiten HinfI digestiert, um die jeweilige Gewinnung (Abtrennung) des PstI/HinfI3'-Fragments von 220 bp und des 5'-HinfI/PstI3'- Fragments von 310 bp zu bewirkenunter Verwendung eines 8 %igen Acrylamidgels. Die Gewinnung (Abtrennung) erfolgte auf konventionelle Weise unter Verwendung einer DEAE-Cellulosesäule nach der Extraktion der beiden Fragmente aus dem Gel. Ihr Nachweis auf der Basis der UV-Absorption (OD260nm) wurde als nicht durchführbar angesehen, so daß die Menge der gewonnenen beiden Fragmente unter Anwendung der folgenden Gleichung abgeschätzt wurde auf der Annahme, daß 100 % gewonnen (abgetrennt) worden waren.
- Gewonnene Menge des PstI/HinfI-Fragments = 2,7 x 220/(310 + 220) = 1,1 ug
- Gewonnene Menge des HinfI/PstI-Fragments = 2,7 x 310/(310 + 220) = 1,6 ug
- 3) Das PstI/HinfI-Fragment wurde mit 8 Einheiten MnCl digestiert und ein MnClI/HinfI-Fragment von 127 bp wurde abgetrennt und gewonnen unter Verwendung eines 8 %igen Acrylamid-Gels; die Ausbeute betrug etwa 100 bis 150 ng.
- 4) 26 ng des MnClI/HinfI-Fragments wurden mit 65 ng HinfI/PstI-Fragment gemischt, danach wurden 87 Einheiten T4 DNA-Ligase zugegeben und die Mischung wurde 1 h lang bei 16ºC reagieren gelassen. Dann wurde das Enzym 5 min lang bei 70ºC inaktiviert, danach wurden 15 Einheiten PstI und eine 2 Stunden-Kultur bei 37ºC zugegeben, wobei etwa 90 ng DNA erhalten wurden.
- 5) Die im obigen Abschnitt (4) erhaltene DNA wurde mit dem BamHI/PstI-Fragment von pUC540 (26ng) in Ethanol (Schlußkonzentration 70 %) in Gegenwart von 100 mM NaCl gemischt. Der Niederschlag wurde abgetrennt und in 5 ul destilliertem Wasser gelöst und dann einer Gefriertrocknung bis auf etwa 0,5 ul unterworfen, um das Ethanol und das destillierte Wasser zu entfernen. Danach wurden 0,4 ul einer 10 %igen Ligase-Reaktionspufferlösung (10 mM ATP, 660 mM Tris-HCl (pH 7,6), 66 mM Magnesiumchlorid und 50 mM Dithiothreit) und 35 Einheiten T4DNA-Ligase zu dem Rückstand zugegeben, danach wurde über Nacht bei 4ºC kultiviert, wobei man etwa 3,5 kbp pUC540HTβ&sub4; erhielt.
- 6) 100 ug pUC540HTβ&sub4; wurden mit 190 Einheiten HinfI bei 37ºC über Nacht digestiert und 50 ug des Digestionsprodukts wurden mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I (40 Einheiten) in Gegenwart von 80 uM Deoxy-ATP und 80 uM Deoxy-TTP gemischt, danach wurde 30 min lang bei Raumtemperatur kultiviert.
- 7) Das oben erhaltene Klenow-Fragment wurde durch 5- minütiges Erhitzen auf 70ºC inaktiviert, es wurden 120 Einheiten BamHI zu der Kulturlösung zugegeben, danach wurde 3 h lang bei 37ºC kultiviert.
- 8) Die BamHI- und HinfI-Schnittstellen wurden repariert zu glatten Enden mit A und T unter Verwendung eines 8 %igen Acrylgels und es wurden etwa 450 ng DNA von 138 bp abgetrennt und gewonnen unter Verwendung einer DEAE-Cellulosesäule.
- 9) 27 ng der DNA aus der obigen Stufe (8) wurden mit 1,6 ng BamHI-Linker in Gegenwart von 87 Einheiten T4DNA- Ligase gemischt, danach wurde über Nacht bei 4ºC kultiviert, wobei man DNA erhielt, die codierte für (Aminosäuresequenz von THβ&sub4;)-Asp-Pro.
- 10) Das Genom-Gen des Antitumor-Polypeptids, das aus einer akuten monozytischen Human-Leukämie-Zelle THP-1 extrahiert worden war (japanische offengelegte Patentanmeldung Nr. 62-282 587), wurde mit XhoI und PstI geschnitten zur Gewinnung des in Fig. 1 dargestellten XhoI/PstI-Fragments. Dann wurde dieses Fragment in den Plasmid-Vektor pUC540 mit einem Tac-Promotor und einer SD-Sequenz an der SalI/Pst-Schnittstelle inseriert zur Herstellung des Plasmids pUC540TMSx/p.
- 11) Getrennt davon wurde das in Fig. 1 dargestellte XhoI/PstI-Fragment mit HincII geschnitten zur Gewinnung des XhoI/HincII-Fragments mit 294 bp und des HincII/PstI- Fragments mit 521 bp. Außerdem wurde das 294 bp-Fragment teilweise geschnitten mit DdcI zur Gewinnung des DdeI/HincII-Fragments mit 206 bp.
- Das auf diese Weise gewonnene HincII/PstI-Fragment mit 521 bp und das DdeI/HincII-Fragment mit 206 bp wurden mit einer doppelsträngigen DNA mit 72/73 bp, die mit einem DNA-Synthesizer 380A (ABT Corp., USA) synthetisiert worden war und in der folgenden Tabelle 1 angegeben ist, kombiniert, dann wurde es in das pUC540TNT x/p an der BamHI/PstI-Stelle inseriert unter Bildung von pUC540TNF AMI. Tabelle 1 Basensequenz der synthetischen DNA (73/72 bp) Base sequence of synthetic DNA (73/72 bp)
- 12) Zu 100 ug pUC54OTNF AMI wurden 120 Einheiten NcoI zugegeben, danach wurde über Nacht bei 37ºC kultiviert. Die Beendigung der Digestion wurde bestätigt durch Agargel-Elektrophorese, danach wurde mit Phenol und dann mit Chloroform extrahiert und anschließend wurde die Reinigung der DNA an einer Sephadex G50-Säule durchgeführt.
- 13) Zu der DNA wurden 90 Einheiten Mung-Been-Nuclease zugegeben und die Mischung wurde 10 min lang bei 37ºC stehen gelassen. Dann wurde die Mischung 5 min lang auf 70ºC erhitzt, um die Nuclease zu inaktivieren.
- 14) Die Mischung wurde nach Zugabe von 160 Einheiten PstI über Nacht bei 37ºC kultiviert. Dann wurde ein 5 %iges Acrylamid-Gel verwendet zur Gewinnung von DNA mit 770 bp (etwa 1 ug).
- 15) Die DNA, die nach den in den obigen Abschnitten (1) bis (8) beschriebenen Verfahren erhalten worden war (28,6 ng), und die andere DNA, die am Ende der in den obigen Abschnitten (9) bis (14) angegebenen Verfahren erhalten worden war (157 ng), wurden gemeinsam über Nacht bei 4ºC kultiviert in Gegenwart von 87 Einheiten T4DNA-Ligase. Dann wurde die Ligase durch 10-minütiges Erhitzen auf 70ºC inaktiviert.
- 16) Eine 24 Stunden-Kultivierung wurde durchgeführt bei 37ºC nach der Zugabe von 0,8 Einheiten PstI und die Mischung wurde 10 min lang auf 70ºC erhitzt, um die PstI zu inaktivieren. Dann wurde die Mischung mit dem BamHI/- PstI-Fragment des Plasmid-Vektores pUC540 (75 ug) gemischt, danach wurde über Nacht bei 4ºC in Gegenwart von 90 Einheiten T4DNA-Ligase kultiviert. Man erhielt so das Plasmid pUC540 (Aminosäuresequenz von THβ&sub4;)-Asp-Pro-x- (Aminosäuresequenz entsprechend der Basensequenz, hergestellt durch Verbinden von Guanin mit dem Beginn der Basensequenz des vierten Exons von TNF-α), worin x steht für
- Val-Arg-Ser-Ser-Thr-Arg-Thr-Pro-Ser-Arg-Lys-Pro-Val-Ala-His-Val-Val.
- 17) E. coli DH-1 mit dem inserierten Plasmid aus dem obigen Abschnitt (16) wurde in 10 ml eines NZY-Mediums (hergestellt durch Mischen von 5 g NaCl, 2 g MgCl&sub2;.7 H&sub2;O, 10 g NZ-Amin A, hergestellt von der Firma Wako Jun-yaku, Japan, und 5 g Hefeextrakten in destilliertem Wasser in einer Menge zur Herstellung von 1 l Medium), das 50 ug/ml Ampicillin und 10 ug/ml Kanamycin enthielt, wurde über Nacht einer Schüttelkultur bei 37ºC unterworfen. 10 ml der resultierenden Kulturlösung wurden zu 100 ml NZY-Medium zugegeben, das 50 ug/ml Ampicillin und 10 ug/ml Kanamycin enthielt, danach wurde 6 h lang eine Schüttelkultur bei 37ºC durchgeführt. Dann wurde die gesamte Kulturlösung (etwa 100 ml) zu 1 l NZY-Medium, das 0,7 mM Isopropyl-β-D- galactopyranosid (nachstehend als IPTG bezeichnet), 50 ug/ml Ampicillin und 10 ug/ml Kanamycin enthielt, zugegeben, danach wurde über Nacht bei 37ºC eine Schüttelkultivierung durchgeführt.
- 18) Das so konstruierte E. coli wurde mit einer Zentrifuge (5000 UpM, 10 min) gesammelt und in 1 mM Phenylmethylsulfonylchlorid (ein Protease-Inhibitor) suspendiert. Die resultierende Zellsuspension wurde in 10 ml-Portionen aufgeteilt, die 3 mal bei dem Wert 40 einer Branson-Ultraschall-Behandlungsvorrichtung 6 min lang mit Ultraschall behandelt wurden, um die E. coli-Zellen zu zerstören (abzubauen).
- 19) Die Mischung wurde 1 h lang mit 100 000 UpM zentrifugiert, um die überstehende Flüssigkeit abzutrennen. Die TNF-Aktivität dieser überstehenden Flüssigkeit gegenüber L-929-Zellen betrug 1,85/10&sup6; Einheiten/ml.
- 20) Ammoniumsulfat-Fraktionen (60 %ige Sättigung) aus der obigen überstehenden Flüssigkeit wurden abgetrennt und 30 min lang mit 10 000 UpM zentrifugiert, wobei man einen Niederschlag erhielt, der dann in 5 ml PBS(-) gelöst wurde, danach wurde dialysiert gegenüber 5 l einer Lösung, die 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) und 10 mM NaCl enthielt. Dann wurde die Lösung über Nacht bei 13 000 UpM zentrifugiert, um die unlöslichen Materialien zu entfernen, danach wurde die überstehende Flüssigkeit abgetrennt.
- 21) Die überstehende Flüssigkeit wurde einer Chromatographie an einer Pharmacia Mono Q FPLC-Säule unterworfen. Die Fließgeschwindigkeit wurde auf 2,0 ml/min eingestellt und die 20 ml-Portionen wurden in Form einer Gradienten-Elution gesammelt, wobei die Nacl-Konzentration linear von 0,01 M bis auf 1 M erhöht wurde. Das Elutionsmuster ist in der Fig. 2 dargestellt.
- In der Fig. 2 repräsentieren die entlang der Abszissen-Achse aufeinanderfolgenden Ziffern die jeweiligen Fraktionen, die Kurve gibt die Menge der eluierten Proteine an, das Säulen-Diagramm macht die TNF-Aktivität gegenüber L 929-Zellen sichtbar (Einheiten) und die Linie (Gerade) gibt den Salzgehalt der Eluate an (von 0,01 M bis 1 M).
- 21) Es wurden einige aktive Fraktionen Nr. 23-27, die reich an dem Protein mit der Struktur waren:
- (Aminosäuresequenz von THβ&sub4;)-Asp-Pro-x-(Aminosäuresequenz entsprechend der Basensequenz, hergestellt durch Verbinden von Guanin mit dem Beginn der Basensequenz des vierten Exons von TNF-α), worin x steht für Val-Arg-Ser-Ser-Thr-Arg-Thr-Pro-Ser-Arg-Lys-Pro-Val-Ala- His-Val-Val
- (nachstehend als "Chimera-TNF" bezeichnet), gesammelt und erneut einer Behandlung an einer Mono Q-Säule unterworfen, wobei man 7,5 ml einer Fraktion erhielt, die nur einen Peak aufwies (Reinheit über 95 %). Das Elutionsmuster ist in Fig. 3 dargestellt.
- In der Fig. 3 sind die entlang der Abszissenachse aufeinanderfolgenden Ziffern, die Kurve, das Säulen-Diagramm und die Linie (Gerade) definiert wie in Fig. 2.
- Die TNF-Aktivität der obengenannten Fraktion gegenüber L929-Zellen betrug 2,5 x 10&sup6; Einheiten/ml. Die Untersuchung durch Gelfitration unter Verwendung einer Pharmacia Superose 12-Säule zeigte, daß das Molekulargewicht 67 000 Dalton oder mehr beträgt und läßt vermuten, daß das Molekül ein Trimer oder Tetramer ist. Die SDS-Elektrophorese zeigte, daß sein Molekulargewicht 22 000 Dalton beträgt. Der LPS-Gehalt betrug 12 ng/mg Protein.
- E. coli JM103 mit der inserierten rDNA, hergestellt nach den Verfahren, wie sie in den Abschnitten (10) bis (14) in Beispiel 1 beschrieben worden sind (nachstehend als rTNF-S-AM1 bezeichnet), wurde in einem 1 x YT Medium (0,8 % Bactotrypon + 0,5 % Bactohefe-Extrakte + 0,5 % NaCl), das 50 ug/ml Ampicillin enthielt, bei 37ºC vorkultiviert und dann in einem Mengenanteil von 1 % in einen 500 ml Sakaguchi-Kolben überführt, der 100 ml eines 1 x YT Mediums mit 50 ug/ml zugesetztem Amapicillin enthielt. Die Mischung wurde auf die gleiche Weise bei 37ºC kultiviert. Wenn die OD&sub6;&sub6;&sub0; den Wert 0,3 erreicht hatte, wurde IPTG zu der Kultur zugegeben bis zu einer Endkonzentration von 0,7 mM, dann wurde weitere 24 h lang kultiviert. Das so erhaltene E. coli wurde mit einer Zentrifuge gesammelt, mit 1 x PBS (0,8 % NaCl + 0,02 % KCl + 0,02 % KH&sub2;PO&sub4; + 0,115 % Na&sub2;HPO&sub4;) gewaschen und in 10 ml 1 x PBS suspendiert, dann wurde Ultraschall auf die Kultur angewendet, um die E. coli-Zellen zu zerkleinern (zerstören). Danach wurde das durch rTNF-S-AM1 exprimierte Polypeptid abgetrennt und auf konventionelle Weise gereinigt. Dieses Polypeptid (nachstehend als AM1 bezeichnet) hat die nachstehend angegebene Aminosäuresequenz und ihr Molekulargewicht betrug 17500 ± 500 (SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese): Val-Arg-Ser-Ser-Thr-Arg-Thr-Pro-Ser-Arg-Lys-Pro-Val-Ala- His-Val-Val
- (Aminosäuresequenz entsprechend der Basensequenz, hergestellt durch Verbinden von Guanin mit dem Beginn der Basensequenz des vierten Exons von TNF-α).
- Nach dem in den Abschnitten (10) bis (16) des Beispiels 1 beschriebenen Verfahren, wobei jedoch Ser durch Cys ersetzt wurde, bei dem es sich um die fünfte Aminosäure der in der Tabelle 1 in Beispiel 1 angegebenen synthetischen DNA handelt, erhielt man eine andere rDNA (nachstehend als rTNF-S-AM2 bezeichnet). Diese Rekombinante wurde dem E. coli JM103 einverleibt und auf die gleiche Weise wie im Bezugsbeispiel 1 behandelt, um das durch rTNF-S-AM2 exprimierte Polypeptid abzutrennen und zu reinigen. Dieses Polypeptid (nachstehend als AM2 bezeichnet) hat die nachstehend angegebene Aminosäuresequenz und sein Molekulargewicht betrug 17500 ± 500 (SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese): Val-Arg-Ser-Cys-Thr-Arg-Thr-Pro-Ser-Arg-Lys-Pro-Val-Ala- His-Val-Val--
- (Aminosäuresequenz entsprechend der Basensequenz, hergestellt durch Verbinden von Guanin mit dem Beginn der Basensequenz des vierten Exons von TNF-α).
- Eine Zellsuspension von Meth A-Fibrosarcoma-Zellen (2 x 10&sup4;/50 ul) wurde in 10 bis 12 Wochen alte männliche Balb/c-Mäuse intradermal inokuliert. 7 Tage später wurden nur die Mäuse mit Tumoren, deren Durchmesser etwa 5 bis 8 mm erreicht hatte, für die weiteren therapeutischen Versuche ausgewählt.
- Die jeweils getesteten Arzneimittel wurden mit einer physiologischen Salzlösung, die 1 % Serum aus normalen Mäusen enthielt, verdünnt und es wurden 200 ul-Lösungen den jeweiligen Tieren intravenös verabreicht. Diese Verabreichung wurde am 7., 10. und 13. Tag nach der Inokulation der Tumorzellen durchgeführt. Die Tumorgröße wurde nach der folgenden Gleichung bestimmt:
- [a x b] mm,
- worin "a" den kürzeren Durchmesser und
- "b" den längeren Durchmesser bezeichnen.
- Die kurzen und langen Durchmesser wurden mit einem Schiebe-Kalieber gemessen und die Ergebnisse sind in der Fig. 4 als Durchschnittswert von 5,7 Tieren pro Gruppe angegeben.
- Die Verabreichung einer Kontrollprobe (Salzlösung, die nur 1 % Serum aus normalen Mäusen enthielt) versagte vollständig bei der Heilung irgendeines der sieben getesteten Tiere. Die Daten sind in der Fig. 4 als Kreise dargestellt.
- Die Verabreichung von 10 000 Einheiten AM2 (LPS-Gehalt 910 pg/mg TNF-Protein) versagte ebenso vollständig bei der Heilung irgendeines der fünf getesteten Tiere. Die Daten sind in der Fig. 4 als Dreiecke dargestellt.
- Die Verabreichung von 10 000 Einheiten Chimera-TNF führte zu einer vollständigen Heilung von zwei der fünf getesteten Tiere. Die Daten sind in der Fig. 4 in Form von ausgefüllten Quadraten dargestellt.
- Eine Zellsuspension von 3LL (3 x 10&sup5;/50 ul) wurde in 10 bis 12 Wochen alte männliche C57BL/6-Mäuse intradermal inokuliert. 7 Tage später wurden nur die Mäuse mit Tumoren, deren Durchmesser etwa 5 bis 8 mm erreicht hatte, für die weiteren therapeutischen Versuche ausgewählt.
- Die jeweils getesteten Arzneimittel wurden an 5 bis 8 Mäuse pro Gruppe nur am 7. Tag oder sowohl am 7. Tag als auch am 13. Tag nach der Inokulierung der Tumorzellen verabreicht. Die Verabreichung einer Kontrollprobe (eine Salzlösung, die nur 1 % Serum aus normalen Mäusen enthielt) versagte vollständig bei der Heilung irgendeines der sechs getesteten Tiere. Die Daten sind in der Fig. 5 durch leere Kreise dargestellt.
- Die intravenöse (i.v.) Verabreichung von 1 x 10&sup4; Einheiten pro 200 ul Chimera-TNF sowohl am 7. als auch am 13. Tag versagte ebenfalls vollständig bei der Heilung irgendeines der fünf getesteten Tiere. Die Daten sind in der Fig. 5 durch leere Quadrate dargestellt.
- Die intratumorale (i.t.) Verabreichung von 1 x 10&sup4; Einheiten pro 50 ml Chimera-TNF nur am 7. Tag führte zu einer vollständigen Heilung von drei der fünf getesteten Tiere. Die Daten sind in der Fig. 5 durch ausgefüllte Quadrate dargestellt.
- Die intratumorale (i.t.) Verabreichung von 1 x 10&sup6; Einheiten pro 50 ul AM1 (LPS-Gehalt 8,9 ng/mg TNF-Protein) nur am 7. Tag versagte ebenfalls vollständig bei der Heilung eines der fünf getesteten Tiere. Die Daten sind in der Fig. 5 durch ausgefüllte Kreise dargestellt.
- Eine Zellsuspension von MH134 (2 x 10&sup5;/50 ul) wurde in 10 bis 12 Wochen alte männliche C3H/He-Mäuse intradermal inokuliert. 7 Tage später wurden nur die Tiere mit Tumoren, deren Durchmesser etwa 6 bis 9 mm erreicht hatte, für die weitere therapeutischen Versuche ausgewählt.
- Die jeweils getesteten Arzneimittel wurden intravenös an 6 bis 8 Mäuse pro Gruppe am 7., 11. und 15. Tag nach der Inokulation der Tumorzellen verabreicht.
- Die Verabreichung der Kontrollprobe (Salzlösung, die nur 1 % Serum aus normalen Mäusen enthielt) versagte vollständig bei der Heilung irgendeines der acht getesteten Tiere. Die Daten sind in der Fig. 6 durch leere Kreise dargestellt.
- Die Verabreichung von 3 x 10³ Einheiten pro 200 ul Chimera-TNF versagte ebenfalls vollständig bei der Heilung irgendeines der 5 getesteten Tiere. Die Daten sind in Fig. 6 durch leere Quadrate dargestellt.
- Die Verabreichung von 1 x 10&sup4; Einheiten pro 200 ul Chimera-TNF versagte ebenfalls vollständig bei der Heilung irgendeines der 5 getesteten Tiere. Die Daten sind in Fig. 6 als Dreiecke dargestellt.
- Die Verabreichung von 3 x 10&sup4; Einheiten pro 200 ul AM1 versagte ebenfalls vollständig bei der Heilung irgendeines der 5 getesteten Tiere. Die Daten sind in Fig. 6 durch ausgefüllte Kreise dargestellt.
- Eine Zellsuspension von B16 (1 x 10&sup6;/50 ul) wurde in 10 bis 12 Wochen alte männliche C57BL/6-Mäuse intradermal inokuliert. 9 Tage später wurden nur die Mäuse mit Tumoren, deren Durchmesser etwa 5 bis 9 mm erreicht hatte, für die weiteren therapeutischen Versuche ausgewählt.
- Die intravenöse Verabreichung der getesteten Arzneimittel erfolgte an 4 bis 5 Mäuse pro Gruppe am 9., 16. und 23. Tag nach der Inokulation der Tumorzellen.
- Die Verabreichung einer Kontrollprobe (einer Salzlösung, die nur 1 % Serum aus normalen Mäusen enthielt) versagte vollständig bei der Heilung irgendeines der 5 getesteten Tiere. Die Daten sind in Fig. 7 in Form von leeren Kreisen dargestellt.
- Die Verabreichung von 1 x 10&sup4; Einheiten pro 200 ul Chimera-TNF führte zu einer vollständigen Heilung von zwei der vier getesteten Tiere. Die Daten sind in der Fig. 7 als leere Quadrate dargestellt.
- Die Verabreichung von 1 x 10&sup4; Einheiten pro 200 ul AM1 versagte vollständig bei der Heilung irgendeines der vier getesteten Tiere. Die Daten sind in der Fig. 7 durch ausgefüllte Quadrate dargestellt.
- 1 oder 10 000 Einheiten (bezogen auf die Aktivität gegenüber L929) Chimera-TNF, erhalten in Beispiel 1, oder AM1, erhalten in Bezugsbeispiel 1, wurde(n) an 7 Wochen alte männliche C3H/He-Mäuse über die Kaudalvene als Primer verabreicht. Den Kontrolltieren wurde nur eine physiologische Salzlösung verabreicht.
- 3 Stunden später wurden 3 KF von OK-432 als Trigger den Tieren über die Kaudalvene verabreicht. Unter "KE" ist hier die Einheit "klinische Einheit" zu verstehen und 1 KE entspricht der Menge eines Präparats, das 0,1 mg getrocknete Zellen enthält. 2 h später wurde das Blut aus der Inguinal-Arterie entnommen und das Serum wurde abgetrennt, um seine TNF-Aktivität auf der Basis des Verhaltens gegenüber L929-Zellen zu bestimmen. Die Ergebnisse, errechnet als Durchschnittswert von drei Messungen pro Gruppe (Durchschnittswert von vier Messungen im Falle von AM1) sind in der Fig. 8 dargestellt.
- Wie aus Fig. 8 ersichtlich, verbesserte nur eine Einheit des erfindungsgemäßen Chimera-TNF die Bildung von endogenem TNF um etwa das 20-fache, während die Verwendung von AM1 keinen Effekt ergab. Beide verbesserten die produktion um das 70- bis 150-fache, wenn sie in einer Dosis von 10 000 Einheiten verabreicht wurden.
- Der in Beispiel 1 erhaltene Chimera-TNF wurde gefriergetrocknet und in 70 %ige Ameisensäure bei 37ºC bei einer Endkonzentration von 0,5 bis 2 mg/ml reagieren gelassen. Die resultierenden Proteine wurden durch SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese unter den folgenden Bedingungen nachgewiesen:
- Trenngel: 15 % Acrylamid + 0,4 % Bisacrylamid + 0,375 M Tris-HCl (pH 8,8) + 0,1 % SDS + 0,08 % TEMED (N,N,N,N-Tetramethylenethylendiamin + 0,08 % Ammoniumpersulfat.
- Konzentrationsgel: 5 % Acrylamid + 0,13 % Bisacrylamid + 0,125 M Tris-HCl (pH 6,8) + 0,1 % SDS + 0,2 % TEMED + 0,075 % Ammoniumpersulfat.
- Wanderungspuffer: 0,025 M Tris-HCl + 0,192 M Glycin + 0,1 % SDS (pH etwa 8,3).
- Wanderungsbedingungen: etwa 4,5 bis 5 h bei einem konstanten Strom von 20 mA.
- Anfärbung und Entfärbung: Am Ende der Wanderung wird das Gel mit 20 %iger Trichloressigsäure 30 min lang bei Raumtemperatur fixiert und die Protein-Banden werden mit einer 0,25 %igen Lösung von Coomassie brillant blue R- 250 in einem Ethanol/Essigsäure/Wasser (9/2/9)-Gemisch angefärbt. Die Entfärbung erfolgt unter Verwendung eines Ethanol/Essigsäure/Wasser (25/8/65)-Gemisches.
- Als Ergebnis wurden Banden nachgewiesen, die Molekulargewichte von etwa 17 000 bzw. etwa 5 000 anzeigten. Diese Banden wurden bestätigt durch Kombination mit einem Antikörper gegenüber TNF und einem solchen gegenüber THβ&sub4;.
Claims (6)
1. DNA, dadurch gekennzeichnet, daß sie die folgende
Aminosäuresequenz codiert:
(Aminosäuresequenz von THβ&sub4;)-Asp-Pro-x-(Aminosäuresequenz
entsprechend der Basensequenz, hergestellt durch Verbinden
von Guanin mit dem Beginn der Basensequenz des vierten
Exons von TNF-α),
worin X einen Teil der Bindung oder eine der folgenden
Aminosäuresequenzen darstellt:
2. Verfahren zur Herstellung von DNA, welche die
folgende Aminosäuresequenz codiert:
(Aminosäuresequenz von THβ&sub4;)-Asp-Pro-x-(Aminosäuresequenz
entsprechend der Basensequenz, hergestellt durch Verbinden
von Guanin mit dem Beginn der Basensequenz des vierten
Exons von TNF-α),
worin X einen Teil der Bindung oder eine der
folgenden-Aminosäuresequenzen darstellt:
dadurch gekennzeichnet, daß es eine der folgenden Stufen
umfaßt:
1) DNA, die (Aminosäuresequenz von THβ&sub4;)-Asp-pro
codiert, wird mit DNA, die x-(Aminosäuresequenz
entsprechend der Basensequenz, hergestellt durch
Verbinden von Guanin mit dem Beginn der Basensequenz des
vierten Exons von TNF-α) codiert, verbunden;
2) DNA, die (Aminosäuresequenz von THβ&sub4;) codiert, wird
mit DNA, die Asp-Pro-x-(Aminosäuresequenz
entsprechend der Basensequenz, hergestellt durch Verbinden
von Guanin mit dem Beginn der Basensequenz des
vierten Exons von TNF-α) codiert, verbunden; oder
3) DNA, die (Aminosäuresequenz von THβ&sub4;) codiert, DNA,
die Asp-Pro codiert, und DNA, die
x-(Aminosäuresequenz entsprechend der Basensequenz, hergestellt
durch Verbinden von Guanin mit dem Beginn der
Basensequenz des vierten Exons von TNF-α) codiert, werden
in der genannten Reihenfolge gleichzeitig miteinander
verbunden.
3. Plasmid, das DNA enthält, welche die folgende
Aminosäuresequenz codiert:
(Aminosäuresequenz von THβ&sub4;)-Asp-Pro-x-(Aminosäuresequenz
entsprechend der Basensequenz, hergestellt durch Verbinden
von Guanin mit dem Beginn der Basensequenz des vierten
Exons von TNF-α),
worin X einen Teil der Bindung oder eine der folgenden
Aminosäuresequenzen darstellt:
4. Polypeptid, dargestellt durch die folgende
Aminosäuresequenz:
(Aminosäuresequenz von THβ&sub4;)-Asp-Pro-x-(Aminosäuresequenz
entsprechend der Basensequenz, hergestellt durch Verbinden
von Guanin mit dem Beginn der Basensequenz des vierten
Exons von TNF-α),
worin X einen Teil der Bindung oder eine der folgenden
Aminosäuresequenzen darstellt:
5. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids,
dargestellt durch die folgende Aminosäuresequenz:
(Aminosäuresequenz von THβ&sub4;)-Asp-Pro-x-(Aminosäuresequenz
entsprechend der Basensequenz, hergestellt durch Verbinden
von Guanin mit dem Beginn der Basensequenz des vierten
Exons von TNF-α),
worin X einen Teil der Bindung oder eine der folgenden
Aminosäuresequenzen darstellt:
dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus kultiviert
(gezüchtet) wird, der ein Plasmid enthält, das in dem
Wirts-Mikroorganismus wachsen kann und das DNA enthält,
welche die obengenannte Aminosäuresequenz codiert.
6. Antitumor-Agens, das ein Polypeptid mit der
nachstehend angegebenen Aminosäuresequenz umfaßt (enthält):
(Aminosäuresequenz von THβ&sub4;)-Asp-Pro-x-(Aminosäuresequenz
entsprechend der Basensequenz, hergestellt durch Verbinden
von Guanin mit dem Beginn der Basensequenz des vierten
Exons von TNF-α),
worin X einen Teil der Bindung oder eine der folgenden
Aminosäuresequenzen darstellt:
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