JP2828988B2

JP2828988B2 - 新規ｄｎａとその生産方法、それを有する新規プラスミド、新規ポリペプチドとその生産方法、及び該ポリペプチドからなる新規抗腫瘍剤

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Publication number: JP2828988B2
Application number: JP63081683A
Authority: JP
Inventors: 源一郎杣; 伝一水野; 良明辻
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Current assignee: Individual
Priority date: 1988-04-03
Filing date: 1988-04-03
Publication date: 1998-11-25
Anticipated expiration: 2013-11-25
Also published as: DE68913802D1; EP0341100A2; JPH01256390A; CA1340244C; EP0341100A3; EP0341100B1; DE68913802T2; ATE102997T1

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は新規DNA、詳細には、サイモシンβ_４（以
下、THβ_４と称す）とTNFとをコードする新規DNAとその
新規生産方法、それを含有する新規プラスミド、該DNA
により発現される新規ポリペプチドとその生産方法及
び、該ポリペプチドからなる新規抗腫瘍剤に関する。

［従来の技術］ THβ_４は、免疫能を回復させると報告されている胸腺
ホルモンであるサイモシンの１種（「現代化学」1985年
12月号34〜38頁）なので、腫瘍細胞等の悪性化骨髄細胞
を単球細胞に分化誘導する作用を有すると考えられてお
り、そのアミノ酸配列も次の通りに解明されている。

しかし、従来の方法では、ウシ胸腺1gから、わずか4.
1μｇが分離できる程度であり、また、精製操作も極め
て煩雑である［アナルズニューヨークアカデミー
オブサイエンシズ（Annals New York Academy of Sci
ences）,vol249,134頁、1975年］。即ち、THβ_４は、そ
れを高純度で大量に生産する方法が発明されていないた
めに、その有用性に関する研究は未だ大きな発展をみて
いない。

一方、TNFは腫瘍壊死因子の総称であり、ヒト起源の
ものとしては、ザジャーナルオブバイオロジカル
ケミストリー［The Journal of Biol.Chem.,260,2345
〜2354頁（1985年）］に記載されているヒト細胞株HL−
60（ATCC240）より得られたTNF−αが知られており、そ
のアミノ酸配列も次の通りに解明されている。

（上記アミノ酸配列において、初めから18番目のアミノ
酸であるAlaから最後のLeuまでのアミノ酸配列は、TNF
−αの第４エクソンの塩基配列の先頭にグアニン（Ｇ）
を連結した形の塩基配列に対応する。従って、明細書の
他の部分における記載においては、上記Ala〜Leu部分は
「TNF−αの第４エクソンの塩基配列の先頭にグアニン
を連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配列」と表
現する）しかし、このTNF−αが抗腫瘍活性を示す細胞は極め
て限定されており［サイエンス（Science），230,943〜
945頁（1985年）］、又、脂肪細胞の異化を亢進させる
いわゆるカケクチン活性を有することも報告されている
［セラピューティックリサーチ（Therapeutic Resear
ch）、７、第２号、184〜190頁、1987年］。そのため、
このTNF−αの欠陥を補うべく、いくつかの組換えTNF
（以下、rTNFと称す）が発明されている。

［発明が解決しようとする課題］このような状況下において、本発明の目的は、THβ_４
とTNFとをコードし、THβ_４を高純度で大量生産するこ
とを初めて可能にした新規DNAとその生産方法、それを
含有する新規プラスミド、該DNAにより発現される新規
ポリペプチドとその生産方法及び、該ポリペプチドから
なる新規抗腫瘍剤を提供することにある。

［課題を解決するための手段］本発明により、次のアミノ酸配列をコードする新規DN
Aが提供される。

（THβ_４のアミノ酸配列）−Asp−−Pro−ｘ−（TNF−
αの第４エクソンの塩基配列の先頭にグアニンを連結し
た形の塩基配列に対応するアミノ酸配列）（式中、ｘは
存在しないか、次のアミノ酸配列のいずれかを表す。

本発明の新規DNAは、THβ_４のアミノ酸配列をコード
するDNAと、ｘ−（TNF−αの第４エクソンの塩基配列の
先頭にグアニンを連結した形の塩基配列に対応するアミ
ノ酸配列）をコードするDNAとを、Asp−Proを連結部と
して連結させることにより生産される。

得られたDNAを発現させるには、それを適当なベクタ
ーDNAに発現されるように組み込み、得られたrDNAを用
いて、動物細胞、酵母、枯草菌、大腸菌等の微生物等の
宿主を形質転換し、発現を誘導すればよい。

又、その発現により得られたポリペプチドを終濃度0.
5〜2mg/mlで、例えばギ酸または酢酸等の適当な酸中で2
4〜48時間、37℃で反応させると分解し、THβ_４とｘ−
（TNF−αの第４エクソンの塩基配列の先頭にグアニン
を連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配列）（式
中、ｘは前記定義通りである）とが得られる。

（１）（THβ_４のアミノ酸配列）−Asp−Pro−ｘ−（TN
F−αの第４エクソンの塩基配列の先頭にグアニンを連
結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配列）をコード
するDNAの生産生産の方法としては、次の３つの形態が考えられる
が、そのいずれによってもよい。

１）（THβ_４のアミノ酸配列）−Asp−Proをコードする
DNAと、ｘ−（TNF−αの第４エクソンの塩基配列の先頭
にグアニンを連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸
配列）をコードするDNAを連結する。

２）（THβ_４のアミノ酸配列）をコードするDNAと、Asp
−Pro−ｘ−（TNF−αの第４エクソンの塩基配列の先頭
にグアニンを連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸
配列）をコードするDNAを連結する。

３）（THβ_４のアミノ酸配列）をコードするDNAと、Asp
−ProをコードするDNAと、ｘ−（TNF−αの第４エクソ
ンの塩基配列の先頭にグアニンを連結した形の塩基配列
に対応するアミノ酸配列）をコードするDNAとをその順
位で同時に連結する。

１）の場合の一例を説明すると、次の通りである。

悪性化骨髄細胞を生体外分化誘導物質で刺激して単球
細胞に分化する過程で合成されるmRNAの１種と相補的な
cDNAであるpHH58［バイオケミカルアンドバイオフ
ィジカルリサーチコミュニケーションズ（BIOCHEMI
CAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS）,vol.
132,No.1,100〜109頁（1985年）］をPst Iで処理し、得
られた約530bpのDNA断片を回収する。ついで、Hinf Iで
処理し、約220bpのPst I/Hinf I断片と約310bpのHinf I
/Pst I断片とを回収する。前者のPst I/Hinf I断片をMn
l I（米国ニューイングランドバイラボス社製）で切断
して127bpのMnl I/Hinf I断片を得、これをさきほどのH
inf I/Pst I断片と連結させて、THβ_４のアミノ酸配列
をコードするMnl I/Pst I断片を得る。この断片を、プ
ラスミドベクターpUC540のMnl I/Pst I断片に連結させ
て、プラスミドpUC540THβ_４（約3.5kb）を生産する。

pUC540は、ファルマシア社より市販されているプラス
ミドベクターpUC8のEcoR I/BamH I部位に、同じく同社
より市販されている、tacプロモーターを有するプラス
ミドpDR540のEcoR I/BamH I断片をクローニングしたも
のである。

ついでpUC540THβ_４から、BamH Iリンカーとの結合を
含む処理により、THβ_４のアミノ酸配列と、ｘ−（TNF
−αの第４エクソンの塩基配列の先頭にグアニンを連結
した形の塩基配列に対応するアミノ酸配列）との連結部
となるアミノ酸配列Asp−ProとをコードするDNAを生産
する。

ｘ−（TNF−αの第４エクソンの塩基配列の先頭にグ
アニンを連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配
列）をコードするDNAは、ヌクレイックアシッズリ
サーチ［（Nucleic Acids Res.）、10、7439〜7448頁
（1981年）］、バイオケミストリー［（Biochemistry］
17、1257〜1267頁（1978年）］等に記載されている方法
に準拠して、化学的に合成できる。

例えば、特開昭62−282587号公報（特願昭61−169522
号出願）の実施例２に開示されているpUC540^TNF21/22
［ｘが存在しない場合に対応する］、pUC540^TNF69/70
［ｘが前記１）に対応する］、pUC540^TNF72/73［ｘが前
記２）に対応する］、実施例３に開示されているpUC540
AMCT−１［ｘが前記３）に対応する］、或いは、後記実
施例で開示するpUC540AM1［ｘが前記４）に対応する］
或いはAM2［ｘが前記５）に対応する］は、ｘ−（TNF−
αの第４エクソンの塩基配列の先頭にグアニンを連結し
た形の塩基配列に対応するアミノ酸配列）をコードする
DNA部分がTacプロモーターのBamH I下流に連結され、Ba
mH I切断点直後に開始コドンとしてのATGを有し、これ
に続くアミノ酸の第１コドンがＧなので、それらをNco
I［日本ジーン（株）製］、ムングビーン（Mung Bea
n）ヌクレアーゼ、Pst Iで処理することにより目的とす
るｘ−（TNF−αの第４エクソンの先頭にグアニンを連
結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配列）をコード
するDNAを得ることができる。一例として、pUC540AM1を
使用した場合の例を実施例で詳しく述べる。

（２）プラスミドpUCTHβ₄/x−（TNF−αの第４エクソ
ンの塩基配列の先頭にグアニンを連結した形の塩基配列
に対応するアミノ酸配列）本発明のDNAをベクターDNAに発現可能なように組み込
むには、よく知られているように、プロモーター配列
（通常オペレータ配列の下流に存在している）とその下
流にシャイン・ダルガルノ配列（以下、SD配列と記す）
を有するベクターDNAのSD配列の下流に本発明のDNAを組
み込むか、ベクターDNAに本発明のDNAを組み込んだ後
に、その上流にプロモータ配列（通常オペレータ配列
も）及びSD配列を挿入すればよい。

rDNA技術により外来遺伝子の遺伝情報を微生物細胞内
で発現させる方法は、「遺伝子組換え実用化技術
（４）」（1983年）（サイエンスフォーラム社）、「モ
レキュラークローニング（Molecular Cloning）」（1
982年）［コールドスプリングハーバーラボラトリ
ー（Cold Spring Harbor Lab）］、「組換え遺伝子の細
胞への導入と発現」（1983年）（共立出版株式会社）等
に記載されている。

大腸菌を宿主として用いた場合の例を実施例に示す。

又、酵母を宿主として用いる時は、以下のようにす
る。

アルコール脱水素酵素（ADHI）のプロモーターを挿入
したプラスミドベクターpMA56［ネイチャー（Nature）2
98、347〜350頁（1982年）］は、プロモーター下流にEc
oR I部位を有しているため、本発明のDNAを、例えば、
実施例に記載してある組換え体よりBamH I−Pst I断片
として回収し、pMA56のADHIプロモーター下流のEcoR I
部位にEcoR I/BamH Iリンカー、Pst I/EcoR Iリンカー
を用いて挿入すればADHIプロモーターの支配になり、本
発明のDNAの遺伝情報は発現可能となる。

又、抑制酸性フォスファターゼ（PH05）プロモーター
を有するpAM82［プロシーデイングオブナショナル
アカデミーサイエンスオブユーエスエー（Proc
i Natl.Acad.Sci.U.S.A.）80、１〜５頁（1983年）］
は、PH05プロモーター下流にXho I部位を有するため、
本発明のDNAを、例えば、実施例に記載してある組換え
体よりBamH I−Pst I断片として回収し、pAM82のPH05プ
ロモーター下流のXho I部位にBamH I/Xho Iリンカー、P
st I/Xho Iリンカーを用いて挿入すればPH05プロモータ
ーの支配になり、その遺伝情報は酵母で発現可能とな
る。

又、枯草菌を宿主として用いても、以下のようにして
本発明のDNAの遺伝情報を発現させることができる。

バチルスサブチリスマーバース（Bacillus subti
lis Marburs）株の有するα−アミラーゼプロモーター
を有するpTUB285［ジーン（Gene）、34、148頁（1985
年）］は、プロモーター、及びシグナルペプチドの下流
にHinc II部位を有しているため、例えば、本発明のDNA
を、実施例に記載されている組換え体よりBamH I−Pst
I断片として回収し、pTUB285のHinc II部にシグナルペ
プチドのアミノ酸フレームと合うようなHinc II/BamH I
リンカー、Hinc II/Pst Iリンカーを用いて挿入してや
れば、α−アミラーゼプロモーターの支配をうけ、枯草
菌でも発現可能となる。

（３）抗腫瘍性ポリペプチドの分離、精製形質転換され
た宿主細胞を遠心分離などによって集め、超音波或いは
リゾチームなどで破砕する。このとき低張液を用いる
が、SDSなどの界面活性剤や塩酸グアニジンなどの蛋白
変性剤を共存させたほうが良い結果が得られる場合もあ
る。

細胞破砕液を遠心分離に付して上清液を得る。

このようにして得られる抗腫瘍性ポリペプチドを含む
破砕上清液を通常の蛋白質精製法に準じて精製する。

即ち、塩基性陰イオン交換体によるイオン交換クロマ
トグラフィー、塩析法、透析法、ゲル瀘過法、疏水クロ
マトグラフィー、高速分子篩クロマトグラフィー、電気
泳動法等を順次又は適宜組み合わせることによって精製
できる。

例えば、塩基性陰イオン交換体としてはDEAE−セファ
デックス（Sephadex）Ａ−25、Ａ−50、DEAE−セファロ
ース（Sepharose）CL−6B、DEAE−セファミル（Sephami
l）（以上、ファルマシア社製）が好ましく、その他、
ジエチルアミノ基、アミノエチル基又は四級化アミノエ
チル基含有陰イオン交換体も使用できる。

使用される緩衝液としては、pH6.0〜9.0のトリス−HC
l又はリン酸緩衝液が望ましく、これらの0.05M程度の希
薄な緩衝液で抗腫瘍性ポリペプチドの培養液を希釈し、
塩濃度0.1M以下の溶液として陰イオン交換体と接触させ
て抗腫瘍性ポリペプチドを吸着させる。

抗腫瘍性ポリペプチドの溶出は0.1〜0.2MのNaCl又はK
Cl等の塩類溶液で行う。抗腫瘍性ポリペプチドは0.2M付
近の塩濃度で溶出される。陰イオン交換体との接触はカ
ラム法が望ましいが、大量の場合はバッチ法も採用でき
る。

陰イオン交換クロマトグラフィーを行う前に、前処理
として限外瀘過膜で低分子物質を除去することが望まし
く、精製効果を上げることが出来る。

陰イオン交換クロマトグラフィーで得られた溶液は透
析後、濃縮してゲル瀘過に付す。ゲル瀘過用の担体とし
ては、セファデックスＧ−75、Ｇ−100（ファルマシア
社製）、セファクリル（Sephacryl）Ｓ−200（ファルマ
シア社製）、バイオゲル（Biogel）Ｐ−100（バイオラ
ッド社製）及びトーヨーパールHW−50、HW−55（東洋曹
達工業社製）等を使用する。

ゲル瀘過に使用する緩衝液はpH6.0〜9.0のトリス−HC
lまたはリン酸緩衝液である。吸着防止のため、0.2〜0.
5MのNaCl等の塩類を添加して使用することが望ましい。

又、陰イオン交換クロマトグラフィーで得られた抗腫
瘍性ポリペプチド活性溶液は、疏水クロマトグラフィー
で精製することもできる。この場合はブチル−トーヨー
パール650（東洋曹達工業社製）等を担体とし、硫安、N
aCl等の塩類を用いて抗腫瘍性ポリペプチドを溶出させ
る。

ゲル瀘過或いは疏水クロマトグラフィーで精製した抗
腫瘍性ポリペプチド含有液は、次いでモノ（Mono）Ｑ
HR5/5カラム（ファルマシア社製の高性能陰イオン交換
体カラム）を使用するファルマシアFPLC（Fast Protei
n,Peptide,Polynucleotide,Liquid Chromatography）シ
ステムによる高性能陰イオン交換体クロマトグラフィー
に付して、精製標品を得る。この高性能陰イオン交換体
クロマトグラフィーの条件は最初のDEAE−セファローズ
等の担体を使用する陰イオン交換クロマトグラフィーの
場合と同じである。

本発明の新規なDNAは、大別すると３つの有用性を持
つ。

第１の有用性は、それ自体が、新規な抗腫瘍性ポリペ
プチドをコードしている点にある。この抗腫瘍性は、Ｌ
−929細胞［プロシーディングオブナショナルア
カデミーサイエンスオブユーエスエー72,3666〜3
670頁］及び繊維芽肉腫メス（Meth）Ａ細胞［サイエン
ス（Science）230、944頁（1985年）］に対する細胞毒
性より確認されている。更に、この新規ポリペプチド
は、高い内因性TNF産生誘導活性を持っている。

第２の有用性は、その発現により得られるポリペプチ
ドをギ酸や酢酸などの適当な酸で処理すると、連結部で
あるAsp−Proの間で切断され、THβ_４と抗腫瘍性ポリペ
プチドであるｘ−（TNF−αの第４エクソンの塩基配列
の先頭にグアニンを連結した形の塩基配列に対応するア
ミノ酸配列）とを得られる点にある。前述の如く、本発
明のDNAは大腸菌等に組み込むことにより大量生産でき
るので、従来、大量生産が不可能であったTHβ_４の大量
生産が初めて可能になった。

第３の有用性は、本発明のDNAがコードするアミノ酸
配列において、（TNF−αの第４エクソンの塩基配列の
先頭にグアニンを連結した形の塩基配列に対応するアミ
ノ酸配列）の先頭のアミノ酸であるアラニン（Ala）の
塩基配列がGCGである場合には、制限酵素Nru I（TCGCG
A）の作用により、TNF−αの第４エクソン部分の塩基配
列と同一の塩基配列の前で塩基配列を切断し、任意の塩
基配列を導入できるという点にある。

なお、本発明の新規DNAがコードする新規ポリペプチ
ドのL929細胞に対する細胞毒性は、次のようにして分析
できる。

L929細胞に対する細胞毒性 A929細胞を、５％仔牛胎児血清（以下FCSと記す）を
加えたイーグルミニマムエッセンシャル培地（以下MEM
と記す）で育成し、８×10⁴個の細胞が100μの同上培
地に含まれる様にし、96穴の平底プレートで育種する。
育種条件は37℃、２時間、５％CO₂、100％H₂Oであり、
通常の細胞培養に用いられる方法でよい。その後、アク
チノマイシンＤを培地中に終濃度１μg/mlとなるように
加え、培養液の液量を150μとする。即座に、検体を
適当にMEM培地で稀釈したものを50μ加える（この際
稀釈率を適宜調製し、ED₅₀を求める事ができる）。更
に、最終液量200μとなったL929細胞を上記条件で18
時間培養する。細胞壊死活性を測定するには、まず全培
地を除去し、ついで0.2％クリスタルバイオレットを含
む２％メチルアルコール溶液を加えて固定染色する。ク
リスタルバイオレットは全有核細胞を染色し、細胞壊死
を生じた結果プレート底面より遊離した細胞は染色しな
いので、細胞壊死活性を直接測定できる。この染色度を
OD_590nmでの吸収で測定し、対照群に対する染色度と比
較する事で細胞壊死活性を測定する。活性の定義は次の
様に行う。

L929細胞が50％生存できる検体原液の稀釈率（Ｎ）を
求める。対照としてウサギTNSを使用し、このウサギTNS
の活性ｎ（単位/ml）を2.4×10⁶単位/mg/mlのヒトTNFを
用いて決定する。このウサギTNSのED₅₀を与える稀釈率
（Ｃ）を求める。

検体原液の活性（単位/ml）はで計算する。

以下、実施例、実験例により本発明を更に詳細に説明
する。

実施例（１）（THβ_４のアミノ酸配列）−Asp−Pro−ｘ−（TN
F−αの第４エクソンの塩基配列の先頭にグアニンを連
結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配列）をコード
するDNAの生産１）pHH58（100μｇ）を250単位のPst Iで消化し（37
℃）、1.2％アガロースゲルで、530塩基対からなるPst
I/Pst I断片を分離した。ゲルからこのDNAを抽出し、ハ
イドロキシルアパタイトカラムで精製して、2.7μｇのD
NAを回収した。

２）ついでこのDNAを12単位のHinf Iで消化し、８％ア
クリルアミドゲルで、220の塩基対からなる^５′Pst I/H
inf I^３′断片と、310塩基対からなる^５′Hinf I/Pst I
^３′断片とを別々に回収した。この回収は、ゲルから両
断片を抽出後、DEAEセルロースカラムを用いる通常の方
法により実施した。両断片の回収量は、紫外線吸収（OD
260nm）での検出が不可能と考え、回収率を100％とし
て、以下の計算式により推定した。

３）Pst I/Hinf I断片を８単位のMnl Iで消化し、８％
アクリルアミドゲルで、127塩基対からなるMnl I/Hinf
I断片を分離、回収した。（回収量は約100〜150ng）。

４）26ngのMnl I/Hinf I断片と、65ngのHinf I/Pst I断
片を混ぜ、87単位のT4DNAリガーゼを加え、16℃で１時
間反応させた。ついで、70℃、５分の処理によって酵素
を失活させた後、15単位のPst Iを加え、37℃で２時間
培養して約90ngのDNAを得た。

５）上記４）で得られたDNAを、100mMのNaClの存在下、
エタノール（終濃度70％）中でpUC540のBamH I/Pst I断
片（26ng）と混じた。沈澱物を回収し、５μの蒸留水
に溶かし、約0.5μになる迄凍結乾燥して、エタノー
ルと蒸留水を除去した。ついで、10×リガーゼ反応緩衝
液［10mMのATP＋660mMのトリス一塩酸（pH7.6）＋66mM
の塩化マグネシウム＋50mMのジチオスレイトール］を0.
4μ、T4DNAリガーゼを35単位加えて、４℃で一晩培養
して、約3.5kbのpUC540THβ_４を得た。

６）100μｇのpUC540THβ_４を190単位のHinf Iにより、
37℃で一晩消化させ、そのうちの50μｇを、80μＭのデ
オキシATPと80μＭのデオキシTTPの存在下、DNAポリメ
ラーゼＩのクレノウ（Klenow）断片（40単位）と混じ、
室温で30分間培養した。

７）70℃、５分間の加熱処理で上記クレノウ断片を失活
させた後、120単位のBamH Iを加えて37℃で３時間培養
した。

７）８％アクリルゲルを使い、BamH I部位、Hinf I部位
をＡ及びＴで修復して平滑末端として、DEAEセルロース
カラムを使い、約450ngの135bpのDNAを分離、回収し
た。

８）上記７）で得られたDNAの27ngと、1.6ngのBamH Iリ
ンカーとを、87単位のT4DNAリガーゼの存在下で合わせ
て、４℃で一晩培養して、（THβ_４のアミノ酸配列）−
Asp−ProをコードするDNAを生産した。

９）ヒト急性単球性白血病細胞THP−１から精製された
抗腫瘍性ポリペプチドのゲノム遺伝子（特開昭62−2825
87号公報）をXho I,Pst Iで切断し、第１図に示すXho I
/Pst I断片を回収した。次にこの断片を、Tacプロモー
ター及びSD配列を有するプラスミドベクターpUC540のSa
l I/Pst I部位に挿入して、プラスミドpUC540^TNFx/pを
調製した。

10）別途、第１図に示すXho I/Pst I断片をHinc IIで切
断し、294塩基対のXho I/Hinc II断片と、521塩基対のH
inc II/Pst I断片を回収し、又、294塩基対の該断片をD
de Iで部分分解して、206塩基対のDde I/Hinc II断片を
回収した。

この様にして回収した521塩基対のHinc II/Pst I断
片、206塩基対のDde I/Hinc II断片を、ABI社（米国）
の380A型DNAシンセサイザーで合成した、第１表に示す7
2/73塩基対の２本鎖DNAと結合させた後に、pUC540^TNFx/
pのBamH I/Pst I部位に挿入してpUC540^TNFAM1を生成し
た。

11）pUC540^TNFAM1（100μｇ）に120単位のNco Iを加
え、37℃で一晩培養した。寒天ゲル電気泳動で完全消化
を確認後、フェノール抽出、クロロホルム抽出を行い、
セファデックスG50カラムでDNAを精製した。

12）90単位のムングビーンヌクレアーゼを加えて37
℃で10分間経過させた。次いで、70℃で５分間の加熱処
理を行って、該ヌクレアーゼを失活させた。

13）160単位のPst Iを加えて37℃で一晩培養した。次い
で、５％アクリルアミドゲルで、770塩基対のDNA（約１
μｇ）を回収した。

14）上記した１）〜８）の手順で得られたDNA（28.6n
g）と、上記した９）〜13）の手順で得られたDNA（157n
g）を、87単位のT4DNAリガーゼの存在下、４℃で一晩培
養した。次いで、70℃で10分間の加熱処理により該リガ
ーゼを失活させた。

15）0.8単位のPst Iを加え、37℃で12時間培養した後、
70℃で10分間の加熱処理によりPst Iを失活させた。次
いで、プラスミドベクターpUC540のBamH I/Pst I断片
（76μｇ）と混ぜ、90単位のT4DNAリガーゼの存在下、
４℃で一晩培養して、プラスミドpU540（THβ_４のアミ
ノ酸配列）−Asp−Pro−ｘ−（TNF−αの第４エクソン
の塩基配列の先頭にグアニンを連結した形の塩基配列に
対応するアミノ酸配列）（式中、ｘはVal−Arg−Ser−S
er−Thr−Arg−Thr−Pro−Ser−Arg−Lys−Pro−Val−A
la−His−Val−Valを表す）を生成した。

16）上記15）で生成したプラスミドを有する大腸菌（DH
−１）を、アンピシリン（50μg/ml）とカナマイシン
（10μg/ml）を含む10mlのNZY培地［5gのNaCl、2gのMgC
l₂・7H₂O、10gのNZアミンＡ（株式会社和光純薬製）、5
gのイーストエキスを混合し、蒸留水で全量を１とし
た培地］で37℃で一晩、振とう培養した。この培養液の
10mlを、アンピシリン（50μg/ml）とカナマイシン（10
μg/ml）を含む100mlのNZY培地に加え、37℃で６時間振
とう培養した。次いで、この培養液の全量（約100ml）
を、0.7mMのイソプロピルβ−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド、アンピシリン（50μg/ml）、カナマイシン（10μg/
ml）を含む１のNZY培地に加えて、37℃一晩振とう培
養した。

17）このようにして得られた大腸菌を遠心分離（5000rp
m、10分）に付し、沈澱を100mlのPBS（−）（ニッスイ
社製）に懸濁した。この懸濁液を遠心分離（5000rpm、1
0分）に付して菌体を集め、1mMのフェニルメチルスルホ
ニルフルオライド（蛋白分解酵素阻害剤）に懸濁した。
得られた菌体浮遊液を10mlずつ超音波に付して［ブラン
ソンソニファイア（Branson sonifier）の目盛り40で
６分間を３回）、大腸菌を破壊した。

18）10000rpm、１時間の遠心操作に付して上清を回収し
た。この上清の、L929細胞に対するTNF活性は1.85×10⁶
単位/mlだった。

19）上記上清の硫安画分（60％飽和）を分取した。この
画分を10000rpm、30分の遠心処理に付して沈澱を得、こ
の沈澱を5mlのPBS（−）に溶かし、５の10mMトリス−
HCl（pH7.4）＋10mM NaClに対して透析した。次いで、1
3000rpmで一晩遠心処理に付して不溶物を除いて、上清
を回収した。

20）この上清をファルマシア社製のモノQFPLCカラムク
ロマトグラフィーに付した。流速は2.0ml/分とし、NaCl
濃度を0.01Mから1Mまで直線的に上げる段階的溶出法に
より各20mlの画分を集めた。溶出パターンを第２図に示
す。

第２図において、横軸に沿った連続番号はそれぞれの
画分を表し、曲線は蛋白の溶出量を表し、柱状グラフ
は、L929細胞に対するTNF活性（単位）を表し、直線は
溶出液の塩濃度（0.01M〜1M）を表している。

21）（THβ_４のアミノ酸配列）−Asp−Pro−ｘ−（TNF
−αの第４エクソンの塩基配列の先頭にグアニンを連結
した形の塩基配列に対応するアミノ酸配列）（式中、ｘ
はVal−Arg−Ser−Ser−Thr−Arg−Thr−Pro−Ser−Arg
−Lys−Pro−Val−Ala−His−Val−Valを表す）の構造
をした蛋白を多量に含む活性画分（23〜27）を集め、再
度モノＱカラムにかけて、ほぼ単一ピーク（精製度＞95
％）を持つ画分（7.5ml）を分取した。溶出パターンを
第３図に示す。

第３図において、横軸に沿った連続番号、曲線、柱状
グラフ、直線が表すものは第２図におけると同じであ
る。

上記画分のL929細胞に対するTNF活性は、2.5×10⁶単
位/mlだった。又、ファルマシアスペローズ（Pharmac
ia Superose）12カラム（ゲル瀘過）に付して分子量を
調べたら、67000ダルトン以上であり、３量体ないし４
量体の構造をとっているものと推定された。又、SDS電
気泳動法によると、22000ダルトンであった。

参考例１実施例中の９）〜13）の手順で得られたrDNA（以下、
rTNF−Ｓ−AM1と称す）を有する大腸菌JM103を、アンピ
シリン50μg/mlを含む１×YT培地（バクトトリプトン0.
8％、バクトイーストエキス0.5％、NaCl0.5％）で37℃
で前培養した後、アンピシリン50μg/mlを含む１×YT培
地100mlを含む500ml坂口フラスコに１％植菌し、同様に
37℃で培養し、0D₆₆₀＝0.3に達した時にイソプロピルβ
−Ｄ−チオガラクトピラノシドを最終濃度0.7mMになる
ように添加し、更に24時間培養を続けた。大腸菌を遠心
分離により集め、１×PBS（NaCl0.8％、KCl0.02％,KH₂P
O₄0.02％、Na₂HPO₄0.115％）で洗浄後、再び10mlの１×
PBSに懸濁し、超音波で大腸菌を破砕した。次いで、通
常の蛋白質精製法により、rTNF−Ｓ−AM1により発現さ
れたポリペプチドを分離、精製した。このポリペポチド
（以下、AM1と称す）のアミノ酸配列は次の通りであ
り、その分子量は17500±500（SDSポリアクリルアミド
電気泳動法）であった。

Val−Arg−Ser−Ser−Thr−Arg−Thr−Pro−Ser−Arg−
Lys−Pro−Val−Ala−His−Val−Val−（TNF−αの第４
エクソンの塩基配列の先頭にグアニンを連結した形の塩
基配列に対応するアミノ酸配列）参考例２実施例中の第１表に示された合成DNAの先頭から５番
目のアミノ酸であるSerをCysに代え、実施例中の９）〜
13）と同じ手順で得られたrDNA（以下、rTNF−Ｓ−AM2
と称す）を有する大腸菌JM103を、参考例１と同様に処
理して、rTNF−Ｓ−AM2により発現されたポリペプチド
を分離、精製した。このポリペポチド（以下、AM2と称
す）のアミノ酸配列は次の通りであり、その分子量は17
500±500（SDSポリアクリルアミド電気泳動法）であっ
た。

Val−Arg−Ser−Cys−Thr−Arg−Thr−Pro−Ser−Arg−
Lys−Pro−Val−Ala−His−Val−Val−（TNF−αの第４
エクソンの塩基配列の先頭にグアニンを連結した形の塩
基配列に対応するアミノ酸配列）実験例１メスＡ腫瘍に対する抗腫瘍活性 10週齢のBALB/c雄マウスの腹部皮内に、同系腫瘍であ
る繊維芽肉腫メスＡ細胞を２×10⁵個移植した。７日
後、平均腫瘍径が５〜6mmに達したマウスに、生理的食
塩水（対照）、実施例で得られた本発明のポリペプチド
（L929細胞に対する活性単位として10000単位）又は、
参考例２で生成されたAM2（L929細胞に対する活性単位
として10000単位）を尾静脈より投与した。この投与は
合計３回（腫瘍移植後７、10、13日目）行った。

腫瘍移植後７日目、10日目、13日目、17日目、21日目
に腫瘍の短径と長径を測定し、その相乗平均を腫瘍径と
して記録した。結果（各群３匹の平均）を第４図に示
す。

第４図に示されるように、本発明のポリペプチドは対
照に対し、危険率５％以下で有意差があるが、AM2で
は、対照に対して有意差は認められなかった。

実験例２内因性TNF産生誘導活性７週齢のC3H/He雄マウスに、プライマーとしての、実
施例で得られた本発明のポリペプチド又は参考例１で得
られたAM1をそれぞれ、L929細胞に対する活性単位とし
て１単位又は10000単位を尾静脈より投与した。対照群
には生理的食塩水を投与した。

その３時間後に、トリガーとしてのピシバニール（登
録商標、中外製薬株式会社製）を3KE［クリニッシェ
アインハイト（Klinische Einheit）系単位であり、1KE
は、0.1mgの乾燥細菌を含む製剤量に当たる］尾静脈か
ら投与した。その２時間後に鼠蹊部動脈から採血し、血
清を分離して、そのTNF活性を、L929細胞に対する活性
単位として測定した。結果（各群３匹、AM1投与群は４
匹の平均）を第５図に示す。

第５図に示されるように、本発明のポリペプチドは１
単位で約20倍の内因性TNF産生増強効果を示したが、AM1
にはかかる効果はほとんどなかった。10000単位では、
共に、70〜150倍という高い増強効果を示した。

参考例実施例で得られた蛋白を凍結乾燥後、終濃度0.5〜2mg
/ml、37℃、70％ギ酸中で24時間反応させて、下記条件
のSDSポリアクリルアミド電気泳動により、生成された
蛋白を検出した。

分離ゲル:15％アクリルアミド＋0.4％ビスアクリルアミ
ド＋0.375Mトリス−HCl（pH8.8）＋0.1％SDS＋0.08％TE
MED（N,N,N,N−テトラメチレンエチレンジアミン＋0.08
％過硫酸アンモニウム濃縮ゲル:5％アクリルアミド＋0.13％ビスアクリルアミ
ド＋0.125Mトリス−HCl（pH6.8）＋0.1％SDS＋0.2％TEM
ED＋0.075％過硫酸アンモニウム泳動バッファー:0.025Mトリス−HCl＋0.192Mグリシン＋
0.1％SDS（pH約8.3）泳動条件:20mA定電流で約4.5〜５時間染色・脱色：泳動終了後、ゲルを20％トリクロロ酢酸
で、室温、30分の条件で固定し、コーマジーブリリア
ントブルー（Coomassie brilliant blue）Ｒ−250の
エタノール・酢酸・水（9:2:9）混液中0.25％溶液で蛋
白のバンドを染色する。脱色は、エタノール・酢酸・水
（25:8:65）混液で行う。

その結果、分子量約17000と、分子量約5000のところ
にバンドが検出された。

これらのバンドはそれぞれ、TNFに対する抗体、THβ
_４に対する抗体と結合することが確認された。

［発明の効果］本発明により、新規な抗腫瘍性ポリペプチドをコード
する新規DNAが提供される。この抗腫瘍性は、Ｌ−929細
胞及び繊維芽肉腫メスＡ細胞に対する細胞毒性により確
認されている。更に、この新規ポリペプチドは、高い内
因性TNF産生誘導活性を持っている。

又、本発明の新規ポリペプチドをギ酸，酢酸等の適当
な酸で処理すると、THβ_４と抗腫瘍性ポリペプチドとを
得られる。本発明のDNAは大腸菌等に組み込むことによ
り大量生産できるので、従来、大量生産が不可能であっ
たTHβ_４の大量生産が初めて可能になった。

又、本発明のDNAがコードするアミノ酸配列におい
て、（TNF−αの第４エクソンの塩基配列の先頭にグア
ニンを連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配列）
の先頭のアミノ酸であるアラニン（Ala）の塩基配列がG
CGである場合には、制限酵素Nru I（TCGCGA）の作用に
より、TNF−αの第４エクソンの塩基配列と同一の塩基
配列の前で塩基配列を切断し、任意の塩基配列を導入で
きるという利点がある。

【図面の簡単な説明】

第１図は、THP−１細胞から精製された抗腫瘍性ポリペ
プチドのゲノム遺伝子のXho I/Pst I断片の塩基配列を
示す。第２図は、実施例で得られた本発明のポリペプチドを含
む遠心分離の上清を第１回のファルマシア社製のモノQF
PLCカラムクロマトグラフィーに付した際の溶出パター
ンを示す。第３図は、第２図に示された溶出パターンを参考にして
集められた活性画分を第２回のファルマシア社製のモノ
QFPLCカラムクロマトグラフィーに付した際の溶出パタ
ーンを示す。第４図は、実施例で得られた本発明のポリペプチドの、
繊維芽肉腫メスＡ細胞に対する抗腫瘍効果を示すグラフ
である。第５図は、実施例で得られた本発明のポリペプチドの、
内因性TNF産生増強効果を示すグラフである。第２、３図において、横軸に沿った連続番号はそれぞれ
の画分を表し、曲線は蛋白の溶出量を表し、柱状グラフ
は、L929細胞に対するTNF活性（単位）を表し、直線は
溶出液の塩濃度（0.01M〜1M）を表している。第４図において、○は対照群の、△は本発明には含まれ
ないポリペプチドAM2の、□は本発明のポリペプチドの
データを示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＬＡ６１Ｋ 37/24 ＡＤＵ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12P 21/00 - 21/06 C07K 14/00 - 14/825 C07K 19/00 A61K 37/24 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇｅｎｅｔｙｘ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】下記アミノ酸配列をコードするDNA。（サイモシンβ_４のアミノ酸配列）−Asp−Pro−ｘ−
（TNF−αの第４エクソンの塩素配列の先頭にグアニン
を連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配列）（式中、ｘは存在しないか、次のアミノ酸配列のいずれ
かを表す。
【請求項２】下記アミノ酸配列をコードするDNAの生産
方法において、（サイモシンβ_４のアミノ酸配列）−Asp−Pro−ｘ−
（TNF−αの第４エクソンの塩基配列の先頭にグアニン
を連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配列）（式中、ｘは存在しないか、次のアミノ酸配列のいずれ
かである。（サイモシンβ_４のアミノ酸配列）−Asp−Proをコード
するDNAと、ｘ−（TNF−αの第４エクソンの塩基配列の
先頭にグアニンを連結した形の塩基配列に対応するアミ
ノ酸配列）をコードするDNAとを連結させる工程；（サイモシンβ_４のアミノ酸配列）をコードするDNA
と、Asp−Pro−ｘ−（TNF−αの第４エクソンの塩基配
列の先頭にグアニンを連結した形の塩基配列に対応する
アミノ酸配列）をコードするDNAとを連結させる工程；（サイモシンβ_４のアミノ酸配列）をコードするDNA
と、Asp−ProをコードするDNAと、ｘ−（TNF−αの第４
エクソンの塩基配列の先頭にグアニンを連結した形の塩
基配列に対応するアミノ酸配列）をコードするDNAとを
その順位で同時に連結させる工程；のいずれかを含む方法。
【請求項３】下記アミノ酸配列をコードするDNAを含有
するプラスミド。（サイモシンβ_４のアミノ酸配列）−Asp−Pro−ｘ−
（TNF−αの第４エクソンの塩基配列の先頭にグアニン
を連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配列）（式中、ｘは存在しないか、次のアミノ酸配列のいずれ
かを表す。
【請求項４】下記アミノ酸配列で表されるポリペプチ
ド。（サイモシンβ_４のアミノ酸配列）−Asp−Pro−ｘ−
（TNF−αの第４エクソンの塩基配列の先頭にグアニン
を連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配列）（式中、ｘは存在しないか、次のアミノ酸配列のいずれ
かを表す。
【請求項５】宿主微生物細胞内で増殖しうるプラスミド
に挿入されている、下記アミノ酸配列をコードするDNA
を有する宿主微生物を培養することを特徴とする、下記
アミノ酸配列で表されるポリペプチドの生産方法。（サイモシンβ_４のアミノ酸配列）−Asp−Pro−ｘ−
（TNF−αの第４エクソンの塩基配列の先頭にグアニン
を連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配列）（式中、ｘは存在しないか、次のアミノ酸配列のいずれ
かを表す。
【請求項６】下記アミノ酸配列で表されるポリペプチド
からなる抗腫瘍剤。（サイモシンβ_４のアミノ酸配列）−Asp−Pro−ｘ−
（TNF−αの第４エクソンの塩基配列の先頭にグアニン
を連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配列）（式中、ｘは存在しないか、次のアミノ酸配列のいずれ
かを表す。