DE69027961T2 - Protein, DNA und ihre Verwendung - Google Patents
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Description
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine DNA, die ein DNA-Segment enthält, welches für ein Xenopus laevis-Knochenmorphogenese-Protein, das zu einem Knochenmorphogenese-Protein (nachstehend als BMP bezeichnet) analog ist, insbesondere ein Vorläuferprotein (oder ein Vorläuferpolypeptid) und ein reifes Protein (oder ein reifes Polypeptid) des Xenopus laevis-BMP kodiert, und auf ein Verfahren zum Herstellen des Vorläuferproteins und des reifen Proteins.
- In dieser Beschreibung schließt der Ausdruck "Vorläuferprotein" ein Protein ein, das eine Aminosäurensequenz des reifen Peptids Xenopus laevis-BMP einschließt und die gesamte, mit einem Xenopus laevis-BMP-DNA-Segment am N-Terminus, am C-Terminus oder beiden Termini davon kodierte Aminosäurensequenz oder einen Teil besitzt.
- Kürzlich ist gefunden worden, daß der Transformierunswachstumsfaktor-beta (TGF-beta, TGF-β) mit einer Knochenmorphogeneseaktivität nicht nur das Zellwachstum steuert, sondern auch verschiedene biologische Aktivitäten wie etwa die Kontrolle der Zelldifferenzierung besitzt. Insbesondere ist eine knochenmorphogenesefördernde Aktivität von TGF-β festgestellt worden und es sind Versuche unternommen worden, TGF zur Behandlung von Brüchen und Osteoporose zu verwenden, wobei von dessen Knorpel-Knocheninduktionsaktivität Gebrauch gemacht wurde [M. Noda et al., J. Endocrinology 124, 2991-2994 (1989); M. E. Joyce et al., J. Bone Mineral Res. 4, S-259 (1989), und S. M. Seydin et al., J. Biol. Chem. 281, 5693-5695 (1986)]. Vor kurzem sind jedoch vier Arten Knochenmorphogenese-Proteine (BMP), die sich voneinander in der molekularen Struktur unterscheiden, als die Morphogenese von Knochen und Knorpeln fördernder Faktor erkannt worden. Von diesen vier Arten sind Human-BMP-1, Human-BMP-2A, Human-BMP-2B und Human-BMP-3 neue Peptide, obschon sie in der Struktur TGF-β ähnlich sind und es gibt einen Bericht, daß sie die Morphogenese von Knochen und Knorpeln auslösen, wenn sie subkutan oder intramuskulär in Tiere implantiert werden [J. M. Wozney et al., Science 242, 1528-1534 (1988)].
- Die vorstehenden Peptide mit Knochenmorphogeneseaktivität werden aus Knochen, von denen angenommen wird, daß sich die Peptide darin befinden, oder aus menschlichen Osteosarkomzellen (U2-OS), von denen angenommen wird, daß sie Peptide produzieren, isoliert und gereinigt. Ein derartiges Verfahren hat jedoch Probleme, weil die Arbeitsweise kompliziert ist und die gewünschten Peptide nur in geringen Mengen erhalten werden.
- Für zukünftige Untersuchungen und die medizinische Behandlung würden wichtige Beiträge geliefert werden, falls ein ähnliches Peptid mit Knochenmorphogeneseaktivität aus Xenopus laevis gesammelt und weiter durch die Gentechnik hergestellt werden könnte. Als Ergebnis wurde die folgende Information erhalten, wodurch man zur vorliegenden Erfindung gelangte.
- Die Erfinder waren zuerst beim Klonieren von fünf Arten DNA, die für BMP-2A und verwandte DNA (Xenopus laevis-BMP) kodieren, und nachfolgend drei Arten komplementäre DNA, insgesamt acht Arten DNA, erfolgreich, indem sie eine komplementäre DNA einer gleichermaßen zur TGF-β-Familie gehörenden komplementären DNA einer Ratten-Inhibin-βA-Kette als Sonde verwendeten. Weiter identifizierten die Erfinder Teile der DNA-Basen, klärten die Aminosäurensequenzen (siehe Formeln (I), (II), (III), (IV) und (V) von Fig. 3 und Formeln (VI), (VII) und (VIII) von Fig. 4) der Xenopus laevis-BMP auf (als B9, M3, C4, A4, A5, Xbr22, Xbr23 und Xbr4l bezeichnet) und waren beim Bereiten des Weges für eine Massenherstellung durch die Gentechnik erfolgreich.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung wird (1) ein Xenopus laevis- BMP, wobei das Protein ein reifes Protein ist, das eine Aminosäurensequenz mit einer Aminosäurensequenz, welche durch die Nr. 15 bis 130 der in Fig. 3 dargestellten Formel (I) dargestellt wird, einer Aminosäurensequenz, welche durch die Nr. 14 bis 127 der in Fig. 3 dargestellten Formel (II) dargestellt wird, einer Aminosäurensequenz, welche durch die Nr. 6 bis 63 der in Fig. 3 dargestellten Formel (IV) dargestellt wird, einer Aminosäurensequenz, welche durch die Nr. 6 bis 65 der in Fig. 3 dargestellten Formel (V) dargestellt wird, einer Aminosäurensequenz, welche durch die Nr. 282 bis 398 oder Nr. 298 bis 398 der in Fig. 4 dargestellten Formel (VI) dargestellt wird, oder einer Aminosäurensequenz, welche durch die Nr. 328 bis 426 der in Fig. 4 dargestellten Formel (VIII) dargestellt wird, enthält und wobei das Protein ein Vorläuferprotein ist, das eine Aminosäurensequenz mit einer Aminosäurensequenz enthält, welche durch die in Fig. 3 dargestellte Formel (I), (II), (IV) oder (V) oder in Fig. 4 dargestellte Formel (VI) oder (VIII) dargestellt wird, enthält; (2) eine DNA, die ein für das in (1) definierte Xenopus laevis- BMP kodierendes DNA-Segment umfaßt, und eine DNA, die ein DNA- Segment umfaßt, das für das Xenopus laevis-BMP kodiert, bei dem das DNA-Segment eine Nukleotidsequenz umfaßt, die der Nukleotidsequenz entspricht, welche durch die in Fig. 2 dargestellte Formel (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) oder (8) dargestellt wird; (3) eine nicht-humane Transformante, die eine DNA trägt, welche das DNA-Segment enthält, das für das in (2) definierte Xenopus laevis-BMP definierte kodiert, das nicht Xenopus laevis ist; (4) ein Verfahren zum Herstellen des Xenopus laevis-BMP, welches das Kultivieren der in (3) beschriebenen nicht-humanen Transformante, das Erzeugen und Anreichern des Proteins in einer Kultur und das Isolieren des auf diese Weise erhaltenen Proteins umfaßt; (5) eine Zusammensetzung zur Fraktur- oder Osteoporosetherapie, die das in (1) definierte Xenopus laevis-BMP enthält, und (6) ein Verfahren zum Herstellen der in (5) definierten Zusammensetzung bereitgestellt.
- Fig. 1 zeigt vereinfachte Restriktionsenzymkarten von DNA-Sequenzen, die Xenopus laevis-BMP-Vorläufer oder reife Peptid-DNA- Segmente enthalten;
- Fig. 2(1) bis 2(8) zeigen Nukleotidsequenzen der DNA-Segmente der Xenopus laevis-BMP B9, M3, C4, A4, AS, BMP-2A, BMP-28 beziehungsweise Vgr-1 und die daraus abgeleiteten Aminosäurensequenzen;
- Fig. 3 zeigt Aminosäurensequenzen der Xenopus laevis-BMP, die aus den Nukleotidsequenzen der in Fig. 2(1) bis 2(5) dargestellten DNA-Segmente abgeleitet wurden, wobei sie mit den Aminosäurensequenzen bekannter Proteine mit Knochenmorphogeneseaktivität verglichen werden, und
- Fig. 4 zeigt die Aminosäurensequenzen der Xenopus laevis-BMP, die aus den in Fig. 2 (6) bis 2 (8) dargestellten Nukleotidsequenzen der CDNA-Segmente abgeleitet wurden.
- Das reife Xenopus laevis-BMP von C4, einem der Xenopus laevis- BMP der vorliegenden Erfindung, welches eine Verwandtschaft mit TGF-β besitzt und ein Peptid ist, das aus 98 oder 114 Aminosäurenresten besteht, hat eine durch Nr. 6 bis 119 oder Nr. 22 bis 119 der in Fig. 3 dargestellten Formel (III) dargestellte Aminosäurensequenz. Das Molekulargewicht desselben ist zu etwa 25000 berechnet, wobei Zuckerketten ausgenommen sind, wenn ein Dimer gebildet wird.
- Die Aminosäurensequenz dieses Peptids unterscheidet sich von der von Wozney et al. berichteten in 3 oder 4 Aminosäurenresten je Molekül.
- Fig. 3 zeigt die Aminosäurensequenzen von fünf Arten in der vorliegenden Erfindung erhaltener neuer Xenopus laevis-BMP, wobei sie mit den Aminosäurensequenzen bekannter Proteine mit einer Knochenmorphogeneseaktivität verglichen werden. In diesen Aminosäurensequenzen wird derselbe Aminosäurenrest wie bei βA durch "." dargestellt und ein von dem von βA verschiedener Aminosäurenrest wird durch ein auf βA beruhendes Einbuchstabensystem dargestellt. In Fig. 3 angeführtes CONSENSUS bezeichnet allen in Fig. 3 dargestellten BMP gemeinsame Aminosäurenreste. Die Veranschaulichung von CONSENSUS führt zur Einführung von Lücken "-" in den Formeln in Fig. 3. Dementsprechend wird die die Abschnitte des Vorläufer- und reifen Proteins darstellende Zahl unter Ausschluß dieser fehlenden Abschnitte gezählt.
- Fig. 4 zeigt die Aminosäurensequenzen der drei Arten aus cDNA abgeleiteter, neuer Xenopus laevis-BMP, die darauffolgend von den Erfindern entdeckt wurden.
- Was die DNA-Sequenzen betrifft, entsprechen die für die Xenopus laevis-BMP der vorliegenden Erfindung kodierenden DNA-Segmente den in Fig. 2 dargestellten Nukleotidsequenzen der Formeln (1) bis (8) (entsprechend B9, M3, C4, A4, A5, Xbr22, Xbr23 beziehungsweise Xbr41) oder sind Abschnitte derselben. Jeder funktionelle Abschnitt kann verwendet werden, so lang die Knochenmorphogeneseaktivitat nicht verloren wurde. Wozney et al. teilen die Aminosäurensequenzen mit, klären aber die Nukleotidsequenzen nicht auf. Hierin verwendet, erlaubt der Ausdruck entsprechend mäßige Hinzufügungen, Auslassungen und Ersetzungen. Vorzugsweise haben die für die BMP der vorliegenden Erfindung kodierenden DNA-Segmente die Nukleotidsequenzen der Formeln (1) bis (8).
- Im Hinblick auf den sich auf reife BNP beziehenden Abschnitt [die Aminosäurensequenz, die durch Nr. 15 bis 130 der in Fig. 3 gezeigten Formel (I) dargestellt wird, die Aminosäurensequenz, die durch Nr. 14 bis 127 der in Fig. 3 gezeigten Formel (II) dargestellt wird, die Aminosäurensequenz, die durch Nr. 6 bis 119 oder Nr. 22 bis 119 der in Fig. 3 gezeigten Formel (III) dargestellt wird, die Aminosäurensequenz, die durch Nr. 6 bis 63 der in Fig. 3 gezeigten Formel (IV) dargestellt wird, die Aminosäurensequenz, die durch Nr. 6 bis 65 der in Fig. 3 gezeigten Formel (V) dargestellt wird, die Aminosäurensequenz, die durch Nr. 282 bis 398 oder Nr. 298 bis 398 der in Fig. 4 gezeigten Formel (VI) dargestellt wird, die Aminosäurensequenz, die durch Nr. 288 bis 401 oder Nr. 304 bis 401 der in Fig. 4 gezeigten Formel (VII) dargestellt wird, oder die Aminosäurensequenz, die durch Nr. 328 bis 426 der in Fig. 4 gezeigten Formel (VIII) dargestellt wird] unterscheiden sich die DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung von der DNA-Sequenz von TGF-β und sind deshalb neu.
- Was die DNA-Sequenzen betrifft, die für die Aminosäurensequenzen der reifen Peptide der BMP der vorliegenden Erfindung kodieren, können alle DNA-Sequenzen verwendet werden, so lang sie Nukleotidsequenzen enthalten, die für die Aminosäurensequenzen der reifen Peptide der BMP kodieren. Zum Beispiel werden vorzugsweise DNA-Sequenzen verwendet, die den Nukleotidsequenzen entsprechen, die durch die Formeln (1) bis (8) oder Teile davon dargestellt werden. Bevorzugter enthalten die DNA-Sequenzen die durch Formeln (1) bis (8) dargestellten Nukleotidsequenzen.
- Die durch Formeln (1) bis (8) dargestellten Nukleotidsequenzen sind die in der vorliegenden Erfindung erhaltenen Xenopus laevis-BMP-DNA-Sequenzen. Beispiele der für die Xenopus laevis-BMP- Aminosäurensequenzen kodierenden Nukleotide, die durch die Formeln (I) bis (VIII) dargestellt werden, schließen Nr. 693 bis 1040 von Formel (1), Nr. 134 bis 475 von Formel (2) , Nr. 435 bis 728 von Formel (3), Nr. 183 bis 356 von Formel (4), Nr. 149 bis 328 von Formel (5), Nr. 249 bis 1442 von Formel (6), Nr. 104 bis 1306 von Formel (7) und Nr. 86 bis 1363 von Formel (8) ein.
- Ein Expressionsvektor mit der DNA-Sequenz, welche die für das BMP der vorliegenden Erfindung kodierende Nukleotidsequenz enthält, kann zum Beispiel durch das folgende Verfahren hergestellt werden:
- (a) Boten-RNA (mRNA) wird aus BMP-produzierenden Zellen isoliert.
- (b) Einzelsträngige, komplementäre DNA (cDNA) wird aus mRNA synthetisiert, gefolgt von der Synthese doppelsträngiger DNA.
- (c) Die komplementäre DNA wird in einen Klonierungsvektor wie etwa einen Phagen oder ein Plasmid eingeführt.
- (d) Wirtszellen werden mit dem auf diese Weise erhaltenen rekombinanten Phagen oder Plasmid transformiert.
- (e) Nach der Kultivierung der auf diese Weise erhaltenen Transformante wird das die gewünschte DNA enthaltende Plasmid oder der Phage aus der Transformante durch ein geeignetes Verfahren, wie etwa Hybridisierung mit einer DNA-Sonde, die für einen Teil des BMP kodiert, oder ein Immuntest, der einen anti-BMP-Antikörper verwendet, isoliert.
- (f) Die gewünschte klonierte DNA-Sequenz wird aus der rekombinanten DNA ausgeschnitten.
- (g) Die klonierte DNA-Sequenz oder ein Teil davon wird stromabwärts eines Promotors in dem Expressionsvektor ligiert.
- Die für die BMP kodierenden mRNA können aus verschiedenen BMPproduzierenden Zellen wie etwa ROS-Zellen erhalten werden.
- Verfahren zum Herstellen der mRNA aus den BMP-produzierenden Zellen schließen das Guanidinthiocyanatverfahren [J. M. Chirgwin et al., Biochemistry 18, 5294 (1979)] ein.
- Unter Verwenden der auf diese Weise erhaltenen mRNA als Matrize wird CDNA unter Verwendung von reverser Transkriptase zum Beispiel gemäß dem Verfahren von H. Okayama et al. [Molecular and Cellular Biology 2, 161 (1979); ibid. 3, 280 (1983)] synthetisiert. Die auf diese Weise erhaltene cDNA wird in das Plasmid eingeführt.
- Die Plasmide, in welche die cDNA eingeführt wird, schließen zum Beispiel pBR322 [Gene 2, 95 (1977), pBR325 [Gene 4, 121 (1978)], pUC12 [Gene 19, 259 (1982)] und pUC13 [Gene 19, 259 (1982)], die jeweils aus Escherichia coli stammen, und aus Bacillus subtilis stammendes pUB110 [Biochemical and Biophysical Research Communication 112, 678 (1983)] ein. Irgendwelche anderen Plasmide können jedoch verwendet werden, so lang sie in den Wirtszellen vermehrungsfähig und wachstumsfähig sind. Beispiele der Phagenvektoren, in welche die cDNA eingeführt werden kann, schließen λgt11 ein. Irgendwelche anderen Phagenvektoren können jedoch verwendet werden, so lang sie in den Wirtszellen wachstumsfähig sind.
- Verfahren zum Einführen der cDNA in das Plasmid schließen zum Beispiel das bei T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 239 (1982), beschriebene Verfahren ein. Verfahren zum Einführen der cDNA in den Phagenvektor schließen zum Beispiel das Verfahren von T. V. Hyunh et al. [DNA Cloning, A Practical Approach 1, 49 (1985)] ein.
- Das auf diese Weise erhaltene Plasmid wird in die geeignete Wirtszelle wie etwa Escherichia und Bachlus eingeführt.
- Beispiele der vorstehend beschriebenen Eschericbia schließen Escherichia coli K12DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 60, 160 (1968)], M103 [Nucleic Acids Research 9, 309 (1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology 120, 517 (1978)], HB101 [Journal of Molecular Biology 41, 459 (1969)] und C600 [Genetics 39, 440 (1954)] ein.
- Beispiele des vorstehend beschriebenen Bacillus schließen Bacillus subtilis MI114 [Gene 24, 255 (1983)] und 207-21 [Journal of Biochemistry 95, 87 (1984)] ein.
- Verfahren zum Transformieren der Wirtszelle mit dem Plasmid schließen zum Beispiel das bei T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 249 (1982), beschriebene Calciumchloridverfahren oder Calciumchlorid/Rubidiumchloridverfahren ein.
- Wenn der Phagenvektor verwendet wird, kann der Phagenvektor zum Beispiel mittels des in-vitro-Verpackungsverfahrens in vermehrte Escherichia coli überführt werden.
- Xenopus laevis-BMP-cDNA enthaltende Xenopus laevis-cDNA-Banken können durch zahlreiche, in der Technik wohlbekannte Techniken einschließlich des Erwerbens am Markt erhalten werden, wenngleich sie durch die vorstehend beschriebenen Verfahren erhältlich sind. Zum Beispiel ist die cDNA-Bank von Xenopus laevis von Clontech Laboratories, Inc., USA, erhältlich.
- Verfahren zum Klonieren der Xenopus laevis-BMP-DNA aus der Xenopus laevis-DNA-Bank schließen zum Beipiel das Plaguehybridisierungsverfahren mittels des Phagenvektors λCharon 28A und Ratten- Inhibin (Aktivin) βA cDNA als Sonden ein [T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, (1982)].
- Die auf diese Weise klonierte Xenopus laevis-BMP-DNA wird nötigenfalls in Plasmide wie etwa pBR322, pUC12, pUC13, pUC19, pUC118 und pUC119 unter Erhalten der Xenopus laevis-BMP-DNA subkloniert.
- Die Nukleotidsequenz der auf diese Weise erhaltenen DNA-Sequenz wird zum Beispiel durch das Maxam-Gilbert-Verfahren [A. M. Maxam und W. Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 560 (1977)] oder das Dideoxyverfahren [J. Messing et al., Nucleic Acids Research 9, 309 (1981)] bestimmt und das Vorliegen der Xenopus laevis-BMP-DNA wird durch Vergleich mit der bekannten Aminosäurensequenz bestatigt.
- Wie vorstehend beschrieben wird die für die Xenopus laevis-BMP kodierende DNA-Sequenz [durch Formeln (1) bis (8) dargestellte Xenopus laevis-BMP-DNA] erhalten.
- Fig. 1 zeigt die Restriktionsenzymfragmentkarten der DNA-Sequenzen, welche die DNA-Segmente enthalten, die für die im nachstehend beschriebenen Beispiel 1 erhaltenen Xenopus laevis-BMP kodieren. Fig. 2 zeigt die durch das Didesoxy-Verfahren bestimmten Nukleotidsequenzen, die durch die Formeln (1) bis (8) der DNA-Sequenzen dargestellt werden, und Fig. 3 und 4 zeigen die durch Formeln (I) bis (V) beziehungsweise Formeln (VI) bis (YIII) dargestellten Aminosäurensequenzen, die aus den vorstehenden Nukleotidsequenzen ermittelt wurden.
- Die DNA-Sequenz, die für das wie vorstehend beschrieben klonierte Xenopus laevis-BMP kodiert, kann in Abhängigkeit von der beabsichtigten Verwendung so wie sie ist oder gewünschtenfalls nach der Verdauung mit einem Restriktionsenzym verwendet werden.
- Eine zum Exprimieren vorgesehene Region wird aus der klonierten DNA ausgeschnitten und stromabwärts des Promotors in einen zur Exprimierung geeigneten Träger (Vektor) ligiert, wodurch der Expressionsvektor erhalten werden kann.
- Die DNA-Sequenz besitzt ATG als Translationsstartkodon an deren 5'-Terminus und kann TAA, TGA oder TAG als Translationsendkodon am 3'-Terminus besitzen. Das Translationsstartkodon und Translationsendkodon können durch Verwendung eines geeigneten synthetischen DNA-Adaptors hinzugefügt werden. Der Promotor wird weiter zum Zweck des Exprimierens der DNA-Sequenz stromaufwärts davon ligiert.
- Beispiele der Vektoren schließen die vorstehenden aus E. coli stammenden Plasmide, wie etwa pBR322, pBR325, pUC12 und pUC13, das aus B. subtilis stammende Plasmid, wie etwa pUB110, pTP5 und pC194, aus Hefe stammende Plasmide, wie etwa pSH19 und pSH15, einen Bakteriophagen wie etwa den Xphagen und tierische Viren wie etwa Retroviren und Vacciniaviren ein.
- Als in der vorliegenden Erfindung verwendete Promotoren können alle Promotoren verwendet werden, so lang sie zur Exprimierung in den für die Genexprimierung gewählten Wirtszellen geeignet sind.
- Wenn die zur Transformierung verwendete Wirtszelle Escherichia ist, ist es bevorzugt, daß ein trp-Promotor, ein lac-Promotor, ein recA-Promotor, ein λPL-Promotor, ein lpp-Promotor usw. verwendet werden. Wenn die Wirtszelle Bacillus ist, ist es bevorzugt, daß ein PHO5-Promotor, ein PGK-Promotor, ein GAP-Promotor, ein ADH-Promotor usw. verwendet werden. Insbesondere ist es bevorzugt, daß die Wirtszelle Escherichia ist und der Promotor der trp-Promotor oder der λPL-Promotor ist.
- Wenn die Wirtszelle eine tierische Zelle ist, sind jeweils ein aus SV-40 stammender Promotor, ein Retrovirus-Promotor, ein Metallothionein-Promotor, ein Hitzeschock-Promotor usw. verwendbar.
- Ein Verstärker, eine gewisse, für die Promotoraktivität in einer Zelle wichtige DNA-Sequenz, wird ebenfalls wirkungsvoll für die Exprimierung verwendet.
- Durch Verwenden des Vektors, der die DNA-Sequenz enthält, die für das auf diese Weise aufgebaute reife Peptid des Xenopus laevis-BMP kodiert, wird die Transformante hergestellt.
- Die Wirtszellen schließen zum Beispiel Escherichia, Bacillus, Hefe und tierische Zellen ein.
- Spezielle Beispiele der vorstehenden Escherichia und Bacillus schließen Stämme ein, die den vorstehend beschriebenen ähnlich sind.
- Beispiele der vorstehenden Hefe schließen Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R&supmin;, NA87-11A und DKD-5D ein.
- Beispiele der tierischen Zellen schließen Affenzellen COS-7, Vero, Zellen des chinesischen Hamsters (CHO), Maus-L-Zellen und menschliche FL-Zellen ein.
- Die Transformierung der vorstehenden Escherichia wird zum Beispiel gemäß dem in Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 2110 (1972), oder Gene 17, 107 (1982), beschriebenen Verfahren durchgeführt.
- Die Transformierung des vorstehenden Bacillus wird zum Beispiel gemäß dem in Molecular & General Genetics 168, 111 (1979), beschriebenen Verfahren ausgeführt.
- Die Transformierung der Hefe wird zum Beispiel gemäß dem in Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75, 1929 (1978), beschriebenen Verfahren durchgeführt.
- Die Transformierung der Tierzellen wird zum Beispiel gemäß dem in Virology 52, 456 (1973), beschriebenen Verfahren durchgeführt.
- Auf diese Weise wird die Transformante erhalten, die mit dem Expressionsvektor transformiert ist, der die DNA-Sequenz enthält, die für das reife Peptid von Xenopus laevis-BMP kodiert.
- Wenn Bakterientransformanten kultiviert werden, ist ein flüssiges Medium besonders als zur Kultur verwendetes Medium geeignet. Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Verbindungen und andere für das Wachstum der Transformante notwendige sind hierin enthalten. Beispiele der Kohlenstoffquellen schließen Glucose, Dextrin, lösliche Stärke und Sucrose ein. Beispiele der Stickstoffquellen schließen anorganische oder organische Materialien wie etwa Ammoniumsalze, Nitrate, Maisquellwasser, Pepton, Casein, Fleischextrakte, Sojabohnenmehl und Kartoffelextraktlösung ein. Die anorganischen Verbindungen schließen zum Beispiel Calciumchlorid, Natriumdihydrogenphosphat und Magnesiumchlorid ein. Hefeextrakt, Vitamine, wachstumsfördernde Faktoren und so weiter können weiter hinzugefügt werden.
- Der pH des Mediums ist vorzugsweise etwa 5 bis 8.
- Als zur Kultivierung von Escherichia verwendetes Medium ist zum Beispiel M9-Medium bevorzugtl das Glucose und Casaminosäuren enthält (Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1972) Um den Promotor wirkungsvoll wirken zu lassen, kann nötigenfalls ein Wirkstoff wie etwa 3β-Indolylacrylsäure hinzugesetzt werden.
- Wenn die Wirtszelle Escherichia ist, wird die Kultivierung üblicherweise etwa 3 bis 24 Stunden bei etwa 15 bis 43ºC nötigenfalls unter Belüften oder Rühren durchgeführt.
- Wenn die Wirtszelle Bacillus ist, wird die Kultivierung üblicherweise etwa 6 bis 24 Stunden bei etwa 30 bis 40ºC nötigenfalls unter Belüften oder Rühren durchgeführt.
- Wenn Hefetransformanten kultiviert werden, wird zum Beispiel Burkholders Minimalmedium [K. L. Bostian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 4505 (1980)] als Medium verwendet. Der pH des Mediums wird vorzugsweise auf etwa 5 bis 8 eingestellt. Die Kultivierung wird üblicherweise 24 bis 72 Stunden bei etwa 20 bis 35ºC nötigenfalls unter Belüften und Rühren durchgeführt.
- Wenn Transformanten aus tierischen Zellen kultiviert werden, schließen Beispiele des Mediums etwa 5 bis 20% fetales Kälberserum enthaltendes MEM-Medium [Science 122, 501 (1952)], DMEM- Medium [Virology 8, 396 (1959)], RPMI1640-Medium [Journal of the American Medical Association 199, 519 (1967)] und 199-Medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine 73, 1 (1950)] ein. Der pH ist vorzugsweise etwa 6 bis 8. Die Kultivierung wird üblicherweise etwa 15 bis 60 Stunden bei etwa 30 bis 40ºC nötigenfalls unter Belüften und Rühren durchgeführt.
- Das vorstehende reife Peptid des Xenopus laevis-BMP kann aus der vorstehend beschriebenen Kultur zum Beispiel durch das folgende Verfahren isoliert und gereinigt werden.
- Wenn das reife Peptid des Xenopus laevis-BMP aus den kultivierten Zellen extrahiert werden soll, werden die Zellen nach der Kultivierung durch in der Technik bekannte Verfahren gesammelt. Anschließend werden die gesammelten Zellen in einer geeigneten Pufferlösung suspendiert und durch Ultraschallbehandlung, Lysozym und/oder Einfrieren-Auftauen aufgebrochen. Danach wird durch Zentrifugieren oder Filtration eine rohe extrahierte Lösung des reifen Proteins des Xenopus laevis-BMP erhalten. Die Pufferlösung kann ein Proteindenaturierungsmittel wie etwa Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid oder ein oberflächenaktives Mittel wie etwa Triton X-100 enthalten.
- Wenn das Xenopus laevis-BMP-Vorläuferprotein oder reife Peptid in die Kulturlösung ausgeschieden wird, wird nach Abschluß der Kultivierung durch in der Technik bekannte Verfahren ein Überstand aus den Zellen abgetrennt und anschließend gesammelt.
- Die Abtrennung und Reinigung des Xenopus laevis-BMP-Vorläuferproteins oder reifen Peptids, das in dem Kulturüberstand oder der so erhaltenen extrahierten Lösung enthalten ist, kann durch eine geeignete Kombination bekannter Trenn- und Reinigungsverfahren ausgeführt werden. Die bekannten Trenn- und Reinigungsverfahren schließen Verfahren ein, welche die Löslichkeit ausnützen, wie etwa eine Salzfällung und Lösungsmittelfällung, Verfahren, die hauptsächlich einen Unterschied beim Molekulargewicht ausnützen, wie etwa Dialyse, Ultrafiltration, Gelfiltration und SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, Verfahren, die einen Unterschied in der elektrischen Ladung ausnützen, wie etwa Ionenaustausch-Säulenchromatographie, Verfahren, die eine spezielle Affinität ausnützen, wie etwa Affinitätschromatographie, Verfahren, die einen Hydrophobieunterschied ausnützen, wie etwa Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromaographie, und Verfahren, die einen Unterschied beim isolelektrischen Punkt ausnützen, wie etwa isolelektrofokussierende Elektrophorese. Verfahren, die einen Antikörper gegenüber einem fusionierten Protein benützen, das durch Fusionieren einer zu BMP komplementären DNA oder DNA mit von E. coli stammender DNA lacZ exprimiert wurde, können ebenfalls verwendet werden.
- Anschauungsbeispiele der Verfahren zum Exprimieren des BMP in der vorliegenden Erfindung schließen bei Wang et al., Proc. natl. Acad. Sci. U.S.A. 807, 2220-2224 (1990), beschriebene Verfahren ein, bei denen Gene in CHO-Zellen unter Erzeugen des BMP in großen Mengen eingeführt werden.
- Die Aktivität des auf diese Weise gebildeten Xenopus laevis-BMP- Vorläuferproteins oder reifen Peptids können durch einen Enzymimmuntest mittels eines spezifischen Antikörpers gemessen werden. Falls die Produkte eine Knochenmorphogeneseaktivität besitzen, kann diese Aktivität auch als Index gemessen werden.
- Die Zellen wie etwa tierische Zellen oder E. coli, die mit den DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung transfiziert oder transformiert sind, gestatten es, große Mengen der reifen Peptide von Xenopus laevis-BMP herzustellen. Somit kann die Herstellung dieser Peptide vorteilhaft erreicht werden.
- Es ist offensichtlich geworden, daß die hier hergestellten reifen Peptide von Xenopus laevis-BMP die Synthese von Proteoglycan fördern, das ein Hauptbestandteil der Knorpelmatrix ist, und die Peptide können auch zur Analyse des Mechanismus eines Organismus, insbesondere der menschlichen Knochen-Knorpelmorphogenesereaktion und als therapeutische Mittel bei einem Bruch oder der Osteoporose benützt werden.
- In derartigen Fällen verabreicht man einem Säuger eine wirksame Menge des Proteins. Eine wirksame Menge ist die Proteinmenge, die zum Fördern der Proteoglycansynthese in Knorpelzellen benötigt wird. Typischerweise reicht diese von 0,001 bis 35 µg je kg/Körpergewicht. Die genaue Menge für einen bestimmten Zweck kann leicht empirisch durch einen gewöhnlichen Fachmann auf der Grundlage der vorliegenden Offenbarung bestimmt werden.
- Wenn man das Protein für therapeutische Zwecke verwendet, sollte man darauf achten, daß es gereinigt und im wesentlichen von Bakterien und Pyrogenen befreit wird. Dies kann durch Standardverfahren erfolgen.
- Wenn die BMP als therapeutische Mittel bei einem Bruch oder Osteoporose verwendet werden, können sie in Form von Lösungen, Injektionen und Salben allein oder in Kombination mit pharmazeutisch annehmbaren zusätzlichen Bestandteilen, wie etwa Träger, Bindemittel, Dispergiermittel, Weichmacher oder Verdünnupgsmittel, parenteral verabreicht werden.
- Die bevorzugten Verabreichungsformen umfassen (1) die Verabreichung des Mittels an die Kutisoberfläche in der Nähe eines erkrankten Teils, (2) die Injektion des Mittels in einen erkrankten Teil, (3) die Aufspaltung eines erkrankten Teils, gefolgt von der direkten Verabreichung des Mittels dahin. Die bei der Bruchtherapie für eine erwachsene Person bevorzugte Dosis ist 0,1 bis 2000 µg oder mehr, bevorzugter 20 bis 400 µg für eine erwachsene Person einmal täglich. Die für eine erwachsene Person bei Osteoporose bevorzugte Dosis ist 0,1 bis 200 µg einmal täglich etwa 1 bis 30 Tage lang. Die Konzentration des therapeutischen Mittels ist vorzugsweise 0,001 bis 0,2% in Form einer Lösung, 0,001 bis 0,2% in Form einer Injektion und 0,0001 bis 0,2% in Form einer Salbe.
- Vorstehend sind im einzelnen das Klonieren der für die Xenopus laevis-BMP kodierenden DNA-Sequenzen, die Herstellung der Expressionsvektoren für die reifen Peptide von Xenopus laevis-BMP, die Herstellung der Transformanten durch Verwenden der Transformanten und ihre Verwendung beschrieben worden.
- Wenn Nukleotide, Aminosäuren und so weiter in dieser Beschreibung und Zeichnungen durch Abkürzungen bezeichnet werden, werden die Abkürzungen eingesetzt, die von der IUPAC-IUB-Komission für biochemische Nomenklatur angenommen wurden oder in der Technik üblicherweise verwendet werden. Zum Beispiel werden die folgenden Abkürzungen verwendet. Wenn die Aminosäuren als optisches Isomer vorliegen können, werden so lang nicht anders angegeben die L-Formen dargestellt.
- DNA: Desoxyribonukleinsäure
- cDNA: komplementäre Desoxyribonukleinsäure
- A: Adenin
- T: Thymin
- G: Guanin
- C: Cytosin
- RNA: Ribonukleinsäure
- mRNA: Boten-Ribonukleinsäure
- dATP: Desoxyadenosintriphosphat
- dTTP: Desoxythymidintriphosphat
- dGTP: Desoxyguanosintriphosphat
- dCTP: Desoxycytidintriphosphat
- ATP: Adenosintriphosphat
- EDTA: Ethylendiamintetraessigsäure
- SDS: Natriumdodecylsulfat
- Gly oder G: Glycin
- Ala oder A: Alanin
- Val oder V: Valin
- Leu oder L: Leucin
- Ile oder I: Isoleucin
- Ser oder S: Serin
- Thr oder T: Threonin
- Cys oder C: Cystein
- Met oder M. Methionin
- Glu oder E: Glutaminsäure
- Asp oder D: Asparaginsäure
- Lys oder K: Lysin
- Arg oder R: Arginin
- His oder H: Histidin
- Phe oder F: Phenylalanin
- Tyr oder Y: Tyrosin
- Trp oder W: Tryptophan
- Pro oder P: Prolin
- Asn oder N: Asparagin
- Gln oder Q: Glutamin
- Was reife Peptide von Xenopus laevis-BMP der vorliegenden Erfindung betrifft, kann ein Teil der Aminosaurensequenz modifiziert sein und zwar kann eine Hinzufügung, eine Entfernung oder ein Ersatz durch andere Aminosäuren vorliegen, so lang die Knochenmorphogeneseaktivität nicht verloren geht.
- Die vorliegende Erfindung wird nachstehend mit den folgenden Beispielen genau beschrieben. Es versteht sich selbstverständlich, daß diese Beispiele nicht dazu vorgesehen sind, den Umfang der Erfindung zu begrenzen.
- Die Transformanten E. coli HB101/pXar3 (die für Protein M3 kodiert), E. coli HB101/pXar4 (die für Protein A4 kodiert), E. coli HB101/pXar5 (die für Protein AS kodiert), E. coli HB101/pXar9 (die für Protein B9 kodiert) und E. coli HB101/pXar14 (die für Protein C4 kodiert), die jeweils im nachstehend beschriebenen Beispiel 1 erhalten wurden, wurden am 28. August 1989 beim Fermentationsinstitut, Osaka, Japan (IFO), unter den Zugangsnummern IFO 14928, IFO 14929, IFO 14930, IFO 14931 beziehungsweise IFO 14932 hinterlegt. Diese Transformanten wurden am 2. September 1989 auch beim Fermentationsforschungsinstitut, Amt für industrielle Wissenschaft und Technologie, Ministerium für internationalen Handel und Industrie, Japan (FRI), unter dem Budapester Vertrag unter den Zugangsnummern FERM BP-2578, FERM BP-2579, FERM BP-2580, FERM BP-2581 beziehungsweise FERM BP-2582 hinterlegt.
- Die jeweils in dem nachstehend beschriebenen Beispiel 2 erhaltenen Transformanten E. coli HB101/pXbr22 (die für Xenopus laevis- BMP-2A kodiert), E. coli HB101/pXbr23 (die für Xenopus laevis- BMP-28 kodiert) und E. coli HB101/pXbr41 (die für Xenopus laevis-Vgr-1 kodiert) wurden am 10. August 1990 beim Fermentationsinstitut, Osaka, Japan (IFO), unter den Zugangsnummern IFO 15080, IFO 15081 und IFO 15082 hinterlegt. Diese Transformanten wurden am 16. August 1990 auch beim Fermentationsforschungsinstitut, Amt für industrielle Wissenschaft und Technologie, Ministerium für internationalen Handel und Industrie, Japan (FRI), unter dem Budapester Vertrag unter den Zugangsnummern FERM BP- 3066, FERM BP-3065 beziehungsweise FERM BP-3067 hinterlegt.
- Die Leber (1 g) von Xenopus laevis wurde in flüssigem Stickstoff gepulvert und 10 ml Puffer (1) [100 µg/ml Proteinase K, 0,5% Sarkosil, 0,5 M EDTA (pH 8,0)] wurden hinzugefügt, gefolgt von 2 Stunden Inkubation bei 50ºC. Die sich daraus ergebende DNA- Probe wurde mit Phenol behandelt und anschließend zum Entfernen von Phenol gegen Puffer (2) [10 mM EDTA, 10 mM NaCl, 50 mM Tris- HCl (pH 8,0)] dialysiert. Rnase wurde auf eine Endkonzentration von 100 µg/ml hinzugefügt und das Gemisch wurde 3 Stunden bei 37ºC inkubiert, gefolgt von der zweimaligen Phenolbehandlung. Die wäßrige Schicht wurde gegen Puffer (3) [1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)] dialysiert. Auf diese Weise wurde etwa 1 mg aus Leber stammende Chromosomen-DNA erhalten. Diese DNA (10 µg) wurde mit dem Restriktionsenzym Sau3AI teilweise gespalten und das sich daraus ergebende Produkt wurde der Gleichgewichtsdichtegradientenzenrifugation mittels CsCl unterzogen. Fraktionen, die DNA-Fragmente mit Längen von 10 bis 20 kb enthielten, wurden ausgewählt und in Fragmente eingeführt, die durch Spalten von Phagen-Charon-28-DNA mit BamHI erhalten wurden, und wurden als Vektor verwendet. Diese "Ligation" genannte Reaktion wurde 16 Stunden bei 15ºC ausgeführt. Der Charon-28-Vektor, in den die Xenopus laevis-Chromosomen-DNA auf diese Weise eingeführt wurde, war in einem Phagenkopf enthalten (in-vitro-Verpacken). Dieses Verfahren wurde mittels eines handelsüblichen Verpackungskits (Gigapack Gold, Stratagene) durchgeführt. Dieser rekombinante Phage wurde durch Infektion mit E. coli LE392 verstärkt. Genauer wurde der Phage mit überschüssigem LE392 gemischt, um LE392 den Phagen 10 Minuten bei 37ºC adsorbieren zu lassen. Anschließend wurde das Gemisch auf NZYM-Medium (das 13% Agar enthielt) plattiert, gefolgt von der Inkubation über Nacht.
- Die Gesamtzahl der Phagenklone wurde aus der Zahl der in einer Schale produzierten Plaques auf etwa 1000000 geschätzt. Als Sonde (zum Nachweis eines gewünschten Gens durch Hybridisierung verwendete DNA) wurde durch ein Verfahren des statistischen Startens ("random priming") mit 32P markierte Ratten-Aktivin-βA- cDNA [Molecular Endocrinology 1, 388-396 (1987)] verwendet. Die aus der Schale auf eine Nitrocellulosemembran transkribierten Plaques wurden durch Alkalibehandlung (30 Sekunden Eintauchen in 0,1 N NaOH, 0,6 M NaCl) wurden wieder neutral gestellt (0,2 M Tris, 0,6 M NaCl, pH 7,4). Nach Abschluß der vorstehend beschriebenen Behandlung wurde die Membran 1 Stunde in einem Vakuumthermostaten auf 80ºC erhitzt. Nach dem Erhitzen wurde die Membran zum Inkubieren 4 Stunden in eine Hybridisierungslösung (50% Formamid, 5 x Denhardts Lösungl 5 X SSPE, 0,1% SDS, 100 µg/ml denaturierte Lachsspermien-DNA) bei 42ºC eingetaucht. Anschließend ließ man die Membran über Nacht in dem Lösungsgemisch aus der vorstehenden Hybridisierungslösung und der DNA-Sonde bei 60ºC stehen. Dieses Verfahren wurde in einem Plastikbeutel durchgeführt. Am nächsten Tag wurde die Nitrocellulosemembran aus dem Beutel genommen und 15 Minuten mit einer Lösung von 2 X SSC und 0,1% SDS und 15 Minuten mit einer Lösung von 0,1 X SSC und 0,1% SDS gewaschen, wobei die Temperatur schrittweise erhöht wurde, bis der cpm-Wert der Membran etwa 1000 cpm erreichte. Nach dem Waschen wurde die Waschlösung durch Filterpapier entfernt und anschließend wurde die Membran der Autoradiographie unterzogen. Die das gewünschte Gen enthaltende Plaque wurde durch Belichtung eines Fuji-Röntgenfilms nachgewiesen. Die Gene wurden durch Wiederholung der vorstehenden Plaquehybridisierung kloniert.
- 20 X SSC enthält 0,3 M Natriumcitrat (pH 7,0) und 3 M NaCl; 20 X SSPE enthält 0,2 M Natriumphosphat, 20 M EDTA und 3 M NaCl (pH 7,4) und Denhardts Lösung enthält 1% Ficoll, 1% Polyvinylpyrrolidon und 1% BSA (Pentex Fraktion V).
- Alle fünf isolierten Klone A4, AS, B9, C4 und M3 wurden jeweils in das Plasmid pUC19 subkioniert. Beim Subklonieren jedes Klons in das Plasmid pUC19 wurde das Subklonieren unter Verwenden einer Restriktionsenzym-Erkennungsstelle durchgeführt, die ein mit der Sonde für jeden Klon hybridisiertes Fragment produzierte. Zum Klonieren von Klon A4 wurde jedoch ein handelsüblicher BglII-Linker unter Ligieren einer Smai-Stelle verwendet.
- Die Plasmide wurden jeweils in die kompetente Zelle HB101 (E. coli) transformiert, die durch das Rubidiumchloridverfahren unter Erhalten fünf Arten von Transformanten E. coli HB101/pXar3 (die für Protein M3 kodiert), E. coli HB101/pXar4 (die für Protein A4 kodiert), E. coli HB101/pXars (die für Protein A5 kodiert), E. coli HB101/pXar9 (die für Protein B9 kodiert) beziehungsweise E. coli HB101/pXar14 (die für Protein C4 kodiert) hergestellt wurde.
- Zur Bestimmung der Nukleotidsequenz wurde eine Deletionsmutante jedes Klons hergestellt und das kürzeste mit der Sonde hybridisierte Fragment wurde selektiert. Die Nukleotidsequenz wurde aus pUC19 durch das direkte Sanger-Verfahren (oder das Dideoxy- Verfahren) bestimmt.
- Zur Translation der Nukleotidsequenz in eine Aminosäurensequenz oder zum Durchmustern der Homologie wurde eine Software für die genetische Analyse (GENETYX, Nippon SDC) verwendet. Homologie auf der Nukleinsäureebene
- In der vorstehenden Tabelle bezeichnen die Zahlenwerte in Klammern die verglichene Länge (bp). Homologie auf der Aminosäurenebene
- In der vorstehenden Tabelle bezeichnen die Zahlenwerte in Klammern die verglichene Länge (bp).
- Eine Sonde wurde durch Fragmentierung der für Xenopus laevis- BMP-2A kodierenden Chromosomen-DNA Xar14 mit den Restriktionsenzymen PstI und HindIII hergestellt und drei Arten cDNA, Xbr22, Xbr23 und Xbr41, wurden durch Durchmustern einer cDNA-Bank eines unbefruchteten Xenopus laevis-Eis durch ein Hybridisierungsverfahren isoliert. Der Vergleich mit der Struktur der bereits isolierten Xenopus laevis-BMP-Chromosomen-DNA zeigte, daß Xbr22, Xbr23 und Xbr41 für Proteine mit einer Homologie zu Xenopus laevis-BMP-2A, Xenopus laevis-BMP-28 beziehungsweise durch Lyon et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 806, 4554-4558 (1989)] mitgeteiltes Maus-Vgr-1 kodierten.
- Die CDNA-Bank eines unbefruchteten Xenopus laevis-Eis wurde durch das Salk-Institut (C. Kintner) zur Verfügung gestellt. Diese Bank wurde auf der Grundlage von λgt10 hergestellt. Dieser rekombinante Phage wurde durch Infektion mit E. coli NM514 verstärkt. Genauer wurde der Phage mit überschüssigem NM514 gemischt, um NM514 den Phagen 10 Minuten bei 37ºC adsorbieren zu lassen. Anschließend wurde das Gemisch auf NZYM-Medium (das 13% Agar enthielt) plattiert, gefolgt von der Inkubation über Nacht.
- Die Gesamtzahl der Phagenklone wurde aus der Zahl der in einer Schale produzierten Plaques auf etwa 1200000 geschätzt. Als Sonde (zum Nachweis eines gewünschten Gens durch Hybridisierung verwendete DNA) wurde ein DNA-Fragment (185 bp) verwendet, das durch Spalten von Xar14 mit den Restriktionsenzymen PstI und HindIII erhalten wurde und durch ein Verfahren des statistischen Startens ("random priming") mit 32P markiert wurde. Die aus der Schale auf eine Nitrocellulosemembran transkribierten Plaques wurden durch Alkalibehandlung (30 Sekunden Eintauchen in 0,1 N NaOH, 0,6 M NaCl) wieder neutral gestellt (0,2 M Tris, 0,6 M NaCl, pH 7,4). Nach Abschluß der vorstehend beschriebenen Behandlung wurde die Membran 1 Stunde in einem Vakuumthermostaten auf 80ºC erhitzt. Nach dem Erhitzen wurde die Membran zum Inkubieren 4 Stunden in eine Hybridisierungslösung (50% Formamid, 5 X Denhardts Lösung, 5 X SSPE, 0,1% SDS, 100 µg/ml denaturierte Lachsspermien-DNA) bei 42ºC eingetaucht. Anschließend ließ man die Membran über Nacht in dem Lösungsgemisch aus der vorstehenden Hybridisierungslösung und der DNA-Sonde bei 60ºC stehen. Dieses Verfahren wurde in einem Plastikbeutel durchgeführt. Am nächsten Tag wurde die Nitrocellulosemembran aus dem Beutel genommen und 15 Minuten mit einer Lösung von 2 X SSC und 0,1% SDS gewaschen, wobei die Temperatur schrittweise erhöht wurde, bis der cpm-Wert der Membran etwa 1000 cpm erreichte. Nach dem Waschen wurde die Waschlösung durch Filterpapier entfernt und anschließend wurde die Membran der Autoradiographie unterzogen. Die das gewünschte Gen enthaltende Plaque wurde durch Belichtung eines Fuji-Röntgenfilms nachgewiesen. Die Gene wurden durch Wiederholung der vorstehenden Plaquehybridisierung kloniert.
- 20 X SSC enthält 0,3 M Natriumcitrat (pH 7,0) und 3 M NaCl; 20 X SSPE enthält 0,2 M Natriumphosphat, 20 M EDTA und 3 M NaCl (pH 7,4) und Denhardts Lösung enthält 1% Ficoll, 1% Polyvinylpyrrolidon und 1% BSA (Pentex Fraktion V).
- Alle drei isolierten Klone Xbr22, Xbr23 und Xbr41 wurden jeweils in das Plasmid pUC19 subkloniert. Beim Subklonieren jedes Klons in das Plasmid pUC19 wurde das Subklonieren unter Verwenden einer Restriktionsenzym-Erkennungsstelle durchgeführt, die ein mit der Sonde für jeden Klon hybridisiertes Fragment produzierte.
- Die Plasmide wurden jeweils in die kompetente Zelle HB101 (E. coli) transformiert, die durch das Rubidiumchloridverfahren unter Erhalten von drei Arten Transformanten E. coli HB101/pXbr22 (die für Xenopus laevis-BMP-2A kodiert), E. coli HB101/pXbr23 (die für Xenopus laevis-BMP-28 kodiert) beziehungsweise E. coli HB101/pXbr41 (die für das Protein Xenopus laevis- Vgr-1 kodiert) hergestellt wurde.
- Zur Bestimmung der Nukleotidsequenz wurde eine Deletionsmutante jedes Klons hergestellt und das kürzeste mit der Sonde hybridisierte Fragment wurde selektiert. Die Nukleotidsequenz wurde aus pUC19 durch das direkte Sanger-Verfahren (oder das Dideoxy- Verfahren) bestimmt.
- Zur Translation der Nukleotidsequenz in eine Aminosäurensequenz oder zum Durchmustern der Homologie wurde eine Software für die genetische Analyse (GENETYX, Nippon SDC) verwendet.
- Fig. 2(6) bis 2(8) zeigen die entsprechenden Nukleotidsequenzen und Fig. 4(VI) bis 4(VIII) zeigen die entsprechenden Aminosäurensequenzen.
- Zum Untersuchen der biologischen Aktivität der mit Xenopus laevis-BMP verwandten Genprodukte wurde Xbr22-, Xbr23- und Xbr41-CDNA jeweils in den Expressionsvektor pCDMB (Invitrogen, USA) für tierische Zellen inseriert und in eine COS-Zelle (Nierenzelle der afrikanischen grünen Meerkatze) exprimiert. Der sich daraus ergebende Kulturüberstand wurde zur Bestimmung der biologischen Aktivität verwendet.
- Jede der Xbr22-, Xbr23- und Xbr41-CDNA, an deren beide Enden XhoI-Linker ligiert waren, wurde in die XhoI-Restriktionsenzym- Spaltungsstelle von pCDM8 inseriert, um es zur Transfizierung (Einführung von DNA) zu verwenden. 3 x 106 Zellen wurden in einer Plastikschale mit 100 mm Durchmesser subkultiviert und das Medium wurde nach 24 Stunden entfernt, gefolgt von einmal Waschen mit 10 ml TBS (Tris-gepufferte Kochsalzlösung). 300 µl einer mit TBS verdünnten DNA-Lösung (1,5 µg DNA) wurden mit 300 µl einer 0,1%igen DEAE-Dextran-Lösung gemischt und die vereinigte Lösung wurde den Zellen tropfenweise zugesetzt. Nach 15 Minuten Stehen bei gewöhnlicher Temperatur wurden die Zellen einmal mit 300 µl TBS gewaschen und anschließend in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, das 10% FBS, 100 E/ml Penicillin, 100 mcg/ml Streptomycin und 100 µm Chloroquin enthielt) inkubiert. Nach 3 Stunden wurden die Zellen zweimal mit TBS gewaschen und in DMEM inkubiert (das 10% FBS, 100 E/ml Penicillin und 100 mcg/ml Streptomycin enthielt). Nach 24 Stunden wurden die Zellen dreimal mit TBS gewaschen und 4 Tage in DMEM (das 100 E/ml Penicillin und 100 mcg/ml Streptomycin enthielt) inkubiert, gefolgt von der Isolierung des Mediums. Das isolierte Medium wurde 5 Minuten bei 2000 Upm unter Erhalten eines Kulturüberstands zentrifugiert.
- Der auf diese Weise erhaltene Kulturüberstand wurde zur Bestimmung der biologischen Aktivität einer Xenopus laevis-BMP2-A, BMP-2B oder Protein Vgr-1 enthaltenden Probe verwendet. Jede Probe wurde dem Medium von Kaninchen-Chondrozyten in Einschichtenkulturen [Y. Kato et al., Exp. Cell Res. 130, 73-81 (1980); Y. Kato et al., J. Biol. Chem. 265, 5903-5909 (1990)] zum Untersuchen ihrer Wirkung auf die Synthese von Proteoglycan, dem Hauptbestandteil der Knorpelmatrixl zugesetzt. Wie in der folgenden Tabelle dargestellt, beeinflußte die Kontrolle, bei der die COS-Zelle mit dem Expressionsvektor allein transfiziert wurde und das durch unbehandelte COS-Zellen konditionierte Medium folglich die Proteoglycansynthese nicht. Im Gegensatz dazu förderten die vorstehenden, in der vorliegenden Erfindung erhaltenen drei Proteinarten die Proteoglycansynthese durch die Knorpelzellen stark. Die höchste Aktivität von Xenopus laevis-BMP- 2A, BMP-2B und Vgr-1 war stärker als die von TGF-beta-1. Die Proteoglycansynthese wurde durch Messen des 355-Sulfateinbaus in Glycosaminoglycane [Y. Kato et al., Exp. Cell Res. 130, 73-81 (1980); Y. Kate et al., J. Biol. Chem. 265, 5903-5909 (1990)] bestimmt. Diese Ergebnisse zeigen, daß die BMP von Xenopus laevis die Differenzierung von Knorpeln fördern und legen nahe, daß die BMP anderer Tiere ähnliche Wirkungen haben. Von den BMP wird daher erwartet, daß sie auf therapeutische Mittel zur Heilungsbeschleunigung von Brüchen und auf verschiedene Erkrankungen der Knorpel und Knochen (wie etwa Arthritis und Osteoporose) angewandt werden.
- * Art der Zelle
- In Plastiknäpfchen mit 6 mm Durchmesser gehaltene Kaninchenrippenchondrozyten
- * Art des Markers
- 355 1 µCi/ in 100 µl Medium je Näpfchen
- * Art des Mediums
- Ein 1:1-Gemisch (Vol./Vol.) von DMEM und mit 0,3% fetalem Rinderserum ergänztem Hams F-12-Medium
- PCDM8: Eine Kulturlösung der Zellen, in die pCDM8 als Vektor eingeführt ist
- DNA(-): Eine Kulturlösung, die mit den Zellen in Berührung steht, die keine BMP produzieren
- DME: Eine Lösung, die nicht mit den Zellen in Berührung steht
- Ins.: Insulin
- Kaninchenchondrozyten wurden aus Wachstumsplatten von Rippen 3 bis 4 Wochen alter, männlicher Neuseeland-Kaninchen wie zuvor beschrieben isoliert (Y. Kato et al., Exp. Cell Res.). Zellen wurden in einer Dichte von 10&sup4; Zellen/Plastikkulturnäpfchen mit 6 mm Durchmesser in 0,1 ml Eagles essentiellem Minimalmedium (MEM) eingesät, das mit 10% fetalem Rinderserum und Antibiotika ergänzt war. Als die Kulturen konfluent wurden, wurden die Zellen 24 Stunden in 0,1 ml eines 1:1-Gemisches von DMEM und Hams F-12-Medium vorinkubiert, das mit 0,3% fetalem Rinderserum (DF) ergänzt war. Die Zellen wurden anschließend in 0,1 ml desselben Mediums (DF) transferiert, das mit 1 oder 5 µl des Mediums ergänzt war, das durch verschiedene COS-Zellen konditioniert war: [Das konditionierte Medium wurde mit DMEM verdünnt (Endkonzentration 10 bis 30%) oder nicht]. Nach 3 Stunden wurden ferner 5 µl mit 1 µCi ³&sup5;SO&sub4;²&supmin; ergänztes DMEM zugesetzt und die Inkubation wurde weitere 17 Stunden fortgesetzt (Y. Kato et al., Exp. Cell Res.).
Claims (16)
1. Xenopus laevis-Knochenmorphogenese-Protein, wobei das
Protein ein reifes Protein ist, das eine Aminosäurensequenz mit
einer Aminosäurensequenz, welche durch die Nr. 15 bis 130 der in
Fig. 3 dargestellten Formel (I) dargestellt wird, einer
Aminosäurensequenz, welche durch die Nr. 14 bis 127 der in Fig 3
dargestellten Formel (II) dargestellt wird, einer
Aminosäurensequenz, welche durch die Nr. 6 bis 63 der in Fig. 3 dargestellten
Formel (IV) dargestellt wird, einer Aminosäurensequenz, welche
durch die Nr. 6 bis 65 der in Fig. 3 dargestellten Formel (V)
dargestellt wird, einer Aminosäurensequenz, welche durch die Nr.
282 bis 398 oder Nr. 298 bis 398 der in Fig. 4 dargestellten
Formel (VI) dargestellt wird, oder einer Aminosäurensequenz,
welche durch die Nr. 328 bis 426 der in Fig. 4 dargestellten
Formel (VIII) dargestellt wird, enthält.
2. Xenopus laevis-Knochenmorphogenese-Protein, wobei das
Protein ein Vorläuferprotein ist, das eine Aminosäurensequenz
mit einer Aminosäurensequenz enthält, welche durch die in Fig.
3 dargestellte Formel (I), (II), (IV) oder (V) oder in Fig. 4
dargestellte Formel (VI) oder (VIII) dargestellt wird.
3. DNA umfassend ein DNA-Segment, das für ein Xenopus laevis-
Knochenmorphogenese-Protein gemäß Anspruch 1 oder 2 kodiert.
4. DNA umfassend ein DNA-Segment, das für ein Xenopus laevis-
Knochenmorphogenese-Protein kodiert, wobei das DNA-Segment eine
Nukleotidsequenz umfaßt, die der Nukleotidsequenz entspricht,
welche durch die in Fig. 2 dargestellte Formel (1), (2), (3),
(4), (5), (6), (7) oder (8) dargestellt wird.
5. Nicht-humane Transformante, die eine DNA trägt, welche ein
DNA-Segment gemäß Anspruch 3 oder 4 umfaßt, wobei die
Transformante nicht Xenopus laevis ist.
6. Transformante gemäß Anspruch 5, welche die Eigenschaften
vön Escherichia coli HB101/pXar3 (FERM BP-2578) hat.
7. Transformante gemäß Anspruch 5, welche die Eigenschaften
von Escherichia coli HB101/pXar4 (FERM BP-2579) hat.
8. Transformante gemäß Anspruch 5, welche die Eigenschaften
von Escherichia coli HB101/pXar5 (FERM BP-2580) hat.
9. Transformante gemäß Anspruch 5, welche die Eigenschaften
von Escherichia coli HB101/pXar9 (FERM BP-2581) hat.
10. Transformante gemäß Anspruch 5, welche die Eigenschaften
von Escherichia coli HB101/pXar14 (FERM BP-2582) hat.
11. Transformante gemäß Anspruch 5, welche die Eigenschaften
von Escherichia coli HB101/pXbr22 (FERM BP-3066) hat.
12. Transformante gemäß Anspruch 5, welche die Eigenschaften
von Escherichia coli HB101/pXbr23 (FERX BP-3065) hat.
13. Transformante gemäß Anspruch 5, welche die Eigenschaften
von Escherichia coli HB101/pXbr41 (FERM BP-3067) hat.
14. Verfahren zum Herstellen eines Xenopus
laevis-Knochenmorphogenese-Proteins gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Verfahren
das Kultivieren einer in Anspruch 5 definierten nicht-humanen
Transformanten, das Erzeugen und Anreichern des Proteins in
einer Kultur und Isolieren des auf diese Weise erhaltenen
Proteins umfaßt.
15. Zusammensetzung zur Fraktur- oder Osteoporosetherapie, die
eine wirksame Menge eines Xenopus laevis-Knochenmorphogenese-
Proteins gemäß Anspruch 1 oder 2 und pharmazeutisch annehmbare
Zusatzbestandteile enthält.
16. Verfahren zum Herstellen einer Zusammensetzung zur
Frakturoder Osteoporosetherapie, welches das Mischen einer wirksamen
Menge eines Xenopus laevis-Knochenmorphogenese-Proteins gemäß
Anspruch 1 oder 2 mit pharmazeutisch annehmbaren
Zusatzbestandteilen umfaßt.
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