DE68907941T2

DE68907941T2 - Polypeptide mit Zellausdehnungs-Aktivität.

Info

Publication number: DE68907941T2
Application number: DE89301440T
Authority: DE
Inventors: Ikunoshin Kato; Fusao Kimizuka; Tatsuru Kinoshita; Yoh Ichi Ohdate; Yuki Taguchi
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1988-02-16
Filing date: 1989-02-15
Publication date: 1994-02-17
Anticipated expiration: 2009-02-16
Also published as: JP2561113B2; DE68907941D1; EP0329413B1; US5045631A; EP0329413A3; JPH01206998A; EP0329413A2

Description

Die Erfindung betrifft ein Protein mit einer Zellen-aus- (ver)breitenden Aktivität wie der von Fibronectin. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Polypeptid mit Zellen-ausbreitender Aktivität wie derjenigen von Fibronectin menschlichen Ursprungs sowie ein Verfahren zu seiner Herstellung.
Fibronectin ist ein multifunktionales Glykoprotein, das weit verbreitet in einer Vielzahl verschiedener tierischer Gewebe und Körperflüssigkeiten sowie auch auf der Oberfläche kultivierter Zellen und anderswo vorkommt. Diese Verbindung hat vielfältige physiologische Wirksamkeiten, so verursacht sie etwa die Anheftung, Ausbreitung, Auswanderung, Differenzierung, Proliferation und Phagozytose von Zellen und ist an Vorgängen, wie etwa der Gewebsregeneration, des Gewebsaufbaus und dem Schutz vor Infektionen, beteiligt.
Fibronectin ist ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht von ca. 250 000 und ist ein Dimer mit einer S-S-Bindung in der Nähe des C-Terminus. Die Aminosäuresequenz dieses Moleküls umfaßt drei verschiedene Typen interner repetitiver Sequenzen und kann in die Typen I, II und III klassifiziert werden. Zusätzlich hierzu gibt es Domänenstrukturen mit verschiedenen Funktionen, welche die Anhaftung und Ausbreitung von Zellen bewirken und die Fähigkeit zur Bindung von Kollagen, Heparin, Fibrin usw. verleihen. Für diese Domänen wurden industrielle Anwendungen der in Zusammenhang mit der Zellanheftung und -ausbreitung stehenden biologischen Aktivität in Betracht gezogen. Bei der Herstellung eines Beschichtungsmittels für ein Zellkultursubstrat ist es beispielsweise möglich, diese Funktion bei der Herstellung einer Unterlage zu nutzen, an welche Zellen dann binden. Ferner kann diese Funktion als Beschleuniger der Zellbindung angewendet werden in Präparationen, wie etwa Collyrium, Lotionen sowie Mitteln zur Förderung der Wundheilung. Damit Zellen proliferieren ist es, mit einigen Ausnahmen, nötig, daß nicht nur allein die Zellanheftung sondern auch das Phänomen der Ausbreitung (Spreitung) stattfinden.
Die grundlegende Struktur, welche die für die Zellanheftungsdomäne von Fibronectin minimal erforderliche Struktur darstellt, ist die Sequenz Arg-Gly-Asp-Ser (Nature 1984; 309:30-35). In der JA-OS (Tokuhyo) 84-501548 ist ein Peptid mit Zellen-anheftender Aktivität beschrieben, welches ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 11 500 ist und das diese Sequenz in seiner Sequenz von 108 Aminosäuren enthält.
Die Zellanheftungsaktivität dieses Polypeptids mit einem Molekulargewicht von 11 500 ist jedoch viel geringer als die von Fibronectin natürlichen Ursprungs, und es ist nicht unbedingt möglich, diese Aktivität bei den oben erwähnten praktischen Anwendungen zu nutzen. Diese Schwierigkeit wird beispielsweise in J. Biol Chem. 260, (1985), 13256-13260 diskutiert. Wir haben ferner dieses Polypeptid vom Molekulargewicht 11 500 auf gentechnologischem Wege hergestellt und seine Aktivität mit der von Fibronectin natürlichen Ursprungs unter Verwendung von normalen Rattennierenzellen (NRK) verglichen. Das Ergebnis war, daß Fibronectin eine merkliche Wirkung in einer Dosis von 0,1 bis 1 ug/Schale aufwies, während eine Dosis von 50 ug/Schale des Polypeptids mit dem Molekulargewicht 11 500 keine derartige Wirkung zeigte.
Die vorliegende Erfindung identifiziert die Aminosäuresequenz, die eine wesentliche Zellen-ausbreitende Wirkung besitzt, als das Peptid der Zellen-ausbreitenden Domäne von Fibronectin und liefert ein Verfahren zu ihrer Herstellung.
Die vorliegende Erfindung liefert Polypeptide mit Zellen- ausbreitender Aktivität, die eine Aminosäurensequenz der folgenden allgemeinen Formel (I) haben:
worin X eine Sequenz der folgenden Formel (II) ist:
oder die Sequenz (II), bei der eine gewisse Aminosäure oder ein Peptid oder gewisse Aminosäuren oder Peptide vom N-Terminus deletiert sind, und Y entweder Cystein oder die Deletion von Cystein bedeutet.
Die vorliegende Erfindung liefert ferner rekombinante Plasmide, die DNA enthalten, welche für die Polypeptide (I) codiert, sowie Transformanten, welche diese rekombinanten Plasmide tragen. Die vorliegende Erfindung liefert außerdem ein Verfahren zur Herstellung der Polypeptide (I) durch Kultivierung dieser Transformanten und Isolieren der Polypeptide aus dem Kulturmedium.
Wir haben gefunden, daß das Polypeptid, für das die oben genannte JA-OS 84-501548 Zellen-anheftende Aktivität beansprucht und das ein 11,5 kDalton-Polypeptid (mit einer Sequenz von 108 Aminosäuren) von Fibronectin humanen Ursprungs (im folgenden als FN bezeichnet) ist, fast keine Zellen-aus- breitende Wirkung aufweist, daß jedoch das Peptid mit der Sequenz von 283 Aminosäuren (Ala¹²³&sup5;-Met¹&sup5;¹&sup7;), das sich vom N- Terminus des genannten Polypeptids erstreckt, etwa die gleiche Höhe an Zellen-ausbreitender Aktivität aufweist wie FN. Das letztere Peptid und seine gentechnologische Herstellung sind in der JA-PA 148/88 (5. Januar 1988), und der entsprechenden US-PA USSN 291,894 (29. Dezember 1988) beschrieben. Die Beschreibung der US-PA USSN 291,894, wie angemeldet, ist in den ursprünglich mit der vorliegenden Anmeldung eingereichten Unterlagen in Kopie enthalten, und auf dieses US- Dokument (z.B. die Seiten 3 bis 7 und die Beispiele 1, 2 und 4) wird zur näheren Hintergrundinformation hingewiesen.
Hochgestellte Nummern bei den Aminosäuresymbolen zeigen in der vorliegenden Beschreibung die Positionsnummer des betreffenden Aminosäurerests, gezählt vom N-Terminus der Aminosäuren von FN gemäß der in der EMBL-Datenbank hinterlegten Form, an.
In weiteren Untersuchungen haben wir unter Anwendung gentechnologischer Verfahren Polypeptide mit Zellen-ausbreitender Aktivität hergestellt, welche aufgrund der Deletion einer Aminosäure oder eines Peptids vom N-Terminus des Peptides der Länge von 283 Aminosäuren verschiedene Kettenlängen aufweisen. Wir haben die Zellen-ausbreitende Aktivität dieser Polypeptide bestimmt und den Zusammenhang zwischen Kettenlänge des Peptids und der Zellen-ausbreitenden Aktivität geklärt. Ferner wurde im Verlauf dieser Forschungsarbeiten gefunden, daß in Abhängigkeit von der Aminosäuresequenz in der Region des N-Terminus eine bemerkenswerte Änderung in der Expression des Peptids auftritt. Als Ergebnis hiervon wurde es möglich, die Sequenz eines Peptids zu identifizieren, das zusätzlich zu seiner hohen Zellen-ausbreitenden Aktivität auch in großen Mengen exprimiert werden kann. Die vorliegende Erfindung beruht auf diesen Befunden.
Die vollständige Aminosäuresequenz von Fibronectin humanen Ursprungs und dessen cDNA-Sequenz sind publiziert (The EMBO Journal 4, (1985), 1755-1759). Die Schritte, durch welche die der Aminosäuresequenz der Zellanheftungs- und -ausbreitungs-Domäne von Fibronectin entsprechende cDNA kloniert werden kann, sind wohl bekannt. Man präpariert beispielsweise eine poly(A)-haltige RNA-Fraktion aus der Leber, und kann daraus nach Methoden, wie der nach Okayama-Berg oder nach Gubler-Hoffmann, eine cDNA-Bibliothek herstellen. Alternativ hierzu sind derartige cDNA-Bibliotheken auch käuflich zu erwerben. Sie sind beispielsweise von der Firma Clontech Laboratories, Inc., erhältlich. Als ein Verfahren, den gewünschten cDNA-Klon aus der cDNA-Bibliothek zu erhalten, kann die der Aminosäuresequenz entsprechende DNA mit den Verfahren der Kolonie- oder Plaque-Hybridisierung als Sonde verwendet werden. Die Klone, die mit der Sonde hybridisieren, werden ausgewählt und DNA wird aus dem Zellsediment oder einer lytischen Phagenlösung extrahiert und mit Restriktionsenzymen geschnitten. Insertionen werden mit Hilfe der Elektrophorese bestätigt. Falls nötig, wird im Southern-Blot-Verfahren geprüft, ob das Insert mit der Sonde hybridisiert. Im letzten Schritt wird schließlich durch die Untersuchung der Basensequenz des Inserts nach der Dideoxy- Methode oder ähnliche die Identität des gewünschten Klons überprüft.
Falls nötig, kann der Vektor, der die für die Zellen-ausbreitende Aktivität von Fibronectin codierende cDNA trägt, in den Wirtszellen amplifiziert, gereinigt und mit Restriktionsenzymen gespalten werden, so daß der cDNA-Anteil entfernt werden kann. Die cDNA-Fragmente können unter Verwendung der Elektrophorese gereinigt werden. Diese cDNA-Fragmente werden durch inframe-Ligierung (Ligierung im Leseraster) unter Verwendung von DNA-Ligase mit Expressionsvektoren verbunden. Durch Einführen in Wirtszellen ist es dann möglich, die cDNA zu exprimieren.
Jeder bekannte Vektor kann als Expressionsvektor für Escherichia coli als Wirtszelle verwendet werden. Vorzugsweise wird jedoch ein wirtszellen/Vektor-System verwendet, dessen Expression induzierbar ist und das eine starke Promotor- Aktivität aufweist. Solche Vektoren sind beispielsweise ein Vektor, der den λPL-Promotor trägt, ein Vektor, der den lac- Promotor trägt, ein Vektor, der den trp-Promotor trägt, ein Vektor, der den pst-Promotor trägt, ein Vektor, der sowohl den lac- als auch den trp-Promotor trägt, ein Vektor, der den lpp-Promotor trägt, ein Vektor, der sowohl den lpp- als auch den lac-Promotor trägt, sowie andere bekannte derartige Vektoren (vgl. Yoshiyuki Sakai, "Vector DNA", Kodansha Scientific, 1986).
Es ist auch möglich, Vektoren zu verwenden, worin exogene Gene downstream von einem Gen für ein Signalpeptid inseriert werden können, so daß das exprimierte Peptid sezerniert werden kann.
Ein Abschnitt gewisser Länge der vom Vektor stammenden Aminosäuresequenz ist durch die Anbindung an den Vektor manchmal mit dem N-Terminus des gewünschten Peptids verbunden, wenn ein Peptid vom Gen für das gewünschte Peptid unter Verwendung eines Expressionsvektors exprimiert wird, der downstream von einem Gen für ein Signalpeptid eingebunden wird, oder unmittelbar unter Verwendung eines Expressionsvektors. Das Hinzufügen dieser Sequenz bewirkt keine wesentliche Änderung der Zellen-ausbreitenden Aktivität des Polypeptids und dieses kann als solches verwendet werden. Es ist jedoch möglich, diese Sequenz nötigenfalls mit gentechnologischen Verfahren zu entfernen. Diese Entfernung umfaßt als dem Fachmann wohlbekanntes Verfahren die sogenannte "site specific" Mutagenese.
Wenn Fremdproteine in Escherichia coli exprimiert werden, hemmen sie im allgemeinen das Wachstum der Wirtszellen. Diese Zellen werden daher in Gegenwart eines Repressors für den Promotor kultiviert. Die Inaktivierung des Repressors oder Zusatz eines Induktionsmittels induzieren dann die Expression des Fremdproteins. Wenn das Fremdprotein das Wachstum der Escherichia coli-Wirtszellen nicht beeinträchtigt, ist die Verwendung dieser Technik nicht nötig. Das exprimierte Polypeptid der vorliegenden Erfindung hemmt die Escherichia coli-Wirtszellen nicht und die Induktion seiner Expression bedarf daher keiner Beschränkung.
Der Vektor, welcher das Gen für das Polypeptid mit Zellen- ausbreitender Aktivität trägt, kann zur Transformation von Escherichia coli nach den gebräuchlichen Verfahren verwendet werden, und die transformierten Zellen können unter für die Expression des Polypeptids geeigneten Bedingungen kultiviert werden, wodurch das gewünschte Polypeptid exprimiert werden kann. Zur Bestätigung, ob das gewünschte Peptid exprimiert wird, kann das Immunoblotting-Verfahren eingesetzt werden. Man setzt beispielsweise den Zellen einen Puffer zu, welcher SDS (Natriumdodecylsulfat) enthält, und erhitzt den gesamten Ansatz, wodurch das gesamte Protein solubilisiert wird. Danach führt man eine Polyacrylamid-Gelelektrophorese durch und überträgt das Elektrophoresemuster auf eine Nitrocellulose- oder Nylonmembran. Die Membran wird zunächst mit einem monoklonalen Antikörper, welcher für die Zellen-ausbreitende Domäne von Fibronectin spezifisch ist, und danach mit einem enzymmarkierten, zweiten Antikörper inkubiert. Die Enzymaktivität des solchermaßen gebundenen zweiten Antikörpers bewirkt die Farbzunahme eines chromogenen Substrates und damit kann das Vorhandensein der Bande für das gewünschte Peptid verifiziert werden.
Das Zellen-ausbreitende Polypeptid kann aus Escherichia coli-Zellen beispielsweise nach dem folgenden Verfahren gereinigt werden. Ein Zellsediment geernteter Zellen wird in Puffer suspendiert und ultraschallbehandelt, so daß man eine lösliche und eine unlösliche Fraktion erhält. Die letztere wird in einem Puffer solubilisiert, der 7 M Harnstoff enthält. Die löslichen Fraktionen werden gesammelt und auf eine Sepharose 4B-Chromatographiesäule aufgebracht, an welche der gleiche Antikörper gebunden ist, der für das Immunoblotting verwendet wird, so daß die Aufreinigung durch Affinitätsbindung bewirkt wird. Als Elutionsmittel wird ein Puffer mit einem pH-Wert in der Gegend von pH 2 verwendet. Durch Immunoblotting wird die Fraktion mit dem gewünschten Polypeptid gesammelt und es ist möglich, ein nach elektrophoretischen Kriterien nahezu reines Polypeptid zu erhalten. Falls nötig, kann weiter mit FPLC (Pharmacia) oder HPLC aufgereinigt werden. Das auf diese Weise erhaltene Polypeptid kann beispielsweise auf die folgende Weise auf die Gegenwart oder die Abwesenheit von Zellen-ausbreitender Aktivität untersucht werden. Man läßt einen Puffer, worin eine Probe gelöst wurde, auf die Vertiefungen einer Mikrotiter-Platte adsorbieren und setzt dann eine Suspension von NRK-Zellen zu und inkubiert die Platte eine Stunde bei 37ºC. Zur Bestimmung der Gegenwart oder Abwesenheit von Zellen-ausbreitender Aktivität begutachtet man dann die morphologischen Veränderungen der Zellen. Durch Vergleich der kleinsten Dosis, die nötig ist, um in jeder Vertiefung das Auftreten von Ausbreitungs-Aktivität zu bewirken, mit der Aktivität von Fibronectin kann die Stärke der Zellen-ausbreitenden Wirkung beurteilt werden.
Die Verwendung des Plasmids pTF301 (vgl. nachstehendes Beispiel B, welches weitgehend dem Beispiel 2 der US-PA USSN 291,894 entspricht), das für das bereits clonierte Peptid mit der Sequenz von 283 Aminosäuren codiert, ist praktisch als Verfahren zur gentechnologischen Herstellung von Polypeptiden verschiedener Längen mit Deletionen in der Gegend des N-Terminus des Peptids mit 283 Aminosäuren. Unter Verwendung eines geeigneten Restriktionsenzyms spaltet man daher zuerst eine etwas upstream des Initiationscodons von pTF301, das für die Sequenz Ala¹²³&sup5;-Met¹&sup5;¹&sup7; codiert, gelegene Schnittstelle und kann dann durch Einsatz von Exonuklease das 5'-Ende der Sequenz entfernen. Durch Abändern der Reaktionsbedingungen ist es möglich, ein Plasmid zu erhalten, aus welchem geeignete Teile des 5'-Terminus der codierenden Region deletiert sind. Man verwendet dann ein geeignetes Restriktionsenzym zur Spaltung einer etwas downstream vom Terminationscodon der codierenden Region dieses Plasmids gelegenen Schnittstelle, trennt die gespaltene DNA durch Gelelektrophorese auf und kann so Fragmente der cDNA erhalten, aus welcher verschiedene Teile des 5'-terminalen Stranges entfernt sind. Durch Inserieren dieser cDNA-Fragmente in einen geeigneten Expressionsvektor können Peptide verschiedener Kettenlängen exprimiert werden, in denen Teile der N- terminalen Region der Sequenz Ala¹²³&sup5;-Met¹&sup5;¹&sup7; (283 Aminosäurereste) deletiert sind.
Als Expressionsvektor kann irgendein bekannter Vektor verwendet werden. Zufriedenstellende Ergebnisse wurden bei direkter Expression unter Verwendung von Vektoren des Typs pUC erzielt, worin der Abstand zwischen Ribosomenbindungsstelle und Initiationscodon optimiert wurde.
Das Ausmaß der Expression kann auch durch Einbindung eines Transkriptionsterminationssignals downstream vom Terminations- oder Stopcodon des pUC-Vektors verbessert werden.
Die Selektion der rekombinanten Klone, welche das Peptid mit Zellen-ausbreitender Aktivität exprimieren, geschieht in praktischer Weise durch Immunoscreening. Hierbei werden Expressionsvektoren, in welche cDNA-Fragmente verschiedener Längen eingebunden wurden, durch übliche Verfahren in Escherichia coli-Zellen eingebracht und die erhaltenen Transformanten werden auf Nitrocellulosefiltern kultiviert. Danach werden sie lysiert und das Protein aus den Zellen wird auf den Filtern fixiert. Nach Blockieren der Filter mit Rinder- Serumalbumin oder dergleichen wird ein monoklonaler Antikörper zur Wirkung gebracht, der die Zellen-ausbreitende Domäne von FN erkennt. Der an den Filter gebundene monoklonale Antikörper wird durch Markierung mit einem zweiten Antikörper detektiert. Auf diese Weise können Rekombinante selektiert werden, welche das Peptid mit der Domäne für Zellausbreitung exprimieren.
Als nächstes werden solchermaßen selektierte rekombinante Klone unter für die Expression geeigneten Bedingungen kultiviert und die Expression des Peptids mit der Domäne für die Zellausbreitung wird induziert. Zum Nachweis stattgefundener Expression kann Immunoblotting eingesetzt werden. Hierzu wird das Gesamtzellprotein der kultivierten Zellen durch Hitzebehandlung in einem SDS-haltigen Puffer lysiert und durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt. Das Elektrophoresemuster wird auf eine Nitrocellulose- oder Nylonmembran übertragen. Nach Inkubation der Membran mit einem für die Zellausbreitungsdomäne von FN spezifischen monoklonalen Antikörper wird ein enzymmarkierter Sekundärantikörper aufgebracht und die Enzymaktivität des gebundenen Antikörpers bewirkt eine Farbzunahme in einem chromogenen Material und erlaubt damit, das Vorhandensein einer Bande des Peptids mit der Zellausbreitungsdomäne zu bestätigen.
Die Aufreinigung des Peptids mit der Domäne für Zellausbreitung aus den Rekombinanten kann beispielsweise wie folgt vorgenommen werden. Das Zellsediment wird in einem Puffer resuspendiert und lösliche und unlösliche Fraktion werden durch Ultraschallbehandlung separiert. Die unlösliche Fraktion wird in einem Puffer solubilisiert, welcher 7 M Harnstoff enthält. Die löslichen Fraktionen werden vereinigt und zur affinitätschromatographischen Reinigung auf eine Sepharose 4B-Säule aufgebracht, an welche der zum Immunoblotting verwendete Antikörper gebunden ist. Zur Elution verwendet man einen Puffer mit einem pH-Wert im Bereich von pH 2,3. Durch Sammeln der gewünschten Fraktionen durch Immunoblotting kann das Peptid mit der Domäne für Zellausbreitung gesammelt werden. Eine weitere Aufreinigung kann nötigenfalls durch FPLC oder HPLC vorgenommen werden.
Das solchermaßen erhaltene Peptid mit der Zellausbreitungsdomäne kann bezüglich seiner Zellen-ausbreitenden Aktivität an NRK-Zellen vermessen werden. Die Probe wird in einem Puffer gelöst und zum Beschichten von Mikrotiterplatten verwendet. Danach werden NRK-Zellen zugegeben und die Platte wird über eine festgelegte Zeit bei 37ºC inkubiert. Die Ausbreitung der Zellen wird mikroskopisch begutachtet und man vergleicht die minimale, die Expression der Zellen-ausbreitenden Wirkung auslösende Dosis der Probe mit der hierfür nötigen Dosis an FN natürlichen Ursprungs. Auf diese Weise läßt sich die Stärke der Zellen-ausbreitenden Aktivität ausdrücken.
Durch die Reihe der oben dargestellten Versuche wurde gefunden, daß die Zellen-ausbreitende Aktivität der Zellausbreitungsdomäne von FN mit der Länge der Peptidkette vom N-Terminus variiert. Das Peptid mit dem Molekulargewicht 11,5 kDa mit 108 Aminosäuren wies keine Zellen-ausbreitende Wirkung auf. Mit Zunahme der Länge vom N-Terminus wird die Aktivität abrupt exprimiert. Mit 138 Aminosäuren betrug die Aktivität etwa 1/25 derjenigen von FN; mit 206 Aminosäuren betrug die Aktivität etwa 1/3 derjenigen von FN; mit 258 Aminosäuren oder 279 Aminosäuren war die Aktivität derjenigen von FN in etwa gleich. Diese Peptide mit Zellen-ausbreitender Aktivität können so wie sie sind oder unter Verwendung eines Quervernetzungsmittels gebunden an andere Peptide eingesetzt werden. Als ein Verfahren zur Bindung an andere Peptide existiert beispielsweise das Hinzufügen eines Cysteinrests am C-Terminus des Peptids, worauf dann unter Verwendung eines bifunktionalen Vernetzungsmittels, wie 3-(2-Pyridyldithio)propionsäure-N-hydroxysuccinimidester oder SPDP, der Cysteinrest an einen Aminosäurerest eines anderen Peptids gebunden werden kann. Ein Cysteinrest kann am C-Terminus des Peptids mit Hilfe gentechnologischer Verfahren leicht angefügt werden. Bei Klonieren des für das gewünschte Peptid codierenden Gens kann beispielsweise unmittelbar vor dem Terminationscodon am 3'-Ende das Cystein entsprechende Codon angefügt werden.
Zusätzlich zu seiner starken Zellen-ausbreitenden Aktivität sollte ein Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung auch zu einem hohen Grad an Expression geeignet sein. Diesbezüglich wurde der Grad der Expression verschiedener Peptide unter Verwendung ihres Musters in der SDS/PAGE (SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese) verglichen. Dabei wurde gefunden, daß der Grad der Expression abhängig von Unterschieden in der Aminosäuresequenz in der N-terminalen Region des Peptids, sich in erheblichem Umfang ändert. Als Ergebnis dieser Untersuchungen war es möglich, Peptide mit der oben genannten Sequenz (I) zu selektieren.
Von den Polypeptiden mit Aminosäuresequenzen entsprechend der allgemeinen Formel (I) wird dasjenige mit der folgenden Aminosäuresequenz (279 Aminosäuren) besonders bevorzugt:
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel A

Klonierung des für Ile¹&sup4;¹&sup0;-Met¹&sup5;¹&sup7; (108 Aminosäuren) von Fibronectin codierenden cDNA-Fragments

(1-1) Herstellung von cDNA-Fragmenten:

Zuerst wurden 100 ug eines Plasmids, pLF5 (beschrieben in Biochemistry, 25 (1986), 4936-4941), mit einer Länge von 4,1 35 kb (KiloBasen), welches die für die Zellen-ausbreitende Domäne von Fibronectin codierende cDNA-Sequenz enthält, zu 200 ul eines Reaktionsgemisches gegeben, das einen Puffer zur Verwendung mit dem Restriktionsenzym BalI sowie 100 Einheiten (U) BalI enthielt, und das Gemisch wurde 2 Stunden bei 37ºC inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde dann auf eine HPLC-Säule mit DEAE-4000 (6x125 mm; Nucleogen) gegeben und mit einem Konzentrationsgradienten von KCl in einem 30 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 6,5) mit 5 M Harnstoff eluiert und mit Isopropylalkohol gefällt. Man erhielt 7,5 ug Fragmente mit 0,75 kb. Als nächstes wurden diese Fragmente mit 30 U FokI eine Stunde bei 37ºC behandelt. Mit der gleichen Aufreinigungsmethode erhielt man 60 ng Fragmente mit 92 bp sowie 140 ng Fragmente mit 203 bp.

(1-2) Herstellung synthetischer DNA-Linker

Damit die cDNA-Fragmente in einen Vektor eingebunden werden konnten, wurden Linker am 5'- und am 3'-Ende chemisch wie folgt synthetisiert: Die Basensequenz ist in Figur 1 gezeigt. Der obere Strang des Linkers am 5'-Ende (Kettenlänge 11), als "5 U" bezeichnet, der untere Strang des Linkers am 5'-Ende (Kettenlänge 7), als "5 L" bezeichnet, der obere Strang des Linkers am 3'-Ende (Kettenlänge 30), als "3 U" bezeichnet, sowie der untere Strang des Linkers am 3'-Ende (Kettenlänge 30), als "3 L" bezeichnet, wurden unter Verwendung eines DNA-Synthesizers der Firma Applied Biosystems, Inc., synthetisiert. Nach Entfernung der Schutzgruppen wurden 5 U und 5 L durch Ionenaustausch-HPLC auf einer TSK-Gel DEAE-2000-Säule gereinigt und auf SepPak (Waters) entsalzt. Man erhielt 60 bzw. 40 ug. 3 U und 3 L wurden durch Elektrophorese in einem 12% Polyacrylamidgel mit 7 M Harnstoff aufgetrennt und nach Isolierung aus dem Gel, wie für 5 U und 5 L beschrieben, entsalzt. Man erhielt 32 bzw. 26 ug. Die Basensequenzen wurden durch Festphasensequenzierung nach der Maxam-Gilbert-Methode überprüft. Jeder Strang wurde dann am 5'-Terminus wie folgt phosphoryliert. Zunächst wurden 25 ug DNA in 10 ul destilliertem Wasser gelöst und zu 20 ul einer Pufferlösung zur Verwendung mit Polynukleotidkinase (PNK) mit 50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM MgCl&sub2; und 10 mM DTT, 1 mM ATP sowie 5 U PNK gegeben. Das Gemisch wurde eine Stunde bei 37ºC inkubiert. Daraufhin wurde die Reaktion durch Hitzebehandlung für 10 Minuten bei 65ºC gestoppt. Nach der Phosphorylierung wurden die Stränge durch Zusammenlagerung (Annealing) von 5 U mit 5 L sowie von 3 U mit 3 L doppelsträngig gemacht, d.h. es wurden gleiche Mengen von 5 U und 5 L miteinander gemischt und 10 Minuten bei 60ºC gehalten, danach ließ man das Gemisch allmählich auf Raumtemperatur abkühlen und kühlte weiter bis auf 15ºC. Die Stränge 3 U und 3 L wurden auf die gleiche Weise behandelt.

(1-3) Bindung von cDNA-Fragmenten und Linkern:

Die im Abschnitt (1-2) hergestellten beiden Arten von Linkern und die beiden Arten von im Abschnitt (1-1) hergestellten DNA-Fragmenten (mit 92 bp und 203 bp Länge) wurden verwendet und miteinander ligiert (verbunden). Hierzu wurden 0,5 pM jeder Art von cDNA-Fragment sowie 5 pM jeder Art von Linker zu 20 ul einer Lösung gegeben, welche einen Ligierungspuffer (66 mM Tris-HCl, pH 7,6, und 6,6 mM NgCl&sub2;) sowie 0,5 mM ATP, 10 mM DTT und 2,8 U T4-DNA-Ligase enthielt. Dies geschah bei 16ºC; das Gemisch wurde über Nacht inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten auf 65ºC erhitzt, danach wurde das zweifache Volumen kaltes Ethanol zugegeben und das Ganze 30 Minuten bei -70ºC stehengelassen. Hierauf wurde die ausgefällte DNA durch Zentrifugation isoliert. Diese DNA wurde in 20 ul eines aus Puffer zur Verwendung mit EcoRI und 7,5 U EcoRI hergestellten Reaktionsgemisches gegeben und 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Das Gemisch wurde dann einer Polyacrylamid-Ggelelektrophorese unterzogen, wobei man Fragmente von 336 bp erhielt. Diese wurden über 10 Stunden bei 37ºC in einem Gelelutionspuffer (0,5 M Ammoniumacetat, 0,01 mM Magnesiumacetat und 1 mM EDTA) eluiert und danach mit Ethanol gefällt. Die DNA wurde isoliert. Diese DNA wurde in 20 ul TE (10 mM Tris-HCl und 1 mM EDTA, pH 8,0) gelöst.

(1-4) Bindung von mit Linkern verbundenen cDNA-Fragmenten an einen Vektor

Zuerst wurde 1 ug des Sekretions-Expressionsvektors pIN-III- ompA-1 (beschrieben in The EMBO Journal, 3 (1984), 2437- 2442) zusammen mit 5 U EcoRI in Puffer zur Verwendung mit EcoRI für eine Stunde bei 37ºC inkubiert. Als nächstes wurden 0,5 U Alkalische Phosphatase zugegeben und die Inkubation über eine weitere Stunde fortgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde zweimal mit Phenol behandelt und durch Ethanolfällung wurden 0,5 ug DNA erhalten. Diese DNA wurde mit EcoRI gespalten, dann wurden 0,1 ug desphosphorylierter Vektor pIN-III-ompA-1 in ein Gemisch mit 0,1 ug der im obigen Abschnitt (1-3) erhaltenen DNA-Fragmente zusammen mit 10 ul Puffer zur Verwendung von T4-DNA-Ligase, 0,5 mM ATP, 10 mM DTT und 1,8 U T4-DNA-Ligase in einem Gesamtvolumen des Reaktionsgemisches von 30 ul gegeben. Dieses Gemisch wurde über Nacht bei 16ºC inkubiert. Dann wurden 15 ul dieses Reaktionsgemisches für die Transformation von Escherichia coli-Zellen eingesetzt.

(1-5) Transformation von Escherichia coli-Zellen:

Zellen von Escherichia coli SB221 (The EMBO Journal, 3 (1984), 2437-2442) wurden in ein 20 ml-Teströhrchen mit 5 ml L-Broth (10 g/Liter Bactotrypton; 5 g/Liter Hefeextrakt; 5 g/Liter NaCl; pH 7,2) gegeben und über Nacht unter Schütteln bei 37ºC kultiviert. Dann wurden 0,05 ml dieser Kulturbrühe zum Beimpfen von 5 ml frischer L-Broth verwendet und diese weiter unter Schütteln kultiviert bis die Absorption bei 600 nm den Wert 0,6 erreichte. Diese Kulturbrühe wurde auf Eis gekühlt und 5 Minuten bei 5000 Upm bei 4ºC zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und mit 2,5 ml einer eiskalten Lösung von 0,1 M MgCl&sub2; gemischt. Danach wurde in gleicher Weise zentrifugiert und der Überstand abgenommen. Er wurde mit 1,25 ml eiskalter Lösung von 0,1 M MgCl&sub2; gemischt, sofort mit eiskaltem Wasser gemischt und 30 Minuten stehengelassen. Das Gemisch wurde zentrifugiert und der Überstand abgenommen und danach mit 0,1 ml eiskaltem 0,1 M CaCl&sub2; zur raschen Suspendierung gemischt. Die Suspension wurde mit 10 ul des im obigen Abschnitt (1-4) erhaltenen Reaktionsgemisches vermischt und 30 Minuten im Eisbad belassen. Als nächstes wurde es 2 Minuten auf 42ºC erwärmt. Dann wurde 1 ml auf 37ºC erwärmte L-Broth zugesetzt und das Ganze 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Danach wurde das Gemisch für eine Stunde unter Schütteln bei 37ºC kultiviert. Die Kulturbrühe wurde auf L-Agarmedium ausgesät, das 50 ug/ml Ampicillin enthielt, und nach Bebrütung über Nacht wurden gewachsene Kolonien isoliert. Es wurden ca. 200 Kolonien erhalten, von denen vierzehn auf Plasmide hin analysiert wurden.

(1-6) Analyse von Plasmiden:

Vierzehn Transformanten wurden unter Schütteln über Nacht in 1,5 ml L-Broth mit 50 ug/ml Ampicillin kultiviert, die Kulturen zentrifugiert und das Zellsediment isoliert. Die Zellsedimente wurden in 100 ul Lösung A (50 mM Glucose, 10 mM EDTA, 25 mM Tris-HCl, pH 8,0, und 2 mg/ml Lysozym) suspendiert und für 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dann wurden 200 ul Lösung B (0,2 M NaOH und 1% SDS) der Suspension zugesetzt und das Reaktionsgefäß fünfmal rasch auf den Kopf gestellt. Danach wurde das zweifache Volumen kaltes Ethanol zugegeben und das Gemisch 30 Minuten bei -70ºC stehen gelassen. Danach wurde die DNA durch Zentrifugation isoliert. Die DNA wurde mit 80% Ethanol gewaschen und Ethanol und Wasser wurden unter vermindertem Druck abgezogen. Der Rückstand wurde in einer geringen Menge TE gelöst. Ein Aliquot der Lösung (0,1 ul) wurde für eine Stunde bei 37ºC in 10 ul eines Reaktionsgemisches mit 5 U EcoRI in einem Puffer zur Verwendung von EcoRI zur Reaktion gebracht. Dann wurde das Reaktionsgemisch durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die erwarteten DNA-Banden (bei 0,33 kb) wurden durch Anfärben mit Ethidiumbromid überprüft mit dem Ergebnis, daß neun der Klone die gewünschte Bande zeigten. Die aus diesen neun Klonen extrahierten Plasmide wurden mit PvuII und HindIII doppelt verdaut. Die Orientierung der inserierten Fragmente wurde festgestellt, wobei gefunden wurde, daß acht der Klone das Insert in der richtigen Orientierung enthielten. Die Plasmide von fünf dieser acht Klone wurden mit XbaI und HindIII doppelt verdaut und die DNA, welche die inserierten Fragmente enthielt, isoliert und in den Phagen M13mp18 und mp19 subkloniert. Die Basensequenz wurde nach der Dideoxy-Methode analysiert. Es wurde gefunden, daß drei der Klone die gewünschte Sequenz enthielten. Die auf diese Weise erhaltenen Plasmide erhielten die Bezeichnung pTF101.

(1-7) Aufreinigung von Plasmiden:

Das, wie oben im Abschnitt (1-6) beschrieben, erhaltene Plasmid pTF101 wurde zur Transformation von Escherichia coli-Zellen (SB221/pTF101) verwendet und derart transformierte Zellen wurden in 5 ml L-Broth über Nacht unter Schütteln bei 37ºC kultiviert. Die Kultur wurde auf 500 ml der gleichen Kulturbrühe überimpft und die Kultur wurde fortgesetzt bis eine Absorption von 0,6 bei 660 nm erreicht wurde. Zu diesem Zeitpunkt wurden 170 ug/ml Chloramphenicol zugesetzt und die Kultivierung wurde erneut über 10 bis 12 Stunden fortgesetzt. Die Kulturbrühe wurde dann 10 Minuten bei 5000 Upm zentrifugiert und das Zellsediment in STE (10 mM Tris-HCl, pH 8, 100 mM NaCl und 1 mM EDTA gewaschen) und erneut in gleicher Weise zentrifugiert, um das Zellsediment zu erhalten. Das Sediment wurde in 10 ml der Lösung A suspendiert und 5 Minuten bei Raumtemperatur gehalten bevor dann 20 ml der Lösung B unter heftigem Rühren zugegeben wurden und die Suspension für 5 Minuten bei 0ºC stehen gelassen wurde. Zu dieser Suspension wurden 15 ml 3 M Kaliumacetat unter heftigem Rühren zugegeben und die Suspension wurde für 10 Minuten bei 0ºC stehen gelassen. Das Gemisch wurde 60 Minuten bei 8000 Upm zentrifugiert und der Überstand isoliert. Dieser wurde daraufhin mit 27 ml (0,6-faches Volumen) Isopropylalkohol versetzt und das Gemisch wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Danach wurde zentrifugiert und der Niederschlag isoliert und in 80% Ethanol gewaschen. Ethanol und Wasser in dem erhaltenen Gemisch wurden unter vermindertem Druck abgezogen und der Rückstand getrocknet. Dieser Rückstand wurde in 4 ml TE gelöst und dieser Lösung wurden 4,75 g Cäsiumchlorid zugesetzt, gefolgt von der Zugabe von 5 mg/ml Ethidiumbromid in einem Volumen von 420 ul. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei 0ºC stehen gelassen. Es wurde dann 10 Minuten bei 8000 Upm zentrifugiert und der Überstand wurde in ein Beckmann Quick-Seal Zentrifugengefäß überführt und über Nacht bei 55000 Upm ultrazentrifugiert. Danach wurden unter UV-Licht Plasmidbanden mit Hilfe einer Injektionsspritze isoliert. Das erhaltene Gemisch wurde sieben Mal mit gleichen Volumina von Isopropylalkohol extrahiert und das verbleibende Ethidiumbromid entfernt, dann wurde zweimal mit Ethanol gefällt, das verbleibende Gemisch in 80% Ethanol gewaschen, unter vermindertem Druck getrocknet und in einem Tropfen TE aufgelöst (Ausbeute 760 ug).

Beispiel B

Klonieren des für Ala¹²³&sup5;-Met¹&sup5;¹&sup7; (283 Aminosäuren) von Fibronectin codierenden cDNA-Fragments
Zuerst wurden 50 ug des Plasmids pLF5 in 200 ul eines Reaktionsgemisches mit 200 U EcoRI-Methylase in einem Puffer zur Verwendung von EcoRI-Methylase (100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM DTT, 10 mM EDTA und 80 uM S-Adenosylmethionin) eingebracht und das Gemisch wurde 60 Minuten bei 37ºC inkubiert, um Schutz der EcoRI-Schnittstellen zu erzielen. Dann wurde die Reaktion durch Erhitzen auf 65ºC über 20 Minuten gestoppt und es wurden 96 U PvuII in einem Puffer zur Verwendung von PvuII zugesetzt. 300 ul des Reaktionsgemisches wurden über 60 Minuten bei 37ºC inkubiert. Dieses Gemisch wurde durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und das Gelstückchen, das die Bande mit 0,60 kb enthielt, wurde ausgeschnitten. Dieses Gelstückchen wurde in ein Dialysierröhrchen gegeben, das Elutionspuffer (5 mM Tris-Acetatpuffer, pH 8,0, und 1 mM EDTA) enthielt, und elektrophoretisch in dem selben Puffer eluiert, wodurch die DNA eluiert wurde. Die Elutionsflüssigkeit wurde zweimal mit Phenol extrahiert und es wurde 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat zugesetzt, gefolgt von der Zugabe von zwei Volumina Ethanol, und es wurde zweimal mit Ethanol gefällt. Dann wurde das erhaltene Gemisch in 80% Ethanol gewaschen, getrocknet und in einer geringen Menge TE gelöst (Ausbeute 1,2 ug).
Ferner wurden 140 ug des im Beispiel A erhaltenen Plasmids pTF101 in 200 ul eines Reaktionsgemisches mit 144 U PvuII eingebracht und das Gemisch wurde 60 Minuten bei 37ºC inkubiert. Dann wurden 150 U EcoRI zugesetzt, die Reaktionslösung wurde auf ein Volumen von 240 ul gebracht und 60 Minuten bei 37ºC inkubiert. Das erhaltene Gemisch wurde durch Polyacrylamid-Gelektrophorese aufgetrennt und die Banden wurden bei 0,25 kb ausgeschnitten. Die DNA wurde aus diesen Gelbanden, wie oben beschrieben, eluiert und durch Ethanolfällung isoliert (Ausbeute 0,4 ug). Dann wurden 1,25 ug des in diesem Beispiel erhaltenen 0,6 kb-Fragments und 0,4 ug des 0,25 kb-Fragments in einen Ligierungspuffer eingebracht, welcher 2,8 U T4-DNA-Ligase, 0,5 mM ATP und 10 mM DTT in 50 ul enthielt, und das Gemisch wurde 30 Minuten bei 16ºC inkubiert. Dann wurden 92 pM phosphorylierter Linker (pCCGAATTGG) und 1,4 U T4-DNA-Ligase dem Reaktionsgemisch zugesetzt, das dann auf ein Volumen von 70 ul aufgefüllt und über Nacht bei 10ºC inkubiert wurde. Die Reaktion wurde durch Erhitzen auf 65ºC für 10 Minuten gestoppt und der Puffer so modifiziert, daß er für EcoRI geeignet war; 30 U EcoRI wurden zugegeben und die Reaktion wurde über 60 Minuten bei 37ºC durchgeführt. Dann wurde das Reaktionsgemisch durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die Banden mit 0,86 kb wurden ausgeschnitten. Die DNA in den Banden wurde, wie oben beschrieben, isoliert (Ausbeute ca. 25 ng). Dann wurden 20 ng der 0,86 kb-Fragmente mit EcoRI verdaut und in einen Ligierungspuffer eingebracht, welcher 0,1 ug dephosphorylierten Vektor pIN-III-ompA-1, 2,8 U T4-DNA-Ligase, 0,5 mM ATP und 10 mM DTT in einem Gesamtvolumen von 20 ul enthielt; das Gemisch wurde 10 Stunden bei 16ºC inkubiert und die Hälfte des Reaktionsgemisches wurde zur Transformation von Escherichia coli-Zellen SB221 nach der oben beschriebenen Methode eingesetzt. 48 der erhaltenen transformierten Klone wurden auf Plasmide nach den bereits beschriebenen Verfahren analysiert und man fand, daß die Plasmide in sechs dieser Klone die gewünschten Fragmente enthielten. Diese sechs Plasmide wurden mit BamHI verdaut und die so erzeugten Fragmente analysiert. Fünf der Klone enthielten die gewünschten Fragmente in der korrekten Orientierung inseriert. Drei dieser fünf Klone wurden bezüglich ihrer Basensequenz untersucht. Für einen der Klone wurde gefunden, daß er die richtige Basensequenz aufwies. Dieses rekombinante Plasmid erhielt die Bezeichnung pTF301 und die dieses Plasmid tragenden Escherichia coli-Zellen SB221 wurden mit SB221/pTF3O1 bezeichnet.

Beispiel 1

(1) Herstellung von DNA-Fragmenten

Zuerst wurden 100 ug des Plasmids pTF301, welches für das Peptid 283AA mit Zellen-ausbreitender Aktivität codiert, mit einem Puffer zur Verwendung des Restriktionsenzyms XbaI und mit 120 U XbaI in einem Gesamtvolumen von 300 ul gemischt und für 2 Stunden bei 37ºC inkubiert. Dann wurde die DNA durch Ethanolfällung isoliert. Die Hälfte der erhaltenen Menge wurde in 375 ul eines Reaktionsgemisches aus Puffer zur Verwendung von BAL 31-Nuklease und 36 U BAL 31-Nuklease eingebracht und das Gemisch wurde bei 30ºC inkubiert; in der Zeit von 2 Minuten bis 8 Minuten Inkubation wurde jeweils im Abstand von 30 Sekunden eine Probe des Reaktionsgemisches entnommen und jeweils in 20 ul 0,5 M EDTA eingebracht, um die Reaktion zu stoppen. Proben wurden vereinigt und DNA wurde durch Phenolbehandlung und nachfolgende Ethanolfällung isoliert. Die erhaltene DNA wurde in 200 ul eines Reaktionsgemisches von 7 mM Tris-HCl, pH 7,5 mit 0,1 mM EDTA, 10 mM NaCl, 7 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM dATP, dGTP, dCTP und dTTP, sowie 2 U Klenow-Fragment eingebracht. Das Gemisch wurde 20 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Reaktion wurde durch 10-minütige Behandlung bei 65 ºC gestoppt und das Reaktionsgemisch wurde an die Zusammensetzung des Puffers zur Verwendung von HindIII angeglichen. Dann wurden zu 250 ul dieses Reaktionsgemisches 60 U HindIII gegeben und das Gemisch wurde eine Stunde bei 37ºC inkubiert. Dieses Gemisch wurde durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und die den Größen von 0,5 bis 0,8 kb entsprechenden Fragmente wurden ausgeschnitten (Ausbeute 1 ug).

(2) Klonierung in pUC119N

Zuerst wurden 0,65 ug der im obigen Abschnitt (1) erhaltenen DNA-Fragmente in 30 ul eines Ligasepuffers eingebracht, der 0,5 ug phosphorylierten NcoI-Linker (d[pAGCCATGGCT]), 2,8 U T4-DNA-Ligase, 0,5 mM ATP und 10 mM DTT enthielt, und das Gemisch wurde über Nacht bei 10ºC inkubiert. Nach dem Stoppen der Reaktion durch Erhitzen auf 65ºC für 10 Minuten wurden 24 U NcoI und 12 U HindIII diesem Reaktionsgemisch zugesetzt und dieses in einem Gesamtvolumen von 50 ul eine Stunde bei 37ºC inkubiert. Danach wurde es auf eine 1 ml- Säule von Sepharose CL-4B aufgetragen; der freie Linker wurde mit STE-Puffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl und 1 mM EDTA, pH 8,0) eluiert. Dann wurden 300 ul DNA-Fraktion isoliert und auf 55 ul eingeengt. Hiervon wurden 5,5 ul zu 1 ul einer Lösung zugegeben, welche 0,2 ug des Plasmids pUC119 enthielt, das vorher durch Behandlung mit NcoI und HindIII dephosphoryliert worden war. Hierzu wurden 65 ul Lösung A und 6,5 ul Lösung B aus einem DNA-Ligierungs-Kit (Takara Shuzo Co., Ltd.) zugesetzt und das Gemisch wurde über Nacht bei 16ºC inkubiert. Dann wurden 20 ul des Reaktionsgemisches zur Transformation von Escherichia coli HB101-Zellen eingesetzt.
Zusätzlich wurde pUC119N isoliert, indem eine das Translationsinitiationscodon des im Handel erhältlichen Vektors pUC119 (Takara Shuzo Co., Ltd.) umgebende NcoI-Schnittstelle geschaffen wurde; der Abstand zwischen Ribosomenbindungsstelle und Initiationskodon wurde außerdem von 7 auf 8 Basen verändert.

(3) Screening der Expressionsplasmide

Die im obigen Abschnitt (2) erhaltenen Transformanten wurden auf einen Nitrocellulosefilter (BA85; S&S) auf L-Agar mit 50 ug/ml Ampicillin übertragen und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Die darauf gewachsenen Kolonien wurden 15 Minuten in Chloroformdampf eingebracht und der Nitrocellulosefilter wurde dann in eine Lösung von 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 mit 150 mM NaCl, 5 mM MgCl&sub2;, 3% Rinder-Serumalbumin, 1 ug/ml DNase und 40 ug/ml Lysozym gelegt; das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Der Filter wurde mit einem monoklonalen anti-FN-Antikörper, FN-10 (Takara Shuzo Co., Ltd.) behandelt, welcher spezifisch die Zellen-ausbreitende Domäne von FN erkennt, und ein mit Peroxidase markierter Sekundärantikörper wurde aufgebracht. Mit Wasserstoffperoxid wurde in Gegenwart von 4-Chlor-1-naphthol die Bildung eines Farbstoffes veranlaßt, durch welchen die aufgetretenen Transformanten aufgefunden wurden. Durch dieses erste Screening wurden 52 Kolonien aus 1300 Klonen selektiert, von denen jede über Nacht unter Schütteln bei 37ºC in 5 ml L- Broth mit 50 ug/ml Ampicillin kultiviert wurde. Das Gesamtzellprotein der erhaltenen Zellen wurde durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) aufgetrennt und es wurde Immunoblotting eingesetzt, wobei man den monoklonalen anti- FN Antikörper, FN-10, reagieren ließ. Es wurde gefunden, daß Polypeptide mit Molekulargewichten von 22 kDa bis 32 kDa erzeugt worden waren. Für 11 Klone wurde jeweils die Basensequenz am 5'-Ende des inserierten Fragments festgestellt; man fand, daß sie für Aminosäuresequenzen einer Länge von 279, 258, 219, 213, 207, 206, 198, 195, 190, 186 bzw. 178, gezählt von Met 1517 als C-Terminus, codierten.
Die Mengen dieser exprimierten Peptide wurden auf SDS-PAGE miteinander verglichen; das in der größten Menge exprimierte Peptid war ein Peptid mit einer 279 Aminosäure betragenden Sequenz (entsprechend etwa 20% des Gesamtzellproteins); dem am nächsten kamen Peptide mit Sequenzen einer Länge von 206 und 258 Aminosäuren.
Das Plasmid, welches das Peptid mit der Sequenz der Länge von 279 Aminosäuren exprimierte, erhielt die Bezeichnung pTFD707, und das Plasmid, welches das Peptid mit der Sequenz der Länge von 258 Aminosäuren exprimierte, die Bezeichnung pTFD202. Am N-Terminus der durch pTFD707 und pTFD202 exprimierten Peptide fand sich eine Sequenz (GCT) angefügt, welche dem Alanin des Ursprungsvektors entsprach. Diese Sequenz wurde durch "site-specific" Mutagenese (ein Verfahren, wie es beispielsweise in Beispiel 4 der US-PS USSN 291,894 angewendet wird) entfernt. Ferner wurde, um den Grad der Expression zu erhöhen, das HindIII-SalI-Fragment mit einer lpp Terminatorsequenz aus dem Sekretions-Expressionsvektor pIN- III-ompA-I entfernt und mit der HindIII-SalI-Schnittstelle von pTFD707 bzw. pTFD202 verbunden, wodurch man die Plasmide mit den Bezeichnungen pTF7021 und pTF2021 erhielt.
Escherichia coli JM109, die pTF7021 trugen, erhielten die Bezeichnung Escherichia coli JM109/pTFD7021, Escherichia coli JM109, die pTFD2021 trugen, die Bezeichnung Escherichia coli JM109/pTDF2021; die originalen Formen wurden wie folgt, beim Fermentation Research Institute of the Agency for Science and Technology, Japan, hinterlegt: die Originalform von pTF2021 als FERM BP-1940 und die Originalform von pTF7021 als FERM BP-1941, beide jeweils am 3. Februar 1988.
Beim Kultivieren von JM109/pTF7021-Zellen und der Untersuchung des exprimierten Polypeptids mit Zellen-ausbreitender Aktivität wurde gefunden, daß dieses Peptid mindestens 30% des Peptids, ausgedrückt als Gesamtzellprotein, ausmachte.
(4) Klonierung und Expression des für die Asn¹³&sup8;&sup0;-Met¹&sup5;¹&sup7;
Sequenz von 138 FN-Aminosäuren codierenden DNA-Fragments Zuerst wurde ein 1,3 kb-Fragment von pTF301 durch Restriktionsabbau mittels EcoRI und SalI isoliert und durch Gelelektrophorese gereinigt. Getrennt davon wurde ein 2,15 kb-Fragment von pUC18 durch Restriktionsabbau mittels EcoRI und SalI isoliert und auf gleiche Weise gereinigt. Die beiden Arten von Fragmenten wurden unter Verwendung von T4-DNA- Ligase miteinander vereinigt und zur Transformation von Escherichia coli HB101 eingesetzt. Die erhaltenen Transformanten wurde kultiviert und ihre Expression durch Anwendung von Immunoblotting überprüft.

Beispiel 2

Reinigung des Peptids mit der Zellausbreitungsdomäne Das durch Verbinden eines Expressionsvektors mit der für die Sequenz Pro¹²³&sup9;-Met¹&sup5;¹&sup7; von FN (eine Sequenz von 279 Aminosäuren) codierenden DNA erhaltene Plasmid pTF7021 wurde in Escherichia coli JM109 eingeführt und ergab so Escherichia coli JM109/pTF7021. Diese Zellen wurden über Nacht unter Schütteln bei 37ºC in 5 ml L-Broth mit 50 ug/ml Ampicillin in einem Teströhrchen kultiviert. Dieses wurde verwendet, um einen 2 Liter-Erlenmeyerkolben mit 500 ml des gleichen Mediums zu beimpfen, und die Kultivierung wurde bei einer Schüttelfrequenz von 180 Upm fortgesetzt. Bei Erreichen einer Absorption von 0,3 bei 660 nm wurden 2 mM IPTG (Isopropyl-β-thiogalactosid) zugesetzt und die Zellen 20 Stunden später geerntet. Ein Teil der isolierten Zellen wurde zum Immunoblotting eingesetzt. Das Gesamtzellprotein wurde durch SDS- PAGE isoliert und das Elektrophoresemuster wurde auf eine Nitrocellulosemembran übertragen. Dann wurde ein monoklonaler Antikörper (FN-10, Takara Shuzo Co., Ltd.) aufgebracht, welcher spezifisch die Zellen-ausbreitende Domäne von FN erkennt, und danach ein mit Peroxidase markierter Sekundärantikörper. Die Aktivität der an den Sekundärantikörper gebundenen Peroxidase führte zu einer Farbzunahme in Gegenwart von 4-Chlornaphthol und Wasserstoffperoxid, und man fand, daß die gewünschte Bande in der Gegend von 35 kDa vorhanden war Als nächstes wurde das Gesamtzellsediment in einer Lösung von 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, mit 5 mM EDTA und 5 mM Mercaptoethanol suspendiert und mit Ultraschall behandelt. Diese Suspension wurde zentrifugiert und der Überstand isoliert und gegen 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) dialysiert. Die innere Dialyseflüssigkeit wurde auf eine Sepharose 4B-Säule (8 ml) aufgebracht, an welche der monoklonale Antikörper FN- 10 gebunden war. Die Säule wurde mit Waschpuffer A (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, und 0,15 M KCl) und danach mit Waschpuffer B (20 mM Tris-HCl, pH 6,4 und 0,15 MKcl) gewaschen. Schließlich wurde der Elutionspuffer (50 mM Glycin-HCl, pH 2,3 und 0,2 M KCl) eingesetzt und Fraktionen wurden isoliert. Die gewünschten Fraktionen wurden durch Immunoblotting erhalten, entsalzt und lyophilisiert und man erhielt durch Elektrophorese ca. 5 mg nahezu reines Peptid. Als nächstes wurde dieses Peptid mit Aminopeptidase P (Enzyme Handbook 1983;Asakura Publishers, S. 534) behandelt und das N-terminale Methionin entfernt, wonach dann das Peptid erneut auf die gleiche, oben beschriebene Weise, gereinigt wurde. Die etwa zehn Aminosäurereste in der Aminosäuresequenz, beginnend vom N-Terminus, wurden untersucht und man fand, daß die Sequenz Pro- Thr-Asp-Leu-Arg-Phe-Thr-Asn-Ile-Gly vorlag, was mit der N- terminalen Sequenz des gewünschten Peptids übereinstimmte.
Die jeweils den Peptiden mit Sequenzen der Länge 258, 219, 206, 178 und 138 Aminosäuren entsprechenden Rekombinanten wurden ebenfalls auf die selbe Weise kultiviert und aufgereinigt; jedes Peptid wurde jeweils isoliert und die Struktur der N-terminalen Region bestimmt.

Beispiel 3

Bestimmung der Zellen-ausbreitenden Aktivität
Die Zellen-ausbreitende Aktivität aller in Beispiel 2 erhaltenen Peptide sowie von FN und den Peptiden der Länge von 283 und 108 Aminosäuren wurde nach der Methode von Ruoslahti et al., Methods in Enzymology 82, (1981), 803-831, bestimmt. Die Proben wurden schrittweise in physiologischer Kochsalzlösung und destilliertem Wasser verdünnt und 50 ul-Aliquote wurden in die Vertiefungen einer 96-Vertiefungs-Mikrotiterplatte injiziert und man ließ die Proben sich an die Vertiefungen anhaften. Dann wurde phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) zum Waschen der Platten verwendet, 100 ul 3% BSA wurden jeder Vertiefung zugesetzt und die Platte wurde eine Stunde bei 37ºC inkubiert. Die Platte wurde zweimal mit PBS gewaschen und dann wurden in einer Konzentration von 10&sup6; Zellen/ml in Eagle's Minimal Essential Medium (MEM) suspendierte normale Rattennieren-Zellen (NRK-49F) in einer Menge von 100 ul/Vertiefung zugegeben und die Platte wurde 2 bis 3 Stunden bei 37ºC inkubiert. Die verwendeten NRK-49F-Zellen wurden als lyophilisierter Stamm zur Lagerung erhalten und vor Verwendung zunächst vorinkubiert und mit Trypsin behandelt. Das Ausbreiten der Zellen wurde unter dem Mikroskop verfolgt und die minimale für eine Zellen-ausbreitende Aktivität nötige Dosis errechnet. Diese Ergebnisse sind in der Tabelle 1 aufgeführt.
Die Tabelle 1 zeigt auch die Menge des von den transformanten Rekombinanten exprimierten Peptids, bezogen auf die Menge Peptid mit der Sequenz von 283 Aminosäuren, welche als + angegeben ist. Tabelle 1 Polypeptid (Länge der Aminosäuresequenz) Minimale Dosis für Zellausbreitung ug/Vertiefung (pM/Vertiefung) Relative exprimierte Menge
Wie oben im Einzelnen ausgeführt, liefert die vorliegende Erfindung ein Peptid, das im wesentlichen die gleiche Zellen-ausbreitende Aktivität wie FN hat, und sie liefert ferner ein Verfahren zu seiner Herstellung durch Anwendung gentechnologischer Verfahren. Das oben erwähnte Polypeptid kann in pharmazeutischen Zubereitungen verwendet werden für Anwendungen, wie etwa die Förderung der Wundheilung, in Collyria (Augenwasser), für die Prävention von Krebsmetastasen, für die Implantierung künstlicher Organe im Körper und dergleichen. Es kann ferner auch in Kosmetika, Zahncreme und dergleichen verwendet werden.

Claims

1. Polypeptid mit Zellen-ausbreitender Aktivität, das eine Aminosäuresequenz der folgenden allgemeinen Formel hat:

worin X eine Sequenz der folgenden Formel (II) ist:

oder diese Sequenz (II), bei der eine gewisse Aminosäure oder ein Peptid oder gewisse Aminosäuren oder Peptide vom N-Terminus deletiert sind und Y entweder Cystein oder die Deletion von Cystein bedeutet.

2. Polypeptid mit Zellen-ausbreitender Aktivität gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgende Aminosäuresequenz hat:

3. Rekombinantes Plasmid, das eine DNA enthält, die für ein Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 codiert.

4. Transformante, die ein rekombinantes Plasmid nach Anspruch 3 aufweist.

5. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Transformante nach Anspruch 4 kultiviert und ein Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 aus dem Kulturmedium gewinnt.