DE69022901T2 - Streptokinase-Proteine, entsprechende Gene, entsprechende Plasmide und Verfahren zu deren Herstellung. - Google Patents
Streptokinase-Proteine, entsprechende Gene, entsprechende Plasmide und Verfahren zu deren Herstellung.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues, chemisch synthetisiertes Gen, das eine Basensequenz umfaßt, die für die Aminosäureprimärsequenz von Streptokinase codiert, entsprechende Plasmidrekombinanten, entsprechende Transformanten und ein Verfahren zur Herstellung von Streptokinase durch Inkubation der Transformanten; die Erfindung betrifft ferner neue Streptokinaseproteinderivate mit einer modifizierten Aminosäureprimärsequenz, chemisch synthetisierte Gene, die eine Basensequenz umfassen, die für das Protein codiert, Plasmidrekombinanten, die das Gen enthalten, Transformanten, die mit den Rekombinaten transformiert sind, und ein Verfahren zur Herstellung der Streptokinaseproteinderivate durch Inkubation der Transformanten.
- Streptokinase ist ein Protein mit thrombolytischer Aktivität, das von hemolytischen Streptococcen produziert oder sekretiert wird und ein Molekulargewicht von ungefähr 47000 besitzt. Die Aminosäureprimärsequenz des Proteins wird durch die nachfolgende Formel (1) dargestellt. Die vollständige Basensequenz, die für das Protein codiert, wurde ebenfalls bestimmt, und zwar aus der DNA von Streptococcus equisimilis H46A (Gruppe C) (Malke et al., 1985, Gene 34 S. 357-362), der das Protein produziert. Rekombinante Vektoren, die für Streptokinase codieren, sind im Stand der Technik bekannt; die EP-A-151337 offenbart eine DNA-Sequenz, die für natürliche Streptokinase in einem rekombinanten Vektor codiert.
- Streptokinase wird in den USA und in Europa bereits als thrombolytisches Mittel für klinische Zwecke verwendet, ist weit verbreitet zur Behandlung von Patienten mit Lungenthrombus und akutem Myocardinfarkt und hat sich als äußerst wirksam erwiesen.
- Wenn man Streptokinase jedoch durch Inkubation der ursprünglichen Bakterien herstellt, enthält die resultierende Kultur einige extrazelluläre Sekretionen, von denen viele für Menschen toxisch oder wahrscheinlich toxisch sind, so daß die Herstellung von Streptokinase aus der Kultur für klinische Zwecke viele Reinigungsschritte erfordert, die mit äußerster Sorgfalt durchgeführt werden müssen. Es wurde ferner berichtet, daß Streptokinase, die durch Inkubation der ursprünglichen Bakterien erhalten wurde, wegen ihrer Antigenität verschiedenartige Schocksymptome verursacht. Es bestand daher ein Bedürfnis, Techniken zur Verringerung der Antigenität zu entwickeln oder neue Streptokinasederivate mit verminderter Antigenität bereitzustellen. Für klinische Zwecke ist es außerdem erwünscht, die Streptokinase in ihrer Stabilität in Blut und in ihrer spezifischen thrombolytischen Aktivität zu verbessern.
- Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur einfachen und hochreinen Herstellung einer großen Menge Streptokinase mit Hilfe von Techniken der Genrekombination, eines chemisch synthetisierten Streptokinasegens mit Nukleotidcodons, die eine leichte Durchführung des Verfahrens in E. coli erlauben, von entsprechenden Plasmidrekombinanten (Expressionsvektor für Streptokinase), die das Gen eingebaut haben, von Wirtszellen, die mit den Rekombinanten transformiert sind (Transformanten), und von Inkubationsverfahren für die Zellen.
- Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung neuer Streptokinaseproteinderivate mit für Streptokinase arteigenen Aktivitäten, insbesondere thrombolytischer Aktivität, die eine verminderte Bindungsaktivität gegenüber Streptokinase-spezifischen Antikörpern aufweisen und eine verminderte Bildung dieser spezifischen Antikörper zur Folge haben (Antigenität), wenn die Proteine verabreicht werden.
- Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung von Proteinderivaten mit verbesserter Stabilität in Blut und verbesserter thrombolytischer Spezifität.
- Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung der neuen Streptokinaseproteinderivate mit Hilfe von Techniken der Genrekombination, die es ermöglichen, die Proteine auf einfache Weise und mit hoher Reinheit in großen Mengen herzustellen, in der Bereitstellung von chemisch synthetisierten Genen mit Nukleotidcodons, die eine leichte Durchführung des Verfahrens in E. coli erlauben, von entsprechenden Plasmidrekombinanten (Expressionsvektoren), die das Gen eingebaut haben, von Wirtszellen, die mit den Rekombinanten transformiert sind (Transformanten), und von Verfahren zur Herstellung der Proteine durch Inkubation der Zellen.
- Die vorliegende Erfindung stellt ein chemisch synthetisiertes Gen mit der in Anspruch 1 wiedergegebenen Basensequenz bereit, das für Streptokinase natürlicher Art (im folgenden: Naturtyp-Streptokinase) mit einer Aminosäureprimärsequenz codiert, die durch die folgende Formel (1) wiedergegeben wird, entsprechende Plasmidrekombinanten, die das Gen eingebaut haben (Expressionsvektoren für die Naturtyp-Streptokinase), entsprechende Transformanten, die mit den Rekombinanten durch Transformation erhalten wurden, und ein Verfahren zur Herstellung von Naturtyp-Streptokinase durch Inkubation der Transformanten. Formel (1) :
- Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Streptokinaseproteinderivat mit einer modifizierten Aminosäureprimärsequenz bereit, die der durch die Formel (1) wiedergegebenen Aminosäuresequenz von Naturtyp-Streptokinase entspricht, wobei die Aminosäurereste von Position 373 bis zum C-Terminus fehlen und in der gegebenenfalls wenigstens ein Aminosäurerest fehlen, ersetzt oder inseriert sein kann.
- Die Symbole, wie sie in der Formel (1) und im folgenden zur Darstellung von Aminosäuresequenzen und Aminosäureresten sowie von Basensequenzen, Nukleinsäurebasen etc. verwendet werden, entsprechen der IUPAC-IUB-Nomenklatur und der üblichen Praxis, wie nachfolgend erläutert.
- Ala: Alanin
- Arg: Arginin
- Asn: Asparagin
- Asp: Asparaginsäure
- Cys: Cystein
- Gln: Glutamin
- Glu: Glutaminsäure
- Gly: Glycin
- His: Histidin
- Ile: Isoleucin
- Leu: Leucin
- Lys: Lysin
- Met: Methionin
- Phe: Phenylalanin
- Pro: Prolin
- Ser: Serin
- Thr: Threonin
- Try: Tryptophan
- Tyr: Tyrosin
- Val: Valin
- A: Adenin
- T: Thymin
- G: Guanin
- C: Cytosin
- Die Positionen der Aminosäurereste in den Aminosäuresequenzen werden alle entsprechend der Aminosäuresequenz der Formel (1) angegeben, selbst wenn ein oder mehrere Aminosäuren fehlen oder inseriert sind.
- Nachfolgend sind bevorzugte Beispiele von erfindungsgemäßen Streptokinaseproteinderivaten mit modifizierter Aminosäureprimärsequenz angegeben.
- (1) Polypeptid mit der Aminosäuresequenz [dargestellt durch die Formel (1)] von Naturtyp-Streptokinase, worin die Aminosäurereste von Position 373 bis zum C-Terminus fehlen.
- (2) Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von Naturtyp-Streptokinase, worin die Aminosäurereste von Position 373 bis zum C- Terminus fehlen und außerdem wenigstens die Aminosäuresequenz von Arg an Position 45 bis Gly an Position 68 fehlt.
- (3) Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von Naturtyp-Streptokinase, worin die Aminosäurereste von Position 373 bis zum C- Terminus fehlen und außerdem wenigstens Phe an Position 118 fehlt oder durch eine andere Aminosäure ersetzt ist.
- (4) Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von Naturtyp-Streptokinase, worin die Aminosäurereste von Position 373 bis zum C- Terminus fehlen und außerdem wenigstens Lys an Position 256 und Lys an Position 257 fehlen oder durch andere Aminosäurereste ersetzt sind.
- (5) Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von Naturtyp-Streptokinase, worin die Aminosäurereste von Position 373 bis zum C- Terminus fehlen und außerdem ein weiterer Aminosäurerest wenigstens jeweils an der Position neben Lys an Position 256 und Lys an Position 257 inseriert ist.
- Der weitere Aminosäurerest, der in den obigen modifizierten Aminosäuresequenzen substituiert oder inseriert sein kann, kann irgendeiner der Aminosäurereste sein, aus denen das Streptokinaseprotein aufgebaut ist, und wird bevorzugt aus den α-Aminosäuren ausgewählt, die die Proteine des menschlichen Körpers bilden. Beispiele für solche Aminosäuren sind Pro, Gln, Thr, Ser, His und dergleichen. Beispiele für bevorzugte Aminosäurereste für eine Substitution an Position 256 sind insbesondere Gln, Thr, His und dergleichen. Beispiele für Substitutionen an Position 257 sind Pro, Gln, Ser und His. Beispiele für Insertionen an den Positionen 256 und 257 umfassen Pro.
- Die vorliegende Erfindung stellt außerdem chemisch synthetisierte Gene bereit, die Basensequenzen umfassen, die für die Streptokinaseproteinderivate mit den modifizierten Aminosäuresequenzen codieren, entsprechende Plasmidrekombinanten, die die Gene inseriert haben (Streptokinaseproteinderivat-Expressionsvektoren), mit den Rekombinanten transformierte Wirtszellen und Verfahren zur Herstellung der Streptokinaseproteinderivate durch Inkubation der Transformanten.
- Nachfolgend findet sich eine ausführliche Beschreibung der erfindungsgemäßen Streptokinaseproteinderivate, der Verfahren zu ihrer Herstellung und des Verfahrens zur Herstellung erfindungsgemäßer Naturtyp-Streptokinase, sowie der chemisch synthetisierten Gene, der Expressionsvektoren und der Transformanten, die in diesen Verfahren verwendet werden.
- Entsprechend der Aminosäureprimärsequenz der Formel (1) lassen sich für das chemisch synthetisierte Gen, das für die Aminosäureprimärsequenz von erfindungsgemäßer Naturtyp-Streptokinase codiert, verschiedene Basensequenzen festlegen. Hierfür sollten zweckmäßig die folgenden Standardmaßnahmen getroffen werden.
- 1) Auswahl von codontriplets, die in der Wirtszelle, z.B. in E. coli, häufig benutzt werden.
- 2) Vorgabe spezifischer Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme (im folgenen: Restriktionsstellen) in der festzulegenden Basensequenz und an ihren beiden Enden, um die wunschgemäße Ligation mit der Basensequenz eines anderen Gens oder dergleichen und die Insertion in den Plasmidvektor mit Hilfe dieser Stellen zu erleichtern.
- 3) Vermeidung oder Minimierung von anderen als den gewünschten Ligationen bei der Verknüpfung oder der Ligation chemisch synthetisierter Gene (DNA-Fragmente).
- 4) Eliminierung unerwünschter Sequenzen, wie beispielsweise von Terminatoren, aus der geplanten Basensequenz.
- 5) Bereitstellung einer Restriktionsstelle an einer geeigneten Position, um so die anschließende Modifikation des Gens zu erleichtern.
- Die nachfolgende Formel (2) stellt eine auf diese Weise bestimmte Basensequenz für ein chemisch synthetisiertes Gen für Naturtyp- Streptokinase dar. Die entsprechende Aminosäuresequenz ist ebenfalls wiedergegeben. Formel (2) :
- Die durch die Formel (2) wiedergegebene Basensequenz liegt in Form einer doppelsträngigen DNA-Sequenz vor, die für die Aminosäureprimärsequenz (Formel (1)) von Naturtyp-Streptokinase codiert und einzelsträngige DNA-Sequenzen umfaßt, die zueinander komplementär sind. Diese komplementären DNA-Sequenzen sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
- Im Hinblick auf die Verwendung von E. coli als Wirtszelle werden für den Aufbau der Basensequenz der Formel (2) bevorzugt Codons ausgewählt, die von E. coli häufig benutzt werden, wenn auch die Codons, die für das vorliegende Gen verwendet werden können, nicht auf solche Codons beschränkt sind. Außerdem sind die Wirtszellen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, wie später beschrieben nicht auf E. coli beschränkt. Dementsprechend können Codons, die in der Wirtszelle häufig benutzt werden, zur Verwendung in Kombination ausgewählt werden. Die Basensequenz der Formel (2) kann durch lokalen Austausch, lokale Deletion oder lokale Insertion einiger Nukleinsäurebasen verändert oder modifiziert werden. Solche Änderungen oder Modifikationen der Basensequenz umfassen die Verwendung genetischer Codons, die für dieselbe Aminosäureprimärsequenz codieren, wie sie durch die Basensequenz der Formel (2) codiert wird, und die Bereitstellung verschiedener Restriktionsstellen, um eine Ligation mit Regulatoren, beispielsweise Promotoren, zu bewerkstelligen, die benötigt werden, wenn die resultierende Basensequenz tatsächlich in einen zur Expression in einem Mikroorganismus geeigneten Vektor inseriert wird. Bei der Konstruktion des gewünschten Expressionsvektors mittels gentechnischer Methoden unter Verwendung des erfindungsgemäßen Gens ist es erforderlich, verschiedene Regulatoren, beispielsweise Promotoren, Shine-Dalgarno Sequenz (SD-Sequenz) und ähnliche Ribosombindungsstellen, Initiationscodons und Terminationscodon für die Proteinsynthese etc., in passender Weise anzuhängen. Da die Ligation und Spaltung von Basensequenzen mit Restriktionsenzymen erfolgt, müssen an den Enden stromaufwärts und stromabwärts geeignete Restriktionsstellen vorgesehen werden. Die nachfolgende Formel (3) stellt ein Beispiel für ein Gen dar, an das derartige geeignete Restriktionsstellen angehängt sind. Das Gen umfaßt die Basensequenz der Formel (2) und an seinen Enden stromaufwärts und stromabwärts spezifische Restriktionsstellen zum Anhängen von Promotoren und ähnlichen Regulatoren, die zur Expression des gewünschten Proteins, das durch die Basensequenz codiert wird, erforderlich sind. Dies Gen ist für die nachfolgende Konstruktion des Expressionsvektors von Vorteil. Die Restriktionsstellen in der Basensequenz der Formel (3) sind in der Formel (4) gezeigt. Selbstverständlich zeigt Formel (4) nur Beispiele für Restriktionsstellen; die Restriktionsstellen, die in dem erfindungsgemäßen Gen vorhanden sein sollen, können zweckmäßig je nach Art des zu konstruierenden Expressionsvektors modifiziert oder gewählt werden. Formel (3) : Formel (4) :
- Das chemisch synthetisierte Gen, das für das erfindungsgemäße Streptokinaseproteinderivat mit einer modifizierten Aminosäureprimärsequenz codiert, kann auf der Grundlage des Gens, das für Naturtyp-Streptokinase codiert, konstruiert werden, indem man eine DNA-Sequenz (Codons) verwendet, die für Aminosäurereste codiert, die der Modifikation der Aminosäureprimärsequenz entsprechen. Ein bestimmter Abschnitt der DNA-Sequenz kann durch verschiedene, auf diesem Gebiet bekannte Methoden modifiziert werden. Das Modifikationsverfahren umfaßt das Spalten oder Entfernen einer bestimmten Region mittels Restriktionsenzymen oder den Ersatz einer bestimmten Region durch ein chemisch synthetisiertes Oligonukleotid mit einem modifizierten Abschnitt, das getrennt hergestellt wird.
- Vorzugsweise wird das chemisch synthetisierte Gen der vorliegenden Erfindung hergestellt, indem man mehrere Oligonukleotid-Fragmente, die der geplanten Basensequenz entsprechen, chemisch synthetisiert und diese Fragmente ligiert. Die Oligonukleotid-Fragmente können nach üblichen Methoden mit handelsüblichen DNA-Synthesegeräten oder dergleichen auf einfache Weise chemisch synthetisiert werden. Diese Methoden umfassen beispielsweise das Festphasen-Phosphittriester- Verfahren und das Festphasen-Phosphoramidit-Verfahren (S.L. Beaucage and M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters, 22, 1859 (1981)). Die synthetisierten Oligonukleotid- Fragmente können nach üblichen Verfahren, beispielsweise durch Hochleistungsflüssigchromatographie, isoliert und gereinigt werden. Die gereinigten Basensequenzen können beispielsweise mit der Maxam- Gilbert-Methode [AM. Maxam and W. Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 74, 560 (1977); A.M. Maxam and W. Gilbert, Methods in Enzymol., 65, 499, Acad. Press (1980)] überprüft werden.
- Das gewünschte erfindungsgemäße Gen kann zusammengesetzt werden, indem man die resultierenden Oligonukleotide an den Hydroxygruppen ihrer 5'-Enden mit T4-Polynukleotidkinase phosphoryliert, anschließend reassoziieren läßt und die Oligonukleotide mit T4-DNA- Ligase zu Blöcken ligiert, die Blöcke entsprechend miteinander zu mehreren Untereinheiten ligiert und dann die Untereinheiten miteinander ligiert. Diese Untereinheiten und das gewünschte Gen können zur Aufbewahrung oder zur Amplifikation in geeignete Vektoren, z.B. pBR322, eingebaut werden. Zur Verwendung in den sich anschließenden Verfahren werden die Untereinheiten oder das Gen zweckmäßig aus dem Vektor isoliert. Das obige Verfahren zur Herstellung der Gene wird in den späteren Beispielen im einzelnen beschrieben.
- Der Plasmidvektor kann nach üblichen gentechnischen Verfahren oder Methoden hergestellt werden. Diese umfassen das Spalten von DNA mit Restriktionsenzymen, S1-Nuklease und dergleichen, Ligation von DNA- Fragmenten mit T4-DNA-Ligase oder dergleichen, Isolieren und Reinigen der DNA durch Agarose-Gelelektrophorese, Polyacrylamid- Gelelektrophorese oder dergleichen, Sammeln und Reinigen der DNA durch Phenolextraktion etc. Die Wirtszellen können durch Alkali- SDS-Extraktion [H.O. Birnboim and J. Doly, Nucleic Acids Res., , 1513 (1979)] auf die Anwesenheit des Plasmidvektors getestet werden, d.h., durch Behandeln der daraus erhaltenen Plasmid-DNA mit Restriktionsenzymen und Überprüfen der DNA auf Anwesenheit entsprechender Restriktionsstellen, oder durch Überprüfen der Länge der erzeugten DNA-Fragmente. Die Anwesenheit des Vektors kann auch getestet werden, indem man die Basensequenz des Gens direkt nach der Dideoxy-DNA-Sequenzierungsmethode [F. Sanger et al., Prog. Natl. Acad. Sci., U.S.A 74 5463 (1977)] oder einer ähnlichen Methode bestimmt.
- Geeignet als Vektoren für die Konstruktion der Plasmidrekombinanten, die das erfindungsgemäße Gel eingebaut haben, sind pBR322 und verschiedene davon abgeleitete Plasmidvektoren. Die geeigneten Vektoren beschränken sich jedoch nicht auf diese Vektoren sondern umfassen verschiedenartige bekannte Vektoren, beispielsweise Bakteriophagen, Virusvektoren einschließlich Tier- und Pflanzenviren, Plasmide, Cosmide und dergleichen.
- Damit die durch Einschleusen des Vektors erhaltenen Transformanten die gewünschte Streptokinase oder eines ihrer Proteinderivate exprimiert, benötigt der Vektor zusätzlich zu dem erfindungsgemäßen Gen verschiedene Regulatoren, beispielsweise einen Promotor, einen Terminator, ein Signal für das Anhängen eines Poly(A) -Schwanzes (in den Fällen, in denen es sich bei den Wirtszellen um eukaryotische Zellen handelt) und dergleichen zur Transkription, und Ribosomenbindungsstellen und dergleichen zur Translation. Für unterschiedliche Wirtszellen sind verschiedene Promotoren bekannt. Beispiele für Promotoren in E. coli sind der trp-Promotor, der lac-Promotor, der tac-Promotor, der λPL-Promotor, der lpp-Promotor und dergleichen, Promotoren in Bacillus subtilis sind der SP01-Promotor, der SP02-Promotor, der pen-Promotor und dergleichen, Promotoren in Hefe und anderen eukaryotischen Zellen sind der PH05-Promotor, der PGK-Promotor, von SV40 abgeleitete Promotoren und dergleichen. Der gewünschte erfindungsgemäße Vektor läßt sich erhalten, indem man als Vektor ein Plasmid auswählt, das bereits derartige Regulatoren enthält, oder indem man solche Regulatoren nach üblichen Verfahren aus einem Plasmid isoliert oder chemisch synthetisiert und die Regulatoren dann in einen geeigneten Vektor einbaut.
- Der zur Expression von Streptokinase oder ihren Proteinderivaten erhaltene Vektor (Rekombinante) enthält das erfindungsgemäße Gen, einen Promotor und eine Ribosomenbindungsstelle, die an das stromaufwärtige Ende des Gens gebunden sind, und einen Terminator, der an das stromabwärtige Ende gebunden ist, d.h. Information zur Expression des Streptokinaseproteins (Naturtyp oder Derivat). Der Vektor wird in geeignete Wirtszellen eingeschleust, wodurch die Zellen dazu gebracht werden, das gewünschte Streptokinaseprotein oder eines seiner Derivate zu exprimieren (produzieren oder akkumulieren).
- Insbesondere in den Fällen, in denen E. coli als Wirtszelle verwendet wird, umfaßt der Expressionsvektor ein System zur Expression des gewünschten Proteins direkt in der Zelle und ein System zur Sekretion des exprimierten Proteins in das Periplasma. Für das Sekretions-Expressions-System ist es erforderlich, einen Vektor zu konstruieren, der das erfindungsgemäße chemisch synthetisierte Gen und ein Gen enthält, das für ein Signalpeptid codiert und an das stromaufwärtige Ende des Gens gebunden ist. Der Expressions-Vektor für die Sekretion wird im folgenden genauer beschrieben.
- Der Ausdruck "Signalpeptid" bezeichnet eine Aminosäuresequenz mit mehr als zehn bis zu mehreren zehn hydrophoben Aminosäureresten, die sich an den Aminoenden verschiedener sekretorischer Proteine befinden. Das Signalpeptid hat die Wirkung, daß das Protein aus dem Cytoplasma transportiert wird, und das Signalpeptid wird durch eine Signalpeptidase vom sekretorischen Protein abgespalten. Die Verwendung solcher Signalpeptide in der Gentechnik und die daraus resultierenden Vorteile sind bekannt, wie beispielsweise ausführlich in der ungeprüften japanischen Patentanmeldung SHO 61-149089 beschrieben wird.
- Die erfindungsgemäß eingesetzten Signalpeptide können mit den in dieser Veröffentlichung beschriebenen Peptiden identisch oder davon verschieden sein. Beispiele für geeignete Signalpeptide sind β- Lactamase aus E. coli (bla), alkalische Phosphatase (pho S), die Proteine der äußeren Membran (Omp A, Omp F, Lpp) aus E. coli und dergleichen.
- Die für ein solches Signalpeptid codierende Basensequenz kann chemisch synthetisiert werden, oder es kann eine natürliche Sequenz verwendet werden. Das in den späteren Beispielen erwähnte pKTN ist ein Beispiel für einen Vektor, der eine solche Basensequenz enthält.
- pKTN ist ein Vektor, der eine Basensequenz enthält, die für das bla-Signalpeptid aus E. coli codiert, genauer gesagt ein Vektor, dessen genetische Information, angeordnet in gleicher Richtung, den tac-Promotor, eine SD-Sequenz und eine Basensequenz umfaßt, die für das bla-Signalpeptid codiert. E. coli-Stamm JM103 mit pKTN wurde unter der Bezeichnung "Escherichia coli, JM-103, pKTN-2-2" und der Hinterlegungsnummer FERM BP-1398 am Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, MITI, hinterlegt.
- Ein bevorzugtes Beispiel für ein Sekretions-Expressions-System ist das Plasmid pSKXT, das - wie in einem späteren Beispiel beschrieben wird - unter Verwendung von pKTN konstruiert wurde. Der Sekretions- Expressions-Vektor pSKXT besitzt eine Basensequenz, die die für das bla-Signalpeptid codierende Basensequenz und ein erstes Codon umfaßt, das für den ersten Aminosäurerest der Streptokinase codiert und unmittelbar an das stromabwärtige Ende dieser Basensequenz angehängt ist, d.h. eine Basensequenz, die fur ein Fusionsprotein aus dem Signalpeptid und der Streptokinase codiert. Mit diesem Vektor ist eine Verschiebung des Leserahmens unwahrscheinlich, weshalb die E. coli-Zelle das Fusionsprotein unter Einfluß des tac- Promotors so exprimieren kann, daß nur das gewünschte Protein durch die innere Membran transportiert, in das Periplasma sekretiert und dort akkumuliert wird.
- Der E. coli-Stamm JM109 mit dem Plasmid pSKXT wurde unter der Bezeichnung "Escherichia coli, JM-109, pSKT" und der Hinterlegungsnummer FERM BP-2464 am Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, MITI, hinterlegt.
- Der auf diese Weise erhaltene gewünschte Expressionsvektor wird in geeignete Wirtszellen eingeschleust (Transformation), wodurch die Zellen die Fähigkeit erlangen, Streptokinase oder eines ihrer Proteinderivate zu produzieren. Die Auswahl an brauchbaren Wirtszellen unterliegt keinen besonderen Beschränkungen, sondern es kann sich dabei um irgendeine der üblichen Wirtszellen handeln, beispielsweise um E. coli-Zellen und ähnliche Gram-negative Bakterien, um Bacillus subtilis und ähnliche Gram-positive Bakterien, um Actinomyceten und Hefe, und um Tier- oder Pflanzenzellen. Unter ihnen wird E. coli bevorzugt, besonders die Stämme HB101 [H. W. Boyer and D. Roulland-Dussoix., J. Mol. Biol., 41 459 (1969)] und JM109 [J. Messing et al., Nucleic Acids Res., , 309 (1981)], die sich vom Stamm K12 ableiten.
- Der erfindungsgemäße Vektor kann mittels üblicher Transformationsmethoden in die Wirtszelle eingeschleust werden, beispielsweise durch Behandeln der Wirtszellen in einer wäßrigen Calciumchlorid- Lösung bei niedriger Temperatur und Zugabe des Vektors zu der Lösung (E. Lederberg and S. Cohen, J. Bacteriol., 119, 1072 (1974)].
- Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch die auf diese Weise transformierten Wirtszellen (Transformanten, die den Vektor zur Expression der erfindungsgemäßen Naturtyp-Streptokinase oder des erfindungsgemäßen Streptokinaseproteinderivats eingeschleust haben).
- Die Transformanten können mit üblichen Medien inkubiert werden, einschließlich beispielsweise L-Broth-Medium, E-Medium, M9-Medium etc. Diese Medien können unter Zusatz von verschiedenen, allgemein bekannten Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganischen Salzen, Vitaminen, Naturextrakten, physiologisch aktiven Substanzen und dergleichen verwendet werden.
- Die Inkubation kann nach verschiedenen Methoden und unter Bedingungen erfolgen, wie sie hinsichtlich pH, Temperatur, Belüftung, Rühren etc. für das Wachstum der Wirtszellen zweckmäßig sind. Beispielsweise ist es wünschenswert, E. coli bei einem pH zwischen ungefähr 5 und ungefähr 8, besonders bevorzugt bei pH 7, und bei einer Temperatur zwischen ungefähr 20 und ungefähr 43ºC unter Belüftung und Rühren zu inkubieren. Der Inkubationsmaßstab unterliegt keinen besonderen Beschränkungen. Die Zusammensetzung des Mediums und die Inkubationsbedingungen können in geeigneter Weise verändert werden, um größere Mengen des exprimierten Proteins herzustellen oder um die Sekretion des gewünschten Proteins zu fördern oder zu hemmen.
- Wenn beispielsweise E. coli, der mit einem Vektor zur Sekretion und Expression der erfindungsgemäßen Streptokinase oder eines ihrer Proteinderivate transformiert ist, auf diese Weise inkubiert wird, wird das gewünschte Protein ins Periplasma sekretiert und dort akkumuliert, und das Protein kann nach üblichen Methoden abgetrennt, gesammelt und gereinigt werden. Zu diesem Zweck kann das durch osmotischen Schock hergestellte Periplasma beispielsweise einer Gelfiltration, Adsorptionschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Hochleistungsflüssigchromatographie oder ähnlichen Verfahren unterworfen werden. Solche Methoden können auch in einer geeigneten Kombination eingesetzt werden. Das in das Periplasma sekretierte oder im Kulturüberstand erhaltene Protein ist insofern vorteilhaft, als es sich leicht abtrennen und nach den obigen Verfahren reinigen läßt.
- Auf diese Weise lassen sich Streptokinase und ihre Proteinderivate erfindungsgemäß durch gentechnische Methoden herstellen. Das erhaltene Protein kann leicht identifiziert werden, da es sich bei einer Hochleistungsflüssigchromatographie als ein Einzelpeak oder bei einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese als eine Einzelbande zeigt. Die gewünschte Streptokinase oder ihre Proteinderivate können, wenn sie höher aufgereinigt sind, nach denselben Methoden identifiziert werden, wie sie gewöhnlich zur Strukturanalyse von Polypeptiden oder Proteinen verwendet werden, beispielsweise durch Bestimmung des Molekulargewichts durch SDS-PAGE, Messung des isoelektrischen Punkts durch isoelektrische Fokussierung, Bestimmung der Aminosäurezusammensetzung mit einem Aminosäureanalysator, Bestimmung der Aminosäuresequenz mit einem Proteinsequenzierautomaten etc.
- Vorteilhafter läßt sich das erfindungsgemäße Streptokinaseproteinderivat mit einer modifizierten Aminosäureprimärsequenz herstellen, indem man nach der zuvor beschriebenen Methode einen Expressionsvektor für Naturtyp-Streptokinase herstellt, den Vektor zur Entfernung einer bestimmten Region mit einem geeigneten Restriktionsenzym spaltet, das Gen mit einem chemisch synthetisierten Oligonukleotid- Fragment, das die gewünschte Basensequenz besitzt, repariert, das Gen zur Konstruktion des gewünschten Expressionsvektors für das Proteinderivat entsprechend wieder in einen geeigneten Vektor einbaut, den Vektor in Wirtszellen einschleust und die Zellen inkubiert. Mit dieser Methode kann der Aminosäurerest an einer gewünschten Position der Naturtyp-Streptokinase der Formel (I) entfernt oder ersetzt werden, oder ein vorgesehener Aminosäurerest kann durch Verfahren, wie sie bereits beschrieben wurden oder in den folgenden Beispielen beschrieben werden, an einer gewünschten Position inseriert werden.
- Auf diese Weise lassen sich durch gentechnische Methoden große Mengen von Naturtyp-Streptokinase und ihren Proteinderivaten einfach und mit hoher Reinheit herstellen. Das erfindungsgemäß erhaltene Streptokinaseproteinderivat besitzt im Vergleich zu Naturtyp-Streptokinase insbesondere eine niedrigere Antigenität, ist stabiler in Blut und besitzt eine höhere Selektivität und Spezifität in seiner thrombolytischen Aktivität (Thrombus-Selektivität). Das Protein läßt sich daher vorteilhaft für medizinische Zwecke verwenden, für die auch Naturtyp-Streptokinase Anwendung findet.
- Die folgenden Beispiele 1 bis 4, in denen Naturtyp-Streptokinase hergestellt wurde, und die Beispiele 5 bis 12, in denen erfindungsgemäße Streptokinaseproteinderivate hergestellt wurden, sollen dem besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung dienen.
- In den Beispielen wird auf die folgenden Abbildungen Bezug genommen:
- Fig. 1 ist ein Schema, das das Vorgehen in Beispiel 1 zur Konstruktion der Blöcke 1 bis 8 aus synthetischen Oligonukleotiden und zur Konstruktion der Untereinheiten SKA, SKB, SKC und SKD des Streptokinasegens aus diesen Blöcken zeigt;
- Fig. 2 ist ein Schema, daß das Vorgehen in Beispiel 1 zur Herstellung der Plasmide pSKA, pSKB, pSKC und pSKD mit den jeweiligen Untereinheiten und zur Herstellung des Streptokinase-Klonierungsvektors pSKX aus diesen Plasmiden über die Plasmidvektoren pSKAB und pSKABX zeigt;
- Fig. 3 ist ein Schema, das das Verfahren zur Herstellung eines Sekretions-Expressionsvektors pSKXT für Streptokinase aus Vektor pSKX und Plasmid pKTN2-2 in Beispiel 2 zeigt;
- Fig. 4 ist ein Schema, das das Verfahren zur Herstellung eines Expressionsvektors für das Streptokinaseproteinderivat (1-372) in Beispiel 5 zeigt;
- Fig. 5 ist ein Schema, das das Verfahren zur Herstellung eines Vektors zur Expression des Streptokinaseproteinderivats (1-372, 118 verlustig) in Beispiel 6 zeigt;
- Fig. 6 ist ein Schema, das das Verfahren zur Herstellung eines Vektors zur Expression des Streptokinaseproteinderivats (1-372, 45-68 verlustig) in Beispiel 7 zeigt;
- Fig. 7 ist ein Schema, das das Verfahren zur Herstellung eines Vektors zur Expression des Streptokinaseproteinderivats (1-372, 256Gln, 257Gln ersetzt) in Beispiel 8 zeigt;
- Fig. 8 ist ein Schema, das das Verfahren zur Herstellung eines Vektors zur Expression des Streptokinaseproteinderivats (1-372, 118 verlustig, 256Gln, 257Gln ersetzt) in Beispiel 9 zeigt;
- Fig. 9 ist ein Schema, das das Verfahren zur Herstellung eines Vektors zur Expression des Streptokinaseproteinderivats (1-372, 45-68 verlustig, 256Gln, 257Gln ersetzt) in Beispiel 10 zeigt;
- Fig. 10 ist ein Schema, das das Verfahren zur Herstellung eines Vektors zur Expression des Streptokinaseproteinderivats (1-372, 45-68 verlustig, 118 verlustig, 256Gln, 257Gln ersetzt) in Beispiel 11 zeigt; und
- Fig. 11 ist ein Schema, das das Verfahren zur Herstellung eines Vektors zur Expression des Streptokinaseproteinderivats (1-372, 256, 257 Lys-Pro-Lys-Pro verändert) in Beispiel 12 zeigt.
- Soweit nicht anders angegeben, kamen in den Beispielen die folgenden Methoden und Verfahren zur Anwendung:
- Die eingesetzten Restriktionsenzyme waren Erzeugnisse der Takara Shuzo Co., Ltd., der Toyobo Co., Ltd. und der Nippon Gene Co., Ltd. Die Reaktionsmischungen entsprachen in ihrer Zusammensetzung den Angaben des jeweiligen Herstellers. Zur Reaktion ließ man jede Mischung in einem Wasserbad bei 37ºC 3 Stunden lang stehen. Als Standard wurde das Restriktionsenzym in einer Menge von einer Einheit (U) pro Mikrogramm DNA derart eingesetzt, daß die Menge der schließlich erhaltenen Reaktionsmischung 100 µl betrug. Als Reaktionsgefäß wurde ein steriles 1,5 ml-Eppendorfröhrchen verwendet.
- Diese Extraktionsmethode wurde nach Ende der enzymatischen Reaktion durchgeführt, um das Enzym zu inaktivieren und die Reaktion zu stoppen. Zu der Reaktionsmischung wurde in halber Menge der Reaktionsmischung TE-gesättigtes Phenol (Phenol gesättigt mit 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) enthaltend 1 mM EDTA) gegeben, und anschließend wurde durch Schütteln vollständig gemischt und dann abzentrifugiert (12000 U/min, 5 Minuten), wobei eine wäßrige Phase erhalten wurde, die die DNA enthielt. Zu der wäßrigen Phase wurde eine gleiche Menge Ether gegeben und dann wurde die Mischung entsprechend gemischt und zentrifugiert, um eine wäßrige Phase zu erhalten. Dieses Verfahren wurde zwei- bis dreimal wiederholt. Zu der resultierenden wäßrigen Phase wurden die 0,1-fache Menge 3 M Natriumacetatpuffer (pH 5,0) und die 2,5-fache Menge kaltes Ethanol gegeben. Die Mischung wurde durch Schütteln gemischt und dann wenigstens 30 Minuten lang bei -80ºC stehen gelassen und anschließend zentrifugiert (12000 U/min, 5 Minuten), wobei die DNA als Sediment anfiel.
- Die DNA wurde in einer wäßrigen Lösung mit 67 mM Tris-HCl (pH 7,6), 6,7 mM Magnesiumchlorid, 10 mM Dithiothreitol und 1 mM ATP gelöst, und zu der Lösung wurde T4-DNA-Ligase (Takara Shuzo Co., Ltd.) in einer Menge von 1 Einheit pro Mikrogramm DNA gegeben. Zur Ligation der DNA-Fragmente ließ man die Mischung wenigstens 5 Stunden lang bei 12ºC oder über Nacht bei 4ºC reagieren. Die schließlich erhaltene Menge an Reaktionsmischung betrug 100 µl. Nach der Reaktion wurde die DNA durch Phenolextraktion gesammelt.
- Als Wirtszellen wurden die E. coli-Stämme HB-101 oder JM-109 verwendet.
- Die Stämme wurden unter Schütteln in L-Broth-Medium (1% Bacto- Trypton, 0,5% Bacto-Hefeextrakt und 0,5% Natriumchlorid) bei 37ºC bis zu einer Extinktion von 0,25 bei 600 nm inkubiert. Die Zellen wurden aus der Kultur abzentrifugiert (10 ml; 7000 U/min, 5 Minuten) und dann in Eis gekühlt. Die Zellen wurden in 5 ml 0,1 M Magnesiumchlorid suspendiert und gewaschen und dann abzentrifugiert (7000 U/min, 1 Minute) und gesammelt. Die Zellen wurden in 5 ml einer eiskalten Mischung aus 0,1 M Calciumchlorid und 0,05 M Magnesiumchlorid suspendiert und die Suspension wurde dann wenigstens 30 Minuten in Eis stehen gelassen und anschließend abzentrifugiert (7000 U/min, 1 Minute). Die gesammelten Zellen wurden in 0,5 ml der gleichen Lösung resuspendiert. Zu 0,2 ml der Suspension wurden 20 µl der Reaktionsmischung mit der mit T4-DNA- Ligase ligierten DNA gegeben und die Mischung wurde 30 Minuten in Eis gekühlt. Anschließend wurde die Mischung in einem Wasserbad 30 Sekunden lang auf 42,5ºC erhitzt. Nach Zugabe von 1,0 ml L-Broth- Medium ließ man die Mischung in einem Wasserbad bei 37ºC eine Stunde lang stehen.
- Die erhaltenen Transformanten wurden mit Hilfe einer Antibiotikaresistenz zur Identifizierung nach folgendem Verfahren selektioniert, d.h., indem man 0,2 ml-Portionen der Reaktionsmischung auf einem Plattenmedium, hergestellt durch Zugabe von 50 µg/ml Ampicillin zu L-Broth-Medium, das 1,5% Agar enthielt, verteilte und die Mischung über Nacht bei 37ºC stehen ließ. Die aktiven Kolonien wurden isoliert.
- Die Stämme mit Plasmiden wurden unter Schütteln 12 bis 16 Stunden in 400 ml L-Broth-Medium mit 50 µg/ml Ampicillin bei 37ºC inkubiert. Die Kultur wurde abzentrifugiert (6000 U/min, 10 Minuten), die Zellen wurden gesammelt und in 14 ml Lösung I (50 mM Glucose, 10 mM EDTA, 25 mM Tris-HCl (pH 8,0) und, nach Sterilisieren, 2 mg/ml Lysozym) suspendiert. Die Suspension wurde 30 Minuten in Eis stehen gelassen. Nach Zugabe von 28 ml Lösung II (0,2N Natriumhydroxid und 1% Natriumdodecylsulfat) wurde die Suspension geschüttelt und 5 Minuten in Eis stehen gelassen. Anschließend wurden der Suspension 21 ml Lösung III (3 M Natriumacetat (pH 4,8), steril) zugegeben und die Mischung wurde wenigstens 60 Minuten in Eis stehen gelassen und anschließend abzentrifugiert (8000 U/min, 10 Minuten). Das erhaltene Sediment wurde in 11 ml Lösung IV (0,1 M Natriumacetat und 0,05 M Tris-HCl (pH 8,0)) gelöst, zu der resultierenden Lösung wurde die 2,5-fache Menge kaltes Ethanol gegeben und die Mischung wurde 30 Minuten lang bei -80ºC stehen gelassen. Die Mischung wurde wiederum abzentrifugiert (12000 U/min, 15 Minuten) und das Sediment gesammelt.
- Das Sediment wurde in 4 ml TE-Puffer (eine Lösung von 10 mM Tris- HCl (pH 7,5) und 1 mM EDTA) gelöst, in der Lösung wurden unter Rühren 4,62 g Cäsiumchlorid gelöst und es wurden 0,42 ml Ethidiumbromid-Lösung (5 mg/ml) zugegeben. Die gemeinsame Lösung wurde zentrifugiert (3000 U/min, 10 Minuten), um das suspendierte Material zu entfernen, und die resultierende Lösung wurde einer Ultrazentrifugation (50000 U/min, 15 Stunden) unterworfen. Das resultierende Produkt wurde mit UV-Licht bestrahlt und der fluoreszierende Teil mit der Plasmid-DNA wurde gesammelt. Diese Menge wurde zur Entfernung von Ethidiumbromid fünf- bis sechsmal mit Isopropanol extrahiert, das mit 5 M Natriumchlorid-Lösung gesättigt war. Schließlich wurde die Menge zur Entfernung von Cäsiumchlorid, RNA und dergleichen einer Säulenchromatographie (Säulengröße: 2,5 cm x 15-20 cm, Elutionsmittel: TE-Puffer + 0,5 M Natriumchlorid-Lösung, Nachweis bei UV 254 nm) an Biogel A-50 (Bio Rad Laboratories) unterworfen. Die Plasmid-DNA wurde durch Phenolextraktion gesammelt.
- Die Menge an gereinigter Plasmid-DNA wurde durch OD&sub2;&sub6;&sub0; nm-Messung bestimmt, wobei eine OD&sub2;&sub6;&sub0;=0,022 als 1 µg/ml DNA berechnet wurde.
- Die DNA wurde chemisch mit einem DNA-Synthesegerät vom Modelltyp 381A, Applied Biochemicals, synthetisiert (Festphasen-β-Cyanoethylphosphoramidit-Verfahren unter Verwendung von 0,2 µM-Säulen). Die Verfahrensweise entsprach der Anleitung des Herstellers. Das mit dem Synthesegerät erhaltene Oligonukleotid trägt an seinem 3'- Ende das Trägerharz der Säule, an seinen aktiven Gruppen Schutzgruppen und an seinem 5'-Ende eine Dimethoxytritylgruppe, so daß das Harz und diese Gruppen abgespalten werden müssen. Das Verfahren zur Abspaltung entsprach ebenfalls der Anleitung.
- Als nächstes wurde zur Fraktionierung und zur Reinigung des gewünschten Oligonukleotids von Nebenprodukten, freien Schutzgruppen und Abspaltungsreagenzien für die Schutzgruppen eine HPLC durchgeführt, bis man einen Einzelpeak erhielt. Als Säule wurde eine YMCA-PACK AM-303 ODS-Säule (4,6 x 250 mm, Typ Waters, Yamamura Chemical Laboratories) eingesetzt. Die Gradientenelution erfolgte mit wäßrigen Lösungen (pH 7,2) mit 5% bis 40% Acetonitril/0,1 M Triethylammoniumacetat als Elutionsmittel. Das benutzte System besaß eine CCPM-Pumpe, einen UV-8000-Detektor für UV- und sichtbaren Bereich und ein CCP-Steuergerät, jeweils Produkte der Tosoh Corporation.
- Agarosegele wurden in Konzentrationen von 0,9% oder 1,6% verwendet. Zur Herstellung der Agarosegele wurde Agarose I (Dojin Chemical Lab.) ausgewogen und dann wurde die Agarose in der gewünschten Konzentration unter Erhitzen in TBE-Puffer (enthaltend 0,089 M Tris-Borsäure und 0,02 M EDTA) gelöst. Die Elektrophorese erfolgte mit einem Minigel-Elektrophoresesystem Mupid-2 (Cosmo-Bio Co., Ltd.) und mit TBE-Puffer als Elektrophoresepuffer. Das resultierende Gel wurde in eine Lösung mit 0,5µg/ml Ethidiumbromid getaucht und zum Nachweis von fluoreszierenden DNA-Fragmenten unter UV- Licht betrachtet. Die DNA wurde aus dem Gel eluiert, indem man die gewünschten Bandenabschnitte mit einem Messer ausschnitt, die Abschnitte in Dialyseschläuche gab (Ausschluß MW 3500), die Schläuche mit TE-Puffer füllte und die Abschnitte mit demselben System wie oben 30 Minuten lang einer Elektrophorese unterwarf. Die erhaltene DNA wurde zur Trockne konzentriert, man gab eine geringe Menge destilliertes Wasser zu, und dann wurde die Mischung mit Phenol extrahiert und die DNA gesammelt.
- Die Basensequenzen von Streptokinase und ihren Proteinderivaten wurden nach der M13-Dideoxy-Methode bestimmt [J. Messing, Methods in Enzymology, , 20 (1983)], wobei ein M13-Sequenzierungskit [mit (α-32P) dCTP, Amersham International Ltd.] der Toyobo Co., Ltd. entsprechend den Angaben des Herstellers verwendet wurde. Als Sequenzierungsgel wurde ein FUJI GENSOR GEL SHEET (SO802, Konzentration 8%) der Fuji Photo Film Co., Ltd. verwendet.
- Im folgenden wird eine genaue Beschreibung der Konstruktion des Plasmids pSKX gegeben, das durch Klonierung ein chemisch synthetisiertes Gen für Naturtyp-Streptokinase eingebaut enthält.
- Zur Konstruktion der gesamten Basensequenz, die durch die Formel (3) wiedergegeben wird und die das Streptokinasegen umfaßt, wurde die Basensequenz zunächst in 52 Oligonukleotid-Fragmente mit 43 bis 56 Basen aufgeteilt (A-1 bis A-14, B-1 bis B-12, C-1 bis C-12 und D1 bis D14), die in den nachfolgenden Tabellen 1 bis 4 aufgelistet sind, und die einzelnen Fragmente wurden chemisch nach dem Festphasen-β-Cyanoethylphosphoramidit-Verfahren synthetisiert. Tabelle 1 Fragment Nummer Basensequenz Tabelle 2 Fragment Nummer Basensequenz Tabelle 3 Fragment Nummer Basensequenz Tabelle 4 Fragment Nummer Basensequenz
- Die Gesamtsequenz der Formel (3) wurde aufgeteilt in die Untereinheiten SKA, SKB, SKC und SKD hergestellt.
- Die Untereinheit SKA umfaßt, wie in der folgenden Formel (5) gezeigt, eine Basensequenz, die mit einer Restriktionsstelle für EcoRI beginnt, Restriktionsstellen für ApaI und NheI enthält und mit einer Restriktionsstelle für SalI endet. Die Untereinheit SKB umfaßt, wie in der folgenden Formel (6) gezeigt, eine Basensequenz, die mit einer Restriktionsstelle für EcoRI beginnt, Restriktionsstellen für NheI und SacI enthält und mit einer Restriktionsstelle für SalI endet. Die Untereinheit SKC umfaßt, wie in der folgenden Formel (7) gezeigt, eine Basensequenz, die mit einer Restriktionsstelle für EcoRI beginnt, Restriktionsstellen für ScaI und AatII enthält und mit einer Restriktionsstelle für SalI endet. Die Untereinheit SKD umfaßt, wie in der folgenden Formel (8) gezeigt, eine Basensequenz, die mit einer Restriktionsstelle für EcoRI beginnt, eine Restriktionsstelle für AatII enthält und mit einer Restriktionsstelle für SalI endet. [ Untereinheit SKA ] [ Untereinheit SKB ] [ Untereinheit SKC ] [ Untereinheit SKD ]
- Die Untereinheiten wurden, wie schematisch in Fig. 1 dargestellt, aufgeteilt in die Blöcke 1 bis 8 hergestellt, die wie nachfolgend beschrieben zusammengesetzt wurden. In Fig. 1 bedeutet der fette Punkt an einem Ende der Linie, die ein chemisch synthetisiertes Oligonukleotid darstellt, eine Phosphorylierung am 5'-Ende.
- Von den 52 chemisch synthetisierten Oligonukleotiden A-1 bis D-14 wurden die 44 von A-1, A-8, B-1, B-7, C-1, C-7, D-1 und D8 verschiedenen Oligonukleotide zur Phosphorylierung des 5'-Endes wie folgt behandelt. Es wurden 20 µl einer Lösung von 1 bis 3 µg/ml eines jeden Oligonukleotids hergestellt, der Lösung wurden 5 Einheiten T4-DNA-Polynukleotidkinase (Takara Shuzo Co., Ltd.), 5 µl Reaktionspuffer, wie vom Hersteller angegeben, und 1 µl 100 mM ATP zugegeben, und die Mischung wurde mit Wasser auf eine Menge von 50 µl gebracht. Dann wurde die Mischung 1 Stunde bei 37ºC reagieren gelassen.
- Als nächstes wurden zu den DNA-Lösungen (jeweils 2 µl) der Oligonukleotide, die als Ausgangsmaterialien für jeden der zusammenzusetzenden Blöcke dienten (z.B. die Oligonukleotide A-1, A-2, A-3, A-12, A-13 und A-14 im Fall von Block 1), 1 µl 100 mM ATP und 10 µl Ligase-Reaktionspuffer (eine Lösung von 660 mM Tris-HCl (pH 7,6), 66 mM Magnesiumchlorid und 100 mM Dithiothreitol) gegeben, und die Gesamtmenge der umzusetzenden Mischung wurde auf 100 µl gebracht. Die Mischung wurde in einem Wasserbad 2 Minuten auf 100ºC erhitzt und dann von selbst abkühlen gelassen. Anschließend wurde die Mischung unter Zugabe von 2,5 Einheiten T4- DNA-Ligase (Takara Shuzo Co., Ltd.) zur Ligation der Nukleotide bei 4ºC über Nacht reagieren gelassen.
- Das ligierte Reaktionsprodukt wurde mit Phenol extrahiert und anschließend einer Elektrophorese auf einem 10%-igen Polyacrylamidgel unterworfen. Ein doppelsträngiger Abschnitt mit der Größe des gewünschten Blocks wurde aus dem Gel entfernt und eluiert. Die Blöcke 1 bis 8 wurden entsprechend dem obigen Verfahren zusammengebaut.
- Die Untereinheit SKA mit den nach Verfahren 2) zusammengesetzten Blöcken 1 und 2, wurde nach dem folgenden Verfahren in Plasmid pBR322 eingebaut; man erhielt Vektor pSKA. Entsprechend wurden pSKB, pSKC und pSKD hergestellt.
- Fig. 2 zeigt das Verfahren schematisch. In dem Schema bedeutet Apr eine Ampicillinresistenz, Tcr eine Tetracyclinresistenz und ori einen Replikationsstartpunkt. Die Restriktionsstellen werden, wie auch in den weiteren Schemas, durch die folgenden Symbole dargestellt:
- A ... AatII
- Ap .. ApaI
- B ... BamHI
- E ... EcoRI
- EV .. EcoRV
- N ... NheI
- Na .. NaeI
- P ... PstI
- S ... SalI
- Sc .. SacI
- Zuerst wurde pBR322 mit den Restriktionsenzymen EcoRI und SalI behandelt und dann einer Elektrophorese auf einem 0,9%-igen Agarosegel unterworfen; man erhielt ein DNA-Fragment mit ungefähr 3,7 kb. Das DNA-Fragment wurde mit den oben hergestellten Blöcken 1 und 2, T4-DNA-Ligase, ATP und Ligase-Reaktionspuffer gemischt und dann wurde die DNA über Nacht bei 4ºC ligiert. E. coli HB-101 wurde nach der Calcium-Methode mit der Reaktionsmischung transformiert. Die DNA aus den erhaltenen Kolonien wurde nach der vereinfachten Kochmethode gewonnen und anschließend zur Selektion auf Kolonien, die das gewünschte pSKA enthielten, gescreent. Dann wurden eine Alkali-SDS-Extraktion, eine CsCl-Gleichgewichtsdichtegradienten- Ultrazentrifugation und eine Biogel A-50-Säulenchromatographie durchgeführt, um gereinigte DNA anzureichern, und mit Hilfe von Restriktionsenzymen (EcoRI, BglII, ApaI, NcoI, SalI XhoII, HinfI, etc.) wurde eine Restriktionskarte erstellt.
- Das Ergebnis bestätigte, daß die selektionierten Kolonien das gewünschte pSKA enthielten.
- Weiterhin wurde der SKA-Anfang von pSKA mit der M13-Dideoxy-DNA- Sequenzierungsmethode auf seine Basensequenz getestet. Genauer wurde ein EcoRI-SalI-Fragment in M13mp18 oder mp19 subcloniert, um die Basensequenz zu bestimmen. Als Ergebnis wurde die gewünschte Sequenz identifiziert.
- E. coli HB-101 wurde entsprechend dem obigen Verfahren 3) -1 mit der die Blöcke 3 und 4 umfassenden Untereinheit SKB transformiert; anschließend wurden die Kolonien gescreent und die Plasmid-DNA wurde gesammelt und gereinigt; man erhielt pSKB, das entsprechend identifiziert wurde.
- Ähnlich wurde E. coli HB101 mit der die Blöcke 5 und 6 umfassenden Untereinheit SKC transformiert; anschließend wurden die Kolonien gescreent und die Plasmid-DNA wurde gesammelt und gereinigt; man erhielt pSKC, das entsprechend identifiziert wurde. Ähnlich wurde E. coli HB101 mit der die Blöcke 7 und 8 umfassenden Untereinheit SKD transformiert; anschließend wurden die Kolonien gescreent und die Plasmid-DNA wurde gesammelt und gereinigt.
- Dieses Plasmid ist ein intermediärer Vektor zur Konstruktion des gewünschten pSKX. Das Verfahren zur Herstellung des Vektors, das in Fig. 2 schematisch dargestellt ist, ist wie folgt:
- Das nach dem Verfahren 3) erhaltene pSKA wurde mit den Restriktionsenzymen PstI und NheI behandelt und einer Agarose-Gelelektrophorese unterworfen; es wurde ein 1072 bp-DNA-Fragment isoliert und gereinigt.
- Ähnlich wurde das nach dem Verfahren 3) erhaltene pSKB mit denselben Restriktionsenzymen wie oben behandelt; es wurde ein 3250 bp-DNA-Fragment isoliert und gereinigt.
- Die beiden DNA-Fragmente wurden mit T4-DNA-Ligase ligiert, und E. coli HB-101 wurde mit der resultierenden Reaktionsmischung transformiert, um Kolonien mit dem gewünschten pSKAB zu erhalten. Aus den Kolonien wurde die Plasmid-DNA gewonnen und gereinigt. Die Struktur von pSKAB mit 4323 bp wurde durch Restriktionskartierung bestätigt.
- Die Konstruktion des Sekretions-Expressionsvektors für Streptokinase erfordert einen Plasmidvektor mit einer Basensequenz, in der das Met-Codon vor der ersten Aminosäure von Streptokinase fehlte. Dementsprechend wurde pSKABX hergestellt, indem der N-Terminus von pSKAB gemäβ dem folgenden Verfahren verändert wurde.
- Fig. 2 zeigt das Verfahren schematisch.
- pSKAB wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und ApaI behandelt und mit den chemisch neu synthetisierten Oligonukleotiden E-1 und E-2 in Gegenwart von T4-DNA-Ligase ligiert. E. coli wurde mit der Reaktionsmischung transformiert, aus den resultierenden Kolonien wurde die Vektor-DNA gewonnen und gereinigt, und es wurde eine Restriktionskarte erstellt; man erhielt das gewünschte pSKABX.
- Nachfolgend sind die Basensequenzen der Oligonukleotide E-1 und E- 2 sowie die Basensequenz des mit diesen Nukleotiden für die Konstruktion des Sekretions-Expressionsvektors erhaltenen Linkers wiedergegeben. Linker Basenanzahl Basensequenz
- Linker für die Konstruktion des Sekretions-Expressionsvektors.
- Der so erhaltene Plasmidvektor kann zur Konstruktion eines Systems zur Sekretion und Expression von Streptokinase benutzt werden. Mittels der M13-Dideoxy-DNA-Sequenzierungsmethode [J. Messing, Methods in Enzymology, , 20 (1983)] wurde gefunden, daß der einleitende Abschnitt von pSKABX aus E-1 und E-2 die obige Basensequenz besaß.
- Fig. 2 zeigt schematisch ein Verfahren zur Herstellung von pSKX.
- pSKABX wurde mit den Restriktionsenzymen SacI und PstI behandelt; es wurde ein 1352 bp-DNA-Fragment erhalten, das mit einem 309 bp- DNA-Fragment, erhalten durch Behandeln von pSKC mit den Restriktionsenzymen SacI und AatII, und einem 3305 bp-DNA-Fragment, erhalten durch Behandeln von pSKD mit den Restriktionsenzymen AatII und PstI, ligiert wurde. E. coli wurde mit der Reaktionsmischung transformiert, worauf sich dasselbe Verfahren wie oben anschloß, d.h. Gewinnen und Reinigen der Vektor-DNA und Restriktionskartierung.
- Das Verfahren ergab, daß das gewünschte pSKX (4966 bp) erhalten wurde.
- Es wurde ein Vektor konstruiert, um Streptokinase zu exprimieren und in das Periplasma von E. coli zu sekretieren. Das chemisch synthetisierte Streptokinasegen wurde so mit dem tac-Promotor und dem bla-Signalpeptid ligiert, daß der Leserahmen des Strukturgens für die Streptokinase gegenüber der codonfolge für die Aminosäuresequenz des bla-Signalpeptids nicht verschoben wurde; hierdurch wurde der gewünschte Sekretions-Expressionsvektor für Streptokinase konstruiert.
- Fig. 3 zeigt das Konstruktionsverfahren. Zur Angabe der Restriktionsstellen wurden dieselben Symbole wie oben verwendet. Spbla steht for das bla-Signalpeptid, SD für die Ribosomenbindungsstelle und Ptac für den tac-Promotor. Der tac-Promotor wird durch eine freie Fläche, das bla-Signalpeptid durch eine schraffierte Fläche und die Basensequenz, die für das Streptokinasegen codiert, durch eine durchgehend schwarze Fläche dargestellt.
- pSKX wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRV und SalI behandelt, wobei ein DNA-Fragment mit 1251 bp erhalten wurde. Entsprechend wurde pSKX mit den Restriktionsenzymen EcoRI und SalI behandelt, wobei ein DNA-Fragment mit 3711 bp erhalten wurde. pKTN2-2, das Abschnitte mit dem tac-Promotor und dem bla-Signalpeptid besitzt, wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und Naei behandelt, wobei ein DNA-Fragment mit 460 bp erhalten wurde (E. coli JM-103 mit pKTN2-2 wurde als FERM BP-1398 hinterlegt). Diese Fragmente wurden durch Agarose-Gel- oder Polyacrylamid-Gelelektrophorese gesammelt und miteinander ligiert. Dann wurde E. coli JM-109 mit der resultierenden Reaktionsmischung transformiert.
- Die Vektor-DNA wurde aus den erhaltenen Kolonien angereichert, gereinigt und dann mit Restriktionsenzymen kartiert; man erhielt den gewünschten Vektor pSKXT.
- E. coli JM-109 mit pSKXT produziert in der Zelle unter dem Einfluß des tac-Promotors das Fusionsprotein aus dem bla-Signalpeptid und der Streptokinase; das Fusionsprotein wird dann unter dem Einfluß des bla-Signalpeptids zur inneren Membran transportiert, wo das Signalpeptid durch eine Protease in der Membran abgespalten wird, und nur die Streptokinase wird in das Periplasma zwischen der inneren und der äußeren Membran sekretiert.
- E. coli JM-109 mit Vektor pSKXT, der in Beispiel 2 erhalten wurde, wurde auf folgende Weise unter Schütteln in flüssigem M9-Casamino acid-Medium mit der in der nachfolgenden Tabelle 5 angegebenen Zusammensetzung inkubiert: Tabelle 5 Zusatz Menge Dinatriumphosphat Kaliumdihydrogenphosphat Natriumchlorid Ammoniumchlorid 1 M Calciumchlorid* 1 M Magnesiumchlorid* Glucose* Casamino acid (Difco) L-Prolin Vitamin B&sub1; Wasser Menge für 1 Liter Medium
- Jeder mit einem Stern versehene Zusatz wurde separat durch Autoklavieren sterilisiert (15 Minuten bei 121ºC). Falls erforderlich wurde sterilfiltriertes Ampicillin auf eine Endkonzentration von 50µg/ml zugegeben.
- Die oben hergestellte Kultur (1 ml) wurde in einen Sakaguchi- Kolben mit 100 ml Medium gegeben und bei 37ºC auf einem Rüttler geschüttelt. Ungefähr 3 Stunden (OD&sub6;&sub0;&sub0;= ca. 0,3) nach Beginn der Inkubation wurde der Kultur IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactosid; Sigma) auf eine Endkonzentration von 0,25 mg/ml zugegeben und dann wurde weiterinkubiert.
- 2) Extraktion des gewünschten Produkts aus den Zellen Die unter den obigen Bedingungen durchgeführte Inkubation wurde ungefähr 4 Stunden nach der Zugabe von IPTG abgebrochen, und in den folgenden Stufen wurden Fraktionen erhalten:
- Zuerst wurde die Zellen aus der Kultur abzentrifugiert (5000 U/min, 10 Minuten) und vom Kulturüberstand abgetrennt. Der so erhaltene Überstand wird als "Mediumfraktion" bezeichnet.
- Die erhaltenen Zellen wurden in 30 mM Tris-HCl (pH 8,0)/20% Sucrosepuffer in einer der Kultur entsprechenden Menge suspendiert, der Suspension wurde wäßrige EDTA-Lösung bis zu einer Endkonzentration von 0,01 M zugegeben, und die Mischung wurde auf einem Umlaufschüttler bei 180 U/min und 24ºC 10 Minuten geschüttelt und dann abzentrifugiert (6000 U/min, 10 Minuten). Der resultierende Überstand wird als "Sucrosepufferfraktion" bezeichnet.
- Das bei der Zentrifugation erhaltene Sediment wurde in eiskaltem Wasser in einer der Kultur entsprechenden Menge resuspendiert, und die Suspension wurde unter gelegentlichem Schütteln 15 Minuten in Eis stehen gelassen und dann abzentrifugiert (10000 U/min, 5 Minuten). Der resultierende Überstand wird als "Periplasmafraktion" bezeichnet.
- Die Plasminogenaktivator-Aktivität der Streptokinase wurde durch Messung der Aktivität des Plasmins, das durch die Plasminogenaktivierung durch die Streptokinase produziert wurde, nach der Methode von Jackson et al. bestimmt [K.W. Jackson et al., Methods in Enzymology, , 387 (1981)].
- Die Plasminaktivität wurde, wie nachfolgend im einzelnen beschrieben, unter Verwendung eines synthetischen Substrats, d.h. S-2251 (D-Val-Leu-Lys-p-Nitroanilin, Erzeugnis der Kabi Vitrum), gemessen, nämlich durch Bestimmung des durch Plasmin freigesetzten p- Nitroanilins, ausgedrückt als Zunahme der Extinktion bei 405 nm.
- Die Probe wurde mit einer 0,025%-igen wäßrigen Lösung von Triton X- 100 verdünnt; eine 25 µl-Portion der Verdünnung und 25 µl 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) wurden in ein Reagenzglas gegeben, und die Mischung wurde 5 Minuten bei 37ºC inkubiert. Human-Plasminogen (Sigma) wurde mit 50mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) enthaltend 1 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) auf eine Konzentration von 80 µg/ml verdünnt. Das verdünnte Human-Plasminogen (25 µl) wurde in das Reagenzglas gegeben, und die Mischung wurde bei 37ºC inkubiert. Nach 15 Minuten wurden der Kultur 25 µl S-2251, verdünnt auf 2,5 mg/ml mit 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) enthaltend 1,6 M Natriumchlorid, zugegeben, und dann wurde 10 Minuten bei 37ºC inkubiert.
- Die Reaktion wurde dann durch Zugabe von 1,5 ml einer 0,2 M wäßrigen Essigsäurelösung gestoppt, und die Extinktion der Kultur wurde bei 405 nm gemessen.
- Die Aktivitätseinheiten der Probe wurden bezüglich einer Eichkurve für eine Eichsubstanz bestimmt, nämlich Streptokinase aus Streptococcus equisimilis H46A (Gruppe C) mit einer spezifischen Aktivität von 100 internationalen Einheiten/µg, wobei die Kurve für die Eichsubstanz in gleicher Weise wie oben erhalten wurde.
- Die Streptokinase in den nach dem obigen Verfahren 2) erhaltenen Zellen wurde, wie nachfolgend im einzelnen beschrieben, durch Western-Blotting [H. Towbin, T. Staehelin and J. Gordon, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 76, 4350 (1979)] unter Verwendung eines Streptokinase-spezifischen Antikörpers nachgewiesen.
- Ein Streptokinase-spezifisches Antiserum wurde hergestellt, indem man Kaninchen mit gereinigter Streptokinase aus Streptococcus equisimilis H46A (Gruppe C) als Antigen immunisierte, d.h., indem man 1 mg gefriergetrocknete Streptokinase in 0,5 ml physiologischer Kochsalzlösung löste, der Lösung zum Emulgieren der Streptokinase 0,5 ml komplettes Freundsches Adjuvans zugab, die Emulsion subcutan in den Rücken von drei Kaninchen verabreichte, die emulgierte Streptokinase zur insgesamt viermaligen Immunisierung der Kaninchen entsprechend und mit gleicher Dosis wiederum alle zwei Wochen verabreichte, 10 Tage nach der letzten Immunisierung das ganze Blut auffing und das Serum abtrennte. Das so erhaltene Antiserum wurde zum Nachweis der Streptokinase verwendet.
- Proben für eine Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (im folgenden als "SDS-PAGE" bezeichnet) wurden präpariert, indem man beispielsweise die aus 1 ml Kultur erhaltenen Zellen in 1 ml 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) enthaltend 2% SDS und 2% Dithiothreithol suspendierte, die Suspension 5 Minuten bei 100ºC erhitzte und die Suspension abzentrifugierte (12000 U/min, 10 Minuten), wobei man einen Überstand erhielt.
- Die SDS-PAGE wurde durchgeführt, indem man die auf diese Weise präparierte Probe bei 2 mA/cm einer Elektrophorese auf 15% Polyacrylamid mit 0,1% SDS nach Laemmli unterwarf (U.K. Laemmli, Nature, 227, 680 (1970)]. Die Streptokinase wurde nachgewiesen, indem man das Protein in dem resultierenden Gel elektrophoretisch auf einen Nitrocellulosefilm (Bio Rad) übertrug und die Streptokinase im Protein mit spezifischen Antikörpern spezifisch anfärbte.
- Zum Anfärben wurde der Nitrocellulosefilm mit dem übertragenen Protein bei Raumtemperatur 1 Stunde in einer 10%-igen Lösung von Rinderserumalbumin (BSA) in 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5, im folgenden kurz als "TBS" bezeichnet) enthaltend 0,15 M Natriumchlorid geschüttelt und dann bei Raumtemperatur 3 Stunden mit dem Streptokinase-Antiserum, das mit 0,1% BSA-TBS 1000-fach verdünnt war, zur Reaktion gebracht. Die resultierende Reaktionsmischung wurde viermal mit TBS gewaschen und 60 Minuten mit Peroxidasegebundenem Anti-Kaninchen-IgG (Erzeugnis von Cappel), das mit 0,1% BSA-TBS 2000-fach verdünnt war, behandelt. Die resultierende Mischung wurde wiederum gewaschen und dann zur Farbentwicklung mit 0,02 M Zitronensäurepuffer (pH 6,5) behandelt, der 0,03% Wasserstoffperoxid und 0,5 mg/ml 4-Chlor-1-naphthol enthielt.
- E. coli JM-109 mit dem Sekretions-Expressionsvektor pSKXT wurde nach den obigen Verfahren 1) und 2) inkubiert und in Fraktionen aufgeteilt und dann nach dem Verfahren 3) getestet, um die Menge an exprimierter Streptokinase zu bestimmen.
- Im Ergebnis wurde keine Aktivität in den überstehenden Mediumfraktionen nachgewiesen, aber 200 internationale Aktivitätseinheiten/ml wurden in der Zellfraktion, d.h. nahezu vollständig in der Periplasmafraktion, nachgewiesen. Bei der weiteren Analyse nach dem obigen Verfahren 4) zeigte sich die Immunaktivität an einer Molekulargewichtsposition von ungefähr 47000, was dem Naturtyp entsprach.
- Diese Ergebnisse zeigen, daß die erfindungsgemäß nachgewiesene Streptokinase der Naturtyp-Streptokinase entspricht, durch Translation in den Zellen produziert wurde, dann unter dem Einfluß des Signalpeptids durch die innere Membran geschleust wurde, zur Abspaltung des Signalpeptids weiterprozessiert und dann sekretiert wurde.
- 2,4 Liter einer nach Inkubation entsprechend Beispiel 3, 1) erhaltenen Kultur wurden abzentrifugiert (8000 U/min, 10 Minuten) und die Zellen wurden gesammelt und wie in Beispiel 3, 2) beschrieben zum Erhalt einer Periplasmafraktion einem osmotischenen Schock unterworfen.
- Aus dem Extrakt dieser Periplasmafraktion kann die Streptokinase durch eine Kombination von Trennungsmethoden wie Aussalzen mit Ammoniumsulfat, isoelektrischer Fokussierung, Gelfiltration, Ionenaustauschchromatographie und Hydrophobchromatographie gewonnen werden, wodurch sich ein einzelnes reines Produkt erhalten läßt. Beispielhaft wird im folgenden die Kombination von Hydrophobchromatographie und Anionenaustauschchromatographie beschrieben.
- Zu 600 ml der Periplasmafraktion wurde zunächst Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 0,6 M gegeben, und dann wurde die Mischung durch eine mit 0,6 M Ammoniumsulfat äquilibrierte Butyl Toyo-Perlsäule (Butyl Toyo pearl column; 3 x 20 cm, Tosoh Corporation) gegeben. Nach dem Waschen der Säule mit 500 ml 0,3 M Ammoniumsulfat wurde 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,5) durch die Säule gegeben, um die Fraktion mit Streptokinase-Aktivität zu eluieren. Diese Fraktion wurde dann gegen 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,5) dialysiert, und das Dialysat wurde durch ein HPLC-Fraktioniersystem (Modell HLC-837, Tosoh Corporation) mit einer DEAE-5PW-Säule (2,15 x 15 cm, Tosoh Corporation) bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 4 ml/min mit 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,5) als Elutionsmittel und einem linearen Konzentrationsgradienten von 0,1 M bis 0,3 M Natriumchlorid aufgetrennt. Die Eluatfraktion aus der Butyl Toyo- Perlsäule wurde nach der Dialyse in das HPLC-System eingespritzt und die Menge mit dem Hauptproteinpeak wurde gepoolt. Die Fraktion mit der Streptokinase-Aktivität wurde bei einem Peak eluiert, der dem Protein-Peak entsprach. Die gepoolte aktive Eluatfraktion wurde über eine Sephadex G-25-Säule (2,5 x 25 cm, Pharmacia) weiter entsalzt und dann unter den gleichen Bedingungen wie oben über eine DEAE-5PW-Säule aufgetrennt. Schließlich wurde die Fraktion mit der Streptokinase-Aktivitat uber dieselbe Sephadex G-25-Säule entsalzt und unter Erhalt eines reinen Endprodukts lyophilisiert.
- Eine Probe des nach Verfahren 2) erhaltenen gereinigten Produkts wurde durch SDS-PAGE sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit eines Reduktionsmittels analysiert.
- Im Ergebnis zeigte die Probe eine Einzelbande an einer Molekulargewichtsposition von 47300, entsprechend der Streptokinase aus Streptococcus equisimilis H46A (Gruppe C).
- Eine Probe des gereinigten Produkts wurde unter Zugabe von 6N Salzsäure 24 Stunden bei 110ºC hydrolysiert und unter Verwendung eines automatischen Aminosäureanalysators, Modell Hitachi 835, einer Aminosäureanalyse nach der Ninhydrin-Methode unterworfen.
- Das Ergebnis wird in der nachfolgenden Tabelle 6 gezeigt. Zum Vergleich zeigt Tabelle 6 auch das Ergebnis, das bei entsprechender Analyse der Streptokinase aus Streptococcus equisimilis H 46A (Gruppe G) erhalten wurde (in Tabelle 6 als "natürlich" bezeichnet). Tabelle 6 Aminosäure Natürlich Rekombinant Berechnet n.n: nicht nachgewiesen
- Die Sequenz der 20 Aminosäurereste am Aminoende einer Probe des gereinigten Produkts wurde nach der Methode von Heiwick et al. [R.M. Heiwick et al., J. Biol. Chem., , 7990 (1981)] bestimmt.
- Das Ergebnis zeigte, daß die Sequenz der 20 Aminosäurereste am Aminoende der Probe mit der Sequenz der (Naturtyp-)Streptokinase aus Streptococcus equisimilis H46A (Gruppe C) identisch war.
- Mit dem obigen Analyseverfahren war es möglich, die Aminosäure Trp, die bei der Aminosäureanalyse nach dem obigen Verfahren 3) -2 nicht nachgewiesen werden konnte, als sechsten Aminosäurerest des N- Terminus zu identifizieren.
- Die Menge der nach dem vorhergehenden Verfahren gewonnenen rekombinanten Streptokinase betrug gemäß der Aminosäureanalyse einer Probe des gereinigten Endprodukts 2,5 mg.
- Die spezifische Plasminogenaktivator-Aktivität betrug 101,5 internationale Einheiten/µg, vergleichbar mit der Aktivität von Naturtyp-Streptokinase (100 internationale Einheiten/µg).
- Diese Ergebnisse zeigten, daß die erhaltene Streptokinase mit der (Naturtyp-)Streptokinase aus Streptococcus equisimilis H46A (Gruppe C) identisch war.
- Ein Expressionsvektor für das Streptokinaseproteinderivat (1-372) wurde unter Verwendung des in Beispiel 2 erhaltenen Streptokinase- Expressionsvektors pSKXT nach dem folgenden Verfahren hergestellt. Fig. 4 zeigt das Verfahren schematisch.
- Zur Herstellung eines Streptokinaseproteinderivats, das einer Streptokinase entspricht, in der die Aminosäurereste am C-Terminus fehlen, wurden die folgenden chemisch neu synthetisierten Oligonukleotid(DNA)-Fragmente F-1 und F-2 eingesetzt.
- Diese DNA-Fragmente wurden nach dem bereits beschriebenen Verfahren hergestellt.
- Der Vektor zur Expression des Proteinderivats wurde hergestellt, indem man Fragmente mit Erkennungsstellen für AccI (an Position 367 der Streptokinase und an drei weiteren Positionen) und Erkennungsstellen für SalI (stromabwärts vom Streptokinase-Terminationscodon und an einer weiteren Position) aus pSKXT entfernte und die Fragmente F-1 und F-2 in das Plasmid inserierte.
- pSKXT wurde mit den Restriktionsenzymen PstI und MluI unter Bildung eines DNA-Fragments mit 1635 bp, mit den Restriktionsenzymen PstI und SalI unter Bildung eines DNA-Fragments mit 2962 bp und außerdem mit den Restriktionsenzymen AccI und MluI unter Bildung eines DNA- Fragments mit 677 bp behandelt. Diese Fragmente wurden durch Agarose-Gelelektrophorese gesammelt und mit den nach dem obigen Verfahren 1) erhaltenen chemisch synthetisierten DNA-Fragmenten ligiert. E. coli JM109 wurde mit der Reaktionsmischung transformiert, aus den resultierenden Kolonien wurde die Vektor-DNA gewonnen und gereinigt, und es wurde eine Restriktionskarte erstellt; man erhielt den gewünschten Vektor pSKXT (1-372).
- E. coli JM109 mit dem nach Verfahren 2) erhaltenen Vektor pSKXT (1- 372) wurde wie in Beispiel 3, 1) unter Schütteln mit flüssigem M9- Casamino acid-Medium mit der in Tabelle 5 angegebenen Zusammensetzung inkubiert.
- Ungefähr 4 Stunden nach Zugabe von IPTG wurde die Inkubation abgebrochen und die Kultur wurde wie in Beispiel 3, 2) in Zellen und einen Kulturüberstand aufgetrennt, und es wurde eine Sucrosepufferfraktion und eine Periplasmafraktion gewonnen.
- Die Fraktionen wurden wie in Beispiel 3, 3) und 4) auf Streptokinaseaktivität (Plasminogenaktivator-Aktivität) getestet und einem Western-Blotting unterzogen, und die Menge des exprimierten Proteins wurde bestimmt.
- Im Ergebnis wurde im Mediumüberstand keine Aktivität nachgewiesen, es wurde jedoch eine Expression von ungefähr 1000 internationalen Einheiten/ml in der Zellfraktion, d.h. nahezu vollständig in der Periplasmafraktion, nachgewiesen. Eine weitere Analyse durch Western-Blotting zeigte die Immunaktivität an der berechneten Molekulargewichtsposition von ungefähr 42300.
- Diese Ergebnisse zeigen, daß das Streptokinaseproteinderivat (1- 372) durch Translation in den Zellen produziert wurde, dann unter dem Einfluß des Signalpeptids durch die innere Membran geschleust wurde, zur Abspaltung des Signalpeptids weiterprozessiert und dann sekretiert wurde.
- 2,4 Liter Kultur wurden wie in Verfahren 3) abzentrifugiert (8000 U/min, 10 min), die Zellen wurden gesammelt und aus den Zellen wurde durch osmotischen Schock eine Periplasmafraktion extrahiert. Das Streptokinaseproteinderivat (1-372) wurde wie in Beispiel 4, 2) aus dem Extrakt gewonnen und gereinigt und schließlich lyophilisiert; man erhielt ein reines Produkt.
- Bei Analyse durch SDS-PAGE in Anwesenheit eines Reduktionsmittels zeigte das gereinigte Produkt eine Einzelbande an der erwarteten Molekulargewichtsposition von 42300.
- Das gereinigte Produkt wurde unter Zugabe von 6N Salzsäure 24 Stunden bei 110ºC hydrolysiert und unter Verwendung eines automatischen Aminosäureanalysators, Modell Hitachi 835, einer Aminosäureanalyse nach der Ninhydrin-Methode unterworfen. Das Ergebnis wird in Tabelle 7 gezeigt. Tabelle 7 Aminosäure Gereinigtes Produkt Berechnet n.n: nicht nachgewiesen
- Die Sequenz der 20 Aminosäurereste am Aminoende des gereinigten Produkts wurden nach der Methode von Heiwick et al. bestimmt, und die Sequenz der 5 Aminosäuren am Corboxyterminus wurde mit den Carboxypeptidasen A und B bestimmt. Im Ergebnis wurde das Produkt als das gewünschte Streptokinaseproteinderivat (1-372) identifiziert.
- Die Menge des nach dem obigen Verfahren erhaltenen rekombinanten Streptokinaseproteinderivats (1-372) betrug gemäß der Aminosäureanalyse einer Probe des gereinigten Produkts 9 mg.
- Die spezifische Plasminogenaktivator-Aktivität betrug 107 im Molverhältnis auf Basis der Aktivität von Naturtyp-Streptokinase, die als 100 angenommen wurde, und war mit der Aktivität von Naturtyp-Streptokinase vergleichbar.
- Ein Vektor zur Expression des Streptokinaseproteinderivats (1-372, 118 verlustig) wurde unter Verwendung des in Beispiel 5 erhaltenen Streptokinasederivat-Expressionsvektors pSKXT (1-372) nach dem folgenden Verfahren hergestellt.
- Fig. 5 zeigt das Verfahren schematisch. Der gewünschte Vektor wird in der Figur als "pSKXT (1-372, 118 def)" bezeichnet.
- Der gewünschte Expressionsvektor für das Proteinderivat wurde hergestellt, indem man die Sequenz von pSKXT (1-372) zwischen den Restriktionsstellen für NheI und HinfI durch die folgenden, chemisch neu synthetisierten Oligonukleotid(DNA)-Fragmente a-1 bis a-4 ersetzte.
- Diese DNA-Fragmente wurden wie bereits oben beschrieben einzeln chemisch synthetisiert. Für die spätere Analyse wurde eine Restriktionsstelle für BamHI vorgesehen, die in pSKXT (1-372) nicht existierte.
- pSKXT (1-372) wurde mit den Restriktionsenzymen PstI und NheI unter Bildung eines DNA-Fragments mit 1522 bp, mit den Restriktionsenzymen PstI und SacI unter Bildung eines DNA-Fragments mit 3488 bp, und mit den Restriktionsenzymen SacI und HinfI unter Bildung eines DNA-Fragments mit 212 bp behandelt. Diese DNA-Fragmente wurden durch Agarose-Gelelektrophorese gesammelt und mit den vier nach obigem Verfahren 1) chemisch synthetisierten DNA-Fragmenten ligiert (die Oligomere a-2 und a-4 wurden mit phosphorylierten 5'- Enden eingesetzt). E. coli JM109 wurde mit der Reaktionsmischung transformiert, aus den resultierenden Kolonien wurde die Vektor- DNA gewonnen und gereinigt, und es wurde eine Restriktionskarte erstellt; man erhielt den gewünschten Vektor pSKXT (1-372, 118 verlustig).
- E. coli JM109 mit dem nach Verfahren 2) erhaltenen Vektor (1-372, 118 verlustig) wurde, wie bereits oben beschrieben, unter Schütteln im selben flüssigen M9-Casamino acid-Medium wie oben inkubiert.
- Nach Zugabe von IPTG wurden die Zellen gesammelt und entsprechend auf Streptokinaseaktivität (Plasminogenaktivator-Aktivität) getestet. Im Ergebnis konnte keine Aktivität im Mediumüberstand nachgewiesen werden, es wurde jedoch eine Expression von ungefähr 250 internationalen Einheiten/ml in der Zellfraktion, d.h. nahezu vollständig in der Periplasmafraktion, nachgewiesen. Eine weitere Analyse durch Western-Blotting zeigte die Immunaktivität an der berechneten Molekulargewichtsposition von ungefähr 42200.
- 1,6 Liter Kultur wurden wie in Beispiel 5, 4) abzentrifugiert, die Zellen wurden gesammelt und aus den Zellen wurde durch osmotischen Schock eine Periplasmafraktion extrahiert. Das gewünschte Proteinderivat (1-372, 118 verlustig) wurde aus dem Extrakt gewonnen und gereinigt.
- Bei Analyse durch SDS-PAGE in Anwesenheit eines Reduktionsmittels zeigte das gereinigte Produkt eine Einzelbande an der erwarteten Molekulargewichtsposition von 42200.
- Das gereinigte Produkt wurde unter Zugabe von 6N Salzsäure 24 Stunden bei 110ºC hydrolysiert und unter Verwendung eines automatischen Aminosäureanalysators, Modell Hitachi 835, einer Aminosäureanalyse nach der Ninhydrin-Methode unterworfen. Das Ergebnis wird in Tabelle 8 gezeigt. Tabelle 8 Aminosäure Gereinigtes Produkt Berechnet n.n: nicht nachgewiesen
- Die Menge des nach dem obigen Verfahren erhaltenen rekombinanten Streptokinaseproteinderivats (1-372, 118 verlustig) betrug gemäß der Aminosäureanalyse einer Probe des gereinigten Produkts 2,4 mg.
- Die spezifische Plasminogenaktivator-Aktivität betrug 100 im Molverhältnis auf Basis der Aktivität von Naturtyp-Streptokinase, die als 100 angenommen wurde, und war der Aktivität von Naturtyp- Streptokinase äquivalent.
- Ein Vektor zur Expression des Streptokinaseproteinderivats (1-372, 45-68 verlustig) wurde unter Verwendung des in Beispiel 5 erhaltenen Streptokinasederivat-Expressionsvektors pSKXT (1-372) nach dem folgenden Verfahren hergestellt.
- Fig. 6 zeigt das Verfahren schematisch. Der gewünschte Vektor wird in der Figur als "pSKXT (1-372, 45-68 def)" bezeichnet.
- Der gewünschte Expressionsvektor für das Proteinderivat wurde hergestellt, indem man die Sequenz von pSKXT (1-372) in der Region zwischen den Restriktionsstellen für Nsp(7524)V und XhoI durch die folgenden, chemisch neu synthetisierten Oligonukleotid(DNA)- Fragmente b-1 und b-2 ersetzte.
- Diese Fragmente entsprechen einer Streptokinaseregion, in der die Positionen 45-68 fehlen, und wurden wie oben einzeln chemisch synthetisiert.
- pSKXT (1-372) wurde mit den Restriktionsenzymen PstI und Nsp(7524)V unter Bildung eines DNA-Fragments mit 1325 bp und mit den Restriktionsenzymen PstI und XhoI unter Bildung eines DNA-Fragments mit 3864 bp behandelt. Diese Fragmente wurden durch Agarose-Gelelektrophorese gesammelt und mit den zwei nach dem obigen Verfahren 1) chemisch synthetisierten DNA-Fragmenten ligiert. E. coli JM109 wurde mit der Reaktionsmischung transformiert, aus den resultierenden Kolonien wurde die Vektor-DNA gewonnen und gereinigt, und es wurde eine Restriktionskarte erstellt; man erhielt den gewünschten Vektor pSKXT (1-372, 45-68 verlustig).
- E. coli JM109 mit dem nach Verfahren 2) erhaltenen Vektor (1-372, 45-68 verlustig) wurde entsprechend unter Schütteln mit demselben flüssigen M9-Casamino acid-Medium inkubiert und die Zellen wurden gesammelt und auf Streptokinaseaktivität (Plasminogenaktivator- Aktivität) getestet. Als Ergebnis wurde eine Expression von ungefähr 1200 internationalen Einheiten/ml in der Zellfraktion nachgewiesen, die nahezu vollständig in der Periplasmafraktion gefunden wurde. Eine weitere Analyse durch Western-Blotting zeigte die Immunaktivität an der berechneten Molekulargewichtsposition von ungefähr 39600.
- 800 ml Kultur wurden wie in Beispiel 5, 4) abzentrifugiert, die Zellen wurden gesammelt und aus den Zellen wurde durch osmotischen Schock eine Periplasmafraktion extrahiert. Das gewünschte Proteinderivat (1-372, 45-68 verlustig) wurde aus dem Extrakt gewonnen, gereinigt und lyophilisiert; man erhielt ein reines Produkt.
- Tabelle 9 zeigt das Ergebnis, das bei der Aminosäureanalyse des gereinigten Produkts erhalten wurde. Tabelle 9 Aminosäure Gereinigtes Produkt Berechnet n.n: nicht nachgewiesen
- Die Menge des nach dem obigen Verfahren erhaltenen rekombinanten Streptokinaseproteinderivats (1-372, 45-68 verlustig) betrug gemäß der Aminosäureanalyse einer Probe des gereinigten Produkts 2 mg.
- Die spezifische Plasminogenaktivator-Aktivität betrug 112 im Molverhältnis auf Basis der Aktivität von Naturtyp-Streptokinase, die als 100 angenommen wurde, und war mit der Aktivität der Naturtyp-Streptokinase vergleichbar.
- Ein Vektor zur Expression des Streptokinaseproteinderivats (1-372, jede der Positionen 256 und 257 durch Gln ersetzt) wurde unter Verwendung des in Beispiel 5 erhaltenen Streptokinasederivat-Expressionsvektors pSKXT (1-372) nach dem folgenden Verfahren hergestellt.
- Fig. 7 zeigt das Verfahren schematisch. Der gewünschte Vektor wird in der Figur als "pSKXT (1-372, 256Gln, 257Gln sub)" bezeichnet.
- Der gewünschte Expressionsvektor für das Proteinderivat wurde hergestellt, indem man die Sequenz von pSKXT (1-372) in der Region zwischen den Restriktionsstellen HindIII und SnaBI durch die folgenden, chemisch neu synthetisierten und nachfolgend wiedergegebenen Oligonukleotid(DNA)-Fragmente c-1 bis c-4 ersetzte.
- Diese Fragmente umfassen eine Streptokinaseregion, in der jede der Positionen 256 und 257 durch Gln substituiert ist. Die vier Fragmente c-1 bis c-4 wurden wie oben einzeln chemisch synthetisiert. Für die spätere Analyse wurde in der Sequenz eine weitere Restriktionsstelle für EcoRV vorgesehen.
- pSKXT (1-372) wurde mit den Restriktionsenzymen HindIII und NcoI unter Bildung eines DNA-Fragments mit 608 bp und mit den Restriktionsenzymen NcoI und SnaBI unter Bildung eines DNA-Fragments mit 4612 bp behandelt. Diese DNA-Fragmente wurden durch Agarose- Gelelektrophorese gesammelt und mit den vier nach dem obigen Verfahren 1) chemisch synthetisierten DNA-Fragmenten ligiert (die Oligomere c-2 und c-4 wurden mit phosphorylierten 5'-Enden eingesetzt). E. coli JM109 wurde mit der Reaktionsmischung transformiert, aus den resultierenden Kolonien wurde die Vektor-DNA gewonnen und gereinigt, und es wurde eine Restriktionskarte erstellt; man erhielt den gewünschten Vektor.
- E. coli JM109 mit dem nach Verfahren 2) erhaltenen Vektor wurde unter Schütteln wie bereits zuvor beschrieben im gleichen flüssigen M9-Casamino acid-Medium wie oben inkubiert. Nach Zugabe von IPTG wurden die Zellen gesammelt und entsprechend auf Streptokinaseaktivität (Plasminogenaktivator-Aktivität) getestet. Im Ergebnis konnte keine Aktivität im Mediumüberstand nachgewiesen werden, es wurde jedoch eine Expression von ungefähr 70 internationalen Einheiten/ml in der Zellfraktion, d.h. nahezu vollständig in der Periplasmafraktion, nachgewiesen. Eine weitere Analyse durch Western-Blotting zeigte die Immunaktivität an der berechneten Molekulargewichtsposition von ungefähr 42300.
- 2,4 Liter Kultur wurden wie in Beispiel 5, 4) abzentrifugiert, die Zellen wurden gesammelt und aus den Zellen wurde durch osmotischen Schock eine Periplasmafraktion extrahiert. Das gewünschte Proteinderivat (1-372, 256Gln, 257Gln ersetzt) wurde aus dem Extrakt gewonnen, gereinigt und lyophilisiert; man erhielt ein reines Produkt.
- Bei Analyse durch SDS-PAGE in Anwesenheit eines Reduktionsmittels zeigte das gereinigte Produkt eine Einzelbande an der erwarteten Molekulargewichtsposition von 42300.
- Tabelle 10 zeigt das Ergebnis, das bei der Aminosäureanalyse des gereinigten Produkts erhalten wurde. Tabelle 10 Aminosäure Gereinigtes Produkt Berechnet n.n: nicht nachgewiesen
- Die Menge des nach dem obigen Verfahren erhaltenen rekombinanten Streptokinaseproteinderivats (1-372, 256Gln, 257Gln ersetzt) betrug gemäß der Aminosäureanalyse des gereinigten Produkts 4 mg.
- Die spezifische Plasminogenaktivator-Aktivität betrug 7 im Molverhältnis auf Basis der Aktivität von Naturtyp-Streptokinase, die als 100 angenömmen wurde.
- Ein Vektor zur Expression des Streptokinaseproteinderivats (1-372, 118 verlustig, 256Gln, 257Gln ersetzt) wurde unter Verwendung des in Beispiel 6 erhaltenen Streptokinasederivat-Expressionsvektores pSKXT (1-372, 118 verlustig) und des in Beispiel 8 erhaltenen Streptokinasederivat-ExpressionsvektorespSKXT (1-372, 256Gln, 257Gln ersetzt) nach dem folgenden Verfahren hergestellt.
- Fig. 8 zeigt das Verfahren schematisch. Der gewünschte Vektor wird in der Figur als "pSKXT (1-372, 118 def, 256Gln, 257Gln sub)" bezeichnet.
- pSKXT (1-372, 118 verlustig) wurde mit den Restriktionsenzymen BglII und HindIII behandelt, wobei ein DNA-Fragment mit 515 bp gebildet wurde. pSKXT (1-372, 256Gln, 257Gln ersetzt) wurde mit den Restriktionsenzymen PstI und BglII unter Bildung eines DNA- Fragments mit 1443 bp und mit den Restriktionsenzymen PstI und HindIII unter Bildung eines DNA-Fragments mit 3335 bp behandelt. Diese DNA-Fragmente wurden durch Agarose-Gelelektrophorese gesammelt und miteinander ligiert. E. coli JM109 wurde mit der Reaktionsmischung transformiert, aus den resultierenden Kolonien wurde die Vektor-DNA gewonnen und gereinigt, und es wurde eine Restriktionskarte erstellt; man erhielt den gewünschten Vektor pSKXT (1-372, 118 verlustig, 256Gln, 257Gln ersetzt).
- E. coli JM109 mit dem nach Verfahren 1) erhaltenen Vektor wurde unter Schütteln wie bereits zuvor beschrieben im gleichen flüssigen M9-Casamino acid-Medium wie oben inkubiert.
- Nach Zugabe von IPTG wurden die Zellen gesammelt und entsprechend auf Streptokinaseaktivität (Plasminogenaktivator-Aktivität) getestet. Im Ergebnis konnte keine Aktivität im Mediumüberstand nachgewiesen werden, es wurde jedoch eine Expression von ungefähr 160 internationalen Einheiten/ml in der Zellfraktion, d.h. nahezu vollständig in der Periplasmafraktion, nachgewiesen. Eine weitere Analyse durch Western-Blotting zeigte die Immunaktivität an der berechneten Molekulargewichtsposition von ungefähr 42200.
- 1,2 Liter Kultur wurden wie in Beispiel 5, 4) abzentrifugiert, die Zellen wurden gesammelt und aus den Zellen wurde durch osmotischen Schock eine Periplasmafraktion extrahiert. Das gewünschte Proteinderivat (1-372, 118 verlustig, 256Gln, 257Gln ersetzt) wurde aus dem Extrakt gewonnen und gereinigt.
- Bei Analyse durch SDS-PAGE in Anwesenheit eines Reduktionsmittels zeigte das gereinigte Produkt eine Einzelbande an der erwarteten Molekulargewichtsposition von 42200.
- Das gereinigte Produkt wurde unter Zugabe von 6N Salzsäure 24 Stunden bei 110ºC hydrolysiert und unter Verwendung eines automatischen Aminosäureanalysators, Modell Hitachi 835, einer Aminosäureanalyse nach der Ninhydrin-Methode unterworfen. Das Ergebnis wird in Tabelle 11 gezeigt. Tabelle 11 Aminosäure Gereinigtes Produkt Berechnet n.n: nicht nachgewiesen
- Die Menge des nach dem obigen Verfahren erhaltenen rekombinanten Streptokinaseproteinderivats (1-372, 118 verlustig, 256Gln, 257Gln ersetzt) betrug nach der Aminosäureanalyse des gereinigten Produkts 5,4 mg.
- Die spezifische Plasminogenaktivator-Aktivität betrug 9,98 im Molverhältnis auf Basis der Aktivität von Naturtyp-Streptokinase, die als 100 angenommen wurde.
- Ein Vektor zur Expression des Streptokinaseproteinderivats (1-372, 45-68 verlustig, 256Gln, 257Gln ersetzt) wurde unter Verwendung der in den Beispielen 7 bzw. 8 erhaltenen Streptokinasederivat-Expressionsvektoren pSKXT (1-372, 45-68 verlustig) und pSKXT (1-372, 256Gln, 257Gln ersetzt) nach dem folgenden Verfahren hergestellt.
- Fig. 9 zeigt das Verfahren schematisch. Der gewünschte Vektor wird in der Figur als "pSKXT (1-372, 45-68 def, 256Gln, 257Gln sub)" bezeichnet.
- pSKXT (1-372, 45-68 verlustig) wurde mit den Restriktionsenzymen PstI und MluI behandelt, wobei ein DNA-Fragment mit 1563 bp gebildet wurde. pSKXT (1-372, 256Gln, 257Gln ersetzt) wurde mit den Restriktionsenzymen PstI und MluI behandelt, wobei ein DNA- Fragment mit 3661 bp gebildet wurde. Diese DNA-Fragmente wurden durch Agarose-Gelelektrophorese gesammelt und miteinander ligiert. E. coli JM109 wurde mit der Reaktionsmischung transformiert, aus den resultierenden Kolonien wurde die Vektor-DNA gewonnen und gereinigt, und es wurde eine Restriktionskarte erstellt; man erhielt den gewünschten Vektor pSKXT (1-372, 45-68 verlustig, 256Gln, 257Gln ersetzt).
- E. coli JM109 mit dem nach Verfahren 1) erhaltenen Vektor wurde unter Schütteln wie bereits zuvor beschrieben im gleichen flüssigen M9-Casamino acid-Medium wie oben inkubiert.
- Nach Zugabe von IPTG wurden die Zellen gesammelt und entsprechend auf Streptokinaseaktivität (Plasminogenaktivator-Aktivität) getestet. Im Ergebnis konnte keine Aktivitat im Überstand des Mediums nachgewiesen werden, es wurde jedoch eine Expression von ungefähr 40 internationalen Einheiten/ml in der Zellfraktion, d.h. nahezu vollständig in der Periplasmafraktion, nachgewiesen. Eine weitere Analyse durch Western-Blotting zeigte die Immunaktivität an der berechneten Molekulargewichtsposition von ungefähr 39800.
- 0,8 Liter Kultur wurden wie in Beispiel 5, 4) abzentrifugiert, die Zellen wurden gesammelt und aus den Zellen wurde durch osmotischen Schock eine Periplasmafraktion extrahiert. Das gewünschte Proteinderivat (1-372, 45-68 verlustig, 256Gln, 257Gln ersetzt) wurde aus dem Extrakt gewonnen und gereinigt.
- Bei Analyse durch SDS-PAGE in Anwesenheit eines Reduktionsmittels zeigte das gereinigte Produkt eine Einzelbande an der erwarteten Molekulargewichtsposition von 39800.
- Das gereinigte Produkt wurde unter Zugabe von 6N Salzsäure 24 Stunden bei 110ºC hydrolysiert und unter Verwendung eines automatischen Aminosäureanalysators, Modell Hitachi 835, einer Aminosäureanalyse nach der Ninhydrin-Methode unterworfen. Das Ergebnis wird in Tabelle 12 gezeigt. Tabelle 12 Aminosäure Gereinigtes Produkt Berechnet n.n: nicht nachgewiesen
- Die Menge des nach dem obigen Verfahren erhaltenen rekombinanten Streptokinaseproteinderivats (1-372, 45-68 verlustig, 256Gln, 257Gln ersetzt) betrug gemäß der Aminosäureanalyse des gereinigten Produkts 0,56 mg.
- Die spezifische Plasminogenaktivator-Aktivität betrug 6,30 im Molverhältnis auf Basis der Aktivität von Naturtyp-Streptokinase, die als 100 angenommen wurde.
- Ein Vektor zur Expression des Streptokinaseproteinderivats (1-372, 45-68 verlustig, 118 verlustig, 256Gln, 257Gln ersetzt) wurde unter Verwendung der in den Beispielen 6 bzw. 10 erhaltenen Streptokinasederivat-Expressionsvektoren pSKXT (1-372, 118 verlustig) und pSKXT (1-372, 45-68 verlustig, 256Gln, 257Gln ersetzt) nach dem folgenden Verfahren hergestellt.
- Fig. 10 zeigt das Verfahren schematisch. Der gewünschte Vektor wird in der Figur als "pSKXT (1-372, 45-68 def, 118 def. 256Gln, 257Gln sub)" bezeichnet.
- pSKXT (1-372, 118 verlustig) wurde mit den Restriktionsenzymen BglII und HindIII behandelt, wobei ein DNA-Fragment mit 515 bp gebildet wurde. pSKXT (1-372, 45-68 verlustig, 256Gln, 257Gln ersetzt) wurde mit den Restriktionsenzymen PstI und BglII unter Bildung eines DNA-Fragment mit 1371 bp und mit den Restriktionsenymen PstI und HindIII unter Bildung eines DNA-Fragment mit 3335 bp behandelt. Diese DNA-Fragmente wurden durch Agarose-Gelelektrophorese gesammelt und miteinander ligiert. E. coli JM109 wurde mit der Reaktionsmischung transformiert, aus den resultierenden Kolonien wurde die Vektor-DNA gewonnen und gereinigt, und es wurde eine Restriktionskarte erstellt; man erhielt den gewünschten Vektor pSKXT (1-372, 45-68 verlustig, 118 verlustig, 256Gln, 257Gln ersetzt).
- E. coli JM109 mit dem obigen Vektor wurde unter der Bezeichnung "Escherichia coli, JM-109, pSKXT (1-372, Δ45-68, Δ118, QQ)" und der Hinterlegungsnummer FERM BP-2828 am Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, MITI, hinterlegt.
- E. coli JM109 (FERM BP-2828) mit dem nach Verfahren 1) erhaltenen Vektor wurde unter Schütteln wie bereits zuvor beschrieben im gleichen flussigen M9-Casamino acid-Medium wie oben inkubiert.
- Nach Zugabe von IPTG wurden die Zellen gesammelt und entsprechend auf Streptokinaseaktivität (Plasminogenaktivator-Aktivität) getestet. Im Ergebnis konnte keine Aktivität im Mediumüberstand nachgewiesen werden, es wurde jedoch eine Expression von ungefähr 170 internationalen Einheiten/ml in der Zellfraktion nachgewiesen, die nahezu vollständig in der Periplasmafraktion gefunden wurde. Eine weiter Analyse durch Western-Blotting zeigte die Immunaktivität an der berechneten Molekulargewichtsposition von ungefähr 39700.
- 1,2 Liter Kultur wurden wie in Beispiel 5, 4) abzentrifugiert, die Zellen wurden gesammelt, und aus den Zellen wurde durch osmotischen Schock eine Periplasmafraktion extrahiert. Das gewünschte Proteinderivat (1-372, 45-68 verlustig, 118 verlustig, 256Gln, 257Gln ersetzt) wurde aus dem Extrakt gewonnen und gereinigt.
- Bei Analyse durch SDS-PAGE in Anwesenheit eines Reduktionsmittels zeigte das gereinigte Produkt eine Einzelbande an der erwarteten Molekulargewichtsposition von 39700.
- Das gereinigte Produkt wurde unter Zugabe von 6N Salzsäure 24 Stunden bei 110ºC hydrolysiert und unter Verwendung eines automatischen Aminosäureanalysators, Modell Hitachi 835, einer Aminosäureanalyse nach der Ninhydrin-Methode unterworfen. Das Ergebnis wird in Tabelle 13 gezeigt. Tabelle 13 Aminosäure Gereinigtes Produkt Berechnet n.n: nicht nachgewiesen
- Die Menge des nach dem obigen Verfahren erhaltenen rekombinanten Streptokinaseproteinderivats (1-372, 45-68 verlustig, 118 verlustig, 256Gln, 257Gln ersetzt) betrug gemäß der Aminosäureanalyse des gereinigten Produkts 2,4 mg.
- Die spezifische Plasminogenaktivator-Aktivität betrug 7,74 im Molverhältnis auf Basis der Aktivität von Naturtyp-Streptokinase, die als 100 angenommen wurde.
- Ein Vektor zur Expression des Streptokinaseproteinderivats (1-372, verändert in -Lys-Pro-Lys-Pro- an den Positionen 256 und 257) wurde unter Verwendung des in Beispiel 5 erhaltenen Streptokinasederivat- Expressionsvektors pSKXT (1-372) nach dem folgenden Verfahren hergestellt.
- Fig. 11 zeigt das Verfahren schematisch. Der gewünschte Vektor wird in der Figur als "pSKXT (1-372, 256, 257LysProLysPro rep)" bezeichnet.
- Der gewünschte Expressionsvektor für das Proteinderivat wurde hergestellt, indem die Sequenz von pSKXT (1-372) in der Region zwischen den Restriktionsstellen HindIII und SnaBI durch die neuen, chemisch synthetisierten und nachfolgend wiedergegebenen DNA- Fragmente d-1 bis d-4 ersetzt wurden.
- Diese Fragmente umfassen Lys-Pro-Lys-Pro als Substitution für Lys- Lys an den Positionen 256 und 257 der Streptokinase und werden für eine Veränderung verwendet, die erfindungsgemäß darin besteht, daß einige Aminosäurereste durch andere Aminosäurereste ersetzt werden.
- Die vier Oligonukleotide d-1 bis d-4 wurden einzeln chemisch synthetisiert. Für die spätere Analyse wurde eine neue Restriktionsstelle für EcoRV vorgesehen.
- pSKXT (1-372) wurde mit den Restriktionsenzymen HindIII und NcoI unter Bildung eines DNA-Fragments mit 608 bp und mit den Restriktionsenzymen NcoI und SnaBI unter Bildung eines DNA-Fragments mit 4612 bp behandelt. Diese DNA-Fragmente wurden durch Agarose- Gelelektrophorese gesammelt und mit den vier chemisch synthetisierten DNA-Fragmenten zur Reaktion gebracht (die Oligomere d-2 und d- 4 waren an ihren 5'-Enden phosphoryliert). E. coli JM109 wurde mit der Reaktionsmischung transformiert, aus den resultierenden Kolonien wurde die Vektor-DNA gewonnen und gereinigt, und es wurde eine Restriktionskarte erstellt; man erhielt den gewünschten Vektor.
- E. coli JM109 mit dem nach obigem Verfahren 2) erhaltenen Vektor wurde unter Schütteln wie bereits zuvor beschrieben im gleichen flüssigen M9-Casamino acid-Medium wie oben inkubiert.
- Nach Zugabe von IPTG wurden die Zellen gesammelt und entsprechend auf Streptokinaseaktivität (Plasminogenaktivator-Aktivität) getestet. Im Ergebnis konnte keine Aktivität im Mediumüberstand nachgewiesen werden, es wurde jedoch eine Expression von ungefähr 7 internationalen Einheiten/ml in der Zellfraktion nachgewiesen, die nahezu vollständig in der Periplasmafraktion gefunden wurde. Eine weiter Analyse durch Western-Blotting zeigte die Immunaktivität an der berechneten Molekulargewichtsposition von ungefähr 42500.
- 2,4 Liter Kultur wurden wie in Beispiel 5, 4) abzentrifugiert, die Zellen wurden gesammelt, und aus den Zellen wurde durch osmotischen Schock eine Periplasmafraktion extrahiert. Das gewünschte Proteinderivat (1-372, 256, 257Lys-Pro-Lys-Pro verändert) wurde aus dem Extrakt gewonnen und gereinigt; man erhielt ein reines lyophilisiertes Produkt.
- Bei Analyse durch SDS-PAGE in Anwesenheit eines Reduktionsmittels zeigte das gereinigte Produkt eine Einzelbande an der erwarteten Molekulargewichtsposition von 42500.
- Tabelle 14 zeigt das Ergebnis, das bei der Aminosäureanalyse des gereinigten Produkts erhalten wurde. Tabelle 14 Aminosäure Gereinigtes Produkt Berechnet n.n: nicht nachgewiesen
- Die Menge des so erhaltenen rekombinanten Streptokinaseproteinderivats (1-372, 256, 257Lys-Pro-Lys-Pro verändert) betrug gemäß der Aminosäureanalyse des gereinigten Produkts 0,46 mg.
- Die spezifische Plasminogenaktivator-Aktivität betrug 17,7 im Molverhältnis auf Basis der Aktivität von Naturtyp-Streptokinase, die als 100 angenommen wurde.
Claims (14)
1. Chemisch synthetisiertes Streptokinase-Gen mit der
Basensequenz:
oder der Basensequenz:
2. Rekombinantes Plasmid, umfassend einen Plasmidvektor, der das
in Anspruch 1 definierte chemisch synthetisierte Gen
inkorporiert enthält.
3. Transformante, transformiert mit dem in Anspruch 2
definierten rekombinanten Plasmid.
4. Streptokinaseproteinderivat mit Streptokinase-Aktivität und
einer modifizierten Aminosäureprimärsequenz entsprechend der
durch die folgende Formel (1) von Streptokinase dargestellten
Aminosäureprimärsequenz, in der die Aminosäurereste von
Position 373 bis zum C-Terminus fehlen, wobei wenigstens einer
der Aminosäurereste der Sequenz der Formel (1) fehlt oder
nicht fehlt oder ersetzt ist, oder wenigstens ein
Aminosäurerest in die Sequenz der Formel (1) inseriert oder nicht
inseriert ist.
Formel (1) :
5. Streptokinaseproteinderivat nach Anspruch 4 mit einer
modifizierten Aminosäureprimärsequenz entsprechend der Sequenz
der Formel (1), worin außerdem Arg an Position 45 bis Gly an
Position 68 fehlen.
6. Streptokinaseproteinderivat nach Anspruch 4 mit einer
modifizierten Aminosäureprimärsequenz entsprechend der Sequenz
der Formel (1), worin außerdem Phe an Position 118 fehlt oder
durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt ist.
7. Streptokinaseproteinderivat nach Anspruch 4 mit einer
modifizierten Aminosäureprimärsequenz entsprechend der Sequenz
der Formel (1), worin Lys an Position 256 und Lys an Position
257 jeweils fehlen oder durch einen anderen Aminosäurerest
ersetzt sind.
8. Streptokinaseproteinderivat nach Anspruch 4 mit einer
modifizierten Aminosäureprimärsequenz entsprechend der Sequenz
der Formel (1), worin außerdem ein weiterer Aminosäurerest
jeweils an der Position neben Lys an Position 256 und Lys an
Position 257 inseriert ist.
9. Streptokinaseproteinderivat nach Anspruch 4 mit einer
modifizierten Aminosäureprimärsequenz umfassend die
Kombination von wenigstens zwei der in den Ansprüchen 5 bis 8
definierten Modifikationen.
10. Chemisch synthetisiertes Gen, das für das in einem der
Ansprüche 4 bis 9 definierte Streptokinaseproteinderivat
codiert.
11. Rekombinantes Plasmid, umfassend einen Plasmidvektor, der das
in Anspruch 10 definierte chemisch synthetisierte Gen
inkorporiert enthält.
12. Transformante, transformiert mit der in Anspruch 11
definierten Rekombinante.
13. Transformante nach Anspruch 12, worin die Wirtszelle E. coli
ist.
14. Verfahren zur Herstellung eines Streptokinaseproteinderivats,
dadurch gekennzeichnet, daß man die in den Ansprüchen 12 oder
13 definierten Transformanten inkubiert und das exprimierte
Streptokinaseproteinderivat sammelt und reinigt.
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