DE3587605T2

DE3587605T2 - Interleukin-1 und dessen Derivat.

Info

Publication number: DE3587605T2
Application number: DE85309453T
Authority: DE
Inventors: Yasuji Furutani; Mitsue Notake; Masaaki Yamada; Junichi Yamagishi; Michiko Yamayoshi
Original assignee: Dainippon Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Dainippon Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1984-12-25
Filing date: 1985-12-23
Publication date: 1994-03-17
Anticipated expiration: 2005-12-24
Also published as: EP0188920A2; US5376639A; EP0188920B1; EP0188920A3; KR950000712B1; KR860005024A; DE3587605D1; US5494663A

Description

Diese Erfindung betrifft eine DNA, die ein Polypeptid mit Interleukin-1-Aktivität codiert, einen Vektor, in welchen die DNA eingefügt ist, einen Wirt, der mit dem Vektor transformiert ist, ein Polypeptid mit Interleukin-1-Aktivität, das durch Züchtung des transformierten Wirts hergestellt wird, Derivate des Polypeptids, ein Arzneimittel, das das Polypeptid oder ein Derivat enthält, deren Verwendung als Antitumormittel oder antiinfektiöses Mittel und Verfahren zu deren Herstellung.

Stand der Technik

Gery et al. zeigten das Vorliegen einer Substanz im Kulturmedium von Makrophagen, die die Proliferation von Mausthymocyten durch Mitogenwirkung steigert, diese Substanz wurde "Lymphocyten aktivierender Faktor" (LAF) genannt. Seit 1979 wurde diese Substanz dann mit "Interleukin-1" (abgekürzt "IL- 1") bezeichnet, daher wird sie in dieser Beschreibung Interleukin-1 genannt.
Es ist bekannt, daß IL-1 die Proliferation von T- und B- Lymphocyten fördert und ferner auf T-Lymphocyten wirkt und dadurch die Produktion von Lymphokinen, insbesondere Interleukin-2 (T-Lymphocyten-Proliferationsfaktor), fördert, aus diesem Grund zählt diese Substanz zu den wichtigen Faktoren, die bei der Produktion von Antikörpern und bei der Kontrolle der zellulären Immunität eine Rolle spielen [vgl. Staruch, M. J., et al., J. Immunol. 130 (1983), 2191]. Außerdem wird berichtet, daß IL-1 auf die Produktion von Prostaglandin E oder Kollagenase, auf die Proliferation von Fibroblasten und die Steigerung der natürlichen Killer(NK)-Zell-Aktivierung durch Interleukin-2 oder Interferon wirkt [Simon, P. L., et al., "Lymphokines" Bd. 6 (1982), 47, Academic Press Inc.].
Somit ist IL-1 in vivo nicht nur an der Immunantwort sondern auch an Schutz- und Reparaturmechanismen beteiligt, aus diesem Grund ist zu erwarten, daß es als Arzneimittel verwendet werden kann.
IL-1 wurde durch Züchtung von Makrophagen, peripheren mononucleären Zellen, Makrophagen-ähnlichen Zellen (z. B. Maus- P388D&sub1;-Zellen) oder monocytischen oder myelocytischen Leukämiezellen in Gegenwart eines geeigneten Induktors und anschließende Isolierung aus dem Kulturmedium hergestellt, die Struktur von IL-1 war jedoch noch nicht geklärt.
Es wurde berichtet, daß menschliches IL-1, das aus dem Kulturmedium von menschlichen monocytischen Leukämiezellen (z. B. U937-Zellen) oder menschlichen peripheren mononucleären Zellen isoliert wurde, ein Molekulargewicht von 11 300 und 15 000 Daltons aufweist [Mizel, S. B., et al., J. Immunol. 131 (1983), 1834; Schmidt, J. A., J. Exp. Med. 160 (1984), 772].
Kürzlich wurde berichtet, daß eine das Maus-IL-1-Polypeptid codierende cDNA aus Maus-P388D&sub1;-Zellen cloniert und das aus 156 Aminosäuren bestehende Maus-IL-1-Polypeptid in Escherichia coli erzeugt wurde [Lomedico, P. T., et al., Nature 312 (1984), 458]. Außerdem wurde berichtet, daß eine das menschliche IL-1-Polypeptid codierende cDNA aus menschlichen mononucleären Zellen cloniert wurde und die Expression davon erfolgreich war [Auron, P. E., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), 7907].
Die erfindungsgemäßen Polypeptide und die DNAs, die diese codieren, unterscheiden sich jedoch deutlich von den vorstehenden, bekannten Produkten.
Keinen Bericht gibt es über Kaninchen-IL-1-Polypeptid und die DNA, die dieses Polypeptid codiert.

Kurze Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfinder haben intensive Studien über die Herstellung von IL-1 durch Gentechnik betrieben, sie haben erfolgreich DNAs cloniert, die menschliches IL-1 und Kaninchen-IL-1 codieren, und sie haben die Transformation eines Wirts mit einem Expressionsvektor, der die clonierte DNA enthält, durchgeführt und bestätigt, daß der transformierte Wirt IL-1 oder eine Substanz mit IL-1-Aktivität produzieren kann.
Somit haben die Erfinder die Produktion eines Polypeptids mit menschlicher oder Kaninchen-IL-1-Aktivität erfolgreich durchgeführt, hierfür haben sie menschliche Zellen, die in Makrophagen-ähnliche Zellen differenziert waren, oder Kaninchen-Makrophagen in Gegenwart eines Induktors (von Induktoren), geeignet für die Produktion von IL-1, gezüchtet und auf diese Weise IL-1-mRNA in den Zellen akkumuliert, durch Verwendung der mRNA als Matrize eine cDNA-Bank hergestellt, daraus eine das menschliche oder Kaninchen-IL-1 codierende DNA cloniert, die gesamte Nucleotidsequenz der DNA bestimmt und die clonierte DNA in einen Expressionsvektor eingefügt und sodann einen Wirt mit dem Vektor transformiert, wodurch ein transformierter Wirt erhalten wurde, der das gewünschte Polypeptid mit IL-1-Aktivität produzieren kann. Im Verlauf der Studie haben die Erfinder herausgefunden, daß das menschliche oder Kaninchen-IL-1 als ein Precursor gebildet wird und daß das aus 159 Aminosäuren bestehende Polypeptid am C-Terminus des menschlichen IL-1-Precursors mit einem Molekulargewicht von 18 000 und einem pI-Wert von 5,3 eine starke IL-1-Aktivität aufweist. Aufgrund dieser Erkenntnisse haben die Erfinder spezifiziert, daß dieses Polypeptid reifes menschliches IL-1 darstellt, und ferner, daß reifes Kaninchen-IL-1 ein Polypeptid ist, das aus 155 Aminosäuren am C-Terminus des Kaninchen- IL-1-Precursors besteht, dies läßt sich aus der Homologie folgern.
In dieser Erfindung werden das Polypeptid, das aus 159 Aminosäuren am C-Terminus des menschlichen IL-1-Precursors besteht, und das Polypeptid, das aus 155 Aminosäuren am C-Terminus des Kaninchen-IL-1-Precursors besteht, als reifes menschliches IL-1 bzw. reifes Kaninchen IL-1 bezeichnet.
Darüberhinaus ist gefunden worden, daß reife Polypeptide mit kürzeren Aminosäuresequenzen als den Sequenzen des aus 159 Aminosäureresten bestehenden, reifen menschlichen IL-1-Polypeptids auch eine IL-1-Aktivität wie reifes menschliches IL-1- Polypeptid zeigen. Außerdem wurden große Homologien zwischen den für menschliche und Kaninchen-IL-1-Polypeptide codierenden Nucleotidsequenzen und zwischen den hergeleiteten Aminosäuresequenzen von menschlichen und Kaninchen-IL-1-Polypeptiden festgestellt. Hieraus kann gefolgert werden, daß menschliche und Kaninchen-IL-1-Polypeptide phylogenetisch von demselben Gen abstammen und daß ein beträchtlicher Teil (Teile) der gemeinsamen Bereiche eine Sequenz (Sequenzen) darstellt (darstellen), die für ihre biologischen Aktivitäten nötig ist (sind).
Eine Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung einer DNA, die ein Polypeptid mit IL-1-Aktivität codiert. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Vektors, in den die vorstehend erwähnte DNA eingefügt ist. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines mit dem rekombinanten Vektor transformierten Wirts. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Polypeptids mit IL-1-Aktivität, das durch Züchtung des transformierten Wirts wie vorstehend beschrieben produziert wird. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines aus dem Polypeptid erhaltenen Derivats (Substanz). Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Arzneimittels, das das Polypeptid oder Derivat als Wirkstoff enthält. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung der DNA, des Vektors, des transformierten Wirts und des Polypeptids oder Derivats. Der Fachmann kann diese und weitere Aufgaben und Vorteile der Erfindung aus der folgenden Beschreibung ersehen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt das Testergebnis der Hybridisierung-Translation bei der Clonierung von cDNA von Kaninchen-IL-1, wobei die gepunktete Linie den ³H-Thymidin-Einbau in die Kontrolle darstellt. Fig. 2 zeigt die Struktur des chromosomalen Gens des menschlichen IL-1 und seine Kartierung mittels Restriktionsendonucleasen (in Beispiel 3). Die Fig. 3 bis 5 zeigen die Schritte zur Konstruktion des Expressionsvektors pHLP101 (in Beispiel 4). Fig. 6 zeigt das Muster der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese von IL-1 (209), das in Beispiel 4 erhalten wurde. Fig. 7 zeigt die Schritte zur Konstruktion des Expressionsvektors pHLP383 (in Beispiel 5). Fig. 8 zeigt die Schritte zur Konstruktion des Expressionsvektors pHLP385 (in Beispiel 7). Fig. 9 zeigt die Schritte zur Konstruktion des Expressionsvektors pHLP373 (in Beispiel 10). Fig. 10 zeigt die Schritte zur Konstruktion des Expressionsvektors pRLP383 (in Beispiel 15).

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Zur Vereinfachung der Beschreibung werden die folgenden Abkürzungen in der vorliegenden Beschreibung und den Patentansprüchen verwendet.
A: Adenin
C: Cytosin
G: Guanin
T: Thymin
Ala: Alanin
Arg: Arginin
Asn: Asparagin
Asp: Asparaginsäure
Cys: Cystein
GIn: Glutamin
Glu: Glutaminsäure
Gly: Glycin
His: Histidin
Ile: Isoleucin
Leu: Leucin
Lys: Lysin
Met: Methionin
Phe: Phenylalanin
Pro: Prolin
Ser: Serin
Thr: Threonin
Trp: Tryptophan
Tyr: Tyrosin
Val: Valin
DNA: Desoxyribonucleinsäure
cDNA: komplementäre DNA
sscDNA: einzelsträngige cDNA
dscDNA: doppelsträngige cDNA
RNA: Ribonucleinsäure
mRNA: messenger-RNA
Poly(A)mRNA: Poly(A)-enthaltende mRNA
dATP: Desoxyadenosintriphosphat
dCTP: Desoxycytidintriphosphat
dGTP: Desoxyguanosintriphosphat
dTTP: Desoxythymidintriphosphat
Oligo(dc): Oligodesoxycytidylsäure
Oligo(dG): Oligodesoxyguanylsäure
Oligo(dT): Oligodesoxythymidylsäure
Poly(A): Polyadenylsäure
Poly(U): Polyuridylsäure
Poly(dc): Polydesoxycytidylsäure
Poly(dG): Polydesoxyguanylsäure
ATP: Adenosintriphosphat
EDTA: Ethylendiamintetraessigsäure
kB: Kilobasen
kBp: Kilobasenpaare
Bp: Basenpaare
In der vorliegenden Beschreibung und den Patentansprüchen bedeutet die durch einen Einzelstrang dargestellte Nucleotidsequenz die Nucleotidsequenz eines Sense-Strangs, wobei das linke Ende einen 5'-Terminus und das rechte Ende einen 3'-Terminus darstellt. In der Aminosäuresequenz ist das linke Ende ein N-Terminus und das rechte Ende ein C-Terminus.

[I] DNAs

(A) Bezeichnung der DNAs

Die erfindungsgemäßen DNAs sind DNAs, die eine Nucleotidsequenz aufweisen oder enthalten, die einer Aminosäuresequenz entspricht, die durch die in der beiliegenden Tabelle 1-1 gezeigte Formel [I-1] dargestellt wird, in der 1 bis 16, vorzugsweise 1 bis 15, Aminosäurereste am N-Terminus und/oder 1 bis 7, vorzugsweise 1 bis 5, Aminosäurereste am C-Terminus deletiert sein können, und DNAs, die eine Nucleotidsequenz aufweisen oder enthalten, die einer Aminosäuresequenz entspricht, die durch die Formel [I-1] dargestellt wird, die am N-Terminus davon darüberhinaus eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch die in der beiliegenden Tabelle 2-1 gezeigte Formel [I-2] dargestellt wird, in der ein Aminosäurerest (Aminosäurereste) am N-Terminus der Aminosäuresequenz der Formel [I-2] deletiert sein kann (können).
Diese DNAs sind solche DNAs, die vom menschlichen Gen oder von der cDNA hergeleitet sind, die menschliches IL-1 codieren.
Eine DNA, die aus einer Nucleotidsequenz besteht, die einer durch die Formel [I-1] dargestellten Aminosäuresequenz entspricht, codiert das reife menschliche IL-1, und eine DNA, die aus der vorstehenden Nucleotidsequenz besteht, die an dessen 5'-Terminus mit einer Nucleotidsequenz verknüpft ist, die einer durch die Formel [1-2] dargestellten Aminosäuresequenz entspricht, codiert den menschlichen IL-1-Precursor.
Die erfindungsgemäßen DNAs umfassen außerdem DNAs, die eine Nucleotidsequenz aufweisen oder enthalten, die einer Aminosäuresequenz entspricht, die durch die in der beiliegenden Tabelle 3-1 gezeigte Formel [A-1] dargestellt wird, die darüberhinaus an dessen N-Terminus eine Aminosäuresequenz aufweisen kann, die durch die in der beiliegenden Tabelle 4-1 gezeigte Formel [A-2] dargestellt wird, in der ein Aminosäurerest (Aminosäurereste) am N-Terminus der Aminosäuresequenz der Formel [A-2] deletiert sein kann (können).
Diese DNAs sind solche DNAs, die vom Kaninchen-Gen oder von der cDNA herleitet sind, die Kaninchen-IL-1 codieren. Eine DNA, die aus einer Nucleotidsequenz entsprechend einer durch die Formel [A-1] dargestellten Aminosäuresequenz besteht, codiert reifes Kaninchen-IL-1, und eine DNA, die aus der vorstehenden Nucleotidsequenz besteht, die an deren 5'-Terminus mit einer Nucleotidsequenz verknüpft ist, die einer durch die Formel [A-2] dargestellten Aminosäuresequenz entspricht, codiert den Kaninchen-IL-1-Precursor.
Bevorzugte erfindungsgemäße DNAs sind
(i) eine DNA, die eine Nucleotidsequenz aufweist, die einer durch die Formel [I-1] dargestellten Aminosäuresequenz entspricht,
(ii) eine DNA, die eine Nucleotidsequenz aufweist, die einer durch die Formel [I-1] dargestellten Aminosäuresequenz entspricht, in der zwei Aminosäurereste am N-Terminus deletiert sind,
(iii) eine DNA, die eine Nucleotidsequenz aufweist, die einer durch die Formel [I-1] dargestellten Aminosäuresequenz entspricht, in der zehn Aminosäurereste am N-Terminus deletiert sind,
(iv) eine DNA, die eine Nucleotidsequenz aufweist, die einer durch die Formel [I-1] dargestellten Aminosäuresequenz entspricht, in der 14 oder 15 Aminosäurereste am N-Terminus deletiert sind,
(v) eine DNA, die eine Nucleotidsequenz aufweist, die einer durch die Formel [I-1] dargestellten Aminosäuresequenz entspricht, in der vier Aminosäurereste am C-Terminus deletiert sind,
(vi) eine DNA, die eine Nucleotidsequenz aufweist, die einer durch die Formel [I-1] dargestellten Aminosäuresequenz entspricht, in der fünf Aminosäurereste am C-Terminus deletiert sind, und
(vii) eine DNA, die eine Nucleotidsequenz aufweist, die einer durch die Formel [I-1] dargestellten Aminosäuresequenz entspricht, in der 15 Aminosäurereste am N-Terminus und vier Aminosäurereste am C-Terminus deletiert sind.
Ferner ist auch eine DNA, die eine Nucleotidsequenz aufweist, die einer durch die Formel [A-1] dargestellten Aminosäuresequenz entspricht, als eine bevorzugte erfindungsgemäße DNA enthalten.
Die vorstehenden DNAs können ein Initiationcodon am 5'- Terminus und/oder ein Terminationscodon (Terminationscodons) am 3'-Terminus aufweisen.
Die typischen Nucleotidsequenzen, die den durch die Formeln [I-1] und [A-1] dargestellten Aminosäuresequenzen entsprechen, sind Nucleotidsequenzen, die durch die in Tabelle 1- 2 bzw. 3-2 gezeigten Formeln [II-1] und [B-1] dargestellt werden.
Die typischen Nucleotidsequenzen, die den durch die Formeln [I-2] und [A-2] dargestellten Aminosäuresequenzen entsprechen, sind Nucleotidsequenzen, die durch die in Tabelle 2- 2 bzw. 4-2 gezeigten Formeln [II-2] und [B-2] dargestellt werden.
Es sollte so verstanden werden, daß die erfindungsgemäßen DNAs die nachstehenden DNAs umfassen:
eine DNA, die ein Polypeptid mit IL-1-Aktivität codiert, eine DNA, die ein Polypeptid mit IL-1-Aktivität codiert, die vom menschlichen oder Kaninchen-IL-1-Gen oder von der cDNA stammt,
eine cDNA, die reifes menschliches oder Kaninchen-IL-1- Polypeptid oder seinen Precursor codiert, eine DNA, die reifes menschliches oder Kaninchen-IL-1-Polypeptid codiert, die aus einer menschlichen oder Kaninchen- Genombank hergestellt wird,
eine DNA, die aus einer chemischen oder enzymatischen Modifikation einer DNA resultiert, die das reife menschliche IL- 1-Polypeptid codiert,
eine teilweise oder vollständig synthetisierte DNA, die im wesentlichen gleich ist wie die DNA, die reifes menschliches oder Kaninchen-IL-1-Polypeptid codiert,
eine DNA mit degenerativen Codons, die das reife menschliche IL-1-Polypeptid, sein modifiziertes Polypeptid oder das Kaninchen-IL-1-Polypeptid codiert,
eine DNA, die das reife menschliche IL-1-Polypeptid, sein modifiziertes Polypeptid oder das Kaninchen-IL-1-Polypeptid codiert und ein Initiationscodon und/oder ein Terminationscodon (Terminationscodons) und/oder einen Promotor, gefolgt von einer Shine-Dalgarno-Sequenz stromaufwärts des Initiationscodons, aufweist,
eine DNA, die mindestens eine Nucleotidsequenz (Nucleotidsequenzen) enthält, die einen Teil (Teile) mit hoher Homologie zwischen der das menschliche IL-1-Polypeptid codierenden Nucleotidsequenz und der das Kaninchen-IL-1-Polypeptid codierenden Nucleotidsequenz aufweist (aufweisen) und
eine DNA, die aus der Deletion eines Teiles des 5'-terminalen Bereichs aus einer solchen Nucleotidsequenz resultiert, die menschliches oder Kaninchen-IL-1-Precursor-Polypeptid codiert.

(B) Produktion von DNAs

Nachstehend werden Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen DNAs beschrieben.
Erfindungsgemäß können die DNAs, die das menschliche IL- 1-Polypeptid und das Kaninchen-IL-1-Polypeptid codieren, hergestellt werden, indem menschliche und Kaninchen-Makrophagen (oder Makrophagen-ähnliche Zellen) zusammen mit einem Induktor (Induktoren) gezüchtet werden, eine die IL-1-mRNA enthaltende Fraktion aus den induzierten Zellen abgetrennt, eine cDNA-Bank aus der Fraktion hergestellt und die IL-1-cDNA aus der cDNA- Bank cloniert wird.
Das heißt, sie kann durch die folgenden Schritte hergestellt werden:
a) Züchtung von Makrophagen oder Makrophagen-ähnlichen Zellen zusammen mit einem Induktor (Induktoren),
b) Abtrennen einer die IL-1-mRNA enthaltenden Fraktion aus den induzierten Zellen,
c) Herstellung einer einzelsträngigen cDNA (sscDNA) aus der mRNA unter Verwendung einer reversen Transkriptase und sodann deren Umwandlung in eine doppelsträngige cDNA (dscDNA),
d) Insertion der dscDNA in einen Vektor,
e) Einführung des rekombinanten Vektors in einen Wirt, wodurch dieser transformiert wird, und Konstruktion einer cDNA(Kolonie) -Bank.
f) Clonierung einer das IL-1-Polypeptid codierenden cDNA aus der Bank, die durch die Schritte a) bis e) konstruiert wird.
Gewünschtenfalls kann eine Modifikation der wie vorstehend hergestellten DNA (als Schritt g) noch andere erfindungsgemäße DNAs ergeben.
Andererseits kann eine DNA, die das menschliche oder Kaninchen-IL-1-Polypeptid codiert, auch erhalten werden, indem eine DNA, die das menschliche oder Kaninchen-IL-1-Polypeptid codiert, aus der Genombank (z. B. DNA-Fragmente, eingefügt in den Bakteriophagen Charon 4A) cloniert und die Intronbereiche anschließend entfernt werden.
Die Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen cDNA werden für diejenige DNA ausführlicher beschrieben, die das menschliche IL-1-Polypeptid und sein modifiziertes Polypeptid codiert. Die Verfahren zur Herstellung der DNA, die das Kaninchen-IL-1-Polypeptid codiert, sind fast die gleichen wie beim menschlichen IL-1-Polypeptids.
Die Arbeitsgänge und Bedingungen im jeweiligen Schritt der nachstehend beschriebenen Verfahren sind dem Fachmann an sich wohlbekannt, die erfindungsgemäßen Verfahren sind keinesfalls auf diese spezifischen Arbeitsabläufe beschränkt.

(1) Herstellung von menschlicher IL-1-mRNA

Schritt a: Menschliche IL-1-mRNA kann beispielsweise aus menschlichen Leukämiezellen nach dem nachstehenden Verfahren erhalten werden.
Menschliche Leukämiezellen werden mit einer Zelldichte von 1 · 10&sup5; bis 5 · 10&sup6; Zellen/ml ausgesät und zusammen mit einem Induktor (Induktoren) zur Differenzierung in Makrophagen-ähnliche Zellen gezüchtet. Die Menge des Induktors (der Induktoren) hängt von seinem Typ, der Art der Leukämiezellen, den Bedingungen der Züchtung usw. ab. Sofern der (die) Induktor(en) wie nachstehend beschrieben eingesetzt wird (werden), beträgt seine (ihre) Endkonzentration im allgemeinen vorzugsweise etwa 100 bis 2000 ng/ml. Die Züchtung wird bei 35 bis 38ºC, vorzugsweise bei etwa 37ºC, bei einer Luftfeuchtigkeit von etwa 90 bis 100% in Luft, die etwa 5 bis 10% Kohlendioxid enthält, 24 bis 72 Stunden durchgeführt.
Menschliche Leukämiezellen, die für den vorstehenden Schritt eingesetzt werden können, sind alle Arten von menschlichen Leukämiezellen, die durch Stimulation mit einem Induktor in Makrophagen-ähnliche Zellen differenziert werden. Beispiele umfassen HL-60- (ATCC, CCL240), THP-1-, Mono-1-207-Zellen und primäre Zellen, die aus Patienten mit Leukämie erhalten werden.
Als Induktor zur Differenzierung können Diterpene, wie z. B. Phorbolester, Mezerein und Retinoesäure eingesetzt werden.
Als Kulturmedien können verschiedene Kulturmedien verwendet werden, die zur Züchtung von Säugerzellen geeignet sind. Beispiele umfassen RPMI-1640, Eagle-MEM-Medium und Dulbeccos modifiziertes MEM-Medium [die Zusammensetzungen der vorstehenden Medien finden sich z. B. in "Cell Cultivation Manual", herausgegeben von Y. Sohmura, Kodansha (1982), und J.
Paul "Cell and Tissue Culture", E. & S. Livingstone Ltd. (1970)]. Vorzugsweise wird dem Kulturmedium ein Tierserum, wie z. B. fetales Rinderserum oder Kälberserum, in einer Menge von etwa 1 bis 20% zugesetzt.
Die folgenden Experimente werden durchgeführt, nachdem bestätigt wurde, daß die Leukämiezellen in Makrophagen-ähnliche Zellen differenziert sind und an der Schale anhaften.
Sofern jedoch menschliche Makrophagen eingesetzt werden, die aus Lunge, Blut, Abdomen, Plazenta, Milz und anderem Gewebe erhalten wurden, kann der vorstehend erwähnte Differenzierungsschritt weggelassen werden.
Schritt b: Nach der Züchtung wie vorstehend werden das Kulturmedium und die nicht-haftenden Zellen abgesaugt. Sodann wird das Medium, das einen Induktor (Induktoren) zur Synthese von IL-1 (z. B. ein von einem gramnegativen Bakterium stammendes Endotoxin, ein Diterpen, wie z. B. Phorbolester und Mezerein) und einen Inhibitor der Proteinsynthese (z. B. Cycloheximid) enthält, in die Schale zugegeben und die Züchtung weitere 3 bis 8 Stunden fortgesetzt, wodurch IL-1-mRNA in den Makrophagen akkumuliert wird. Die Menge des Endotoxins beträgt im allgemeinen etwa 0,1 bis 1000 ug/ml (Endkonzentration; wie nachstehend), vorzugsweise etwa 1 bis 100 ug/ml. Die Menge eines Phorbolesters beträgt etwa 1 bis 2000 ng/ml. Die Menge an Cycloheximid beträgt vorzugsweise 0,1 bis 50 ug/ml.
Nach der Züchtung wird die gesamte RNA durch ein herkömmliches Verfahren, z. B. das Verfahren von Chirgwin et al. [Biochemistry 18 (1979), 5294], aus den Zellen extrahiert und sodann durch Affinitätssäulenchromatographie auf Oligo (dT) -Cellulose oder Poly(U)-Sepharose oder durch ein Batch-Verfahren eine Fraktion abgetrennt, die Poly(A)mRNA enthält. Eine angereicherte mRNA-Fraktion mit menschlicher IL-1-mRNA kann durch Säure-Harnstoff-Agarosegelelektrophorese oder Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation der Poly(A)mRNA-Fraktion erhalten werden.
Zur Bestätigung, daß es sich bei der resultierenden mRNA- Fraktion um die gewünschte Fraktion handelt, die die mRNA enthält, welche das menschliche IL-1-Polypeptid codiert, wird die mRNA durch Translation in ein Protein überführt und dessen biologische Aktivität getestet. Dieser Test kann beispielsweise durchgeführt werden, indem das Protein in Oocyten von Xenonus laevis injiziert wird oder indem es mit einem geeigneten Proteinsynthesesystem, wie z. B. einem zellfreien Proteinsynthesesystem aus Retikulocytenlysat oder aus Weizenkeimen, gestestet wird und indem auf diese Weise bestätigt wird, daß das translatierte Protein IL-1-Aktivität aufweist.

(2) Clonierung von menschlicher IL-1-cDNA

Schritt c: Die im vorstehenden Abschnitt (1) erhaltene mRNA-Fraktion wird als Matrize verwendet und ein Oligo(dT) wird als Primer eingesetzt, wobei unter Verwendung von reverser Transkriptase (z. B. derjenigen, die von dem Myeloblastose- Virus von Hühnern (AMV) stammt) in Gegenwart von dATP, dGTP, dCTP und dTTP eine sscDNA synthetisiert wird. Sodann wird die sscDNA als Matrize eingesetzt und unter Verwendung von reverser Transkriptase oder E. coli-DNA-Polymerase-I (großes Fragment) eine dscDNA synthetisiert.
Schritte d und e: Die resultierende dscDNA wird beispielsweise in die Spaltstelle der Restriktionsendonuclease PstI von Plasmid pBR322 durch ein herkömmliches Verfahren eingefügt, z. B. das Verfahren der Poly(dG)-Poly(dC)-Homopolymerverlängerung (Nelson, T. S., Methods in Enzymology 68 (1979), 41, Academic Press Inc., New York). Die resultierenden rekombinanten Plasmide werden gemäß dem Verfahren von Cohen et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69 (1972), 2110] in einen Wirt, z. B. E. coli χ 1776, zu dessen Transformation eingeführt, sodann wird durch Selektion von Tetracyclin-resistenten Kolonien eine cDNA(Kolonie)-Bank hergestellt.
Schritt f: Zur Selektion der gewünschten Clone, die rekombinante Plasmide beinhalten, welche eine das menschliche IL-1-Polypeptid codierende cDNA-Insertion enthalten, werden die folgenden Verfahren eingesetzt.
Sofern ein geeignetes DNA-Fragment, z. B. ein cDNA-Fragment oder ein chemisch synthetisiertes DNA-Fragment, das einem tierischen (aber nicht menschlichem) IL-1-Polypeptid entspricht, vorausgehend erhalten werden kann, wird die vorstehende cDNA-Bank einem Koloniehybridisierungstest [Hanahan, D., et al., Gene 10 (1980), 63] unter Verwendung des vorstehenden, mit ³²P markierten DNA-Fragments als Sonde unterworfen und die gewünschten Clone selektiert, die rekombinante Plasmide beinhalten, welche eine cDNA-Insertion mit einer Nucleotidsequenz (Nucleotidsequenzen) enthalten, die zur verwendeten DNA-Sonde komplementär ist (sind).
Sofern eine solche geeignete IL-1-DNA-Sonde, wie vorstehend, nicht erhalten werden kann, werden die gewünschten Clone durch Koloniehybridisierung unter Verwendung von Plus-Induktion-Sonden und Minus-Induktion-Sonden und durch den mRNA- Hybridisierungs-Translations-Test, z. B. gemäß den nachstehend beschriebenen Verfahren, herausgesucht.
Eine ³²P-markierte cDNA wird unter Verwendung derjenigen mRNA-Fraktion als Matrize synthetisiert, die die menschliche IL-1-mRNA enthält, die im vorstehenden Abschnitt (1) erhalten wurde, und als Plus-Induktion-Sonde eingesetzt. Getrennt davon wird eine ³²P-markierte cDNA synthetisiert, indem eine mRNA- Fraktion als Matrize verwendet wird, die durch das gleiche Verfahren wie im vorstehenden Abschnitt (1) erhalten wird, mit der Ausnahme, daß die nicht-induzierten Makrophagen als Ausgangsmaterial verwendet werden. Diese ³²P-markierte cDNA wird als Minus-Induktion-Sonde eingesetzt. Aus der vorstehenden cDNA-Bank werden Plasmidclone selektiert, die eine starke Hybridisierung mit der Plus-Induktion-Sonde, jedoch keine Hybridisierung mit der Minus-Induktion-Sonde zeigten.
Ein mRNA-Hybridisierungs-Translations-Test wird durchgeführt, um zu bestätigen, daß die selektierten Clone eine cDNA- Insertion beinhalten, die das menschliche IL-1-Polypeptid codiert. Die Plasmid-DNAs werden aus den vorstehenden selektierten Clonen isoliert, durch Erhitzen oder Alkali-Behandlung in eine einzelsträngige DNA umgewandelt und auf Nitrocellulosefilter fixiert. Die menschliche IL-1-mRNA enthaltende mRNA- Fraktion, die gemäß dem vorstehend in Abschnitt (1) beschriebenen Verfahren erhalten wurde, wird zu den Filtern zugegeben, damit sie mit der fixierten DNA hybridisiert. Anschließend wird die hybridisierte mRNA eluiert und gewonnen. Die gewonnene mRNA wird in Oocyten von Xenopus laevis injiziert, wodurch bestimmt wird, ob die gewonnene mRNA das menschliche IL- 1-Polypeptid codiert.
Die vorstehenden Verfahren ergeben Transformanten, die ein rekombinantes Plasmid mit einem cDNA-Fragment beinhalten, das eine zur menschlichen IL-1-mRNA komplementäre Nucleotidsequenz enthält.
Wenn die erhaltenen clonierten cDNAs keine ganzen codierenden Bereiche des menschlichen IL-1-Polypeptids enthalten, werden cDNAs mit größerer Größe durch Absuchen der cDNA-Bank selektiert, wobei das clonierte cDNA-Fragment aus der vorstehend selektierten Transformante als Sonde verwendet wird.
Die clonierte cDNA, die ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz des menschlichen IL-1-Polypeptids enthält, kann schließlich geprüft werden, indem die Nucleotidsequenz von einigen resultierenden clonierten cDNA-Fragmenten gemäß beispielsweise dem Verfahren von Maxam-Gilbert [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 560] oder der Didesoxy-Methode unter Verwendung eines M13-Phagen [Sanger, F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463, und Messing, J., Methods in Enzymology 101 (1983), 20] analysiert wird.
Schritt g (Modifikation): Gewünschtenfalls kann die vorstehend erhaltene clonierte cDNA durch bekannte Techniken modifiziert werden, wodurch eine DNA erhalten wird, die eine Nucleotidsequenz aufweist und/oder enthält, in der eines oder mehrere Codons deletiert und/oder durch ein anderes Codon (andere Codons) oder ein degeneratives Codon (degenerative Codons) ersetzt sind.
Eine Modifikation wird beispielsweise durchgeführt, indem die DNA mit einer geeigneten Restriktionsendonuclease (geeigneten Restriktionsendonucleasen) gespalten wird und eines oder mehrere Codons mit geeigneten Exonucleasen und/oder Endonucleasen, einzeln oder in Kombination, abgespalten werden, worauf das Ersetzen durch degenerative Codons, z. B. diejenigen, die durch das Phosphotriester-Verfahren synthetisiert wurden [Ohtsuka, E., et al., Heterocycles 15 (1981), 395], oder die Ligierung ohne Ergänzen von Codons folgt, wodurch eine DNA mit einem oder mehreren deletierten Codons hergestellt wird.

[II] Polypeptide

Die im vorstehenden Abschnitt [I] hergestellten DNAs werden in einen Expressionsvektor passend eingefügt und sodann ein Wirt mit dem Expressionsvektor transformiert. Danach wird der transformierte Wirt gezüchtet, wodurch das gewünschte Polypeptid produziert wird.

(A) Bezeichnung der Polypeptide

Das Polypeptid, das unter Verwendung einer DNA erzeugt wird, die vom menschlichen IL-1-Gen oder von der cDNA hergeleitet wird, ist ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch die in der beiliegenden Tabelle 1-1 gezeigte Formel [1-1) dargestellt wird, in der 1 bis 16, vorzugsweise 1 bis 15, Aminosäurereste am N-Terminus und/oder 1 bis 7, vorzugsweise 1 bis 5, Aminosäurereste am C-Terminus deletiert sein können.
Außerdem ist das Polypeptid, das unter Verwendung einer DNA erzeugt wird, die vom Kaninchen-IL-1-Gen oder von der cDNA hergeleitet wird, ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch die in der beiliegenden Tabelle 3-1 gezeigte Formel [A-1) dargestellt wird.
Bevorzugte Polypeptide der Erfindung sind wie folgt:
(1) ein Polypeptid mit einer durch die Formel [I-1] dargestellten Aminosäuresequenz,
(2) ein Polypeptid mit einer durch die Formel [I-1] dargestellten Aminosäuresequenz, in der zwei Aminosäurereste am N-Terminus deletiert sind,
(3) ein Polypeptid mit einer durch die Formel [I-1] dargestellten Aminosäuresequenz, in der zehn Aminosäurereste am N-Terminus deletiert sind,
(4) ein Polypeptid mit einer durch die Formel [I-1] dargestellten Aminosäuresequenz, in der 14 oder 15 Aminosäurereste am N-Terminus deletiert sind,
(5) ein Polypeptid mit einer durch die Formel [I-1] dargestellten Aminosäuresequenz, in der vier Aminosäurereste am C-Terminus deletiert sind,
(6) ein Polypeptid mit einer durch die Formel [I-1] dargestellten Aminosäuresequenz, in der fünf Aminosäurereste am C-Terminus deletiert sind,
(7) ein Polypeptid mit einer durch die Formel [I-1] dargestellten Aminosäuresequenz, in der 15 Aminosäurereste am N- Terminus und vier Aminosäurereste am C-Terminus deletiert sind, und
(8) ein Polypeptid mit einer durch die Formel [A-1] dargestellten Aminosäuresequenz.
Es sollte so verstanden werden, daß die erfindungsgemäßen Polypeptide die folgenden Polypeptide umfassen:
ein Polypeptid mit IL-1-Aktivität, ein Polypeptid mit IL-1-Aktivität, das vom menschlichen IL-1-Gen oder Kaninchen-IL-1-Gen oder der cDNA stammt,
ein Polypeptid, das durch Züchtung eines Wirtes erzeugt wird, der mit einem Expressionsvektor transformiert ist, der eine Insertion mit der erfindungsgemäßen DNA aufweist,
ein menschliches oder Kaninchen-IL-1-Polypeptid,
ein modifiziertes menschliches IL-1-Polypeptid,
ein Abbauprodukt vom menschlichen oder Kaninchen-IL-1-Polypeptid im Wirt,
ein Polypeptid, das mindestens einen Teil (Teile) mit hoher Homologie zwischen dem menschlichen IL-1-Polypeptid und
dem Kaninchen-IL-1-Polypeptid aufweist.

(B) Produktion von Polypeptiden

Nachstehend werden Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Polypeptide beschrieben.
Erfindungsgemäß kann ein menschliches IL-1-Polypeptid oder sein modifiziertes Polypeptid und ein Kaninchen-IL-1-Polypeptid (nachstehend werden alle diese Polypeptide gelegentlich nur als "das Polypeptid" bezeichnet) durch die folgenden Schritte erzeugt werden:
i) Insertion einer DNA, die eine das Polypeptid codierende Nucleotidsequenz aufweist oder enthält, in einen Expressionsvektor,
ii) Einführung des rekombinanten Vektors in einen Wirt,
iii) Züchtung des mit dem rekombinanten Vektor transformierten Wirts, wodurch das Polypeptid hergestellt wird,
iv) Sammlung der gezüchteten Zellen und Extraktion des hergestellten Polypeptids aus ihnen und
v) Reinigung des Polypeptids durch herkömmliche Verfahren zur Reinigung von Proteinen.
Gewünschtenfalls kann das durch die vorstehenden Schritte erzeugte Polypeptid modifiziert werden (als Schritt vi), wodurch andere erfindungsgemäße Polypeptide oder ihre Derivate oder Salze hergestellt werden.
Anschließend folgt eine ausführliche Beschreibung der Verfahren zur Herstellung des Polypeptids unter Verwendung einer DNA, die das Polypeptid codiert.

Schritt i

Ein Expressionsvektor zur Herstellung des Polypeptids kann durch Insertion einer clonierten DNA, die das Polypeptid codiert, erhalten werden. Alle Vektoren, die sich in den zu transformierenden Mikroorganismen vermehren, können verwendet werden. Beispiele umfassen Plasmide (wie z. B. das E. coli-Plasmid pBR322), Phagen (wie z. B. Abkömmlinge des Lambda-Phagen) und Viren (wie z. B. SV40). Sie können einzeln oder in Kombination verwendet werden, z. B. als ein pBR322-SV40-Hybridplasmid. Die Insertionsstelle der DNA kann geeignet selektiert werden. Mit anderen Worten, eine geeignete Stelle eines geeigneten Vektors kann mit einer geeigneten Restriktionsendonuclease (Restriktionsendonucleasen) in herkömmlicher Art und Weise gespalten und die clonierte DNA mit einer geeigneten Länge in die Spaltstelle eingefügt werden.
Insbesondere wird ein Expressionsvektor zur Herstellung des (nicht-fusionierten) Polypeptids konstruiert, indem ein DNA-Fragment, das die das Polypeptid codierende Nucleotidsequenz enthält, in der das Initiationscodon ATG am 5'-Terminus und das (die) Terminationscodon(s) (TAA, TAG oder TGA) am 3'- Terminus angefügt ist (sind), stromabwärts eines DNA-Fragments mit einem geeigneten Promotor und der Shine-Dalgarno-Sequenz verknüpft und in einen Vektor eingefügt wird. Ein Expressionsvektor zur Herstellung des fusionierten Polypeptids kann konstruiert werden, indem das DNA-Fragment, das die das Polypeptid codierende Nucleotidsequenz aufweist, in der das Terminationscodon am 3'-Terminus angefügt ist, in den Vektor eingefügt wird, so daß das translationale Leseraster mit demjenigen des zu fusionierenden Strukturgens übereinstimmt.
Beispiele der Promotoren sind lac, trp, tac, phoS, phoA, PL und SV40 frühe Promotoren.

Schritt ii

Transformanten werden durch Einführung des Expressionsvektors in einen Wirt, z. B. einen Mikroorganismus, eine Tier- oder eine Pflanzenzelle erhalten. Beispielsweise wird E. coli nach dem Verfahren von Cohen et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69 (1972), 2110] transformiert. Anschließend wird das Polypeptid oder das Polypeptid mit einem Methionin am N-Terminus durch Züchtung der Transformante hergestellt. Das Produkt kann entweder im Cytoplasma oder im Periplasma der Wirtszelle akkumuliert werden, abhängig vom Verfahren zur Konstruktion des Expressionsvektors. Um die Sekretion des Polypeptids ins Periplasma auszulösen, kann man einen Expressionsvektor konstruieren, indem man ein Gen verwendet, das ein sekretorisches Protein codiert, wie z. B. ein Gen der alkalischen Phosphatase (phoA) oder ein Gen eines phosphatbindenen Proteins (phoS), und die das Polypeptid codierende DNA im korrekten translationalen Leseraster in das vorstehende Gen an einer geeigneten Stelle anschließend an einen das Signalpeptid codierenden DNA-Bereich einbaut.

Schritte iii und iv

Die resultierende Transformante wird unter den für die Transformante geeigneten Bedingungen solange gezüchtet, bis das gewünschte Polypeptid vollständig hergestellt wurde. Sodann wird das Polypeptid aus der Kultur extrahiert. Sofern das produzierte Polypeptid im Cytoplasma akkumuliert wird, werden die Wirtszellen durch Lysozymspaltung und Einfrieren und Auftauen oder durch Beschallung oder durch Verwendung einer French-Press aufgeschlossen und anschließend zur Sammlung des Extrakts zentrifugiert oder filtriert. Sofern es im Periplasma akkumuliert wird, kann es beispielsweise nach dem Verfahren von Willsky et al. [J. Bacteriol. 127 (1976), 595] extrahiert werden.

Schritt v

Das auf diese Weise erhaltene Polypeptid kann nach herkömmlichen Verfahren zur Reinigung von Proteinen gereinigt werden, z. B. durch Kombination von Aussalzen, Ultrafiltration, Dialyse, Ionenaustauscherchromatographie, Gelfiltration, Elektrophorese, Affinitätschromatographie usw.
Durch die vorstehenden Verfahren kann das Polypeptid und/oder das Polypeptid mit einem Methionin am N-Terminus des Polypeptids hergestellt werden.

[III] Modifikation von Polypeptiden

Die durch Modifikation des Polypeptids erhaltenen Substanzen umfassen Polypeptide, die durch Addition einer Aminosäure oder eines Peptids (bestehend aus zwei oder mehr Aminosäuren) am N-Terminus und/oder am C-Terminus des Polypeptids erhalten werden; Polypeptide, die durch Deletion von einer oder mehreren Aminosäuren aus dem Polypeptid erhalten werden; Polypeptide, die durch Austausch eines Asparagin- oder Glutaminrestes durch einen Asparginsäure- bzw. Glutaminsäurerest oder durch Austausch eines Asparaginsäure- oder Glutaminsäurerestes durch einen Asparagin- bzw. Glutaminrest erhalten werden, und umfassen ferner Derivate der Polypeptide, wie z. B. Ester, Acylderivate oder Säureamide, die durch Verwendung einer funktionellen Gruppe im Molekül, eines Aminorestes des N- Terminus oder eines Carboxylrestes des C-Terminus, erzeugt werden, sowie deren Salze, die durch Verwendung von Aminoresten oder Carboxylresten zusammen mit beispielsweise Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Arginin, Coffein, Procain, Salzsäure, Gluconsäure usw. erzeugt werden.
Eine solche Modifikation oder Herstellung von Derivaten des Polypeptids wird nach bekannten Techniken durchgeführt, z. B. gemäß dem in "Chemical Modification of Proteins" von Means, G. E., und Feeney, R. E., Holden-Day, Inc., California (1971), beschriebenen Verfahren.
Das erfindungsgemäße Polypeptid kann als Aggregat vorliegen oder es kann auch entweder im Wirt oder im Verlauf der Trennung verändert werden. In dem Fall, daß ein Cysteinrest ein Bestandteil eines erfindungsgemäßen Polypeptids ist, kann dieser Rest eine S-S-Bindung zwischen den Molekülen bilden. Diese veränderten Polypeptide werden auch von der vorliegenden Erfindung umfaßt.
Falls ein Wirt mit einem Vektor transformiert wird, der als Insertion eine DNA, die den menschlichen oder Kaninchen- IL-1-Precursor codiert, oder eine DNA beinhaltet, die einen Bereich stromaufwärts einer Nucleotidsequenz, die das reife menschliche oder Kaninchen-IL-1 codiert, enthält, kann der transformierte Wirt möglicherweise ein Precursor-Polypeptid oder ein mit einem Polypeptid kombiniertes Polypeptid produzieren, das der stromaufwärts liegenden DNA am N-Terminus des reifen Polypeptids zusammen mit oder ohne reifes Polypeptid entspricht. Diese Polypeptide werden auch von dieser Erfindung umfaßt.
[IV] Chemische und physikalische Eigenschaften der Polypeptide:
Nachstehend werden die chemischen und physikalisch-chemischen Eigenschaften des reifen menschlichen IL-1-Polypeptids und seiner modifizierten Polypeptide beschrieben.

(A) Analyseverfahren

Molekulargewicht

Das Molekulargewicht wurde durch Natriumdodecylsulfat (SDS)-Polyacrylamidgelelektrophorese (Gelkonzentration: 12,5%) bestimmt.
Eine Probelösung wurde mit einem gleichen Volumen von 0,125 M Tris-HCl-Puffer (pH 6,8), der 4% SDS, 10% 2-Mercaptoethanol, 20% Glycerin und 0,02% Bromphenolblau enthielt, gemischt und anschließend 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Das Gemisch wurde 3 Stunden einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese bei 200 Volt unter Verwendung - von 0,2 M Glycinlösung, die 25 mM Tris und 0,1% SDS enthielt, als Elektrophoreseelektrolyt unterworfen. Nach der Elektrophorese wurden die einzelnen Wanderungsbahnen auseinandergeschnitten und eine Bahn zum Nachweis von Proteinen mit Coomassie Brillantblau G-250 angefärbt. Sodann wurde eine andere Bahn in 2 mm breite Streifen geschnitten und jeder Streifen in RPMI-1640- Medium gelegt, das 5% fetales Rinderserum oder eine 1% Ammoniumbicarbonatlösung enthielt, wodurch das Polypeptid aus dem Gelstreifen eluiert wurde. Das Eluat aus jedem Gelstreifen wurde einem Test auf IL-1-Aktivität gemäß dem in Beispiel 1 erwähnten Verfahren unterworfen.
Als Markerproteine zur Bestimmung des Molekulargewichts wurden die nachstehenden Proteine eingesetzt; Phosphorylase b (MG: 94 000), Rinderserumalbumin (MG: 67 000), Ovalbumin (MG: 43 000), Carboanhydrase (MG: 30 000), Trypsin-Inhibitor aus Sojabohnen (MG: 20 100) und Alpha-Lactalbumin (MG: 14 400).

Bestimmung der N-terminalen Aminosäure und Aminosäuresequenz

Die N-terminale Aminosäure wurde nach dem Dansylierungsverfahren [Gray, W. R., Methods in Enzymol., Bd. XI (1967), S. 139] bestimmt.
Die Probelösung (100 ul) wurde mit 10 ul 10% SDS, 100 ul N-Ethylmorpholin und 50 ul Dansylchlorid-Lösung (5 mg/ml in Aceton) gemischt und eine Stunde bei 37ºC inkubiert. Anschließend wurden 2 ml Aceton zum Reaktionsgemisch zugefügt und der resultierende Niederschlag abzentrifugiert. Nach Waschen mit 80% Aceton wurde der Niederschlag im Vakuum getrocknet. Sodann wurde er in 100 ul 6 N HCl gelöst und in einem unter Vakuumbedingungen versiegelten Glasröhrchen 5 bis 18 Stunden bei 105ºC erhitzt. Die resultierende dansylierte Aminosäure wurde durch wassergesättigten Essigsäureethylester aus der im Vakuum getrockneten Probe extrahiert. Die dansylierte Aminosäure wurde durch zweidimensionale Dünnschichtchromatographie unter Verwendung eines Polyaminbogens (Cheng-Chin Trading Co., Taiwan) gemäß dem Verfahren von Wood und Wang [Biochem. Biophys. Acta 133 (1967), 369] identifiziert.
Die N-terminale Aminosäuresequenz wurde durch das Edman- Abbau-Verfahren [Arch. Biochem. Biophys. 22 (1949), 475] bestimmt.
Eine Phenylthiohydantoin-Aminosäure, die durch das Edman- Abbau-Verfahren aus einer N-terminalen Aminosäure hergeleitet wurde, wurde durch eine Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie unter Verwendung einer Säule mit TSK-Gel ODS-120A (Toyo Soda Kogyo, Japan) identifiziert. Diese Verfahren wurden serienmäßig wiederholt, wodurch nacheinander jeweils ein neugebildetes N-terminales Aminosäurederivat bestimmt wurde.
Bestimmung der C-terminalen Aminosäuresequenz Die C-terminale Aminosäuresequenz wurde nach dem enzymatische Verfahren unter Verwendung von Carboxypeptidasen bestimmt.
Die Probe wurde mit Carboxypeptidase A und Carboxypeptidase Y gespalten. Die freigesetzten Aminosäuren wurden in geeigneten Zeitabständen während der enzymatischen Spaltung durch einen Mikro-Aminosäureanalysator (Shimadzu Seisakusho, Japan) identifiziert und quantitativ bestimmt.

Isoelektrischer Punkt

Ein isoelektrischer Punkt wurde durch eine isoelektrische Fokussierung mittels Gelelektrophorese bei 5 Watt, 3 Stunden, unter Verwendung eines 5% Polyacrylamid-Flachgels, mit einem mit Pharmalyte (Pharmacia, Schweden) hergestellten pH- Gradienten bestimmt.
(B) Chemische und physikalisch-chemische Eigenschaften:
Die chemischen und physikalisch-chemischen Eigenschaften des reifen menschlichen IL-1-Polypeptids und seiner modifizierten Polypeptide wurden in den folgenden Tabellen (a), (b) und (c) zusammengestellt.
In den Tabellen (a), (b) und (c) sehen das reife menschliche IL-1-Polypeptid und seine modifizierten Polypeptide wie nachstehend aus:
Das reife menschliche IL-1-Polypeptid ist ein in Beispiel 5-(2) erhaltenes Polypeptid, das einer Aminosäuresequenz von Aminosäure Nr. 113 bis Aminosäure Nr. 271 in Tabelle 5 entspricht.
IL-1(157) ist ein in Beispiel 6-(2) erhaltenes Polypeptid, das einer Aminosäuresequenz von der Aminosäure Nr. 115 bis zur Aminosäure Nr. 271 in Tabelle 5 entspricht.
IL-1(149) ist ein in Beispiel 7-(2) erhaltenes Polypeptid, das einer Aminosäuresequenz von der Aminosäure Nr. 123 bis zur Aminosäure Nr. 271 in Tabelle 5 entspricht.
IL-1(144) ist ein in Beispiel 8-(2) erhaltenes Polypeptid, das einer Aminosäuresequenz von der Aminosäure Nr. 127 oder 128 bis zur Aminosäure Nr. 271 in Tabelle 5 entspricht.
IL-1(155-C) ist ein in Beispiel 10-(2) erhaltenes Polypeptid, das einer Aminosäuresequenz von der Aminosäure Nr. 113 bis zur Aminosäure Nr. 267 in Tabelle 5 entspricht. Tabelle (a) Eigenschaften des reifen menschlichen IL-1-Polypeptids Merkmal reifes menschliches IL-1-Polypeptid Molekulargewicht Isoelektrischer Punkt N-terminale Aminosäuresequenz C-terminale Aminosäuresequenz Tabelle (b) Eigenschaften von IL-1(157), IL-1(149) und IL-1(144) Merkmal Molekulargewicht N-terminale Aminosäure C-terminale Aminosäure Aus jedem der vorstehenden drei Polypeptids wurden die folgenden Aminosäuren freigesetzt und identifiziert: Ala, Glx, Asx, Leu, Ile, Phe. Tabelle (c) Eigenschaften von IL-1(155-C) Merkmal Molekulargewicht N-terminale Aminosäure C-terminale Aminosäure
In den vorstehenden Tabelle bedeuten Glx Glu oder Gln, stellt Asx Asp oder Asn dar und bedeutet Y Arg oder Met-Arg.

[V] Formulierung und Verwendung

Die erfindungsgemäßen Polypeptide oder Substanzen können zur Formulierung als Lösung oder gefriergetrocknetes Produkt vorliegen. Vom Standpunkt der Langzeitstabilität ist es wünschenswert, daß sie in Form von gefriergetrockneten Produkten vorliegen. Vorzugsweise werden Träger oder Stabilisatoren zu den Präparaten zugesetzt. Beispiele der Stabilisatoren umfassen Albumin, Globulin, Gelatine, Protamin, Protaminsalze, Glucose, Galactose, Xylose, Mannit, Glucuronsäure, Trehalose, Dextran, Hydroxyethylstärke und nichtionische oberflächenaktive Mittel (wie z. B. Polyoxyethylenfettsäureester, Polyoxyethylenalkylether, Polyoxyethylenalkylphenylether, Polyoxyethylensorbitanfettsäureester, Polyoxyethylenglycerinfettsäureester, Polyoxyethylen-gehärtetes-Rizinusöl, Polyoxyethylen-Rizinusöl, Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Alkylether, Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymer, Sorbitanfettsäureester, Saccharosefettsäureester und Glycerinfettsäureester).
Die erfindungsgemäßen Polypeptide oder Substanzen sind als Antitumormittel oder antiinfektiöses Mittel nützlich, da sie den Rückgang von Tumoren, die in Tiere transplantiert wurden, bewirken und Tiere von lebensgefährlichen mikrobiellen Infektionen heilen.
Solche Präparate werden vorzugsweise parenteral oder äußerlich verabreicht. Parenterale Verabreichungswege, z. B. intravenöse, subcutane und intramuskuläre Verabreichungswege, werden benutzt, wenn sich Tumorzellen oder Krankheitserreger über einen großen Bereich des Körpers ausbreiten oder wenn eine Vorbeugung gegen Tumormetastasen oder mikrobielle Infektionen beabsichtigt ist. Gegen lokales Tumorgewebe oder lokale Infektionen wird eine örtliche Anwendung bevorzugt. Die Dosierung hängt vom Typ und von der Größe der Tumoren und Infektionen, vom Zustand des Patienten und vom Verabreichungsweg ab. Gleichzeitig kann ein entzündungshemmendes Mittel, wie z. B. Indomethacin, verabreicht werden.

[VI] Beispiele

Die folgenden Beispiele dienen der genaueren Erläuterung dieser Erfindung. Sie sollen jedoch in keiner Weise den Umfang der Patentansprüche einschränken.
Die Fig. 1 bis 10 und die Tabellen 5 bis 8 sind der vorliegenden Beschreibung zum besseren Verständnis der folgenden Beispiele beigefügt.

Beispiel 1

Clonierung und Sequenzierung von cDNA, die menschliches IL-1 codiert

(1) Herstellung von menschlicher IL-1-mRNA aus menschlichen promyelocytischen Leukämiezellen (HL-60)

HL-60-Zellen wurden in Petrischalen (8 cm Durchmesser) mit einer Zelldichte von 1 · 10&sup7; Zellen/Schale in 10 ml RPMI- 1640-Medium, das 10% fetales Rinderserum enthielt, mit 500 ng/ml Phorbol-12-myristat-13-acetat und 500 ng/ml Retinoesäure als Induktor zur Differenzierung ausgesät. Nach zweitägiger Züchtung bei 37ºC in einer vollständig feuchten Atmosphäre, die 5% Kohlendioxid enthielt, wurden das Kulturmedium und die nichtanhaftenden Zellen abgesaugt. In die Schalen mit den daran haftenden differenzierten Zellen wurden 10 ml RPMI-1640- Medium zugefügt, das 10% fetales Rinderserum enthielt und mit 10 ug/ml Endotoxin (aus E. coli stammendem Lipopolysaccharid, nachstehend als "LPS" bezeichnet) als Induktor und 1 g/ml Cycloheximid (Inhibitor der Proteinsynthese) angereichert war, und weitere 5 Stunden gezüchtet. Das Kulturmedium wurde abgesaugt und die induzierten Zellen, die an den Schalen hafteten, wurden lysiert und in 6 M Guanidiniumthiocyanatlösung homogenisiert, die 0,5% Natrium-N-lauroylsarkosinat, 5 mM Natriumcitrat und 0,1 M 2-Mercaptoethanol enthielt. Das Homogenisat wurde auf eine 5,7 M Cäsiumchloridlösung, die 0,1 M EDTA enthielt, aufgetragen und 20 Stunden bei 26 500 UpM unter Verwendung einer Ultrazentrifuge (RPS27-2 Rotor, Hitachi Koki, Japan) zentrifugiert, wodurch eine Gesamt-RNA-Fraktion als Pellets erhalten wurde. Die Pellets wurden in einer kleinen Menge einer 7 M Harnstofflösung gelöst, die 0,35 M NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,4) und 20 mM EDTA enthielt, und durch Ethanolfällung gewonnen. Aus 1,5 · 10&sup8; HL-60-Zellen wurden 1,7 mg Gesamt-RNA erhalten. Die Gesamt-RNA-Fraktion wurde in 2 ml 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,4) gelöst, der 1 mM EDTA enthielt (nachstehend als "TE-Lösung" bezeichnet), und die Lösung 5 Minuten bei 65ºC erhitzt. Eine NaCl-Lösung wurde bis zur Endkonzentration von 0,5 M zugefügt und die Lösung auf eine Oligo- (dT)-Cellulose-Säule aufgetragen, die vorher mit der 0,5 M NaCl enthaltenden TE-Lösung äquilibriert worden war. Poly(A)mRNA wurde mit der TE-Lösung aus der Säule mit einer Ausbeute von etwa 75 ug eluiert.
Die Poly(A)mRNA wurde in die Oocyten von Xenous laevis mit einer Dosis von etwa 150 ng pro Oocyte injiziert und die 10 Oocyten in 100 ul Barth-Medium 24 Stunden bei 22ºC inkubiert. Die Oocyten wurden homogenisiert und zentrifugiert. Der Überstand wurde einem Test auf IL-1-Aktivität gemäß dem nachstehend beschriebenen Verfahren unterworfen.
Das RPMI-1640-Medium, das 5% fetales Rinderserum enthielt, wird als Medium verwendet. Eine Probe wird mit dem Medium bis zu einer geeigneten Konzentration verdünnt. 50 ul der Verdünnung werden in jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen (Flow Labs., USA) eingebracht. Außerdem werden 50 ul einer Lösung von 50 ug/ml Phytohämagglutinin-P (Difco Labs., USA) und 100 ul Thymocyten-Suspension (1 · 10&sup7; Zellen/ml), gesammelt von C3H/He-Mäusen (6-10 Wochen alt), jeweils zu der Vertiefung zugefügt. Die Platte wird in einer vollkommen feuchten Atmosphäre, die 5% Kohlendioxid enthält, bei 37ºC inkubiert. Nach zweitägiger Inkubation wird 1 uCi ³H-Thymidin in jede Vertiefung zugegeben und die Platte weitere 18 Stunden inkubiert. Die Thymocyten-Zellen werden auf einen Harvester- Filter (Flow Labs.) unter Verwendung eines Titertek-Cell-Harvester (Flow Labs.) gesammelt. Die Radioaktivität des in die Zellen eingebauten ³H-Thymidins wird gezählt. Die LAF-Aktivität (LAF = Lymphocyten aktivierender Faktor) wird durch die Steigerung des ³H-Thymidin-Einbaus im Vergleich zum ³H- Thymidin-Einbau einer Kontrolle unter Verwendung des Mediums anstelle einer Testprobe bestimmt.
Das vorstehende Verfahren wurde in allen nachstehenden Beispielen als Test für die IL-1-Aktivität verwendet.
Eine 320-fach verdünnte Lösung des wie vorstehend hergestellten Überstands zeigte einen Einbau von etwa 15 000 bis 18 000 cpm ³H-Thymidin. Dies weist darauf hin, daß das Poly (A) mRNA-Präparat IL-1-mRNA enthält.

(2) Synthese von cDNA

Komplementäre DNA wurde gemäß dem Verfahren von Gubler und Hoffman [Gene 25 (1983), 263] unter Verwendung der im vorstehenden Abschnitt (1) erhaltenen Poly(A)mRNA als Matrize synthetisiert.
6 ug Poly(A)mRNA wurden in 6 ul destilliertem Wasser gelöst und sodann mit 0,6 ul 100 mM Methylquecksilberhydroxidlösung versetzt. Nach zehnminütigem Stehenlassen bei Raumtemperatur wurden 1,7 ul einer 500 mM 2-Mercaptoethanollösung, die 20 Einheiten Ribonuclease-Inhibitor (RNasin®, Produkt von Promega Biotech, USA) enthielt, zum Gemisch zugefügt. Nach fünfminütigem Stehenlassen bei Raumtemperatur wurden 32 ul 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,3) zum Gemisch zugefügt, der 10 mM MgCl&sub2;, 1,25 mM dGTP, 1,25 mM dATP, 1,25 mM dTTP, 0,5 mM dCTP, 170 nM α-³²P-dCTP (spezifische Radioaktivität 750 Ci/mMol), 4 ug Oligo(dT)&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; und 120 Einheiten reverse Transkriptase von AMV enthielt, und das Ganze 60 Minuten bei 42ºC inkubiert. Die Umsetzung wurde durch Zusatz von EDTA abgestoppt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Phenol/Chloroform (1 : 1) extrahiert und Ammoniumacetat zur wäßrigen Phase bis zu einer Endkonzentration von 2,5 M zugefügt. Das resultierende sscDNA- mRNA-Hybrid wurde aus der wäßrigen Phase durch Ethanolfällung gewonnen. Der sscDNA-mRNA-Hybrid-Niederschlag wurde in 100 ul 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) gelöst, der 5 mM MgCl&sub2;, 10 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 100 mM KCl, 0,15 mM β-Nikotinamidadenindinucleotid, 5 ug Rinderserumalbumin, jeweils 0,04 mM der 4 Desoxyribonucleotidtriphosphate dGTP, dATP, dTTP und dCTP, 1,25 Einheiten E. coli-Ribonuclease H und 24 Einheiten E. coli-DNA-Polymerase I enthielt. Das Reaktionsgemisch wurde 60 Minuten bei 12ºC inkubiert und sodann 2,5 Einheiten E. coli-DNA-Ligase zugefügt und das Ganze zur Synthese einer dscDNA weitere 60 Minuten bei 22ºC inkubiert. Die Umsetzung wurde durch Zusatz von EDTA abgestoppt. Die dscDNA wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert und wie vorstehend erwähnt durch Ethanolfällung gewonnen.

(3) Herstellung von cDNA mit Oligo(dC)-Schwanz

Die wie vorstehend erhaltene dscDNA wurde in 100 ul 100 mM Natriumkakolydat-Puffer (pH 7,2) gelöst, der 2 mM CoCl&sub2;, 0,2 mM Dithiothreit, 0,1 mM α-³²P-dCTP (spezifische Radioaktivität 1 Ci/mMol) und 100 Einheiten terminale Desoxynucleotidyl-Transferase enthielt, und 30 Minuten bei 37ºC inkubiert, wobei die Addition von Oligo(dC)-Schwänzen an die 3'-Termini von dscDNA stattfand.
Die Umsetzung wurde durch Zusatz von EDTA abgestoppt. Die dscDNA mit Oligo(dC)-Schwanz wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert und durch Ethanolfällung gewonnen. Die dscDNA mit Oligo(dC)-Schwanz wurde in 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,4) gelöst, der 1 mM EDTA und 100 mM NaCl enthielt, so daß die Lösung 2 ug der dscDNA mit Oligo(dC)-Schwanz pro ml enthielt.

(4) Konstruktion von rekombinanten Plasmiden

pBR322-DNA mit Oligo(dG)-Schwanz (Produkt von Bethesda Res. Labs. Inc., USA) und die im vorstehenden Abschnitt (3) erhaltene dscDNA mit Oligo(dC)-Schwanz wurden in 10 mM Tris- HCl-Puffer (pH 7,4), der 1 mM EDTA und 100 mM NaCl enthielt, so gelöst, daß die Lösung 1,5 ug beziehungsweise 0,09 ug in einem Gesamtvolumen von 1,5 ml enthielt.
Das Gemisch wurde nacheinander 10 Minuten bei 65ºC, 2 Stunden bei 57ºC und 2 Stunden bei 45ºC inkubiert, wobei die Anelierung durchgeführt und rekombinante Plasmide konstruiert wurden.

(5) Selektion von Transformanten

Der E. coli-Stamm χ 1776 wurde mit den vorstehend erhaltenen rekombinanten Plasmiden transformiert.
Hierfür wurde E. coli χ 1776 bei 37ºC in 20 ml L-Brühe gezüchtet (Zusammensetzung: 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 5 g NaCl und 1 g Glucose pro Liter, pH 7,2), die mit 100 ug/ml Diaminopimelinsäure und 40 ug/ml Thymidin angereichert war, bis eine Trübung von 0,5 bei 600 nm erreicht war. Die Zellen wurden bei 4ºC abzentrifugiert und mit 10 ml 10 mM-Tris-HCl- Puffer (pH 7,3), der 50 mM CaCl&sub2; enthielt, gewaschen. Die Zellen wurden in 2 ml des gleichen Puffers wie vorstehend resuspendiert und 5 Minuten bei 0ºC stehengelassen. 0,2 ml der Zellsuspension wurden mit 0,1 ml der wie vorstehend erhaltenen Lösung des rekombinanten Plasmids versetzt. Das Gemisch wurde 15 Minuten bei 0ºC stehengelassen und anschließend 2 Minuten bei 42ºC gehalten. Sodann wurden 0,5 ml der vorstehend verwendeten angereicherten L-Brühe zugefügt und die Züchtung eine Stunde unter Schütteln durchgeführt. Ein Aliquot der Kultur wurde abgenommen, auf die Agarplatte mit angereicherter L- Brühe, die 15 ug/ml Tetracyclin enthielt, ausgestrichen und etwa 12 Stunden bei 37ºC gezüchtet. Durch Selektierung der gegenüber Tetracyclin resistenten Transformanten wurde eine cDNA-Bank hergestellt.

(6) Clonierung

Diejenigen Transformanten, die die rekombinanten Plasmide beinhalteten, die die menschliches IL-1 codierenden cDNAs enthielten, wurden aus der im vorstehenden Abschnitt (5) erhaltenen cDNA-Bank durch den Koloniehybridisierungstest unter Verwendung der in Beispiel 2 erhaltenen, das Kaninchen-IL-1 codierenden, clonierten cDNA als Sonde selektiert.
Hierfür wurde die clonierte cDNA (etwa 1,1 kBp), die Kaninchen-IL-1 codiert, aus dem rekombinanten Plasmid pRLls, wie in Beispiel 2-(6) gezeigt, durch Spaltung mit der Restriktionsendonuclease PstI isoliert und mit ³²P markiert. Diese markierte cDNA wurde als Sonde zum Absuchen der cDNA-Bank eingesetzt, wodurch solche Transformanten durch den Koloniehybridisierungs-Test wie vorstehend erwähnt selektiert wurden, die ein Plasmid aufwiesen, welches die das menschliche IL-1 codierende cDNA enthielt.
Fünf Clone, die eine cDNA aufwiesen, welche mit der markierten Sonde stark hybridisierte, wurden aus etwa 20 000 Clonen selektiert. Ferner wurden 2 Clone selektiert, die die rekombinanten Plasmide beinhalteten, welche cDNA mit 2 kBp oder darüber enthielten, und diese dem mRNA Hybridisierung- Translations-Test unterworfen. Die Plasmid-DNA wurde aus jedem der selektierten Clone extrahiert und nach Hitzedenaturierung auf Nitrocellulosefilter fixiert. Die im vorstehenden Abschnitt (1) erhaltene Poly(A)mRNA-Fraktion, die menschliche IL-1-mRNA enthielt, wurde zu den Filtern zugegeben und zur Durchführung der Hybridisierung 5 Stunden bei 50ºC inkubiert. Die hybridisierte mRNA wurde gewonnen und in die Oocyten von Xenopus laevis injiziert, wodurch festgestellt wurde, ob die gewonnene mRNA IL-1-mRNA war. Durch diesen Test wurde bestätigt, daß jeder dieser zwei Clone cDNA enthielt, die eine starke Hybridisierung mit menschlicher IL-1-mRNA zeigte.
Von diesen zwei Clonen wurde ein Clon für die Sequenzierung der clonierten cDNA selektiert, der ein rekombinantes Plasmid beinhaltete, welches eine cDNA mit einer Größe von etwa 2,1 kBp enthielt (bezeichnet mit Plasmid Nr. pHL4; Clon Nr. v1776/pHL4).

(7) Bestimmung der Nucleotidsequenz der clonierten cDNA

Die im vorstehenden Abschnitt (6) selektierte Transformante (v1776/pHL4) wurde in L-Brühe gezüchtet, die mit Diaminopimelinsäure und Thymidin angereichert war. Die Zellen wurden gemäß dem Verfahren von Wilkie et al. [Nucleic Acids Res. 7 (1979), 859] behandelt, wodurch eine Plasmid-DNA erhalten wurde. Die Plasmid-DNA wurde mit der Restriktionsendonuclease PstI gespalten und gereinigt, wodurch eine clonierte cDNA-Insertion erhalten wurde. Die clonierte cDNA wurde mit einer einzigen oder zwei der folgenden Restriktionsendonucleasen weiter gespalten, SacI, RsaI, HindIII, HincII, Fnu4HI, HinfI, Ball und EcoRI. Die resultierenden cDNA-Fragmente mit einer Größe von etwa 150 bis 700 Bp wurden isoliert und zur Bestimmung ihrer Nucleotidsequenzen eingesetzt.
Die Bestimmung der Nucleotidsequenzen wurde nach dem Didesoxyverfahren gemäß der Vorschrift von "M13 Cloning and Sequencing Handbook", (Amersham International Plc.), unter Verwendung des M13-Sequenzierungs-Kits (Amersham International Plc.) und von M13mp18 und M13mp19 (Produkt von P-L Biochemicals) als Clonierungsvektor durchgeführt.
Tabelle 5 zeigt die Nucleotidsequenz, die das menschliche IL-1 codiert, und die aus der Nucleotidsequenz abgeleitete Aminosäuresequenz, worin das Codon von Base Nr. 1 bis Base Nr. 3 ein Initiationscodon ATG und das Codon von Base Nr. 814 bis Base Nr. 816 ein Stoppcodon TAG darstellt.
Die das menschliche IL-1 codierende Nucleotidsequenz codiert sein Precursor-Polypeptid, das aus 271 Aminosäuren besteht (Aminosäuren Nr. 1-271 in Tabelle 5). Das reife menschliche IL-1-Polypeptid ist ein Polypeptid, das den 159 Aminosäuren vom C-Terminus seines Precursors entspricht und von der Nucleotidsequenz von Base Nr. 337 bis Base Nr. 813 in Tabelle 5 codiert wird.

Beispiel 2

Clonierung und Sequenzierung von cDNA, die Kaninchen-IL-1 codiert

(1) Herstellung von Kaninchen-IL-1-mRNA aus alveolären Makrophagenzellen des Kaninchens

Kaninchen mit einem Gewicht von etwa 2,5 bis 3,0 kg erhielten intravenöse Injektionen mit abgetöteten Zellen von Propionibacterium acnes in einer Dosierung von 100 mg pro Kaninchen und wurden 8 Tage später getötet. Die Lungen wurden wiederholt über einen in die Luftröhre der Tiere eingeführten Schlauch mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen und die alveolären Makrophagen gesammelt. Die alveolären Makrophagen wurden in RPMI-1640-Medium, das 10% fetales Rinderserum enthielt, suspendiert und in Petri-Schalen (8 cm Durchmesser) mit einer Zelldichte von 1 · 10&sup7; Zellen/Schale ausgesät. Sie wurden in einer vollständig feuchten Atmosphäre, die 5% Kohlendioxid enthielt, bei 37ºC vorgezüchtet. Nach einer Stunde Züchtung wurden LPS, TPA (Phorbol-12-myristat-13-acetat) und Cycloheximid zu den Schalen zugegeben, so daß Endkonzentrationen von 10 ug/ml, 10 ng/ml bzw. 1 ug/ml erhalten wurden. Die Züchtung wurde weitere vier Stunden fortgesetzt. Das Kulturmedium wurde abgesaugt und die an den Schalen haftenden Makrophagen in einer 6 M Guanidiniumthiocyanatlösung, die 0,5% Natrium-N-lauroylsarcosinat, 5 mM Natriumcitrat und 0,1 M 2- Mercaptoethanol enthielt, lysiert und homogenisiert. Das Homogenisat wurde auf ein Kissen aus einer 5,7 M Cäsiumchloridlösung, die 0,1 M EDTA enthielt, aufgetragen und 20 Stunden bei 26 500 UpM unter Verwendung einer Ultrazentrifuge (RPS27-2-Rotor, Hitachi Koki) zentrifugiert, wodurch eine Gesamt-RNA- Fraktion als Pellets erhalten wurde. Die Pellets wurden in einer kleinen Menge einer 7 M Harnstofflösung, die 0,35 M NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,4) und 20 mM EDTA enthielt, gelöst und durch Ethanolfällung gewonnen. Die Gesamt-RNA-Fraktion wurde in 2 ml TE-Lösung gelöst und die Lösung 5 Minuten bei 65ºC erhitzt. Eine NaCl-Lösung wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,5 M zugegeben und die Lösung auf eine Säule mit Oligo(dT)-Cellulose aufgetragen, die vorher mit der 0,5 M NaCl enthaltenden TE-Lösung äquilibriert worden war. Poly(A)mRNA wurde mit der TE-Lösung von der Säule eluiert. Die Poly(A)mRNA wurde aus 1,3 · 10 &sup9; alveolären Makrophagenzellen des Kaninchens mit einer Ausbeute von etwa 300 ug erhalten.
Die resultierende Poly(A)mRNA wurde einer Agarosegelelektrophorese (Gelkonzentration 1%, in Gegenwart von 6 M Harnstoff bei pH 4) gemäß dem Verfahren von Lehrach et al. [Biochemistry 16 (1977), 4743] unterworfen und die Poly(A)mRNA- Fraktion, die die Kaninchen-IL-1-mRNA enthielt, aus derjenigen Gelfraktion, die etwa einer Größe von 2,6 bis 3,7 kB entsprach, nach dem Verfahren von Gray et al. [Nature 295 (1982), 503] gewonnen (nachstehend als "angereicherte Poly(A)mRNA" bezeichnet). Aus 200 ug Poly(A)mRNA wurden etwa 34 ug angereicherte Poly(A)mRNA erhalten.
Die angereicherte Poly(A)mRNA wurde in destilliertem Wasser mit einer Konzentration von 0,2 ug/ul gelöst, sodann die Lösung in die Oocyten von Xenopus laevis in einer Dosierung von etwa 50 nl pro Oocyte injiziert und die zehn Oocyten in 100 ul Barth-Medium [J. B. Gurdon, J. Embryol. Exp. Morphol. 20 (1968), 401] 24 Stunden bei 22ºC inkubiert. Die Oocyten wurden homogenisiert und zentrifugiert. Der Überstand wurde auf IL-1-Aktivität getestet.
Jede der 100-fachen und 400-fachen Verdünnungen des wie vorstehend hergestellten Überstandes zeigte einen ³H-Thymidin- Einbau in die Mausthymocyten von 7 979 cpm bzw. 2 187 cpm. Dies weist darauf hin, daß das angereicherte Poly(A)mRNA-Präparat IL-1-mRNA enthält.

(2) Synthese von cDNA

Komplementäre DNA wurde gemäß dem Verfahren von Gubler und Hoffman [Gene 25 (1983), 263] unter Verwendung der im vorstehenden Abschnitt (1) erhaltenen angereicherten Poly(A)mRNA als Matrize synthetisiert.
4 ug der angereicherten Poly(A)mRNA wurden in 50 ul 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,3) gelöst, der 10 MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreit, 4 mM Natriumpyrophosphat, 1,25 mM dGTP, 1,25 mM dATP, 1,25 mM dTTP, 0,5 mM dCTP, 170 nM α-³²P-dCTP (spezifische Radioaktivität 750 Ci/mMol), 5 ug Qligo(dT)&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; und 120 Einheiten der aus AMV stammenden reversen Transkriptase enthielt, und 60 Minuten bei 42ºC inkubiert. Die Umsetzung wurde durch Zusatz von EDTA abgestoppt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Phenol/Chloroform (1 : 1) extrahiert und zur wäßrigen Phase Ammoniumacetat bis zu einer Endkonzentration von 2,5 M zugefügt. Das resultierende SscDNA-mRNA-Hybrid wurde aus der wäßrigen Phase durch Ethanolfällung gewonnen. Der Niederschlag des sscDNA-mRNA-Hybrids wurde in 100 ul 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) gelöst, der 5 mM MgCl&sub2;, 10 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 100 mM KCl, 0,15 mM β-Nicotinamidadenindinucleotid, 5 ug Rinderserumalbumin, jeweils 0,04 mM von jedem der vier Desoxyribonucleotidtriphosphate dGTP, dATP, dTTP und dCTP, 12,5 Einheiten E. coli-Ribonuclease H und 50 Einheiten E. coli-DNA-Polymerase I enthielt. Das Reaktionsgemisch wurde 60 Minuten bei 12ºC und sodann weitere 60 Minuten bei 22ºC inkubiert, wobei eine dscDNA synthetisiert wurde. Die Umsetzung wurde durch Zusatz von EDTA abgestoppt. Die dscDNA wurde mit Chloroform/Phenol extrahiert und durch Ethanolfällung gewonnen, wie vorstehend erwähnt.

(3) Herstellung von cDNA mit Oligo(dC)-Schwanz

Die wie vorstehend erhaltene dscDNA wurde in 100 ul 100 mM Natriumkakodylat-Puffer (pH 7,2) gelöst, der 2 mM CoCl&sub2;, 0,2 mM Dithiothreit, 0,1 mM α-³²P-dCTP (spezifische Radioaktivität 1 Ci/mMol) und 10 Einheiten terminale Desoxynucleotidyl-Transferase enthielt, und 30 Minuten bei 37ºC inkubiert, wobei die Addition von Oligo(dC)-Schänzen an die 3'-Termini von dscDNA stattfand.
Die Umsetzung wurde durch Zusatz von EDTA abgestoppt. Die dscDNA mit Oligo(dC)-Schwanz wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert und durch Ethanolfällung gewonnen. Die dscDNA mit Oligo(dC)-Schwanz wurde in 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,4) gelöst, der 1 mM EDTA und 100 mM NaCl enthielt, so daß die Lösung 2 ug der dscDNA mit Oligo(dC)-Schwanz pro ml enthielt.

(4) Konstruktion von rekombinanten Plasmiden

pBR322-DNA mit Oligo(dG)-Schwanz (Produkt von Bethesda Res. Labs. Inc., USA) und die im vorstehenden Abschnitt (3) erhaltene dscDNA mit Oligo(dC)-Schwanz wurden in 10 mM Tris- HCl-Puffer (pH 7,4), der 1 mM EDTA und 100 mM NaCl enthielt, so gelöst, daß die Lösung davon 1,5 ug beziehungsweise 0,09 ug in einem Gesamtvolumen von 1,5 ml enthielt.
Das Gemisch wurde nacheinander 10 Minuten bei 65ºC, 2 Stunden bei 57ºC und 2 Stunden bei 45ºC inkubiert, wobei die Anelierung durchgeführt und rekombinante Plasmide konstruiert wurden.

(5) Selektion von Transformanten

Der E. coli-Stamm v1776 wurde mit den vorstehend erhaltenen rekombinanten Plasmiden transformiert.
Hierfür wurde E. coli v1776 bei 37ºC in 20 ml L-Brühe gezüchtet (Zusammensetzung: 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 5 g NaCl und 1 g Glucose pro Liter, pH 7,2), die mit 100 ug/ml Diaminopimelinsäure und 40 ug/ml Thymidin angereichert war, bis eine Trübung bei 600 nm von 0,5 erreicht war. Die Zellen wurden bei 4ºC abzentrifugiert und mit 10 ml 10 mM-Tris-HCl- Puffer (pH 7,3), der 50 mM CaCl&sub2; enthielt, gewaschen. Die Zellen wurden in 2 ml des gleichen Puffers wie vorstehend resuspendiert und 5 Minuten bei 0ºC stehengelassen. 0,2 ml der Zellsuspension wurden mit 0,1 ml der wie vorstehend erhaltenen Lösung des rekombinanten Plasmids versetzt. Das Gemisch wurde 15 Minuten bei 0ºC stehengelassen und anschließend 2 Minuten bei 42ºC gehalten. Sodann wurden 0,5 ml der vorstehend verwendeten angereicherten L-Brühe zugefügt und die Züchtung eine Stunde unter Schütteln durchgeführt. Ein Aliquot der Kultur wurde abgenommen, auf die angereicherte L-Brühe-Agarplatte, die 15 ug/ml Tetracyclin enthielt, ausgestrichen und etwa 12 Stunden bei 37ºC gezüchtet. Durch Selektion der gegenüber Tetracyclin resistenten Transformanten wurde eine cDNA-Bank hergestellt.

(6) Clonierung

Mit dem Ziel, die cDNA-Bank nach Transformanten abzusuchen, die ein Plasmid beinhalteten, das die Kaninchen-IL-1 codierende cDNA enthielt, wurde der Koloniehybridisierungs-Test nach dem Verfahren von Hanahan und Meselson [Gene 10 (1980), 63] durchgeführt, wobei eine ³²P-markierte Plus-InduktioncDNA-Sonde und eine solche Minus-Induktion-Sonde verwendet wurde. Die ³²P-markierten Plus-Induktion- und Minus-InduktionsscDNA-Sonden wurden jeweils nach dem im vorstehenden Abschnitt (2) beschriebenen Verfahren synthetisiert, wobei als Matrize die angereicherte Poly(A)mRNA-Fraktion verwendet wurde, die jeweils durch die Säure-Harnstoff-Agarosegelelektrophorese aus den nach dem im vorstehenden Abschnitt (1) beschriebenen Verfahren mit LPS, TPA und Cycloheximid induzierten alveolären Makrophagen und aus den nichtinduzierten alveolären Makrophagen fraktioniert worden war. Durch diesen Test wurden Kolonien von Transformanten selektiert, die die rekombinanten Plasmide beinhalteten, die eine starke Hybridisierung mit einer Plus-Induktion-Sonde zeigten, die jedoch keine Hybridisierung mit der Minus-Induktion-Sonde zeigten. Aus etwa 5000 Kolonien wurden 648 Kolonien selektiert.
Zehn Gruppen der selektierten Kolonien (umfassend 10 Kolonien in jeder Gruppe) wurden sodann dem mRNA-Hybridisierungs-Translations-Test nach dem in T. Maniatis et al., (Hrsg.) "Molecular Cloning", 329 (1980), Cold Spring Harbor Lab., beschriebenen Verfahren unterworfen. Die Plasmid-DNAs wurden aus jeder Gruppe extrahiert, durch Spaltung mit der Restriktionsendonuclease EcoRI linearisiert und nach Hitzedenaturierung an Nitrocellulosefilter fixiert. Die im vorstehenden Abschnitt (1) erhaltene Poly(A)mRNA-Fraktion, die die Kaninchen-IL-1-mRNA enthielt, wurde zum Filter zugegeben und zur Durchführung der Hybridisierung fünf Stunden bei 50ºC inkubiert. Die hybridisierte mRNA wurde gewonnen und in die Oocyten von Xenopus laevis injiziert, wodurch festgestellt wurde, ob die gewonnenen mRNA Kaninchen-IL-1-mRNA war. Als Ergebnis dieses Tests wurde gefunden, daß eine Gruppe (mit H- 1603 bezeichnet) Plasmide aufwies, die cDNA enthielten, die eine starke Hybridisierung mit der Kaninchen-IL-1-mRNA zeigten (vgl. Fig. 1-A). Jeder Clon der Gruppe H-1603 wurde außerdem dem mRNA-Hybridisierungs-Translations-Test wie vorstehend unterworfen, wobei gefunden wurde, daß ein Clon mit Kaninchen- IL-1-mRNA stark hybridisierte (vgl. Fig. 1-B). Dieser selektierte Clon wurde mit pRLls bezeichnet. Die cDNA-Insertion wurde aus dem rekombinanten Plasmid pRL15 durch Spaltung mit der Restriktionsendonuclease PstI ausgeschnitten und mit 32 markiert. Unter Verwendung dieser ³²P-markierten cDNA als Sonde wurden die 648 wie vorstehend selektierte Kolonien erneut durch den Koloniehybridisierungs-Test abgesucht. Als Ergebnis dieses Test zeigten 8 Clone eine Hybridisierung mit der ³²P-markierten cDNA-Sonde.

(7) Bestimmung der Nucleotidsequenz der clonierten cDNA

Das rekombinante Plasmid pRL15 wurde mit der Restriktionsendonuclease PstI gespalten und gereinigt, wodurch eine clonierte cDNA-Insertion erhalten wurde. Die clonierte cDNA wurde weiter mit einer einzigen oder zwei verschiedenen der folgenden Restriktionsendonucleasen, HaeIII, HincII, AccI, PvuII, AvaII und RsaI, gespalten. Die resultierenden cDNA- Fragmente mit einer Größe von etwa 100 bis 600 Bp wurden zur Bestimmung der Nucleotidsequenz verwendet.
Die Bestimmung der Nucleotidsequenzen wurde nach dem Didesoxyverfahren gemäß der Vorschrift in "M13 Cloning and Sequencing Handbook" (Amersham International Plc.), unter Verwendung eines M13-Sequenzierungs-Kits (Amersham International Plc.) und von M13mp18 und M13mp19 (Produkt von P-L Biochemicals) als Clonierungsvektor durchgeführt.
Tabelle 7 zeigt die Nucleotidsequenz und die von der das Kaninchen-IL-1 codierenden Nucleotidsequenz abgeleitete Aminosäuresequenz.
Das Codon von Base Nr. 1 bis Base Nr. 3 ist das Initiationscodon ATG und das Codon von Base Nr. 802 bis Base Nr. 804 ist das Stoppcodon TAA. Die das Kaninchen-IL-1 codierende DNA codiert sein Precursor-Polypetid, das aus 267 Aminosäureresten besteht (Aminosäure Nr. 1 bis 267 in Tabelle 7). Das reife Kaninchen-IL-1-Polypeptid ist ein Polypeptid, das den 155 Aminosäuren vom C-Terminus seines Precursors aus entspricht und von der Nucleotidsequenz von Base Nr. 337 bis Base Nr. 801 in der Tabelle 7 codiert wird.
Die Homologie zwischen den Nucleotidsequenzen, die menschliches und Kaninchen-IL-1-Precursor-Polypeptid codieren, und die Homologie zwischen den daraus abgeleiteten Aminosäuresequenzen von menschlichem und Kaninchen-IL-1-Precursor-Polypeptid werden in Tabelle 8-1 bzw. 8-2 gezeigt. Die Homologien in den Nucleotidsequenzen und Aminosäuresequenzen machen etwa 79% bzw. 64% aus.

Beispiel 3

Clonierung und Sequenzierung des menschlichen genomischen IL-1-Gens

Das menschliche genomische IL-1-Gen wurde herausgesucht aus der menschlichen Genombank, den mit HaeIII-AluI gespaltenen menschlichen DNA-Fragmenten, eingefügt in den Bakteriophagen Charon 4A, zur Verfügung gestellt von Dr. T. Maniatis [Harvard University, Department of Biochemistry and Molecular Biology, USA; Lawn, R. M. et al., Cell 15 (1978), 1157], durch das Plaquehybridisierungs-Verfahren von Benton und Davis [Science 196 (1977), 180] unter Verwendung des wie nachstehend hergestellten ³²P-markierten DNA-Fragments als Sonde. Aus dem in Beispiel 1-(6) erhaltenen rekombinanten Plasmid pHL4 wurde das DNA-Fragment mit einer Größe von etwa 847 Bp, das dem stromabwärts von Base Nr. 5 liegenden Bereich in Tabelle 5 entsprach, durch eine doppelte Spaltung mit den Restriktionsendonucleasen Ball und HincII ausgeschnitten und durch das Verfahren der Nick-Translation mit ³²P markiert.
Als Ergebnis wurden sechs Phagenclone, die die stark mit der Sonde hybridisierende Nucleotidsequenz enthielten, aus der Bank von etwa 600 000 Phagenplaques isoliert. Diese Clone wurden weiter nach Clonen abgesucht, die alle Exons des menschlichen IL-1-Gens abdeckten, wobei das Hybridisierungsverfahren unter Verwendung des ³²P-markierten DNA-Fragments (mit einer Größe von etwa 1,1 kBp) als Sonde eingesetzt wurde, das mit den Restriktionsendonucleasen HincII und HindIII aus der cDNA- Insertion des in Beispiel 1-(6) erhaltenen rekombinanten Plasmids pHL4 herausgeschnitten wurde. Das vorstehende HincII- HindIII-DNA-Fragment enthält den größten Teil des 3'-nichtcodierenden Bereichs der menschlichen IL-1-cDNA. Von sechs, wie vorstehend selektierten Clonen zeigten vier Clone eine starke Hybridisierung mit dieser Sonde. Die rekombinante Phagen-DNA wurde aus jedem Clon isoliert und durch Kartierung mittels Restriktionsendonuclease charakterisiert. Ein Clon (λXHL#4) wurde zur Nucleotidsequenzierung selektiert.
Fig. 2 zeigt die Struktur des menschlichen chromosomalen IL-1-Gens, einschließlich Exons und Introns. Tabelle 6 zeigt die Nucleotidsequenz in den Bereichen, die den menschlichen IL-1-Precursor codieren, und die Aminosäuresequenz, die dem menschlichen IL-1-Precursor entspricht. In dieser Tabelle wurden die Intronbereiche durch gepunktete Linien dargestellt.
Die vorstehend erhaltene, das menschliche IL-1 codierende Nucleotidsequenz stimmt vollständig mit der Nucleotidsequenz der das menschliche IL-1 codierenden, clonierten cDNA, überein, die in Beispiel 1 beschrieben wird.

Beispiel 4

Herstellung des menschlichen IL-1-Polypeptids

(1) Konstruktion von Transformanten, die menschliches IL-1 herstellen

Ein Expressionsplasmid zur Herstellung von menschlichem IL-1 wurde unter Verwendung eines trp-Promotors konstruiert, wie in Fig. 3-5 dargestellt.
Die das menschliche IL-1 codierende cDNA wurde aus dem rekombinanten Plasmid pHL4 isoliert, wie in Beispiel 1-(6) beschrieben. 20 ug der cDNA wurden in 100 ul 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) gelöst, der 50 mM NaCl, 6 mM MgCl&sub2; und 6 mM 2- Mercaptoethanol enthielt, sodann mit 240 Einheiten Restriktionsendonuclease HindIII versetzt und 60 Minuten bei 37ºC inkubiert. Anschließend wurden 100 ul 0,2 M NaCl und 100 Einheiten der Restriktionsendonuclease ScaI zugegeben und das Ganze weitere 60 Minuten bei 37ºC inkubiert. Am Ende der Inkubation wurde NaCl zum Reaktionsgemisch zum Erhalt einer Endkonzentration von 0,3 M zugesetzt und die resultierenden DNA- Fragmente durch Fällung mit 2 Volumina Ethanol gewonnen. Ein etwa 1,6 kBp großes DNA-Fragment, das einen menschliches IL-1 codierenden Bereich enthielt, wurde durch 5% Polyacrylamidgelelektrophorese isoliert, wobei etwa 5 ug erhalten wurden.
Dieses DNA-Fragment wurde mit einem chemisch synthetisierten Oligodesoxyribonucleotid-Adaptor durch T4-Ligase ligiert.
Der synthetische Adaptor wird durch die folgende Formel dargestellt.
Das resultierende DNA-Fragment wird als HIL-Adaptor-Fragment bezeichnet.
Der trp-Promotor-Bereich wurde aus dem trp-Promotor-Vektor pDR720 [Russell, D. R., et al., Gene 20 (1982), 231; Produkt von P-L Biochemicals] durch doppelte Spaltung mit den Restriktionsendonucleasen EcoRI und HpaI ausgeschnitten und ein 35 Bp großes DNA-Fragment isoliert, das den trp-Promotor-Bereich enthielt. Ein synthetischer Adaptor, der durch die nachstehende Formel dargestellt wird, wurde unter Verwendung von T4-Ligase an das glatte Ende des 35 Bp großen DNA-Fragments ligiert. Das resultierende DNA-Fragment wird hierin nachstehend als "tr"-Promotor-Fragment" bezeichnet.
Getrennt davon wurden 20 ug des Plasmids pBR322 in 100 ul 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) gelöst, der 50 mM NaCl, 6 mM MgCl&sub2;, 6 mM 2-Mercaptoethanol und 180 Einheiten der Restriktionsendonuclease HindIII enthielt, und 60 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die resultierende DNA wurde durch Extraktion mit Phenol/Chloroform und Ethanolfällung gewonnen. Dieses DNA- Fragment wurde sodann in 20 ul TE-Lösung gelöst. 10 ul der Lösung wurden mit 40 ul 62,5 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,2) versetzt, der 12,5 mM MgCl&sub2;, 0,125 mM Dithiothreit, 0,25 mM dGTP, 0,25 mM dATP, 0,25 mM dTTP, 0,25 mM dCTP, 2,5 ug Rinderserumalbumin und 2,6 Einheiten E. coli-DNA-Polymerase I (großes Fragment) enthielt, und 60 Minuten bei 20ºC inkubiert. Das resultierende DNA-Fragment wurde durch Extraktion mit Phenol/Chloroform und Ethanolfällung gewonnen. Das DNA-Fragment wurde in 20 ul TE-Lösung gelöst. Das vorstehende Verfahren ergab ein linearisiertes doppelsträngiges DNA-Fragment, dieses wurde mit der Restriktionsendonuclease HindIII gespalten und sodann beide Enden in glatte Enden überführt. Anschließend wurde das DNA-Fragment mit der Restriktionsendonuclease EcoRI in zwei Fragmente gespalten. Ein größeres DNA-Fragment (etwa 4,3 kBp), das das Ampicillin-Resistenz-Gen enthielt, wurde isoliert (nachstehend als "pBR322-Ampr-Fragment" bezeichnet) u Das vorher hergestellte HIL-Adaptor-Fragment wurde mit dem trp-Promotor-Fragment an den ClaI-kohäsiven Enden dieser zwei Fragmente durch T4-Ligase ligiert. Das resultierende DNA- Fragment, das ein EcoRI-kohäsives Ende und ein glattes Ende aufwies, wurde mit dem pBR322-Ampr-Fragment durch T4-Ligase ligiert, wodurch ein Expressionsplasmid (pHLp101) zur Herstellung von menschlichem IL-1 konstruiert wurde.
Das resultierende Expressionsplasmid pHLP101 wurde nach dem folgenden Verfahren in E. coli HB101 eingeführt.
E. coli HB101 wurde in 5 ml L-Brühe eingeimpft und über Nacht bei 37ºC gezüchtet. 1 ml der resultierenden Kultur wurde in 100 ml L-Brühe eingeimpft und die Züchtung bei 37ºC fortgesetzt, bis die Trübung der Kultur bei 650 nm den Wert 0,6 erreichte. Nach 30-minütigem Stehenlassen in Eiswasser wurden die Zellen abzentrifugiert, sodann in 50 ml 50 mM Cacl&sub2; suspendiert und 60 Minuten bei 0ºC stehengelassen. Anschließend wurden die Zellen abzentrifugiert und erneut in 10 ml 50 mM CaCl&sub2;&sub1; das 20% Glycerin enthielt, suspendiert.
Das Expressionsplasmid pHLP101 wurde mit dem wie vorstehend mit Calcium behandelten E. coli HB101 gemischt und erst 20 Minuten in Eiswasser, sodann eine Minute bei 42ºC und weitere 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und mit LB-Brühe versetzt. Das Gemisch wurde 60 Minuten bei 37ºC geschüttelt. Ein Aliquot der resultierenden Zellsuspension wurde auf LB- Agarplatten, die 25 ug/ml Ampicillin enthielten, ausgesät und über Nacht bei 37ºC gezüchtet. Anschließend wurden Ampicillinresistente Kolonien selektiert, wodurch Transformanten erhalten wurden. Eine dieser Transformanten wurde HB101/pHLP101 genannt und zur Herstellung von menschlichem IL-1 verwendet.

(2) Herstellung des menschlichen IL-1-Polypeptids

Die Transformante (HB101/pHLP101) wurde über Nacht bei 37ºC in LB-Brühe gezüchtet. 1/10 ml der Kultur wurde in 10 ml modifiziertes M9-Medium (Zusammensetzung: 1,5% Na&sub2;HPO&sub4; 12H&sub2;0, 0,3% KH&sub2;PO&sub4;, 0,05% NaCl, 0,1% NH&sub4;Cl, 2 mg/l Vitamin B&sub1;&sub1; 0,5% Casaminosäure, 2 mM MgSO&sub4;, 0,1 mM CaCl&sub2; und 0,5% Glucose) eingeimpft und eine Stunde bei 37ºC gezüchtet. Anschließend wurde 3-Indolacrylsäure bis zu einer Endkonzentration von 20 ug/ml zugegeben und die Züchtung weitere 24 Stunden fortgesetzt. Sodann wurden die Zellen abzentrifugiert. Die Zellen wurden in 1 ml 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) suspendiert, der 0,1% Lysozym und 30 mM NaCl enthielt, und 30 Minuten bei 0ºC stehengelassen. Sodann wurden das Einfrieren in einem Trockeneis/Ethanol-Bad und das Auftauen bei 37ºC sechsmal wiederholt. Nach Abzentrifugieren der Zelltrümmer wurde ein klares Lysat erhalten.
Die IL-1-Aktivität des Lysats wurde gemäß dem in Beispiel 1-(1) beschriebenen Verfahren bestimmt.
Eine 16-fach verdünnte Lösung des Lysats zeigte einen ³H- Thymidin-Einbau von 8 103 cpm, dieser Wert entsprach etwa einem dreifachen oder noch höheren Einbau im Vergleich zum Kontrollwert. Er zeigt an, daß das wie vorstehend hergestellte Lysat menschliches IL-1-Polypeptid enthält.
Das Muster der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese des Lysats wurde in Fig. 6 durch Vergleich mit dem Muster des in Beispiel 5-(2) erhaltenen reifen menschlichen IL-1-Polypeptids dargestellt. Man erwartet, daß das von E. coli HB101/pHLP101 erzeugte Produkt ein Polypeptid ist, das aus 209 Aminosäureresten besteht, die der Aminosäure Nr. 63 bis Aminosäure Nr. 271 in Tabelle 5 entsprechen. Das erwartete Molekulargewicht sollte theoretisch 23 642 betragen, sofern das N-terminale Methionin entfernt wurde. Wie in Fig. 6 gezeigt, wurde jedoch in drei Fraktionen eine IL-1-Aktivität nachgewiesen. Der Hauptpeak mit IL-1-Aktivität wurde an der Position nachgewiesen, die 18 Kilodalton (KD) entsprach. Das Polypeptid mit 18 KD könnte das reife menschliche IL-1 sein, das dem Bereich von Aminosäure Nr. 113 bis Aminosäure Nr. 271 in Tabelle 5 entspricht.
Dieses Ergebnis zeigt an, daß das Produkt möglicherweise durch ein Enzym (Enzyme) in E. coli schrittweise in Polypeptide, einschließlich des reifen menschlichen IL-1-Polypeptids, umgewandelt wird.

Beispiel 5

Herstellung von reifem menschlichem IL-1-Polypeptid

(1) Konstruktion einer Transformante, die reifes menschliches IL-1 herstellt

Ein Expressionsplasmid (pHLP383) zur Herstellung des reifen menschlichen IL-1-Polypepitds, das aus 159 Aminosäuren entsprechend den Aminosäuren von Nr. 113 bis Nr. 271, vgl. Figur 5, besteht, wurde konstruiert, wie in Fig. 7 erläutert.
Die clonierte cDNA, die reifes menschliches IL-1 codierte' wurde durch Spaltung mit der Restriktionsendonuclease PstI aus dem rekombinanten Plasmid pHL4 isoliert, wie in Beispiel 1-(6) beschrieben. Die cDNA wurde weiter mit der Restriktionsendonuclease AluI gespalten, wodurch ein DNA-Fragment erhalten wurde, das eine Größe von etwa 533 Bp aufwies und der DNA stromabwärts der Base Nr. 351 in Tabelle 5 entsprach. Ferner wurde das DNA-Fragment mit der Restriktionsendonuclease BstNI gespalten, wodurch das DNA-Fragment isoliert wurde, das der Base Nr. 351 bis Nr. 808 in Tabelle 5 entsprach. Das resultierende DNA-Fragment wurde schrittweise mit den durch die nachstehenden Formeln dargestellten chemisch synthetisierten Oligodesoxyribonucleotid-Adaptoren durch T4-Ligase ligiert.
und
Das DNA-Fragment wurde konstruiert, das das Initiationscodon ATG am 5'-Ende des DNA-Fragments, das das aus 159 Aminosäuren bestehende reife menschliche IL-1-Polypeptid codierte, wie vorstehend erwähnt, und die doppelten Stopp-Codons TGATGA an dessen 3'-Ende aufwies (nachstehend als "HIL-1-Fragment" bezeichnet).
Ein etwa 380 Bp großes DNA-Fragment, das den trp-Promotor-Bereich enthielt, wurde aus dem Plasmid pCT-1 [Ikehara, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), 5956) durch doppelte Spaltung mit den Restriktionsendonucleasen HpaI und AatII ausgeschnitten und isoliert. Das DNA-Fragment wurde mit dem durch die nachstehende Formel dargestellten, chemisch synthetisierten Oligodesoxyribonucleotid-Adaptor durch T4-Ligase ligiert.
Das resultierende DNA-Fragment wurde mit dem vorher hergestellten HIL-1-Fragment durch T4-Ligase ligiert (nachstehend als "Promotor-HIL-1-Fragment" bezeichnet).
Getrennt davon wurde das Plasmid pBR322 mit den Restriktionsendonucleasen AvaI und PvuII gespalten und das resultierende größere DNA-Fragment (mit einer Größe von etwa 3,7 kBp) durch 0,7% Agarosegelelektrophorese isoliert. Nach Auffüllen der kohäsiven Enden mit E. coli-DNA-Polymerase 1 (großes Fragment) und vier verschiedenen Desoxyribonucleotidtriphosphaten zum Erhalt von glatten Enden wurden beide Enden durch T4-Ligase ligiert, wodurch ein neues Plasmid (mit pBRS6 bezeichnet) konstruiert wurde.
Das Plasmid pBRS6 wurde mit den Restriktionsendonucleasen AatII und HindIII in zwei Fragmente gespalten und ein größeres DNA-Fragment (etwa 3,6 kBp) isoliert. Sodann wurde dieses Fragment mit dem vorher hergestellten Promotor-HIL-1-Fragment durch T4-Ligase ligiert, wodurch das Expressionsplasmid pHLP383 hergestellt wurde.
Das resultierende Expressionsplasmid pHLP383 wurde nach dem in Beispiel 4-(1) beschriebenen Verfahren in E. coli HB101 eingeführt. Die Transformante zur Herstellung von reifem menschlichem IL-1 wurde mit HB101/pHLP383 bezeichnet.

(2) Herstellung des reifen menschlichen IL-1-Polypeptids

Die Transformante (HB101/pHLP383) wurde über Nacht in LB- Brühe gezüchtet. 10 ml der Kultur wurden in 1 Liter modifiziertes M9-Medium eingeimpft und eine Stunde bei 37ºC gezüchtet. Anschließend wurde 3-Indolacrylsäure bis zu einer Endkonzentration von 20 ug/ml zugegeben und die Züchtung weitere 24 Stunden fortgesetzt. Sodann wurden die Zellen abzentrifugiert. Die Zellen wurden in 100 ml 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) suspendiert, der 0,1% Lysozym und 30 mM NaCl enthielt, und 30 Minuten bei 0ºC stehengelassen. Sodann wurde die Suspension in einem Trockeneis/Ethanol-Bad eingefroren und bei 37ºC aufgetaut. Nachdem diese Einfrieren-Auftauen-Prozedur sechsmal wiederholt worden war, wurden 2 ml einer 10%igen Polyethyleniminlösung zur Zellsuspension zugefügt und das Ganze stehengelassen. Die Zelltrümmer wurden abzentrifugiert, wodurch ein klarer Extrakt erhalten wurde.
Der Extrakt wurde mit einem gleichen Volumen gesättigter Ammoniumsulfatlösung gemischt. Nach Stehenlassen wurde ein Niederschlag abzentrifugiert. Der Niederschlag wurde in etwa 100 ml 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) gelöst und gegen den gleichen Puffer dialysiert. Das Dialysat wurde auf eine Säule mit DEAE-Sepharose CL-6B aufgetragen, die vorher mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit dem gleichen Puffer gewaschen und mit einem linearen Gradienten von NaCl von 0 bis 0,5 M eluiert. Die Fraktionen mit IL-1-Aktivität wurden gesammelt und vereinigt. Sodann wurde das Ganze durch Ultrafiltration eingeengt und unter Verwendung einer Säule mit Sephacryl S-200 einer Gelfiltration unterworfen. Die Fraktionen mit IL-1-Aktivität wurden gesammelt und vereinigt. Das gereinigte Präparat wurde durch Wiederholen der vorstehenden Arbeitsgänge, d. h. der Säulenchromatographie mit DEAE-Sepharose CL-6B und der Gelfiltration mit Sephacryl 5-200, erhalten.
Schließlich wurden etwa 15 mg des gereinigten menschlichen IL-1-Polypeptids aus dem aus 1 Liter Kultur hergestellten Zellextrakt erhalten.
Durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese-Analyse des gereinigten Präparats wurde nur ein einziges Protein mit IL-1- Aktivität und keinerlei Verunreinigungen nachgewiesen. Die chemischen und physikalisch-chemischen Eigenschaften des gereinigten reifen menschlichen IL-1-Polypeptids waren wie in der vorstehenden Tabelle (a) angegeben.
Die IL-1-Aktivität der Lösung des gereinigten menschlichen IL-1-Polypeptids (etwa 40 ug/ml) wurde bestimmt und die Ergebnisse in der nachstehenden Tabelle zusammengefaßt. Tabelle (d) IL-1-Aktivität Verdünnung der Probe (-fach) eingebautes ³H-Thymidin (cpm) Kontrolle
Das gereinigte reife Il-1-Polypeptid war in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung zu etwa 1% löslich.

(3) Antitumorwirkung des reifen menschlichen IL-1-Polypeptids

Das vorstehend erhaltene gereinigte reife menschliche IL- 1-Polypeptid wurde auf die Antitumorwirkung gegen B-16-Melanom und Meth A-Sarkom, die in Mäuse transplantiert worden waren, untersucht.
Die Antitumorwirkung bei Mäusen, die B-16-Melanome trugen, wurde nach dem folgenden Verfahren getestet.
Weibliche C57BL/6 Mäuse (6 Wochen alt) erhielten intradermale Transplantationen mit 0,1 ml 20% "brei". Am siebten Tag nach der Tumortransplantation wurde das in Beispiel 5-(2) erhaltene reife menschliche IL-1-Polypeptid intramuskulär oder intravenös in die Tumormasse verabreicht. Der Endotoxingehalt des verwendeten Präparats des reifen menschlichen IL-1-Polypeptids betrug weniger als 0,08 ng pro mg Protein.
Als Ergebnis ging das Wachstum der transplantierten B-16- Melanome durch nachfolgende Verabreichung über 7 Tage mit einer Dosis von täglich 3 ug pro Maus in die Tumormasse signifikant zurück, wobei eine Wachstumshemmrate von 79% erhalten wurde. Ferner wurden die transplantierten B-16-Melanome durch Steigerung der Dosis auf den bis zu zehnfachen Wert in 6 von 7 Mäusen vollständig zur Regression gebracht. Sofern die intravenöse und intramuskuläre Injektion einer Dosis von 30 ug pro Maus täglich an 7 Tagen vom siebten Tag nach der Tumortransplantation durchgeführt wurde, wurde das Wachstum des transplantierten B-16-Melanoms signifikant mit Hemmraten von 45% bzw. 68% gehemmt.
Die Antitumorwirkung bei Mäusen, die Meth-A-Sarkome trugen, wurde nach dem folgenden Verfahren getestet.
Weibliche BALB/c-Mäuse (8 Wochen alt) erhielten intradermale Transplantationen von 2 · 10&sup5; Meth-A-Sarkomzellen. Am siebten Tag nach der Tumortransplantation wurde zuerst Indomethacin in einer Dosis von 2 mg/kg oral verabreicht. 30 Minuten später wurde das reife menschliche IL-1-Polypeptid einmal mit einer Dosis von 30 ug pro Maus intramuskulär injiziert und sodann Indomethacin zweimal in der gleichen Dosis 6 und 24 Stunden nach der IL-1-Injektion oral verabreicht.
Als Ergebnis wurde das Wachstum des transplantierten Meth-A-Sarkoms durch Behandlung mit dem reifen menschlichen IL-1-Polypeptid mit und ohne Indomethacin signifikant mit Wachstumshemmraten von 96% bzw. 62% gehemmt. Zu einer vollständigen Regression kam es in 3/7 bzw. 2/7 Fällen.

(4) Antiinfektiöse Wirkung des reifen menschlichen IL-1-Polypeptids

Männliche Std-ddY-Mäuse mit einem Gewicht von jeweils etwa 20 g wurden intraperitoneal mit 1,5 · 10¹ Klebsiella Dneumoniae P-5709-Zellen pro Maus infiziert. Das reife menschliche IL-1-Polypeptid wurde einmal täglich intramuskulär (im) in den angegebenen Dosen an den angegebenen Tagen vor der Infektion, wie in Tabelle (3) dargestellt, injiziert. Die Mortalität wurde 14 Tage nach der Infektion bestimmt.
Reifes menschliches IL-1-Polypeptid zeigte eine prophylaktische und therapeutische Wirkung auf die Infektion, wie in der nachstehenden Tabelle dargestellt. Tabelle (e) Prophylaktische und therapeutische Wirkung auf die experimentelle Infektion
[Anm.]: *) -3T, -1T, Oh und 24h bedeutet die IL-1-Injektion 3 Tage vor der Infektion, 1 Tag vor, unmittelbar nach bzw. 24 Stunden nach der Infektion.

Beispiel 6

Herstellung eines modifizierten Polypeptids des menschlichen IL-1-Polypepids

(1) Konstruktion einer Transformante, die das menschliche IL-1(157) herstellt

Ein Expressionsplasmid (pHLP384) zur Herstellung eines menschlichen IL-1-Polypeptids, das aus 157 Aminosäuren entsprechend den in Tabelle 5 dargestellten Aminosäuren von Nr. 115 bis Nr. 271 besteht und als IL-1(157)-Polypeptid bezeichnet wurde, wurde gemäß dem im wesentlichen gleichen Verfahren wie in Beispiel 5-(1) konstruiert, mit der Ausnahme, daß der nachstehend dargestellte, chemisch synthetisierte Oligodesoxyribonucleotid-Adaptor anstelle des synthetischen Adaptors [c] eingesetzt wurde.
Das resultierende Expressionsplasmid pHLP384 wurde nach dem in Beispiel 4-(1) beschriebenen Verfahren in E. coli HB101 eingeführt. Die Transformante zur Herstellung des menschlichen IL-1 (157) -Polypeptids wurde HB101/pHLP384 genannt.

(2) Herstellung des menschlichen IL-1(157)-Polypeptids

Die Transformante (HB101/pHLP384) wurde über Nacht in LB- Brühe gezüchtet. 10 ml der Kultur wurden in 1 Liter modifiziertes M9-Medium eingeimpft und eine Stunde bei 37ºC gezüchtet. Anschließend wurde 3-Indolacrylsäure bis zu einer Endkonzentration von 20 ug/ml zugesetzt und die Züchtung weitere 24 Stunden fortgesetzt. Sodann wurden die Zellen abzentrifugiert. Die Zellen wurden in 100 ml 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) suspendiert, der 0,1% Lysozym und 30 mM NaCl enthielt, und 30 Minuten bei 0ºC stehengelassen. Danach wurde die Suspension in einem Trockeneis/Ethanol-Bad eingefroren und bei 37ºC aufgetaut. Nachdem diese Einfrieren-Auftauen-Prozedur sechsmal wiederholt worden war, wurden 2 ml einer 10%igen Polyethyleniminlösung zur Zellsuspension zugefügt und das Ganze stehengelassen. Die Zelltrümmer wurden abzentrifugiert, wodurch ein klarer Extrakt erhalten wurde.
Der Extrakt wurde mit dem gleichen Volumen einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung gemischt. Nach Stehenlassen wurde ein Niederschlag abzentrifugiert. Der Niederschlag wurde in etwa 100 ml 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) gelöst und gegen den gleichen Puffer dialysiert. Das Dialysat wurde auf eine Säule mit DEAE-Sepharose CL-6B aufgetragen, die vorher mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit dem gleichen Puffer gewaschen und mit einem linearen Gradienten von NaCl von 0 bis 0,5 M eluiert. Die Fraktionen mit IL-1- Aktivität wurden gesammelt und vereinigt. Sodann wurde das Ganze durch Ultrafiltration eingeengt und unter Verwendung einer Säule mit Sephacryl S-200 einer Gelfiltration unterworfen. Die Fraktionen mit IL-1-Aktivität wurden gesammelt und vereinigt.
Die resultierende Lösung besaß eine IL-1-Aktivität, die beim Test einer 1 · 10&sup4;-fachen Probenverdünnung einen ³H- Thymidin-Einbau von 45 394 cpm zeigte.
Die chemischen und physikalisch-chemischen Eigenschaften des menschlichen IL-1(157)-Polypeptids sind wie in der vorstehend gezeigten Tabelle (b).

Beispiel 7

Herstellung eines modifizierten Polypeptids des menschlichen IL-1-Polypeptids

(1) Konstruktion einer Transformante, die das menschliche IL-1(149) herstellt

Ein Expressionsplasmid (pHLP385) zur Herstellung eines menschlichen IL-1-Polypeptids, das aus 149 Aminosäuren entsprechend den in Tabelle 5 dargestellten Aminosäuren von Nr. 123 bis Nr. 271 besteht und als IL-1(149)-Polypeptid bezeichnet wurde, wurde konstruiert, wie in Fig. 8 erläutert.
Das in Beispiel 5-(1) erhaltene rekombinante Plasmid pHLP383 wurde mit den Restriktionsendonucleasen EcoRI und HindIII gespalten, wobei ein etwa 422 Bp großes DNA-Fragment entsprechend der Nucleotidsequenz des stromabwärts der Base Nr. 398 liegenden Bereichs in Tabelle 5 isoliert wurde. Das resultierende DNA-Fragment wurde mit einem durch die nachstehende Formel dargestellten, chemisch synthetisierten Oligodesoxyribonucleotid-Adaptor durch T4-Ligase ligiert.
Getrennt davon wurde das rekombinante Plasmid pHLP383 mit den Restriktionsendonucleasen ClaI und HindIII gespalten und das resultierende größere DNA-Fragment isoliert, das einen Teil des trp-Promotor-Bereichs, ein Ampicillin-Resistenz-Gen und ein Tetracyclin-Resistenz-Gen enthielt.
An dieses DNA-Fragment wurde das vorher hergestellte DNA- Fragment durch T4-Ligase ligiert, wodurch das Expressionsplasmid pHLP385 zur Herstellung des vorstehenden, aus 149 Aminosäuren bestehenden Polypeptids konstruiert wurde.
Das resultierende Expressionsplasmid pHLP385 wurde nach dem in Beispiel 4-(1) beschriebenen Verfahren in E. coli HB101 eingeführt. Die Transformante zur Herstellung des menschlichen IL-1 (149) -Polypeptids wurde mit HB101/pHLP385 bezeichnet.

(2) Herstellung von menschlichem IL-1(149)-Polypeptid

Gemäß dem in Beispiel 6-(2) beschriebenen Verfahren wurde die Transformante (HB101/pHLP385) gezüchtet und sodann das gewünschte Polypeptid aus dem Zellextrakt isoliert.
Das erhaltene Polypeptid besaß eine IL-1-Aktivität, die beim Test einer 1 · 10&sup4;-fachen Probenverdünnung einen ³H-Thymidin-Einbau von 27 766 cpm zeigte.
Die chemischen und physikalisch-chemischen Eigenschaften sind wie in der vorstehend gezeigten Tabelle (b).

Beispiel 8

Herstellung eines modifizierten Polypeptids des menschlichen IL-1-Polypeptids

(1) Konstruktion einer Transformante, die das menschliche IL-1(144) herstellt

Ein Expressionsplasmid (pHLP386) zur Herstellung eines menschlichen IL-1-Polypeptids, das aus den Aminosäuren entsprechend den in Tabelle 5 dargestellten Aminosäuren von Nr. 127 oder 128 bis Nr. 271 besteht und als IL-1(144)-Polypeptid bezeichnet wurde, wurde gemäß dem in Beispiel 7-(1) beschriebenen Verfahren konstruiert, mit der Ausnahme, daß der nachstehend dargestellte, chemisch synthetisierte Oligodesoxyribonucleotid-Adaptor anstelle des synthetischen Adaptors [g] eingesetzt wurde.
Das resultierende Expressionsplasmid pHLP386 wurde nach dem in Beispiel 4-(1) beschriebenen Verfahren in E. coli HB101 eingeführt. Die Transformante zur Herstellung des menschlichen IL-1(144) Polypeptids wurde HB101/pHLP386 genannt.

(2) Herstellung des menschlichen IL-1 (144) -Polypeptids

Gemäß dem in Beispiel 6-(2) beschriebenen Verfahren wurde die Transformante (HB101/pHLP386) gezüchtet und sodann das gewünschte Polypeptid aus dem Zellextrakt isoliert.
Das erhaltene Polypeptid besaß eine IL-1-Aktivität, die beim Test einer 1 · 10³-fachen Probenverdünnung einen ³H- Thymidin-Einbau von 15 092 cpm zeigte.
Die chemischen und physikalisch-chemischen Eigenschaften des menschlichen IL-1-Polypeptids sind wie in der vorstehend gezeigten Tabelle (b).

Beispiel 9

Herstellung eines modifizierten Polypeptids des menschlichen IL-1-Polypeptids

(1) Konstruktion einer Transformante, die das menschliche IL-1(143) herstellt

Ein Expressionsplasmid (pHLP387) zur Herstellung eines menschlichen IL-1-Polypeptids, das aus 143 Aminosäuren entsprechend den in Tabelle 5 dargestellten Aminosäuren von Nr. 129 bis Nr. 271 besteht und als IL-1(143)-Polypeptid bezeichnet wurde, wurde gemäß dem in Beispiel 7-(1) beschriebenen Verfahren konstruiert, mit der Ausnahme, daß der nachstehend dargestellte, chemisch synthetisierte Oligodesoxyribonucleotid-Adaptor anstelle des synthetischen Adaptors [g] eingesetzt wurde.
Das resultierende Expressionsplasmid pHLP387 wurde nach dem in Beispiel 4-(1) beschriebenen Verfahren in E. coli HB101 eingeführt. Die Transformante zur Herstellung des menschlichen IL-1(143)-Polypeptids wurde HB101/pHLP387 genannt.

(2) Herstellung des menschlichen IL-1-(143)-Polypeptids

Gemäß dem in Beispiel 6-(2) beschriebenen Verfahren wurde die Transformante (HB101/pHLP387) gezüchtet und sodann das gewünschte Polypeptid aus dem Zellextrakt isoliert.
Das erhaltene Polypeptid besaß eine IL-1-Aktivität, die beim Test einer 10-fachen Probenverdünnung einen ³H-Thymidin- Einbau von 12 700 cpm zeigte.

Beispiel 10

Herstellung eines modifizierten Polypeptids des menschlichen IL-1-Polypeptids

(1) Konstruktion einer Transformante, die das menschliche IL-1(155-C) herstellt

Ein Expressionsplasmid (pHLP373) zur Herstellung eines menschlichen IL-1-Polypeptids, das aus 155 Aminosäuren entsprechend den in Tabelle 5 dargestellten Aminosäuren von Nr. 113 bis Nr. 267 besteht, wurde konstruiert, wie in Fig. 9 erläutert.
Die das menschliche IL-1 codierende, clonierte cDNA wurde durch Spaltung mit der Restriktionsendonuclease PstI aus dem rekombinanten Plasmid pHL4, wie in Beispiel 1-(6) beschrieben, isoliert. Die cDNA wurde mit der Restriktionsendonuclease AluI weiter gespalten, wodurch ein DNA-Fragment mit einer Größe von etwa 533 Bp erhalten wurde, das der DNA stromabwärts der Base Nr. 351 in Tabelle 5 entsprach. Außerdem wurde das DNA-Fragment mit der Restriktionsendonuclease Sau961 gespalten, wodurch das DNA-Fragment entsprechend den Basen von Nr. 351 bis Nr. 769 in Tabelle 5 isoliert wurde. Das resultierende DNA- Fragment wurde nacheinander mit den durch die folgenden Formeln dargestellten, chemisch synthetisierten Oligodesoxyribonucleotid-Adaptoren durch T4-Ligase ligiert.
und
Das DNA-Fragment, das das Initiationscodon ATG am 5'-Ende des DNA-Fragments, das das aus 155 Aminosäuren bestehende menschliche IL-1-Polypeptid codiert, wie vorstehend erwähnt, und die doppelten Stoppcodons TGATGA am 3'-Ende davon aufwies, wurde konstruiert (nachstehend als "HIL-155-Fragment" bezeichnet).
Ein etwa 380 Bp großes DNA-Fragment, das den trp-Promotor-Bereich enthielt, wurde aus dem Plasmid pCT-1 durch doppelte Spaltung mit den Restriktionsendonucleasen HpaI und AatII ausgeschnitten und isoliert. Das DNA-Fragment wurde mit dem durch die nachstehende Formel dargestellten, chemisch synthetisierten Oligodesoxyribonucleotid-Adaptor durch T4-Ligase ligiert.
Das resultierende DNA-Fragment wurde mit dem vorher hergestellten HIL-155-Fragment durch T4-Ligase ligiert (nachstehend als "Promotor-HIL-155-Fragment" bezeichnet).
Getrennt davon wurde Plasmid pBR322 mit den Restriktionsendonucleasen AvaI und PvuII gespalten und das resultierende größere DNA-Fragment (mit einer Größe von etwa 3,7 kBp) durch 0,7%ige Agarosegelelektrophorese isoliert. Nach Auffüllen der kohäsiven Enden mit E. coli-DNA-Polymerase I (großes Fragment) und vier verschiedenen Desoxyribonucleotidtriphosphaten zum Erhalt von glatten Enden wurden beide Enden durch T4-Ligase ligiert, wodurch ein neues Plasmid (mit pBRS6 bezeichnet) konstruiert wurde.
Das Plasmid pBRS6 wurde mit den Restriktionsendonucleasen AatII und HindIII in zwei Fragmente gespalten und ein größeres DNA-Fragment (etwa 3,6 kBp) isoliert. Sodann wurde dieses Fragment mit dem vorher hergestellten Promotor-HIL-155-Fragment durch T4-Ligase ligiert, wodurch das Expressionsplasmid pHLP373 konstruiert wurde.
Das resultierende Expressionsplasmid pHLP373 wurde nach dem in Beispiel 4-(1) beschriebenen Verfahren in E. coli HB101 eingeführt. Die Transformante zur Herstellung des menschlichen IL-1(155-C)-Polypeptids wurde mit HB101/pHLP373 bezeichnet.

(2) Herstellung des menschlichen IL-1(155-C)-Polypeptids

Die Transformante (HB101/pHLP373) wurde über Nacht in LB- Brühe gezüchtet. 10 ml der Kultur wurden in 1 Liter modifiziertes M9-Medium eingeimpft und eine Stunde bei 37ºC gezüchtet. Anschließend wurde 3-Indolacrylsäure bis zu einer Endkonzentration von 20 ug/ml zugegeben und die Züchtung weitere 24 Stunden fortgesetzt. Sodann wurden die Zellen abzentrifugiert. Die Zellen wurden in 100 ml 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) suspendiert, der 0,1% Lysozym und 30 mM NaCl enthielt, und 30 Minuten bei 0ºC stehengelassen. Sodann wurde das Einfrieren in einem Trockeneis/Ethanol-Bad und das Auftauen bei 37ºC sechsmal wiederholt. Anschließend wurden die Zelltrümmer abzentrifugiert, wodurch ein klarer Extrakt erhalten wurde.
Der Zellextrakt besaß eine IL-1-Aktivität, die beim Test einer 1 · 10&sup5;-fachen Probenverdünnung einen ³H-Thymidin-Einbau von 27 109 cpm zeigte.
Die chemischen und physikalisch-chemischen Eigenschaften des menschlichen IL-1(155-C)-Polypeptids werden in der vorstehenden Tabelle (c) gezeigt.

Beispiel 11

Herstellung eines modifizierten Polypeptids des menschlichen IL-1-Polypeptids

(1) Konstruktion einer Transformante, die das menschliche IL-1(152-C) herstellt, und dessen Herstellung

Ein Expressionsplasmid (pHLP358) zur Herstellung eines menschlichen IL-1-Polypeptids, das aus 152 Aminosäuren entsprechend den in Tabelle 5 dargestellten Aminosäuren von Nr. 113 bis Nr. 264 besteht und als IL-1(152-C)-Polypeptid bezeichnet wurde, wurde gemäß dem in Beispiel 10-(1) beschriebenen Verfahren konstruiert, mit der Ausnahme, daß der nachstehend dargestellte, chemisch synthetisierte Oligodesoxyribonucleotid-Adaptor anstelle des synthetischen Adaptors [j] eingesetzt wurde.
Das resultierende rekombinante Plasmid pHLP358 wurde nach dem in Beispiel 4-(1) beschriebenen Verfahren in E. coli HB101 eingeführt. Die Transformante zur Herstellung des menschlichen IL-1(152-C) -Polypeptids wurde HB101/pHLP358 genannt.
Gemäß dem in Beispiel 6-(2) beschriebenen Verfahren wurde die Transformante (HB101/pHLP358) gezüchtet und sodann das gewünschte Polypeptid aus dem Zellextrakt isoliert.

Beispiel 12

Herstellung eines modifizierten Polypeptids des menschlichen IL-1-Polypeptids

(1) Konstruktion einer Transformante, die das menschliche IL-1(154-C) herstellt

Ein Expressionsplasmid (pHLP363) zur Herstellung eines menschlichen IL-1-Polypeptids, das aus 154 Aminosäuren entsprechend den in Tabelle 5 dargestellten Aminosäuren von Nr. 113 bis Nr. 266 besteht und als IL-1(154-C)-Polypeptid bezeichnet wurde, wurde gemäß dem in Beispiel 10-(1) beschriebenen Verfahren konstruiert, mit der Ausnahme, daß der nachstehend dargestellte, chemisch synthetisierte Oligodesoxyribonucleotid-Adaptor anstelle des synthetischen Adaptors [j] eingesetzt wurde.
Das resultierende Expressionsplasmid pHLP363 wurde nach dem in Beispiel 4-(1) beschriebenen Verfahren in E. coli HB101 eingeführt. Die Transformante zur Herstellung des menschlichen IL-1(154-C)-Polypeptids wurde HB101/pHLP363 genannt.

(2) Herstellung des menschlichen IL-1(154-C)-Polypeptids

Gemäß dem in Beispiel 6-(2) beschriebenen Verfahren wurde die Transformante (HB101/pHLP363) gezüchtet und sodann das gewünschte Polypeptid aus dem Zellextrakt isoliert.
Das Zellysat besaß eine IL-1-Aktivität, die beim Test einer 1 · 10²-fachen Probenverdünnung einen ³H-Thymidin-Einbau von 11 058 cpm zeigte. Das Molekulargewicht des erhaltenen Polypeptids mit IL-1-Aktivität wurde durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese auf etwa 17 500 Dalton bestimmt.

Beispiel 13

Herstellung eines modifizierten Polypeptids des menschlichen IL-1-Polypeptids

(1) Konstruktion einer Transformante, die das menschliche IL-1(153-C) herstellt

Ein Expressionsplasmid (pHLP353) zur Herstellung eines menschlichen IL-1-Polypeptids, das aus 153 Aminosäuren entsprechend den in Tabelle 5 dargestellten Aminosäuren von Nr. 113 bis Nr. 265 besteht und als IL-1(153-C)-Polypeptid bezeichnet wurde, wurde gemäß dem in Beispiel 10-(1) beschriebenen Verfahren konstruiert, mit der Ausnahme, daß der nachstehend dargestellte, chemisch synthetisierte Oligodesoxyribonucleotid-Adaptor anstelle des synthetischen Adaptors [j] eingesetzt wurde.
Das resultierende Expressionsplasmid pHLP353 wurde nach dem in Beispiel 4-(1) beschriebenen Verfahren in E. coli HB101 eingeführt. Die Transformante zur Herstellung des menschlichen IL-1(153-C)-Polypeptids wurde HB101/pHLP353 genannt.

(2) Herstellung des menschlichen IL-1(153-C)-Polypeptids

Gemäß dem in Beispiel 6-(2) beschriebenen Verfahrens wurde die Transformante (HB101/pHLP353) gezüchtet und sodann das gewünschte Polypeptid aus dem Zellextrakt isoliert.
Das Zellysat besaß eine IL-1-Aktivität, die beim Test einer 10-fachen Probenverdünnung einen ³H-Thymidin-Einbau von 3 875 cpm zeigte. Das Molekulargewicht des erhaltenen Polypeptids mit IL-1-Aktivität wurde durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese auf etwa 17 500 Dalton bestimmt.

Beispiel 14

Herstellung eines modifizierten Polypeptids des menschlichen IL-1-Polypeptids

(1) Konstruktion einer Transformante, die das menschliche IL-1(140-NC) herstellt

Ein Expressionsplasmid (pHLP376) zur Herstellung eines menschlichen IL-1-Polypeptids, das aus 140 Aminosäuren entsprechend den in Tabelle 5 dargestellten Aminosäuren von Nr. 128 bis Nr. 267 besteht, wurde konstruiert.
Das in Beispiel 8 erhaltene Expressionsplasmid pHLP386 wurde mit den Restriktionsendonucleasen EcoRI und HindIII gespalten und ein resultierendes größeres DNA-Fragment isoliert. Getrennt davon wurde das in Beispiel 10-(1) erhaltene Expressionsplasmid pHLP373 mit den Restriktionsendonucleasen EcoRI und HindIII gespalten und ein resultierendes kleineres DNA- Fragment isoliert. Sodann wurden die beiden wie vorstehend erhaltenen DNA-Fragmente durch T4-Ligase ligiert, wodurch ein Expressionsplasmid zur Herstellung des vorstehenden, aus 140 Aminosäuren bestehenden Polypeptids konstruiert wurde (mit pHLP376 bezeichnet).
Das resultierende rekombinante Plasmid pHLP376 wurde nach dem in Beispiel 4-(1) beschriebenen Verfahren in E. coli HB101 eingeführt. Die Transformante zur Herstellung des menschlichen IL-1(140-NC) wurde HB101/pHLP376 genannt.

(2) Herstellung des menschlichen IL-1(140-NC)-Polypeptids

Die Transformante (HB101/pHLP376) wurde über Nacht in LB- Brühe gezüchtet. 10 ml der Kultur wurden in 1 Liter modifiziertes M9-Medium eingeimpft und eine Stunde bei 37ºC gezüchtet. Anschließend wurde 3-Indolacrylsäure bis zu einer Endkonzentration von 20 ug/ml zugegeben und die Züchtung weitere 24 Stunden fortgesetzt. Sodann wurden die Zellen abzentrifugiert. Die Zellen wurden in 100 ml 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) suspendiert, der 0,1% Lysozym und 30 mM NaCl enthielt, und 30 Minuten bei 0ºC stehengelassen. Sodann wurde das Einfrieren in einem Trockeneis/Ethanol-Bad und das Auftauen bei 37ºC sechsmal wiederholt. Anschließend wurden die Zelltrümmer abzentrifugiert, wodurch ein klarer Extrakt erhalten wurde.
Der Zellextrakt besaß eine IL-1-Aktivität, die beim Test einer 1 · 10²-fachen Probenverdünnung einen ³H-Thymidin-Einbau von 12 493 cpm zeigte. Das Molekulargewicht des erhaltenen Polypeptids mit IL-1-Aktivität wurde durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese auf etwa 16 000 Dalton bestimmt.

Beispiel 15

Herstellung von reifem Kaninchen-IL-1-Polypeptid

Ein Expressionsplasmid zur Herstellung von reifem Kaninchen-IL-1 wurde unter Verwendung eines trp-Promotors konstruiert, wie in Fig. 10 dargestellt.
Die clonierte cDNA-Insertion, die einen codierenden Bereich für reifes Kaninchen-IL-1 enthielt, wurde aus dem in Beispiel 2-(6) erhaltenen rekombinanten Plasmid durch Spaltung mit der Restriktionsendonuclease PstI isoliert. Die cDNA wurde weiter mit den Restriktionsendonucleasen HincII undBglII gespalten, wodurch ein DNA-Fragment (mit einer Größe von etwa 509 Bp) isoliert wurde. Sodann wurde das 509 Bp große DNA- Fragment mit der Restriktionsendonuclease DpnI partiell gespalten und die resultierende DNA, die den größten Teil des codierenden Bereichs für reifes Kaninchen-IL-1 enthielt, durch 5%ige Polyacrylamidgelelektrophorese isoliert.
Dieses DNA-Fragment wurde mit chemisch synthetisierten Oligodesoxyribonucleotid-Adaptoren durch T4-Ligase ligiert.
Die synthetischen Adaptoren werden durch die nachstehende Formel dargestellt.
Das resultierende DNA-Fragment wird als RIL-Adaptor-Fragment bezeichnet.
Getrennt davon wurde ein etwa 380 Bp großes DNA-Fragment, das den trp-Promotor-Bereich enthielt, aus dem Plasmid pCT-1 durch doppelte Spaltung mit den Restriktionsendonucleasen HpaI und AatII ausgeschnitten und isoliert. Das DNA-Fragment wurde mit dem durch die nachstehende Formel dargestellten, chemisch synthetisierten Oligodesoxyribonucleotid-Adaptor durch T4-Ligase ligiert.
Das resultierende DNA-Fragment wurde nacheinander mit dem vorher hergestellten RIL-1-Adaptor-Fragment und dem in Beispiel 5-(1) erhaltenen 3,6 Bp großen AatII-HindIII-DNA-Fragment von Plasmid pBRS6 durch T4-Ligase ligiert, wodurch das Expressionsplasmid pRLP383 erhalten wurde.
Durch Einführung des Expressionsplasmids pRLP383 in E. coli HB101 gemäß dem in Beispiel 4-(1) beschriebenen Verfahren und Züchtung der Transformante kann reifes Kaninchen-IL-1-Polypeptid erhalten werden, das aus 155 Aminosäuren entsprechend den in Tabelle 7 gezeigten Aminosäuren von Nr. 113 bis Nr. 267 besteht. Tabelle 1-1 Tabelle 1-2 Tabelle 2-1 Tabelle 2-2 Tabelle 3-1 Tabelle 3- 2 Tabelle 4-1 Tabelle 4-2 Tabelle 5 (menschl.) Tabelle 5 (menschl.) (Fortsetzung) Tabelle 5 (menschl.) (Fortsetzung) [Anm.]: 1) *** bedeutet Stoppcodon. 2) Die Klammer bedeutet den Bereich, der reifes IL-1 codiert. Tabelle 6 (menschl.) Tabelle 6 (menschl.) (Fortsetzung) [Anm.]: *** bedeutet Stoppcodon. Tabelle 7 (Kaninschen) Tabelle 7 (Kaninchen) (Fortsetzung) Tabelle 7 (Kaninchen) (Fortsetzung) [Anm.]: 1) *** bedeutet Stoppcodon. 2) Die Klammer bedeutet den Bereich, der reifes IL-1 codiert Tabelle 8-1 Tabelle 8-1 (Fortsetzung) [Anm.]: 1) Obere Sequenz ist die Nucleotidsequenz einer DNA, die Kaninchen-IL-1-Precursor codiert. 2) Untere Sequenz ist die Nucleotidsequenz einer DNA, die menschl. IL-1-Precursor codiert. 3) --- bedeutet Deletion. 4) *** bedeutet Stoppcodon. 5) Die umrandeten Bereiche sind homologe Bereiche. Tabelle 8-2 Tabelle 8-2 (Fortsetzung) [Anm.]: 1) Obere Sequenz ist das Polypeptid des Kaninchen IL-1-Precursors. 2) Untere Sequenz ist das Polypeptid des menschl. IL-1-Precursosrs. 3) --- bedeutet Deletion. 4) Die umrandeten Bereiche sind homologe Bereiche.

Claims

1. DNA der den IL-1-Precursor codierenden Sequenz gemäß der Beschreibung in Tabelle 5 oder eine allele Variante des Gens, das diese den IL-1-Precursor codierende Sequenz enthält, erhältlich durch Clonierung von menschlicher genomischer DNA oder durch Clonierung von cDNA von menschlichen Makrophagen-ähnlichen Zellen.

2. DNA, die das gleiche Polypeptid codiert wie das, welches durch die DNA nach Anspruch 1 codiert wird, die sich aber von der DNA nach Anspruch 1 aufgrund der Degeneration des genetischen Codes unterscheidet.

3. DNA, welche nicht Maus-IL-1 codiert, und die eine Modifikation, die sich in einer Aminosäuredeletion und/oder -ersatz äußert, des Polypeptids codiert, das durch die DNA der den Precursor codierenden Sequenz gemäß der Definition in Anspruch 1 oder 2 codiert wird und das IL-1- Aktivität aufweist.

4. DNA nach Anspruch 3, die ein Polypeptid codiert, welches nur einen Teil dieses IL-1-Precursors enthält, wobei das Polypeptid Il-1-Aktivität aufweist.

5. DNA nach Anspruch 4, wobei dem Polypeptid ein N-termina- 1er Bereich des Il-1-Precursors fehlt.

6. DNA nach Anspruch 5, wobei dem Polypeptid ein N-terminaler Teil des IL-1-Precursors fehlt, der 122 oder 127 Aminosäuren lang ist.

7. DNA nach Anspruch 4 oder Anspruch 5, wobei dem Polypeptid bis zu 5 Aminosäuren vom C-Terminus des IL-1-Precursors fehlen.

8. DNA nach Anspruch 7, wobei dem Polypeptid vier oder 5 Aminosäuren vom C-Terminus des IL-1-Precursors fehlen.

9. DNA nach Anspruch 4, wobei dem Polypeptid 126 oder 127 N-terminale und gegebenenfalls vier C-terminale Aminosäuren des IL-1-Precursors fehlen.

10. DNA nach Anspruch 4, wobei dem Polypeptid 112 N-terminale und vier C-terminale Aminosäuren des IL-1-Precursors fehlen.

11. DNA nach Anspruch 4, wobei dem Polypeptid höchstens die ersten 127 N-terminalen Aminosäuren und höchstens vier C-terminale Aminosäuren des IL-1-Precursors fehlen.

12. DNA nach Anspruch 5, wobei dem Polypeptid mindestens die ersten 62 N-terminalen Aminosäuren des IL-1-Precursors fehlen.

13. DNA nach Anspruch 5, wobei dem Polypeptid die ersten 112 N-terminalen Aminosäuren des IL-1-Precursors fehlen und es Serin als Rest Nr. 114 der Precursor-Sequenz aufweist.

14. DNA nach einem der Ansprüche 4 bis 13, wobei die codierende Sequenz ein Translationsstartcodon an ihrem 5'- Ende aufweist.

15. Expressionsvektor, enthaltend DNA nach einem der vorangehenden Ansprüche, die für ihre Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus angeordnet ist.

16. Rekombinanter Wirtsorganismus, der mit DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 14 transformiert ist, so daß er zur Expression dieser DNA unter Produktion eines Polypeptids mit IL-1-Aktivität fähig ist.

17. Verfahren, umfassend die Züchtung eines rekombinanten Wirtsorganismus nach Anspruch 16 und Gewinnung des Polypeptids daraus.

18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei der N-Terminus des Polypeptids bei Position Nr. 113 des Il-1-Precursors liegt und der Rest in Position 114 Serin ist.

19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Polypeptid sich von Position Nr. 113 bis Position Nr. 271 des IL-1-Precursors erstreckt.

20. Verfahren, das nach der Produktion eines Polypeptids durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 17, 18 und 19 die Verwendung des Polypeptids in der Herstellung eines Medikaments umfaßt.

21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei ein Medikament für eine Antitumor- oder Antiinfektionsbehandlung hergestellt wird.

22. Polypeptid mit IL-1-Aktivität, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19.

23. Polypeptid mit IL-1-Aktivität und mit der Aminosäuresequenz 113 bis 271 gemäß der Beschreibung in Tabelle 5.

24. Arzneimittel, umfassend ein Polypeptid nach Anspruch 22 oder 23.