DE3786767T2

DE3786767T2 - Neues Polypeptid.

Info

Publication number: DE3786767T2
Application number: DE87119157T
Authority: DE
Inventors: Seiga Itoh; Yoshinori Komatsu; Tetsuro Kuga; Horomasa Miyaji; Makoto Morimoto; Masami Okabe; Moriyuki Sato; Kazuo Yamaguchi; Motoo Yamasaki; Yoshiharu Yokoo
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1986-12-23
Filing date: 1987-12-23
Publication date: 1994-01-13
Anticipated expiration: 2007-12-24
Also published as: CA1341522C; NO875378L; PT86465B; EP0272703A1; DK680987D0; DE3786767D1; NO875378D0; ES2059354T5; DE3786767T3; NO176799C; DK680987A; JPH068317B2; EP0272703B2; HK164195A; NO176799B; EP0272703B1; ES2059354T3; KR880007734A; JPS63267292A; DK174044B1

Description

BEREICH DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Polypeptidderivate des humanen Granulozyten-koloniestimulierenden Faktors (hG-CSF) rekombinante Plasmide mit einer darin insertierten DNA, die für eines dieser Polypeptidderivate codiert, Mikroorganismen, von denen jedes eines dieser Plasmide trägt, und eine Methode zur Produktion dieser neuen hG-CSF Polypeptidderivate.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Der humane Granulozyten-koloniestimulierende Faktor (hG-CSF) ist eine Polypeptidart, die essentiell zur Bildung verschiedener Blutzellen als Resultat von Proliferation und Differenzierung hämatopoetischer Stammzellen ist. Sein Haupteffekt ist es, die Erhöhung der Anzahl von Granulozyten, insbesondere von Neutrophilen, zu fördern. Neutrophile spielen beim Schutz des lebenden Körpers vor Infektionen eine wichtige Rolle.
Ihre Lebensdauer ist jedoch kurz, und daher ist eine konstante Ergänzung durch Proliferation und Differenzierung von Vorläuferzellen notwendig. Die Therapien, die in jüngeren Jahren gegen proliferative Tumoren weitverbreitet angewendet wurden, inhibieren gleichzeitig das Wachstum von neutrophilen Vorläufern, wodurch ein ernster Nebeneffekt verursacht wird, nämlich eine Reduktion des Neutrophilen-Schutzes bei an Krebs erkrankten Patienten, was sie anfälliger für Infektionen macht. Von hG-CSF wird angenommen, einerseits durch Promotion der Erhöhung der Neutrophilen-Anzahl und andererseits durch Prävention und Behandlung infektiöser Krankheiten, wirksam zur Linderung dieses unerwünschten Nebeneffektes zu sein. Weiterhin ist hG-CSF dadurch aktiv, daß eine Differenzierung leukämischer Zellinien in vitro bewirkt wird und er daher möglicherweise als therapeutisches Agens gegen Leukämie nützlich sein kann. Die erfindungsgemäßen hG-CSF Polypeptidderivate sind bezüglich der hG-CSF-Aktivität dein bekannten hG-CSF überlegen, und es wird erwartet, daß sie als Arzneimittel nützlich sind.
Durch den jüngsten, schnellen Fortschritt bei rekombinanten DNA-Technologien sind aufeinanderfolgend Gene von Proteinen isoliert worden, die an der Proliferation und Differenzierung von Blutzellen beteiligt sind. Solche Faktoren werden durch Gentechnologie unter Verwendung von Mikroorganismen oder Animalzellen produziert.
Eine cDNA des hG-CSF wurde aus der humanen Squamazellen- Carcinoma-Zellinie CHU-II isoliert, ihre Basensequenz bestimmt und über ihre Expression in COS-Zellen wurde durch Nagata et al. berichtet [Nagata et al.: Nature, 319, 415 (1986)]. Ebenso isolierten Souza et al. eine cDNA aus der humanen Blasenkrebs-Zellinie 5637, bestimmten ihre Basensequenz und berichteten über ihre Expression in Escherichia coli (E. coli) [Souza et al.: Science, 232, 61 (1986)].
Die Aminosäuresequenz des Proteins, das von den obigen zwei cDNAs codiert wird, stimmt mit der Aminosäuresequenz (Tabelle 1) des Proteins überein, das von der cDNA codiert wird, die aus normalen, human peripheren Blut-Makrophagen durch die jetzigen Erfinder isoliert wurde. Tabelle 1
WO 87/01132, ein Dokument gemäß Artikel 54(3) EPC, offenbart neue Polypeptide, die einen Teil der oder die gesamte primärstruktur-Konformation und eine oder mehrere der biologischen Eigenschaften des hpG-CSF besitzen. Zum Beispiel werden die Substitutionsanaloga [Ala¹]hpG-CSF und [Ser¹&sup7;]hpG-CSF offenbart.
EP-A- 0 256 843, ebenfalls ein Dokument gemäß Artikel 54(3) EPC, offenbart rekombinante Analoga von hG-CSF. Zum Beispiel werden Substitutionsanaloga erwähnt, in denen [Thr¹] des hG-CSF durch Ala, Gly oder Pro ersetzt wurde. Weiterhin wird das Deletionsanalogon Δ&sub4;-G-CSF, dem die vier N-terminalen Aminosäuren des hG-CSF fehlen, offenbart.

KURZFASSUNG DER ERFINDUNG

Eine Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren bereitzustellen, das unter geringen Kosten und in hohen Ausbeuten hG-CSF-Polypeptidderivate, die eine hohe spezifische Aktivität und eine hohe Stabilität in Blut besitzen, produziert.
Die jetzigen Erfinder fanden heraus, daß hG-CSF-Polypeptidderivate, die eine hohe spezifische Aktivität besitzen, durch Modifizierung der in Tabelle 1 gezeigten cDNA des hG-CSF und Kultivierung eines E. coli-Stammes, der ein Plasmid enthält, in das die modifizierte cDNA insertiert wurde, oder durch limitierten Polypeptidabbau unter Verwendung einer Protease produziert werden können, und sie haben nun die vorliegende Erfindung vervollständigt.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt ein Konstruktionsschema des Plasmides pCfTA1.
Fig. 2 zeigt ein Konstruktionsschema des Plasmides pCfTB20.
Fig. 3 zeigt Konstruktionsschemata der Plasmide pCfTL23, 38, 35 und 41.
Fig. 4 zeigt Konstruktionsschemata der Plasmide pCfTM14, 17 und 113.
Fig. 5 zeigt ein Konstruktionsschema des Plasmides pCfWD1.
Fig. 6 zeigt Konstruktionsschemata der Plasmide pCfT95K19, pCfAA1 und pCfAB5.
Fig. 7 zeigt Konstruktionsschemata der Plasmide pCfBA8, pCfBB101, pCfBC52, 59, 42B1, 45, 76, 77, 93, 95, 97, pCfBD28, 56 und 82.
Fig. 8 zeigt Konstruktionsschemata der Plasmide pCfCB101, pCfCC52, 59, pCfCD28 und 56.
Fig. 9 (1) und (2) zeigen schematisch die Prozesse, die die Okayama-Berg-Methode zur cDNA-Synthese und die Konstruktion eines rekombinanten Plasmides, das die synthetisierte DNA enthielt, umfaßte.
Fig. 10 zeigt ein Konstruktionsschema des Plasmides pLA1.
Fig. 11 zeigt ein Konstruktionsschema des Plasmides pLSA1.
Fig. 12 zeigt ein Konstruktionsschema des Plasmides pCfTNS501.
Fig. 13 zeigt ein Konstruktionsschema des Plasmides pTrS20.
Fig. 14 zeigt Konstruktionsschemata der Plasmide pCfTNS7 und pCfTAArg4S.
Fig. 15 zeigt Kontruktionsschemata der Plasmide pCfTN205 und pCfTAArg4.
Fig. 16 zeigt Konstruktionsschemata der Plasmide pCfTNS301 und pCfTNS401.
Fig. 17 (1) und (2) zeigen Konstruktionsschemata der Plasmide pCfBD28A17 und pCfBD28T17.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die erfindungsgemäßen hG-CSF-Polypeptidderivate unterscheiden sich als Resultat einer Substitution und/oder Deletion teilweise von der Aminosäuresequenz des hG-CSF-Polypeptides, das die in Tabelle 1 gezeigte Aminosäuresequenz besitzt. Die zu substituierende(n) Aminosäure oder Aminosäuren sind diejenigen Aminosäuren, die am oder in der Nähe des N-Terminus lokalisiert sind. Analog sind die zu deletierenden Aminosäuren jene Aminosäuren am oder in der Nähe des N-Terminus.
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Plasmide werden durch Insertion eines DNA-Fragmentes, das für eine der oben erwähnten hG-CSF-Polypeptid-Derivate codiert, in ein geeignetes Plasmid, das eine DNA-Expressionsfunktion besitzt, erhalten. Als DNA- Fragmente, die für die oben erwähnten hG-CSF-Polypeptidderivate der Erfindung codieren, werden solche bevorzugt, die aus Substitutionen von mindestens einer Base resultieren, die aus der 1. bis 51. Base der Basensequenz der in Tabelle 1 gezeigten DNA, die für hG-CSF codiert, ausgewählt wird.
Genauer beinhaltet die vorliegende Erfindung: neue Polypeptide mit einer Aminosäuresequenz, die von der Aminosäuresequenz des humanen Granulozyten-koloniestimulierenden-Faktor (hG-CSF)- Polypeptides durch Aminosäuresubstitution abgeleitet ist, welche dadurch gekennzeichnet sind, daß wenigstens eine Aminosäure aus der 1. bis 6. Aminosäure des N-terminalen Endes und gegebenenfalls die 17. Aminosäure davon von der Aminosäure an der entsprechenden Position des hG-CSF-Polypeptides differiert, mit der Maßgabe, daß mehr als eine Aminosäure von hG-CSF substituiert wird, falls die Aminosäure Thr&spplus;¹ von hG-CSF ersetzt wird durch Ala, Gly oder Pro; weiterhin eine DNA, codierend für solche Polypeptide, und rekombinante Plasmide, umfassend eine Plasmid-DNA und als Insert darin ein DNA- Fragment, das für ein wie oben definiertes Polypeptid codiert.
Vorzugsweise werden solche Plasmide in Betracht gezogen, worin die Plasmid-DNA eine Tryptophan-Promotor enthaltende Plasmid- DNA ist, die das DNA-Fragment als Insert in der Plasmid-DNA stromabwärts vom Tryptophan-Promotor enthält.
Vorzugsweise werden die Plasmide aus der Gruppe ausgewählt, die aus pCfTL38, pCfTL41, pCfTL35 und pCfTAArg4 besteht, umfassend ein Insert, welches für ein hG-CSF-Polypeptid codiert, das wie folgt modifiziert ist: Plasmid Position der Aminosäure-Substitution (substituierte Aminosäure von hG-CSF) *) keine Substitution
oder sie werden ausgewählt aus der Gruppe, die aus pCfTM14, pCfTM17, pCfTM113 und pCfTAArg4S besteht, umfassend ein Insert, welches für ein hG-CSF-Polypeptid codiert, das wie folgt modifiziert ist: Plasmid Position der Aminosäure-Substitution (substituierte Aminosäure von hG-CSF) *) keine Substitution
oder sie werden ausgewählt aus der Gruppe, die aus pCfBC42B1, pCfBC45, pCfBC52, pCfBC59, pCfBC76, pCfBC77, pCfBC93, pCfBC95, pCfBC97, pCfBD28, pCfBD56, pCfBD82, pCfBB101, pCfBD28A17 und pCfBD28T17 besteht, umfassend ein Insert, welches für ein hG-CSF-Polypeptid codiert, das wie folgt modifiziert ist: Position der Aminosäure-Substitution (Aminosäure von hG-CSF) Plasmid * Keine Substitution
Eine andere erfindungsgemäße Ausführungsform umfaßt einen Mikroorganismus, der mindestens eines der oben erwähnten Plasmide enthält. Vorzugsweise gehören diese Mikroorganismen zur Spezies Escherichia coli.
Eine andere erfindungsgemäße Ausführungsform umfaßt ein Verfahren zur Herstellung der oben erwähnten Substitutions- Analoga, wobei man (a) in einem Medium einen Mikroorganismus kultiviert, der ein für das Polypeptid codierendes rekombinantes Plasmid enthält, wobei man die Bildung und Akkumulierung des Polypeptides in der Kultur bewirkt, und (b) man das Polypeptid aus der Kultur isoliert.
Vorzugsweise wird eines der oben erwähnten rekombinanten Plasmide angewendet, das in einem Mikroorganismus enthalten ist, der zu der Spezies Escherichia coli gehört.
Eine andere erfindungsgemäße Ausführungsform umfaßt Polypeptide, die vom hG-CSF-Polypeptid durch Deletion abgeleitet sind, worin ein Peptid, umfassend die 1. bis 4., 1. bis 5., 1. bis 6., 1. bis 7. oder 1. bis 11. Aminosäure des N-terminalen Endes des hG-CSF-Polypeptides, fehlt, und worin gegebenenfalls zusätzlich zur Aminosäure-Deletion die 17. Aminosäure, Cystein (Cys&spplus;¹&sup7;) des hG-CSF-Polypeptides durch Serin (Ser) ersetzt ist, mit der Maßgabe, daß die 1. bis 4. Aminosäure von hG-CSF nur dann deletiert wird, wenn Cys&spplus;¹&sup7; des hG-CSF durch Ser ersetzt wird; ebenso DNA-Moleküle, codierend für diese Polypeptide, und rekombinante Plasmide, umfassend eine Plasmid-DNA und darin insertiert ein DNA-Fragment, das für ein wie oben definiertes Polypeptid codiert.
Vorzugsweise umfaßt das rekombinante Plasmid eine Plasmid-DNA und darin insertiert ein DNA-Fragment, welches für ein Polypeptid codiert, das vom hG-CSF-Polypeptid abgeleitet ist durch Deletion eines Peptides, umfassend die 1. bis 11. Aminosäure des N-terminalen Endes. Bevorzugt werden Plasmide, worin eine Tryptophan-Promotor-enthaltende Plasmid-DNA als Plasmid-DNA verwendet wird, wobei das DNA-Fragment in der Plasmid-DNA stromabwärts vom Tryptophan-Promotor insertiert ist.
Stärker bevorzugt sind Plasmide, die aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus pCfTNS7, pCfTNS301, pCfTNS401 und pCfTNS501 besteht, umfassend ein Insert, welches für ein hG-CSF- Polypeptid codiert, das wie folgt modifiziert ist: Plasmid Art der Sequenz-Modifikation Deletion¹) Substitution Ser ¹) Position der deletierten Aminosäuren von hG-CSF ²) substituierte Aminosäure von hG-CSF
Eine andere erfindungsgemäße Ausführungsform bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung der oben-erwähnten Deletions- Analoga des hG-CSF, wobei man in einem Medium einen Mikroorganismus kultiviert, der ein rekombinantes Plasmid enthält, das eine Plasmid-DNA und darin insertiert ein DNA-Fragment umfaßt, das für das Polypeptid codiert, wobei die Bildung und Akkumulierung des Polypeptides in der Kultur bewirkt wird und man das Polypeptid aus der Kultur isoliert. Diese Methode wird angewendet zur Herstellung eines neuen Polypeptides mit einer Aminosäuresequenz, abgeleitet von der Aminosäuresequenz des hG-CSF-Polypeptides durch Substitution der 17. Aminosäure (Cystein) durch Serin und Deletion von 4-7 Aminosäuren am N-terminalen Ende davon, wobei man ein Polypeptid, abgeleitet vom hG-CSF-Polypeptid durch Substitution der 17. Aminosäure (Cystein) durch Serin und wenigstens einer Aminosäure der 1. bis 6. Aminosäure des N-terminalen Endes davon durch eine davon verschiedene Aminosäure der Einwirkung einer Protease in einem wäßrigen Medium aussetzt, wodurch man die Bildung des neuen Polypeptides im Reaktionsgemisch bewirkt und man das neue Polypeptid aus dem Reaktionsgemisch abtrennt.
Vorzugsweise wird die Protease aus der Gruppe ausgewählt, die aus Subtilisin A, Subtilisin BPN', Subtilisin Carlsberg, Subtilisin Novo, Proteinase K, Nagase, Thermolysin, Endoproteinase Arg-C, Trypsin und α-Chymotrypsin besteht.
Eine cDNA (hG-CSF cDNA), erhältlich durch reverse Transkription einer hG-CSF-codierenden Boten-RNA durch rekombinante DNA- Technologie oder eine hG-CSF-codierende DNA, erhältlich aus chromosomaler DNA, kann zum Beispiel als die in Tabelle 1 gezeigte hG-CSF-codierende DNA verwendet werden.
Jede hG-CSF-cDNA kann verwendet werden, vorausgesetzt, daß sie für hG-CSF codiert. Als ein spezifisches Beispiel kann pCSF1-2, ein Plasmid, das durch die jetzigen Erfinder hergestellt wurde, verwendet werden. Der Herstellungsprozeß des pCSF1-2 ist im Vergleichsbeispiel 1 beschrieben.
Die in pCSF1-2 enthaltende hG-CSF-cDNA besitzt die in Tabelle 1 gezeigte Basensequenz, wie sie mittels der Didesoxysequenziermethode unter Verwendung des M13-Phagen [J. Messing et al.: Gene, 19, 269 (1982)] bestimmt wurde.
pCSF1-2 ist ein Plasmid, das die in Fig. 1 gezeigte Restriktionsenzym-Karte besitzt, und ein E. coli-Stamm, der dieses enthält, E. coli ECSF 1-2, ist bei Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (FRI) am 27. November 1986 unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-1220 nach dem Budapester Abkommen hinterlegt worden.
Jedes Plasmid kann zur Insertion einer hG-CSF-Polypeptidderivat-codierenden DNA verwendet werden, vorausgesetzt, daß diese DNA in E. coli exprimiert werden kann.
Ein vorteilhaft zu verwendendes Plasmid erlaubt die Insertion von fremder DNA an einer Stelle stromabwärts eines geeigneten Promotors, zum Beispiel eines trp- oder lac-Promotors, und hat die Distanz zwischen der Shine-Dalgarno-Sequenz (im folgenden SD-Sequenz) und dem Initiations-Codon (ATG) einem geeigneten Abstand angepaßt, zum Beispiel 6-18 Basenpaare.
Als geeignete Beispiele solcher Plasmide können erwähnt werden pKYP10 (US Patent 4 686 191) pLSA1 (Vergleichsbeispiel 3), pGEL1 [Sekine et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)], pKYP26 [Japanische Patentanmeldung (OPI) Nr. 48 699/87 (der Ausdruck "OPI" bedeutet eine ungeprüfte publizierte Anmeldung) und pBR322 (Bolivar et al.: Gene, 2, 95 (1977)].
Die Rekombination zwischen einer DNA, die für das hG-CSF- Polypeptid oder ein Derivat davon codiert, und einer Vektor-DNA kann durch allgemein gebräuchliche rekombinante DNA-Techniken erreicht werden, die ein Verdauen der DNA mit einem Restriktionsenzym oder -enzymen und der nachfolgenden Ligation unter Verwendung von T4-DNA-Ligase beinhalten. Zur Ligation können die DNA-Fragmentenden, die aus dem Verdau mit Restriktionsenzymen resultieren, bei Bedarf prozessiert werden unter Verwendung der Auffüllungsreaktion mit dem DNA-Polymerase I Klenow-Fragment oder der Trimm-Reaktion mit der T4 DNA-Polymerase; die DNA-Linkertechnik ist ebenfalls anwendbar.
Beispiele der Konstruktion rekombinanter Plasmide, die eine darin insertierte hG-CSF-Polypeptidderivat-codierende DNA enthalten, wobei pCSF1-2 als die hG-CSF cDNA und pGEL1, pKYP10, pKYP26, pBR322 oder pLSA1 als Plasmid zur Inkorporation der DNA und, wenn nötig, ein chemisch synthetisierter DNA-Linker oder eine Technik zur ortsspezifischen Mutagenese verwendet wurden, werden im folgenden angegeben.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

(Rekombinations-Verfahrens)

Wie in Fig. 1 gezeigt ist, wird pCSF1-2 [ca. 4,5 Kilobasen (im folgenden kb)] mit ApaI und BamHI gespalten, und ein DNA- Fragment von ca. 1.5 kb wird durch Gelelektrophorese mit bei niedriger Temperatur erstarrender Agarose (LGT-Methode) gereinigt [L. Wieslander: Analytical Biochemistry, 98, 305 (1979)].
Sodann wird pLSA1 mit BanIII und BamHI gespalten und ein DNA- Fragment von ca. 2,8 kb wird mit der LGT-Methode gereinigt. Die beiden solchermaßen erhaltenen Fragmente und die in Fig. 1 gezeigte synthetische DNA werden unter Verwendung von T4 DNA- Ligase zusammenligiert, was pCfTA1 ergibt.
Sodann wird, wie in Fig. 2 gezeigt, pCfTA1 mit BamHI geschnitten, die überstehenden Enden werden durch Behandlung mit dem Klenow-Fragment in glatte Enden überführt, und nach weiterer Spaltung mit EcoRI wird ein DNA-Fragment mit ca. 2,5 kb mittels der LGT-Methode gereinigt. Getrennt davon wird pCfTAL mit EcoRI und DraI gespalten, und ein DNA-Fragment mit ca. 1,0 kb wird mittels der LGT-Methode gereinigt. Die so erhaltenen DNA-Fragmente werden unter Verwendung von T4 DNA- Ligase zusammenligiert, was pCfTB20 ergibt.
Wie in Fig. 3 gezeigt, wird weiterhin pCSF1-2 mit ApaI und BamHI gespalten, und ein DNA-Fragment mit ca. 1,5 kb wird mittels der LGT-Methode gereinigt. Getrennt davon wird pGEL1 mit HindIII, BamHI und PstI gespalten, und ein DNA-Fragment mit ca. 1,7 kb wird mittels der LGT-Methode gereinigt. Weiterhin wird pKYP10 mit PstI und BanIII gespalten, und ein DNA-Fragment mit ca. 1,1 kb wird mittels der LGT-Methode gereinigt. Ligation dieser drei DNA-Fragmente und der in Fig. 3 gezeigten synthetischen DNA ergibt pCfTL23, pCfTL38, pCfTL35 und pCfTL41, während Ligation dieser drei DNA-Fragmente und der in Fig. 4 gezeigten synthetischen DNA pCfTM14, pCfTM17 und pCfTM113 ergibt.
Wie in Fig. 5 gezeigt, wird weiterhin pCfTA1 mit BanIII und StuI gespalten, und ein die hG-CSF cDNA-enthaltendes DNA-Fragment mit ca. 1,3 kb wird mittels der LGT-Methode gereinigt. Davon getrennt wird pKYP26 mit BamHI gespalten, die überstehenden Enden werden durch Behandlung mit dem DNA-Polymerase I Klenow-Fragment in glatte Enden überführt, und nach weiterer Spaltung mit PstI wird eine DNA von ca. 1,8 kb mittels der LGT-Methode gereinigt. Getrennt davon wird im weiteren pGEL1 mit BanIII und PstI gespalten, und ein DNA-Fragment von ca. 1,0 kb wird mittels der LGT-Methode gereinigt. Die so erhaltenen drei DNA-Fragmente werden unter Verwendung von T4 DNA-Ligase zusammenligiert, was pCfWD1 ergibt.
Wie in Fig. 6 gezeigt, wird weiterhin pCfTL38 mit HindIII und BglII gespalten, und ein DNA-Fragment von ca. 2,6 kb wird mittels der LGT-Methode gereinigt. Getrennt davon wird pCfTL38 mit HindIII, BamHI und DpnI gespalten, und ein DNA-Fragment mit ca. 300 bp (Basenpaaren) wird mittels der LGT-Methode gereinigt. Getrennt davon wird weiterhin pCfTB20 mit AvaI gespalten, die überstehenden Enden werden durch Behandlung mit dem Klenow-Fragment abgeschnitten, und nach weiterer Spaltung mit BglII wird ein DNA-Fragment von ca. 480 bp mittels der LGT- Methode gereinigt. Die so erhaltenen drei ,DNA-Fragmente werden unter Verwendung von T4 DNA-Ligase zusammenligiert, was pCfT95K19 ergibt. Wie ebenfalls in Fig. 6 gezeigt, wird pCfT95K19 mit BanIII und BglI gespalten, und eine DNA von ca. 1,0 kb wird mittels der LGT-Methode gereinigt, und getrennt davon wird pCfT95K19 mit BglI allein gespalten, und ein DNA- Fragment mit ca. 1,8 kb wird mittels dieser Methode gereinigt. Getrennt davon wird weiterhin pCfT95K19 mit BglI und Sau3A gespalten, und ein DNA-Fragment mit ca. 350 bp wird mittels der LGT-Methode gereinigt. Die so erhaltenen drei DNA-Fragmente und die in der Mitte von Fig. 6 (d. h. auf halber Höhe) gezeigte synthetische DNA werden zusammenligiert, was pCfAA1 ergibt.
Sodann wird, ebenfalls in Fig. 6 gezeigt, pCfAA1 mit XhoI und BglI geschnitten, und ein DNA-Fragment von ca. 3,0 kb wird mittels der LGT-Methode gereinigt. Dieses Fragment, das obenerwähnte BglI-Sau3A-Fragment (ca. 350 bp) des pCfT9SK19, und die unten in der Fig. 6 gezeigte synthetische DNA werden unter Verwendung von T4 DNA-Ligase zusammenligiert, was pCfAB5 und pCfAB14 ergibt. Weiterhin, wie in Fig. 7 gezeigt, wird pCfAB5 mit AvaI und BglII gespalten, und ein DNA-Fragment mit ca. 2,8 kb wird mittels der LGT-Methode gereinigt. Getrennt davon wird pCfWD1 mit BglII und AvaI gespalten, und das DNA- Fragment mit ca. 1,3 kb wird mittels der LGT-Methode gereinigt. Die so erhaltenen zwei Fragmente werden unter Verwendung von T4 DNA-Ligase zusammenligiert, was pCfBA8 ergibt. Auf der anderen Seite wird pCfAB14 mit AvaI und BglII gespalten, und ein DNA- Fragment mit ca. 2,8 kb wird mittels der LGT-Methode gereinigt, und dieses Fragment wird mit dem oben erwähnten 1,3 kb DNA- Fragment, hergeleitet von pCfWD1 durch Spaltung mit BglII und AvaI, unter Verwendung von T4 DNA-Ligase ligiert, was pCfBA32 ergibt. Weiterhin, wie ebenfalls in Fig. 7 gezeigt, wird pCfBA8 mit BanIII, BglII und XhoI gespalten, und ein DNA-Fragment mit ca. 1,4 kb und ein DNA-Fragment mit ca. 2,7 kb werden mittels der LGT-Methode gereinigt. Ligation unter Verwendung der T4 DNA-Ligase der beiden solchermaßen erhaltenen DNA-Fragmente und der in Abbildung 7 gezeigten synthetischen DNA-Linker ergibt pCfBB101, pCfBC52, pCfBC59 pCfBD28, pCfBD56, pCfBC42B1, pCfBC45, pCfBC76, pCfBC77, pCfBC93, pCfBC95, pCfBC97 und pCfBD82.
Wie in Fig. 8 gezeigt, wird pBR322 mit PstI gespalten, die überstehenden Enden werden mit T4 DNA-Polymerase abgeschnitten, der BglII-Linker wird unter Verwendung von T4 DNA-Ligase insertiert, und nach weiterer Spaltung mit EcoRI und BglII wird ein DNA-Fragment mit ca. 3,6 kb mittels der LGT-Methode gereinigt.
Die in der obigen Weise erhaltenen Plasmide pCfBB101, pCfBC52, pCfBC59, pCfBD28 und pCfBD56 werden jeweils mit EcoRI und BglII gespalten, und ein DNA-Fragment mit ca. 1,8 kb wird mittels der LGT-Methode gereinigt. Jedes 1,8 kb DNA-Fragment wird unter Verwendung von T4 DNA-Ligase mit dem pBR322-hergeleiteten 3,6 kb DNA-Fragment ligiert. Es werden somit pCfCB101, pCfCC52, pCfCC59, pCfCD28 und pCfCD56 erhalten, welche sich auf die jeweiligen oben erwähnten Plasmide beziehen.
Auf der anderen Seite wird pCfBA8 mit BanIII und BglII gespalten, und ein DNA-Fragment mit ca. 2,7 kb wird mittels der LGT-Methode gereinigt. Getrennt davon wird pCfBA8 mit XhoI und BglII gespalten, und ein DNA-Fragment mit ca. 1,4 kb wird mittels der LGT-Methode gereinigt. Ligation der so erhaltenen beiden Fragmente und dem in Fig. 14 gezeigten synthetischen DNA-Linker ergibt pCfTNS7 und pCfTAArg4S. Zusätzlich wird, wie in Fig. 15 gezeigt, pCfTNS7 mit PvuI und XhoI gespalten, und ein DNA-Fragment mit ca. 1 kb wird mittels der LGT-Methode gereinigt. Getrennt davon wird pCfBA32 mit PvuI und XhoI gespalten, und ein DNA-Fragment mit ca. 3 kb wird mittels der LGT-Methode gereinigt. Die so erhaltenen zwei Fragmente werden unter Verwendung von T4 DNA-Ligase ligiert, was pCfTN205 ergibt. Ähnlich wird pCfTAArg4S mit PvuI und XhoI gespalten, ein Fragment mit ca. 1 kb mittels der LGT-Methode gereinigt und dieses Fragment unter Verwendung von T4 DNA-Ligase mit einem DNA-Fragment von ca. 3 kb, hergeleitet aus dem oben erwähnten Plasmid pCfBA32 durch Spaltung mit PvuI und XhoI ligiert, was pCfTAArg4 ergibt. pCfBA8 wird mit BanIII und BglII gespalten und ein DNA-Fragment mit ca. 2,7 kb wird mittels der LGT- Methode gereinigt. Getrennt davon wird pCfBA8 mit HindIII und BglII gespalten, und ein DNA-Fragment von ca. 1,4 kb wird mittels der LGT-Methode gereinigt. Die beiden so erhaltenen Fragmente und der in Fig. 16 gezeigte synthetische Linker werden unter Verwendung von T4 DNA-Ligase zusammenligiert, was pCfTNS301 und pCfTNS401 ergibt. Weiterhin wird, wie in Fig. 12 gezeigt, pCfBA8 mit XhoI gespalten, die überstehenden Enden werden durch Behandlung mit dem Klenow-Fragment in glatte Enden überführt, und, nach weiterer Spaltung mit PvuI, wird ein DNA- Fragment mit ca. 3 kb mittels der LGT-Methode gereinigt. Getrennt davon wird der ATG-Vektor pTrS20 (Vergleichsbeispiel 4) mit SacI gespalten, gefolgt durch Konversion der überstehenden Enden in glatte Enden durch Klenow-Fragment- Behandlung. Nach weiterer Spaltung mit PvuI wird ein DNA- Fragment mit ca. 1 kb mittels der LGT-Methode gereinigt. Die so erhaltenen zwei Fragmente werden unter Verwendung von T4-DNA- Ligase zusammenlegiert, was pCfTNS501 ergibt.
In einem Beispiel, in dem ortsspezifische Mutagenese verwendet wird, wird pCfBD28 mit BanIII und PstI gespalten, wie in Fig. 17 gezeigt, und ein DNA-Fragment mit ca. 210 bp wird mittels der LGT-Methode gereinigt. Getrennt davon wird die M13- Phagenvektor M13mp19RF-DNA mit AccI und PstI gespalten, und ein DNA-Fragment mit ca. 7,24 kb wird mittels der LGT-Methode gereinigt. Die so erhaltenen zwei DNA-Fragmente werden unter Verwendung von T4 DNA-Ligase zusammenlegiert, was pt19BD28N ergibt. Sodann wird dieses pt19BD28N zur Transfektion von E. coli JM105 verwendet, und einzelsträngiges pt19BD28N wird aus den erhaltenen Phagen gewonnen. Ähnlich wird, wie ebenfalls in Fig. 17 gezeigt, die M13mp19RF-DNA mit HindIII und EcoRI gespalten, und ein DNA-Fragment mit ca. 7,2 kb wird mittels der LGT-Methode gereinigt. Nachdem dieses 7,2 kb DNA-Fragment mit dem in der obigen Weise erhaltenen einzelsträngigen pt19BD28N gemischt wird, wird eine "gapped duplex" DNA-Formation durch Denaturierungs-Behandlung, gefolgt von von einer Anlagerung, erzeugt, und die resultierende "gapped duplex"-DNA wird mittels der LGT-Methode gereinigt. Sodann wird diese DNA an die in Fig. 17 gezeigte synthetische DNA angelagert und danach unter Verwendung des Klenow-Fragmentes und der T4 DNA-Ligase zirkularisiert. Diese zirkularisierte DNA wird zur Transfektion von E. coli JM105 verwendet, wobei die ortsspezifisch mutagenisierten pt19BD28NA17 und pt19BD28NT17 erhalten werden. Weiterhin werden, wie ebenfalls in Fig. 17 gezeigt, pt19BD28NA17 und pt19BD28NT17 mit AvaI und XhoI gespalten, und jedes DNA-Fragment mit ca. 110 bp wird mittels der LGT-Methode gereinigt. Getrennt davon wird pCfBD28 mit XhoI und BglII gespalten, und ein DNA-Fragment mit ca. 2,74 kb wird mittels der LGT-Methode gereinigt. Weiterhin wird getrennt davon pCfBD28 mit BglII und AvaI gespalten, und ein DNA-Fragment mit ca. 1,29 kb wird mittels der LGT-Methode gereinigt. Ligation unter Verwendung von T4 DNA-Ligase der so erhaltenen DNA- Fragmente mit ca. 110 bp, ca. 2,74 kb und ca. 1,29 kb ergeben pCfBD28A17 bzw. pCfBD28T17.
Die Reaktionsbedingungen der obigen rekombinanten DNA- Technologie sind allgemein wie folgt:
Die DNA-Verdaureaktion in Gegenwart eines Restriktions-enzymes oder -enzymen wird allgemein unter Verwendung von 0,1-20 ug DNA in einem Reaktionsgemisch, enthaltend 2-200 mM (vorzugsweise 10-40 mM) Tris-HCl (pH 6,0-9,5, vorzugsweise 7,0-8,0), 0-200 mM NaCl und 2-20 mM (vorzugsweise 5-10 mM) MgCl&sub2;, bei 20-70ºC (die optimale Temperatur variiert in Abhängigkeit des(r) verwendete(n) Restriktionsenzyme(s)) für 15 Minuten bis 24 Stunden durchgeführt. Die Restriktionsenzyme werden jeweils in einer Menge von 0,1-100 Einheiten (vorzugsweise 1-3 Einheiten) pro Mikrogramm DNA verwendet. Die Termination der Reaktion wird allgemein durch Erhitzen auf 55-75ºC für 5-30 Minuten erreicht. Ebenso ist es möglich, die Restriktionsenzyme mit einem Reagenz wie Phenol oder Diethylpyrocarbonat zu inaktivieren.
Die durch den Restriktionsenzym-Verdau gebildeten DNA-Fragmente oder die "gapped duplex" DNAs können unter anderem mittels der LGT-Methode oder durch Polyacrylamid-Geleletro-phorese [A. M. Maxam et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 560 (1977)] gereinigt werden.
Die DNA-Fragment-Ligationsreaktion wird unter Verwendung von 0,3 bis 10 Einheiten T4-DNA-Ligase in einer Reaktionsmischung, enthaltend 2-200 mM (vorzugsweise 10-40 mM) Tris-HCl (pH 6,1-9,5, vorzugsweise 7,8-8,0), 2-20 mM (vorzugsweise 5-10 mM) MgCl&sub2;, 0,1-10 mM (vorzugsweise 0,5-2,0 mM) ATP und 1-50 mM (vorzugsweise 5-10 mM) Dithiothreitol, bei 1-37ºC (vorzugsweise 3-20ºC) für 15 Minuten bis 72 Stunden (vorzugsweise 2-20 Stunden) durchgeführt.
Die durch die Ligations-Reaktion erhaltene rekombinante Plasmid-DNA kann, wenn gewünscht, gemäß der Transformations- Methode nach Cohen et al. [S.N. Cohen et al: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972] in E. coli eingeführt werden.
Die durch die Ligations-Reaktion gebildeten rekombinanten M13- Phagen RF-DNAs werden - wo notwendig - unter Verwendung der bekannten Transfektionsmethode [Yoshiyuki Kuchino et al.: Tanpakushitsu, Kakusan, Koso (Protein, Nucleic Acid and Enzyme), 29, 294 (1984)] in E. coli JM105 [J. Messing et al.: Gene, 33, 103 (1985)] eingebracht.
Die rekombinanten Plasmid-DNAs und rekombinanten M13-Phagen RF- DNAs können zum Beispiel mittels der Methode von Birnboim et al. [H.C. Birnboim et al.: Nucleic Acids Res.; 7, 1513 (1979)] aus den entsprechenden E. coli Transformanden isoliert werden.
Die Isolierung von einzelsträngiger DNA des rekombinanten M13- Phagen wird mittels der bekannten Methode [Yoshiyuki Kuchino et al.: Tanpakushitsu, Kakusan, Koso, 29, 294 (1984)] durchgeführt.
Die Plasmid-DNAs werden nach erfolgter Spaltung mit 1-10 Restriktionsenzymen mittels Agarose-Gelelektrophorese oder Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf Spaltstellen hin untersucht. Weitere DNA-Basensequenzbestimmung wird, wenn notwendig, mittels der Didesoxy-Sequenzierungsmethode unter Verwendung des M13-Phagen [J. Messing et al.: Gene, 19, 269 (1982)] durchgeführt.
Die gewünschten rekombinanten Plasmid-DNAs können unter solchen, wie oben erwähnten Bedingungen produziert werden. Die hG-CSF-Polypeptid-Derivate der Erfindung können in folgender Weise hergestellt werden.
So wird E. coli K-12 HB101 mit einem geeigneten Plasmid (z. B. pCfBD28) transformiert, und ein Plasmid- (z. B. pCfBD28)tragender E. coli-Transformand wird aus Ampicillin-resistenten (im folgenden Apr)-Kolonien ausgewählt. Das Wachstum des Plasmid- (z. B. pCfBD28)-tragenden E. coli-Stammes in einem Medium kann zur Formation eines hG-CSF Polypeptid-Derivates in der Kultur führen.
Jedes Medium, ob synthetisch oder natürlich, kann verwendet werden, vorausgesetzt, daß es zum Wachstum von E. coli und zur Produktion des hG-CSF Polypeptid-Derivates geeignet ist.
Nutzbare Kohlenstoff-Quellen beinhalten, neben anderen, Glucose, Fructose, Lactose, Glycerin, Mannit und Sorbit, und nutzbare Stickstoff-Quellen sind NH&sub4;Cl, (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, Casaminosäuren, Hefeextrakt, Polypepton, Fleischextrakt, Bactotrypton, Maisquellwasser ("corn steep liquor") usw., K&sub2;HPO&sub4;, KH&sub2;PO&sub4;, NaCl, MgSO&sub4;, Vitamin B&sub1;, MgCl&sub2; und so weiter können als andere Nahrungsquellen genutzt werden. Die Kultivierung wird unter Belüftung und Rühren bei einem pH von 5,5-8,5 und einer Temperatur von 18-40ºC durchgeführt. Eine Kultivierung für 5-90 Stunden führt zur Akkumulation eines hG- CSF Polypeptid-Derivates in den kultivierten Zellen. Die Zellen werden dann aus der Kultur geerntet und durch Ultraschall zertrümmert. Eine Zentrifugation liefert die Zellrückstände.
Das hG-CSF Polypeptid-Derivat wird aus den Zellrückständen extrahiert, gereinigt, gelöst und renaturiert durch die Methode von Marston et al. [F. A. O. Marston et al.: BIO/TECHNOLOGY, 2, 800 (1984)]. Maus-Knochenmarkzellen werden mit dem Derivat behandelt, und das hG-CSF Polypeptid-Derivat wird mit der Methode, bei der die Zahl von in Weichagar geformten Kolonien als Index verwendet wird, untersucht.
Bei Anwendung der Erfindung wird die hG-CSF-Aktivität in der folgenden Weise bestimmt. Knochenmarkszellen werden aseptisch aus dem Femur männlicher, 8-12 Wochen alter C3H/He-Mäusen (Shizuoka Laboratory Animal Center) gesammelt und in α-Minimum Essential Medium (Flow Laboratories; im folgenden als α-MEM bezeichnet), ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum (FBS), suspendiert. In eine Säule gepackte Nylon-Wolle (0,3 g; Wako Pure Chemical Industries' Nylon Fiber 146-04231) wird mit 1,5 ml der obigen Zell-Suspension imprägniert (ca. 5 · 10&sup7; Zellen), und die Reaktion wird in einem 5%-CO&sub2; Inkubator bei 37ºC für 90 Minuten fortgeführt. Sodann wird α-MEM vorher auf 37ºC erwärmt, über die Säule gegeben, und nicht auf der Nylon- Wolle absorbierte Knochenmarkszellen werden als Effluens- Fraktion gesammelt. Die Zellen werden einmal mit α-MEM gewaschen, und die Zellkonzentration wird auf einen vorbestimmten Wert eingestellt.
Danach wird das Vermögen, myelopoetische Stammzell-Kolonien zu bilden, mittels der Methode von Okabe et al. [T. Okabe, et al.: Cancer Research, 44, 4503-4506 (1986)] bestimmt. So werden 0,2 ml der Knochenmarkszell-Suspension (2 · 10&sup6;-Zellen/ml), präpariert in der obigen Weise, mit einem Gemisch von 0,2 ml α- MEM, 0,4 ml FBS und 0,2 ml von jeder 2-fach verdünnten Probe vermischt. Ein jeweils gleiches Volumen (1,0 ml) einer bei 42ºC gehaltenen 0,6% Agarlösung (Difco, gereinigter Agar 0506-01) wird mit dem obigen Gemisch vermischt, und das resultierende Gemisch wird in 0,5 ml-Portionen auf einer Mikrotiterplatte, die 24 Vertiefungen ("well") (Nunc's Multidish #143982) (5 · 10&sup4; Zellen/Vertiefung, n=3) aufweist, verteilt. Nach 7-tägiger Inkubation bei 37ºC in einem 5%-CO&sub2;-Inkubator werden Kolonien, die nicht weniger als 40 Zellen umfassen, unter einem Mikroskop (Olympus X40) gezählt. Nach dem Zählen wird jede Kolonie sorgfältig auf einen Objektträger transferiert, dort mit einer Aceton-Formalinmixtur für 30 Sekunden fixiert und einer Esterase-Doppelfärbung nach der Methode von Kubota et al. [K. Kubota, et al.: Exp. Hematology, 8, 339-344 (1980)] zur Identifizierung der Kolonie unterzogen.
Die Potenz jeder Probe wird für die 2-fache Verdünnung, basierend auf den Zellresultaten des Kolonie-Bildungstests, wie folgt berechnet. Die Aktivität, die die Hälfte des maximalen Kolonie-Bildungswertes ergab, der unter Verwendung von intaktem G-CSF als Standard erhalten wurde, wird als 50 Einheiten definiert. Die Potenz (in Einheiten) wird gemäß dieser Definition berechnet und unter Verwendung des Multiplikationsfaktors 20 zur Umwandlung in Aktivität pro Milliliter, auch hinsichtlich des Verdünnungsfaktors der Probe, benutzt. Die spezifische Aktivität wird ausgedrückt als Potenz (Einheiten/mg) pro Gewichtseinheit (mg) des Proteins. Die hG-CSF Polypeptid-Derivate, in denen eine oder mehrere Aminosäuren des N-terminalen Endes des hG-CSF Polypeptides fehlen, können auch durch enzymatischen Abbau hergestellt werden.
Die Derivate können natürlich durch enzymatischen Abbau von natürlichem hG-CSF als Ausgangsmaterial hergestellt werden. Da natürliches hG-CSF jedoch eine schwache Reaktivität gegenüber dem Enzym (Protease) besitzt, ist die Verwendung eines modifizierten hG-CSF, das eine erhöhte Reaktivität gegenüber der Protease besitzt, zur Produktion solcher Derivate mit hoher Aktivität in guten Ausbeuten vorzuziehen.
Vorzugsweise werden als Ausgangsmaterial die in Tabelle 2 gezeigten modifizierten hG-CSFs (a), (b), (c) und (d) verwendet, die aus Substitutionen von einer oder mehrerer Aminosäuren des N-terminalen Endes des hG-CSF-Polypeptides stammen. Die Modifizierungen (a), (b), (c) und (d) können durch Kultivierung der Bakterienstämme erhalten werden, die die Plasmide mit den korrespondierenden Basensequenzen, nämlich pCfBC59 (NC59), pCfBD28 (ND28), pCfBC95 (NC95) bzw. pCfTAArg4S (Arg4S) beinhalten, gefolgt von Isolierung und Reinigung mittels bekannter Methoden.
Geeigneterweise werden als Enzyme Endoproteasen, wie Serin- Protease und Thiol-Protease verwendet. Insbesondere können zum Beispiel Subtilisin A, Subtilisin BPN', Subtilisin Carlsberg, Subtilisin novo, Proteinase K, Nagase, Thermolysin, Endoproteinase Arg-C, Trypsin und α-Chymotrypsin erwähnt werden. Das Enzym wird in einer Menge von 3,4 · 10&supmin;&sup6; bis 8,5 · 10&supmin;³ Einheiten pro Milligramm des Ausgangsmaterials verwendet. Tabelle 2 Beispiele für N-terminal Protease-empfindliche hG-CSF-Derivate Modifiziertes Substituierte Aminosäure Plasmid* * Aminosäuren nach der Substitution. Die hochgestellten Indizes zeigen die Positionsnummern der relevanten Aminosäuren des N-Terminus an.
Nach Lösen des Ausgangsmaterials in einer wäßrigen Lösung, wie Tris-Hydrochlorid-Puffer oder Phosphat-Puffer und der Zugabe eines Enzyms wird die enzymatische Reaktion bei 10-37ºC für 30 Minuten bis 3 Tage durchgeführt.
Die gesamte Proteinmenge und die Proteinmenge werden mittels der folgenden Methoden bestimmt:
Die Bestimmung des gesamten Proteins wird mittels der Methode von M. M. Bradford [M. M. Bradford: Anal. Biochem., 72, 248 (1976)] durchgeführt.
Die Proteinmenge wird durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese mittels der Methode von Laemmli [U. K. Laemmli: Nature, 227, 680 (1970)] bestimmt, gefolgt von einer Messung auf einem Chromatoscanner (Shimadzu CS-930).
Die N-terminale Aminosäuresequenz des nach der enzymatischen Spaltung erhaltenen Peptides wird unter Verwendung eines automatischen Aminosäuresequenziergerätes "Gas-Phase Protein Sequencer Model 470A" (Applied Biosystems) in Kombination mit einem Spectra Physics "high-performance liquid chromatograph" bestimmt.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM

Die folgenden Beispiele illustrieren die Erfindung.

Beispiel 1

Konstruktion des hG-CSF Expressions-Plasmides pCfTA1 (s. Fig. 1)

Ein 2 ug-Teil der im Vergleichsbeispiel 1 erhaltenen pcSF1-2- DNA wurde in einer Gesamtmenge von 20 ul einer Lösung (im folgenden als "Y-100-Puffer"), enthaltend 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl&sub2;) 6 mM 2-Mercaptoethanol und 100 mM NaCl, gelöst. 10 Einheiten von jedem der Restriktionsenzyme ApaI (Boehringer Mannheim) und BamHI (Takara Shuzo; im weiteren wurden alle verwendeten Restriktionsenzyme, wenn nicht anders gekennzeichnet, von Takara Shuzo bezogen) wurden zugegeben, und die Reaktion wurde bei 37ºC für 4 Stunden durchgeführt. Aus dem Reaktionsgemisch wurden 0,4 ug eines 1,5 kb DNA-Fragmentes mittels der LGT-Methode gereinigt und zurückgewonnen.
Getrennt davon wurden 2 ug des Plasmides pLSA1, das mittels der Methode des Vergleichsbeispiels 3 präpariert wurde, in 20 ul Y- 100-Puffer gelöst, wurden 10 Einheiten jedes der Restriktionsenzyme BanIII (Toyobo) und BamHI zugegeben, und die Reaktion wurde bei 37ºC für 4 Stunden durchgeführt. Aus diesem Reaktionsgemisch wurden 0,8 ug eines 2,8 kb DNA-Fragmentes mittels der LGT-Methode gereinigt und zurückgewonnen.
Auf der anderen Seite wurde der folgende DNA-Linker synthetisiert, um die Codons, die für die ersten bis fünften N-terminalen Aminosäuren des reifen hG-CSF-Polypeptides codierten [Threonin¹ (ACA oder ACT), Prolin² (CCA oder CCT), Leucin³ (CTA), Glycin&sup4; (GGC) und Prolin&sup5; (CCC)], und das zur Expression erforderliche Initiationscodon (ATG) zu liefern, und um die Entfernung zwischen der SD-Sequenz und dem ATG, stromabwärts des Tryptophan-Promotors (Ptrp), auf eine geeignete Länge von 6-18 Bp. einzustellen:
Zuerst wurden die 26-mer und 20-mer einzelsträngigen DNAs mittels der Phosphotriester-Methode synthetisiert [R. Crea et al.: Proc. Nath. Acad. Sci. USA, 75, 5765 (1978)]. Das 26-mer und das 20-mer (jeweils 2 ug) wurden in 40 ul eines Puffers gelöst (im folgenden als "T4 Kinase-Puffer" bezeichnet), enthaltend 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM Dithiothreitol, 0,1 mM EDTA und 1 mM ATP. 30 Einheiten der T4 Polynucleotid-Kinase (Takara Shuzo; im folgenden soll das gleiche gelten) wurden zugegeben, und die Phosphorylierungs- Reaktion wurde bei 37ºC für 60 Minuten durchgeführt.
In 25 ul eines Puffers (im folgenden als "T4 Ligase-Puffer" bezeichnet), enthaltend 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 Mm MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreitol und 1 mM ATP, wurden 0,4 ug des auf die obige Weise erhaltenen pCSF1-2-hergeleiteten ApaI- BamHI-Fragmentes (1,5 kb) und 0,2 ug des auf die obige Weise erhaltenen pLSA1-hergeleiteten BanIII-BamHI-Fragmentes (2.8 kb) gelöst; 0,1 ug des oben erwähnten DNA-Linkers wurde zu dem Gemisch zugegeben. Zu dieser vermischten Lösung wurden weiterhin 6 Einheiten T4 DNA-Ligase addiert (erhalten von Takara Shuzo; im folgenden soll das Analoge gelten), und die Ligations-Reaktion wurde bei 4ºC für 18 Stunden durchgeführt.
Das so erhaltene rekombinante Plasmid-Gemisch wurde verwendet, um E. coli HB101 (Bolivar et al.: Gene, 2, 75 (1977)) mittels der Methode von Cohen et al. [S. N. Cohen et al.: Proc. Natl. Acad. Aci. USA, 69, 2110 (1972)] zu transformieren (im folgenden wurde diese Methode zur Transformation von E. coli verwendet), und eine Apr-Kolonie wurde erhalten. Die Plasmid-DNA wurde mittels einer bekannten Methode [E. C. Birnboim et al.: Nucleic Acids Res.; 7, 1513 (1979)] aus den kultivierten Zellen dieser Kolonie gewonnen (im folgenden wird diese Methode zur Plasmid-DNA-Trennung verwendet). Die Struktur des erhaltenen Plasmides wurde durch Spaltung mit BanIII, RsaI, PstI, HindIII und BglII, gefolgt von Agarose-Gelelektrophorese bestätigt. Dieses Plasmid wird pCfTA1 genannt. Die Basen-Sequenz des pCfTA1 in der Nachbarschaft der BanIII und HindIII-Stellen wurde mittels der Didesoxy-Sequenzierungsmethode unter Verwendung des M13-Phagen wie folgt bestätigt

Beispiel 2

Konstruktion des Plasmides pCfTB20 dem teilweise die 3'-nichttranslatierte Region der hG-CSF-cDNA fehlt (s. Fig. 2)

In 20 ul Y-100-Puffer wurden 2 ug des in Beispiel 1 erhaltenen hG-CSF Expressions-Plasmides pCfTA1 (4,3 kb) gelöst, 4 Einheiten des Restriktions-Enzymes BamHI wurden zugegeben, und die Verdau-Reaktion wurde bei 37ºC für 4 Stunden durchgeführt. Nach Extraktion mit einer Mischung gleicher Volumina Phenol und Chloroform (im folgenden als Phenol-Chloroform-Extraktion bezeichnet) wurden 1,8 ug eines DNA-Fragmentes durch Ethanol- Präzipitation gewonnen. Dieses DNA-Fragment wurde in 20 ul eines Puffers (im folgenden als "Klenow-Puffer" bezeichnet), enthaltend 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 7 mM MgCl&sub2; und 6 mM Mercaptoethanol, gelöst. Sodann wurden dATP, dTTP, dCTP und dGTP jeweils bis zu einer Konzentration von 1 mM zugegeben, und weiter nach Zugabe von 4 Einheiten des DNA-Polymerase I Klenow- Fragmentes (erhalten von Takara Shuzo; im folgenden soll das analoge gelten) wurde die Reaktion bei Raumtemperatur für 1 Stunde durchgeführt, wobei die überstehenden Enden in glatte Enden überführt wurden. Nach Phenol-Chloroform-Extraktion wurden 1,6 ug eines DNA-Fragmentes durch Ethanol-Präzipitation gewonnen. Dieses DNA-Fragment wurde in 20 ul Y-100-Puffer gelöst, 10 Einheiten EcoRI wurden zugegeben, und die Spaltungs- Reaktion wurde bei 37ºC für 4 Stunden durchgeführt. Aus dem Reaktionsgemisch wurde 1 ug eines 2,5 kb DNA-Fragmentes [BamHI (glatt)-EcoRI Fragment] mittels der LGT-Methode erhalten. Getrennt davon wurden 2 ug pCfTA1 in 20 ul Y-100-Puffer gelöst, 10 Einheiten von EcoRI wurden zugegeben, und die Spaltungs- Reaktion wurde bei 37ºC für 4 Stunden durchgeführt. Danach wurde NaCl bis zu einer NaCl-Konzentration von 150 mM zugegeben, woraufhin 10 Einheiten von DraI addiert wurden und die Spaltungs-Reaktion bei 37ºC für 4 Stunden durchgeführt wurde. Nach Bestätigung der kompletten Spaltung durch Agarose- Gelelektrophorese wurden 0,2 ug eines hG-CSF cDNA-enthaltenden 1,0 kb DNA-Fragmentes (EcoRI-DraI Fragment) mittels der LGT- Methode gereinigt und zurückgewonnen.
In 25 ul T4 Ligase-Puffer wurden 0,2 ug des BamHI (glatt)- EcoRI-Fragmentes (2.5 kb) und 0,2 ug des EcoRI-DraI Fragmentes (1.0 kb), jedes auf die obige Weise erhalten, gelöst. 6 Einheiten der T4 DNA-Ligase wurden zum resultierenden Gemisch zugegeben, und die Ligations-Reaktion wurde bei 4ºC für 18 Stunden durchgeführt.
Das so erhaltene rekombinante Plasmid-Gemisch wurde zur Transformation von E. coli HB101 verwendet, und eine Apr-Kolonie wurde erhalten. Aus von dieser Kolonie hergeleiteten kultivierten Zellen wurde eine Plasmid-DNA gewonnen. Die Struktur des erhaltenen Plasmides wurde durch Spaltung mit HindIII und PstI, gefolgt von Agarose-Gelelektrophorese, bestätigt. Dieses Plasmid wird als pCfTB20 bezeichnet.

Beispiel 3

Konstruktion der Plasmide pCfTL23, pCfTL38 pCfTL35 und pCfTL41, die für die Polypeptide codieren, die aus der Substitution der N-terminalen Aminosäuren des hG-CSF resultieren (s. Fig. 3)

In 60 ul Y-100 Puffer wurden 3 ug des mittels der Methode des Vergleichsbeispiels 1 erhaltenen pCSF1-2 (4,5 kb) gelöst. Jeweils 8 Einheiten der Restriktions-Enzyme ApaI (Boehringer Mannheim) und BamHI wurden zugegeben, und die Spaltungs- Reaktion wurde bei 37ºC für 3 Stunden durchgeführt. Aus diesem Reaktionsgemisch wurden 0,4 ug eines DNA-Fragmentes mit ca. 1,5 kb (ApaI-Bam-I Fragment) erhalten, das den größten Teil des hG-CSF-Gens enthielt.
Getrennt davon wurden 2 ug pGEL1 [Sekine et al.: Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 82, 4306 (1985)] (erhalten aus einer Kultur von E. coli IGEL1 FERM BP-629 mittels der geläufigen Methode) (3,4 kb) in 40 ul des Y-100-Puffers gelöst. Jeweils 4 Einheiten der Restriktions-Enzyme HindIII, BamHI und PstI wurden zugegeben, und die Spaltungs-Reaktion wurde bei 37ºC für 3 Stunden durchgeführt. Aus dem Reaktionsgemisch wurden mittels der LGT- Methode ca. 0,5 ug eines DNA-Fragmentes mit ca. 1,7 kb (PstI- BamHI-Fragment), enthaltend den Lipoprotein-hergeleiteten Terminator (lpp-Terminator), erhalten.
Getrennt davon wurden 3 ug von pKYP10, hergestellt mittels der in der Japanischen Patentanmeldung (OPI) Nr. 110600/83 beschriebenen Methode, in 60 ul des Y-100-Puffers gelöst. Jeweils 6 Einheiten der Restriktions-Enzyme BanIII (Toyobo) und PstI wurden zugegeben, und die Spaltungs-Reaktion wurde bei 37ºC für 3 Stunden durchgeführt. Aus dem Reaktionsgemisch wurden mittels der LGT-Methode 0,5 ug eines DNA-Fragmentes mit ca. 1,1 kb (BanIII-PstI (Fragment), enthaltend den Tryptophan- Promotor (Ptrp), erhalten.
Auf der anderen Seite wurde, in Hinsicht auf die Notwendigkeit der Substitution der N-terminalen Aminosäure des reifen hG-CSF, nämlich Thr, durch Ser, Cys, Arg oder Gly, und der Ausstattung mit dem zur Expression erforderlichen Initiations-Codon (ATG), und ebenso in Hinsicht auf die Einstellung der Entfernung zwischen der SD-Sequenz und dem ATG, stromabwärts des Ptrp, auf eine geeignete Länge von 6-18 Bp., und aus anderen Gründen, der folgende DNA-Linker synthetisiert:
In der obigen Formel bedeutet N eine der Basen G, A, T oder C. Zunächst wurden die 26-mer und 20-mer einzelsträngigen DNAs mittels der gewöhnlichen Phoshotriester-Methode synthetisiert. Das 26-mer und das 20-mer (jeweils 20 Picomol) wurden in 40 ul des T4 Kinase-Puffers gelöst. 6 Einheiten der T4 Polynucletodid-Kinase (Takara Shuzo) wurden zugegeben, und die Phosphorylierungs-Reaktion wurde bei 37ºC für 60 Minuten durchgeführt.
Sodann wurden 0,3 ug des pCSF1-2-hergeleiteten ApaI-BamHI- Fragmentes (ca. 1,5 kb), 0,2 ug des pGEL1-hergeleiteten PstI- BamHI-Fragmentes (ca. 1,7 kb) und 0,2 ug des Expressions- Vektors pKYP10-hergeleiteten BanIII-PstI-Fragmentes (ca. 1,1 kb), von denen jedes auf die obige Weise erhalten wurde, in einer Gesamtmenge von 30 ul des T4 Ligase-Puffers gelöst, und ca. 1 Picomol des obigen DNA-Linkers wurde zum Lösungsgemisch zugegeben. Nach weiterer Addition von 6 Einheiten der T4 DNA- Ligase zur Lösung wurde die Ligations-Reaktion bei 4ºC für 18 Stunden durchgeführt.
Das die rekombinanten Plasmide enthaltende Reaktionsgemisch wurde verwendet um E. coli C600SF8 (FERM BP-1070) [Cameron et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 3416 (1975)), zu transformieren, und Apr-Kolonien wurden erhalten. Aus diesen Transformanden wurden die Plasmid-DNAs mittels bekannter Methoden abgetrennt und gereinigt. Die Struktur jeder der Plasmid-DNAs wurde durch Spaltung mit PstI, EcoRI und BanIII, gefolgt von Polyacrylamid-Gelelektrophorese, bestätigt. Die auf diesem Wege erhaltenen Plasmide werden als pCfTL23, pCfTL38, pCfTL35 und PCfTL41 bezeichnet, wie in Fig. 3 dargestellt. Die Sequenzen in der Nachbarschaft des N-Terminus der hG-CSF- hergeleiteten Gene in den Plasmiden wurden mittels der Didesoxy-Sequenzierungsmethode unter Verwendung des M13-Phagens wie folgt bestätigt:
Die Substitution des N-terminalen Thr des reifen hG-CSF wurde in dem pCfTL23-codierten hG-CSF-Derivat bestätigt, das als hG- CSF[Gly¹] bezeichnet wird. Ähnlich wurde die N-terminale Aminosäuresubstitution durch Ser im pCfTL38-codierten hG-CSF- Derivat, das als hG-CSF[Ser¹] bezeichnet wird, Substitution durch Cys im pCfTL35-codierten hG-CSF-Derivat, das als hG- CSF[Cys¹] bezeichnet wird, und Substitution durch Arg im pCfTL41-codierten hG-CSF-Derivat, das als hG-CSF[Arg¹] bezeichnet wird, bestätigt.

Beispiel 4

Konstruktion der Plasmide pCfTM14 pCfTM17 und pCfTM113 die für Polypeptide codieren, die aus Substitutionen der N-terminalen und dritten Aminosäuren des hG-CSF resultieren (s. Fig. 4)

In 60 ul Y-100-Puffer wurden 3 ug des durch das Verfahren des Vergleichsbeispiels 1 erhaltenen pCSF1-2 (4,5 kb) gelöst. Jeweils 8 Einheiten von ApaI und BamHI wurden zugegeben, und die Spaltungs-Reaktion wurde bei 37ºC für 3 Stunden durchgeführt. Aus diesem Reaktionsgemisch wurden mittels der LGT- Methode ca. 0,4 ug eines DNA-Fragmentes mit ca. 1,5 kb (ApaI- BamHI Fragment), enthaltend den größten Teil des hG-CSF-Genes, erhalten.
Getrennt davon wurden 2 ug von pGEL1 (3,4 kb) in 40 ul des Y-100-Puffers gelöst. Jeweils 4 Einheiten der Restriktions-Enzyme HindIII, BamHI und PstI wurden zugegeben, und die Spaltungs- Reaktion wurde bei 37ºC für 3 Stunden durchgeführt. Aus diesem Reaktionsgemisch wurden mittels der LGT-Methode ca. 0,5 ug eines DNA-Fragmentes mit 1,7 kb (PstI-BamHI Fragment), enthaltend den Lipoprotein-Terminator, erhalten.
Weiterhin wurden getrennt 3 ug des pKYP10, hergestellt mittels des in der Japanischen Patentveröffentlichung (OPI) Nr. 110600/83 beschriebenen Verfahrens, in 60 ul des Y-100-Puffers gelöst. Jeweils 6 Einheiten der Restriktionsenzyme BanIII und PstI wurden zugegeben, und die Spaltungs-Reaktion wurde bei 37ºC 3 Stunden durchgeführt. Aus diesem Reaktionsgemisch wurden mittels der LGT-Methode ca. 0,5 ug eines Ptrp-enthaltenden DNA- Fragmentes mit ca. 1,1 kb (BanIII-PstI Fragment) erhalten.
Im Hinblick auf die Notwendigkeit der Substitution der N-terminalen Aminosäure Thr des reifen hG-CSF durch Ser und der dritten Aminosäure Leu des reifen hG-CSF durch Gly, Ser, Cys oder Arg, und um das zur Expression erforderliche Initiations- Codon (ATG) zu liefern, und ebenso hinsichtlich der Notwendigkeit, den Abstand zwischen der SD-Sequenz und dem ATG, stromabwärts des Ptrp, auf eine geeignete Länge von 6-18 Bp. einzustellen, und aus anderen Gründen, wurde der folgende DNA- Linker synthetisiert:
In der obigen Formel bedeutet N eine der Basen G, A, T oder C. Zunächst wurden die 26-mer und 20-mer einzelsträngigen DNAs mittels der geläufigen Phosphotriester-Methode synthetisiert. Das 26-mer und das 20-mer (jeweils 20 Picomol) wurden in 40 ul des T4 Kinase-Puffers gelöst. 6 Einheiten der T4 Polynukleotid- Kinase wurden zugegeben, und die Phosphorylierungs-Reaktion wurde bei 37ºC für 60 Minuten durchgeführt.
Sodann wurden 0,3 ug des pCSF1-2-hergeleiteten ApaI-BamHI- Fragmentes (ca. 1,5 kb), 0,2 ug des pGEL1-hergeleiteten PstI- BamHI-Fagmentes (ca. 1,7 kb) und 0,2 ug des BanIII-PstI- Fragmentes (ca. 1,1 kb) des Expressions-Vektors pKYP10, jedes auf die obige Weise erhalten, in 30 ul des T4 Ligase-Puffers gelöst, und ca. 1 Picomol des obigen DNA-Linkers wurde zum Lösungsgemisch zugegeben. Nach weiterer Addition von 6 Einheiten T4 DNA-Ligase zur Lösung, wurde die Ligations- Reaktion bei 4ºC für 18 Stunden durchgeführt.
Das die rekombinanten Plasmide enthaltende Reaktions-Gemisch wurde verwendet, um E. coli C600SF8 (FERM BP-1070) mittels der Methode von Cohen et al. zu transformieren, und Apr-Kolonien wurden erhalten. Die Plasmid-DNAs wurden aus diesen Transformanden durch bekannte Methoden abgetrennt und gereinigt. Die Struktur von jeder der Plasmid-DNAs wurde durch Spaltung mit PstI, EcoRI und BanIII, gefolgt von Polyacrylamid- Gelelektrophorese, bestimmt. Die auf die obige Weise erhaltenen Plasmide werden als pCfTM14, pCfTM17 und pCfTM113 bezeichnet, wie in Fig. 4 dargestellt. Die Sequenzen in der Nachbarschaft des N-Terminus der hG-CSF-Derivat-codierten Gene wurden mittels der Didesoxy-Sequenzierungsmethode unter Verwendung des M13- Phagen wie folgt bestätigt:
Die Substitution des N-terminalen Thr und der dritten Aminosäure Leu des reifen hG-CSF durch Ser bzw. Cys wurde in dem pCfTM14-codierten Derivat bestätigt, das als hG-CSF[Ser¹, Cys³] bezeichnet wird. Ähnlich wurde die Substitution des N-terminalen Thr und der dritten Aminosäure Leu durch Ser bzw. Arg in dem pCfTM17-codierten Derivaten, das als hG-CSF[Ser¹, Arg³] bezeichnet wird, und die Substitution des N-terminalen Thr und der dritten Aminosäure Leu durch Ser bzw. Ser in dem pCfTM113-codierten Derivates, das als hG-CSF[Ser¹, Ser³] bezeichnet wird, bestätigt.

Beispiel 5

(1) Konstruktion des rekombinanten Plasmides pCfWD1 (s. Fig. 5)

In 50 ul des Y-100-Puffers wurden 5 ug des durch das Verfahren des Beispiels 1 gewonnenen pCfTA1 gelöst.
10 Einheiten des Restriktions-Enzymes StuI und 10 Einheiten des Restriktions-Enzymes BanIII (Toyobo) wurden zugegeben, und die Verdau-Reaktion wurde bei 37ºC für 1 Stunde durchgeführt. Aus dem Reaktionsgemisch wurden ca. 0,5 ug eines hG-CSF cDNA- enthaltenden DNA-Fragmentes von ca. 1,3 kb(BanIII-StuI Fragment) erhalten. Getrennt davon wurden 3 ug des durch das Verfahren des Vergleichsbeispiels 2 hergestellten pKYP26 in 50 ul des Y-100-Puffers gelöst. 6 Einheiten von BamHI wurden zugegeben, und die Verdau-Reaktion wurde bei 37ºC für eine Stunde durchgeführt.
Dazu wurde das gleiche Volumen Phenol, gesättigt mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 1 mM EDTA, gegeben. Nach kräftigem Rühren wurde die wäßrige Phase durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit (3 300 UpM, 10 Minuten; im folgenden werden die gleichen Bedingungen verwendet) gesammelt. Das gleiche Volumen Chloroform wurde zugegeben, und nach kräftigem Rühren wurde die wäßrige Phase durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit gesammelt. Es wurden 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat und dann 2,5 Volumen Ethanol zugegeben, und das Gemisch wurde bei - 20ºC für 1 Stunde stehengelassen. Das Gemisch wurde durch Kalt- Zentrifugation (4ºC, 11 000 UpM, 10 Minuten) gesammelt. Dieses Präzipitat wurde in 30 ul Klenow-Puffer gelöst, dATP, dTTP, dCTP und dGTP wurden jeweils bis zu einer Konzentration von 100 uM zugegeben, 2 Einheiten des DNA-Polymerase I Klenow-Fragmentes wurden addiert, und die Reaktion wurde bei 17ºC für 15 Minuten durchgeführt. Das DNA-Polymerase I Klenow-Fragment wurde durch Behandlung bei 68ºC für 10 Minuten inaktiviert, wonach NaCl bis zu einer Konzentration 100 mM und 5 Einheiten des Restriktionsenzymes PstI zugegeben wurden, und die Verdau- Reaktion wurde bei 37ºC für 1 Stunde durchgeführt. Aus dem Reaktionsgemisch wurden mittels der LGT-Methode ca. 0,6 ug eines lpp-Terminator-enthaltenden DNA-Fragmentes mit ca. 1,8 kb [BamHI (glatt)-PstI (Fragment] erhalten. Getrennt davon wurden 4 ug von pGEL1 in 40 ul des Y-100-Puffers gelöst. Jeweils 10 Einheiten der Restriktions-Enzyme BanIII (Toyobo) und PstI wurden zugegeben, und die Verdau-Reaktion wurde bei 37ºC für 1 Stunde durchgeführt. 0,4 ug des Tryptophan-Promotor-enthaltenden DNA-Fragmentes mit ca. 1 kb (BanIII-PstI-Fragment) wurden mittels der LGT-Methode aus dem Reaktionsgemisch erhalten.
Circa 0,2 ug des pCfTA1-hergeleiteten BanIII-StuI-Fragmentes (ca. 1,3 kb), ca. 0,1 ug des pKYP26-hergeleiteten BamHI glatt- PstI-Fragmentes (ca. 1,8 kb) und ca. 0,1 4 des pGEL1- hergeleiteten BanIII-PstI-Fragmentes (ca. 1 kb) wurden in 30 ul des T4 DNA-Ligase-Puffers gelöst. 4 Einheiten der T4 DNA-Ligase wurden zugegeben und die Ligations-Reaktion wurde bei 4ºC für 18 Stunden durchgeführt.
Das Reaktionsgemisch wurde verwendet, um E. coli HB101 zu transformieren, eine Apr-Kolonie wurde erhalten, und die
Plasmid-DNA wurde aus dieser Kolonie mit der oben erwähnten Methode von Birnboim et al. zurückgewonnen. Das erhaltene pCfWD1 ist in Fig. 5 gezeigt.

(2) Konstruktion des pCfT95K19 (s. Fig. 6)

In 50 ul des Y-100-Puffers wurden 5 ug des durch das Verfahren des Beispiels 3 erhaltenen pCfTL38 gelöst. Jeweils 10 Einheiten der Restriktions-Enzyme HindIII und BglII wurden zugegeben, und die Verdau-Reaktion wurde bei 37ºC 1 Stunde durchgeführt. Circa 0,7 ug eines Tryptophan-Promotor-enthaltenden DNA-Fragmentes mit ca. 2,6 kb (HindIII-BglII-Fragment) wurden aus dem Reaktionsgemisch mittels der LGT-Methode erhalten. Getrennt davon wurden 100 ug des pCfTL38 in 1,5 ml des Y-100-Puffers gelöst. Jeweils 80 Einheiten der Restriktions-Enzyme BamHI und HindIII wurden zugegeben, und die Verdau-Reaktion wurde bei 37ºC für 6 Stunden durchgeführt. Ein hG-CSF cDNA-enthaltendes DNA-Fragment wurde mittels der LGT-Methode aus dem Reaktionsgemisch zurückgewonnen und unter Verwendung von ELUTIPTM-d (Schleicher & Schuell) gereinigt. Dieses DNA- Fragment wurde in einem Gesamtvolumen von 90 ul einer Lösung, enthaltend 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl&sub2;, 150 mM NaCl und 6 mM 2-Mercaptoethanol (im folgenden als "Y-150-Puffer" bezeichnet), gelöst. 3 Einheiten des Restriktions-Enzymes DpnI (Boehringer Mannheim) wurden zugegeben, und die Verdau-Reaktion wurde bei 37ºC für 15 Minuten durchgeführt. Circa 1 ug eines hG-CSF cDNA-enthaltenden DNA-Fragmentes von ca. 300 Bp (HindIII-DpnI-Fragment) wurde durch Polyacrylamid- Gelelektrophorese aus dem Reaktionsgemisch erhalten.
Getrennt davon wurden 10 ug des durch das Verfahren des Beispiels 2 gewonnenen pCfTB20 in 100 ul des Y-100-Puffers gelöst. 10 Einheiten des Restriktions-Enzymes AvaI wurden zugegeben, und die Verdau-Reaktion wurde bei 37ºC für 1 Stunde durchgeführt. Die aus dem Verdau durch Phenol-Chloroform- Extraktion und Ethanol-Präzipitation zurückgewonnene DNA wurde in 30 ul Klenow-Puffer gelöst, 2 Einheiten des DNA-Polymerase I Klenow-Fragmentes wurden zugegeben und die Reaktion wurde bei 17ºC für 30 Minuten durchgeführt. Das DNA-Polymerase I Klenow- Fragment wurde durch Behandlung bei 68ºC für 10 Minuten inaktiviert, und NaCl wurde bis zu 100 mM zugegeben. 10 Einheiten des Restriktionsenzymes BglII wurden zugegeben, und die Verdau-Reaktion wurde bei 37ºC für 1 Stunde durchgeführt. Circa 0,3 ug eines DNA-Fragmentes von ca. 480 bp. [AvaI(glatt)- BglII-Fragment, das einen Teil des lpp-Terminators enthielt, wurde mittels der LGT-Methode aus dem Reaktionsgemisch erhalten.
In 30 ul des T4 DNA-Ligase-Puffers wurden ca. 0,1 ug des pCfTL38-hergeleiteten HindIII-BglII-Fragmentes (ca. 2,6 kb), ca. 0,2 ug des pCfTL38-hergeleiteten HindIII-DpnI-Fragmentes (ca. 300 Bp.) und ca. 0,15 ug des pCfTB20-hergeleiteten AvaI(glatt)-BglII-Fragmentes (ca. 480 Bp.), jeweils in der obigen Weise erhalten, gelöst. Nach Zugabe von 4 Einheiten der T4 DNA-Ligase wurde die Ligations-Reaktion bei 4ºC für 18 Stunden durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde verwendet, um E. coli HB101 zu transformieren und eine Apr-Kolonie wurde erhalten. Aus dieser Kolonie wurde die Plasmid-DNA mittels der oben erwähnten Methode von Birnboim et al. zurückgewonnen. Das so erhaltene pCfT95K19 ist in Fig. 6 gezeigt.

(3) Konstruktion des pCfAA1 (s. Fig. 6)

In 50 ul des Y-100-Puffers wurden 5 ug des pCfT95K19, das wie im vorstehenden Kapitel beschrieben erhalten wurde, gelöst.
Dazu wurden 7 Einheiten des Restriktions-Enzymes BanIII (Toyobo) und 2 Einheiten des BglI (Nippon Gene) addiert, und die Verdau-Reaktion wurde bei 37ºC für 1 Stunde durchgeführt. Aus dem Reaktionsgemisch wurden mittels der LGT-Methode ca. 0,6 ug eines DNA-Fragmentes von ca. 1 kb (BanIII-BglI-Fragment), das einen Teil des Tryptophan-Promotors enthielt, und ca. 1 ug eines DNA-Fragmentes mit ca. 1,8 kb (BglI-BglI-Fragment), das einen Teil des lpp-Terminators enthielt, erhalten. Getrennt davon wurden 15 ug des pCfT95K19 in 150 ul des Y-100- Puffers gelöst. 6 Einheiten des Restriktionsenzymes BglI (Nippon Gene) und 10 Einheiten des Sau3A wurden zugegeben, und die Verdau-Reaktion wurde bei 37ºC für 1 Stunde durchgeführt. Eine Polyacrylamid-Gelelektrophorese des Reaktionsgemisches ergab ca. 0,3 ug eines DNA-Fragmentes mit ca. 350 Bp. (BglI- Sau3A-Fragment), das einen Teil der hG-CSF cDNA enthielt.
Weiterhin wurde getrennt davon der folgende DNA-Linker synthetisiert:
Zunächst wurden die 39-mer und 41-mer einzelsträngigen DNAs mittels der gewöhnlichen Phosphotriester-Methode synthetisiert. Das 39-mer und das 41-mer (jeweils 20 Picomol) wurden in einem Gesamtvolumen von 40 ul des T4 DNA-Kinase-Puffers gelöst. 6 Einheiten der T4 Polynukleotid-Kinase (Takara Shuzo) wurden zugegeben, und die Phosphorylierungs-Reaktion wurde bei 37ºC für 60 Minuten durchgeführt.
Sodann wurden 0,1 ug des pCfT95K19-hergeleiteten BanIII-BglI- Fragmentes (ca. 1 kb), 0,05 ug des BglI-BglI-Fragmentes (ca. 1,8 kb) und 0,1 ug des BglI-Sau3A-Fragmentes (ca. 350 Bp), jeweils auf die obige Weise erhalten, in 25 ul des T4 DNA- Ligase-Puffers gelöst, gefolgt von der Addition von ca. 2 Picomol des obigen DNA-Linkers. Nach weiterer Zugabe von
6 Einheiten der T4-DNA-Ligase wurde die Ligations-Reaktion bei 4ºC für 18 Stunden durchgeführt.
Das Reaktionsgemisch wurde verwendet um E. coli HB101 zu transformieren. Eine Apr-Kolonie wurde erhalten, und die Plasmid-DNA wurde aus dieser Kolonie mittels der obenerwähnten Methode von Birnboim et al. zurückgewonnen. Somit wurde das in Fig. 6 gezeigte pCfAA1 erhalten. Die Bestimmung der Basensequenz des Linker-Anteils des pCfAA1 durch die obenerwähnte Didesoxy-Sequenzierungsmethode zeigte, daß die dritte Base des Codons, das für die vierte Aminosäure Leu codiert, ein A ist. In diesem pCfAA1 fehlt der DNA-Teil, der für 14 Aminosäuren von der 10. Aminosäure Pro bis zur 23. Aminosäure Lys des hG-CSF codiert. Weiterhin ist eine solche Mutation eingeführt worden, die die 6. Aminosäure des hG-CSF von Ala nach Asn ändert, und dort ist nun eine neue XhoI-Stelle.

(4) Herstellung des pCfAB5 (s. Fig. 6)

In 30 ul des Y-100-Puffers wurden 3 ug des pCfAA1, das wie in dem vorhergehenden Kapitel beschrieben erhalten wurde, gelöst. 5 Einheiten des Restriktions-Enzymes XhoI wurden zugegeben, und die Verdau-Reaktion wurde bei 37ºC für 1 Stunde durchgeführt. Nach Bestätigung der vollständigen XhoI-Spaltung durch Agarose- Gelelektrophorese wurde 1 Einheit des Restriktions-Enzymes BglI (Nippon Gene) zugegeben, und ein partieller Verdau wurde bei 37ºC für 25 Minuten bewirkt. Aus dem Reaktionsgemisch wurde mittels der LGT-Methode ca. 1 ug eines DNA-Fragmentes von ca. 3 kb (XhoI-BglI-Fragment), das einen Teil des Tryptophan- Promotors und einen Teil des lpp-Terminators enthielt, erhalten. Getrennt davon wurde der folgende DNA-Linker synthetisiert:
(N ist G, A T oder C).
Diese Linker-DNA enthält den DNA-Teil, der für die 14 Aminosäuren des hG-CSF von der 10. Aminosäure Pro bis zur 23. Aminosäure Lys codiert. Dieser Teil fehlt in der hG-CSF-cDNA des pCfAA1.
Zunächst wurden die 27-mer, 25-mer (zwei Arten) und 23-mer einzelsträngigen DNAs mittels der gewöhnlichen Phosphotriester- Methode synthetisiert. Die jeweils komplementären 27-mer und 25-mer DNAs und die jeweils komplementären 25-mer und 23-mer DNAs wurden in einer Menge von 20 Picomol paarweise in einem Gesamtvolumen von 40 ul des T4 Kinase-Puffers gelöst.
6 Einheiten der T4 Polynukleotid-Kinase (Takara Shuzo) wurde zu jeder Lösung zugegeben, und die Phosphorylierungs-Reaktion wurde bei 37ºC für 60 Minuten durchgeführt.
Sodann wurden 0;1 ug des pCfAA1-hergeleiteten XhoI-BglI- Fragmentes (ca. 3 kb), das wie oben beschrieben erhalten wurde, und 0,1 ug des pCfT95K19-hergeleiteten BglI-Sau3A-Fragmentes (ca. 350 Bp), das wie in den vorhergehenden Kapitel beschrieben erhalten wurde, in 30 ul des T4 DNA-Ligase-Puffers gelöst, und 2 Picomol von jedem der obigen DNA-Linker-Teile wurden zum Lösungsgemisch zugegeben. Weiterhin wurden 6 Einheiten der T4- DNA-Ligase zugegeben, und die Ligations-Reaktion wurde bei 4ºC 18 Stunden durchgeführt.
Das Reaktionsgemisch wurde verwendet, um E. coli HB101 zu transformieren und Apr-Kolonien wurden erhalten. Aus diesen Kolonien wurden die Plasmid-DNAs mittels der oben erwähnten Methode von Birnboim et al. zurückgewonnen. Es wurden somit die in Fig. 6 gezeigten pCfAB5 und pCfAB14 erhalten. Die Bestimmung der Basensequenz des DNA-Linker-Teils von pCfAB5 und von pCfAB14 mittels der oben erwähnten Didesoxy-Sequenzierungsmethode ergab, daß die erste Base des Codons, das für die 17. Aminosäure codiert, ein A in pCfAB5 und ein T in pCfAB14 ist, was das Codon für Ser (AGC) im ersten und für Cys (TGC) im letzteren Falle bedeutet, was zu einer Substitution von Ser für die 17. Aminosäure Cys des reifen hG-CSF im pCfAB5 führt, aber zu keiner Substitution im pCfAB14.

Beispiel 6

(1) Konstruktion von pCfBA8 und pCfBA32 (s. Fig. 7)

In 40 ul des Y-100-Puffers wurden 3 ug des pCfAB5, das wie in dem vorhergehenden Kapitel beschrieben erhalten wurde, gelöst. Jeweils 5 Einheiten der Restriktions-Enzyme AvaI und BglII wurden zugegeben, und die Verdau-Reaktion wurde bei 37ºC für 1 Stunde durchgeführt. Aus dem Reaktionsgemisch wurde mittels der LGT-Methode ca. 1 ug eines DNA-Fragmentes mit ca. 2,8 kb (AvaI- BglII-Fragment) erhalten, das einen Teil des Tryptophan- Promotors und einen Teil des lpp-Terminators enthielt.
Getrennt davon wurden 6 ug des pCfWD1, erhalten wie in Sektion 1 beschrieben, in 50 ul des Y-100-Puffers gelöst.
5 Einheiten des Restriktions-Enzymes BglII wurden zugegeben, und die Verdau-Reaktion wurde bei 37ºC für 1 Stunde durchgeführt. Eine Agarose-Gelelektrophorese bestätigte, daß die Spaltung mit BglII vollständig war. Danach wurden 3 Einheiten des Restriktions-Enzymes AvaI zugegeben, und eine Partialspaltung wurde bei 37ºC für 20 Minuten vorgenommen. Aus dem Reaktionsgemisch wurden mittels der LGT-Methode 0,4 ug eines DNA-Fragmentes (ca. 1,3 kb) erhalten, das den größten Teil des hG-CSF (BglII-Ava-I-Fragment) enthielt.
Sodann wurden 0,1 ug des pCfAB5-hergeleiteten AvaI-BglII- Fragmentes (ca. 2,8 kb) und 0,3 ug des pCfWD1-hergeleiteten BglII-AvaI-Fragmentes (ca. 1,3 kb), jedes wie oben beschrieben erhalten, in 25 ul des T4 DNA-Ligase-Puffers gelöst.
3 Einheiten der T4 DNA-Ligase wurden zugegeben, und die Ligations-Reaktion wurde bei 4ºC für 18 Stunden durchgeführt.
Das Reaktionsgemisch wurde verwendet, um E. coli HB101 zu transformieren, und eine Apr-Kolonie wurde erhalten. Aus dieser Kolonie wurde die Plasmid-DNA mittels der oben erwähnten Methode nach Birnboim et al zurückgewonnen. So wurde pCfBAb erhalten, dargestellt in Fig. 7.
Die durch pCfBA8-codierte Aminosäurensequenz des hG-CSF- Derivates enthält Asn anstelle der 6. Aminosäure Ala des reifen hG-CSF und Ser anstelle der 17. Aminosäure Cys. Im folgenden wird dieses Derivat als hG-CSF [NA8] bezeichnet werden.
Auf der anderen Seite wurden 3 ug des pCfAB14, das wie in dem vorhergehenden Kapitel beschrieben erhalten wurde, in 40 ul des Y-100-Puffers gelöst. Jeweils 5 Einheiten der Restriktions- Enzyme AvaI und BglII wurden zugegeben, und die Verdau-Reaktion wurde bei 37ºC für 1 Stunde durchgeführt. Aus dem Reaktionsgemisch wurde mittels der LGT-Methode ca. 1 ug eines DNA- Fragmentes mit ca. 2,8 kb (AvaI-BglII-Fragment), das einen Teil des Tryptophan-Promotors und einen Teil des lpp-Terminators enthielt, erhalten.
Getrennt davon wurden 6 ug des pCfWD1, erhalten wie in Kapitel 1 beschrieben, in 50 ul des Y-100-Puffers gelöst.
5 Einheiten des Restriktions-Enzymes BglII wurden zugegeben, und die Verdau-Reaktion wurde bei 37ºC für 1 Stunde durchgeführt. Nach Bestätigung der Vollständigkeit der BglII- Spaltung durch Agarose-Gelelektrophorese wurden 3 Einheiten des Restriktions-Enzymes AvaI zugegeben, und eine Partialspaltung wurde bei 37ºC für 20 Minuten bewirkt. Aus dem Reaktionsgemisch wurden mittels der LGT-Methode 0,4 ug eines DNA-Fragmentes (ca. 1,3 kb) erhalten, das den größten Teil der hG-CSF-cDNA (BglII- AvaI-Fragment) enthielt.
Sodann wurden 0,1 ug des pCfAB14-hergeleiteten AvaI-BglII- Fragmentes (ca. 2,8 kb) und 0,3 ug des pCfWD1-hergeleiteten BglII-AvaI-Fragmentes (ca. 1,3 kb), jedes wie oben beschrieben erhalten, in 25 ul des T4 DNA-Ligase-Puffers gelöst. 3 Einheiten der T4 DNA-Ligase wurden zugegeben, und die Ligations- Reaktion wurde bei 4ºC für 18 Stunden durchgeführt.
Das Reaktionsgemisch wurde verwendet, um E. coli HB101 zu transformieren, und eine Apr-Kolonie wurde erhalten. Aus dieser Kolonie wurde die Plasmid-DNA mittels der oben erwähnten Methode nach Birnboim et al. gewonnen. Das so erhaltene pCfBA32 ist in Fig. 7 gezeigt.
Die durch pCfBA32 codierte Aminosäurensequenz des hG-CSF- Derivates enthält Asn anstelle der 6. Aminosäure Ala des reifen hG-CSF.

(2) Konstruktion des pCfBB101

In 50 ul des Y-100-Puffers wurden 6 ug des pCfBA8, das wie in dem vorhergehenden Kapitel beschrieben erhalten wurde, gelöst. 10 Einheiten des Restriktions-Enzymes BanIII (Toyobo), 8 Einheiten BglII und 8 Einheiten XhoI wurden zugegeben, und die Verdau-Reaktion wurde bei 37ºC für 1 Stunde durchgeführt. Aus dem Reaktionsgemisch wurden mittels der LGT-Methode 0,6 ug eines hG-CSF cDNA-enthaltenden DNA-Fragmentes mit ca. 1,4 kb (XhoI-BglII-Fragment) und ca. 0,8 ug eines DNA-Fragmentes mit ca. 2,7 kb (BanIII-BglII-Fragment), das einen Teil des Tryptophan-Promotors enthielt, erhalten.
Getrennt davon wurde der folgende DNA-Linker synthetisiert:
Zunächst wurden die 31-mer und 33-mer einzelsträngigen DNAs mittels der gewöhnlichen Phosphortriester-Methode synthetisiert. Das 31-mer und das 33-mer (jeweils 2 ug) wurden in einer Gesamtmenge von 40 ul des T4-Kinase-Puffers gelöst.
30 Einheiten der T4 Polynukleotid-Kinase (Takara Shuzo) wurden zugegeben, und die Phoshphorylierungs-Reaktion wurde bei 37ºC für 60 Minuten durchgeführt.
Sodann wurden 0,1 ug des pCfBA8-hergeleiteten BanIII-BglII- Fragmentes (ca. 2,7 kb-Fragment) und 0,1 ug des pCfBA8- hergeleiteten XhoI-BglII-Fragmentes (ca. 1,4 kb-Fragment), jedes wie oben beschrieben erhalten, in 25 ul des T4 DNA- Ligase-Puffers gelöst, und ca. 2 Picomol des obigen DNA-Linkers wurden zum Lösungsgemisch addiert. Nach weiterer Zugabe von 6 Einheiten T4 DNA-Ligase wurde die Ligations-Reaktion bei 4ºC für 18 Stunden durchgeführt.
Das so erhaltene rekombinante Plasmid-Gemisch wurde verwendet, um E. coli HB101 zu transformieren, und eine Apr-Kolonie wurde erhalten. Aus kultivierten Zellen, hergeleitet aus dieser Kolonie, wurde die Plasmid-DNA zurückgewonnen. Somit wurde pCfBB101 erhalten, dargestellt in Fig. 7. Die Aminosäuresequenz des durch pCfBB101 codierten hG-CSF-Derivates enthält Ala, Thr, Arg, Ser bzw. Ser anstelle der ersten Aminosäure Thr, der dritten Aminosäure Leu, der vierten Aminosäure Gly, der fünften Aminosäure Pro bzw. der 17. Aminosäure Cys des reifen hG-CSF. Im folgenden wird dieses Derivat als hG-CSF [NB101] bezeichnet werden.

(3) Konstruktion des pCfBC42B1, pCfBC45, pCfBC52 pCfBC59, pCfBC76, pCfBC77, pCfBC93, pCfBC95 und pCfBC97 (s. Fig. 8)

Zunächst wurde der folgende DNA-Linker synthetisiert:
(N bedeutet G, A, T oder C).
In diesem synthetischen DNA-Linker bedeuten die drei jeweils durch N repräsentierten Basen jeweils unabhängig voneinander G, A, T oder C. Weiterhin bedeutet eine Base G bzw. A (im Falle des 31-mer) oder C bzw. T (im Falle des 33-mer), weswegen dieser Linker als Gemisch von insgesamt 128 DNA-Linkern erhalten wird. Als Resultat des Designs dieses Linkers sind in der durch diesen Linker codierten N-terminalen hG-CSF- Aminosäurensequenz 16 verschiedene Aminosäuren anstelle der Met nächstgelegenen Aminosäure und 8 verschiedene Aminosäuren anstelle der dem Pro nächstgelegenen Aminosäure möglich, das heißt insgesamt sind 128 Aminosäuresequenzen möglich. Zunächst wurden die 31-mer und 33-mer einzelsträngigen DNAs mittels der gewöhnlichen Phosphotriester-Methode synthetisiert. Das 31-mer und das 33-mer (jeweils 2 ug) wurden in einem Gesamtvolumen von 40 ul des T4 Kinase-Puffers gelöst, 30 Einheiten der T4 Polynukleotid-Kinase (Takara Shuzo) wurden zugegeben, und die Phosphorylierungs-Reaktion wurde bei 37ºC für 60 Minuten durchgeführt.
Sodann wurden 0,1 ug des pCfBA8-hergeleiteten BanIII-BglII- Fragmentes (ca. 2,7 kb Fragment) und 0,1 ug des pCfBA8- hergeleiteten XhoI-BglII-Fragmentes (ca. 1,4 kb-Fragment), jeweils im Beispiel 6 erhalten, in 25 ul des T4 DNA-Ligase- Puffers gelöst, und ca. 2 Picomol der obigen DNA-Linker wurden zum Lösungsgemisch zugegeben. Nach weiterer Addition von 6 Einheiten der T4 DNA-Ligase wurde die Ligations-Reaktion bei 4ºC für 18 Stunden durchgeführt.
Das so erhaltene rekombinante Plasmid-Gemisch wurde verwendet, um E. coli HB101 zu transformieren, und Apr-Kolonien wurden erhalten. Aus kultivierten Zellen dieser Kolonien wurden die Plasmid-DNAs zurückgewonnen. Somit wurden pCfBC42B1, pCfBC45, pCfBC52, pCfBC59, pCfBC76, pCfBC77, pCfBC93, pCfBC95 und pCfBC97 erhalten. Die Bestimmung der Basensequenz jedes DNA- Linkerteils mittels der oben erwähnten Didesoxy-Sequenzierungsmethode ergab, daß die Basensequenzen des N-terminalen Teils der hG-CSF-Derivate wie folgt aussehen:
Die durch diese Plasmide codierten substituierten Aminosäure- Reste der hG-CSF-Derivate sehen, jeweils verglichen mit reifem hG-CSF, wie folgt aus: Position der Aminosäuren-Substitution (Aminosäure von hG-CSF) Plasmid * Keine Substitution
Die pCfBC42B1, pCfBC42B1, pCfBC52, pCfBC59, pCfBC76, pCfBC77, pCfBC93, pCfBC95 bzw. pCfBC97 codierten hG-CSF-Derivate werden im folgenden als hG-CSF[NC42B1], hG-CSF[NC45], hG-CSF[NC52], hG-CSF[NC59], hG-CSF[NC76], hG-CSF[NC77], hG-CSF[NC93] hG- CSF[NC95] bzw. hG-CSF[NC97] bezeichnet.

(4) Konstruktion von pCfBD28, pCfBD56 und pCfBD82

Zunächst wurde der folgende DNA-Linker synthetisiert:
*(N bedeutet G, A, T oder C).
In diesem DNA-Linker bedeuten die vier durch N repräsentierten Basen jeweils unabhängig voneinander G, A, T oder C, und der Linker wird demgemäß als Gemisch von insgesamt 256 verschiedenen DNA-Linkern erhalten. Als Resultat des Designs dieses DNA-Linkers sind bei der durch den DNA-Linker codierten N-terminalen hG-CSF-Aminosäurensequenz vier Aminosäuren in jeder der fraglichen Positionen möglich, womit insgesamt 256 verschiedene Aminosäuresequenzen möglich sind.
Zunächst wurden die 31-mer und 33-mer einzelsträngigen DNAs mittels der gewöhnlichen Phosphotriester-Methode synthetisiert. In insgesamt 40 ul des T4 Kinase-Puffers wurden jeweils 2 ug des 31-mers und des 33-mers gelöst, 30 Einheiten der T4 Polynukleotid-Kinase (Takara Shuzo) wurden zugegeben, und die Phosphorylierungs-Reaktion wurde bei 37ºC für 60 Minuten durchgeführt.
Sodann wurden 0,1 ug des pCfBA8-hergeleiteten BanIII-BglII- Fragmentes (ca. 2,7 kb Fragment) und 0,1 ug des pCfBA8- hergeleiteten XhoI-BglII-Fragmentes (ca. 1,4 kb Fragment), jedes in Beispiel 6 erhalten, in 25 ul des T4 DNA-Ligase- Puffers gelöst, und ca. 2 Picomol der obigen DNA-Linker wurden zum Lösungsgemisch addiert. Nach weiterer Zugabe von 6 Einheiten der T4 DNA-Ligase wurde die Ligations-Reaktion bei 4ºC für 18 Stunden durchgeführt.
Das erhaltene, rekombinante Plasmidgemisch wurde verwendet, um E. coli HB101 zu transformieren, und Apr-Kolonien wurden erhalten. Aus kultivierten Zellen dieser Kolonien wurden die jeweiligen Plasmide zurückgewonnen. Somit wurden pCfBD28, pCfBD56 und pCfBD82 erhalten. Die Bestimmung der Basensequenz der DNA-Linkerteile mittels der oben erwähnten Didesoxy- Sequenzierungsmethode ergab, daß die Basensequenzen der N-terminalen Seite der hG-CSF-Derivate wie folgt aussehen:
Die durch diese Plasmide codierten, im Vergleich zum reifen hG- CSF ausgetauschten Aminosäurereste der hG-CSF-Derivate sehen wie folgt aus: Position der Aminosäure-Substitution (Aminosäure von hG-CSF) Plasmid * Keine Substitution.
Die durch pCfBD28, pCfBD56 bzw. pCfBD82 codierten hG-CSF- Derivate werden im folgenden als hG-CSF[ND28], hG-CSF[ND56] bzw. hG-CSF[ND82] bezeichnet. Ein E. coli-Stamm, enthaltend pCfBD56, E. coli ECfBD56, und ein E. coli-Stamm, enthaltend pCfBD28, E. coli ECfBD28, sind bei dem Fermentation Research Institute unter den Hinterlegungsnummern FERM BP-1221 bzw. FERM BP-1479 in Übereinkunft mit dem Budapester Abkommen hinterlegt worden.

(5) Konstruktion des pCfTNS7 (s. Fig. 14)

Der folgende DNA-Linker wurde synthetisiert.
Gemäß dem Design dieses DNA-Linkers fehlen vier Aminosäuren von der 1. Aminosäure Thr bis zur 4. Aminosäure Gly der N-terminalen Aminosäuresequenz des hG-CSF in der durch den Linker codierten N-terminalen Aminosäuresequenz.
Zunächst wurden die einzelsträngigen 18-mer und 20-mer DNAs mittels der gewöhnlichen Phosphotriester-Methode synthetisiert. Das 18-mer und, das 20-mer (jeweils 2 ug) wurden in insgesamt 40 ul des T4 Kinase-Puffers gelöst. 30 Einheiten der T4 Polynukleotid-Kinase (Takara Shuzo) wurden zugegeben, und die Phosphorylierungs-Reaktion wurde bei 37ºC für 60 Minuten durchgeführt.
Sodann wurden 0,1 ug des pCfBA8-hergeleiteten BanIII-BglII- Fragmentes (ca. 2,7 kb Fragment) und 0,1 ug des pCfBA8- hergeleiteten XhoI-BglII-Fragmentes (ca. 1,4 kb), jeweils in Beispiel 6 erhalten, in 25 ul des T4 DNA Ligase-Puffers gelöst, 2 Picomol des obigen DNA-Linkers zum Lösungsgemisch zugegeben, und die Ligations-Reaktion bei 4ºC für 18 Stunden durchgeführt.
Das so erhaltene rekombinante Plasmidgemisch wurde verwendet, um E. coli HB101 zu transformieren, und eine Apr-Kolonie wurde erhalten. Aus kultivierten Zellen dieser Kolonie wurde das Plasmid zurückgewonnen. Somit wurde pCfTNS7 erhalten. In dem durch pCfTNS7 codierten hG-CSF-Derivat fehlen die 1. bis 4. N-terminalen Aminosäuren des reifen hG-CSF, und die 17. Aminosäure ist Ser anstelle von Cys. Die durch pCfTNS7 codierten hG-CSF-Derivate werden im folgenden als hG-CSF[Δ1-4S] bezeichnet.

(6) Konstruktion des pCfTAArg4S (s. Fig. 14)

Der folgende DNA-Linker wurde synthetisiert:
In diesem DNA-Linker sind zwei Basen jeweils unabhängig voneinander A bzw. G, wodurch dieser Linker als ein Gemisch von insgesamt vier DNA-Linkern erhalten wird. Das Design dieses DNA-Linkers ist demgemäß so, daß vier Aminosäuren als die 4. Aminosäure der N-terminalen hG-CSF-Aminosäurensequenz, codiert durch diesen Linker, möglich sind.
Zunächst wurden die einzelsträngigen 31-mer und 33-mer DNAs mittels der gewöhnlichen Phosphotriester-Methode synthetisiert. Das 31-mer und das 33-mer (jeweils 2 ug) wurden in einem Gesamtvolumen von 40 ul des T4 Kinase-Puffers gelöst. 30 Einheiten der T4 Polynukleotid-Kinase (Takara Shuzo) wurden zugegeben, und die Phosphorylierungs-Reaktion wurde bei 37ºC für 60 Minuten durchgeführt.
Sodann wurden 0,1 ug des pCfBA8-hergeleiteten BanIII-BglII- Fragmentes (ca. 2,7 kb Fragment) und 0,1 ug des pCfBA8- hergeleiteten XhoI-BglII-Fragmentes (ca. 1,4 kb Fragment), jeweils wie in Kapitel (1) beschrieben erhalten, in 25 ul des T4 DNA-Ligase-Puffers gelöst, und ca. 2 Picomol der obigen DNA- Linker wurden zum Lösungsgemisch zugegeben. Nach weiterer Addition von 6 Einheiten der T4 DNA-Ligase wurde die Ligations- Reaktion bei 4ºC für 18 Stunden durchgeführt.
Das so erhaltene rekombinante Plasmid-Gemisch wurde verwendet, um E. coli HB101 zu transformieren, und eine Apr-Kolonie wurde erhalten. Aus kultivierten Zellen dieser Kolonie wurde das Plasmid zurückgewonnen somit wurde pCfTAArg4S erhalten. Die Bestimmung der Basensequenz des DNA-Linkerteils mittels der oben erwähnten Didesoxy-Sequenzierungsmethode ergab, daß die N-terminale Basensequenz des hG-CSF-Derivates wie folgt aussieht:
Das durch pCfTAArg4S codierte hG-CSF-Derivat wird im folgenden als hG-CSF[Arg&sup4;, Ser¹&sup7;) bezeichnet.

(7) Konstruktion von pCfTN205 (s. Fig. 15)

In 40 ul K-150-Puffer (gleich dem Y-100-Puffer, außer dem Austausch von 150 mM KCl für 100 mM NaCl) wurden 3 ug des in Kapitel 5 erhaltenen pCfTNS7 gelöst. Jeweils 5 Einheiten der Restriktionsenzyme PvuI und XhoI wurden zugegeben, und die Verdau-Reaktion wurde bei 37ºC für 1 Stunde durchgeführt. Aus dem Reaktionsgemisch wurden mittels der LGT-Methode ca. 0,5 ug eines DNA-Fragmentes mit ca. 1,0 kb (PvuI-XhoI-Fragment), das einen Teil des Tryptophan-Promotors enthielt, erhalten.
Getrennt davon wurden 3 ug des in Kapitel 1 erhaltenen pCfBA32 in 40 ul des K-150-Puffers gelöst, jeweils 5 Einheiten der Restriktions-Enzyme PvuI und XhoI wurden zugegeben, und die Verdau-Reaktion wurde bei 37ºC für 1 Stunde durchgeführt. Aus dem Reaktionsgemisch wurden mittels der LGT-Methode 2 ug eines ca. 3,0 kb DNA-Fragmentes (XhoI-PvuI-Fragment) erhalten, das den größten Teil der hG-CSF cDNA enthielt.
Sodann wurden 0,1 ug des pCfTNS7-hergeleiteten PvuI-XhoI- Fragmentes (ca. 1,0 kb) und 0,3 ug des pCfBA32-hergeleiteten XhoI-PvuI-Fragmentes (ca. 3,0 kb), jeweils in der obigen Weise erhalten, in 25 ul des T4 DNA-Ligase-Puffers gelöst. 3 Einheiten der T4 DNA-Ligase wurden zugegeben, und die Ligations- Reaktion wurde bei 4ºC für 18 Stunden durchgeführt.
Das Reaktionsgemisch wurde verwendet, um E. coli HB101 zu transformieren, eine Apr-Kolonie wurde erhalten, und die Plasmid-DNA dieser Kolonie wurde mittels der oben erwähnten Methode nach Birnboim et al. zurückgewonnen. Somit wurde das in Fig. 15 dargestellte pCfTN205 erhalten.
In der Aminosäuresequenz des durch pCfTN205 codierten hG-CSF- Derivates fehlen die 1. bis 4. Aminosäuren des reifen hG-CSF. Im folgenden wird dieses Derivat als hG-CSF[Δ1-4] bezeichnet werden.

(8) Herstellung des pCfTAArg4 (s. Fig. 15)

In 40 ul des K-150-Puffers wurden 3 ug des in Kapitel 6 erhaltenen pCfTAArg4S gelöst. Jeweils 5 Einheiten der Restriktions-Enzyme PvuI und XhoI wurden zugegeben, und eine Verdau-Reaktion wurde bei 37ºC für 1 Stunde durchgeführt. Aus dem Reaktionsgemisch wurden mittels der LGT-Methode 0,5 ug eines DNA-Fragmentes mit ca. 1,0 kb (PvuI-XhoI-Fragment), das einen Teil des Tryptophan-Promotors enthielt, erhalten.
Getrennt davon wurden 3 ug des in Kapitel 1 erhaltenen pCfBA32 in 40 ul des K-150-Puffers gelöst. Jeweils 5 Einheiten der Restriktionsenzyme PvuI und XhoI wurden zugegeben, und die Verdau-Reaktion wurde bei 37ºC für 1 Stunde durchgeführt. Aus dem Reaktionsgemisch wurden mittels der LGT-Methode 2 ug eines ca. 3,0 kb DNA-Fragmentes (XhoI-PvuI-Fragment) erhalten, das den größten Teil der hG-CSF cDNA enthielt.
Sodann wurden 0,1 ug des pCfTAArg4s-hergeleiteten PvuI-XhoI- Fragmentes (ca. 1,0 kb) und 0,3 ug des pCfBA32-hergeleiteten XhoI-PvuI-Fragmentes (ca. 3,0 kb), jedes auf die obige Weise erhalten, in 25 ul des T4 DNA-Ligase-Puffers gelöst. 3 Einheiten der T4 DNA-Ligase wurden zugegeben und die Ligations- Reaktion wurde bei 4ºC für 18 Stunden durchgeführt.
Das Reaktionsgemisch wurde verwendet, um E. coli HB101 zu transformieren, eine Apr-Kolonie wurde erhalten, und die Plasmid-DNA dieser Kolonie wurde mittels der oben erwähnten Methode nach Birnboim et al. zurückgewonnen. Somit wurde das in Fig. 15 dargestellte pCfTAArg4 erhalten.
Die vierte Aminosäure der Aminosäuresequenz des durch pCfTAArg4 codierten hG-CSF-Derivates ist ein Arg anstelle des Gly im reifen hG-CSF. Im folgenden wird dieses Derivat als hG- GSF[Arg&sup4;] bezeichnet.

(9) Herstellung des pCfTNS301 (s. Fig. 16)

In 50 ul des Y-100 Puffers wurden 6 ug des in Kapitel 1 erhaltenen pCfBA8 gelöst. 10 Einheiten des Restriktion-Enzymes HindIII und 8 Einheiten des BglII wurden zugegeben, und die Verdau-Reaktion wurde bei 37ºC für 1 Stunde durchgeführt. Aus dem Reaktionsgemisch wurden mittels der LGT-Methode ca. 0,6 ug eines hG-CSF-cDNA enthaltenden DNA-Fragmentes mit ca. 1,4 kb (HindIII-BglII-Fragment) erhalten.
Sodann wurde der folgende DNA-Linker synthetisiert:
Das Design dieses DNA-Linkers sieht so aus, daß die 11 Aminosäuren, von der ersten Aminosäure Thr bis zur 11. Aminosäure Gln des hG-CSF, in der durch diesen Linker codierten N-terminalen Aminosäuresequenz, fehlen.
Zunächst wurden die einsträngigen 27-mer und 29-mer DNAs mittels der gewöhnlichen phosphotriester-Methode synthetisiert. Das 27-mer und das 29-mer (jeweils 2 ug) wurden in insgesamt 40 ul T4 Kinase-Puffer gelöst, 30 Einheiten der T4 Polynukleotid- Kinase (Takara Shuzo) wurden zugegeben, und die Phosphorylierungs-Reaktion wurde bei 37ºC für 60 Minuten durchgeführt.
Sodann wurden 0,1 ug des pCfBA8-hergeleiteten BanIII-BglII- Fragmentes (ca. 2,7 kb Fragment) und 0,1 ug des pCfBA8- hergeleiteten HindIII-BglII-Fragmentes (ca. 1,4 kb Fragment), von denen jedes wie oben erwähnt erhalten wurden, in 25 ul des T4 DNA-Ligase-Puffers gelöst, und ca. 2 Picomol des obigen DNA- Linkers wurden zum Lösungsgemisch dazugegeben. Nach weiterer Addition von 6 Einheiten der T4-DNA-Ligase wurde die Ligations- Reaktion bei 4ºC für 18 Stunden durchgeführt.
Das so erhaltene rekombinante Plasmid-Gemisch wurde verwendet, um E. coli HB101 zu transformieren, und eine Apr-Kolonie wurde erhalten. Aus kultivierten Zellen dieser Kolonie wurde die Plasmid-DNA zurückgewonnen. Somit wurde pCfTNS301 erhalten. In dem durch pCfTNS301 codierten hG-CSF-Derivat fehlen die 1. bis 11. N-terminalen Aminosäuren des reifen hG-CSF, und die 17. Aminosäure ist Ser anstelle von Cys. Das durch pCfTNS301 codierte hG-CSF-Derivat wird im folgenden als hG-CSF[Δ1-11S] bezeichnet.

(10) Konstruktion des pCfTNS401 (s. Fig. 16)

Der folgende DNA-Linker wurde synthetisiert:
Das Design des DNA-Linkers sieht so aus, daß die 7 Aminosäuren, von der ersten Aminosäure Thr bis zur 7. Aminosäure Ser des hG- CSF, in der durch den Linker codierten N-terminalen Aminosäuresequenz, fehlen.
Zunächst wurden die einzelsträngigen 39-mer und 41-mer DNAs mittels der gewöhnlichen Phosphotriester-Methode synthetisiert. Das 39-mer und das 41-mer (jeweils 2 ug) wurden in insgesamt 40 ul des T4 Kinase-Puffers gelöst. 30 Einheiten der T4 Polynukleotid-Kinase (Takara Shuzo) wurden zugegeben, und die Phosphorylierungs-Reaktion wurde bei 37ºC für 60 Minuten durchgeführt.
Sodann wurden 0,1 ug des pCfBA8-hergeleiteten BanIII-BglII- Fragmentes (ca. 2,7 kb Fragment) und 0,1 ug des pCfBA8- hergeleiteten HindIII-BglII-Fragmentes (ca. 1,4 kb Fragment), von denen jedes wie oben beschrieben erhalten wurde, in 25 ul des T4 DNA-Ligase-Puffers gelöst, und ca. 2 Picomol des obenerwähnten DNA-Linkers wurden zu diesem Lösungsgemisch zugegeben. Nach weiterer Zugabe von 6 Einheiten der T4 DNA- Ligase wurde die Ligations-Reaktion bei 4ºC für 18 Stunden durchgeführt.
Das so erhaltene rekombinante Plasmid-Gemisch wurde verwendet, um E. coli HB101 zu transformieren, und eine Apr-Kolonie wurde erhalten. Die Plasmid-DNA wurde aus dieser Kolonie zurückgewonnen. Somit wurde pCfTNS401 erhalten. In dem durch pCfTNS401 codierten hG-CSF-Derivat fehlen die 1. bis 7. N-terminalen Aminosäuren des reifen hG-CSF, und die 17. Aminosäure ist Ser anstelle von Cys. Das durch pCfTNS401 codierte hG-CSF-Derivat wird im folgenden als hG-CSF[Δ1-7S] bezeichnet.

(11) Herstellung des pCfTNS501 (s. Fig. 12)

In 40 ul des Y-100-Puffers wurde das in Kapitel 1 erhaltene pCfBA8 gelöst. 10 Einheiten des Restriktionsenzymes XhoI wurden zugegeben, und die Verdau-Reaktion wurde bei 37ºC für 1 Stunde durchgeführt. Die durch Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanol-Präzipitation zurückgewonnene DNA wurde in 30 ul des Klenow-Puffers gelöst. 2 Einheiten des DNA-Polymerase I Klenow- Fragmentes wurden zugegeben, und die Reaktion wurde bei 17ºC für 30 Minuten durchgeführt. Das DNA-Polymerase I Klenow- Fragment wurde durch 10-minütige Behandlung bei 68ºC inaktiviert. Es wurden KCl bis zu einer Konzentration von 150 mM und 8 Einheiten des Restriktions-Enzymes PvuI zugegeben, und die Verdau-Reaktion wurde bei 37ºC für l Stunde durchgeführt. Aus dem Reaktionsgemisch wurden mittels der LGT-Methode ca. 2 ug eines hG-CSF-cDNA enthaltenden DNA-Fragmentes mit ca. 3 kb [XhoI(glatt)-PvuI] erhalten.
Getrennt davon wurden 5 ug des ATG-Vektors pTrS20 (3,8 kb), der durch das Verfahren des Vergleichsbeispiels 4 erhalten wurde, in 50 ul des Y-O-Puffers (Y-100-Puffer ohne 100 mM NaCl) gelöst. 16 Einheiten des Restriktions-Enzymes SacI wurden zugegeben, und die Spaltungsreaktion wurde bei 37ºC für 3 Stunden durchgeführt. Die mittels phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanol-Präzipitation zurückgewonnene DNA wurde in 30 ul des Klenow-Puffers gelöst. 2 Einheiten des DNA-Polymerase I Klenow-Fragmentes wurden zugegeben, und die Reaktion wurde bei 17ºC für 30 Minuten durchgeführt. Das DNA-Polymerase I Klenow- Fragment wurde durch Behandlung bei 68ºC für 10 Minuten inaktiviert. Es wurden KCl bis zu einer Konzentration von 150 mM und 8 Einheiten des Restriktions-Enzymes PvuI zugegeben, und die Verdau-Reaktion wurde bei 37ºC für 1 Stunde durchgeführt. Aus dem Reaktionsgemisch wurden mittels der LGT-Methode ca. 0,5 ug eines Ptrp-enthaltenden DNA-Fragmentes mit ca. 1 kb [SacI(glatt)-PvuI) erhalten.
Sodann wurden 0,1 ug des pCfBA8-hergeleiteten XhoI(glatt)-PvuI- Fragmentes (ca. 3 kb) und 0,2 ug des pTrs20-hergeleiteten SacI(glatt)-PvuI-Fragmentes (ca. 1 kb) in 25 ul des T4 DNA- Ligase-Puffers gelöst. 3 Einheiten der T4 DNA-Ligase wurden zugegeben, und die Ligations-Reaktion wurde bei 4ºC für 18 Stunden durchgeführt.
Das Reaktionsgemisch wurde verwendet, um E. coli HB101 zu transformieren, eine Apr-Kolonie wurde erhalten, und die Plasmid-DNA wurde mittels der oben erwähnten Methode nach Birnboim et al. zurückgewonnen. Somit wurde das in Fig. 12 gezeigte pCfTNS501 erhalten.
In dem durch pCfTNS501 codierten hG-CSF-Derivat fehlen die 1. bis 6. N-terminalen Aminosäuren des reifen hG-CSF, und die 17. Aminosäure ist Ser anstelle von Cys. Das durch pCfTNS501 codierte hG-CSF-Derivat wird im folgenden als hG-CSF[Δ1-6S] bezeichnet.

Beispiel 7

(1) Herstellung von pCfCB101, pCfCC52, pCfCC59, pCfCD28 und pCfCD56 (s. Fig. 8)

Zunächst wurden 3 ug pBR322 [Bolivar et al.: Gene, 2, 95 (1977)) in 40 ul des Y-100-Puffers gelöst. 5 Einheiten des Restriktions-Enzymes PstI wurden zugegeben, und die Verdau- Reaktion wurde bei 37ºC für 1 Stunde durchgeführt. Die durch phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanol-Präzipitation zurückgewonnene DNA wurde in 20 ul einer Lösung, enthaltend 33 mM Tris-Essigsäure (pH 7,9), 66 mM Kaliumacetat, 10 mM Magnesiumacetat, 5 mM Dithiothreit und dATP, dCTP, dGTP und dTTP (jeweils 0,4 mM) (im folgenden als "T4 DNA-Polymerase- Puffer" bezeichnet) gelöst. 1 Einheit der T4 DNA-Polymerase (Takara Shuzo) wurde zugegeben, und die Reaktion wurde bei 37ºC für 30 Minuten durchgeführt. Die durch Phenol-Chloroform- Extraktion und Ethanol-Präzipitation zurückgewonnene DNA wurde in 20 ul des T4 DNA-Ligase-Puffers gelöst. Hierzu wurden ca. 8 Picomol der BglII Linker-DNA [Takara Shuzo; d(pC-A-G-A-T-C-T- G)] addiert. Nach weiterer Zugabe von 6 Einheiten der T4 DNA- Ligase wurde die Ligations-Reaktion bei 4ºC für 18 Stunden durchgeführt. Die durch Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanol-Präzipitation zurückgewonnene DNA wurde in 40 ul Y-100- Puffer gelöst. 10 Einheiten des Restriktions-Enzymes EcoRI und 8 Einheiten von BglII wurden zugegeben, und die Verdau-Reaktion wurde bei 37ºC für 1 Stunde durchgeführt. Aus dem Reaktionsgemisch wurden mittels der LGT-Methode ca. 0,9 ug eines DNA- Fragmentes mit ca. 3,6 kb (EcoRI-BglII-Fragment), das einen Teil des Tetracyclin-Resistenzgenes enthielt, erhalten.
Getrennt davon wurden 3 ug des in Beispiel 6-(2) erhaltenen pCfBB101, des in Beispiel 6-(3) erhaltenen pCfBC52 oder pCfBC59 oder des in Beispiel 6-(4) erhaltenen pCfBD28 oder pCfBD56 wurden in 10-fach konzentriertem Y-100-Puffer gelöst. 5 Einheiten des Restriktions-Enzymes EcoRI und 6 Einheiten von BglII wurden zugegeben, und die Verdau-Reaktion wurde bei 37ºC für 1 Stunde durchgeführt. Aus dem Reaktionsgemisch wurden mittels der LGT-Methode in jedem Fall ca. 0,4 ug eines DNA- Fragmentes mit ca. 1,8 kb (EcoRI-BglII Fragment), das einen Teil der hG-CSF-cDNA enthielt, erhalten.
Fünf Röhrchen, von denen jedes eine Lösung mit ca. 0,05 ug des pBR322-hergeleiteten EcoRI-BglII-Fragmentes (ca. 3,6 kb), das wie oben beschrieben erhalten wurde, in 20 ul des T4 DNA- Ligase-Puffers enthielt, wurden vorbereitet. In jedes Röhrchen wurden ca. 0,1 ug der pCfBB101-, pCfBC52-, pCfBC59-, pCfBD28- oder pCfBD56-hergeleiteten EcoRI-BglII-Fragmente (ca. 1,8 kb Fragment) gegeben, und die Ligations-Reaktion wurde nach weiterer Zugabe von 4 Einheiten der T4 DNA-Ligase bei 4ºC für 18 Stunden durchgeführt.
Die erhaltenen rekombinanten Plasmid-Gemische wurden verwendet, um E. coli HB101 zu transformieren, und Tcr-Kolonien wurden erhalten. Aus kultivierten Zellen jeder dieser Kolonien wurde die Plasmid-DNA zurückgewonnen. Somit wurden pCfCB101, pCfCC52, pCfCC59, pCfCD28 und pCfCD56 erhalten, jeweils in Fig. 8 dargestellt. Die Aminosäuresequenzen der durch diese Plasmide codierten hG-CSF-Derivate sind identisch mit den Aminosäuren der hG-CSF-Derivate, die durch pCfBB101, pCfBC52, pCfBC59, pCfBD28 bzw. pCfBD56 codiert werden.

Beispiel 8

Herstellung und Reinigung von hG-CSF-Derivaten

Die E. coli W3110-strA-hergeleiteten Transformanden (bezeichnet als ECfTL23, ECfTL35, ECfTL38, ECfTL41, ECfTM14, ECfTM17, ECfTM113, ECfBB101, ECfBC42B1, ECfBC45, ECfBC52, ECfBC59, ECfBC76, ECfBC77, ECfBC93, ECfBC95, ECfBC97, ECfBD28, ECfBD56, ECfBD82, ECfTNS7, ECfTAArg4S, ECfTNS301, ECfTNS401, ECfTNS501, ECfBD28A17 und ECfBD28T17) enthaltend die rekombinanten Plasmide (erhalten in Beispielen 3, 4, 6 und 7) pCfTL23, pCfTL35, pCfTL38, pCfTL41, pCfTM14, pCfTM17, pCfTM113, pCfBB101, pCfBC42B1, pCfBC45, pCfBC52, pCfBC59, pCfBC76, pCfBC77, pCfBC93; pCfBC95, pCfBC97, pCfBD28, pCfBD56, pCfBD82, pCfTNS7, pCfAArg4S, pCfTNS301, pCfTN401, pCfTNS501, pCfBD28T17 bzw. pCfBD28A17, wurden jeweils bei 37ºC für 18 Stunden in LG- Medium (hergestellt durch Lösen von 10 g Bactotrypton, 5 g Hefeextrakt, 5 g NaCl und 1 g Glucose in 1 Liter Wasser und Einstellen des pH auf 7,0 mit NaOH) kultiviert. 100 ml MCG- Medium (0,6% Na&sub2;HPO&sub4;, 0,3% KH&sub2;PO&sub4;, 0,5 R NaCl, 0,5% Casaminosäuren, 1 mM MgSO&sub4;, 4 ug/ml Vitamin B&sub1;&sub1; pH 7,2) enthaltend 25 ug/ml Tryptophan und 50 ug/ml Ampicillin, wurden mit einem 5 ml-Teil der Kulturlösung beimpft. Nach Inkubation bei 30ºC für 4-8 Stunden wurden 10 ug/ml 3β-Indolacrylsäure (im folgenden IAA), einem Tryptophan-Promotor-Induktor, zugegeben, und die Inkubation wurde für weitere 2-12 Stunden fortgesetzt. Die Zellen wurden geerntet, indem die Kulturlösung einer Zentrifugation bei 8 000 UpM für 10 Minuten unterzogen wurde, und mit 30 mM NaCl-30 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden in 30 ml des obenerwähnten Puffers suspendiert und dann mittels Ultraschall bei 0ºC zerstört (BRANSON SONIC POWER COMPANY'S SONIFIER CELL DISRUPTOR 200, Ausgangs-Kontrolle 2, 10 Minuten). Eine Zentrifugation bei 9 000 UpM für 30 Minuten ergab einen Zellrückstand. Unter Verwendung der Methode von Marston et al. [F. A. O. Marston et al.: BIO/TECHNOLOGY, 2, 800 (1984)] wurde das hG-CSF-Derivat aus dem Zellrückstand extrahiert, gereinigt, gelöst und renaturiert. Die Proteinmenge wurde unter Verwendung von "Nippon Bio-Rad laboratories' protein assay kit" (Standard- Assay Methode) (M. M. Bradford: Anal. Biochem., 72, 248 (1976)) bestimmt.
Die G-CSF-Aktivität wurde auf dem folgenden Wege bestimmt. Knochenmarkszellen wurden aseptisch dem Femur von männlichen, 8-12 Wochen alten C3H/He-Mäusen (Shizuoka Laboratory Tier- Zentrum) entnommen und in α-MEM, ergänzt durch 10% fötalem Rinderserum (FBS) suspendiert. Nylon-Wolle (Wako Pure Chemical Industrie; Nylon-Faser 146-04231) (0,3 g), gepackt in einer Säule, wurde mit 1,5 ml Zellsuspension (ca. 5 · 10&sup7; Zellen) imprägniert, und die Reaktion wurde in einem 5% CO&sub2;-Inkubator bei 37ºC für 90 Minuten durchgeführt. Sodann wurde α-MEM, das vorher auf 37ºC erwärmt worden war, über die Säule gegeben, und nicht an der Nylon-Wolle adsorbierte Knochenmarkszellen wurden als Effluent-Fraktion erhalten. Diese Zellen wurden einmal mit α-MEM gewaschen und auf eine vorher bestimmte Konzentration eingestellt.
Sodann wurde die Aktivität, myelopoetische Stammzellkolonien zu bilden, mittels der Methode von Okabe et al. [Okabe, T. et al.: Cancer Research, 44, 4503-4506 (1986)] bestimmt. So wurden 0,2 ml der wie oben hergestellten Markzellen-Suspension (2 · 10&sup6; Zellen/ml) vermischt mit einem Gemisch von 0,2 ml α-MEM, 0,4 ml FBS und 0,2 ml von jeder 2-fach verdünnten Probe. Ein gleiches Volumen (1,0 ml) von auf 42ºC erwärmten 0,6% Agar (Difco, Agar-gereinigt #0560-01) wurde mit dem Gemisch vermischt, und das gesamte Gemisch wurde in 0,5 ml-Portionen pro Vertiefung ("well") einer 24-"well"-Platte (Nunc's Multidish #143982) (5 · 10&sup4; Zellen/"dish", n=3) verteilt. Nach Inkubation in einem 5% CO&sub2;-Inkubator bei 37ºC für 7 Tage wurden Kolonien, die jeweils nicht weniger als 40 Zellen umfaßten, unter einem Mikroskop (Olympus X40) gezählt. Nach dem Zählen der Kolonien wurden die Zellen sorgfältig auf einen Objektträger gebracht und mit einer Aceton-FormaIin-Mischlösung 30 Sekunden fixiert. Nach einer Esterase-Doppelfärbung der Zellen mittels der Methode von Kubota et al. [Kubota, K. et al.: Exp. Hematology, 8, 339-344 (1980)] wurde jede Kolonie identifiziert.
Die Potenz jeder Probe wurde auf der Basis der Resultate des Zählens der 2-fachen Verdünnung im Koloniebildungs-Assay wie folgt berechnet. Die Aktivität, die die Hälfte des maximalen Koloniebildungswertes des als Standard verwendeten G-CSF ergab, wurde als 50 Einheiten definiert. Die Potenz (in Einheiten) wurde berechnet durch Multiplizieren mit 20, inklusive dem Verdünnungsfaktor für jede Probe, zur Umrechnung in Aktivität pro Milliliter. Die spezifische Aktivität wurde ausgedrückt durch den Term Potenz pro Gewichtseinheit (mg) des Proteins, das heißt in Einheiten/mg.
Die Potenzen des intakten G-CSF und der G-CSF-Derivate sind in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3 Stamm. Plasmid Plasmid-codiertes Produkt Spezifische Aktivität (Einheiten/mg) Spezifisches Aktivitäts-Verhältnis

BEISPIEL 9

Messung der Aktivität von hG-CSF-Derivaten gegenüber humanen Knochenmarkzellen

Aus dem Darmbeinknochen gesunder, 20 bis 30 Jahre alter Menschen wurde die Markflüssigkeit entnommen. Ein gleiches Volumen α-MEM wurde zugegeben und mit der Markflüssigkeit vermischt. 4 ml der obigen Knochenmarkflüssigkeit wurden auf 3 ml Ficoll-Paque-Lösung (Pharmacia Fine Chemicals, spezifisches Gewicht 1,007) geschichtet, und nach Zentrifugation bei 400 · g für 30 Minuten wurden die in der Zwischenphase erscheinenden Zellen abgetrennt. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen (hergestellt durch Lösen von 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,15 g Na&sub2;HPO&sub4; und 0,2 g KH&sub2;PO&sub4; in Wasser, zur Herstellung von 1 l Lösung) und dann in α-MEM, das mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt wurde, suspendiert. Die Zellkonzentration wurde auf höchstens 2 · 10&sup6;-Zellen/ml eingestellt. Ein 10 ml-Teil der Zellsuspension wurde in einer Plastikschale (Falcon 3003) plaziert und in einem 5% CO&sub2;-Inkubator bei 37ºC für 90 min inkubiert. Nicht in der Plastikschale adsorbierte Zellen wurden zurückgewonnen, einmal mit α-MEM gewaschen, und, nach Einstellung der Konzentration auf einen vorbestimmten Wert, einer das humane myelopoetische Stammzell-Wachstum-fördernden Aktivität und Kolonie-Bildungs-Tests unterzogen. So wurde 10% FBS-ergänztes (α-MEM in 100 ul-Portionen auf Vertiefungen ("wells") einer 96- "well", flachen Mikroplatte (NUNC, 167008) verteilt. Sodann wurden Proben des hG-CSF und der hG-CSF-Derivate, erhalten mittels der Methode des Beispiels 8, in 100 ul-Portionen in die Vertiefungen der ersten Reihe gegeben. Nach gründlichem Mischen wurden 100 ul jedes Gemisches in eine Vertiefung der zweiten Reihe transferiert, um eine 2-fache Verdünnung zu präparieren. Eine Verdoppelung der Verdünnung wurde in der gleichen Weise bis zur 12. Reihe (n=3) fortgesetzt. In einer Gruppe wurde α-MEM allein als Negativ-Kontrolle verwendet.
Sodann wurden 100 ul (5 · 10&sup4; eukaryontische Zellen) der Knochenmarkzell-Suspension, hergestellt wie oben beschrieben, in jede Vertiefung verteilt. Die Inkubation wurde in einem 5%- CO&sub2;-Inkubator bei 37ºC für 3 Tage durchgeführt. Während der 20 Stunden-Periode, die den letzten 18 h voranging, wurden 10 ul 6-³H-Thymidin (Amersham Japan, Kode TRK61, 107 mCi/mg) zugegeben. Die Zellen wurden unter Verwendung eines Zellsammlers (Labo-Science) auf einem Glasfilter zurückgewonnen, getrocknet und unter Verwendung eines Flüssigszintillationszählers (Packard, Tricarb 3320) wurde die von den Zellen aufgenommen Radioaktivität gemessen.
Auf der anderen Seite wurden der humane, myelopoetische Stammzellkolonie-Bildungsassay und die Kolonie-Identifizierung, wie in Beispiel 8 beschrieben, durchgeführt.
Zur Berechnung der Potenz jeder Probe wurde die Aktivität, die in der Lage war, eine Kolonie zu bilden, als eine Einheit definiert. Somit wurde der Halb-Max.-Wert (die Hälfte des maximalen Aufnahmewertes) bestimmt, basierend auf der Dosis- Wirkungskurve, die eine Linearität in bezug auf die Ergebnisse des Zählens der verdoppelnden Verdünnungsserie zeigte, und die Potenz jeder Probe wurde berechnet.
Die spezifische Aktivität wurde ausgedrückt als Potenz pro Gew.-Einheit (mg) des Proteins, d. h., in Einheiten/mg. Die Potenzen des intakten hG-CSF und der hG-CSF-Derivate sind in Tabelle 4 dargestellt. TABELLE 4 Stamm. Plasmid Plasmid-codiertes Produkt Spezifische Aktivität (Einheiten/mg) Spezifisches Aktivitäts-Verhältnis

BEISPIEL 10

Herstellung eines hG-CSF-Derivates, dem die N-terminalen 1. bis 7. Aminosäuren fehlen und das ein Serin als 17. Aminosäure besitzt (im folgenden als M-7S bezeichnete

Zu 50 ml einer 10 mM Tris-HCl-, 100 mM NaCl-Lösung (pH 8,0), enthaltend das in Tabelle 2 gezeigte Derivat (a) (132 ug/ml), erhalten durch Kultivierung des E. coli-Stammes (ECfBC59), der das im Beispiel 6 erhaltene rekombinante Plasmid pCFBC59 trägt, gefolgt von der Aufreinigung gemäß der Prozedur des Beispiels 8, wurden 0,7 ug von Subtilisin BPN' (8,5 Einheiten/mg Protein) (Sigma) addiert, und die Inkubation wurde bei 25ºC für 40 h durchgeführt. Nach 3-facher Verdünnung mit 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) wurde das Inkubationsgemisch bei einer Flußrate von 10 ml/h auf eine DEAE-Toyopearl 650 M (Toyo Soda Manufacturing)- Säule (1,7 cm · 4,4 cm), gefüllt mit 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), appliziert. Sodann wurden 20 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) bei einer Flußrate von 5 ml/h über die Säule gegeben. Danach wurde bei der gleichen Flußrate die Elution mit einem Puffersystem von 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) mit einem linearen NaCl-Konzentrationsgradienten von 0 M bis 0,4 M durchgeführt (gesamtes Eluenten-Volumen 50 ml). Das M-7S-Derivat wurde bei NaCl- Konzentrationen von 100 bis 150 mM eluiert (Ausbeute 0,7 mg, oder 10%). Die Reinheit betrug nicht weniger als 90%.

BEISPIEL 11

Herstellung von M-7S

Zu 50 ml einer 10 mM Tris-HCl-, 100 mM NaCl-Lösung (pH 8,0), enthaltend das in Tabelle 2 gezeigte Derivat (b) (132 ug/ml), erhalten durch Kultivierung des E. coli-Stammes (ECfBC59), der das in Beispiel 6 erhaltene rekombinante Plasmid pCfBC59 trägt, gefolgt durch Aufreinigung gemäß der Prozedur des Beispiels 8, wurden 0,7 ug Subtilisin BPN' (8,5 Einheiten/mg Protein) (Sigma) zugegeben, und die Inkubation wurde bei 25ºC für 14 h durchgeführt. Nach 3-facher Verdünnung mit 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) wurde das Inkubationsgemisch bei einer Flußrate von 10 ml/h auf einer DEAE-Toyopearl 650 M (Toyo Soda Manufacturing)- Säule (1,7 cm · 4,4 cm), gefüllt mit 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), gegeben. Sodann wurden bei einer Flußrate von 5 ml/h 20 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) über die Säule gegeben. Danach wurde bei der gleichen Flußrate die Elution mit einem Puffersystem von 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) mit einem linearen NaCl-Konzentrationsgradienten von 0 M bis 0,4 M durchgeführt (gesamtes Eluenten-Volumen 50 ml). Das M-7S-Derivat wurde bei NaCl- Konzentrationen von 100 bis 150 mM eluiert (Ausbeute 4,2 mg, oder 63%). Die Reinheit betrug nicht weniger als 90%.

BEISPIEL 12

Herstellung von M-7S

Zu 50 ml einer 10 mM Tris-HCl-, 100 mM NaCl-Lösung (pH 8,0), enthaltend das in Tabelle 2 gezeigte Derivat (d) (132 ug(ml), erhalten durch Kultivierung des E. coli-Stammes (ECfTAArg4S), der das in Beispiel 6 erhaltene rekombinante Plasmid pCfTAArg4S trägt, gefolgt von der Aufreinigung gemäß der Prozedur des Beispiels 8, wurden 0,7 ug Subtilisin BPN' (8,5 Einheiten/mg Protein) (Sigma) zugegeben, und die Inkubation wurde bei 25ºC für 40 h durchgeführt. Nach Einstellung der NaCl-Konzentration auf 0,5 M wurde das Inkubationsgemisch bei einer Flußrate von 6 ml/h auf eine Zn-Chelat-Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals)- Säule (1,7 cm · 2,6 cm), gefüllt mit 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,5 M NaCl, aufgebracht. Sodann wurden bei einer Flußrate von 3 ml/h 12 ml von 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,5 M NaCl über die Säule gegeben. Danach wurde bei der gleichen Flußrate die Elution mit einem Gesamtvolumen von 30 ml 10 mM Tris-HCl-, 0,5 M NaCl-Puffer mit einem linearen pH-Gradienten von 8,0 bis 6,0 durchgeführt. Das M-7S-Derivat wurde nahe pH 7,0 eluiert (Ausbeute 0,6 mg, oder 9%). Die Reinheit betrug 90%.

BEISPIEL 13

Herstellung eines hG-CSF-Derivats, dem die N-terminalen 1. bis 6. Aminosäuren fehlen und das Serin als 17. Aminosäure besitzt (im folgenden bezeichnet als M-6S)

Zu 50 ml einer Lösung des in Tabelle 2 gezeigten Derivates (a) (132 ug/ml) in 10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl (pH 8,0) wurden 0,7 ug Subtilisin BPN' (8,5 Einheiten/mg Protein) (Sigma) gelöst, und die Inkubation wurde bei 25 ºC für 2 h durchgeführt. Nach 3-facher Verdünnung mit 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) wurde das Reaktionsgemisch bei einer Flußrate von 10 ml/h auf eine DEAE-Toyopearl 650 M (Toyo Soda Manufacturing)-Säule (1,7 cm · 4,4 cm), gefüllt mit 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), appliziert. Sodann wurden bei einer Flußrate von 5 ml/h 20 ml 10 mM Tris- HCl (pH 8,0) über die Säule gegeben. Danach wurde bei der gleichen Flußrate die Elution mit einem Gesamtvolumen von 50 ml eines Puffersystems von 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) mit einem linearen NaCl-Konzentrationsgradienten von 0 M bis 0,4 M durchgeführt. Das M-6S-Derivat wurde bei NaCl-Konzentrationen von 100 bis 150 mM eluiert (Ausbeute 2,6 mg, oder 40%). Die Reinheit betrug nicht weniger als 90%.

BEISPIEL 14

Herstellung von M-6S

Zu 50 ml einer 10 mM Tris-HCl-, 100 mM NaCl-Lösung (pH 8,0), enthaltend das in Tabelle 2 gezeigte Derivat (a) (132 ug/ml), wurden 0,7 g Epolozym (4120 Einheiten/mg Protein) (Kyowa Hakko Kogyo) zugegeben, und die Inkubation wurde bei 25ºC für 20 h durchgeführt. Nach Einstellung der NaCl-Konzentration auf 0,5 M wurde das Inkubationsgemisch bei einer Flußrate von 6 ml/h auf eine Zn-Chelat-Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals)-Säule (1,7 cm · 2,6 cm), gefüllt mit 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,5 M NaCl, appliziert. Sodann wurden bei einer Flußrate von 3 ml/h 12 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,5 M NaCl über die Säule gegeben. Danach wurde bei der gleichen Flußrate die Elution mit einem Gesamtvolumen von 30 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,5 M NaCl-Puffer mit einem linearen pH-Gradienten von 8,0 bis 6,0 durchgeführt. Das M-6S-Derivat wurde nahe pH 7,0 eluiert (Ausbeute 2,5 mg, oder 38%). Die Reinheit betrug nicht weniger als 90%.

BEISPIEL 15

Herstellung von M-6S

Zu 50 ml einer 10 mM Tris-HCl-, 100 mM NaCl-Lösung (pH 8,0), enthaltend das in Tabelle 2 gezeigte Derivat (b) (132 ug/ml), wurde 0,7 ug von Subtilisin-Amylosacchalytikus gegeben, und die Inkubation wurde bei 25ºC für 20 h durchgeführt. Nach Einstellung der NaCl-Konzentration auf 0,5 M wurde das Inkubationsgemisch bei einer Flußrate von 6 ml/h auf eine Zn-Chelat- Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals)-Säule (1,7 cm · 2,6 cm), gefüllt mit 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,5 M NaCl appliziert. Sodann wurden bei einer Flußrate von 3 ml/h 12 ml 10 mM Tris- HCl (pH 8,0), 0,5 M NaCl über die Säule gegeben. Danach wurde bei der gleichen Flußrate die Elution mit einem Gesamtvolumen von 30 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,5 M NaCl-Puffer mit einem linearen pH-Gradienten von 8,0 bis 6,0 durchgeführt. Das M-6S- Derivat wurde nahe pH 7,0 eluiert (Ausbeute 2,5 mg, oder 38%). Die Reinheit betrug nicht weniger als 90%.

BEISPIEL 16

Herstellung von M-6S

Zu 50 ml einer 10 mM Tris-HCl-, 100 mM NaCl-Lösung (pH 8,0), enthaltend das in Tabelle 2 gezeigte Derivat (d) (132 ug/ml), wurde 0,7 ug von Subtilisin Carlsberg (0,034 Einheiten/mg Protein) (NOVO) zugegeben, und die Inkubation wurde bei 25ºC für 20 h durchgeführt. Nach Einstellen der NaCl-Konzentration auf 0,5 M wurde das Inkubationsgemisch bei einer Flußrate von 6 ml/h auf eine Zn-Chelat-Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals)- Säule (1,7 cm · 2,6 cm), gefüllt mit 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) 0,5 M NaCl, appliziert. Sodann wurden bei einer Flußrate von 3 ml/h 12 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,5 M NaCl über die Säule gegeben. Danach wurde bei der gleichen Flußrate die Elution mit einem Gesamtvolumen von 30 ml eines Puffersystems mit 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,5 M NaCl, mit einem linearen pH-Gradienten von 8,0 bis 6,0 durchgeführt. Das M-6S-Derivat wurde nahe pH 7,0 eluiert (Ausbeute 3 mg, oder 45%). Die Reinheit betrug nicht weniger als 90%.

BEISPIEL 17

Herstellung von M-6S

Zu 50 ml einer 1 : 0 mM Tris-HCl-, 100 mM NaCl-Lösung (pH 8,0), enthaltend das in Tabelle 2 gezeigte Derivat (a) (132 ug/ml), wurden 0,7 ug Proteinase K (0,027 Einheiten/mg Protein) (Sigma) zugegeben, und die Inkubation wurde bei 25ºC für 40 h durchgeführt. Nach 3-facher Verdünnung mit 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) wurde das Inkubationsgemisch bei einer Flußrate von 10 ml/h auf eine DEAE-Toyopearl 650 M (Toyo Soda Manufacturing)-Säule (1,7 cm · 4,4 cm), gefüllt mit 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), appliziert. Sodann wurden bei einer Flußrate von 5 ml/h 20 ml 10 mM Tris- HCl (pH 8,0) über die Säule gegeben. Danach wurde bei der gleichen Flußrate die Elution mit einem Gesamtvolumen von 50 ml eines Puffersystems von 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), mit einem linearen NaCl-Konzentrationsgradienten von 0 M bis 0,4 M durchgeführt. Das M-6S-Derivat wurde bei NaCl-Konzentrationen von 100 bis 150 mM eluiert (Ausbeute 2,6 mg, oder 39%). Die Reinheit betrug nicht weniger als 90%.

BEISPIEL 18

Herstellung eines hG-CSF-Derviates, dem die N-terminale 1. bis 5. Aminosäuren fehlen und daß ein Serin als 17. Aminosäure besitzt (im folgenden bezeichnet als M-5S)

Zu 50 ml einer 10 mM Tris-HCl-, 100 mM NaCl-Lösung (pH 8,0), enthaltend das in Tabelle 2 gezeigte Derivat (b) (132 ug/ml), wurden 0,5 ug Trypsin (267 Einheiten/mg Protein) (Sigma) zugegeben, und die Inkubation wurde bei 25ºC für 10 h durchgeführt. Nach Einstellen der NaCl-Konzentration auf 0,5 M wurde das Inkubationsgemisch bei einer Flußrate von 6 ml/h auf eine Zn-Chelat-Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals)-Säule (1,7 cm · 2,6 cm), gefüllt mit 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,5 M NaCl, appliziert. Sodann wurden bei einer Flußrate von 3 ml/h 12 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,5 M NaCl über die Säule gegeben. Danach wurde bei der gleichen Flußrate die Elution mit einem Gesamtvolumen von 30 ml eines Puffersystems von 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,5 M NaCl, mit einem linearen Imidazol-Konzentrationsgradienten von 0 M bis 0,3 M durchgeführt. Das M-5S- Derivat wurde bei 0,1 M Imidazol eluiert (Ausbeute 2,7 mg, oder 41%). Die Reinheit betrug nicht weniger als 90%.

BEISPIEL 19

Herstellung eines hG-CSF-Derviates dem die N-terminalen 1. bis 4. Aminosäuren fehlen, und das Serin als 17. Aminosäure besitzt (im folgenden bezeichnet als M-4S)

Zu 50 ml einer 10 mM Tris-HCl-, 100 mM NaCl-Lösung (pH 8,0), enthaltend das in Tabelle 2 gezeigte Derivat (d) (132 ug/ml), wurden 5 ug Trypsin (267 Einheiten/mg Protein) (Sigma) zugegeben, und die Inkubation wurde bei 25ºC für 20 h durchgeführt. Nach Einstellung der NaCl-Konzentration auf 0,5 M wurde das Inkubationsgemisch bei einer Flußrate von 6 ml/h auf eine Zn- Chelat-Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals)-Säule (1,7 cm · 2,6 cm), gefüllt mit 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,5 M NaCl, appliziert. Sodann wurden bei einer Flußrate von 3 ml/h 12 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,5 M NaCl über die Säule gegeben. Danach wurde bei der gleichen Flußrate die Elution mit einem Gesamtvolumen von 30 ml eines Puffersystems von 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,5 M NaCl, mit einem linearen Imidazol-Konzentrationsgradienten von 0 M bis 0,3 M durchgeführt. Das M-4S- Derivat wurde bei 0,1 M Imidazol eluiert (Ausbeute 2,7 mg, oder 41%). Die Reinheit betrug nicht weniger als 90%.

BEISPIEL 20

Herstellung von M-4S

Zu 50 ml einer 10 mM Tris-HCl-, 100 mM NaCl-Lösung (pH 8,0), enthaltend das in Tabelle 2 gezeigte Derivat (d) (132 ug/ml) wurden 5 ug α-Chymotrypsin (267 Einheiten/mg Protein) (Sigma) zugegeben, und die Inkubation wurde bei 25ºC für 20 h durchgeführt. Nach Einstellung der NaCl-Konzentration auf 0,5 M wurde das Inkubationsgemisch bei einer Flußrate von 6 ml/h auf eine Zn-Chelat-Sepharose (Pharmacia Fine Chemicals)-Säule (1,7 cm · 2,6 cm), gefüllt mit 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,5 M NaCl, appliziert. Sodann wurden bei einer Flußrate von 3 ml/h 12 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,5 M NaCl über die Säule gegeben. Danach wurde bei der gleichen Flußrate die Elution mit insgesamt 30 ml eines Puffersystems von 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,5 M NaCl, mit einem linearen Imidazol-Konzentrationsgradienten von 0 M bis 0,3 M durchgeführt. Das M-4S-Derivat wurde bei 0,1 M Imidazol eluiert (Ausbeute 2,3 mg, oder 35%). Die Reinheit betrug nicht weniger als 90%.

BEISPIEL 21

Wie in den Beispielen 10 bis 20 gezeigt, können solche hG-CSF- Derivate erhalten werden, die Serin als Ersatz über die 17. Aminosäure besitzen und denen 4 (M-4S), 5 (M-5S), 6 (M-6S) und 7 (M-7S) N-terminale Aminosäuren fehlen. Die Anwendung der rekombinanten DNA-Technologie resultiert im allgemeinen in der Addition von Methionin an den N-Terminus, und dies ist eine der nachteiligen Eigenschaften von rekombinanten Produkten. Demgegenüber ist die erfindungsgemäße Anwendung von enzymatischen Spaltungstechniken vorteilhaft, da solche Produkte ohne Methionin am N-Terminus produziert werden können.
Die auf diese Weise erhaltenen Derivate wurden auf ihre G-CSF- Aktivitäten zu Vergleichszwecken untersucht. Die erhaltenen Resultate sind in Tabelle 5 gezeigt. TABELLE 5 Aktivitätsvergleich zwischen G-CSF-Derviaten, gebildet durch enzymatische Spaltungstechniken Relative Aktivität Hg-CSF-Derivate (Derivat/intakt)
Aus den in Tabelle 5 gezeigten Resultaten folgte, daß in der obigen in vitro-Bestimmung die Derivate, denen die 4-7 N- terminalen Aminosäuren fehlten, eine 2- bis 4-fach höhere Aktivität im Vergleich zum intakten hG-GSF besitzen.
Somit besitzen die erfindungsgemäß hergestellten Derivate, denen N-terminale Aminosäuren fehlen, kein an den N-Terminus addiertes Methionin und eine 2- bis 4-fach höhere Aktivität als das intakte Produkt.
Die folgenden Beispiele illustrieren die Reaktivität (Suszeptibilität) bei der Spaltung mittels hydrolytischer Enzyme als Resultat von Mutationen im N-terminalen Teil.

TESTBEISPIEL 1

Vergleich der Reaktivität mit Subtilisin-Carlsberg zwischen intaktem hG-CSF und N-terminalen Mutanten des hG-CSF
Die in Tabelle 2 gezeigten Derivate und intaktes hG-CSF wurden jeweils in Gegenwart von 3,6 · 10&supmin;&sup4;-Einheiten von Subtilisin- Carlsberg (Novo)/mg G-CSF bei 25ºC für 14 h in der gleichen Weise wie im Beispiel 16 inkubiert. Während die in Tabelle 2 gezeigten Derivate das M-6S-Derivat ergaben, verhielt sich das intakte hG-CSF nicht reaktiv. Sogar als dieses Enzym weiterhin in einer 100-fach größeren Menge (3,6 · 10&supmin;²-Einheiten/mg G-CSF) verwendet wurde, produzierte das intakte Produkt kein M-6S, sondern erfuhr vorzugsweise umfassende Zersetzungsreaktionen.

TESTBEISPIEL 2

Vergleich der Reaktivität mit Trypsin zwischen intaktem hG-CSF und N-terminalen Mutanten des hG-CSF

Das in der Tabelle 2 gezeigte Derivat (a) und intaktes hG-CSF wurden jeweils in Gegenwart von 0,22 Einheiten Trypsin (Sigma)/mg G-CSF bei 25ºC für 20 h in der gleichen Weise wie in Beispiel 19 inkubiert. Während das in Tabelle 2 gezeigte Derivat (a) das M-4S-Derivat ergab, reagierte das intakte hG- CSF nicht.
Sogar als das Enzym in einer 100-fach erhöhten Menge (22 Einheiten/mg G-CSF) vorlag, ergab weiterhin das intakte hG-CSF nicht M-4S, sondern wurde vorzugsweise umfassenden Zerstörungsreaktionen unterworfen.

TESTBEISPIEL 3

Hitzestabilität von hG-CSF-Derivaten

Jeweils ein 20 ug Teil der verschiedenen, in Tabelle 6 gezeigten Derivate der Erfindung wurde in 1 ml Phosphat-gepufferter physiologischer Saline (PBS (pH 7,2) oder in α-MEM, das mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt wurde, gelöst. Die Inkubation wurde bei 56ºC durchgeführt, und Proben wurden in Zeitintervallen entnommen und mittels des Kolonie-Bildungstests unter Verwendung von Mausknochenmarkzellen (die oben erwähnte Methode von Okabe et al.) auf ihre CSF-Aktivität hin getestet.
Jede Probe wurde mittels der verdoppelnden Verdünnungstechnik verdünnt, was ausgehend von 40 ng/ml zehn Verdünnungsstufen ergab. Für jede Stufe wurde ein Aktivitätstest durchgeführt, und die Restaktivität wurde bestimmt durch Vergleich der Aktivität bei einer bestimmten Konzentration, bei der eine gute Dosis- Antwort vorlag, mit der vor der Erhitzung (0 Minuten).
Die Restaktivitäts-Daten (entsprechend der thermalen Stabilität), erhalten in PBS und in 10% FBS-ergänztem α-MEM, sind in Tabelle 6(A) bzw. Tabelle 6(B) dargestellt. TABELLE 6 (A) Restaktivität (%) Probe 30 min Intaktes G-CSF TABELLE 6(B) Restaktivität (%) Probe 30 min Intaktes G-CSF

BEISPIEL 22

Konstruktion von pCfBD28A17 und pCfBD28T17 unter Verwendung von ortsspezifischer Mutagenese (s. Fig. 17)

(1) Herstellung von einzelsträngiger Template-DNA (einzelsträngiges pt19BD28N)

In 50 ul Y-100-Puffer wurden 3 ug pCfBD28, erhalten mittels des Verfahrens des Beispiels 6-(4), gelöst. Jeweils 10 Einheiten der Restriktions-Enzyme BanIII (Toyobo) und PstI wurden zugegeben, und die Spaltungsreaktion wurde bei 37ºC für 2 h durchgeführt. Aus dem Reaktionsgemisch wurden mittels der LGT- Methode ca. 0,1 ug eines ca. 210 bp-DNA-Fragmentes (BanIII-PstI- Fragment) kodierend für den N-terminalen Teil des hG-CSF- Derivates (ND28), gewonnen.
Getrennt davon wurde 1 ug des M13-phagen-Vektors M13mp19RF-DNA (Takara Shuzo) in insgesamt 50 ul Y-50-Puffer gelöst. 10 Einheiten des Restriktions-Enyzmes AccI (Toyobo) wurde zugegeben, und die Spaltungsreaktion wurde bei 37ºC für 2 h durchgeführt. Danach wurde NaCl bis zu einer NaCl-Konzentration von 100 mM zugegeben, wurden 10 Einheiten des Restriktions-Enyzmes PstI addiert, und die Spaltungsreaktion wurde bei 37ºC für 2 h durchgeführt. Aus dem Reaktionsgemisch wurde mittels der LGT- Methode ca. 0,8 ug eines DNA-Fragmentes mit 7,24 kb (AccI-PstI- Fragment) erhalten.
In 50 ul T4-DNA-Ligase-Puffer wurde 0,2 ug des BanIII-PstI- Fragmentes (ca. 210 Bp) und 0,05 ug des AccI-PstI-Fragmentes (ca. 7,24 Kb), jeweils wie oben beschrieben, erhalten, gelöst. T4-DNA-Ligase (10 Einheiten) wurde zum Lösungsgemisch gegeben, und die Ligationsreaktion wurde bei 12ºC für 16 h durchgeführt.
Sodann wurde das obige Reaktionsgemisch verwendet, um E. coli JM105 mittels einer bekannten Methode zu transfizieren. Somit wurde ein rekombinanter Phage erhalten. Aus kultivierten Zellen eines E. coli JM105-hergeleiteten Transformanden, infiziert mit dem rekombinanten Phagen, wurde die rekombinante M13-Phagen RF- DNA gewonnen. Die Struktur dieser RF-DNA (im folgenden bezeichnet als pt19BD28N) wurde durch Spaltung mit PstI, EcoRI, AvaI und XhoI, gefolgt von Polyacrylamid-Gelelektrophorese, bestätigt. Sodann wurde einzelsträngiges pt19BD28N aus dem rekombinanten Phagen mittels einer bekannten Methode gewonnen und als Template verwendet.

Herstellung von "gapped-duplex"-DNA

In 30 ul Y-100-Puffer wurden 3 ug der M13mp19 RF-DNA (Takara Shuzo) gelöst. Jeweils 10 Einheiten der Restriktions-Enzyme EcoRI und HindIII wurden zugegeben, und die Spaltungsreaktion wurde bei 37ºC für 2 h durchgeführt. Aus dem Reaktionsgemisch wurden mittels der LGT-Methode ca. 2,5 ug eines DNA-Fragmentes mit 7,2 Kb (EcoRI-HindIII-Fragment) gewonnen.
Dieses M13mp19 RF-DNA-hergeleitete EcoRI-HindIII-Fragment (ca. 7,2 Kb) und 1 ug der einzelsträngigen Template-DNA pt19BD28N, erhalten wie im vorgehenden Kapitel beschrieben, wurden in 27 ug Klenow-Puffer gelöst, und die DNA-Denaturierung wurde durch Kochen bei 100ºC für 6 Minuten verursacht. Danach blieb das Gemisch bei 65ºC für 10 Minuten, bei 37ºC für 40 Minuten, bei 4ºC für 40 Minuten und auf Eis für 10 Minuten stehen, um den Fortgang der Anlagerungsreaktion zu bewirken, wobei eine "gapped-duplex"-DNA gebildet wurde, in dem nur der G-CSF- Genteil des Templates einzelsträngig war. Die so gebildete "gapped-duplex"-DNA wurde mittels der LGT-Methode zurückgewonnen.

(c) Mutagenese (Konstruktion von pt19BD28NA17 und pt19BD28NT17)

Eine einzelsträngige DNA (D-1), erforderlich zur Substitution von Ala für die 17. Aminosäure (ausgehend vom N-Terminus), nämlich Ser, des im Beispiel 6 erhaltenen hG-CSF-Derviates [ND28], und eine einzelsträngige DNA (D-2), erforderlich zur Substitution von Thr für Ser, wurden mittels der gewöhnlichen Phosphotriester-Methode synthetisiert. Die Basen-Sequenzen von D-1 (33-mer) und D-2 (33-mer) sind nachfolgend dargestellt:
Die Designs der obigen DNAs sind derart, daß Mutagenese unter Verwendung von D-1 die Bildung einer neuen StuI-Stelle bewirken kann, und Mutagenese unter Verwendung von D-2 eine neue XbaI- Stelle entstehen läßt. Daher können die Mutanten durch Spaltung mit diesen Restriktions-Enzymen identifiziert werden.
D-1 und D-2 wurden jeweils einzeln, in einer Menge von 1 ug, in 50 ul T4-Kinase-Puffer gelöst. 30 Einheiten der T4-Polynukleotid-Kinase wurden zugegeben, und die Phosphorylierungsreaktion wurde bei 37ºC für 60 Minuten durchgeführt.
Sodann wurden 0,2 ug der phosphorylierten D-1 oder D-2 und 0,1 ug der "gapped-duplex"-DNA, erhalten wie im Eingangs- Kapitel beschrieben, in 34 ul eines Puffers, enthaltend 6,5 mM Tris-HCl (pH 7,5), 8 mM MgCl&sub2;, 1 mM 2-Mercaptoethanol und 100 mM NaCl, gelöst. Die Lösung wurde bei 65ºC für 60 Minuten und sodann bei Raumtemperatur für 30 Minuten stehengelassen, wobei sich D-1 oder D-2 an die "gapped-duplex"-DNA anlagerten.
Zu der Lösung wurden dATP, dTTP, DCTP und dGTP, jeweils in einer Konzentration von 0,5 mM, zugegeben. Nach weiterer Zugabe von 1,5 Einheiten des DNA-Polymerase I Klenow-Fragmentes und 10 Einheiten der T4-DNA-Ligase wurde die Extensions-Reaktion bei 4ºC für 16 h durchgeführt.
Die so erhaltenen Reaktionsgemische wurden verwendet, um E. coli JM105 zu transfizieren, und mutierte Phagen wurden erhalten. Die RF-DNAs wurden aus den mit mutierten Phagen infizierten E. coli JM105-Transformanden gewonnen und durch Spaltung mit AvaI, XhoI und StuI (wenn D-1 verwendet wurde) oder mit XbaI (wenn D-2 verwendet wurde), gefolgt von Polyacrylamid-Gelelektrophorese, identifiziert. Die RF-DNA mit der durch D-1 eingeführten Mutation wird als pt19BD28NA17 bezeichnet, und die RF-DNA mit der durch D-2 eingeführten Mutation wird als pt19BD28NT17 bezeichnet. Die Basensequenzen von pt19BD28NA17 und pt19BD28NT17 in der Nachbarschaft der StuI- Stelle bzw. XbaI-Stelle wurden mittels der Didesoxy-Sequenzierungsmethode unter Verwendung des M13-Phagen wie folgt bestätigt:

(d) Herstellung von pCfBD28A17 und pCfBD28T17

In 50 ul Y-100-Puffer wurden 3 ug von pt19BD28NA17 oder pt19BD28NT17, erhalten wie oben beschrieben, gelöst. Jeweils 10 Einheiten der Restriktions-Enzyme AvaI und XhoI wurden zugegeben, und die Spaltungsreaktion wurde bei 37ºC für 2 h durchgeführt. Aus dem Reaktionsgemisch wurden mittels der LGT- Methode 0,05 ug eines ca. 110 Bp. DNA-Fragmentes, enthaltend die Stelle der Mutation, die wie im vorhergehenden Kapitel beschrieben eingeführt wurde (AvaI-XhoI-Fragment).
Getrennt davon wurden 2 ug von pCfBD28, erhalten in Beispiel 6-(4), in 50 ul Y-100-Puffer gelöst. Jeweils 10 Einheiten der Restriktions-Enzyme XhoI und BglII wurden zugegeben, und die Spaltungsreaktion wurde bei 37ºC für 2 h durchgeführt. Aus dem Reaktionsgemisch wurde mittels der LGT-Methode ca. 1 ug eines DNA-Fragmentes mit ca. 2,74 Kb (XhoI-BglII-Fragment), das einen Teil des Tryptophan-Promotors enthielt, gewonnen.
Weiterhin wurden getrennt davon 2 ug von pCfBD28 in 50 ul Y- 100-Puffer gelöst. 10 Einheiten des Restriktions-Enzymes BglII wurden zugegeben, und die Spaltungsreaktion wurde bei 37ºC für 2 h durchgeführt. Nach Bestätigung der Vollständigkeit der BglII-Spaltung mittels Agarose-Gelelektrophorese wurden 5 Einheiten des Restriktions-Enzymes Aval zugegeben, und eine Partialspaltung wurde bei 37ºC für 10 Minuten erreicht. Aus dem Reaktionsgemisch wurden mittels der LGT-Methode 0,4 ug eines ca. 1,29 Kb-DNA-Fragmentes (BglII-AvaI-Fragment), das den größten Teil der reifen hG-CSF-cDNA mit dem Teil des lpp-Terminators enthielt, gewonnen.
Sodann wurde 0,1 ug des pCfBD28-hergeleiteten XhoI-BglII- Fragmentes (ca. 2,74 Kb), 0,05 ug des pCfBD28-hergeleiteten BglII-AvaI-Fragmentes (ca. 1,29 Kb) und 0,02 ug des pt19BD28NA17- oder pt19BD28NT17-hergeleiteten AvaI-XhoI- Fragmentes (ca. 110 Bp.) in 60 ug T4-DNA-Ligase-Puffer gelöst. 10 Einheiten der T4-DNA-Ligase wurden zugegeben, und die Ligationsreaktion wurde bei 12ºC für 16 h durchgeführt.
Das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde verwendet, um E. coli HB101 zu transformieren, und eine Apr-Kolonie wurde erhalten.
Die Plasmid-DNA wurde aus kultivierten Zellen dieser Kolonie zurückgewonnen. Das unter Verwendung von pt19BD28NA17 konstruierte Plasmid wird als pCfBD28A17 bezeichnet, und das unter Verwendung von pt19BD28NT17 konstruierte wird als pCfBD28T17 bezeichnet. Die Struktur von pCfBD28A17 wurde mittels Spaltung mit AvaI, XhoI, BglII und StuI, gefolgt von Agarose-Gelelektrophorese, bestätigt. Die Struktur von pCfBD28T17 wurde mittels Spaltung mit AvaI, XhoI, BglII und XbaI, gefolgt von Agarose-Gelelektrophorese, bestätigt.
Die im hG-CSF-Derivat ersetzten Aminosäurereste, die durch diese beiden Plasmide kodiert werden, lauten im Vergleich zum reifen hG-CSF wie folgt: Position der Aminosäre-Substitution Plasmid (Aminosäure von hG-CSF)
Die durch pCfBD28A17 und pCfBD28T17 kodierten hG-CSF-Derivate werden im folgenden als hG-CSF[ND28A17] bzw. hG-CSF[ND28T17] bezeichnet.

VERGLEICHSBEISPIEL 1

Isolierung des hG-CSF-cDNA-tragenden Plasmides pCSF1-2

(1) Herstellung von Poly(A)-RNA aus normalen, humanen, peripheren Blut-Makrophagen

Makrophagen, die zu den adhärenten Zellen gehören, wurden durch Kultivierung von Leukocyten isoliert, die erhalten wurden durch Zentrifugation von normalem, humanem, peripherem Blut in einer Plastikflasche und Entfernung nicht-adhärenter Zellen durch Waschen. Die Poly(A)-RNA wurde aus den Makrophagen mittels der Guanidinium-Thiocyanat-Lithiumchlorid-Methode [Cathala et al.: DNA, 2, 329 (1983)] wie folgt präpariert.
Normales, humanes, peripheres Blut (400 ml) wurde mit einem Hitachi-RPR10-Rotor bei 1.800 UpM für 20 Minuten zentrifugiert. Das resultierende Blutzell-Präzipitat wurde in 50 ml Phosphatgepufferter Salzlösung [8 g/l NaCl, 0,2 g/l KCl, 1,15 g/l wasserfreies Na&sub2;HPO&sub4;, 0,2 g/l KH&sub2;PO&sub4; (pH 7,2); im folgenden abgekürzt als PBS] suspendiert. Ein 25 ml-Teil dieser Suspension wurde auf 25 ml Lymphocyten-Separations-Flüssigkeit (BIONETICS) geschichtet, und das Ganze wurde mit einem Hitachi- RPR10-Rotor bei 1.800 UpM für 30 Minuten zentrifugiert. Die Leukocyten in der mittleren Schicht wurden entnommen, mit dem gleichen Volumen PBS gewaschen (auf einem Hitachi RPR10-Rotor bei 1.500 UpM für 10 Minuten), sodann in 20 ml RPMI-1640-Medium (Nissui Seiyaka), enthaltend 5% fötales Rinderserum, suspendiert, und unter Verwendung einer Gewebekultur-Flasche (Corning) kultiviert. Nach Wachstum bei 37ºC für 1,5 h wurde der Kulturüberstand zusammen mit nicht-adhärenten Zellen entfernt. Eine frische 20 ml-Portion des gleichen Mediums und E. coli-hergeleitetes Lipopolysaccharid (LPS) (in einer Menge um eine Konzentration von 0,3 mg/ml zu ergeben) wurden zugegeben, und die Kultivierung wurde bei 37ºC für weitere 4 h fortgesetzt. Sodann wurden die Zellen aus der Kultur mittels Zentrifugation bei 1.100 · g bei 4ºC für 10 Minuten geerntet, mit 30 ml PBS gewaschen und unter Verwendung eines Vortex- Mixers in 10 ml einer Lösung, bestehend aus 5 M Guanidinium- Thiocyanat, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl (pH 7) und 8% (v/v) 2-Mercaptoethanol, aufgelöst. Das Lösungsprodukt wurde in ein Zentrifugationsröhrchen transferiert, 80 ml 4 M LiCl wurden zugegeben, die Mischung wurde gerührt, daraufhin bei 4ºC für 20 h stehengelassen und mit einem Hitachi-RPR10-Rotor bei 9.000 UpM für 90 Minuten zentrifugiert. Dadurch wurde ein RNA- Präzipitat gewonnen. Das RNA-Präzipitat wurde in 50 ml einer Lösung, bestehend aus 4 M Harnstoff und 2 M Lithiumchlorid, suspendiert, die Suspension wurde mit einem Hitachi-RPR10-Rotor bei 9.000 UpM für 60 Minuten zentrifugiert und ein RNA- Präzipitat wurde wieder zurückgewonnen.
Das RNA-Präzipitat wurde in 10 ml einer Lösung, bestehend aus 0,1% Natriumlaurylsulfat, 1 mM EDTA und 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), gelöst, und die RNA wurde mittels Phenol-Chloroformextraktion und Ethanol-Präzipitation zurückgewonnen. Die erhaltene RNA (ca. 0,8 mg) wurde in l ml einer Lösung, bestehend aus 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 1 mM EDTA, gelöst. Nach Inkubation bei 65ºC für 5 Minuten wurden 0,1 ml 5 M NaCl zugegeben. Das Gemisch wurde einer Oligo(dT)-Cellulose-Säule (P-L Biochemicals)-Chromatographie (Säulenvolumen 0,5 ml), unterzogen. Die adsorbierte, Poly(A)-enthaltende mRNA wurde mit einer Lösung, bestehend aus 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 1 mM EDTA eluiert, was ca. 30 ug Poly(A)-enthaltende mRNA ergab.

(2) cDNA-Synthese und Insertion der DNA in einen Vektor

Die Okayama-Berg-Methode (Mol. Cell. Biol., 2, 161 (1982)) wurde zur cDNA-Synthese und zur rekombinanten Plasmid- Konstruktion mittels Insertion der erhaltenen cDNA angewendet. Die Verfahren hierzu sind in Fig. 9 dargestellt.
Zu 300 ul einer Lösung, enthaltend 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl&sub2; und 10 mM NaCl, wurden 400 ug pCDV1 (Okyama & Berg: Mol. Cell. Biol. 3, 280 (1983)) gegeben, und nach weiterer Zugabe von 500 Einheiten KpnI wurde die Reaktion bei 37ºC für 6 h durchgeführt, wobei das Plasmid an der KpnI-Stelle gespalten wurde. Die DNA wurde mittels Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanol-Präzipitation zurückgewonnen. Ca. 200 ug der KpnI- gespaltenen DNA wurden zu 200 ul einer Lösung gegeben, die hergestellt wurde durch Zugabe von dTTP in einer Konzentration von 0,25 mM zu einem Puffer (im folgenden abgekürzt als TdT- Puffer), enthaltend 40 mM Natriumcacodylat, 30 mM Tris-HCl (pH 6,8), 1 mM CaCl&sub2; und 0,1 mM Dithiotreitol (im folgenden abgekürzt als DTT), und nach weiterer Zugabe von 81 Einheiten terminaler Desoxynukleotid-Transferase (im folgenden abgekürzt als TdT) (P-L Biochemicals) wurde die Reaktion bei 37ºC für 11 Minuten durchgeführt, wobei eine Poly(dT)-Kette, enthaltend ca. 67 dT-Reste, an jede KpnI-Spaltungsstelle am 3'-Ende von pCDV1 addiert wurde. Ca. 100 ug der Poly(dT)-Ketten-addierten pCDV1-DNA wurde aus dem obigen Reaktionsgemisch mittels Phenol- Chloroform-Extraktion und Ethanol-Präzipitation zurückgewonnen. Die DNA wurde zu einem Puffer, enthaltend 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl&sub2; und 100 mM NaCl, gegeben. 360 Einheiten EcoRI wurden weiterhin zugegeben, und die Reaktion wurde bei 37ºC für 2 h durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde mit der LGT- Methode behandelt, und ein DNA-Fragment mit ca. 3,1 Kb wurde gewonnen. So wurden ca. 60 ug des pCDV1 mit angehängter Poly(dT)-Kette erhalten. Die DNA wurde in 500 ul einer Lösung, enthaltend 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 1 mM EDTA, gelöst. Die Lösung wurde bei 65ºC für 5 Minuten inkubiert, dann mit Eis gekühlt, und 50 ul 5 M NaCl wurden zugegeben. Das Gemisch wurde einer Oligo(dA)-Cellulose-Säule (Collaborative Research)- Chromatographie unterzogen. Moleküle einer ausreichenden Poly(dT)-Kettenlänge wurden an der Säule adsorbiert und wurden mit einer Lösung, enthaltend 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 1 mM EDTA, eluiert. So wurden 27 ug des pCDV1 mit angehängter Poly(dT)-Kette erhalten (im folgenden abgekürzt als Vektor- Primer).
Sodann wurde eine Linker-DNA synthetisiert.
Zu 200 ul eines Puffers, enthaltend 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl&sub2; und 50 mM NaCl, wurden ca. 14 ug pL1 (Okayama & Berg: Mol. Cell. Biol. 3, 280 (1983)) zugegeben. 50 Einheiten PstI wurden weiterhin zugegeben, und die Reaktion wurde bei 37ºC für 4 h durchgeführt, wobei die pL1-DNA an der PstI-Stelle gespalten wurde. Das Reaktionsgemisch wurde einer Phenolchloroform-Extraktion, gefolgt von Ethanol-Präzipitation, unterzogen, wobei ca. 13 ug der PstI-gespaltenen pL1-DNA gewonnen wurden. Die DNA (ca. 13 ug) wurde zu 50 ul TdT-Puffer, ergänzt durch dGTP mit einer Endkonzentration von 0,25 mM, gegeben. 54 Einheiten TdT (P-L Biochemicals) wurden weiterhin zugegeben, und das Gemisch wurde bei 37ºC für 13 Minuten inkubiert, wobei eine (dG)-Kette, enthaltend ca. 14 dG-Reste, an jedem 3'-Ende der PstI-Spaltungsstelle des pL1 addiert wurde. Die DNA wurde mittels Phenol-Chloroform-Extraktion, gefolgt von Ethanol-Präzipitation, gewonnen. Die DNA wurde zu 100 ul eines Puffers, bestehend aus 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl&sub2; und 60 mM NaCl, gegeben. 80 Einheiten HindIII wurden weiterhin zugegeben, und das Gemisch wurde bei 37ºC für 3 h inkubiert, wobei die pL1-DNA an der HindIII-Stelle gespalten wurde. Das Reaktionsgemisch wurde mittels Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert, und ein DNA-Fragment mit ca. 0,5 Kb wurde mittels der DEAE-Papier-Methode (Dretzen et al.: Anal. Biochem., 112, 295 (1981)) gewonnen. Somit wurde die mit einer Oligo(dG)-Kette versehene Linker-DNA erhalten (im folgenden einfach als Linker-DNA bezeichnet).
In 22,3 ul einer Lösung, enthaltend 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 8 mM MgCl&sub2;, 30 mM KCl, 0,3 mM DTT, 2 mM dNTP (dATP, dTTP, dGTP und dCTP) und 10 Einheiten Ribonuklease-Inhibitor (P-L Biochemicals) wurden ca. 3 ug Poly(A)-RNA und ca. 1,4 ug des Vektor-Primers, jeweils hergestellt wie oben beschrieben, gelöst. 10 Einheiten Reverse Transkriptase (Seikagaku Kogyo) wurden zugegeben, und eine zur mRNA komplementäre DNA wurde mittels Inkubation des Gemisches bei 41ºC für 90 Minuten synthetisiert. Das Reaktionsgemisch wurde einer Phenol- Chloroform-Extraktion unterzogen und die Vektor-Primer-DNA mit dem addierten RNA-DNA-Doppelstrang wurde mittels Ethanol- Präzipitation zurückgewonnen. Diese DNA wurde in 20 ul TdT-Puffer, enthaltend 66 uM dCTP und 0,2 ug Poly(A), gelöst. 14 Einheiten TdT (P-L-Biochemicals) wurden zugegeben, und das Gemisch wurde bei 37ºC für 2 Minuten inkubiert, wobei eine (dC)-Kette, enthaltend 20 dC-Reste, an das 3'-Ende der cDNA addiert wurde. Das Reaktionsgemisch wurde mit Phenol-Chloroform extrahiert, und die mit der (dC)-Kette versehene cDNA-Vektor-Primer-DNA wurde mittels Ethanol-Präzipitation zurückgewonnen. Die DNA wurde in 400 ul einer Lösung, enthaltend 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl&sub2; und 60 mM NaCl, gelöst. 20 Einheiten HindIII wurden zugegeben, und die Inkubation wurde bei 37ºC für 2 h durchgeführt, um eine Spaltung an der HindIII-Stelle zu erreichen. Eine Phenol-Chloroform-Extraktion des Reaktionsgemisches und die nachfolgende Ethanol-Präzipitation ergaben 0,5 Picomol der mit der (dc)-Kette versehenen cDNA- Vektor-Primer-DNA. In 100 ul einer Lösung, enthaltend 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,1 M NaCl und 1 mM EDTA, wurden 0,2 Picomol der DNA und 0,4 Picomol der oben erwähnten Linker-DNA gelöst, und die Inkubation wurde bei 65ºC, 42ºC und 0ºC für 10 Minuten, 25 Minuten bzw. 30 Minuten durchgeführt. Ein Gesamtvolumen von 1000 ul eines Reaktionsgemisches, das die folgende Zusammensetzung hatte, wurde hergestellt: 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 4 mM MgCl&sub2;, 10 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 0,1 M KCl und 0,1 mM β-NAD. Zu diesem Reaktionsgemisch wurden 25 Einheiten von E. colihergeleiteter DNA-Ligase (New England Bio-Labs) zugegeben, und die Inkubation wurde bei 11ºC für 18 h durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde mit 40 uM dNTP und mit β-NAD in einer Endkonzentration von 0,15 mM ergänzt. 10 Einheiten E. coli-DNA- Ligase, 20 Einheiten E. coli-DNA-Polymerase I (P-L Biochemicals) und 10 Einheiten E. coli-Ribonuklease H (P-L Biochemicals) wurden zugegeben, und die Inkubation wurde bei 12ºC für 1 h und dann bei 25ºC für 1 h durchgeführt. Das obige Reaktionsverfahren verursachte eine Zirkularisierung der cDNA- enthaltenden rekombinanten DNA und eine Substitution des RNA- Teils des RNA-DNA-Doppelstranges durch die zugehörige DNA. Somit wurde das rekombinante Plasmid in der gänzlich doppelsträngigen DNA-Form gebildet.

(3) Selektion der hG-CSF-cDNA-enthaltenden rekombinanten DNA

Die rekombinanten Plasmide, erhalten wie in (2) beschrieben, wurden verwendet, um E. coli C600SF8 mittels der Methode von Scott et al. (Katsuya Shigesada: Saibo Kogaku (Cell Technology), 2, 616 (1983)) zu transformieren. Ca. 9.200 erhaltene Kolonien wurden auf einem Nitrocellulose-Filter fixiert. Ein Stamm wurde ausgewählt, der in der Lage war, stark bei 60ºC mit einer Sonde zu assoziieren, die hergestellt wurde durch Markierung mit ³²P der 27 Nukleotide-langen synthetischen DNA 5'-ACCCCCCTGGGCCCTGCCAGCTCCCTG-3', entsprechend den N-terminalen neun Aminosäuren des reifen hG-CSF-Proteins, isoliert nach Nagata et al. (Nagata et al.: Nature, 319, 415 (1986)), (die Grunstein-Hogness-Methode; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 3961 (1975)). Die gesamte Basensequenz der in dem, in diesem Stamm vorhandenen, Plasmid pCSF1-2 enthaltenen cDNA wurde mittels der Didesoxy-Sequenzierungs-Methode unter Verwendung des M13-Phagen bestimmt (Tabelle 1). Als Resultat wurde gefunden, daß die in pCSF1-2 enthaltene cDNA für hG-CSF codiert.
Wie oben erwähnt wurde dieser bakterielle Stamm beim FRI unter der Bezeichnung E. coli ECSF1-2 (FERM BP-1220) deponiert.

VERGLEICHSBEISPIEL 2

Isolierung und Reinigung des Plasmides pKYP26

Ein pKYP26-enthaltender E. coli-Stamm (E. coli IKYP26 (FERM BP- 863)) wurde in 10 ml L-Medium (1 & Bacto-Trypton, 0,5% Hefe- Extrakt, 1% NaCl, pH 7,5), enthaltend 50 ug/ml Ampicillin, bei 37ºC für 18 h kultiviert. Die gesamte Kultur wurde in 1 l L- Medium, enthaltend 50 ug/ml Ampicillin, transferiert und bei 37ºC kultiviert. Nach 4 h wurde Chloramphenicol in einer Konzentration von 170 ug/ml zugegeben, und die Kultivierung wurde bei 37ºC für weitere 16 h fortgesetzt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (5000 UpM, 10 Minuten) geerntet, mit 0,8% NaCl gewaschen, in 20 ml 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) suspendiert, und die Suspension wurde auf Eis gekühlt. Lysozym (10 mg/ml, 8 ml) wurde zugegeben, und nach Verweilen auf Eis für 10 Minuten wurden 9,6 ml 0,5 M EDTA zugegeben. Nach Verweilen auf Eis für 10 Minuten wurden 2,3 ml 2% Triton X-100 (Wako Pure Chemical Industries) zugegeben, gefolgt von weiterer Inkubation auf Eis für 1 h. Eine Ultrazentrifugation bei 50.000 · g bei 4ºC für 1 h ergab ca. 40 ml eines Überstandes. Sodann wurde dieser Überstand durch Zugabe von 3 mM NaOH auf einen pH von 12,5 eingestellt und langsam bei Raumtemperatur für 10 Minuten gerührt. Der pH wurde durch Zugabe von 2 M Tris-HCl (pH 7,5) auf 8,5 zurückgebracht, gefolgt von weiterem Rühren für 3 Minuten. Zu diesem Zeitpunkt betrug das Flüssigkeitsvolumen ca. 55 ml. Ein 1/9-Volumen 5 M NaCl wurde zugegeben und dann eine Phenol-Extraktion durchgeführt. Ein 1/250 Volumen von 5 mg/ml RNase A (Sigma) wurde zugegeben, und die RNA-Abbaureaktion wurde bei 37ºC für 1 h durchgeführt. Sodann wurde ein 1/5 Volumen 5 M NaCl und daraufhin ein 1/3 Volumen von 30% PEG 6000 (Nakarai Chemicals) zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde bei -20ºC für 2 h inkubiert. Das resultierende Präzipitat wurde mittels Zentrifugation gesammelt und in 2 ml einer Lösung, enthaltend 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 1 mM EDTA, gelöst. Natrium-Dodecyl-Sulfat (SDS) wurde in einer Konzentration von 0,5%, und Proteinase K (Sigma) wurde in einer Konzentration von 50 ug/ml zugegeben, und die proteolytische Reaktion wurde bei 37ºC für 1 h durchgeführt. Nach drei Wiederholungen einer Phenol-Extraktion wurde die DNA mittels Chloroform-Extraktion und Ethanol-Präzipitation zurückgewonnen und in 1 ml einer Lösung, enthaltend 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 1 mM EDTA, gelöst. Auf diesem Wege konnten 800 ug von pKYP26 erhalten werden. Die Struktur von pKYP26 wurde mittels Spaltung mit EcoRI, KpnI, BamHI, BglII und PstI, gefolgt von Agarose-Gelelektrophorese, bestätigt.

VERGLEICHSBEISPIEL 3

(1) Isolierung des humanen LT cDNA-enthaltenden Plasmides pLT1

(1) Herstellung von Poly(A)-RNA aus LukII-Zellen

Die Guanidinium-Thiocyanat-Lithiumchlorid-Methode (Cathala et al.: DNA, 2, 329. (1983)) wurde wie folgt verwendet, um Poly(A)enthaltende RNA aus der humanen Lymphoblastoid-Zellinie LukII herzustellen:
Humane Lymphoblastoid-LukII-Zellen (Berish Y. Rubin et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 6637 (1985)) wurden in 1 l RPMI 1640-Medium (Nissui Seiyaku), enthaltend 5% fötales Rinderserum und 1 mM N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure (HEPES), in einer Zellkonzentration von 8 · 10&sup5;-Zellen/ml aufgenommen und dort kultiviert. Eine Spinner-Kulturflasche wurde für die Kultur verwendet. Nach Kultivierung bei 37ºC für 48 h wurden die Zellen mittels Zentrifugation gesammelt, in ein frisches 1 l-Volumen RPMI 1640-Medium, enthaltend 10 ng/ml Phorbolmyristylacetat (PMA), 5% fötales Rinderserum und 1 mM HEPES, und die Kultivierung wurde bei 37ºC für weitere 48 h fortgesetzt. Aus einem Teil (250 ml) dieser Zellsuspension wurden die Zellen durch Zentrifugation bei 1.100 · g bei 4ºC für 10 Minuten geerntet, mit 80 ml Phosphatpuffer gewaschen und unter Verwendung eines Vortex-Mixers in 10 ml einer Lösung, enthaltend 5 M Guanidinium-Thiocyanat, 10 mM EDTA, 50 mM Tris- HCl (pH 7) und 8% (v/v) 2-Mercaptoethanol, aufgelöst. Das Lösungsprodukt wurde in ein Zentrifugationsröhrchen transferiert, 80 ml 4 M LiCl wurden zugegeben, die Mischung wurde gerührt und dann bei 4ºC für 20 h stehengelassen. Nach Zentrifugation mit einem Hitachi-RPR10-Rotor bei 9.000 UpM für 90 Minuten wurde ein RNA-Präzipitat gewonnen. Das RNA- Präzipitat wurde in 50 ml einer Lösung, enthaltend 4 M Harnstoff und 2 M Lithiumchlorid, suspendiert, und nach Zentrifugation mit einem Hitachi-RPR10-Rotor bei 9.000 UpM für 60 Minuten wurde die RNA wiederum als ein Präzipitat zurückgewonnen. Das RNA-Präzipitat wurde in 10 ml einer Lösung, enthaltend 0,1% Natriumlaurylsulfat, 1 mM EDTA und 10 mM Tris- HCl (pH 7,5), gelöst, und die RNA wurde mittels Phenol- Choroform-Extraktion, gefolgt von Ethanol-Präzipitation, zurückgewonnen. Ca. 2,5 mg der so erhaltenen RNA wurden in 1 ml einer Lösung, enthaltend 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 1 mM EDTA gelöst. Nach Inkubation bei 65ºC für 5 Minuten wurden 0,1 ml 5 M NaCl zugegeben. Das Gemisch wurde einer Oligo(dT)-Cellulose- Säulen-(P-L Biochemicals)-Chromatographie (Säulenvolumen 0,5 ml) unterzogen. Die adsorbierte, Poly(A)-enthaltende mRNA wurde mit einer Lösung, enthaltend 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 1 mM EDTA, eluiert. Ca. 100 ug der Poly(A)-enthaltenden mRNA wurden erhalten.

(2) cDNA-Synthese und Insertion der DNA in einen Vektor

Die Okayama-Berg-Methode (Mol. Cell. Biol., 2, 161, 1982)) wurde verwendet zur cDNA-Synthese und zur rekombinanten Plasmid-Konstruktion durch Insertion der erhaltenen cDNA. Die entsprechenden Verfahrensweisen sind in Fig. 9 dargestellt.
Zu 300 ul einer Lösung, enthaltend 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl&sub2; und 10 mM NaCl, wurden 400 ug pCDV1 (Okayama & Berg: Mol. Cell. Biol., 3, 280, (1983)) gegeben, und nach weiterer Zugabe von 500 Einheiten KpnI wurde die Reaktion bei 37ºC für 6 h durchgeführt, wobei das Plasmid an der KpnI-Stelle gespalten wurde. Die DNA wurde mittels Phenol-Chloroform-Extraktion, gefolgt von Ethanol-Präzipitation, zurückgewonnen. Ca. 200 ug der KpnI-gespaltenen DNA wurden zu 200 ul einer Lösung, hergestellt durch Zugabe von dTTP in einer Konzentration von 0,25 mM zu TdT-Puffer, zugegeben, und nach weiterer Zugabe von 81 Einheiten TdT (P-L Biochemicals) wurde die Reaktion bei 37ºC für 11 h durchgeführt, wobei eine Poly(dT)-Kette (ca. 67 dT- Reste) an jedes 3'-Ende der KpnI-Spaltungsstellen des pCDV1 addiert wurden. Ca. 100 ug der mit einer Poly(dT)-Kette versehenen pCDV1-DNA wurden aus der Lösung mittels Phenol- Chloroform-Extraktion gefolgt von Ethanol-Präzipitation zurückgewonnen. Die DNA wurde zu 150 ul einer Lösung, enthaltend 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl&sub2; und 100 mM NaCl, gegeben, und nach weiterer Zugabe von 360 Einheiten EcoRI wurde die Reaktion bei 37ºC für 2 h durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde mit der LGT-Methode behandelt, und ein DNA-Fragment mit ca. 3,1 Kb wurde zurückgewonnen. Ca. 60 ug des mit einer Poly(dT)-Kette versehenen pCDV1 wurden somit erhalten. Die DNA wurde in 500 ul einer Lösung, enthaltend 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) und 1 mM EDTA, gelöst. Die Lösung wurde bei 65ºC für 5 Minuten inkubiert, sodann auf Eis gekühlt, und 50 ul 5 M NaCl wurde zugegeben. Das Gemisch wurde einer Oligo(dA)-Cellulose-Säulen-(Collaborative Research)-Chromatographie unterzogen. Moleküle mit einer ausreichenden Poly(dT)-Kettenlänge wurden an der Säule adsorbiert und wurden dann mit einer Lösung, enthaltend 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 1 mM EDTA, eluiert, was 27 ug des mit einer Poly(dT)- Kette versehenen pCDV1 ergab (im folgenden bezeichnet als Vektor-Primer).
Sodann wurde eine Linker-DNA hergestellt.
Ca. 14 ug pL1 (Okayama & Berg: Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)) wurden zu 200 ul eines Puffers, enthaltend 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl&sub2; und 50 mM NaCl, gegeben, und nach weiterer Zugabe von 50 Einheiten PstI wurde die Reaktion bei 37ºC für 4 h durchgeführt, um die pL1-DNA an der PstI-Stelle zu spalten. Das Reaktionsgemisch wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion unterzogen, und ca. 13 ug der PstI-gespaltenen pL1-DNA wurden mittels Ethanol-Präzipitation zurückgewonnen. Ca. 13 ug der DNA wurden zu 50 ul TdT-Puffer, enthaltend dGTP in einer Endkonzentration von 0,25 mM, gegeben, und nach weiterer Zugabe von 54 Einheiten TdT (P-L Biochemicals) wurde die Inkubation bei 37ºC für 13 Minuten durchgeführt, um die Addition einer (dG)-Kette (ca. 14 dG-Reste) an jedes 3'-Ende der PstI-Spaltungsstelle des pL1 zu erreichen. Nach Phenol-Chloroform-Extraktion wurde die DNA mittels Ethanol-Präzipitation gewonnen. Die DNA wurde zu 100 ul eines Puffers, enthaltend 10 mM Tris-HCl (PH 7,5), 6 mM MgCl&sub2; und 60 mM NaCl, gegeben, und nach weiterer Zugabe von 80 Einheiten HindIII wurde die Inkubation bei 37ºC für 3 h durchgeführt, um eine Spaltung der pL1-DNA an der HindIII- Stelle zu erreichen. Das Reaktionsgemisch wurde mittels Agarose-Gel-Elektrophorese fraktioniert, und ein DNA-Fragment mit ca. 0,5 Kb wurde mittels der DEAE-Papiermethode (Dretzen et al.: Anal. Biochem., 112, 295 (1981)) zurückgewonnen. Auf diese Weise wurde die mit einer Oligo(dG)-Kette versehene Linker-DNA erhalten (im folgenden einfach als Linker-DNA bezeichnet).
Ca. 2 ug der Poly(A)-RNA und ca. 1,4 ug des Vektor-Primers wurden in 22,3 ul einer Lösung, enthaltend 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 8 mM MgCl&sub2;, 30 mM KCl, 0,3 mM DTT, 2 mM dNTP (dATP, dTTP, dGTP und dCTP) und 10 Einheiten Ribonuklease-Inhibitor (P-L Biochemicals), gelöst. 10 Einheiten Reverse Transkriptase (Seikagaku Kogyo) wurden zugegeben, und die Inkubation wurde bei 41ºC für 90 Minuten durchgeführt, um die Synthese einer zur RNA komplementären DNA zu erreichen. Das Reaktionsgemisch wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion, gefolgt einer Ethanol- Präzipitation, unterzogen, wobei die Vektor-Primer-DNA mit dem addierten RNA-DNA-Doppelstrang gewonnen wurde. Die USA wurde in 20 ul TdT-Puffer enthaltend 66 uM dCTP und 0,2 ug Poly(A), gelöst. 14 Einheiten TdT (P-L Biochemicals) wurden zugegeben, und die Inkubation wurde bei 37ºC für 2 Minuten durchgeführt, um die Addition einer (dC)-Kette (20 dC-Reste) an das 3'-Ende der cDNA zu erreichen. Das Reaktionsgemisch wurde einer Phenol- Chloroform-Extraktion unterzogen, und die mit einer (dC)-Kette versehene cDNA-Vektor-Primer-DNA wurde mittels Ethanol- Präzipitation zurückgewonnen. Die DNA wurde in 400 ul einer Lösung, enthaltend 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl&sub2; und 60 mM NaCl, gelöst. 20 Einheiten HindIII wurden zugegeben, und die Inkubation wurde bei 37ºC für 2 h zur Spaltung an der HindIII- Stelle durchgeführt. Eine Phenol-Chloroform-Extraktion des Reaktionsgemisches und eine Ethanol-Präzipitation ergaben 0,5 Picomol der mit einer (dC)-Kette versehenen cDNA-Vektor-Primer DNA. Die DNA (0,2 Picomol) und 0,4 Picomol der oben erwähnten Linker-DNA wurden in 100 ul einer Lösung, enthaltend 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,1 M NaCl und 1 mM EDTA gelöst, und die Inkubation wurde bei 65ºC, 42ºC und 0ºC für 10 Minuten, 25 Minuten bzw. 30 Minuten in dieser Reihenfolge durchgeführt. Ein Gesamtvolumen von 100 ul eines Reaktionsgemisches wurde gemäß der folgenden Zusammensetzung hergestellt: 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 4 mM MgCl&sub2;, 10 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 0,1 M KCl und 0,1 mM β-NAD. Zu diesem Reaktionsgemisch wurden 25 Einheiten E. coli-DNA- Ligase (New England Bio-Labs) zugegeben, und die Inkubation wurde bei 11ºC für 18 h durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde durch 40 uM von dNTP und durch β-NAD in einer Endkonzentration von 0,15 mM ergänzt, und nach Zugabe von 10 Einheiten E. coli-DNA-Ligase, von 20 Einheiten E. coli-DNA- Polymerase I (P-L Biochemicals) und von 10 Einheiten E. coli- Ribonuklease H (P-L Biochemicals) wurde die Inkubation bei 12ºC für 1 h und danach bei 25ºC für 1 h durchgeführt. Das obige Reaktionsverfahren verursachte eine Zirkulisierung der cDNA-enthaltenden rekombinanten DNA und eine Substitution des RNA-Teils des RNA-DNA-Doppelstranges durch die zugehörige DNA. Somit wurde das rekombinante Plasmid in Form einer gänzlich doppelsträngigen DNA gebildet.

(3) Selektion der humanen LT cDNA-enhaltenden rekombinanten DNA

Die, wie in (2) beschrieben, erhaltenen rekombinanten Plasmide wurden verwendet, um E. coli C600SF8 (Cameron: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 3416 (1975)) mittels der Methode von Scott et al. (Katsuya Shigesada: Saibo Kogaku (Cell Technology), 2, 616 (1983)) zu transformieren. Ca. 30.000 erhaltene Kolonien wurden auf einem Nitrocellulose-Filter fixiert. Ein Stamm wurde ausgewählt, der in der Lage war, stark bei 52ºC mit einer Sonde zu assoziieren, die hergestellt wurde durch ³²P-Markierung der 17-Nukleotide langen synthetischen DNA 5'-GATCCCCGGCCTGCCTG-3', entsprechend der Basensequenz eines Teils der 5'- nichtranslatierten Region der humanen LT-cDNA, isoliert durch Genentech (Patric W. Gray et al.: Nature, 312, 721 (1984)) (Grunstein-Hogness-Methode: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 3961 (1975)). Die gesamte Basensequenz der cDNA des Plasmides pLT1, das in diesem Stamm enthalten war, wurde mittels der Didesoxy-Sequenzierungsmethode unter Verwendung des M13-Phagen bestimmt. Als Resultat wurde festgestellt, daß die pLT1-DNA für das humane LT codiert.

(2) Herstellung des rekombinanten Plasmides pLA1

In insgesamt 50 ul einer Lösung (im folgenden bezeichnet als "Y- 0-Puffer"), enthaltend 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl&sub2; und 6 mM 2-Mercaptoethanol, wurden 5 ug pLT1 (4,7 Kb), erhalten mittels des in dem vorhergehenden Kapitel beschriebenen Verfahrens, gelöst. 10 Einheiten des Restriktionsenzymes XhoII (Boehringer Mannheim) wurden zugegeben, und die Spaltungsreaktion wurde bei 37ºC für 2 h durchgeführt. Sodann wurde NaCl bis zu einer Endkonzentration von 150 mM zugegeben. 10 Einheiten des Restriktionsenzymes NsiI (New England Bio-Labs) wurden zugegeben, und die Spaltungsreaktion wurde bei 37ºC für weitere 3 h durchgeführt. Aus dem Reaktionsgemisch wurden mittels der LGT-Methode ca. 0,3 ug eines ca. 750 Bp. DNA- Fragmentes (XhoII-NsiI-Fragment), enthaltend den größten Teil der humanen LT-DNA, gewonnen.
Getrennt davon wurden 20 ug pLT1 in 200 ul Y-50-Puffer gelöst. 40 Einheiten des Restriktions-Enzymes HaeIII wurden zugegeben, und die Spaltungsreaktion wurde bei 37ºC für 2 h durchgeführt. Sodann wurde NaCl in einer Endkonzentration von 150 mM zugegeben. 40 Einheiten von NsiI wurden addiert, und die Spaltungsreaktion wurde bei 37ºC für weitere 3 h durchgeführt. Eine Polyacrylamid-Gelelektrophorese des Reaktionsgemisches ergab ca. 40 ng eines ca. 50 Bp. DNA-Fragmentes (HaeIII-NsiI- Fragment), enthaltend den N-terminalen Teil des humanen LT.
Weiterhin wurden getrennt davon 3 ug pGEL1 (3,4 Kb) in insgesamt 40 ul Y-100-Puffer gelöst. Jeweils 6 Einheiten der Restriktions-Enzyme StuI und BglII wurden zugegeben, und die Spaltungsreaktion wurde bei 37ºC für 3 h durchgeführt.
Aus dem Reaktionsgemisch wurde mittels der LGT-Methode ca. 1,0 ug eines Apr-Gen-enthaltenden DNA-Fragmentes mit ca. 2,3 Kb (StuI-BglII-Fragment) gewonnen.
Sodann wurden 0,2 ug des pLT1-hergeleiteten XhoII-NsiI- Fragmentes (ca. 750 Bp.), 20 ng des pLT1-hergeleiteten HaeIII- NsiI-Fragmentes (ca. 50 Bp.) und 0,6 ug des pGEL1-hergeleiteten StuI-BglII-Fragmentes (ca. 2,3 Kb) in insgesamt 20 ul T4- Ligase-Puffer gelöst. 2 Einheiten T4-DNA-Ligase (Takara Shuzo) wurden weiterhin zu diesem Lösungsgemisch gegeben, und die Reaktion wurde bei 4ºC für 18 h durchgeführt.
Die so erhaltene rekombinante Plasmid-DNA wurde verwendet, um E. coli KM430 mittels der Methode von Cohen et al. zu transformieren, und eine Apr-Kolonie wurde erhalten. Die Plasmid-DNA wurde aus diesem Transformanden mittels einer bekannten Methode isoliert und gereinigt, und die Struktur des Plasmides wurde durch Spaltung der Plasmid-DNA mit Restriktions-Enzymen wie StuI analysiert. Als Resultat wurde bestätigt, daß das gewünschte Plasmid erhalten worden war. Dieses rekombinante Plasmid wird pLA1 genannt.

(3) Konstruktion des LT-Expressions-Plasmides pLSA1

Ein pLA1 enthaltender E. coli KM430-Transformand (3,1 Kb), erhalten wie in dem vorhergehenden Kapitel beschrieben, wurde kultiviert, und die pLA1-DNA wurde auf die gewöhnliche Weise aus den kultivierten Zellen präpariert. In 30 ul Y-100-Puffer wurden 3 ug der erhaltenen pLA1-DNA gelöst. Jeweils 3 Einheiten von StuI und BglII wurden zugegeben, und die Spaltungsreaktion wurde bei 37ºC für 3 h durchgeführt. Aus dem Reaktionsgemisch wurden mittels der LGT-Methode ca. 0,5 ug eines ca. 790 Bp. großen DNA-Fragmentes (StuI-BglII-Fragment), enthaltend den größten Teil des humanen LT-Gens, erhalten.
Getrennt davon wurden 3 ug pKYP10, präpariert mittels der im US-Patent 4 686 191 beschriebenen Methode, in 30 ul Y-100- Puffer gelöst. Jeweils 6 Einheiten der Restriktions-Enzyme BanIII und PstI wurden zugegeben, und die Spaltungsreaktion wurde bei 37ºC für 3 h durchgeführt. Aus dem Reaktionsgemisch wurde mittels der LGT-Methode ein Tryptophan-Promotor (Ptrp)enthaltendes DNA-Fragment mit ca. 1,1 Kb (BanIII-PstI-Fragment) erhalten. Weiterhin wurden 2 ul pGEL1 (3,4 Kb) in 20 ul Y-100- Puffer gelöst. Jeweils 4 Einheiten der Restriktions-Enzyme HindIII, BamHI und PstI wurden zugegeben, und die Spaltungsreaktion wurde bei 37ºC für 3 h durchgeführt. Aus dem Reaktionsgemisch wurden mittels der LGT-Methode ca. 0,7 ug eines Lipoprotein-hergeleiteten Terminator-enthaltenden DNA- Fragmentes mit ca. 1,7 Kb (PstI-BamHI-Fragment) erhalten.
Getrennt davon wurde, aus Gründen der Notwendigkeit, die Sequenz, ausgehend vom N-Terminus des reifen humanen LT- Polypeptides, nämlich Leu (CTA), bis zur zweiten Base (GG) der 5. Aminosäure Gly (GGC), ebenso wie das zur Expression erforderliche Initiations-Kodon (ATG), zu liefern, und der Notwendigkeit, die Entfernung zwischen der SD-Sequenz stromabwärts des Ptrp und dem ATG auf eine geeignete Länge von 6 bis 18 Bp. einstellen, der folgende DNA-Linker synthetisiert:
Zunächst wurden die 27-mer und 25-mer einzelsträngigen DNAs mittels der gewöhnlichen Phosphotriester-Methode synthetisiert. Das 27-mer und das 25-mer (jeweils 20 Picomol) wurden in insgesamt 40 ul T4-Kinase-Puffer gelöst. 6 Einheiten T4- Polynukleotid-Kinase (Takara Shuzo) wurden zugegeben, und die Phosphorylierungs-Reaktion wurde bei 37ºC für 60 Minuten durchgeführt.
Sodann wurden 0,3 ug des pLA1-hergeleiteten StuI-BglII- Fragmentes (ca. 790 Bp.), 0,4 ug des BanIII-PstI-Fragmentes (ca. 1,1 Kb) des Expressions-Vektors pKVP20 und 0,6 ug des pGEL1-hergeleiteten PstI-BamHI-Fragmentes (ca. 1,7 Kb), jeweils wie oben beschrieben erhalten, in 25 ul T4-Ligase-Puffer gelöst, und ca. 1 Picomol des obigen DNA-Linkers wurde zu diesem Lösungsgemisch gegeben. Nach weiterer Zugabe von 6 Einheiten T4-DNA-Ligase zu diesem Gemisch, wurde die Ligations-Reaktion bei 4ºC für 18 h durchgeführt.
Das die rekombinanten Plasmide enthaltende Reaktionsgemisch wurde verwendet; um E. coli KM430 zu transformieren, und eine Apr-Kolonie wurde erhalten. Die Plasmid-DNA wurde aus kultivierten Zellen dieser Kolonie gewonnen. Die Struktur des erhaltenen Plasmides wurde durch Spaltung mit den Restriktions- Enzymen EcoRI, BanIII, PstI, HindIII und BglII, gefolgt von Agarose-Gelelektrophorese, bestätigt. Dieses Plasmid wird als pLSA1 bezeichnet. Die Basensequenz des pLSA1 nahe BanIII und HindIII wurde mittels der Maxam-Gilbert-Methode (A.M. Maxam et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 560 (1977)) wie folgt bestätigt:

VERGLEICHSBEISPIEL 4

Konstruktion des ATG-Vektors pTrS20

Dem in Fig. 13 dargestellten Verfahren folgend wurde der ATG- Vektor pTrS20, in dem der Abstand zwischen der SD-Sequenz und dem Initiations-Codon ATG 14 Basen beträgt, und der eine SacI- Stelle direkt hinter dem ATG-Kodon besitzt, konstruiert.
Zunächst wurden 3 ug des pKYP10, hergestellt mittels der im US- Patent 4 686 191 dargestellten Methode, in 30 ul Y-100-Puffer gelöst. Jeweils 6 Einheiten der Restriktions-Enzyme BanIII und NruI (New England Bio-Labs) wurden zugegeben, und die Spaltungsreaktion wurde bei 37ºC für 3 h durchgeführt. Aus dem Reaktionsgemisch wurden mittels der LGT-Methode ca. 0,5 ug eines Ptrp-enthaltenden DNA-Fragmentes mit ca. 3,0 Kb (BanIII- NruI-Fragment) erhalten.
Getrennt davon wurde der folgende DNA-Linker mittels der Phosphotriester-Methode synthetisiert, um das Initiations- Kondon ATG stromabwärts des Ptrp zu liefern:
Die 19-mer und 17-mer synthetischen DNAs (jeweils 10 Picomol) wurden in insgesamt 20 ul einer Lösung, enthaltend 50 mM Tris- HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM Dithiothreit, 0,1 mM EDTA und 1 mM ATP gelöst. 3 Einheiten der T4-Polynukleotid-Kinase (Takara Shuzo) wurden zugegeben, und die Phosphorylierungs-Reaktion wurde bei 37ºC für 60 Minuten bewirkt.
Sodann wurden 0,1 ug des pKYP10-hergeleiteten BanIII-NruI- Fragmentes (ca. 3,8 Kb), erhalten wie oben beschrieben, und ca. 0,5 Picomol des obigen DNA-Linkers in 20 ul T4-Ligase-Puffer gelöst. 2 Einheiten T4-DNA-Ligase wurden weiterhin zugegeben, und die Ligations-Reaktion wurde bei 4ºC für 18 h durchgeführt.
Das erhaltene rekombinante Plasmid-Gemisch wurde verwendet, um E. coli HB101 (Boliver et al.: Gene, 2, 75 (1977)) zu transformieren und eine Apr-Kolonie wurde erhalten. Aus kultivierten Zellen dieser Kolonie wurde die Plasmid-DNA gewonnen. Die Struktur des erhaltenen Plasmides wurde mittels Spaltung mit den Restriktions-Enzymen EcoRI, BanIII, HindIII, SacI und NruI, gefolgt von Agarose-Gelelektrophorese, bestätigt. Dieses Plasmid wurde als pTrS20 (Fig. 13) bezeichnet. Die Basensequenz von pTrS20 in der Nachbarschaft der BanIII und HindIII-Stellen wurde mittels der Didesoxy- Sequenzierungs-Methode unter Verwendung des M13-Phagen wie folgt bestätigt:

Claims

1. Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die von der Aminosäuresequenz des humanen Granulozyten-Colony-Stimulating- Factor (hG-CSF) Polypeptids durch Aminosäuresubstitution abgeleitet ist, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eine Aminosäure aus der 1. bis 6. Aminosäure des N-terminalen Endes und gegebenenfalls die 17. Aminosäure davon von der Aminosäure in der entsprechenden Position des hG-CSF-Polypeptids differiert, mit der Maßgabe, daß mehr als eine Aminosäure von hG-CSF substituiert ist, falls die Aminosäure Thr&spplus;¹ von hG-CSF ersetzt ist durch Ala, Gly oder Pro.

2. DNA, codierend für ein Polypeptid gemäß Anspruch 1.

3. Rekombinantes Plasmid, umfassend eine Plasmid-DNA und als Insert darin ein DNA-Fragment, das für ein Polypeptid gemäß Anspruch 1 codiert.

4. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 3, worin die Plasmid-DNA eine Tryptophan-Promotor enthaltende Plasmid-DNA ist, die das DNA-Fragment als Insert in der Plasmid-DNA stromabwärts vom Tryptophan-Promotor enthält.

5. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 3 oder 4, ausgewählt unter pCfTL38, pCfTL41, pCfTL35 und pCfTAArg4, umfassend ein Insert, welches für ein hG-CSF-Polypeptid codiert, das wie folgt modifiziert ist: Plasmid Position der Aminosäure-Substitution (substituierte Aminosäure von hG-CSF) *) keine Substitution

6. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 3 oder 4, ausgewählt unter pCfTM14, pCfTM17, pCfTM113 und pCfTAArg4S, umfassend ein Insert, welches für ein hG-CSF-Polypeptid codiert, das wie folgt modifiziert ist: Plasmid Position der Aminosäure-Substitution (substituierte Aminosäure von hG-CSF) *) keine Substitution

7. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 3 oder 4, ausgewählt unter pCfBC42B1, pCfBC45, pCfBC52, pCfBC59, pCfBC76, pCfBC77, pCfBC93, pCfBC95, pCfBC97, pCfBD28, pCfBD56, pCfBD82, pCfBB101, pCfBD28A17 und pCfBD28T17, umfassend ein Insert, welches für ein hG-CSF-Polypeptid codiert, das wie folgt modifiziert ist: Plasmit Position der Aminosäure-Substitution (Aminosäure von hG-CSF) *) keine Substitution

8. Mikroorganismus, enthaltend ein rekombinantes Plasmid gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7.

9. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids gemäß Anspruch 1, wobei man (a) in einem Medium einen Mikroorganismus kultiviert, der ein für das Polypeptid codierendes rekombinantes Plasmid enthält, wobei man die Bildung und Akkumulierung des Polypeptids in der Kultur bewirkt, und (b) man das Polypeptid aus der Kultur isoliert.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin der Mikroorganismus der Species Escherichia coli zuzuordnen ist.

11. Verfahren nach Anspruch 9, worin das rekombinante Plasmid ausgewählt ist unter den Plasmiden gemäß den Ansprüchen 5 bis 7.

12. Polypeptid, abgeleitet vom hG-CSF-Polypeptid durch Deletion, worin ein Peptid, umfassend die 1. bis 4., 1 bis 5., 1 bis 6., 1. bis 7. oder 1. bis 11. Aminosäure des N-terminalen Endes des hG-CSF-Polypeptids fehlt, und worin gegebenenfalls zusätzlich zur Aminosäure-Deletion die 17. Aminosäure, Cystein (Cys&spplus;¹&sup7;), des hG-CSF-Polypeptids durch Serin (Ser) ersetzt ist, mit der Maßgabe, daß die 1. bis 4. Aminosäure von hG-CSF nur dann deletiert ist, wenn Cys&spplus;¹&sup7; von hG-SCF durch Ser ersetzt ist.

13. DNA, codierend für ein Polypeptid gemäß Anspruch 12.

14. Rekombinantes Plasmid, umfassend eine Plasmid-DNA und darin insertiert ein DNA-Fragment, codierend für ein Polypeptid gemäß Anspruch 12.

15. Rekombinantes Plasmid gemäß Anspruch 14, umfassend eine Plasmid-DNA und darin insertiert ein DNA-Fragment, welches für ein Polypeptid codiert, das vom hG-CSF-Polypeptid abgeleitet ist durch Deletion eines Peptids, umfassend die 1. bis 11. Aminosäure am N-terminalen Ende davon.

16. Rekombinantes Plasmid gemäß Anspruch 14 oder 15, worin eine Tryptophan-Promotor-enthaltende Plasmid-DNA als Plasmid-DNA verwendet wird, wobei das DNA-Fragment in der Plasmid-DNA stromabwärts vom Tryptophan-Promotor insertiert ist.

17. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 16, ausgewählt unter pCfTNS7, pCfTNS301, pCfTNS401 und pCfTNS501, umfassend ein Insert, welches für ein hG-CSF-Polypeptid codiert, das wie folgt modifiziert ist: Plasmid Art der Sequenzmodifikation Deletion¹) Substitution ¹) Position der deletierten Aminosäuren von hG-CSF ²) substituierte Aminosäure von hG-CSF

18. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids gemäß Anspruch 12, wobei man in einem Medium einen Mikroorganismus kultiviert, der ein rekombinantes Plasmid enthält, das eine Plasmid-DNA umfaßt und darin insertiert ein DNA-Fragment, das für das Polypeptid codiert, wobei die Bildung und Akkumulierung des Polypeptids in der Kultur bewirkt wird und man das Polypeptid aus der Kultur isoliert.

19. Verfahren nach Anspruch 18 zur Herstellung eines Polypeptids mit einer Aminosäuresequenz, abgeleitet von der Aminosäuresequenz des hG-CSF-Polypeptids durch Substitution der 17. Aminosäure (Cystein) durch Serin und Deletion von 4-7 Aminosäuren am N-terminalen Ende davon, wobei man ein Polypeptid, abgeleitet vom hG-CSF-Polypeptid durch Substitution der 17. Aminosäure (Cystein) durch Serin und von wenigstens einer Aminosäure der 1. bis 6. Aminosäure des N-terminalen Endes davon durch eine davon verschiedene Aminosäure, der Wirkung einer Protease in einem wäßrigen Medium aussetzt, wodurch man die Bildung des neuen Polypeptids im Reaktionsgemisch bewirkt, und man das neue Polypeptid aus dem Reaktionsgemisch abtrennt.

20. Verfahren nach Anspruch 19, worin die Protease ausgewählt ist unter Subtilisin A, Subtilisin BPN', Subtilisin Carlsberg, Subtilisin Novo, Proteinase K, Nagase, Thermolysin, Endoproteinase Arg-C, Trypsin und α-Chymotrypsin.

21. Pharmazeutisches Mittel, umfassend eine wirksame Menge wenigstens eines Polypeptids gemäß Anspruch 1 oder 12, gegebenenfalls in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Adjuvans.

22. Verwendung eines Polypeptids gemäß Anspruch 1 oder 12 zur Herstellung eines pharmazeutischen Mittels zur Behandlung infektiöser Erkrankungen, zur Behandlung von Leukämie und zur Erhöhung der Neutrophilen-Zahl.