DE3587875T2

DE3587875T2 - Rekombinantverfahren zur herstellung von serinproteaseinhibitoren, sowie dns-sequenzen dazu.

Info

Publication number: DE3587875T2
Application number: DE3587875T
Authority: DE
Inventors: Pradip Bandyopadhyay; Stephen Eisenberg; Gary Stetler; Robert Thompson
Original assignee: Synergen Biologicals Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1984-12-06
Filing date: 1985-12-04
Publication date: 1994-10-13
Anticipated expiration: 2005-12-05
Also published as: NO863182L; HU204563B; IL77227A; JPH06315384A; PT81624B; ATE108205T1; DE3587875T3; HUT41442A; JP2683500B2; EP0205475A4; IL95223A; MX9203519A; IE853083L; EP0205475A1; PT81624A; IE64175B1; AU590238B2; NO863182D0; DD253642A5; NO301122B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Endogene proteolytische Enzyme dienen zur Degradation bzw. Zerstörung von eindringenden Organismen, von Antigen-Antikörper-Komplexen und von gewissen Gewebeproteinen, die für den Organismus nicht länger notwendig oder nützlich sind. In einem normal funktionierenden Organismus werden proteolytische Enzyme in beschränktem Ausmaß produziert und zum Teil durch die Synthese von Protease- Inhibitoren reguliert.
Eine große Anzahl von natürlich vorkommenden Protease-Inhibitoren dient dazu, die endogenen Proteasen durch die räumliche und zeitliche Einschränkung ihrer Reaktionen zu regulieren. Zudem können Protease-Inhibitoren Proteasen, welche durch infektiöse oder parasitäre Agenzien in den Körper gelangt sind, hemmen. Die Gewebe, welche besonders anfällig für proteolytische Angriffe und Infektionen sind, wie zum Beispiel diejenigen der Atemwege, besitzen viele Protease-Inhibitoren.
Protease-Inhibitoren machen etwa 10% der menschlichen Plasmaproteine aus. Wenigstens acht Inhibitoren wurden aus dieser Quelle isoliert und in der Literatur charakterisiert. Diese beinhalten α&sub2;-Makroglobulin (α&sub2;M), α&sub1;-Protease-Inhibitor (α&sub1;PI), α&sub1;-Antichymotrypsin (α&sub1;Achy), β&sub1;-Anticollagenase (β&sub1;AC) und Inter-α- Trypsin-Inhibitor (IαI).
Eine Störung des Protease/Protease-Inhibitor-Gleichgewichts kann zu von Proteasen verursachten Gewebezerstörungen führen, wobei Emphyseme, Arthritis, Glomerulonephritis, Periodontits, Muskeldystrophie, Tumorinvasion und verschiedene andere pathologische Befunde beinhaltet sind. In bestimmten Situationen, z. B. gravierenden pathologischen Vorgängen wie Sepsis oder akuter Leukämie vergrößert sich die Menge der vorhandenen proteolytischen Enzyme aufgrund der Enzymausschüttung der sekretorischen Zellen. Zusätzlich, oder unabhängig davon in anderen Situationen, kann eine verminderte Kapazität an regulierenden Inhibitoren im Organismus ebenfalls Veränderungen im Protease/Protease-Inhibitor-Gleichgewicht verursachen. Ein Beispiel einer derartig verringerten Kapazität an regulierenden Inhibitoren ist der α&sub1;- Pintease-Inhibitor-Mangel, der stark mit der Entwicklung von Lungenemphysemen zusammenhängt.
In Organismen in denen solche abweichenden Befunde vorliegen, können schwere Schäden für den Körper auftreten, es sei denn es können Maßnahmen zur Regulierung der proteolytischen Enzyme ergriffen werden. Deshalb wurden Protease-Inhibitoren gesucht, welche geeignet sind, einen Organismus verabreicht zu werden, um die proteolytischen Enzyme zu regulieren.
Vom pharmakologischen Standpunkt aus betrachtet ist Leukozyten-Elastase ein Beispiel für eine Serinprotease von besonderem Interesse. Die Leukozyten-Elastase degradiert bei extrazellulärer Ausschüttung das Bindegewebe und andere wertvolle Proteine. Während es für einen normal funktionierenden Organismus notwendig ist, eine gewisse Menge von Bindegewebe und anderen Proteinen abzubauen, wurde das Vorhandensein einer übermaßigen Menge von Leukozyten-Elastase mit verschiedenen pathologischen Zuständen in Verbindung gebracht, wie z. B. Emphysemen oder rheumatischer Arthritis. Um den Wirkungen der Leukozyten-Elastase, wenn in größeren Mengen als normal vorhanden, entgegenzuwirken, wurde ein Proteaseinhibitor gesucht, der gegen Leukozyten-Elastase wirksam ist. Ein solcher Protease- Inhibitor wäre besonders brauchbar, wenn er geeignet wäre, über ein rekombinantes DNA-Verfahren in einer gereinigten Form und in ausreichenden Mengen hergestellt zu werden, um pharmazeutisch nützlich zu sein.
In der Vergangenheit wurden in der Literatur mindestens zwei Leukozyten-Elastase- Inhibitoren identifiziert. Ein Protein, beschrieben in Schiessler et al., "Acid-Stable Inhibitors of Granulocyte Neutral Proteases in Human Mucous Secretions: Biochemistry and Possible Biological Function", in "Neutral Proteases of Human Polymorphonuclear Leucocytes", Havemann et al., (Hrsg.), Urban and Schwarzenberg, Inc. (1978), wurde aus menschlichem Samenplasma und Sputum isoliert und als von etwa 11 kD Größe mit einem Tyrosin als N-terminaler Aminosäure charakterisiert. Die Berichte in der Literatur über dieses Protein haben nur eine teilweise Aminosäuresequenz geliefert, jedoch zeigt sogar diese teilweise Sequenz, daß dieses Protein wesentlich von den Proteinen der vorliegenden Erfindung abweicht. Die Berichte über die Sequenz dieses Proteins in Verbindung mit den Aminosäuresequenz-Daten für Proteine der vorliegenden Erfindung weisen die Erfinder darauf hin, daß das von Schiessler et al. sequenzierte Produkt ein degradiertes Protein gewesen sein könnte, welches nicht eine einzelne Polypeptidkette war.
Ein zweites Protein, das in einem Fall aus menschlichem Plasma isoliert wurde, wurde α&sub1;-Protease-Inhibitor genannt. Die Arbeit an diesem Protein wurde in einem Übersichtsartikel von Travis und Salvesen, Annual Review of Biochemistry 52, S. 655-709 (1983) zusammengefaßt. Berichte über die Aminosäuresequenz dieses Proteins deuten darauf hin, daß es ebenfalls wesentlich von den Proteinen der vorliegenden Erfindung abweicht.
Aufgrund der wesentlichen Unterschiede in der Struktur zwischen den Proteinen aus einer einzelnen Polypeptidkette der vorliegenden Erfindung und allen Serin-protease- Inhibitoren aus einer einzelnen Polypeptidkette des Stands der Technik, sind die Serinprotease-Inhibitoren aus einer einzelnen Polypeptidkette des Stands der Technik nicht "im wesentlichen homolog" zu den Proteinen nach der vorliegenden Erfindung.
Trypsin ist vom pharmakologischen Standpunkt aus eine andere Protease von besonderem Interesse. Trypsin leitet bekannterweise den Abbau bestimmter weicher Organgewebe, wie Gewebe des Pankreas, während einer Vielzahl von akuten Befunden, wie z. B. Pankreatitis ein. Zahlreiche Bemühungen wurden, ohne merklichen Erfolg, auf die Behandlung dieser Befunde durch die Verwendung von Proteinen, von denen man erhoffte, sie würden die Aktivität von Trypsin inhibieren, gerichtet. Beispielhaft für solche Bemühungen sind Versuche in der Behandlung von Pankreatitis beim Menschen exogene Rinder-Trypsin-Inhibitoren zu verwenden. Während solche Techniken in Europa erprobt wurden, hatte sie die "U.S. Food and Drug Administration" nicht als wirkungsvoll anerkannt. Somit besteht ein Bedarf für Protease-Inhibitoren, welche bei der Neutralisation eines Überschusses an Trypsin in einer Vielzahl von akuten und chronischen Befunden wirksam sind. Wie es bei dem obenstehend erörterten Leukozyten-Elastase-Inhibitor der Fall war, wäre ein Trypsin- Inhibitor besonders brauchbar, wenn er durch rekombinante DNA-Verfahren in einer gereinigten Form und in ausreichender Menge isoliert und hergestellt werden könnte, um pharmazeutisch nutzbar zu sein.
Eine andere in Leukozyten in großer Menge vorhandene Protease ist Cathepsin G. Von Cathepsin G ist seine Fähigkeit, in vitro eine Vielzahl von wertvollen Proteinen, einschließlich der des Komplementsystems, zu degradieren, bekannt. Pankreas- Elastase ist eine andere Protease, welche eine Rolle in der Pankreatitis spielen könnte. Somit sind die Inhibitoren für diese Proteasen ebenfalls von potentiellem pharmazeutischen Wert.
Leukozyten-Elastase, Trypsin, Cathepsin G und Pankreas-Elastase sind Beispiele einer als Serinproteasen bekannten Klasse von Proteasen, welche gemeinsame Strukturelemente und Mechanismen aufweisen. Es wird angenommen, daß ihre Aktivität gegenüber verschiedenen Substraten und ihre Empfindlichkeit für verschiedene Inhibitoren aus Veränderungen in nur wenigen Aminosäureresten resultieren. Es ist möglich durch Analogie eine Klasse von Serinprotease-Inhibitoren zu erdenken, die ebenfalls gemeinsame Strukturelemente und Mechanismen aufweisen, in denen Veränderungen in relativ wenigen Aminosäuren in der Inhibition von verschiedenen Proteasen resultierten, und daß wenigstens ein Vertreter dieser Klasse jede Serinprotease der vorherigen Klasse inhibieren wird. Diese Klasse von Serinprotease- Inhibitoren wäre dann von wesentlichem Wert.
Überraschenderweise haben die Autoren der vorliegenden Erfindung eine DNA-Sequenz entdeckt, welche geeignet ist, die Synthese eines solchen Serinprotease- Inhibitors, welcher Inhibitor biologisch äquivalent zu einem aus Parotissekreten isolierten ist, zu lenken. Von dem Protease-Inhibitor der vorliegenden Erfindung, der durch die hier dargestellten rekombinanten DNA-Verfahren hergestellt wurde, wird vermutet, daß er wenigstens zwei aktive Stellen besitzt: eine Stelle, die inhibitorische Eigenschaften gegen Leukozyten-Elastase aufweist und eine zweite Stelle, die inhibitorische Aktivität gegen Trypsin besitzt.
Es wird angenommen, daß der in der vorliegenden Erfindung hergestellte rekombinante Inhibitor bemerkenswert widerstandsfähig gegen Hitze- und Säuredenaturierung und resistent gegen proteolytischen Abbau durch eine Vielzahl von proteolytischen Enzymen ist. Es wird beabsichtigt, daß mit dem Begriff "rekombinanter Inhibitor", wie in dieser Anmeldung verwendet, ein Protease-Inhibitor bezeichnet wird, der durch rekombinante DNA-Methodik und -Techniken hergestellt wurde. Darüberhinaus ist die aktive Form des rekombinanten Inhibitors der vorliegenden Erfindung unter Bedingungen, die normalerweise im Säugetierkörper extrazellulär angetroffen werden, thermodynamisch stabil. Denaturierte Formen des rekombinanten Protease-Inhibitors haben ebenfalls die Fähigkeit, Disulfidbrücken und nicht-kovalente Wechselwirkungen auszubilden, die nötig sind, um eine aktive Tertiärstruktur in der Abwesenheit eines biochemischen Stimulus bzw. Reizes anzunehmen.
Die DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung, die von hier ab im folgenden vollständiger dargestellt werden, sind geeignet, um die Synthese eines Proteins zu lenken, das stark von anderen veröffentlichten Sequenzen für Leukozyten-Elastase- Inhibitoren abweicht. Somit hat die Identifikation der DNA-Sequenz der vorliegenden Erfindung die Einführung bzw. Erfindung von rekombinanten DNA-Verfahren zur Herstellung der hier offenbarten, neuen rekombinanten Protease-Inhibitoren möglich gemacht.
Solche rekombinanten Verfahren werden die Herstellung der Inhibitoren in Mengen und in einer Reinheit erlauben, welche ausreichend sind, um wirtschaftliche pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verfügung zu stellen, die Serinprotease- Inhibitoraktivität besitzen. Darüberhinaus hat die Identifikation der DNA-Sequenz die Erfindung rekombinanter DNA-Verfahren zur Herstellung von Analoga zu dem obenstehend beschriebenen Serinprotease-Inhibitor ermöglicht.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft rekombinante DNA-Verfahren zur Herstellung von Protease- Inhibitoren im allgemeinen und, im genaueren, die Herstellung von gegen Proteasen aus menschlichen polymorphonuclearen (PMN)-Granulozyten gerichtete rekombinante Inhibitoren. Insbesondere betrifft die Erfindung rekombinante DNA-Verfahren zur Herstellung von Inhibitoren menschlicher Serinproteasen, wobei Leukozyten-Elastase und Trypsin eingeschlossen sind.
Zusätzlich betrifft die vorliegende Erfindung rekombinante DNA-Verfahren zur Herstellung von Analoga der betrachteten Serinprotease-Inhibitoren. Die vorliegende Erfindung betrifft auch in den rekombinanten DNA-Verfahren nützliche synthetische und natürliche DNA-Sequenzen, wie im folgenden dargestellt.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Synthese rekombinanter DNA eines Serinprotease-Inhibitors zur Verfügung zu stellen, welcher Inhibitor eine einzelne Polypeptidkette ist, die Serinprotease-Inhibtoraktivität aufweist. Diese Inhibitoren besitzen eine Aktivität, welche biologisch äquivalent zu der von nativen, aus menschlichen Parotissekreten isolierten Inhibitoren der Leukozyten-Elastase oder von Trypsin ausgeübten Aktivität ist.
Um alternative Synthesen der rekombinanten DNA für diese Serinprotease-Inhibitoren zu erleichtern, ist es ein weiteres Ziel dieser Erfindung, synthetische DNA-Sequenzen zur Verfügung zu stellen, die geeignet sind, die Produktion dieser rekombinanten Protease-Inhibitoren so gut wie äquivalente natürliche DNA-Sequenzen zu steuern. Solche natürlichen DNA-Sequenzen können aus einer cDNA oder einer genomischen Bank isoliert werden, aus denen das zur Steuerung der Synthese des Proteaseinhibitors geeignete Gen identifiziert und isoliert werden kann.
Darüberhinaus ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, rekombinante DNA- Verfahren zur Herstellung von den obenstehend diskutierten Analoga der Protease- Inhibitoren und entsprechender in solchen Verfahren hilfreichen analogen DNA- Sequenzen zur Verfügung zu stellen.
Zusätzliche Ziele und Vorteile der Erfindung werden zum Teil in der Beschreibung, die folgt, dargestellt, und zum Teil aus der Beschreibung offensichtlich oder können durch die Ausführung der Erfindung erfahren werden. Die Ziele und Vorteile können auf dem Wege der in den beigefügten Patentansprüchen besonders hervorgehobenen Mittel und Kombinationen ausgeführt und erreicht werden.
Um diese Ziele zu erreichen und in Übereinstimmung mit der Absicht der vorliegenden Erfindung, wurde eine DNA-Sequenz entdeckt, die geeignet ist, die Herstellung von Protease-Inhibitoren, die in ihren aktiven Formen einzelne Polypeptidketten sind, die Serinprotease-Inhibitor-Aktivität aufweisen, durch rekombinante DNA-Methodiken zu steuern. Diese rekombinanten Protease-Inhibitoren sind bemerkenswert widerstandsfähig gegen Hitze- und Säuredenaturierung. Außerdem behalten diese Protease-Inhibitoren ihre biologische Aktivität selbst nach dem Ausgesetzt sein mit vielen proteolytischen Enzymen, wie Chymotrypsin, Mäuse- Submaxillare Protease und Clostripain.
Der codierende Strang einer DNA-Sequenz, bei welcher entdeckt wurde, daß sie die Herstellung dieser rekombinanten Serinprotease-Inhibitoren steuert, ist:
Die durch die vorstehenden Abkürzungen bezeichneten Nucleotide werden in der detaillierten Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen dargelegt.
Der codierende Strang für eine zweite bevorzugte DNA-Sequenz, bei der entdeckt wurde, daß sie die Herstellung dieser rekombinanten Serinprotease-Inhibitoren, insbesondere einem Inhibitor der sekretorischen Leukozyten-Protease (SLPI) nach der vorliegenden Erfindung, ist:
Um darüberhinaus die Ziele zu erreichen und in Übereinstimmung mit der Absicht/den Zwecken der vorliegenden Erfindung, wird eine rekombinante DNA-Methode offenbart, die in der mikrobiellen Herstellung der betreffenden Serinprotease-Inhibtoren resultiert, wobei entweder die natürlichen oder synthetischen DNA-Sequenzen, auf die obenstehend Bezug genommen wird, verwendet werden. Dieses rekombinante DNA-Verfahren umfaßt:
(a) Herstellung einer DNA-Sequenz, welche fähig ist, einen Wirtsmikroorganismus zu lenken, um ein Protein zu produzieren, das Serinprotease-Inhibitoraktivität besitzt, bevorzugterweise Leukozyten-Elastase-Inhibitoraktivität;
(b) Klonieren der DNA-Sequenz in einen Vektor, welcher fähig ist, in einen Wirtsmikroorganismus transferiert zu werden und in diesem repliziert zu werden, wobei ein solcher Vektor funktionelle Elemente für die DNA-Sequenz enthält;
(c) Transferieren des Vektors, welcher die DNA-Sequenz und die funktionellen Elemente enthält, in einen Wirtsmikroorganismus, welcher fähig ist, das Proteaseinhibierende Protein zu exprimieren.
(d) Kultivieren des Mikroorganismus unter Bedingungen, die für die Amplifizierung des Vektors und die Expression des Inhibitors geeignet sind;
(e) Gewinnen des Inhibitors; und
(f) einen Schritt, worin der Inhibitor eine aktive Tertiärstruktur einnehmen kann, wodurch er Serinprotease-Inhibitoraktivität erhält.
Um die Identifikation und Isolierung von natürlichen DNA-Sequenzen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung zu erleichtern, haben die Erfinder der vorliegenden Anmeldung eine cDNA-Bank aus menschlichem Parotis-Gewebe entwickelt. Diese Bank enthält die genetische Information, welche fähig ist, eine Zelle zu lenken, so daß sie die Serinprotease-Inhibitoren der vorliegenden Erfindung synthetisiert. Andere natürliche DNA-Sequenzen, welche in den hier dargestellten rekombinanten DNA-Methoden verwendet werden können, können aus einer humanen genomischen Bank isoliert werden.
Die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendbaren synthetischen DNA- Sequenzen können durch Polynucleotid-Synthese und Sequenzierungstechniken hergestellt werden, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind. Die in den vorstehenden Verfahren verwendbaren natürlichen DNA-Sequenzen können identifiziert und isoliert werden in einem Verfahren, umfassend:
(a) Herstellen einer humanen cDNA-Bank aus Zellen, bevorzugt Parotis-Zellen, welche fähig sind, einen Serinprotease-Inhibitor hervorzubringen.
(b) Durchsuchen der humanen cDNA-Bank mit mindestens einer Nucleinsäure-Sonde, welche fähig ist, an das Protease-Inhibitor-Gen oder dessen Proteinprodukt zu binden.
(c) Identifizieren mindestens eines Klons, welcher das Gen enthält, das für den Inhibitor codiert, und zwar auf Grund der Fähigkeit des Klons mindestens eine Sonde für das Gen oder sein Proteinprodukt zu binden.
(d) Isolieren des Gens, das für den Inhibitor codiert, aus dem (den) identifizierten Klon(en); und
(e) Verbinden des Gens, oder geeigneten Fragmenten davon, mit funktionellen Elementen, die nötig sind, um das Gen in einem Wirtsmikroorganismus zu halten und zu exprimieren.
Die in den vorstehenden Verfahren verwendbaren natürlichen DNA-Sequenzen können auch durch ein Verfahren identifiziert und isoliert werden, welches umfaßt
(a) Herstellen einer humanen genomischen DNA-Bank, bevorzugt in einem recArecBC E.coli-Wirt herangezogen;
(b) Durchsuchen der humanen genomischen DNA-Bank mit mindestens einer Sonde, welche fähig ist an ein Serinprotease-Inhibitor-Gen oder dessen Proteinprodukt zu binden.
(c) Identifizieren mindestens eines Klons, welcher das Gen enthält, das für den Inhibitor codiert, auf Grund der Fähigkeit des Klons mindestens eine Sonde für das Gen oder sein Proteinprodukt zu binden.
(d) Isolieren des Gens, das für den Inhibitor codiert, aus dem oder den identifizierten Klon oder Klonen; und
(e) Verbinden des Gens, oder geeigneten Fragmenten davon, mit funktionellen Elementen, die nötig sind, um das Gen in einem Wirtsmikroorganismus zu halten und zu exprimieren.
Ferner könnten, um die Ziele zu erreichen und in Übereinstimmung mit den Absichten der vorliegenden Erfindung, pharmazeutisch anwendbare Analoga des Serinprotease-Inhibitors durch die obenstehend aufgeführte rekombinante DNA-Methode hergestellt werden, wobei die synthetische DNA-Sequenz oder das natürliche DNA-Fragment durch rekombinante DNA-Techniken verändert wird, um ein Gen zu erzeugen, das fähig ist, die Expression des gewünschten Analogons zu induzieren, wenn es in einen passenden Vektor kloniert worden ist und in einen geeigneten Wirtsmikroorganismus transferiert worden ist.
Um diese Ziele zu erreichen und in Übereinstimmung mit den Absichten der vorliegenden Erfindung werden außerdem pharmazeutische Zusammensetzungen, welche als aktiven Bestandteil einen rekombinanten Protease-Inhibitor in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung oder dessen biologisch aktives Analoges, hergestellt mittels den oben beschriebenen rekombinanten DNA-Methoden, enthalten, offenbart.
Die begleitenden Zeichnungen, die hier mit eingebunden sind und einen Teil dieser Anmeldung darstellen, illustrieren verschiedene Plasmide, die in dieser Erfindung verwendbar sind, und dienen, zusammen mit der Beschreibung dazu, die Prinzipien der Erfindung zu erklären.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist eine Karte von Plasmid pSGE6.
Fig. 2 ist eine Karte von Plasmid pSGE8.
Fig. 3 ist eine Karte von Plasmid pG5285.
Fig. 4 ist eine Karte von Plasmid pG5485.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Es wird nun das Augenmerk im Detail auf die vorliegenden bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung gerichtet, welche, zusammen mit dem nachfolgenden Beispiel, dazu dienen, die Prinzipien der Erfindung zu erklären.
Wie obenstehend bemerkt wurde, betrifft die vorliegende Erfindung Protease- Inhibitoren, welche in einer gereinigten Form isoliert wurden. Bevorzugterweise sind die Serinprotease-Inhibitoren der vorliegenden Erfindung Proteine aus einer einzelnen Polypeptidkette, welche im wesentlich homolog und vor allem bevorzugterweise biologisch äquivalent zu nativen, aus humanen Parotissekreten isolierten Serinprotease-Inhibitoren sind. Unter "biologisch äquivalent", wie durchgehend in der Beschreibung und den Patentansprüchen verwendet, ist zu verstehen, daß die Zusammensetzungen fähig sind, von Proteasen hervorgerufene Gewebeschäden von der selben Art, aber nicht notwendigerweise im selben Ausmaß, wie der native Protease-Inhibitor zu verhindern. Unter "im wesentlichen homolog", wie durchgehend in der folgenden Beschreibung und den Patentansprüchen verwendet, ist ein Grad an Homologie zu den nativen Parotis-Inhibitor zu verstehen, welcher denjenigen, der von den früher beschriebenen Serinprotease-Inhibitorproteinen aus einer einzelnen Polypeptidkette aufgewiesen wird, überschreitet. Vorzugsweise überschreitet der Grad an Homologie 40%, am meisten bevorzugt überschreitet er 50%, mit einer besonders bevorzugten Gruppe von Proteinen, welche zu über 60% mit dem nativen Parotis- Inhibitor homolog sind. Der Prozentsatz der Homologie, wie oben beschrieben, wird als Prozentsatz von den in der kleineren der beiden Sequenzen gefunden Komponenten, die auch in der größeren der beiden Sequenzen gefunden werden können, berechnet, wobei eine Komponente als eine Sequenz von vier zusammenhängenden Aminosäuren verstanden wird.
Bevorzugte Protease-Inhibitoren, welche durch die vorliegenden rekombinanten Verfahren hergestellt wurden, sind in der U.S.-Patentanmeldung Seriennummer 678 823 von Robert C. Thompson et al. unter dem Titel "Serin Protease Inhibitors and Methods for Isolation of Same", eingereicht am 6. Dezember 1984 und der U.S.-Patentanmeldung Seriennummer 06/803 423 von Robert C. Thompson et al. unter dem Titel "Serin Protease Inhibitors and Methods for Isolation of Same", hiermit eingereicht zum selben Datum, welche als U.S.-Patent Nr. 4 760 130 am 26. Juli 1988 erteilt wurde, beschrieben. Solche Protease-Inhibitoren sind bemerkenswert widerstandsfähig gegen Hitze- und Säuredenaturierung und resistent gegen Aktivitätsverlust, wenn sie vielerlei proteolytischen Enzymen ausgesetzt werden, wobei Chymotryosin, Mäuse-Submaxillar-Protease und Clostripain eingeschlossen sind. Diese Inhibitoren besitzen ebenfalls die Fähigkeit, die nötigen Disulfidbrücken auszubilden und geeignete nicht-kovalente Wechselwirkungen einzugehen, um eine aktive Tertiärstruktur anzunehmen, welche fähig ist, Serinprotease-Inhibitoraktivität in Abwesenheit eines biologischen Stimulus hervorzubringen, oder, wenn die Disulfidbrücken zerstört und die nicht-kovalenten Wechselwirkungen unterbrochen worden sind, solche Brücken und Wechselwirkungen wieder auszubilden, um eine solche aktive Tertiärstruktur in Abwesenheit eines biologischen Stimulus wiederzugewinnen.
Ein bevorzugter Serinprotease-Inhibitor welcher diese Charakteristika aufweist wurde sequenziert. Die Sequenz wurde als die folgende bestimmt:
Die vorstehenden Abkürzungen entsprechen den Aminosäuren in dem Polypeptid wie folgt:
Aminosäure Abkürzung
Alanin Ala
Valin Val
Leucin Leu
Isoleucin Ile
Prolin Pro
Phenylalanin Phe
Tryptophan Trp
Methionin Met
Glycin Gly
Serin Ser
Threonin Thr
Cystein Cys
Tyrosin Tyr
Asparagin Asn
Glutamin Gin
Asparaginsäure Asp
Glutaminsäure Glu
Lysin Lys
Arginin Arg
Histidin His
Es wurde herausgefunden, daß die Protease-Inhibitoren, welche durch die hier offenbarten rekombinanten DNA-Verfahren hergestellt wurden, mehr als eine abgegrenzte bzw. distinkte Domäne besitzen. Mit mehr als einer distinkten Domäne ist gemeint, daß das Protein mehrere aktive Stellen besitzt, welche gegen verschiedene Enzyme wirksam sind. Das Vorhandensein und die Lage dieser Stellen wurden durch die Entdeckung einer wesentlichen Homologie zwischen mindestens zwei Bereichen des Protease-Inhibitors bestimmt. Es wird angenommen, daß das Vorhandensein verschiedener Domänen den vorliegenden Protease-Inhibitoren die Fähigkeit, eine weite Auswahl von Serinproteasen, die sowohl Leukozyten-Elastase als auch Trypsin beinhaltet, zu inhibieren, vermittelt.
Weiterhin wurde bemerkt, daß aufgrund der Vielzahl von Domänen dieser Protease- Inhibitoren, die Protease-Inhibitoren als Stützgerüst bzw. Rahmen, auf dem verschiedene andere aktive Stellen aufgebaut werden könnten, dienen können, um Protease-Inhibitoren zu erzeugen, welche zusätzliche Eigenschaften besitzen. Die bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beinhaltet die Herstellung eines Protease-Inhibitors, welcher Leukozyten-Elastase, Cathepsin G, Pankreas-Elastase und Trypsin inhibiert. Diese Enzyme sind alle Vertreter der als Serinproteasen bekannten Klasse von Proteasen, welche gemeinsame Mechanismen und viele strukturelle Merkmale gemeinsam haben. Es wird angenommen, daß durch die Manipulation bzw. Abänderung weniger Aminosäure-Seitenketten auf den durch die vorliegende Erfindung hergestellten Protease-Inhibitoren eine Vielzahl von Inhibitoren erzeugt werden kann, wobei jeder fähig ist, wenigstens einen Vertreter aus der gesamten Klasse der Serinproteasen zu inhibieren. Weiterhin kann man von solchen Modifikationen der Seitenketten erwarten, eine Vielzahl von Inhibitoren zu gewinnen, welche verbesserte inhibitorische Eigenschaften im Hinblick auf einzelne Vertreter der oben beschriebenen Klasse der Serinproteasen besitzen.
Die zur Erlangung dieser Ziele erforderlichen Austausche der Aminosäure-Seitenketten werden von bestimmten zwischen dem durch die vorliegenden Erfindung hergestellten Inhibitor und anderen Serinprotease-Inhibitoren, für die der bedeutsame funktionelle Bereich durch Röntgenstrukturanalyse bestimmt worden ist, ähnlichen Strukturelementen nahegelegt. Diese Elemente struktureller Ähnlichkeit beinhalten die Aminosäuren 17-29 und 70-83 des bevorzugten Serinprotease-Inhibitors, der mittels der vorliegenden oben beschriebenen Erfindung hergestellt wird. Die vorgeschlagenen Veränderungen zur Verbesserung der Inhibitorenaktivität, entweder im Hinblick auf Quantität oder Qualität, gegen Trypsin-ähnliche Serinproteasen beinhalten das Verändern von einer oder mehreren der Aminosäure 20 von Arg nach Lys, Aminosäure 72 oder 74 von Leu nach Lys oder Arg und Aminosäure 73 von Met nach Lys oder Arg.
Die im Hinblick auf Quantität oder Qualität zur Verbesserung der Inhibitorenaktivität gegen Chymotrypsin-ähnliche Serinproteasen, wobei Cathepsin G eingeschlossen ist, vorgeschlagenen Veränderungen beinhalten das Austauschen von einer oder mehrerer der Aminosäuren 20 von Arg nach Phe, Tyr oder Trp, Aminosäure 72 oder 74 von Leu nach Phe, Tyr oder Trp, und der Aminosäure 73 von Met nach Phe, Tyr oder Trp.
Die vorgeschlagenen Veränderungen zur Verbesserung der Inhibitorenaktivität, im Hinblick auf Quantität oder Qualität, gegen Pankreas-Elastase-ähnliche Serinproteasen beinhalten das Austauschen von einer oder mehrerer der Aminosäure 20 von Arg nach Ala, Aminosäure 72 oder 74 von Leu nach Ala und der Aminosäure 73 von Met nach Ala.
Es muß bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung berücksichtigt werden, daß die Veränderung von Aminosäuresequenzen um den vorliegenden Proteinen neue protease-inhibierende Eigenschaften zu verleihen, die Inhibitorenaktivität gegen Leukozyten-Elastase und Trypsin zerstören kann. Solche Effekte können durch Routine-Experimente gemäß den Erkenntnissen der vorliegenden Erfindung bestimmt werden.
Weiterhin wurde beabsichtigt, daß der Austausch diskreter Aminosäuren oder diskreter Aminosäuresequenzen, wie obenstehend dargelegt, entweder die inhibitorischen Eigenschaften der vorliegenden Protease-Inhibitoren gegen Leukozyten- Elastase oder die inhibitorischen Eigenschaften gegen Trypsin verbessern könnte, während einige Aktivität der unverbesserten Domäne preisgegeben würde. In der Tat könnte die Aktivität jeder Domäne innerhalb der Inhibitorproteins durch angemessene Aminosäureaustausche vollkommen zunichtegemacht werden, wobei Inhibitorproteine erzeugt werden, die spezifisch für eine oder mehrere Teilbereiche (subset) der Enzyme sind, gegen die das Protein normalerweise aktiv ist. Zum Beispiel deaktiviert der Austausch von Gly gegen Arg an Position 20 die Trypsin-inhibitorische Domäne, während ein Austausch von Gly gegen Met in Position 73 oder gegen Leu in der Position 72 oder 74 die Leukozyten-Elastase-inhibitorische Domäne deaktiviert. Die Domänen können auch auf separate Proteine aufgeteilt werden, von denen jedes die gewünschten inhibitorischen Funktionen beibehält. Die vorliegenden Patentansprüche erstrecken sich auf weitere Verfahren zur Herstellung solcher Inhibitoren mittels dieser Methoden.
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben eine synthetische DNA-Sequenz entdeckt, welche fähig ist, die intrazelluläre Herstellung der oben diskutierten Protease-Inhibitoren zu steuern. Diese Sequenz besitzt die nachfolgende Struktur:
worin die nachfolgenden Nucleotide durch die untenstehenden Abkürzungen dargestellt werden.
Nucleotid Abkürzung
Desoxyadenylsäure A
Desoxyguanylsäure G
Desoxycytidylsäure C
Thymidylsäure T
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben eine zweite bevorzugte synthetische DNA-Sequenz entdeckt, die dazu geeignet ist, die extrazelluläre Herstellung der oben diskutierten Protease-Inhibitoren zu steuern, insbesondere des Inhibitors gegen die sekretorische Leukozyten-Protease (SLPI), der obenstehend erwähnt wurde. Diese Sequenz besitzt die nachfolgende Struktur:
Aufgrund der Struktur der vorliegenden Protease-Inhibitoren aus mehreren Domänen, wie oben erwähnt, werden Variationen in der hier dargestellten synthetischen DNA- Sequenz betrachtet, die in einer DNA-Sequenz resultieren, welche dazu geeignet ist, die Herstellung von Analoga zu Serinprotease-Inhibitoren, wie oben diskutiert, zu lenken. Insbesondere besitzen die bevorzugten Analoga zu den Serinprotease- Inhibitoren, welche durch rekombinante DNA-Techniken gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, die Aminosäuresequenz:
worin R&sub1; und R&sub7; gleich oder verschieden und ausgewählt sind aus einer Gruppe, bestehend aus substituierten oder unsubstituierten Aminosäureresten oder Derivaten davon, und R&sub2;, R&sub3;, R&sub4;, R&sub5;, R&sub6;, R&sub8; und R&sub9;, gleich oder verschieden sind und ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Methionin, Valin, Alanin, Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan, Lysin, Glycin und Arginin.
Es sollte erwähnt werden, daß die oben dargestellte DNA-Sequenz eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt. Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes kann es verstanden werden, daß zahlreiche Möglichkeiten in der Nucleotidwahl zu einer DNA-Sequenz führen, welche fähig ist, die Herstellung der vorliegenden Protease-Inhibitoren oder ihren Analoga zu lenken. Innerhalb der vorliegenden Erfindung wird beabsichtigt, DNA-Sequenzen, welche funktionell äquivalent zu der oben dargestellten Sequenz sind oder welche funktionell äquivalent zu Sequenzen sind, welche die Herstellung von Analoga zu dem, gemäß der oben dargestellten Aminosäuresequenz hergestellten, Protease-Inhibitor lenken würden, als solche mit einzuschließen. Als ein Beispiel für die Codon-Austausche, welche als ein Ergebnis der Degeneration des genetischen Codes beabsichtigt sind, zeigt das folgende Diagramm zusätzliche DNA-Sequenzen, welche im Umfang der vorliegenden Erfindung, zur Herstellung der bevorzugten, oben aufgelisteten Aminosäuresequenz enthalten sein sollen. Durch Befolgen des Beispiels für die Bestimmung äquivalenter DNA- Sequenzen zur Herstellung dieses Proteins, wird der Durchschnittsfachmann in der Lage sein, auch äquivalente DNA-Sequenzen zur Herstellung von Analoga der bevorzugten Aminosäuresequenz zu bestimmen.
In der obenstehenden Sequenz sollen die verwendeten Abkürzungen für die nachfolgend aufgezeigten Nucleotide stehen.
Nucleotid Abkürzung
A, G, C, T N
A, G P
C, T Q
Bei der Auswahl von Codons zur Verwendung in den synthetischen DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung, wobei diejenigen, die unmittelbar obenstehend dargelegt sind eingeschlossen werden, wird es bevorzugt, daß die Codons, welche zur Angabe einer bestimmten Aminosäure verwendet werden, solche sein sollen, die mit hoch exprimierten Proteinen in Zusammenhang stehen. Beispiele für solche bevorzugten Codons sind teilweise in Grantharn, R. et al., "Codon Catalog Usage Is a Genome Strategy Modulated For Gene Expressivity" in Nucleic Acids Research 9:r43 (1981) dargestellt. Die bevorzugte DNA-Sequenz der vorliegenden Erfindung wurde durch Auswählen von Codonsequenzen für E.coli für jede beliebige der degenerierten Sequenzen gewählt.
Darüberhinaus ist es erwünscht, Codons zu wählen, welche die Veränderung der synthetischen DNA-Sequenz erleichtern, um zusätzliche synthetische DNA-Sequenzen zu konstruieren, welche fähig sind, die Herstellung von Analoga des vorliegenden Protease-Inhibitors zu lenken. Insbesondere wird bevorzugt, daß Nucleotidsequenzen ausgewählt werden, welche wenn möglich Restriktionsendonuclease-Schnittstellen an oder nahe bei Positionen in der synthetischen DNA-Sequenz erzeugen, in die man zusätzliche Codons einzufügen wünscht oder an welchen Stellen gewünscht wird, ein Codon so zu ersetzen, daß Analoga erzeugt werden können. In der bevorzugten Ausführungsform der DNA-Sequenz der vorliegenden Erfindung sind die Restriktions- Stellen unter der obenstehend dargestellten Nucleotidsequenz angegeben.
Verfahren zur Erzeugung der hier betrachteten synthetischen DNA-Sequenzen sind im allgemeinen innerhalb des Bereichs der von einem Durchschnittsfachmann, unter Anleitung durch die vorliegenden Offenbarung, durchgeführten Routineaufgaben. Ein Beispiel für ein geeignetes Verfahren, welches verwendet werden kann, um die hier offenbarte synthetische DNA-Sequenz zu erhalten, ist dargestellt in Matteacci, M. D: und Caruthers, M. H., J. Am. Chem. Soc. 103, S. 3185 (1981) und in Beaucage, S. L. und Caruthers, M. H., Tetrahedron Lett. 22, S. 1859 (1981), welche beide im einzelnen hier durch den Bezug darauf einbezogen sind.
In einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, wurde aus einer humanen genomischen Bank eine DNA-Sequenz isoliert, welche für einen bevorzugten sekretorischen Leukozyten-Protease-Inhibitor (SLPI) der vorliegenden Erfindung codiert. Diese Sequenz, codierend vom vierten Codon ab und unter Beinhaltung der derzeit den Erfindern bekannten Introns, lautet wie folgt:
In dieser Sequenz sind die für die Aminosäurereste verwendeten Abkürzungen die Ein-buchstaben-Abkürzungen, welche üblicherweise verwendet werden und zum Beispiel in "Biochemistry" von A. L. Lehninger, 2. Auflage, Worth Publishers Inc. New York, New York (1976) auf S. 72 gefunden werden können.
Unter Verwendung dieser Sequenz und der hier enthaltenen Aminosäuresequenzdaten kann eine synthetische DNA-Sequenz konstruiert werden, welche bei Zufügung zu der obenstehenden genomischen Sequenz zu einem Gen führt, das für den gesamten Protease-Inhibitor codiert. Alternativ können unter Verwendung der obenstehend dargestellten DNA-Sequenz Sonden konstruiert und eingesetzt werden, um ein DNA- Segment aus einer humanen genomischen Bank zu erhalten, welches Codone für die ersten drei Aminosäuren aufweist.
Außerdem können solche Sonden eingesetzt werden, um eine humane genomische Sequenz zu identifizieren, welche eine geeignete Leader-Sequenz enthält. Es wird beabsichtigt, daß diese Leader-Sequenz oder jede andere geeignete Leader-Sequenz in Verbindung mit dieser genomischen Sequenz in einem Säugetier-Expressions-System verwendet werden könnte.
In einer anderen alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde ein cDNA-Klon aus einer Parotis-Genbank isoliert, welcher eine DNA-Sequenz codiert, die fähig ist, die intrazellulare Herstellung von einem bevorzugten sekretorischen Leukozyten-Protease-Inhibitor der vorliegenden Erfindung zu lenken. Dieser Klon ist enthalten auf . . . bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, unter der Zugangs-Nr . . . . hinterlegt.
Ein rekombinantes DNA-Verfahren zur Herstellung eines aus einer einzelnen Polypeptidkette zusammengesetzten Protease-Inhibitors mit mindestens einer aktiven Stelle, welche Protease-Inhibitor-Aktivität aufweist, wurde offenbart. In einer Ausführungsform der Erfindung fungiert die aktive Stelle in einer biologisch äquivalenten Weise zu der des nativen Leukozyten-Elastase-Inhibitors, der aus humanen Parotissekreten isoliert worden ist. Eine natürliche oder synthetische DNA- Sequenz kann verwendet werden, um die Herstellung der Protease-Inhibitoren zu lenken. Dieses Verfahren umfaßt:
(a) Herstellen einer DNA-Sequenz, welche fähig ist, einen Wirtsmikroorganismus zur Herstellung eines Proteins, das Serinprotease-Inhibitoraktivität besitzt zu lenken;
(b) Klonieren der DNA-Sequenz in einen Vektor, welcher fähig ist, in einen Wirtsmikroorganismus transferiert zu werden und darin zu replizieren, wobei ein solcher Vektor funktionelle Elemente für die DNA-Sequenz enthält;
(c) Transferieren des Vektors, welcher die synthetische DNA-Sequenz und die funktionellen Elemente enthält, in einen Wirtsmikroorganismus, welcher fähig ist den Protease-Inhibitor zu exprimieren;
(d) Kultivieren des Mikroorganismus unter Bedingungen die für die Amplifizierung des Vektors und die Expression des Inhibitors geeignet sind;
(e) Gewinnen des Inhibitors; und
(f) einen Schritt, worin der Inhibitor eine aktive Tertiärstruktur einnehmen kann, wodurch er Serinprotease-Inhibitoraktivität erhält.
Synthetische DNA-Sequenzen, die für die Verwendung in diesem Verfahren in Betracht kommen, wurden obenstehend im Detail diskutiert. Es wird ferner beabsichtigt, daß in einer alternativen Ausführungsform, die natürlichen DNA- Sequenzen ebenfalls in diesem Verfahren verwendet werden können. Diese Sequenzen umfassen cDNA oder genomische DNA-Segmente. In einer bevorzugten Version dieser Ausführungsform, wird in Betracht gezogen, daß die natürliche DNA-Sequenz durch ein Verfahren erhalten wird, welches umfaßt:
(a) Herstellen einer humanen cDNA-Bank aus Zellen, vorzugsweise Parotis-Zellen, die fähig sind, einen Serinprotease-Inhibitor hervorzubringen.
(b) Durchsuchen der humanen DNA-Bank mit mindestens einer Sonde, die fähig ist, an das Protease-Inhibitorgen oder sein Proteinprodukt zu binden;
(c) Identifizieren mindestens eines Klons, welcher ein für den Inhibitor codierendes Gen enthält, auf Grund der Fähigkeit des Klons wenigstens eine Sonde für das Gen oder sein Proteinprodukt zu binden.
(d) Isolieren des Gens, das für den Inhibitor codiert, aus dem Klon oder den gewählten Klonen.
(e) Verbinden des Gens, oder geeigneten Fragmenten davon, mit funktionellen Elementen, die nötig sind, um das Gen in einem Wirtsmikroorganismus zu halten und zu exprimieren.
Die in dem voranstehenden Verfahren verwendbaren natürlichen DNA-Sequenzen können ebenfalls identifiziert und isoliert werden durch ein Verfahren, das beinhaltet:
(a) Herstellen einer humanen genomischen DNA-Bank, vorzugsweise herangezogen in einem recArecBC E.coli-Wirt;
(b) Durchsuchen der humanen genomischen DNA-Bank mit mindestens einer Sonde, die fähig ist, an ein Serinprotease-Inhibitorgen oder sein Proteinprodukt zu binden,
(c) Identifizieren mindestens eines Klons, welcher das für den Inhibitor codierende Gen enthält, auf Grund der Fähigkeit des Klons mindestens eine Sonde für das Gen oder sein Proteinprodukt zu binden;
(d) Isolieren des Gens, welches für den Inhibitor codiert, aus dem (den) identifizierten Klon(en); und
(e) Verbinden des Gens oder eines geeigneten Fragments davon mit funktionellen Elementen, die nötig sind, um das Gen in einem Wirtsmikroorganismus zu halten und zu exprimieren.
Bei der Isolierung einer natürlichen DNA-Sequenz, die geeignet zur Verwendung in dem obenstehenden Verfahren ist, wird bevorzugt, die zwei innerhalb oder am nächsten zu den Endabschnitten des entsprechenden Gens oder Sektionen des Gens gelegenen Restriktionsstellen zu identifizieren. Das DNA-Segment, welches das geeignete Gen enthält, wird dann vom Rest des genomischen Materials unter Verwendung von Restriktionsendonucleasen entfernt. Nach der Excission werden das 3'- und das 5'-Ende der DNA-Sequenz wiederaufgebaut um geeignete DNA-Sequenzen zu erhalten, welche fähig sind, für den N- und den C-Terminus des Serinprotease-Inhibitorproteins zu codieren und welche fähig sind, die DNA-Sequenz an ihre funktionellen Elemente zu fusionieren.
Die Vektoren die für den Einsatz in der vorliegenden Erfindung in Betracht kommen, umfassen jeden Vektor, in den eine DNA-Sequenz wie obenstehend diskutiert, zusammen mit beliebigen bevorzugten oder benötigten funktionellen Elementen, eingefügt werden kann, und welcher Vektor dann anschließend in einen Wirtsmikroorganismus transferiert und in solch einem Mikroorganismus repliziert werden kann. Bevorzugte Vektoren sind solche, deren Restriktionsstellen gut dokumentiert worden sind und welche die zur Transkription der DNA-Sequenz bevorzugten oder benötigten funktionellen Elemente enthalten.
Die "funktionellen Elemente", wie hier diskutiert, beinhalten mindestens einen Promotor, mindestens einen Operator, mindestens eine Leader-Sequence, mindestens eine Shine-Dalgarno-Sequenz, mindestens ein Terminatorcodon und jegliche andere zur angemessenen Transkription und anschließenden Translation der Vektor-DNA benötigte oder bevorzugte DNA-Sequenzen. Insbesondere wird beabsichtigt, daß solche Vektoren mindestens einen vom Wirtsmikroorganismus erkannten Replikationsursprung zusammen mit mindestens einem selektierbaren Marker und mindestens einer Promotorsequenz enthalten, welche fähig ist, die Transkription der synthetischen DNA-Sequenz zu initiieren. Es wird außerdem bevorzugt, daß der Vektor, in einer Ausführungsform, bestimmte DNA-Sequenzen enthält, die fähig sind, als Regulatoren zu wirken, und andere DNA-Sequenzen, die fähig sind, für ein Regulatorprotein zu codieren. In einer Ausführungsform dienen diese Regulatoren dazu, die Expression der synthetischen DNA-Sequenz bei Vorhandensein bestimmter Umweltbedingungen zu verhindern und bei Vorhandensein anderer Umweltbedingungen die Transkription und anschließende Expression des von der synthetischen DNA-Sequenz codierten Proteins zu ermöglichen. Genauer gesagt, wird es bevorzugt, daß die regulatorischen Segmente so in den Vektor eingefügt werden, daß die Expression der synthetischen DNA nicht in der Abwesenheit von, zum Beispiel, Isopropylthio- -d-galactosid von statten geht. In dieser Situation können die transformierten, die synthetische DNA- Sequenz enthaltenden Mikroorganismen zu einer erwünschten Dichte herangezogen werden, bevor die Expression des Protease-Inhibitors initiiert wird. In dieser Ausführungsform wird die Expression des gewünschten Protease-Inhibitors durch die Zugabe einer Substanz, welche fähig ist, die Expression der DNA-Sequenz herbeizuführen, nachdem die gewünschte Dichte erreicht worden ist, zu der mikrobiellen Umgebung induziert.
Darüberhinaus wird es bevorzugt, daß eine geeignete sekretorische Leader-Sequenz vorhanden ist, und zwar entweder im Vektor oder am 5 '-Ende der synthetischen DNA-Sequenz. Die Leader-Sequenz befindet sich an einer Position, welche der leeader-Sequenz gestattet, unmittelbar angrenzend zu dem ersten Abschnitt der Nucleotidsequenz zu sein, welche fähig ist, die Expression des Protease-Inhibitors ohne irgendwelche intervenierenden Translationsterminationssignale zu lenken. Das Vorhandensein der Leader-Sequenz ist zum Teil aus einem oder mehreren der folgenden Gründe erwünscht: 1) Die Gegenwart der Leader-Sequenz kann die im Wirt stattfindende Prozessierung des Primärprodukts zu einem reifen rekombinanten Protease-Inhibitor erleichtern; 2) die Gegenwart der Leader-Sequenz kann die Reinigung der rekombinanten Protease-Inhibitoren durch Herauslenken des Protease- Inhibitors aus dem zellulären Cytoplasma vereinfachen; 3) die Gegenwart der Leader- Sequenz kann durch Herauslenken des Protease-Inhibitors aus dem zellulären Cytoplasma die Fähigkeit des rekombinanten Protease-Inhibitors beeinflussen, sich in seine aktive Struktur zu falten.
Insbesondere kann die Leader-Sequenz die Spaltung des anfänglichen Translationsprodukts durch eine Leader-Peptidase lenken, wodurch die Leader-Sequenz entfernt wird, und ein Polypeptid mit der bevorzugten Aminosäuresequenz übrigbleibt, welches potentielle Serinprotease-Inhibitoraktivität besitzt. In manchen Arten von Wirtsmikroorganismen wird die Gegenwart der geeigneten Leader-Sequenz den Transport des fertiggestellten Proteins in den periplasmatischen Raum ermöglichen, so wie es bei E. coli der Fall ist. Im Fall von gewissen Hefen und Stämmen von Bacilli und Pseudomonas wird die geeignete Leader-Sequenz den Transport des Proteins durch die Zellmembran und in das extrazelluläre Medium ermöglichen. In dieser Situation kann das Protein aus den extrazellulären Proteinen gereinigt werden.
Drittens kann im Falle einiger der mittels der vorliegenden Erfindung hergestellten Protease-Inhibitoren, die Gegenwart der Leader-Sequenz notwendig sein, um das fertiggestellte Protein in eine Umgebung setzen, in welcher es sich falten kann, um seine aktive Struktur einzunehmen, welche Struktur die passende Elastase- Inhibitoraktivität besitzt.
Zusätzliche funktionelle Elemente umfassen, sind aber nicht auf diese beschränkt, Ribosomenbindestellen und andere zur mikrobiellen Expression von Fremdproteinen notwendige DNA-Sequenzen. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung würde die Sequenz GAGGCGCAAAAA(ATG) als Ribosomenbindestelle verwendet werden. Die hier diskutierten funktionellen Elemente werden vom Durchschnittsfachmann routinemäßig unter Berücksichtigung der Literatur nach dem Stand der Technik und der hier enthaltenen Erkenntnisse ausgewählt. Allgemeine Beispiele für diese funktionellen Elemente sind in B. Lewin, Genes, Wiley & Sons, New York (1983) dargestellt, welches hier im besonderen durch den Literaturhinweis einbezogen ist. Die Vektoren, wie hier in Betracht gezogen, können zum Teil aus Bereichen der Plasmide pBR322 und/oder pIQ konstruiert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine zusätzliche DNA-Sequenz unmittelbar vorangehend vor der synthetischen DNA- Sequenz welche für den Protease-Inhibitor codiert, positioniert. Die zusätzliche DNA-Sequenz ist fähig, als ein Translations-Koppler zu wirken, d. h. sie ist eine DNA-Sequenz, welche eine RNA codiert, die dazu dient, Ribosomen unmittelbar angrenzend an die Ribosomenbindestelle auf der Protease-Inhibitor-RNA zu positionieren, mit welcher sie zusammenhängend vorliegt. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann der Translations-Koppler unter Benutzung der Sequenz TAACGAGGCGCAAAAAATGAAAAAGACAGCTATCGCGATCGGAG TGTAAGAAATG und derzeit dem Durchschnittsfachmann bekannter Verfahren, die mit Translations-Kopplern in Beziehung stehen, abgeleitet werden. Ein zweiter bevorzugter Translations-Koppler besitzt die DNA-Sequenz:
Nach Synthese und Isolierung aller notwendigen und gewünschten Bestandteile des obenstehend diskutierten Vektors, wird der Vektor durch dem Durchschnittsfachmann allgemein bekannte Verfahren zuammengesetzt. Es wird angenommen, daß der Zusammenbau solcher Vektoren innerhalb der Pflichten und Aufgaben des Durchschnittsfachmanns liegt und als solches ohne besonderes Experimentieren durchgeführt werden kann. Zum Beispiel sind ähnliche DNA-Sequenzen in passende Klonierungsvektoren einligiert worden, wie in Schoner et al., Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 81, S. 5403-5407 (1984) dargestellt, was hier im besonderen durch den Literaturhinweis einbezogen ist.
Bei der Konstruktion des Klonierungsvektors der vorliegenden Erfindung sollte darüberhinaus bemerkt werden, daß mehrere Kopien der synthetischen DNA-Sequenz und ihrer begleitenden funktionellen Elemente in jeden Vektor eingefügt werden können. In solch einer Ausführungsform würde der Wirtsorganismus pro Vektor größere Mengen des gewünschten Protease-Inhibitors herstellen. Die Anzahl der mehrfachen Kopien der DNA-Sequenz, welche in den Vektor eingefügt werden kann, wird lediglich, aufgrund seiner Größe, durch die Fähigkeit des resultierenden Vektors begrenzt, in einen geeigneten Wirtsmikroorganismus transferiert zu werden, darin zu replizieren und transkribiert zu werden.
Außerdem ist es bevorzugt, daß der Vektor einen selektierbaren Marker enthält, wie einen Arzneimittelresistenz-Marker oder einem anderen Marker, welcher die Expression einer selektierbaren Eigenschaft durch den Wirtsmikroorganismus bedingt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, ist das Gen für Tetracyclin-Resistenz vorzugsweise auf dem Klonierungsvektor enthalten.
Mit einem solchen Arzneimittelresistenz- oder anderen selektierbaren Marker wird teilweise beabsichtigt, die Selektion von Transformanten zu vereinfachen. Außerdem kann das Vorhandensein eines solchen selektierbaren Markers auf dem Klonierungsvektor nützlich sein, um kontaminierende Mikroorganismen von der Vermehrung in dem Kulturmedium abzuhalten. In dieser Ausführungsform würde solch eine reine Kultur des transformierten Wirtsmikroorganismus durch Kultivieren des Mikroorganismus unter Bedingungen erhalten werden, welche den induzierten Phänotyp für das Überleben erfordern.
Der so erhaltene Vektor wird dann in den geeigneten Wirtsmikroorganismus transferiert. Es wird angenommen, daß jeder Mikroorganismus, der die Fähigkeit zur Aufnahme exogener DNA und zur Expression dieser Gene und der begleitenden funktionellen Elemente besitzt, gewählt werden kann. Es wird bevorzugt, daß der Wirtsmikroorganismus ein fakultativer Anaerobier oder ein Aerobier ist. Besondere Wirte, welche für die Verwendung in diesem Verfahren zu bevorzugen sind, umfassen Hefen und Bakterien. Spezifische Hefen umfassen diejenigen aus der Gattung Saccharomyces und insbesondere Saccharomyces cerevisiae. Spezifische Bakterien umfassen diejenigen der Gattungen Bacillus, Escherichia und Pseudomonas, insbesondere Bacillus subtilis und Escherichia coli.
Nachdem ein Wirtsmikroorganismus gewählt wurde, wird der Vektor unter Verwendung von dem Durchschnittsfachmann allgemein bekannten Verfahren in diesen Wirtsmikroorganismus transferiert. Beispiele solcher Verfahren können in "Advanced Bacterial Genetics" von R. W. Davis et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1980) gefunden werden, was hier im besonderen durch den Literaturhinweis einbezogen ist. Es ist in einer Ausführungsform bevorzugt, daß die Transformation bei niedrigen Temperaturen erfolgt, weil die Temperatur-Regulation als ein Weg zur Regulierung von Genexpression unter Verwendung von funktionellen Elementen, wie obenstehend dargestellt, angesehen wird. Wenn osmolare Regulatoren in den Vektor eingefügt wurden, wäre, in einer anderen Ausführungsform, die Regulation der Salzkonzentrationen während der Transformation erforderlich, um eine angemessene Regulierung der synthetischen Gene zu gewährleisten.
Wenn es beabsichtigt wird, daß die rekombinanten Serinprotease-Inhibitoren letztlich in Hefe exprimiert werden, wird bevorzugt, daß der Klonierungsvektor zuerst in Escherichia coli transferiert wird, worin dem Vektor ermöglicht wird zu replizieren und aus welchem der Vektor nach der Amplifizierung gewonnen und gereinigt werden könnte. Der Vektor würde dann zur letzendlichen Expression des Serinprotease- Inhibitors in die Hefe transferiert werden.
Die Wirtsmikroorganismen werden unter für die Expression des Serinprotease- Inhibitors geeigneten Bedingungen kultiviert. Diese Bedingungen sind im allgemeinen spezifisch für den Wirtsorganismus und sind leicht durch den Durchschnittsfachmann unter Hinblick auf die veröffentlichte Literatur betreffend die Wachstumsbedingungen für solche Organismen, zum Beispiel "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 8. Auflage, Williams & Wilkins Company, Baltimore, Maryland, was hier im besonderen durch den Bezug darauf einbezogen ist, bestimmbar.
Alle zur Regulierung der Expression der DNA-Sequenz notwendige Bedingungen, abhängig von jedweden funktionellen Elementen, die in den Vektor inseriert wurden oder vorhanden sind, sind bei der Transformation und in den Kultivierungs-Stadien wirksam. In einer Ausführungsform werden die Zellen unter der Gegenwart von geeigneten regulierenden Bedingungen, welche die Expression der DNA-Sequenz verhindern, bis zu einer hohen Dichte herangezogen. Wenn die optimale Zelldichte erreicht ist, werden die Umweltbedingungen zu solchen verändert, die zur Expression der synthetischen DNA-Sequenz geeignet sind. Es wird dadurch beabsichtigt, daß die Herstellung des Protease-Inhibitors in einer Zeitspanne anschließend an das Wachstum der Wirtszellen nahe zur optimalen Dichte stattfindet, und daß der resultierende Protease-Inhibitor einige Zeit, nachdem die zu seiner Expression nötigen, regulierenden Bedingungen induziert wurden, gewonnen wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der rekombinante Protease-Inhibitor anschließend an seine Gewinnung und bevor er seine aktive Struktur einnimmt gereinigt. Diese Ausführungsform wird bevorzugt, weil die Erfinder annehmen, daß das Erzielen einer hohen Ausbeute an rückgefaltetem Protein erleichtert wird, wenn das Protein zuerst gereinigt wird. Jedoch kann in einer bevorzugten, alternativen Ausführungsform dem Protease-Inhibitor erlaubt werden, sich zurückzufalten, um seine aktive Struktur noch vor der Reinigung einzunehmen. In noch einer weiteren bevorzugten, alternativen Ausführungsform ist der Protease- Inhibitor bei der Gewinnung aus dem Kulturmedium bereits in seiner zurückgefalteten, aktiven Form vorhanden.
Unter bestimmten Umständen wird der Protease-Inhibitor seine korrekte, aktive Struktur nach der Expression im Wirtsmikroorganismus und dem Transport des Proteins durch die Zellwand oder Membran oder in den periplasmatischen Raum einnehmen. Dies wird im allgemeinen stattfinden, wenn DNA, welche für eine geeignete Leader-Sequenz codiert, mit der DNA, die für das rekombinante Protein codiert, verbunden wurde. Wenn der Protease-Inhibitor seine richtige, aktive Struktur nicht einnimmt, werden jegliche Disulfidbrücken, die gebildet worden sind, und/oder jegliche nicht-kovalente Wechselwirkungen, die aufgetreten sind, zuerst durch denaturierende und reduzierende Agenzien, zum Beispiel Guanidiniumchlorid und β-Mercaptoethanol zerstört, bevor dem Protease-Inhibitor erlaubt wird, seine aktive Struktur einzunehmen, was nach Verdünnung und Oxidation dieser Agenzien unter kontrollierten Bedingungen erfolgt.
Es versteht sich, daß die Anwendung der Erkenntnisse der vorliegenden Erfindung auf ein spezifisches Problem oder eine Umgebung sich innerhalb der Fähigkeiten eines Durchschnittsfachmanns, der die hier enthaltenen Erkenntnisse berücksichtigt, bewegt. Beispiele für die Produkte der vorliegenden Erfindung und repräsentative Verfahren für deren Isolierung und Herstellung erscheinen im folgenden Beispiel.

BEISPIEL 1

Auf der Grundlage der obenstehend beschriebenen Aminosäuresequenz, der Codonenverwendung in hochexprimierten Genen von Escherichia coli und der Bereitstellung passender Schnittstellen für Restriktionsendonucleasen wurde die nachfolgende DNA-Sequenz vorgeschlagen:
Um die Expression des Proteins in einer Form zu regulieren, welche für den Export bzw. die Ausschleusung in das Periplasma von E. coli geeignet ist, wurden die folgenden regulatorischen Elemente vorgeschlagen: Ein tac-Promotor zur Initiation der Transkription bei hohen Raten; ein lac-Operator zur Transkriptionsregulation; ein lac-Repressor (lac I ), welcher anderswo auf dem Plasmid codiert wird; eine OmpA Shine-Dalgarno-Sequenz, um die Translation bei hohen Raten zu initiieren; ein OmpA- Leader um den Export des Produkts in das Periplasma zu erleichtern; ein Ala einer Ala-Ser-Bindung zwischen der von diesen Operatorelementen codierten Proteinsequenz und derjenigen, die von den oben beschriebenen Strukturgenen codiert wird, um die Spaltung des anfänglichen Produktes zu lenken, wodurch ein reifer Leukozyten-Elastase-Inhibitor gewonnen wird. Alle diese Merkmale sind in der folgenden DNA-Sequenz enthalten:
Um die Expression des Proteins in einer Form zu regulieren, so daß das Protein im E.coli-Cytoplasma verbleibt, werden die folgenden funktionellen Elemente vorgeschlagen: Der tac-Promotor; der lac-Operator und der lac-Repressor (lac I ); ein Konsensus von Shine-Dalgarno-Sequenzen; und, um die Translation bei hohen Raten zu initiieren, ein Fragment des OmpA-Leader-Peptids, um als translationaler Koppler verwendet zu werden. Die translationale Kopplersequenz umfaßt die für die Translationsinitiationsregion des OmpA-Gens codierende DNA, die ersten acht Aminosäuren des OmpA-Leader-Peptids, die obenstehend beschriebene Konsensus- Shine-Dalgarno-Sequenz und einen Translationsterminator. Die translationale Kopplersequenz soll zwischen den Promotor und die Translationsinitiations-Stelle des Serinprotease-Inhibitorgens eingefügt werden, wobei sie mit dem letzteren überlappt. Alle diese Merkmale sind in der nachfolgenden DNA-Sequenz enthalten:

A. Konstruktion von Genfragmenten

Um die obenstehenden Sequenzen zu konstruieren, werden die folgenden Desoxyribonucleotide unter Verwendung des ABI-DNA-Synthesizers (Foster City, California) synthetisiert. Die Produkte werden durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese wie im ABI Geräte-Handbuch beschrieben gereinigt. Sie werden durch Verwenden von T4-Polynucleotidkinase und ATP einsetzenden Standardverfahren 5'-phosphoryliert.
Die nachfolgende Gruppe von Oligonucleotidsequenzen wird verwendet, um das Fragment Aa zu konstruieren.
Die folgenden Oligonucleotidsequenzen werden zusammengesetzt, um das Fragment Ab aufzubauen.
Die Folgenden sind diejenigen Oligonucleotidsequenzen, welche zusammengesetzt werden um das Fragment B zu konstruieren:
Die Folgenden sind die Oligonucleotidsequenzen, die verwendet werden, um das Fragment C zu konstruieren.
Die nachfolgende Gruppe von Oligonucleotidsequenzen wird zusammengesetzt, um das Fragment D zu bilden.
Die nachfolgenden Gruppen von Oligonucleotiden werden gemischt und unter Standardbedingungen annealt, und unter Verwendung von T4-DNA-Ligase unter Standardbedingungen aneinander sowie an die Klonierungs- und Sequenzierungs- Vektoren M13 mp 18 und 19 ligiert, die mit geeigneten Restriktionsendonucleasen geschnitten worden sind. Die Produkte werden verwendet, um E.coli JM105 zu transformieren, und die Klone, welche die interessierende DNA enthalten, werden unter den weißen Plaques auf IPTG-Xgal-Platten ausgewählt und mittels Hybridisierung mit ³²P-markierten Oligonucleotiden, welche aus der im Annealingschritt eingesetzten Gruppe gewählt wurden, weiter durchsucht. Die Struktur des Inserts wird unter Einsatz von einem universellen Primer durch Didesoxysequenzierung der klonierten DNA bestätigt.
Die Gruppe Aa enthält die Oligonucleotide Aa1-Aa10, welche in mit PstI und HindIII geschnittene M13 mp 18 und 19 ligiert werden. Die Gruppe Ab enthält die Oligonucleotide Ab1-Ab9, welche in mit PstI und HindIII geschnittene M13 mp 18 und 19 ligiert werden. Gruppe B, welche die Oligonucleotide B1-B7 enthält, wird in mit HindIII und BamHI geschnittene M13 mp 18 und 19 ligiert. Gruppe C, welche die Oligonucleotide C1-C9 enthält, wird in mit BamHI und XbaI geschnittene M13 mp 18 und 19 ligiert. Gruppe D, welche die Oligonucleotide D1-D4 enthält, wird in mit BamHI und SalI geschnittene M13 mp 18 und 19 ligiert.
Die M13-DNA in ihrer replikativen Form wird aus dem Klon, welcher die gewünschte Insert-DNA besitzt, durch Standardmethoden gewonnen. Die der Gruppe Aa entsprechende Insert-DNA wird aus der M13-DNA durch Spaltung der DNA mit geeigneten Restriktionsendonucleasen ausgeschnitten und wird durch Polyacrylamid- Gelelektrophorese gereinigt. Ihre Struktur ist:
Die der Gruppe Ab entsprechende Insert-DNA wird durch Spaltung der DNA mit den Restriktionsendonucleasen EcoRI und HindIII ausgeschnitten und wird durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt. Ihre Struktur ist:
Die der Gruppe B entsprechende Insert-DNA wird durch Spaltung der DNA mit den Restriktionsendonucleasen HindIII und BamHI ausgeschnitten und wird durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt. Ihre Struktur ist:
Die der Gruppe C entsprechende Insert-DNA wird durch Spaltung der DNA mit den Restriktionsendonucleasen BamHI und BglII ausgeschnitten und wird durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt. Ihre Struktur ist:
Die der Gruppe D entsprechende Insert-DNA wird durch Spaltung der DNA mit den Restriktionsendonucleasen SauIIIA und SalI ausgeschnitten und wird durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt. Ihre Struktur ist:

B. Konstruktion des Gens

Bei der Konstruktion für die Ausschleusung werden die Inserts der Gruppen Aa, B, C und D zusammengefügt und unter Verwendung von T4-DNA-Ligasen unter Standardbedingungen an mit EcoRI und SalI geschnittene M13 mp 18 und 19 ligiert. Die das Gen enthaltenden Klone werden nach ihrer Farbe auf Xgal-Platten selektiert und mittels Hybridisierung mit dem ³²P-markierten Oligonucleotid weiter durchsucht. Die Struktur der ausgewählten Klone wird durch eine Didesoxy-Sequenzierung der Insertregion der DNA unter Verwendung des universellen Primers bestätigt.
Bei der Konstruktion für die cytoplasmatische Expression werden die Inserts der Gruppen Ab, B, C und D zusammengefügt und unter Verwendung von T4-DNA- Ligase unter Standardbedingungen an mit EcoRI und SalI geschnittene M13 mp 18 und 19 ligiert. Die die Gene enthaltenden Klone werden nach ihrer Farbe auf Xgal-Platten selektiert und mittels Hybridisierung mit dem ³²P-markierten Insert weiter durchsucht.
Die Strukturen der ausgewählten Klone werden durch eine Didesoxy-Sequenzierung der Insertregion der DNA unter Verwendung des universellen Primers bestätigt.

BEISPIEL 2

Auf der Grundlage der obenstehend beschriebenen Aminosäuresequenz, der Codonenverwendung in hochexprimierten Genen von Escherichia coli und der Bereitstellung passender Schnittstellen für Restriktionsendonucleasen wurde die nachfolgende DNA-Sequenz vorgeschlagen:
Um die Expression des Proteins in einer Form zu regulieren, welche für die Ausschleusung in das Periplasma von E. coli geeignet ist, werden die folgenden regulatorischen Elemente vorgeschlagen: Ein tac-Promotor auf dem Plasmid pKK223-3 zur Initiation der Transkription bei hohen Raten; ein lac-Operator auf dem Plasmid pKK223-3 zur Transkriptionsregulation; ein lac-Repressor (lac I ), welcher auf dem Chromosom des E.coli-Stammes JM107 codiert wird; eine OmpA Shine-Dalgarno- Sequenz, um die Translation bei hohen Raten zu initiieren; ein OmpA-Leader um die Ausschleusung des Produkts in das Periplasma zu erleichtern; ein Ala einer Ala-Ser- Bindung zwischen der von diesen Operatorelementen codierten Proteinsequenz und derjenigen, die von den oben beschriebenen Strukturgenen codiert wird, um die Spaltung des anfänglichen Produktes festzulegen, wodurch ein reifer Leukozyten- Elastase-Inhibitor gewonnen wird. Die OmpA-Elemente sind in der nachfolgenden DNA-Sequenz enthalten:
Um die Expression des Proteins in einer Form zu regulieren, so daß das Protein im E.coli-Cytoplasma verbleibt, werden die folgenden funktionellen Elemente vorgeschlagen: Der tac-Promotor auf Plasmid pKK223-3; der lac-Operator auf Plasmid pKK223-3 und der lac-Repressor (lac 1% auf dem Chromosom des E.coli-Stammes JM107; eine Konsensus-Shine-Dalgarno-Sequenz; und, um die Translation bei hohen Raten zu initiieren, ein Fragment des OmpA-Leader-Peptids, um als translationaler Koppler verwendet zu werden. Die translationale Kopplersequenz umfaßt die für die Translationsinitiationsregion des OmpA-Gens codierende DNA, die ersten acht Aminosäuren des OmpA-Leader-Peptids, die obenstehend beschriebene Konsensus- Shine-Dalgarno-Sequenz und einen Translationsterminator. Die translationale Kopplersequenz soll zwischen den lac-Operator und die Translationsinitiations-Stelle des Serinprotease-Inhibitorgens eingefügt werden, wobei sie mit dem zweiteren überlappt. Die Merkmale des Translationskopplers sind in der nachfolgenden DNA-Sequenz enthalten:

C. Konstruktion von Genfragmenten

Um die obenstehenden Sequenzen zu konstruieren, werden die folgenden Desoxyribonucleotide unter Verwendung des ABI-DNA-Synthesizers (Foster City, California) synthetisiert. Die Produkte werden durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese wie im ABI Geräte-Handbuch beschrieben gereinigt. Sie werden durch Verwenden von T4-Polynucleotidkinase und ATP einsetzenden Standardverfahren 5'-phosphoryliert.
Die nachfolgende Gruppe von Oligonucleotidsequenzen wird verwendet, um das Fragment Aa zu konstruieren.
Die nachfolgenden Oligonucleotidsequenzen werden zusammengesetzt, um das Fragment Ab zu konstruieren.
Die Folgenden sind diejenigen Oligonucleotidsequenzen, die zusammengesetzt werden um das Fragment B zu konstruieren.
Die Folgenden sind diejenigen Oligonucleotidsequenzen, die verwendet werden, um das Fragment C zu konstruieren.
Die nachfolgende Gruppe von Oligonucleotidsequenzen wird zusammengesetzt, um das Fragment D zu konstruieren.
Die folgenden Oligonucleotidgruppen werden gemischt und unter Standardbedingungen annealt, und unter Verwendung von T4-DNA-Ligase unter Standardbedingungen aneinander sowie an die Klonierungs- und Sequenzierungs-Vektoren M13 mp 18 und 19 ligiert, die mit geeigneten Restriktionsendonucleasen geschnitten worden sind. Die Produkte werden verwendet, um E.coli JM105 zu transformieren, und Klone, welche die interessierende DNA enthalten, werden mittels Hybridisierung mit ³²P-markierten Oligonucleotiden, welche aus der im Annealingschritt eingesetzten Gruppe gewählt wurden, selektiert. Die Insertstruktur wird unter Einsatz von einem universellen Primer durch Didesoxysequenzierung der klonierten DNA bestätigt.
Die Oligonucleotide Aa1-Aa4 werden in M13 mp 18 und M13 mp 19, die mit EcoRI und
BamHI geschnitten wurden, ligiert. M13-DNA in der replikativen Form, welche die gewünschte Insert-DNA besitzt, wird mittels Standardverfahren gewonnen. Die Insert- DNA wird durch Spaltung der M13-DNA mit den Restriktionsendonucleasen EcoRI und PvuI aus der M13-DNA herausgeschnitten und wird durch Polyacrylamid- Gelelektrophorese gereinigt. Ihre Struktur ist:
Die Oligonucleotide Aa5 und Aa6 werden in M13 mp 18 und M13 mp 19, die mit BamHI und HindIII geschnitten wurden, ligiert. M13-DNA in der replikativen Form, welche die gewünschte Insert-DNA besitzt, wird mittels Standardverfahren gewonnen. Die Insert-DNA wird durch Spaltung der DNA mit den Restriktionsendonucleasen PvuI und HindIII aus der M13-DNA herausgeschnitten und wird durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt. Ihre Struktur ist:
Dieses PvuI-HindIII-Fragment wird mit dem EcoRI-PvuI-Fragment, das aus den Oligonucleotiden Aa1-Aa4 hergestellt wurde, zusammengefügt und mit M13 mp 18 oder M13 mp 19, welche mit EcoRI und HindIII geschnitten wurden, ligiert. M13- DNA in der replikativen Form, welche die gewünschte Insert-DNA besitzt, wird mittels Standardverfahren gewonnen. Die Insert-DNA, welche aus dem DNA- Fragment Aa besteht, wird durch Spaltung der M13-DNA mit den Restriktionsendonucleasen EcoRI und HindIII aus der M13-DNA herausgeschnitten und wird durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt. Ihre Struktur ist:
Die Oligonucleotide Ab1-Ab4 werden in M13 mp 18 und M13 mp 19, welche EcoRI und BamHI geschnitten wurden, ligiert. Die M13-DNA in der replikativen Form, welche die gewünschte Insert-DNA besitzt, wird mittels Standardverfahren gewonnen. Die Insert-DNA wird durch Spaltung der DNA mit den Restriktionsendonucleasen EcoRI und PvuI aus der M13-DNA herausgeschnitten und wird durch Polyacrylamid- Gelelektrophorese gereinigt. Ihre Struktur ist:
Dieses EcoRI-PvuI-Fragment wird mit den Oligonucleotiden Ab5 und Ab6 zusammengefügt und mit M13 mp 18 oder M13 mp 19, welche mit EcoRI und HindIII geschnitten wurden, ligiert. M13-DNA in der replikativen Form, welche die gewünschte Insert-DNA besitzt, wird mittels Standardverfähren gewonnen. Die Insert-DNA, welche aus dem DNA-Fragment Ab besteht, wird durch Spaltung der DNA mit den Restriktionsendonucleasen EcoRI und HindIII aus der M13-DNA herausgeschnitten und wird durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt. Ihre Struktur ist:
Die Gruppe B, welche die Oligonucleotide B1 bis B7 enthält, wird in mit HindIII und BamHI geschnittene M13 mp 18 und 19 ligiert. Die der Gruppe B entsprechende Insert- DNA wird durch Spaltung der DNA mit den Restriktionsendonucleasen HindIII und BamHI herausgeschnitten und durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt. Ihre Struktur ist:
Die Gruppe C, welche die Oligonucleotide C1 bis C9 enthält, wird in mit BamHI und XbaI geschnittene M13 mp 18 und 19 ligiert. Die der Gruppe C entsprechende Insert- DNA wird durch Spaltung der DNA mit den Restriktionsendonucleasen BamHI und BglII herausgeschnitten und durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt. Ihre Struktur ist:
Die Gruppe D, welche die Oligonucleotide D1 bis D4 enthält, wird in mit BamHI und SalI geschnittene M13 mp 18 und 19 ligiert. Die der Gruppe D entsprechende Insert- DNA wird durch Spaltung der DNA mit den Restriktionsendonucleasen SauIIIA und SalI herausgeschnitten und durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt. Ihre Struktur ist:

D. Konstruktion des Gens

In der Konstruktion für die Ausschleusung werden die Inserts der Gruppen Aa, B, C und D zusammengefügt und unter Verwendung von T4-DNA-Ligase unter Standardbedingungen an mit EcoRI und SalI geschnittene M13 mp 18 und 19 ligiert. In der Konstruktion für die cytoplasmatische Expression werden die Inserts der Gruppen Ab, B, C und D zusammengefügt und unter Verwendung von T4-DNA-Ligase unter Standardbedingungen an mit EcoRI und SalI geschnittene M13 mp 18 und 19 ligiert. Die das Gen enthaltenden Klone werden nach ihrer Farbe auf Xgal-Platten selektiert und mittels Hybridisierung mit dem ³²P-markierten Oligonucleotid weiter durchsucht. Die Struktur der ausgewählten Klone wird durch eine Didesoxy-Sequenzierung der Insertregion der DNA unter Verwendung des universellen Primers bestätigt.

BEISPIEL 3

Konstruktion von Expressionsvektoren

Die Inserts für die Konstruktion für die Ausschleusung und die Konstruktion für die cytoplasmatische Expression werden wie folgt in Expressionsplasmide überführt.
M13-DNA in der replikativen Form, welche die gewünschte Insert-DNA aufweist, wird wie oben angedeutet mittels Standardverfahren gewonnen. Die geeignete Insert- DNA wird aus der M13-DNA durch Spaltung der DNA mit den Restriktionsendonucleasen EcoRI und PstI herausgeschnitten und durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt. Sie wird danach in pKK223-3, welcher mit den Restriktionsendonucleasen EcoRI und PstI geschnitten wurde, ligiert, und das resultierende Plasmid wird in E.coli JM107 kloniert. Die Konstruktion zur Verwendung in Beispiel 4 und 5 für die Ausschleusung ist pSGE6 und diejenige zur Verwendung in Beispiel 7 für die cytoplasmatische Expression ist pSGE8. Der E.coli-Stamm für die Ausschleusung in Beispiel 4 und 5 ist SGE10 und derjenige für die cytoplasmatische Expression in Beispiel 6 ist SGE30

A. Organisation von pSGE6

Das Plasmid pSGE6 wurde durch Ersetzen der DNA zwischen den EcoRI und PstI- Stellen auf pKK223-3 mit einem EcoRI/PstI-Fragment, welches für ompA-SLPI codierende DNA enthält, konstruiert. Die DNA-Sequenz von ompA-SLPI ist wie folgt:
Die Sequenz, welche von hier ab als "ompA-SLPI" bezeichnet wird, besteht aus der DNA aus dem obenstehend erörterten endgültigen M13mp18-Konstrukt für die Ausschleusung. Das Plasmid pSGE6 ist in Fig. 1 abgebildet. In Fig. 1 befindet sich das erste Codon für ompAss-SLPI an Position 62-64 der "ompA-SLPI" genannten DNA-Sequenz. Das erste Codon für den reifen SLPI ist an Position 125-127. Ptac enthält DNA für den tac-Promotor, lac-Operator und die β-Galactosidase-Shine/- Dalgarno-Sequenz. Die Abkürzungen R1, Pst und Bam stehen für Erkennungssequenzen für die Restriktionsenzyme EcoRI, PstI und BamHI. Tet® ist eine Teil aus dem Gen von pBR322, welches Resistenz gegen Tetracyclin vermittelt, amp® vermittelt Resistenz gegen Ampicillin, rrnB enthält die DNA aus dem rrnB-Operon von Position 6416 bis Position 6840. Pfeile verdeutlichen die Richtung der Transkription.

B. Organisation von pCJ-ompA-SLPI

Das Plasmid pCJ-ompA-SLPI ist das gleiche wie pSGE6, mit der Ausnahme daß, es das vollständige Tetracyclin-Resistenzgen und Promotor anstelle des partiellen Gens enthält. Diese Plasmid vermittelt Resistenz gegen Tetracyclin, wenn es in E.coli eingeführt wird, und wurde in einer analogen Weise wie pSGE6 konstruiert, mit der Ausnahme, daß das EcoRI/PstI-Fragment, welches die für ompA-SLPI codierende DNA enthielt, in den Vektor pCJ1 anstatt pKK223-3 kloniert wurde. Der Vektor pCJ1 wurde wie folgt konstruiert. Das Plasmid pKK223-3 wurde vollständig mit SphI und partiell mit BamHI verdaut. Ein Fragment von 4,4 kbp Länge wurde aus einem Gel gereinigt und mit einem synthetischen Adaptor
und einem 539 bp großem DNA-Fragment aus einem ClaI, SphI-Verdau des tet®-Gens von pBR322 (PL Biochemicals, 27-4891-01) zusammengefügt.

C. Struktur von pSGE8

Das Plasmid pSGE8 ist isogen mit pSGE6, mit der Ausnahme, daß die DNA zwischen den EcoRI und Pst-Stellen die ompA-tc-met-SLPI genannte Sequenz enthält, welche aus dem obenstehend erörterten endgültigen M13mp18-Konstrukt für die cytoplasmatische Expression abgeleitet wurde. Diese Sequenz dirigiert die Synthese von Methionyl-SLPI in das Cytoplasma von E.coli. Ein partielles Diagramm von pSGE8 ist in Fig. 2 enthalten. In der "ompA-tc-met-SLPI" genannten Sequenz befindet sich das Initiationscodon für ompA an Position 62-64, das Terminationscodon bei 95-97 und das Initiationscodon für Methionyl-SLPI bei 98-100. Die DNA-Sequenz von ompA-tc-met-SLPI ist wie folgt

D. Organisation von pCJ-met-SLPI

Das Plasmid pCJ-met-SLPI ist das gleiche wie pSGE8, mit der Ausnahme, daß es das vollständige (anstatt dem teilweisen) Tetracyclin-Resistenzgen enthält. Das Plasmid pCJ-met-SLPI wurde analog wie pSGE8 konstruiert außer, daß das EcoRI/PstI- Fragment, welches die für ompA-tc-met-SLPI codierende DNA enthält, in den Vektor pCJ1 anstatt pKK223-3 kloniert wurde.

E. Konstruktion von Hefe-Expressionsplasmiden

Das Plasmid pUC8 wurde mit HindIII verdaut und an einen HindIII/SmaI-Adaptor (erhalten von Amersham, Kat.-Nr. DA 1006) ligiert. Die Anfügung dieses Adaptors an eine HindIII-Stelle bewirkt keine Rekonstruktion dieser HindIII-Stelle. Die DNA wurde danach mit SmaI verdaut und in verdünnter Lösung ligiert, was von einer Transformation in E.coli JM83 gefolgt wurde. Das korrekte Plasmid, d. h. ein Plasmid, dem im Polylinker die Restriktionsstellen von der HindIII-Stelle bis zur SinaI-Stelle fehlen, wurde durch Verdau der aus Transformanten isolierten Plasmid- DNA mit EcoRI, SmaI oder HindIII identifiziert. Auf diese Weise wurde eine Transformante identifiziert, welche ein Plasmid enthielt, dem die HindIII-Stelle fehlte, aber
das die EcoRI-Stelle und die SinaI-Stelle enthielt. Dieses Plasmid ist pGS185.
Ein EcoRI-Fragment, welches das Hefe MFα1-Gen enthielt, wurde durch Gelelektrophorese aus dem Plasmid pCY17 wie von J. Kurjan & I. Hershkowitz in Cell 30, 5.933 (1982) beschrieben, was hier ausdrücklich als Literaturhinweis inbegriffen ist, gereinigt und in mit EcoRI geschnittenen pGS185 einligiert. Diese Ligationsmischung wurde verwendet, um E.coli HB101 zu transformieren, wobei auf Ampicillin-Resistenz selektiert wurde. Die Plasmid-DNA wurde aus den Transformanten isoliert, und die Gegenwart des korrekten Inserts wurde durch Verdau der DNA mit EcoRI bestätigt. Dies ist das Plasmid pGS285 und in Fig. 3 abgebildet.
Das Plasmid pGS285 wurde vollständig mit HindIII verdaut und unter verdünnten Bedingungen religiert, wodurch drei von den vier internen HindIII-Stellen im MFα1- Gen eliminiert wurden, wie von Kurjan & Hershwitz, ebenda, bemerkt. Das korrekte Konstrukt wurde wie oben beschrieben selektiert. Dies ist das Plasmid pGS385.
Der M13 AaBCD-Klon, wie in Beispiel 2 beschrieben, welcher Nucleotidsequenzen trägt, die für die Aminosäuren 4 bis 107 des synthetischen SLPI-Gens codieren, wurde mit HindIII verdaut. Diese DNA wurde mit dem folgenden Oligonucleotidadaptor ligiert:
Dieser Adaptor war durch Annealen der zwei Oligonucleotide: 5'GCT GAA GCT TCA GGT AAG und 5'AGC TCT TAC CTG AAG CTT CAGC zuerst bei 70ºC für 2', gefolgt von langsamen Abkühlen über Nacht, gebildet worden.
Nachfolgend an die Ligation des Adaptors an mit HindIII geschnittenem M13 AaBCD, wurde die Ligationsmischung mit HindIII und SalI verdaut, um ein Fragment freizusetzen, welches mittels Agarosegelelktrophorese und Elektroelution gereinigt wurde. Dieses Fragment wurde noch einmal mit HindIII verdaut und dann mit pGS385-DNA ligiert, welche mit HindIII und SalI geschnitten worden war. E.coli HB 101 wurde mit der Ligationsmischung transformiert, und Ampicillin-resistente Transformanten wurden selektiert. Die Transformanten, welche Plasmide mit der korrekten Insert-DNA enthielten, wurden durch Präparation der Plasmid-DNA und deren Verdau mit HindIII und SalI identifiziert. Ein in dieser Weise konstruiertes und isoliertes Plasmid wurde als pGS485 bezeichnet und ist in Fig. 4 abgebildet. Dieses Plasmid enthalt das MFα1-Gen, das an der HindIII-Stelle in der ersten Spacer Region des MFα1-Gens im Leserahmen an das synthetische SLPI-Gen fusioniert ist. Es wurde gezeigt, daß solche Konstrukte, wenn in die Hefe gebracht, die Synthese, die Prozessierung und die Sekretion von heterologen Proteinen lenken, wie von A. J. Brake et al. in PNAS (USA) 81, S. 4642, was hier spezifisch durch Bezug einbegriffen ist, dargelegt wurde. Die Fusion des MFα1-Gens und des SPLI ist auf einem EcoRI-Fragment in pGS485 enthalten. Dieses EcoRI-Fragment wurde, wie in Beispiel 8 beschrieben, in den Vektor YIp5 kloniert.

BEISPIEL 4

Expression und Reinigung von sekretorische Leukozyten-Protease-Inhibitor (SLPI) unter Verwendung des Plasmids pSGE6.
E.coli-Zellen, welche das Plasmid pSGE6 (SGE10-Zellen) enthalten, wurden 6 Stunden lang in 10 Litern M9-Medium mit Zusatz von 2% Trypton, 0,5% Hefe- Extrakt, 20 g/l Glucose, 200 mg Vitamin B1 und 100 mg/l Ampicillin kultiviert. IPTG wurde zu 0,2 mM zugegeben, und die Kultur wurde weitere 6 Stunden wachsen gelassen. Zehn Liter der E.coli SGE10-Zellen, von 8 Gramm pro Liter, wurden bei 18 000 · g pelletiert und in 50 mM Tris HCl (pH 7,5), 4 mM EDTA-Puffer (nachfolgend als T50E4 bezeichnet) resuspendiert und pelletiert. Das Pellet wurde in 2,7 Litern T50E4 resuspendiert und in 150 ml Einheiten eingefroren. Acht dieser Aliquots (äquivalent zu 36 Gramm Zellen) wurden vereinigt und durch einen einzelnen Durchlauf durch eine "French Press" bei 12 000 psi bei 4ºC lysiert. Das Lysat wurde 1 ,5 Stunden lang bei 20000 · g zentrifugiert. Ein Sechstel des Pellets, welches die unlöslichen Zellrückstände enthielt (entsprechend 6 Gramm der Zellen), wurde zweimal mit 125 ml T50E4 gewaschen und das verbliebene Material wurde über Nacht eingefroren.
Das gefrorene Pellet wurde mit 25 ml 100 mM Tris HCl (pH 8,0), 4 mM EDTA (von hier ab T100E4), enthaltend 20 mM DTT (erhalten von Sigma, Kat.-Nr. D-0632), 4 mM PMSF (bezogen von Sigma, Kat.-Nr. P-7626) und 8M Harnstoff (ultrarein, bezogen von BRL, Kat.-Nr. 5505UA) eine Stunde lang bei 37ºC extrahiert und zehn Minuten lang bei 10 000 · g zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde mit 10 ml gepackter Sephadex SP-C25 (erhalten von Pharmacia) vermischt, welche mit dem Extraktionspuffer T100E4, enthaltend 20 mM DTT und 8 M Harnstoff, voräquilibriert worden war, und auf einem Rollengerät (roller) zehn Minuten lang bei 37ºC durchgemischt, um den SLPI an das SP-Sephadex zu adsorbieren.
Das Harz mit dem adsorbierten SLPI wurde durch eine zehnminütige Zentrifugation bei 3000 · g pelletiert, und der Überstand wurde abdekantiert. Das verbleibende Harz wurde zweimal mit 25 ml T100E4, enthaltend 20 mM DTT und 8M Harnstoff, gewaschen, gefolgt von zwei Wasch-Schritten mit 25 ml T100E4, enthaltend 20 mM DTT. Das Harz wurde danach einmal mit einer Mischung aus 0,6 ml 5M NaCl und 25 ml T100E4, enthaltend 20 mM DTT und 0,3 M NaCl extrahiert. Dieser Extrakt enthielt etwa 0,15 mg/ml Protein und mehr als 0,04 mg/ml SLPI. Es wurde durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) bestimmt, daß der durch dieses Verfahren gewonnene SLPI zu mehr als 70% rein war.

BEISPIEL 5

Unter Verwendung des Verfahrens aus Beispiel 4 wurde ein zweites eingefrorenes Pellet mit 1% Triton X-100 (bezogen von Sigma, Kat.-Nr. T-6878) enthaltendem T100E4 anstelle des ersten T100E4/DTT/PMS F/Harnstoff-Waschschritts extrahiert. Der resultierende SLPI war leicht sauberer als der in Beispiel 4 gewonnene und ergab eine höhere Aktivität in dem nachfolgend in Beispiel 6 dargestellten Rückfaltungs- Assay.

BEISPIEL 6

Rückfaltung des gereinigten SLPI

Etwa 40 ug des teilweise gereinigten SLPI aus Beispiel 4 oder 5 wurde auf 8 M Harnstoff oder auf 5 M Guanidinhydrochlorid (erhalten von Pierce Chemical Co., #24110) und 4 mM DTT gebracht und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Oxidiertes Glutathion (bezogen von Sigma, Kat.-Nr. G-4626) wurde zu 13,5 mM zugegeben und die Mischung wurde wieder 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Mischung wurde 10-fach mit einer Lösung von 50 mM Tris in NaOH, pH 10,7 verdünnt und weitere 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Mischung wurde danach 5-fach mit 50 mM Tris, pH 8,0 und 0,15 M NaCl verdünnt und auf eine 1 · 2 cm-Säule mit Sephadex SP-C25 aufgetragen, welche mit 50 mM Tris, pH 8,0 und 0,25 M NaCl voräquilibriert worden ist. Das Harz wurde mit 50 mM Tris, pH 8,0, enthaltend 0,25 M NaCl, und dann mit 50 mM Tris, pH 8,0, welcher 0,5 M NaCl enthielt, gewaschen. Die mit dem 0,5 M Salz-Waschschritt eluierende Fraktion war vollständig aktiv und stellte etwa 30% des auf die Säule aufgetragenen SLPI dar.

BEISPIEL 7

Reinigung des SLPI aus löslichen und nicht löslichen Fraktionen des SGE30- Zellysates.
Die Expression des Plasmids pSGE8 in E.coli SGE30-Zellen produzierte SLPI in beiden, den löslichen und nicht löslichen Fraktionen des Zellysates. Bei 1% des gesamten Zellproteins war der SLPI zu etwa 80% auf die löslichen und zu etwa 20% auf die nicht löslichen Fraktionen aufgeteilt.

A. Reinigung des SLPI aus der nicht löslichen Fraktion

Die pSGE8 enthaltenden E.coli SGE30-Zellen wurden in LB-Medium, das 50 ug/ml Ampicillin enthielt, in Schüttel-Kolben zu einer OD600 von 0,7 herangezogen und durch Zugabe von IPTG zu 0,2 mM induziert. Nach drei Stunden werden die Zellen pelletiert und mit dem doppelten Gewicht an 50 mM Tris HCl (pH 7,5) und 4 mM EDTA (ab hier T50E4) suspendiert. Die Zellen wurden durch Ultraschallbehandlung bei 4ºC aufgebrochen, und der Extrakt wurde 20 Minuten lang bei 4ºC bei 12 000 · g zentrifugiert.
Das Pellet wurde in drei Volumen T50E4 gewaschen und wurde bei Raumtemperatur in einer Lösung aufgelöst, welche entweder 10 M Harnstoff oder 6 M Guanidinhydrochlorid und 5 mM reduziertes DTT enthielt. Nach einer Stunde Inkubation bei Raumtemperatur, wurde oxidiertes Glutathion zu einer Konzentration von 17,5 mM zugegeben, und die Mischung wurde eine weitere Stunde lang inkubiert. Die Mischung wurde in 10 Volumina 50 mM Tris HCl, pH 10,7 verdünnt. Die verdünnte Lösung wurde 4 Stunden lang bei Raumtemperatur stehengelassen, gefolgt von einer Einstellung des pH-Werts auf 8 durch Zugabe von 5 N HCl. Diese Mischung wurde zentrifugiert, um gefälltes Protein zu entfernen.
Der dieserart hergestellte Überstand enthielt SLPI, welcher inhibierende Aktivität gegen sekretorische Leukozyten-Protease besaß. Diese Protein wurde mittels Chromatographie auf einer Sephadex SP-C25-Säule wie oben beschrieben gereinigt.

B. Reinigung von SLPI aus der löslichen Fraktion

E.coli SGE30-Zellen, welche das Plasmid pSGE8 enthalten, wurden in einem Schüttelkolben zu einer OD600 von 0,7 herangezogen und durch die Zugabe von IPTG zu 0,2 mM induziert. Bei einer OD600 von 1,1 wurden die Zellen bei 25 000 · g 15 Minuten lang pelletiert. Das Pellet wurde in T50E4 resuspendiert und mit zwei Durchgängen durch eine "French Press" bei 20 000 psi und bei 4ºC lysiert. Das Lysat wurde 15 Minuten lang bei 25 000 · g zentrifugiert.
Der Überstand wurde auf 25 mM DTT gebracht. Diese Mischung wurde bei 0ºC eine Stunde lang inkubiert, und es wurde genügend HCl zugegeben, um eine Endkonzentration von 5% zu erreichen. Nach einer 30 Minuten langen Inkubation bei 0ºC wurde die Mischung 15 Minuten lang bei 25 000 · g zentrifugiert, und der Überstand wurde zur weiteren Bearbeitung abgenommen. Der pH-Wert des Überstandes wurde mit 10 M NaOH auf 8,0 eingestellt, und es erfolgte eine Analyse über SDS-PAGE, Umkehrphasen-HPLC-Chromatographie und ELISA, welche mindestens 0,7 ug SLPI pro 130 ug Gesamtprotein anzeigten. Der so gewonnene SLPI wurde auf einer Sephadex SP-C25-Chromatographiesäule weiter gereinigt. Er wurde gemäß Beispiel 6 zu aktivem SLPI zurückgefaltet.

BEISPIEL 8

Das EcoRI-Fragment, welches das fusionierte SLP1-MFα1-Gen (siehe Beispiel 3.E) enthält, wurde in die EcoRI-Stelle des Hefevektors YIp5 einligiert, wie beschrieben von D. Botstein und R. W. Davis in "The Moiecular Biology of the Yeast Saccharomyces", Cold Spring Harbor Laboratories, S. 607-636 (1982), was hier durch den Bezug spezifisch einbezogen ist, wodurch YIpSLPI-1 erzeugt wurde, und wurde durch ortsspezifische (site-directed) Rekombination, wie beschrieben von T. Orr-Weaver et al. in Methods of Enzymology 101, S. 228 (1983), was hier spezifisch durch Bezug einbezogen ist, in das URA3-Gen von S.cerevisiae BS214 (MATα, Ura3-52, pep4, prb1) integriert. Dieser Stamm, S.cerevisiae SGY-1, sekretiert vollständig aktiven SLPI in den Kulturüberstand.
Ein zweiter Stamm, SGY-3, produziert und sezerniert ebenfalls aktiven SLPI. Dieser Stamm trägt die MFα1::SLPI-Fusion auf dem replizierenden Hefeplasmid pGS585. Dieses Plasmid wurde, wie beschrieben von J. R. Broach in Methods in Enzymology 101, S. 307 (1983), was hier spezifisch durch Bezug einbezogen ist, aus pJDB207 durch die Addition des Hefe URA3-Gens konstruiert, welches aus dem Plasmid YEp24 wie von D. Botstein und R. W. Davis in "The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces", Cold Spring Harbor Laboratories, S. 607-636, beschrieben, was hier durch den Literaturverweis spezifisch eingeschlossen ist, isoliert wurde, und in die HindIII-Stelle von pJDB207 einkloniert wurde, um pGS585 zu konstruieren. Das auf einem EcoRI-Fragment enthaltene MFα1::SLPI-Fusionsgen wurde unter Verwendung von EcoRI-XhoI-Adaptoren (bezogen von Amersham, Kat.-Nr. DA 1007) in die SalI-Stelle von pGS585 einkloniert, um YEpSLPI-1 zu erzeugen. Diese Plasmid wurde durch Transformation in S.cerevisiae DBY746 (MATα, Ura3-52, leu2-3, his3-1, trp 1-289) eingeführt, wie von Ito et al. in J. Bacteriology 153, S. 163 (1983) beschrieben, was hier durch den Bezug spezifisch einbezogen ist.
Die Saccharomyces cerevisiae-Stämme SGY-1 und SGY-3 wurden bei 30ºC in SD-Medium, welchem Uracil fehlt, bis zur stationären Phase gemäß dem Verfahren von F. Sherman et al. herangezogen, welches beschrieben ist in "Methods in Yeast Genetics", 5.62, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York (1981), was hier spezifisch durch den Bezug einbegriffen ist. Die Zellen wurden durch Zentrifugation aus dem Kulturmedium entfernt, und der Kulturüberstand wurde durch Messen (1) der Protease-inhibierenden Aktivität und (2) der Menge an Material, welches spezifisch mit Anti-SLPI-Antikörpern in einem enzymverbundenen Immunoassay reagiert, auf SLPI-Aktivität untersucht. Reinigungs-Schemata können in einer zu den hier beschriebenen, früheren Verfahren analogen Weise entwickelt werden.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Serinprotease-Inhibitors, umfassend eine einzelne, unfragmentierte Polypeptidkette, wobei der Inhibitor mindestens eine aktive Stelle besitzt, die Serinprotease- Inhibitoraktivität und mindestens 40% Homologie zu einem aus parotissekreten isolierten, nativen Serinprotease-Inhibitor aufweist und wobei der native Serinprotease-Inhibitor die folgende Aminosäuresequenz besitzt:

worin das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

a) Kultivieren eines Wirtsmikroorganismus, der mit einer DNA-Sequenz transformiert ist, welche fähig ist, die Herstellung des Serinprotease-Inhibitors unter Bedingungen, die für die Expression der DNA-Sequenz geeignet sind, zu lenken, und;

b) Gewinnen des Inhibitors.

2. Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend einen Schritt, worin der Inhibitor eine aktive Tertiärstruktur einnehmen kann, wodurch dieser Serinprotease-Inhibitoraktivität erhält.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin die DNA-Sequenz eine synthetische DNA-Sequenz ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, worin die DNA-Sequenz eine natürliche DNA-Sequenz ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, welches weiterhin die Reinigung des Inhibitors umfaßt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, worin die Reinigung vor dem Schritt durchgeführt wird, worin der Inhibitor eine aktive Form einnimmt.

7. Verfahren nach Anspruch 5, worin die Reinigung nach dem Schritt durchgeführt wird, worin der Inhibitor eine aktive Form einnimmt.

8. Verfahren nach Anspruch 1, worin die DNA-Sequenz auf einem Vektor getragen wird, welcher Teile der Vektoren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus pBR322 und pIQ, umfaßt.

9. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Wirtsmikroorganismus ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Mikroorganismen der Gattungen Escherichia, Bacillus und Saccharomyces.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin der Wirtsmikroorganismus Escherichia coli ist.

11. Verfahren nach Anspruch 9, worin der Wirtsmikroorganismus Bacillus subtilis ist.

12. Verfahren nach Anspruch 9, worin der Wirtsmikroorganismus Saccharomyces cerevisiae ist.

13. Verfahren nach Anspruch 4, worin die natürliche DNA-Sequenz durch ein Verfahren erhalten wird, welches die folgenden Schritte umfaßt:

a) Herstellen einer humanen cDNA-Bank aus Zellen, die fähig sind, den nativen Serinprotease-Inhibitor zu exprimieren;

b) Durchsuchen der cDNA-Bank mit mindestens einer Nukleinsäure-Sonde, welche fähig ist, an eine cDNA zu hybridisieren, die für den Inhibitor kodiert, oder mit mindestens einer Sonde, welche fähig ist, an ein durch einen Klon der cDNA-Bank exprimiertes protease-Inhibitorprotein zu binden;

c) Identifizieren mindestens eines Klons, welcher eine cDNA enthält, die für den Inhibitor kodiert und, wahlweise;

d) Isolieren der cDNA, die für den Inhibitor aus dem Klon kodiert; und

e) Verbinden der cDNA, oder von Fragmenten davon, mit funktionellen Elementen, um die cDNA in einem Wirtsmikroorganisinus zu halten und zu exprimieren.

14. Verfahren nach Anspruch 13, worin die Zellen humane Parotiszellen sind.

15. Verfahren nach Anspruch 4, worin die natürliche DNA-Sequenz durch ein Verfahren erhalten wird, welches die folgenden Schritte umfaßt:

a) Herstellen einer humanen, genomischen DNA-Bank;

b) Durchsuchen der genomischen DNA-Bank mit mindestens einer Nukleinsäure-Sonde, welche fähig ist, an eine genomische DNA zu hybridisieren, die für den Inhibitor kodiert, oder mit mindestens einer Sonde, welche fähig ist, an ein durch einen Klon der genomischen DNA-Bank exprimiertes Protease-Inhibitorprotein zu binden;

c) Identifizieren mindestens eines Klons, welcher eine genomische DNA enthält, die für den Inhibitor kodiert und wahlweise;

d) Isolieren der genomischen DNA, welche für den Inhibitor kodiert, aus dem Klon; und

e) Verbinden der genomischen DNA, oder von Fragmenten davon, mit funktionellen Elementen, um die DNA in einem Wirtsmikroorganisinus zu halten und zu exprimieren.

16. synthetische DNA-Sequenz, welche fähig ist, die mikrobielle Synthese eines Serinprotease-Inhibitors, welcher eine einzelne, unfragmentierte Polypeptidkette umfaßt, zu lenken, worin der Inhibitor mindestens eine aktive stelle besitzt, welche Serinprotease-Inhibitoraktivität besitzt und mindestens 40% Homologie zu einem aus Parotissekreten isolierten, nativen Serinprotease-Inhibitor aufweist, und wobei der native Serinprotease-Inhibitor die folgende Aminosäuresequenz besitzt:

17. DNA-Sequenz nach Anspruch 16, worin die DNA-Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus (1):

oder (2) Sequenzen, welche als Folge der Degeneriertheit des genetischen Codes äquivalent zu (1) sind.

18. Rekombinanter Vektor, umfassend die DNA-Sequenz nach Anspruch 16 oder 17.

19. Wirtszelle, welche mit dem rekombinanten Vektor nach Anspruch 18 transformiert ist.

20. Isolierte DNA-Sequenz, welche für einen Serinprotease- Inhibitor, umfassend eine einzelne, unfragmentierte Polypeptidkette mit der folgenden Aminosäuresequenz, kodiert:

21. DNA-Sequenz nach Anspruch 20, welche eine cDNA ist.

22. DNA-Sequenz nach Anspruch 20, welche eine genomische DNA ist.

23. Rekombinanter Vektor, umfassend die DNA-Sequenz nach Anspruch 20, 21 oder 22.

24. Wirtszelle, welche mit dein rekombinanten Vektor nach Anspruch 23 transformiert ist.

25. Verfahren zur Synthese eines rekombinanten Serinprotease-Inhibitors, umfassend eine einzelne, unfragmentierte Polypeptidkette, wobei ein solches Verfahren umfaßt:

a) Herstellen einer DNA-Sequenz, welche fähig ist, einen Wirtsmikroorganismus zur Herstellung eines Polypeptids, umfassend die Aminosäuresequenz:

zu lenken, oder eines Fragments der DNA, welches für ein Polypeptid mit mindestens einer aktiven Stelle, die Serinprotease-Inhibitoraktivität aufweist, kodiert;

worin

R&sub1; und R&sub7; gleich oder verschieden und ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus einem substituierten oder unsubstituierten Aminosäurerest oder Derivaten davon; und

R&sub2;, R&sub3;, R&sub4;, R&sub5;, R&sub6;, R&sub8; und R&sub9; gleich oder verschieden und ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Methionin, Valin, Alanin, Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan, Lysin, Glycin und Arginin,

b) Klonieren der DNA-Sequenz in einen Vektor, welcher fähig ist, in einen Wirtsmikroorganismus transferiert zu werden und darin zu replizieren, wobei ein solcher Vektor funktionelle Elemente für die DNA-Sequenz enthält;

c) Transferieren des Vektors, welcher die DNA-Sequenz und funktionellen Elemente enthält, in einen Wirtsmikroorganismus, welcher fähig ist, den Serinprotease-Inhibitor zu exprimieren;

d) Kultivieren des Wirtsmikroorganisinus unter Bedingungen, die für die Amplifizierung des Vektors und Expression des Inhibitors geeignet sind;

e) Gewinnen des Inhibitors; und

f) einen Schritt, worin der Inhibitor eine aktive Tertiärstruktur einnehmen kann, wodurch er Serinprotease-Inhibitoraktivität erhält.

26. Verfahren nach Anspruch 25, worin der Serinprotease- Inhibitor aus einer einzelnen, unfragmentierten Polypeptidkette die folgende Aminosäuresequenz umfaßt:

oder ein Fragment davon, wobei das Fragment mindestens eine aktive Stelle aufweist, die Serinprotease-Inhibitoraktivität besitzt.

27. DNA-Sequenz, welche fähig ist, die mikrobielle Synthese einer einzelnen, unfragmentierten Polypeptidkette zu lenken, worin das Polypeptid die Aminosäuresequenz umfaßt:

oder ein Fragment dieser DNA, welches ein Polypeptid mit mindestens einer aktiven Stelle, die Serinprotease- Inhibitoraktivität aufweist, kodiert, worin

R&sub2;, R&sub3;, R&sub4;, R&sub5;, R&sub6;, R&sub8; und R&sub9; gleich oder verschieden und ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Methionin, Valin, Alanin, Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan, Lysin, Glycin und Arginin.

28. DNA-Sequenz nach Anspruch 27, worin der Serinprotease- Inhibitor die folgende Aminosäuresequenz umfaßt:

oder eines Fragments davon, wobei das Fragment mindestens eine aktive Stelle besitzt, welche Serinprotease-Inhibitoraktivität aufweist.

29. Rekombinanter Vektor, umfassend die DNA-Sequenz nach Anspruch 27 oder 28.

30. Wirtszelle, welche mit dem rekombinanten Vektor nach Anspruch 29 transformiert ist.