DE3382821T2 - Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit der Proteasehemmenden Aktivität von Säugetier-alpha-1-Antitrypsin - Google Patents
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit der Proteasehemmenden Aktivität von Säugetier-alpha-1-AntitrypsinInfo
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Description
- Die Fähigkeit, die Expression fremder, d.h. exogener DNA in einzelligen Mikroorganismen zu erreichen, ergab die Möglichkeit, interessierende lange Polypeptidketten in geeigneter Weise herzustellen. Nahezu sofort wurden verschiedene Polypeptide, wie das kleine Hormon Somatostatin, und kompliziertere Polypeptide, wie Insulin, Interferone, Thymosin und eine Anzahl von Vakzinen mit Kapsidproteinen, hergestellt und in der Literatur beschrieben. Die Arbeit wurde anfänglich überwiegend am E. coli Bakterium durchgeführt, das das Ziel intensiver Untersuchungen war, weil Wissenschaftler mit vielen Aspekten seiner genetischen Struktur und seinen Eigenschaften vertraut waren. Somit richtete sich die anfängliche Aufmerksamkeit darauf, fremde Proteine in E. coli herzustellen. Nachdem die Fähigkeit, E. coli als Wirt zu verwenden, erst entwickelt worden war, legten die Beschränkungen und Nachteile des Einsatzes von E. coli die Verwendung anderer Wirte nahe.
- Ein Wirt, der als besonders attraktiv erschien, weil ihm viele Mängel von E. coli fehlen, ist Hefe. Jedoch ist Hefe ein Eukaryot und hat deshalb ein komplizierteres genetisches System. Ferner ist über das Hefe-Genom weniger bekannt als über E. coli. Um Hefe als Wirt für die Produktion hefefremder Proteine einzusetzen, sind noch eine Reihe von Entdeckungen erforderlich, und neue Materialien müssen zugänglich gemacht werden.
- Zuerst wurde ein Replikationssystem benötigt, das in Hefe stabil ist, entweder als extrachromosomales Element oder durch Integration in das Hefechromosom. Zusätzlich mußten die mit der Transkription und Expression verbundenen Regulationsfunktionen entwickelt werden, um die Expression des gewünschten Proteins zu ermöglichen. Es gab auch noch die Unsicherheit, ob fremde DNA-Sequenzen transkribiert und translatiert werden würden und, wenn sie exprimiert würden, ob die resultierenden Polypeptide in der Hefezelle überleben würden. Auch war noch der Effekt des fremden Proteins auf die Lebensfähigkeit der Hefezelle zu bestimmen, und ebenso der Effekt der rekombinanten DNA (RDNA) auf die Mitose, Sporenbildung und vegetatives Wachstum.
- Es gab deshalb wesentliche Anstrengungen um, neue RDNA- Systeme in Hefe zu entwickeln, die die regulierte Expression eines interessierenden Proteins wie auch die hocheffiziente Produktion dieses Proteins ermöglichen.
- Hitzemann et al J. Biol. Chem., 255:12073-12080 (1980) beschreibt ein Plasmid mit einem 3-Phosphoglyceratkinase- (PGK)-Gen und begleitenden Regulationssignalen, das zur Expression in Hefe in der Lage ist. Andere interessierende Referenzen umfassen Clifton et al., Genetics, 88:1-11 (1978); Clark und Carbon, Cell 9:91-99 (1976); Thomson, Gene, 1:347-356 (1977); Holland und Holland, J. Biol. Chem., 254:5466-5474 (1979); Holland und Holland, ibid, 254:9830-9845 (1979); Nasmyth und Reed, Proc. Nat. Acad. Sci., 77:2119-2123 (1980); Broach et al., Gene, 8:121-133 (1979) und Williamson et al., Nature, 283:214-216 (1980).
- In Zeichnungen zeigen
- FIG. 1A und 1B cDNA-Sequenzen zweier Formen von Humanalpha-1-Antitrypsin codierenden Genen;
- FIG. 2 die Restriktionskarten der Plasmide CTEA32 und CAT1 dar;
- FIG. 3 ein Schaubild des Elektrophoresechromatogramms, das gereinigtes, erfindungsgemäß hergestelltes alpha-1- Antitrypsin zeigt;
- FIG. 4 die Restriktionskarte des Plasmids C1/1;
- Fig. 5 die DNA-Sequenz der multiplen Restriktionsstelle von pUC13;
- FIG. 6 die Restriktionskarte des Plasmids pUCα1, das die DNA-Sequenz aus FIG. 1 enthält;
- FIG. 7 die Restriktionskarte des Plasmids HAT4.
- Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit der Proteaseinhibitoraktivität von Human-alpha-1-Antitrypsin mit den Schritten: Transformierung einer Hefekultur mit einem DNA-Transfervektor, wobei der Vektor ein Human-alpha-1-Antitrypsin-codierendes Segment und einen Promotor, der in der Lage ist, die Expression des Polypeptids in der Hefekultur zu steuern, umfaßt, sowie Wachsenlassen der Hefekultur unter Bedingungen, die zur Expression des Polypeptids geeignet sind.
- Die vorliegende Erfindung liefert ebenso ein Verfahren zur Überproduktion eines Polypeptids mit der Proteaseinhibitoraktivität von Human-alpha-1-Antitrypsin, mit den Schritten: Transformierung einer Hefekultur mit einem DNA-Transfervektor, wobei die Kultur Hefezellen umfaßt, die allelische Mutationen für GK-100 (ATCC 20669) Mutationen enthalten, wobei der Vektor ein Human-alpha-1-Antitrypsin-codierendes Segment und einen Promotor, der in der Lage ist, die Expression des Polypeptids in der Hefekultur zu steuern, umfaßt, sowie Wachsenlassen der Hefekultur unter Bedingungen, die zur Expression des Polypeptids geeignet sind.
- Bevorzugt umfassen die Zellen der Hefekultur den Mutantenstamm GK-100 (ATCC 20669). Der DNA-Transfervektor kann 2- Mikron Plasmid-DNA umfassen.
- Die vorliegende Erfindung liefert ebenfalls die Schritte zur Extraktion des produzierten alpha-1-Antitrypsin-Polypeptids und dessen Reinigung davon.
- Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann ebenfalls den Schritt umfassen, einen geeigneten Vektor zu verändern, so daß er das Human-alpha-1-Antitrypsin-codierende Segment enthält, um den DNA-Transfervektor zu bilden.
- Das nach der vorliegenden Erfindung hergestellte Polypeptid kann die Aminosäuresequenz von natürlich vorkommendem Human-alpha-1-Antitrypsin aufweisen. Das Polypeptid kann die vorherrschende Humanform von alpha-1-Antitrypsin sein.
- Die vorliegende Erfindung liefert ebenfalls ein unglykosyliertes Human-alpha-1-Antitrypsin, das im wesentlichen aus einem N-terminalen Methioninrest, gefolgt von der in FIG. 1A oder 1B von der Aminosäure 1 (Glu) bis zur Aminosäure 394 (Lys) gezeigten Aminosäuresequenz oder unglykosyliertem vollentwickeltem Human-alpha-1-Antitrypsin, wobei das alpha-1-Antitrypsin die biologische Aktivität der glykosylierten Form von Human-alpha-1-Antitrypsin besitzt. Diese Formen von unglykosyliertem Human-alpha-1-Antitrypsin können einem Wirt verabreicht werden, der ein alpha-1-Antitrypsin-Mangel besitzt oder zur Regulierung der proteolytischen Aktivität in einem Säugetierwirt. Insbesondere kann das alpha-1-Antitrypsin verabreicht werden, um durch Tabakoder anderen Rauch inaktiviertes alpha-1-Antitrypsin zu ersetzen.
- Promotoren zur Verwendung bei der Expression eines Polypeptids mit der Proteaseinhibitoraktivität von Human-alpha-1- Antitrypsin kann durch Einsatz einer Genbank mit großen DNA-Fragmenten erhalten werden. Durch Einführen der Fragmente in geeignete Vektoren, insbesondere Shuttle-Vektoren mit Replikationseinheiten für Prokaryoten und Hefe, kann die Hefe-DNA in einem Bakterium leicht amplifiziert und geklont werden und dann kann die Hefe-DNA in Mutantenhefezellen zur Komplementation eingeführt werden. Auf diese Weise können Hefefragmente identifiziert werden, die auxotrophe Läsionen oder Mutationen in einem Hefewirt komplementieren.
- Nachdem ein DNA-Segment mit dem gewünschten Transformationsgen in einer Hefewirtszelle etabliert wurde, kann man mit verschiedenen Techniken erneut klonen, um das DNA-Segment zu verkürzen und ein Segment zu liefern, das hauptsächlich das interessierende Gen in Verbindung mit seinen Regulationssignalen für die Transkription und Expression enthält.
- Um den Promotor zu erhalten, ist es wesentlich, daß der Initiator Methionin bestimmt und dieses Codon verwendet wird, um die Strategie zur Einführung der Fremd-DNA stromabwärts des Promotors zu entwickeln. Verschiedene Techniken können zur Schaffung einer Stelle für die Einführung der Fremd-DNA eingesetzt werden, so daß sie unter der Regulationskontrolle des Promotors steht.
- Wenn eine Restriktionsstelle geeigneterweise benachbart zum Initiatormethionin-Codon ist, kann das Gen an dieser Stelle gespalten werden und die DNA mit Ba131 für verschiedene Zeitspannen zurückverdaut werden, um in oder hinter das Initiatormethionin-Codon hinein zu verdauen oder das Initiatormethionin-Codon zu erhalten.
- Wenn keine geeignete Restriktionsstelle vorhanden ist, müssen andere Spleißtechniken wie Primer-Reparatur angewandt werden. Man kann auch durch Anwendung der in vitro Mutagenese eine Restriktionsstelle benachbart zum Initiatormethionin einführen, die die Anfangsaminosäuren des gewünschten Proteins kodiert. In jedem Fall wird ein linearisiertes DNA-Segment mit intaktem Promotor erhalten, das normalerweise andere DNA-Sequenzen wie ein intaktes Replikon, einen oder mehrere Marker und dergleichen enthält.
- Exemplarisch für das obige Vorgehen ist die Entwicklung eines Vektors mit dem Promotor für das TPI1-Gen. Ein exemplarischer Vektor CV13 mit sowohl den Replikons oder Replikationssystemen von pBR322 und 2µ-Plasmid von Hefe als auch dem LEU2-Gen wurde für die Insertion eines Hefefragments, von dem gezeigt wurde, daß es das TPI1-Gen enthält, verwendet. Dies wurde durch Einsatz der doppelten Selektion mit einer Mutant-Hefe, die leu&supmin;, tpi&supmin; war, erreicht. Es wurde gefunden, daß das TPI1-Gen eine einzige KpnI-Stelle besitzt. Der Vektor wurde an der KpnI-Stelle gespalten und dann mit der doppelstrangigen Exonuclease Ba131 für verschiedene Zeitspannen behandelt, um die DNA auf etwa das N- Formylmethionyl-Codon zurückzuverdauen. Dann wurden Linker insertiert, die die gewünschten Restriktionsstellen liefern. Fremd-DNA, die eine Sequenz mit einem N-Formylmethionyl-Codon besaß, konnte dann in der geeigneten Position zur Initiation insertiert werden. Alternativ kann die fremde DNA unter Verwendung des N-Formylmethionyl-Codons des TPI1-Gens exprimiert werden.
- Um Expression zu erreichen, wird ein extrachromosomales Konstruktionselement vorbereitet, das eine Anzahl an verschiedene Funktionen definierende Sequenzen besitzt. Eine Funktion ist das Replikationssystem, das einen Teil eines Vektors bildet. Eine andere Funktion ist selbst oder in Verbindung mit der Fremd-DNA ein Promotor. Andere Funktionen schließen Expressionsinitiatoren und -terminatoren ein. Es werden auch auswählbare Marker vorhanden sein.
- Obwohl es nicht notwendig ist, ist es üblich bei der Entwicklung eines geeigneten Vektors sowohl ein Replikationssystem für Hefe als auch ein Replikationssystem für einen Prokaryoten (ein Shuttle-Vektor) zu haben. Das Replikationssystem für Hefe kann eines sein, das die stabile Erhaltung eines extrachromosomalen Elements liefert oder eines, das eine ausreichende Lebensdauer der DNA im Wirt liefert, so daß es eine akzeptable Wahrscheinlichkeit für die Integration der DNA in den Wirt gibt. Die Integration kann stark unterstützt werden durch die Bereitstellung einer zur Wirts-DNA homologen Sequenz, um Rekombination zu ermöglichen. Im allgemeinen umfaßt die homologe Sequenz wenigstens 800 bp, üblicherweise nicht mehr als 2000 bp. Deshalb kann entweder Integration oder ein autonomes Replikationssystem, wie die Verwendung des ARS1-Gens, eingesetzte werden, um den Erhalt der Fremd-DNA im Hefewirt zu liefern. Das ausgewählte Replikationssystem sollte eine annehmbare Anzahl Kopien liefern, üblicherweise mehr als 1, bevorzugt mehr als 5. Eine große Vielfalt an Replikationssystemen sind für eine große Vielfalt an prokaryotischen Vektoren verfügbar, wie pBR322, pACYC184, pSC101, pMB9, etc. Alternativ können eine oder mehrere Kopien des DNA-Konstrukts in das Wirtschromosom integriert werden. Die Replikationssysteme können auch bedingt gesteuert werden, da sie üblicherweise temperaturabhängig sind, so daß die Replikation durch Veränderung der Temperatur ein- und ausgeschaltet werden kann.
- Zusätzlich zum Replikationssystem sind auch ein oder mehrere auswählbare Marker vorhanden, wobei in der Regel mindestens ein Marker zusätzlich zur Fremd-DNA vorhanden ist, der als Marker dienen kann. Herkömmliche Marker schließen biozide Marker ein, die zu Antibiotikaresistenz, und solche, die zu Resistenz gegen Gifte und Schwermetalle führen. Es ist ebenfalls nützlich, einen auxotrophen Wirt einzusetzen und durch Komplementation Prototrophie herbeizuführen. Zusätzlich zu den eben beschriebenen herkömmlichen Selektionssystemen sind die glykolytischen Gene der vorliegenden Erfindung besonders erwünschte Marker, da sie unter Verwendung von Zuckern als Selektionssubstraten Selektion in geeigneten Mutant-Wirtsstämmen liefern können.
- Andere Gene können ebenfalls in das extrachromosomale Element für eine Reihe von Zwecken insertiert werden. Wenn die Integration in das Genom des Wirts erwünscht ist, kann eine homologe Sequenz einer besonderen Region des Wirtsgenoms in das extrachromosomale Element eingefügt werden. Wo eine Amplifikation einer oder mehrerer Sequenzen erwünscht ist, können Gene, von denen bekannt ist, daß sie zu einer solchen Amplifikation führen, wie Dihydrofolat-Reduktase-Gene, die auf Methotrexat-Belastung reagieren, oder Metallothionein-Gene, die auf Schwermetallbelastung reagieren, flankiert von den zu wiederholenden DNA-Regionen, in das extrachromosomale Element eingebaut werden. Andere Regulationssignale, wie Zentromere, autonome Replikationssegmente, etc., können ebenfalls eingebaut werden.
- Um die interessierenden Promotoren zu isolieren, können Klone von chromosomaler Hefe-DNA durch Zufallsverdauung oder mechanisches Scheren des Hefegenoms hergestellt werden. Die Anwesenheit des gewünschten Gens wird dann durch Einführen eines homogenen Klons eines Hefefragments in einen auxotrophen Wirt zur Komplementation festgestellt. Wünschenswerterweise kann das Klonierungshilfsmittel ein anderes Gen enthalten, das eine zusätzliche Selektionsbasis bietet, so daß Doppelselektionstechniken eingesetzt werden können. Die Mutanten sind im wesentlichen unfähig, auf begrenztem Nährmedium zu wachsen, so daß durch Auswahl des Mediums auf das Vorhandensein des gewünschten glykolytischen Gens selektiert werden kann. Nach der Isolierung des Hefefragments mit dem gewünschten Gen, kann das Fragment subkloniert werden, um überflüssige flankierende DNA- Regionen zu entfernen und ein Fragment zur Verfügung zu stellen, das einfacher manipuliert werden kann. Das kleinere, das gewünschte Gen enthaltende Fragment, mit einer Größe von weniger als 500 Basenpaaren, kann dann weiter geklont, die Restriktionskarte erstellt und sequenziert werden, um eine brauchbare Quelle für die gewünschten Promotoren und Insertion der Fremd-DNA bereitzustellen. Wie angedeutet, können die Promotoren selbst nützlich sein, indem sie als Titer für einen Repressor oder einen Aktivator dienen, wenn es wünschenswert ist, die Produktion eines bestimmten Enzyms im Hefewirt zu modulieren. Die Fremd-DNA kann aus jeder Quelle stammen, sowohl natürlich vorkommende als auch synthetische, sowohl prokaryotische als auch eukaryotische. Von besonderem Interesse sind Säugetiergene, die Poly(aminosäure), das heißt Polypeptid oder Protein, das physiologische Aktivität besitzt, exprimieren. In variierendem Maße können in Hefe hergestellte Poly(aminosäuren) durch Glykosylierung modifiziert werden, wobei die Glykosylierung an vom natürlich vorkommenden Säugetierpolypeptid verschiedenen Stellen und/oder in verschiedenem Ausmaß mit verschiedenen Sacchariden auftritt oder nicht auftritt. Es ist deshalb von großem Interesse, in der Lage zu sein, Polypeptide herstellen zu können, die sich vom natürlich vorkommenden Polypeptid im Grad und der Art der Glykosylierung unterscheiden und sich in vielen Fällen auf eine oder mehrere Arten in den Aminosäuresequenzen unterscheiden, sei es durch Deletionen von ein oder mehreren Aminosäuren oder durch Substitutionen von ein oder mehreren Aminosäuren. Säugetiergene können von einer großen Anzahl von Säugetierquellen stammen, wie Haustieren (z.B. Rind, Schwein, Schaf und Pferd) und Primaten, z.B. Menschen und Affen.
- Ein das Gen für Human-alpha-1-Antitrypsin und ein Hefetriosephosphatisomerase-Promotorfragment enthaltendes DNA- Konstrukt wird beschrieben und hergestellt.
- Der Proteaseinhibitor hat dieselbe oder im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz von Human-alpha-1-Antitrypsin und ist in der Lage, eine Anzahl proteolytischer Enzyme zu inhibieren. Das Human-alpha-1-Antitrypsin-Gen scheint auf einem 9,6 kb EcoRI-DNA-Fragment im menschlichen Genom zu liegen. Die vollentwickelte mRNA scheint etwa 1400 Nucleotide zu enthalten. Eine Human-alpha-1-Antitrypsin-cDNA hat die in FIG. 1B gezeigte Sequenz. Die vorwiegende Form des Human-alpha-1-Antitrypsins ist in FIG. 1A gezeigt. Andere natürlich vorkommende Formen (Polymorphismus) sind bekannt.
- Die Sequenzierung von alpha-1-Antitrypsin (oder nachfolgend in der alternativen Schreibweise 'AT') codierender chromosomaler DNA wurde durch Kurachi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 78, 6826-6830 (1981) und Chandra et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 103, 751-758 (1981) beschrieben, deren Offenbarung hiermit durch Bezugnahme mitaufgenommen wird. Ein alpha-1-Antitrypsin-Primatengen kann durch von Chandra et al., ibid., beschriebene DNA-Klonierungsverfahren erhalten werden. Das die vorherrschende Form Human- alpha-1-Antitrypsin codierende Gen, isoliert aus einer menschlichen cDNA-Bibliothek unter Verwendung der Pavian- Sequenz als DNA-Hybridisierungssonde, ist in FIG. 1A gezeigt.
- Das Human-alpha-1-Antitrypsin hat eine BamHI-Restriktionsstelle, die das Abschneiden des Gens unter Entfernung der Information für eine einzelne Glutaminsäure vom vollentwikkelten Protein ermöglicht. Verschiedene Schemata können angewandt werden, um das Human-alpha-1-Antitrypsin-Gen benachbart zum glykolytischen Promotor einzuführen, so daß es unter dessen Steuerung steht. Wenn der Promotor keine geeignete Restriktionsstelle nahe dem N-Formylmethionyl-Codon besitzt, kann das glykolytische Gen aufgespalten und mit Ba131 zum Promotor zurückverdaut werden. Ein Linker kann dann stromabwärts vom Promotor eingeführt werden, um ein geeignetes kohäsives Ende oder glattes Ende zur Verbindung mit dem Human-alpha-1-Antitrypsin zu liefern. Der Linker kann ebenfalls ein oder mehrere Codons für Aminosäuren am N-terminierten Ende des alpha-1-Antitrypsin-Gens liefern, die gleich oder verschieden sein können von den natürlich vorkommenden Aminosäuren.
- Das Gen für Human-alpha-1-Antitrypsin kann dann stromabwärts vom glykolytischen Promotor in das extrachromosomale Element insertiert werden, wo das N-Formylmethionyl-Codon für die Initiation der Expression des Human-alpha-1-Antitrypsin vorgesehen ist.
- Zum Beispiel kann die alpha-1-Antitrypsin codierende cDNA in einen Expressionsvektor, wie CTEA32 (FIG. 2), insertiert werden, der den Hefepromotor für an der BamHI-Stelle des bifunktionellen Plasmids, CV13, eingefügte Triosephosphatisomerase (TPI) enthält [Broach J. R., Strathern J. N., Hicks J. B., Gene 8:121-133 (1979)]. Ein synthetischer DNA-Linker wurde mit einem TPI-Promotor ligiert, nachdem die TPI-Struktursequenzen durch BAL31-Verdauen von der KpnI-Restriktionsstelle in der TPI-codierenden Region, entfernt wurden. (Alber et al, J. Molec. Applied Genet., 1, 419-434 (1982)). Dieser DNA-Linker enthielt ein ATG-Codon zur Translationsinitiation, gefolgt von der Sequenz GAG- GATCC. Das GAG-Codon spezifiziert einen Glutaminsäurerest, der die erste Aminosäure des natürlich vorkommenden menschlichen ATs ist. Der GGATCC-Abschnitt des DNA-Linkers ist eine Spaltstelle für BamHI-Endonuclease und ermöglicht das Spleißen des Restes der menschlichen AT-DNA-Sequenz in diesen Vektor.
- Die BamHI-Stelle von CTEA32 wurde so konstruiert, daß sie "im Leseraster" mit dem Rest des AT-Strukturgens ist, was die Expression des Polypeptids erlaubt, wenn ein BamHI- Fragment von der geklonten cDNA geeignet in CTEA32 insertiert wird. Das aus CTEA32 und dem AT-Gen bestehende Plasmid wird als CAT1 (FIG. 2) bezeichnet.
- Dieses DNA-Konstrukt, das das stromabwärts zu einem Hefe- Triosephosphatisomerase (TPI)-Promotorfragment gelegene Gen für menschliches AT enthält, wurde in Hefestämme, N501-1B und GK100, transformiert. Die Transformation in Hefe ist bei Beggs, Nature, 275, 104-109 (1978) beschrieben. Screening der transformierten Hefestämme durch immunologische Assays (Vergleichsassays und ELISA-Assays, unter Verwendung von Antikörpern gegen alpha-1-Antitrypsin) bestätigte das Vorhandensein großer Mengen menschlichen ATs in aus dem Plasmid CAT1 hergestellter Hefe. Der "Standardtyp"-Hefestamm, N501-1B, (beschrieben von Kawasaki et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 108, 1107-1112 (1982)) produzierte, nach der Transformation mit CAT1, 1,8 mg alpha-1-Antitrypsin pro Gramm löslichen Proteins (oder 0,18% alpha-1- Antitrypsin), wenn er bei 30ºC auf einem synthetischen Minimalmedium (modifiziertes Wickerham Medium) mit 6% Glucose kultiviert wurde. Ein Mutant-Hefestamm, GK100, produzierte, nach der Transformation mit CAT1, 10-15 mg alpha-1-Antitrypsin pro Gramm löslichem Protein (oder 1-1,5% alpha-1- Antitrypsin) unter denselben Wachstumsbedingungen. Jeder der Stämme N501-1B und GK100 trägt ein defektes LEU2-Gen, das die selektive Erhaltung auf Minimal- und leucinfreiem Medium von CV13 und CV13-abstammenden Plasmiden (so wie CAT1) ermöglicht, wobei jedes ein funktionelles LEU2-Gen enthält. Bei Kultivierung auf Minimalmedien mit nur CV13 als Steuerung, produzierten N501-1B und GK100 kein nachweisbares AT. Somit kann AT spezifisch durch das CAT1- Plasmid produziert werden.
- Da GK100 signifikant mehr AT produziert als N501-1B, ist es bevorzugt. Jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht auf die AT-Produktion mittels GK100 beschränkt. Es kann wünschenswert sein, Mutationen von GK100 zu verwenden, was zu Hyperproduktion von AT führt.
- Eine Immunoadsorptionssäule, hergestellt nach dem Verfahren von Cuatrecasas, P., J. Biol. Chem., 245, 3059 (1970), wurde durch kovalentes Anhängen von affinitätsgereinigten Ziegenantikörpern auf menschliches AT an CNBr-aktivierter Sepharose hergestellt. Zerstörte GK100-Hefezellen wurden mit dem dreifachen Volumen einer phosphatgepufferten, 0,5 M NaCl enthaltenden Salzlösung mit pH 7,2 extrahiert und die Extrakte wurden auf die Säule gegeben. Hefeproduziertes menschliches AT (0,5-1,0 mg) wurde mit 3M NaSCN von der Säule eluiert. Nachdem das Material zur Entfernung von Salz dialysiert war, wurde es durch Elektrophorese auf einem Polyacrylamidgel in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat analysiert, wobei die Ergebnisse in FIG. 3 gezeigt sind. Basierend auf der relativen Migration des Proteins im Gel ist das genäherte Molekulargewicht von menschlichem in Hefe hergestelltem alpha-1-Antitrypsin 42.000-43.000 Dalton. Natürlich vorkommendes menschliches AT besitzt ein Molekulargewicht von ungefähr 54.000 Dalton mit einer Kohlenhydratzusammensetzung von ungefähr 16 Gew.-%, wie von Hodges et al., J. Biol. Chem., 254 8208-8212 (1979) gezeigt. Es scheint deshalb so, als ob das hefeproduzierte AT unglykosyliert oder im wesentlichen unglykosyliert ist und Kohlenhydratanteile fehlen, die im natürlich vorkommenden Protein vorhanden sind.
- Alternativ können auch andere Expressionsvektoren konstruiert werden, die ein alpha-1-Antitrypsin codierendes Segment enthalten. Solche Expressionsvektoren können durch dem Durchschnittsfachmann im Stand der Technik bekannte Verfahren unter Verwendung verfügbarer DNA-Konstrukte konstruiert werden. Ein bevorzugter Vektor ist das Plasmid C1/1, das stabiler ist als CV13- und von CV13 abgeleitete Vektoren, wie CAT1. C1/1 wurde aus dem Plasmid pJDB248 konstruiert (Beggs, J., Nature, 275, 104-109 (1978)). Die pMB9- Sequenzen wurden von pJDB248 durch teilweises Verdauen mit Eco RI entfernt und durch pBR322-DNA, die durch Eco RI zerschnitten wurde, ersetzt. Die Restriktionskarte von C1/1 ist in FIG. 4 angegeben. Das C1/1-Plasmid enthält die gesamte 2-Mikron-DNA der Hefe (S. cervisiae), mit einer pBR322-Insertion an einer EcoRI-Stelle. Es enthält ebenfalls das LEU2-Gen. Somit kann der Hefe-TPI-Promotor mit dem DNA-Linker an der einzelnen BamHI-Stelle des Tc -Gens von C1/1 insertiert werden. Dann kann die AT-Sequenz, angehängt an ein Transkriptionsterminatorfragment des Hefe-TPI- Gens, auf der BamHI-Seite stromabwärts vom TPI-Promotor insertiert werden. Das resultierende Plasmid HAT4 kann dann in N501-1B und GK100 in einer der oben beschriebenen Arten transformiert werden.
- Die Sequenz der ersten zehn Aminosäuren im hefeproduzierten AT kann durch Aminosäuresequenzanalyse zu den ersten zehn Aminosäuren des natürlich vorkommenden menschlichen ATs als identisch bestätigt werden:
- Das hefeproduzierte AT enthält nicht das Initiationsmethionin, das durch das ATG-Startcodon spezifiziert wird. Deshalb verbraucht die Hefezelle das Methionin, um die Aminosäuresequenz des natürlichen menschlichen ATS herzustellen.
- Die erfindungsgemäß hergestellten Polypeptide mit AT- Aktivität können bei der Behandlung eines genetischen AT- Mangels und anderen Krankheitsbildern, die mit einem unzureichenden AT-Spiegel zu tun haben, hilfreich sein. Somit können Zustände wie Emphyseme und andere mit fortschreitender Zersetzung einer Sacklunge verwandte Lungenkrankheiten, wie chronische pulmonale Obstruktionserkrankung oder Respirations-Distress-Syndrom bei Erwachsenen ebenfalls behandelt werden. Nichtgenetisch bedingte Emphyseme können ebenfalls behandelt werden, wie Emphyseme aufgrund starken Rauchens. Zustände, die nicht notwendigerweise mit den Lungen zu tun haben, können auch behandelt werden, wie Mukoviszidose oder Arthritis. Für eine Übersicht über AT-Mangel, siehe Gadek, J.E. und R. Crystal, "Alpha-1-Antitrypsin Deficiency", The Metabolic Basis of Inherited Desease", J.B. Stanbury, J.B. Wyngaarden, D.S. Fredrickson, McGraw-Hill, N.Y. S. 1450-67 (1982).
- Das alpha-1-Antitrypsin kann als Antigen zur Herstellung von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern für Humanalpha-1-Antitrypsin verwendet werden, zum Einführen in einen Wirt mit einem alpha-1-Antitrypsin-Mangel oder zur Modulation der proteolytischen Aktivität in einem Säugetierwirt. Insbesondere kann das alpha-1-Antitrypsin Menschen verabreicht werden, um alpha-1-Antitrypsin zu ersetzen, das durch Tabak- oder anderen Rauch inaktiviert (oxidiert) wurde.
- Die erfindungsgemäßen Polypeptide können mit herkömmlichen pharmazeutischen Trägern gemischt werden. Vorzugsweise werden die Polypeptide intravenös oder durch Inhalation verabreicht. Obwohl die Dosierungen entsprechend der Schwere des Falls und dem Gewicht des Patienten variieren können, können Dosierungen im Bereich von 0,5-10,0 g/Woche eines intravenös zugeführten Polypeptids in vielen Fällen wirkam sein. Niedrigere Dosierungen können wirksam sein, wenn sie inhalatorisch verabreicht werden. Orale Verabreichung kann ebenfalls wirksam sein, vorausgesetzt daß das AT in Kapseln oder beschichteten Trägern vor dem vorzeitigen Abbau im Verdauungstrakt geschützt ist.
- Die folgenden Beispiele 1, 2 und 3 sind keine spezifischen Beispiele der vorliegenden Erfindung. Sie beschreiben Versuche, um die Transformation von Hefezellen mit Vektoren, die die Human-alpha-1-Antitrypsin codierende Sequenz enthalten können, zu demonstrieren. Die Beispiele 4, 5 und 6 sind Beispiele der vorliegenden Erfindung.
- Stämme. Isogene Stämme, die Mutationen in PGI1, PGK1, GPM1, PYK1 und GCR1 tragen, werden durch Ethylmethansulfonat(EMS)-Mutagenese von S. cerevisiae (S. c.) X2180-1A (MATa SUC2 CUP1 gal2, vom Berkeley Yeast Stock Center) erhalten. 35.000 unabhängige Kolonien wurden auf YEP-3% Glycerol-2% Ethanol kultiviert und durch Replikaplattierung auf die Unfähigkeit auf YEP-4% Dextrose zu wachsen gescreent (Tabelle 1).
- Die Identifikation spezifischer Läsionen wurde durch Komplementationstest mit bekannten Glykolysemutanten durchgeführt (Ciriacy und Breitenbach, J. Bacteriol., 139:152-160 (1979)), wobei mindestens 15 zusätzliche Komplementationsgruppen durch artenkreuzende Mutantenstämme gefunden wurden. Enzymassays (Clifton et al., Genetics, 88:1-11 (1980)) bestätigten die glykolytischen Defekte in den pgi1-, pgk1-, gpm1-, pyk1- und gcr1-Mutanten.
- Ein LEU2-Mutant wurde ebenso aus S. cerevisiae X2180-1A durch EMS-Behandlung erhalten und mit X2180-1B (einem isogenen MATα-Stamm) gekreuzt, um N501-1B (MATα leu2 SUC2 CUP1 gal2) zu erzeugen. Cycloheximid- (cyh2) und Canavanin(can1) -Resistenzen wurden dann als spontane Mutationen in N501-1B selektiert. Die Glykolysemutanten wurden mit N501- 1B gekreuzt, um eine Reihe von isogenen leu2-Stämmen zu erzeugen, wobei jeder in einer einzelnen glykolytischen Funktion oder in GCR1 defekt war.
- Ein tpi1-Mutant S. cerevisiae GLU77 wurde mit N551-1A (MATa leu2 SUC2 CUP1 gal2) gekreuzt; aus dieser Paarung erhaltene Stämme wurden zweimal mit N501-1B gekreuzt, um einen tpi1 leu2-Stamm, N587-2D, zu erhalten, der hinsichtlich des genetischen Hintergrunds den anderen Glykolysemutanten ähnelte.
- Mutationen in drei glucosephosphorylierenden Enzymen erzeugte einen Stamm, der auf Dextrose als einziger Kohlenstoffquelle nicht wachsen kann, und der gegen katabolische Repression durch 2-Deoxyglucose und Glucosamin resistent ist. N517-6C (hxk1 hxk2 glk1 leu2 can1-100 cyh2 ade2-1) wurde aus einem hxk1 hxk2 glk1-Stamm, D308.3, durch Screenen nach glucosaminresistenten Sporenkolonien erhalten. Defekte in den Glucosekinaseaktivitäten wurden durch Assay bestätigt. Tabelle 1
- Komplementationsgruppen von glu&supmin;-Derivaten von X2180-1A
- 27 sterile glu&supmin;-Stämme
- 35.000 gescreente Kolonien (EMS mutagenisierte für 50% Tötung)
- Der haplomonözische diploide Stamm S. c. AB320 war die Quelle des Hefe-DNA-Pools (Nasmyth und Reed, Proc. Nat. Acad. Sci., 77:2119-2123 (1980)) und wurde als Kontrolle in einigen Versuchen verwendet.
- Das Triosephosphatisomerasegen (einschließlich der Upstream-Sequenz mit den Regulationssignalen) ist wie folgt:
- Die Upstream-Sequenz des Pyruvatkinasegens mit den Regulationssignalen ist wie folgt:
- Die leu2-Glykolysemutanten wurden mit einem in pYE13 insertierten Hefe-DNA-Pool transformiert, einem ein selektierbares LEU2-Standardtyp-Gen tragendes Plasmid mit hoher Kopienzahl (Broach et al., Gene, 8:121-133 (1979)). Die glykolytischen Gene wurden durch Komplementation unter Einbeziehung der Simultan-Selektion für Wachstum auf Glucose und Leucin-Prototrophie erhalten. Ein synthetisches Medium wurde verwendet, das Hefestickstoffbase, 4% Glucose und die folgenden Zusätze enthielt: pro Liter 40 mg Adenin, 20 mg Arginin, 50 mg Aspartat, 10 mg Histidin, 60 mg Isoleucin, 40 mg Lysin, 10 mg Methionin, 60 mg Phenylalanin, 50 mg Threonin, 40 mg Tryptophan, 50 mg Tyrosin, 20 mg Uracil und 60 mg Valin.
- Die Transformanten wurden aufleucinfreien Medien gereinigt und dann auf einem nicht-selektiven Medium (YEPGE) kultiviert, um die mitotische Segregation der Plasmide zu ermöglichen. Stämme, die leu2- und Glykolysemutanten-Phenotypen cosegregierten, wie durch Replikationsplattierung auf Selektivmedien bestimmt, wurden auf glykolytische Enzymaktivitäten getestet. Hefe-DNA-Präparate wurden hergestellt und der E. coli-Stamm RR1 wurde mit Selektion auf Ampicillin- Resistenz transformiert, um das Vorhandensein von Plasmid- DNA in diesen glykolytischen Hefetransformanten nachzuweisen.
- Die transformierten Hefestämme wurden selektiv auf Minimalmedium mit 8% Glucose (Adenin wurde bis auf eine Endkonzentration von 50 mg/l zugegeben) kultiviert. Die Standardtyp-Kontrolle N501-1B wurde auf demselben Medium plus Leucin (100 mg/l) kultiviert. Die Glykolyse- Mutantenstämme wurden auf YEP-5% Glycerin-1%-Lactat kultiviert. Über Nacht wurden die Kulturen mit frischen Medien versorgt und aerobisch bei 30ºC 4 Stunden lang kultiviert, bevor sie geerntet wurden. Die Zellen wurden zweimal mit Wasser gewaschen und mit 50 mM K&sub2;HPO&sub4;, 2mM EDTA, 3mM 2- Mercaptoethanol (mit HCl auf einen pH von 7,4 eingestellt) resuspendiert. Extrakte wurden durch Verwirbelung der Zellen mit einem gleichen Volumen Glasperlen (0,45 mm Durchmesser) bei hoher Geschwindigkeit für zwei Minuten erhalten. Die Zellbruchstücke wurden durch Zentrifugieren in einer Mikrozentrifuge für 15 Minuten bei 4ºC entfernt. Enzyme wurden wie von Clifton und Breitenbach, siehe oben, beschrieben, getestet. Proteinkonzentrationen wurden durch das Biuret-TCA-Verfahren bestimmt.
- Um die Aktivität der verschiedenen glykolytischen Gene in den Transformanten zu bestimmen, wurden die verschiedenen Enzyme getestet und die Ergebnisse der Transformanten mit Mutanten- und Standardtyp-Stämmen verglichen. Der gcr1- Mutant hatte 5-10% der Standardtyp-Niveaus bei den meisten glykolytischen Aktivitäten (veranschaulicht durch PGI, Aldolase und Enolase) und wuchs sehr schlecht auf Glucosemedien. Demgegenüber hatten die GCR1-Transformanten nahezu Standardtyp-Niveaus der Enzyme und waren beim Wachstum auf Glucosemedien praktisch indentisch mit dem Standardtyp. Die anderen glykolytischen Mutanten hatten weniger als 5% der normalen Niveaus der entsprechenden Enzymaktivitäten. Wenn sie jedoch mit einem komplementierenden Plasmid hoher Kopienzahl transformiert wurden, wurden die spezifischen Enzymaktivitäten wesentlich über die Standardtyp-Niveaus angehoben (typischerweise 5-10fach höher). Die nachfolgende Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse. Tabelle 2 Vergleich der glykolytischen Aktivitäten im Standardtyp, Mutanten und transformierte Stämme
- aStandardtyp ist N501-1B.
- cDie jeweiligen Mutantenstämme sind N543-9D (pgi1 leu2), N587-2D (tpi1 leu2) , N548-8A (pkg1 leu2), N583-2C (gpm1 leu2) und N549-3A (pyk1 leu2).
- cDie Aktivitäten der Transformanten sind Mittelwerte vieler verschiedener Isolate. Die Zahlen in Klammern geben die Anzahl der durch Assay untersuchten unabhängigen Transformanten an.
- Der gcr1 leu2 Mutantenstamm ist N525-2C.
- Um zu demonstrieren, daß die Überproduktion glykolytischer Enzyme spezifisch für den Mutationsdefekt, der durch das besondere Plasmid komplementiert wird, war, wurden Assays für zehn verschiedene glykolytische Proteine an den verschiedenen Transformanten durchgeführt. Die nachfolgende Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse für einen Transformanten für jedes der sechs verschiedenen Glykolysegene, die im Detail untersucht wurden. Relative Enzymaktivitäten des Standardtyps und der Tranformanten Glykolytische Enzyme
- Der GCR-8-Transformant ergab nahezu die Niveaus des Standardtyps bei allen zehn Enzymen, während die PGI-19, TPI- 10, PKG-2, GPM-2 und PYK-1-Transformanten ihre jeweiligen glykolytischen Proteine überproduzierten, nicht jedoch die anderen Enzyme.
- Es wurde festgestellt, daß die Plasmide selbst unter selektiven Druck durch Leucin-Prototrophie bereitwillig segregierten (typischerweise 5-50% Segregation in vollentwickelten Kulturen), so daß die getesteten Kulturen möglicherweise Zellen mit einer ganzen Anzahl an Plasmiden enthalten. Durch Komplementation mit E. coli und/oder Sequenzierung wurde gezeigt, daß TPI1 und PYK1 beide das strukturelle Gen sind.
- Die Exploitation des Promotor für TPI1 zur Herstellung von Human-alpha-1-Antitrypsin wurde wie folgt demonstriert. Das Plasmid CV13 wurde eingesetzt. CV13 kann durch Selektion von Hefe mit einem Durchschnitt von etwa zehn Kopien pro Zelle erhalten werden. CV13 beinhaltet pBR322, dem Replicon für das 2µ-Plasmid und dem Hefe-LEU2-Gen. Das TPI1-Promotorfragment wurde durch Schneiden des TPI1-Gens an der einzelnen KpnI-Stelle (Basen 511 bis 518) erhalten; und die resultierende linearisierte DNA wurde dann mit Bal31 für vier bis fünf Minuten behandelt, um die TPI1-Struktursequenzen zu entfernen. Dann wurden Linker, entweder EcoRI, Hind III oder BamHI insertiert. Die Linker werden dann durch das geeignete Restriktionsenzym aufgespalten, um kohäsive Enden zur Insertion von Human-alpha-1-Antitrypsin- Genen zur Verfügung zu stellen. Das Human-alpha-1-Antitrypsin-Gen wurde mit BamHI verdaut, das am 5'-Ende des codierenden Strangs aufgespalten, um die Information für ein einzelnes Glutaminsäurecodon vom vollentwickelten Protein zu entfernen. Vier verschiedene Konstrukte wurden hergestellt, wie in der nachfolgenden Tabelle 4 ausgeführt. Aus dieser Tabelle ist ersichtlich, daß das Glutaminsäurecodon durch die Codons für Alanin und Prolin in drei der das Initiatormethionin enthaltenden Konstrukte ersetzt wurde.
- Nach der Ligation der Human-alpha-1-Antitrypsin-Konstruktion in das CV13-Plasmid, wurde das resultierende Plasmid in S. c. N501-1B transformiert. Die resultierenden Hefezellen wurden dann auf einem synthetischen Minimalmedium kultiviert. Tabelle 4
- *Rest von ungefähr 400 Aminosäuren von Human-alpha-1- Antitrypsin
- Hefezellen, die die Human-alpha-1-Antitrypsin-Gene enthielten, wurden durch Verwirbelung mit Glasperlen (0,45 mm) bei hoher Geschwindigkeit für 2-3 Minuten aufgebrochen. Der Extraktionspuffer enthielt 50 mM K&sub2;HPO&sub4;, 2mm EDTA, 2mm 2- Mercaptoethanol und 1mM PMSF (pH 7,4). Zellbruchstücke wurden durch Zentrifugieren entfernt, und die Extrakte enthielten 3-4 mg/ml Protein, wie durch Lowry-Assays bestimmt wurde.
- Die Gegenwart von Human-alpha-1-Antitrypsin wurde unter Verwendung einer RIA, unter Einsatz von tritiummarkiertem Human-alpha-1-Antitrypsin und gegen das Protein gerichteten Antikörpern, bestimmt. Die nachfolgende Tabelle 5 zeigt die Ergebnisse. Tabelle 5 Verdrängungsassay für alpha-1-Antitrypsin
- *Plasmide wurden in einem Hefestamm, N501-1B, gezüchtet. 100 µl der Extrakte wurden untersucht.
- **Nicht-radioaktives alpha-1-Antitrypsin gemischt mit 100 µl Hefeextrakt (330 µg Protein)
- Es ist aus den obigen Ergebnissen ersichtlich, daß ein immunologisch aktives Produkt erhalten wurde, das in der Lage ist, mit natürlich vorkommendem Human-alpha-1-Antitrypsin um Antikörper für das natürliche Protein zu konkurrieren.
- Des weiteren wird die Expression des alpha-1-Antitrypsin- Gens durch den TPI-Promotor gesteuert, da festgestellt werden kann, daß, wenn ein Teil des TPI-Promotors entfernt wird, kein alpha-1-Antitrypsin produziert wird. Zusätzlich wurde die Produktion des Säugetierproteins Human-alpha-1- Antitrypsin in der obigen Studie nicht optimiert, so daß die Ergebnisse eine Minimalproduktion des Produkts, die weiter verbessert werden kann, darstellen. Somit wurde gefunden, daß der TPI-Promotor ein wirksamer Promotor für die effiziente Erzeugung hoher Ausbeuten an exprimiertem Produkt an Fremd-DNA ist.
- Eine Immunoadsorptionssäule wurde durch kovalentes Anhängen von affinitätsgereinigten Antikörpern für Human-alpha-1- Antitrypsin an CNBr-aktivierte Sepharose gemäß dem Verfahren von Cuatrecasas, J. Biol. Chem., 245, 3059 (1970) hergestellt. Zerstörte GK100-Zellen wurden mit dem dreifachen Volumen einer phosphatgepufferten, 0,5 M NaCl enthaltenden Salzlösung mit pH 7,2 extrahiert und auf die Säule gegeben. Die Säule wurde mit 3M NaSCN eluiert und das gewonnene Material wurde durch Elektrophorese auf einem Polyacrylamidgel in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat analysiert. Die Ergebnisse der Elektrophorese sind in FIG. 3 gezeigt. Spur 1 enthielt eine Mischung von Molekulargewichtsstandards: a) Phosphorylase B, 97.000 Dalton; b) Rinderserum Albumin (BSA), 65.000 Dalton; c) Ovalbumin, 43.500 Dalton; carbonische Anhydrase, 30.000 Dalton; e) Sojabohnen-Trypsininhibitor, 20.000 Dalton und f) alpha-Lactalbumin, 14.000 Dalton. Spur 3 enthielt hefeproduziertes AT, gereinigt durch Immunoadsorption, mit einem Molekulargewicht von ungefähr 42.000 Dalton. Spur 7 ist eine Probe natürlich vorkommenden stark durch Blutproteine verunreinigten ATs, vertrieben von der Sigma Chemical Company. Ein Hauptbestandteil von Spur 7 ist Human-alpha-1-Antitrypsin, Molekulargewicht 54.000 Dalton.
- Als Kontrolle wurden 10 Mikroliter (1 Mikrogramm) einer Lösung von 100 Mikrogramm/ml Trypsin, 100 Mikrogramm (100 Mikroliter) Rinderserum Albumin und 100 Mikroliter 0,05 molarem TRIS, pH 8,0 Puffer, 1 mM Benzoylarginioyl-p-nitroanilid enthaltend, gemischt und die Zunahme der Absorption bei 405 nm wurde mit der Zeit in einem Spektrophotometer gemessen. Der Absorptionswert dieser Lösung wurde als Standard für 100%ige Trypsinaktivität verwendet. Drei zusätzliche Proben wurden als Duplikate untersucht, wobei jede 1 µl Trypsin und jeweils 25 µl AT-Lösung plus 175 µl Puffer, 100 µl alpha-1-Antitrypsin plus 100 µl Puffer und 200 µl alpha- 1-Antitrypsin enthielt. Alle Proben enthielten gleiche Konzentrationen Substrat und Rinderserum Albumin. Die Ergebnisse zeigten, daß bei Verwendung von 25 Mikroliter AT 73% der Trypsinaktivität erhalten blieb, mit 100 Mikroliter AT 41% der Trypsinaktivität erhalten blieb und mit 200 Mikroliter alpha-1-Antitrypsin 26% der Trypsinaktivität erhalten blieb. Dies zeigte, daß durch Erhöhung des Niveaus des hefeerzeugten AT auch die Trypsininhibitoraktivität erhöht wurde.
- Erhöhte AT-Niveaus können durch Verwendung von C1/1, einem Plasmid, das genetisch stabiler ist als CV13, erhalten werden. Das C1/1-Plasmid enthält die gesamte 2-Mikron-DNA von S. cerevisiae und kann deshalb seine eigene Replikation unterstützen und bleibt in Hefe bei Abwesenheit der Selektion eines genetischen Markers erhalten. Auch hat C1/1-Plasmid besitzt eine einzelne BamHI-Stelle, die sich auf dem Tc - Gen befindet. C1/1-tragende Transformanten können in E. coli durch Ampicillin- oder Tetracyclin-Resistenz und in Hefe durch Leucinprototrophie selektiert werden. C1/1 enthält an einer EcoRI-Stelle der 2-Mikron-DNA insertiertes pBR322 und trägt das von J. Beggs, Nature, 275 104-109 (1978) beschriebene LEU2-Gen.
- Der Hefe-TPI-Promotor (aus CTEA32) mit dem synthetischen DNA-Linker (oben beschrieben) wurde als ein Bg1 II-BamHI- Fragment (ungefähr 900 Basenpaare) an der BamHI-Stelle des C1/1 insertiert. Diese Insertion erzeugte eine einzelne BamHI-Stelle, an der das Human-AT-Gen zur Expression in Hefe eingespleißt werden konnte. Wenn das AT-Gen (FIG. 1A) insertiert ist, besitzt das resultierende Plasmid, wie in CAT1-Plasmid, ein ATG-Initiationscodon, gefolgt von einem GAG (Glutaminsäurecodon), das die Produktion der voll entwickelten Human-AT-Proteinsequenz in Hefe ermöglicht. Ungefähr 700 Basenpaare der 3'-Flankenregion des Hefe-TPI- Gens wurden nach der Human-AT-Sequenz eingefügt, um bei der Transkriptionstermination zu helfen. Die "Terminations"- Fragmente sind Sequenzen von den XbaI- zu den EcoRI-Stellen im Plasmid TPIC10 (T. Alber und G. Kawasaki, J. Molec. Applied Genet., 1, 419-434 (1982)).
- Die Hefe-Terminationssequenzen wurden unter Verwendung des Vektors pUC13, der multiple Klonierungsstellen besitzt, an denen der Terminator und AT-DNAs getrennt voneinander insertiert werden können, an das Human-AT-Gen angehängt. Das pUC13-Plasmid wurde wie in Vieira, J., und Messing, J., Gene, 19, 259-268 (1982) für die Vektoren pUC8 und pUC9 beschrieben, aufgebaut. Das pUC13-Plasmid enthielt am Anfang des lac-z-Gens multiple Restriktionsstellen, gezeigt in FIG. 5. Um das Human-AT-Gen mit dem TPI-Transkritptionsterminator zu verbinden, wurde der AT-cDNA-Klon (FIG. 1) als ein PstI-Fragment an einer einzelnen PstI-Stelle in pUC13 insertiert. Dem AT-Gen folgte in der multiplen Klonierungssequenz eine XbaI-Stelle und eine EcoRI-Stelle. Zwischen diesen XbaI- und EcoRI-Stellen von pUC13 wurde der Hefe-TPI-Terminator als ein 700 Basenpaare XbaI-EcoRI- Fragment von pTPIC10 insertiert. Das resultierende Plasmid pUCα1+FG1 enthielt ein Human-AT-Gen mit einem Hefe-Transkriptionsterminator (siehe FIG. 6). Ein synthetischer Eco- RI-BamHI-DNA-Linker wurde dann an die EcoRI-Stelle des Plasmids addiert, um eine BamHI-Stelle am 5'-Ende des Hefe- Terminators zu erzeugen. Durch Verwendung dieses DNA- Linkers konnte die Human-AT-Hefe-Terminationssequenz durch Schneiden mit BamHI entfernt werden, um ein Fragment mit ungefähr 2100 Basenpaaren freizusetzen. Dieses BamHI- Fragment wurde in das den TPI-Promotor mit dem BamHI-DNA- Linker enthaltende C1/1-Plasmid insertiert. Das resultierende Plasmid HAT4 besitzt den TPI-Promotor, den ATGGAG- GATCC-DNA-Linker, das Human-AT-Gen (von der BamHI-Stelle) und den TPI-Terminator, insertiert in C1/1. Die Topologie von HAT4 ist in FIG. 7 dargestellt.
- HAT4 wurde in N501-1B und GK100 transformiert. Auf Minimalmedium mit 6% Glucose war 2-3% des löslichen Hefeproteins alpha-1-Antitrypsin bei einer Zelldichte von fast 3 g pro Liter (Feuchtgewicht) . Weil HAT4 C1/1 enthielt, war dieses Plasmid in einer Vielzahl reicher Medien einschließlich YEPD (1% Hefeextrakt, 2% Pepton und 2% Glucose) haltbar. Auf reichen Medien wurde immer noch 2-3% AT produziert, aber bei einer höheren Zelldichte von 10-20 g pro Liter (Feuchtgewicht). Das HAT4-Plasmid wurde ohne Selektion in N510-1B für über 30 Teilungen auf reichen Medien gehalten, wobei mehr als 70% der Zellen das Plasmid enthielten. Bei GK100 hatten mehr als 95% der Zellen nach 30 Teilungen auf reichen Medien HAT4. Die Vorteile der Verwendung von HAT4 gegenüber CAT1 waren 1) größere Plasmidstabilität, 2) höhere AT-Niveaus als Prozentsatz an Gesamtprotein, 3) viel größere Ausbeuten an Zellen pro Liter aufgrund der Verwendung reicher Medien und 4) geringere Kosten reicher Medien gegenüber synthetischen (leucinfreien) Medien. Der Hefemutantenstamm GK100 wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, mit der ATCC-Nr. 20669 hinterlegt.
- Es ist aus den obigen Ergebnissen offensichtlich, daß Hefepromotoren effizient zur Herstellung fremder Proteine durch Steuerung der Expression von Fremd-DNA in Hefe eingesetzt werden können. Es wurde gefunden, daß die Promotoren starke Promotoren sind, so daß sie eine hohe Expressionsrate liefern. Darüber hinaus scheinen die Botenstoffe ausreichend stabil zu sein, um einen signifikanten Translationsgrad in das gewünschte Expressionsprodukt zu ermöglichen. Des weiteren kann die Expression der Fremd-DNA durch den Einsatz der glykolytischen Promotoren und geeigneter Nährmedien moduliert werden. Auf diesem Wege kann die Herstellung der Fremd-DNA ein- und ausgeschaltet werden. Somit liefert der Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Verwendung von Hefe als wirksamem Wirt bei der Herstellung fremder Proteine, wobei die Herstellung moduliert werden kann. Zusätzlich kann eine Vielzahl von glykolytischen Promotoren durch Verwendung der glykolytischen Regulationsgene ein und ausgeschaltet werden.
Claims (12)
1. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit der
Proteaseinhibitoraktivität von Human-alpha-1-Antitrypsin mit
den Schritten: Transformierung einer Hefekultur mit einem
DNA-Transfervektor, wobei der Vektor ein Human-alpha-1-
Antitrypsin-codierendes Segment und einen Promotor, der
in der Lage ist, die Expression des Polypeptids in der
Hefekultur zu steuern, umfaßt, sowie Wachsenlassen der
Kultur unter Bedingungen, die zur Expression des
Polypeptids geeignet sind.
2. Verfahren zur Überproduktion eines Polypeptids mit der
Proteaseinhibitoraktivität von Human-alpha-1-Antitrypsin,
mit den Schritten: Transformierung einer Hefekultur mit
einem DNA-Transfervektor, wobei die Hefekultur Hefezellen
umfaßt, die allelische Mutationen für GK-100 (ATCC 20669)
Mutationen enthalten, wobei der Vektor ein Human-alpha-1-
Antitrypsin-codierendes Segment und einen Promotor, der
in der Lage ist, die Expression des Polypeptids in der
Hefekultur zu steuern, umfaßt, sowie Wachsenlassen der
Kultur unter Bedingungen, die zur Expression des
Polypeptids geeignet sind.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, in dem die
Hefezellen Zellen des Mutantenstamms GK-100 (ATCC 20669)
umfassen.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, in dem der
Vektor 2 Mikron Plasmid-DNA umfaßt.
5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche mit den
weiteren Schritten: Extrahieren des Polypeptids aus der
Kultur und Reinigen des Polypeptids.
6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche mit dem
weiteren Schritt: Verändern eines geeigneten Vektors
derart, daß er daß für Human-alpha-1-Antitrypsin codierende
Segment enthält, um den DNA-Transfervektor zu bilden.
7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, in dem
das Polypeptid die Aminosäuresequenz von natürlich
vorkommendem Human-alpha-1-Antitrypsin aufweist.
8. Verfahren nach Anspruch 7, in dem das Polypeptid die
vorherrschende Humanform von alpha-1-Antitrypsin ist.
9. Unglykosyliertes Human-alpha-1-Antitrypsin, im
wesentlichen bestehend aus einem N-terminalen Methioninrest,
gefolgt von der Aminosäuresequenz, die in Figur 1A oder 1B
von Aminosäure 1 (Glu) bis zur Aminosäure 394 (Lys)
gezeigt ist.
10. Unglykosyliertes, vollentwickeltes
Human-alpha-1-Antitrypsin mit der biologischen Aktivität der glykosylierten
Form von Human-alpha-1-Antitrypsin.
11. Unglykosyliertes Human-alpha-1-Antitrypsin nach Anspruch
9 oder Anspruch 10 zur Einführung in einen Wirt mit
alpha-1-Antitrypsin-Mangel oder zur Regulierung der
proteolytischen Aktivität in einem Säugetierwirt.
12. Unglykosyliertes Human-alpha-1-Antitrypsin nach Anspruch
9 oder Anspruch 10 als Ersatz für durch Tabak und anderen
Rauch inaktiviertes alpha-1-Antitrypsin.
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