DE69121192T2 - Hirudinmutante, deren herstellung, antikoagulans, sekretorischer vektor, durch besagten vektor transformierter mikroorganismus und herstellung eines produkts durch besagten mikroorganismus - Google Patents
Hirudinmutante, deren herstellung, antikoagulans, sekretorischer vektor, durch besagten vektor transformierter mikroorganismus und herstellung eines produkts durch besagten mikroorganismusInfo
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Description
- Hirudin-Analogon, Verfahren zu dessen Herstellung und gerinnungshemmendes Mittel.
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Hirudin-Analogon, eine für dieses Hirudin-Analogon kodierende DNA-Sequenz, ein Verfahren zur Herstellung dieses Hirudin-Analogons unter Verwendung der DNA-Sequenz und ein gerinnungshemmendes Arzneimittel.
- Das in der vorliegenden Erfindung beschriebene neue Hirudin-Analogon ist aufgrund seiner verglichen mit bekanntem Hirudin-HV1 stärkeren Antithrombinwirkung und geringeren Neigung, Blutung hervorzurufen, als gerinnungshemmendes Mittel geeignet.
- Hirudin ist ein gerinnungshemmender Faktor, der von den Speicheldrüsen medizinischer Egel, Hirudo medicinalis, ausgeschieden wird und ist ein Gemisch aus Peptiden mit 65 und 66 Aminosäuren. Die Hirudinstruktur wurde von Dodt et al. [FEBS Lett. 165, 180 (1984)] als Hirudinvariante 1 (HV1) ermittelt. Eine weitere Variante Hirudin HV2 [Harvey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 1084 (1986)] weist, verglichen mit Hirudin HV1, neun verschiedene Aminosäuren auf und eine andere Variante Hirudin HV3 [Dodt et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 367, 803 (1986)] weist, verglichen mit HV2, zehn verschiedene Aminosäuren auf, wobei sie bis Ser³² dieselbe Sequenz wie HV2 und eine Aminosäure (Ala&sup6;³) im C-terminalen Bereich inseriert aufweist. Die Strukturen dieser drei Hirudinvarianten sind in Fig. 1 dargestellt.
- Diese natürlichen Varianten umfassen 65 oder 66 Aminosäuren und zwei Domänen sind erkennbar. Dieses sind der sphärisch ausgebildete N-terminale Bereich mit drei Disulfidbindungen und der saure C-terminale Bereich, der Homologie mit dem Thrombin-Spaltbereich des Prothrombinmoleküls, oder der Homologie mit dem Thrombin-Spaltbereich des Prothrombinmoleküls, oder mit dem Fibrinogenspaltbereich aufweist.
- Die Erfinder haben erkannt, daß HV1 Leu&sup6;&sup4;-Gln&sup6;&sup5; enthält, während HV3 Asp&sup6;&sup5;-Glu&sup6;&sup6; im C-terminalen Aminosäurebereich enthält. Es wurde eine Patentanmeldung (Japanische Offenlegungsschrift 3-164184 (1991)] in bezug auf die Synthese synthetischer Gene für HV1 und HV3 und deren Expression in E. coli eingereicht.
- Die antithrombotische Wirkung aufweisenden Hirudinvarianten HV1, HV2 und HV3 sind aufgrund ihrer starken Nebenwirkungen, wie Verlängerung der Blutungszeit, zur klinischen Verwendung als Arzneistoffe nicht annehmbar.
- Es wurden einige Systeme zur Erzeugung von Hirudin durch die Gentechnik vorgeschlagen, jedoch wurde ein zufriedenstellendes Verfahren bislang nicht entwickelt. Aus industrieller Sicht ist ein extrazelluläres Erzeugungssystem besonders wünschenswert, da, wenn das erzeugte Protein extrazellulär ausgeschieden werden kann, Vorteile nicht nur hinsichtlich der Vereinfachung von Abtrennung und Reinigung des Produktes aufgrund seines Vorliegens in aktiver Form entstehen, sondern das Produkt auch vor der Verdauung durch intrazelluläre, bakterielle Proteasen geschützt wird.
- Verfahren unter Verwendung von Bacillus subtilis, Hefe oder E. coli als Wirte wurden zur Erzeugung von Hirudin durch Sekretion vorgeschlagen.
- Verfahren unter Verwendung von Bacillus subtilis als Wirt weisen Nachteile auf, da Plasmide in diesem Bakterium im allgemeinen instabil sind, häufig zum Curing der Plasmide führen, wodurch eine stabile Proteinerzeugung schwierig wird oder die Proteinprodukte in dem Medium können durch ihre eigenen, ebenfalls in das Medium ausgeschiedenen Proteasen verdaut werden. Zur Hirudinerzeugung vorgeschlagene Verfahren (beispielsweise Japanische Offenlegungsschrift 2-35084 (1990)) haben derartige Aufgaben nicht gelöst und die Produktionsausbeute ist nur etwa 100 mg/l.
- Bei Verfahren unter Verwendung von Hefen als Wirte ist bekannt, daß die C-terminalen Aminosäuren der Produkte durch Carboxypeptidase hydrolysiert werden.
- In einer früheren Mitteilung (N. Riehl-Bellon et al., Biochemistry 1989, 28, 2941-2949) werden Nebenprodukte mit 1 oder 2 vom C-terminalen Ende von HV2 weg hydrolysierten Aminosäureresten offenbart.
- Um diese Probleme zu überwinden, wurde ein Verfahren unter Verwendung von Carboxypeptidase-armen Hefen (Japanische Offenlegungsschrift 2- 104279 (1990)) als Wirte vorgeschlagen, führte jedoch zu keiner zufriedenstellenden Produktivität.
- Ein Verfahren unter Verwendung der Signalsequenz der alkalischen Phosphatase und unter Verwendung von E. coli als Wirt wurde mitgeteilt. (J. Dodt et al., FEBS Lett. 202, 373-377 (1986)). Obwohl dies ein Sekretionssystem ist, wird das Produkt hauptsächlich in den periplasmatischen Raum ausgeschieden und dies ist nicht zufriedenstellend, da Aufbruch der Bakterienzellen durch einen zusätzlichen Gewinnungsverfahrensschritt, wie osmotischer Schock, erforderlich wird und die Produktausbeute nur 4 mg/l beträgt.
- Die Erfinder erzeugten verschiedene Hirudin-Analoga auf der Grundlage der Primärstruktur der vorstehend genannten Hirudinvarianten HV1, HV2 und HV3, um ihre Eigenschaften in Tiermodellen zu vergleichen. Sie fanden, daß ein Hirudin-Analogon (chimäres Hirudin) mit der Aminosäuresequenz von Hirudin HV1 bis zur 52. Aminosäure und anschließend mit der Sequenz von HV3 substituiert, nicht nur starke Antithrombinwirkung, sondern auch eine Verkürzung der längeren Blutungszeit zeigte.
- Die Erfinder haben darüberhinaus die extrazelluläre Erzeugung von Fremdproteinen in hoher Ausbeute unter Verwendung von E. coli als Wirt untersucht und vervollständigten die vorliegende Erfindung aufgrund der Erkenntnis, daß bei Verwendung eines Replikationsstartpunktes (ori) eines pUC-Plasmids als Replikationsstartpunkt in einem Sekretionsvektor mit der DNA-Sequenz für ein Signalpeptid und einen Promotor, Fremdprotein in großer Menge aus E. coli ausgeschieden werden kann.
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Hirudin-Analogon mit starker Antithrombinwirkung.
- Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine DNA-Sequenz, welche für die Aminosäuresequenz des Hirudin-Analogons mit der vorstehend genannten starken Antithrombinwirkung und geringer Blutungsneigung kodiert, transformierte Mikroorganismen, erzeugt durch Transformieren von E. coli mit Expressionsvektoren, die die DNA-Sequenz einschließen, und ein Verfahren zur Herstellung von Hirudin-Analoga durch Expression der DNA-Sequenz unter Verwendung des vorstehend genannten transformierten Mikroorganismus und Gewinnen des Hirudin- Analogons.
- Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein gerinnungshemmendes Arzneimittel mit dem vorstehend genannten Hirudin-Analogon als Wirkstoff.
- Das neue Hirudin-Analogon HV1C3 der vorliegenden Erfindung weist die Aminosäuresequenz, die in nachstehender Primärstruktur dargestellt ist, auf:
- Eine beispielhafte DNA-Sequenz, welche für Aminosäuresequenz dieses Analogons kodiert, kann durch nachstehende Formel angeführt werden:
- Das in Formel-1 gezeigte erfindungsgemäße Hirudin-Analogon kann durch chemische Synthese hergestellt werden oder kann durch gentechnische Verfahren erzeugt werden.
- Zur Herstellung des Hirudin-Analogons durch die Gentechnik werden zunächst, wie in einem späteren Beispiel beschrieben, die Hirudin HV1 ausscheidenden Plasmide pMTSHV1 und pMKSHV1 konstruiert und werden zur Transformation von E. coli verwendet. Hirudin HV1 wurde durch Sekretion unter Verwendung transformierter Mikroorganismen erzeugt. Plasmid pMTSHV1 umfaßt einen Promotor (Ptrp), eine DNA-Sequenz, die für ein Signalpeptid (PhoA-Signal) kodiert, eine DNA-Sequenz, die für eine Aminosäuresequenz von Hirudin HV1 kodiert, einen Replikationsstartpunkt (ori) und eine DNA-Sequenz, die ein Translationsstoppsignal (rrnBT&sub1;T&sub2;), wie in Fig. 3 dargestellt, einschließt. In der vorliegenden Erfindung wurde zur Substitution der 52. Aminosäure von Hirudin HV1 durch die Aminosäuresequenz von HV3 das HV1 ausscheidende Plasmid pMTSHV1 zur Entfernung der für die Aminosäuresequenz nach der 52. Aminosäure von Hirudin HV1 kodierenden DNA-Sequenz mit einem Restriktionsenzym geschnitten. Andererseits wurde die die Aminosäuresequenz kodierende DNA-Sequenz, beginnend mit der 53. Aminosäure des HV3 Expressionsplasmids pUCHV3, unter Verwendung eines Restriktionsenzyms herausgeschnitten. Die DNA, mit der bis zur 52. Aminosäure von Hirudin HV1 aus Plasmid pMTSHV1 kodierenden Sequenz und die DNA, die für die mit der 53. Aminosäure von Hirudin HV3, abgeleitet von Plasmid pUCHV3, beginnenden Aminosäuresequenz kodiert, wurden mit DNA-Ligase unter Konstruktion des Plasmids pMTSHV1C3, das die für die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Hirudin-Analogons kodierende DNA enthält, ligiert.
- Plasmid pMTSHV1C3 umfaßt eine DNA-Sequenz, die einen Promotor, ein Signalpeptid und einen Replikationsstartpunkt (ori), abgeleitet von Plasmid pMTSHV1, eine für die 1. - 52. Aminosäuren kodierende DNA-Sequenz von Hirudin HV1 und ein Translationsstoppsignal und eine DNA-Sequenz, die für Aminosäuren, beginnend mit der 53. Aminosäure von Hirudin HV3, abgeleitet von Plasmid pUCHV3, welches zwischen der vorstehend genannten DNA-Sequenz, die die 1. - 52. Aminosäuren von Hirudin HV1 kodiert, und das Translationsstoppsignal inseriert wird, einschließt.
- Das erfindungsgemäße Hirudin-Analogon wird intrazellulär erzeugt und aus dem Medium ausgeschieden, wenn das Plasmid pMTSHV1C3 in E. coli eingeführt wird, gefolgt von Züchten der transformierten Mikroorganismen.
- In der vorliegenden Erfindung wurde das Hirudin-Analogon durch allgemein bekannte Verfahren abgetrennt und durch Verfahren, wie Säulenchromatographie, Umkehrphasen-HPLC usw., gereinigt.
- Das erhaltene Hirudin-Analogon zeigte im Tiermodell stärkere Antithrombinwirkung und geringere Blutungstendenz, verglichen mit Hirudin HV1. Es kann zu einem ausgezeichneten gerinnungshemmenden Arzneimittel durch Zubereiten mit allgemein bekannten Formulierungsverfahren formuliert werden. D.h. das erfindungsgemäße Hirudin-Analogon kann außerdem durch beliebige bekannte Verfahren unter Verwendung beliebiger bekannter Träger zur pharmazeutischen Verwendung oder Zusätze zur Formulierung zubereitet werden. Das Arzneimittel wurde intravenös, intracutan, subcutan oder intramuskulär oder nichtoral örtlich verabreicht. Obwohl die genaue Dosierung in jedem Fall durch Beachtung von Faktoren, wie Symptomen, Alter und Geschlecht des Patienten, bestimmt wird, liegt sie im allgemeinen im Bereich 0,1 mg bis 100 mg für einen Erwachsenen pro Tag und die Gesamtmenge wird einmal bis zu einige Dosen verabreicht.
- Fig. 1 zeigt die Aminosäuresequenz der Hirudine HV1, HV2, HV3 und HV1C3.
- Fig. 2 zeigt die DNA-Sequenz des phoA-Signalpeptids.
- Fig. 3 zeigt eine Skizze der Konstruktion von Hirudin HV1 ausscheidendem Plasmid pMTSHV1.
- Fig. 4 zeigt eine Skizze der Konstruktion von Plasmid pMKSHV1.
- Fig. 5 zeigt eine Skizze der Konstruktion von Hirudin HV1C3 ausscheidendem Plasmid pMTSHV1C3.
- Fig. 6 (A) zeigt das C4-Umkehrphasen-HPLC-Profil von Hirudin HV1 bzw. (B) zeigt das C4-Umkehrphasen-HPLC-Profil von Hirudin HV1C3.
- Fig. 7 zeigt die DNA-Sequenz des tac-Promotors.
- Fig. 8 zeigt die DNA-Sequenz des trp-Promotors.
- Die Verfahren zur Konstruktion der Plasmide pUCHV1, pMT1 und pMK2 zur Verwendung bei der Konstruktion von pMTSHV1 oder pMKSHV1 als in der vorliegenden Erfindung verwendete Hirudin HV1 ausscheidende Plasmide und von Plasmid pUCHV3 zur Verwendung bei der Konstruktion des Plasmids pMTSHV1C3 werden in den nachstehenden Bezugsbeispielen angegeben.
- 10 µg handelsübliches Plasmid pUC18 wurden mit 30 Einheiten EcoRI und 30 Einheiten HindIII bei 37ºC 2 Stunden aufgeschlossen. Der Vektorrest wurde dann durch Agarosegelelektrophorese, gefolgt von Extraktion abgetrennt. Die Proteine wurden durch Phenolextraktion entfernt; DNA wurde mit kaltem Ethanol ausgefällt und in 50 µl TE-Pufferlösung gelöst (10 mM Tris-HCI, pH 8,0, 1 mM EDTA). Zu dieser Menge an Lösung, die 50 ng DNA enthalten sollte, wurden 10 µl 66 mM Tris-HCI, pH 7,5, 5 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT, 1 mM ATP und 300 Einheiten T4-DNA-Ligase mit doppelsträngiger HV1- oder HV3-DNA gegeben, gefolgt von Umsetzung über Nacht bei 16ºC zur Erzeugung von Plasmid pUCHV1 oder pUCHV3, worin das HV1-Gen bzw. das HV3-Gen zwischen den EcoRI- und HindIII-Stellen von Plasmid pUC18 inseriert war.
- Ein den tac-Promotor enthaltendes Fragment, erhalten durch Schneiden handelsüblichen Plasmids pKK223-3 (Pharmacia) mit den Restriktionsenzymen PvuI und NruI, ein einen Replikationsstartpunkt (ori) enthaltendes Fragment, erhalten durch Schneiden von handelsüblichem pUC18 mit Restriktionsenzymen PvuI und PvuII und ein das Ampicillinresistenzgen enthaltendes Fragment wurden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert. Das so erhaltene Fragment wurde in E. coli JM109 eingeführt, gefolgt von Züchten, Screening hinsichtlich Ampicillinresistenz und ein Vektor mit sowohl dem tac-Promotor als auch dem Replikationsstartpunkt (ori) von pUC18 wurde erhalten und pMK2 bezeichnet.
- 10 µg Plasmid pMK2 wurden mit 30 Einheiten EcoRI und Eco47III aufgeschlossen unter Entfernen des den tac-Promotor enthaltenden Fragments und anschließend das den Replikationsursprung (ori) enthaltende Fragment durch Agarosegelelektrophorese gewonnen. Das den trp-Promotor enthaltende DNA- Fragment wurde mit einem DNA-Synthesizer synthetisiert. Dieses Fragment wurde mit dem vorstehend genannten, durch Aufschluß von pMK2 mit EcoRI und Eco47III erzeugten Fragment unter Verwendung von T4-DNA-Ligase bei 16ºC über Nacht ligiert. Die Ligierungsprodukte wurden zur Transformation von E. coli JM109 unter Herstellung eines Vektors, der sowohl den trp-Promotor als auch den Replikationsstartpunkt (ori) von Plasmid pMK2 enthält, verwendet. Die DNA- Sequenz dieses Plasmids wurde durch das Verfahren von Sanger et al. bestätigt und als pMT1 bezeichnet.
- Die Erfindung wird nachstehend genauer erläutert.
- Plasmid pMTSHV1 wurde gemäß dem in Fig. 3 gezeigten Verfahren konstruiert. Vier in Fig. 2 ausgewiesene Oligonudeotide wurden zur Konstruktion eines dem Signalpeptid von alkalischer Phosphatase (phoA) von E. coli entsprechenden DNA-Fragments und des DNA-Fragments, das für Val¹ -Val² der N- terminalen Aminosäure von Hirudin HV1 kodiert, synthetisiert. Nach Entfernen der Schutzgruppen wurde jedes Oligonucleotid mit 10% Polyacrylamidgelelektrophorese gereinigt.
- Nachdem 500 pMol von jeweils zwei Oligonudeotiden S2 und S4 phosphorylisiert wurden, wurden 20 pMol jeweils der 4 Oligonudeotide vermischt, hybridisiert und dann bei 16ºC über Nacht in 20 µl Lösung mit T4-DNA-Ligase behandelt. Nach Entfernen von Protein unter Verwendung von Phenol und Chloroform und Fällen durch kaltes Ethanol wurde das gewünschte doppelsträngige DNA-Fragment erhalten. 1/10 der Menge des erhaltenen Fragments und 100 ng Plasmid pUCHV1 (Japanische Offenlegungsschrift 3-164184 (1991)), geschnitten mit Restriktionsenzymen EcoRI und Accl, wurden mit T4-DNA-Ligase bei 16ºC über Nacht umgesetzt. Hybridplasmid pSHV1, enthaltend das Fusionsgen, worin die DNA-Sequenz, die für Hirudin HV1 kodiert, unmittelbar nach der für das phoA- Signalpeptid kodierenden Sequenz ligiert ist, wurde durch Transformieren von E. coli JM109 erhalten. Die DNA-Sequenz dieses Plasmids pSHV1 wurde durch das Verfahren von Sanger et al. bestätigt.
- 10 µg des pSHV1 wurden mit Restriktionsenzym EcoRI (30 Einheiten) und HindIII (30 Einheiten) aufgeschlossen und das 276 Bp fusionierte Genfragment wurde durch Agarosegelelektrophorese gereinigt.
- 100 ng des erhaltenen DNA-Fragments und 100 ng DNA, hergestellt durch Aufschluß von E. coli Expressionsvektor pMTI (Japanische Offenlegungsschrift 3-76579 (1991)) mit Restriktionsenzymen EcoRI und Hindlil, gefolgt von Reinigen der DNA-Fragmente durch Agarosegelelektrophorese, wurden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase bei 16ºC über Nacht ligiert. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde zur Transformation von E. coli JM109 zur Gewinnung des Hirudin HV1-Sekretionsplasmids pMTSHV1 verwendet, worin das fusionierte für das phoA-Signalpeptid und Hirudin HV1 kodierende Gen von dem trp-Promotor- Bereich gefolgt wird. Die DNA-Sequenz von pMTSHV1 wurde durch das Verfahren von Sanger et al. bestätigt.
- Plasmid pMKSHV1 wurde gemäß dem in Fig. 4 gezeigten Verfahren konstruiert.
- Die vorstehend genannte für das phoA-Signalpeptid und Hirudin HV1 kodierende fusionierte DNA und das DNA-Fragment, das durch Aufschluß von E. coli-Expressionsplasmid pMK2 (Japanische Offenlegungsschrift 3-76579 (1991)) mit Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII erhalten wurde, wurden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase ligiert, die Ligierungsprodukte wurden zur Transformation von E. coli JM109 verwendet und das Hirudin HV1 ausscheidende Plasmid pMKSHV1 mit dem stromabwärts des tac-Promotors inserierten fusionierten Gen wurde erhalten. Die DNA-Sequenz von Plasmid pMKSHV1 wurde durch das Verfahren von Sanger et al. bestätigt.
- Plasmid pMTSHV1C3 wurde gemäß dem in Fig. 5 beschriebenen Verfahren konstruiert. Zur Substitution nach der 52. Aminosäure von Hirudin HV1 mit der Sequenz von HV3 wurde das HV1-Sekretionsplasmid pMTSHV1 (10 µg) mit Restriktionsenzymen Kpn I (30 Einheiten) und HindIII (30 Einheiten) aufgeschlossen, gefolgt von Agarosegelelektrophorese zur Reinigung eines DNA-Fragments von 2,8 kBp.
- In ähnlicher Weise wurden auch 10 pg von Plasmid pUCHV3 (Japanische Offenlegungsschrift 3-164184 (1991)) auch mit Kpn I und HindIII aufgeschlossen und ein 80 Bp DNA-Fragment, das für die C-terminale Aminosäuresequenz von HV3 kodiert, wurde gereinigt.
- 100 ng beider DNA-Fragmente wurden mit T4-DNA-Ligase bei 16ºC über Nacht umgesetzt und das erhaltene Reaktionsgemisch wurde zur Transformation von E. coli JM109 unter Bereitstellung von chimärem Hirudin HV1C3 Sekretionsplasmid pMTSHV1C3 verwendet. Die DNA-Sequenz des Plasmids pMTSHV1C3 wurde durch das Verfahren von Sanger et al. bestätigt.
- E. coli RR1 (FERM BP-3130), transformiert mit Plasmid pMTSHV1C3, das wie vorstehend in (1) konstruiert wurde, wurde in 2 x YT-Medium, enthaltend 100 µg/ml Ampicillin, gezüchtet. Nach Züchten bei 37ºC für 24 Stunden wurde 1 ml Züchtungsmedium gesammelt und osmotischer Schock zur Messung der Antithrombinwirkung der periplasmatischen Fraktion angewendet.
- Im Ergebnis wurden 3060 ATU Antithrombinaktivität pro 1 ml Kulturmedium nachgewiesen.
- Wenn E. coli JM109 (FERM BP-3104), transformiert mit Plasmid pMTSHV1C3, in 2 l 2 x YT-Kulturmedium, das 2% Glucose enthielt, in einem 5 l- Fermenter unter Rühren und Belüften bei 37ºC für 24 Stunden gezüchtet wurde, wurde eine Antithrombinaktivität von 6050 ATU/ml, 350 ATU/ml in dem Periplasma und 5700 ATU/ml in dem Züchtungsmedium, beobachtet.
- Hirudin HV1C3 wurde aus dem in vorstehendem Punkt (3) erhaltenen Kulturmedium wie nachstehend gereinigt.
- Nach Fermentation wurden 1,5 l Kulturmedium gesammelt und bei 6000 x g 10 Minuten zur Abtrennung des Überstands von der Zelldebris zentrifugiert. Da die Salzkonzentration des Überstands 1,3% betrug, wurde er mit einem Salinimeter gemessen, der Überstand 4fach mit 10 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) verdünnt und durch einen 3,2 pm Filter (Pole Co. Ltd.) filtriert. Das Filtrat wurde auf eine QAE-Toyopearlsäule (4,4 x 7 cm) mit 10 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) ins Gleichgewicht gebracht, beladen. Nach Auftragen der Probe wurde die Säule in Puffer ins Gleichgewicht gebracht, gefolgt von stufenweiser Elution mit Hirudin HV1C3 mit 0,2M NaCl. Die eluierte Lösung wurde unter Verwendung einer Diaflow-Membran (YM5) von Amicon eingeengt, gefolgt von Gelfiltrieren an Sephacryl S-100HR, vorher mit 10 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) zum Entsalzen ins Gleichgewicht gebracht.
- Die aktiven Fraktionen wurden auf eine mit 10 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) ins Gleichgewicht gebrachte DEAE-Toy6pearl-Säule (4,4 x 40 cm) beladen, sorgfältig gewaschen und dann mit einem linearen Gradienten, hergestellt zwischen 3 1 des Gleichgewichtspuffer und 3 l 0,3M NaCl- Gleichgewichtspuffer, eluiert. Letzte Reinigung wurde an einer C4- Umkehrphasen-HPLC-Säule mit Delta-prep 3000, einem Waters' Produkt, ausgeführt. Das gereinigte Hirudin HV1C3 wurde durch Eluieren von der Säule unter Verwendung eines linearen Gradienten von 15 bis 30% (Volumenolumen) Acetonitril, enthaltend 0,065% (V/V) Trifluoracetat, erhalten. Wenn die Aminosäuresequenz des gereinigten chimären Hirudins HV1C3 bestimmt wurde, wurde die C- terminale Aminosäuresequenz als verschieden von HV1, wie in Fig. 1 gezeigt, bestimmt. Die spezifische Aktivität betrug 11250 ATU/mg. Die HPLC-Profile von gereinigtem HV1 und HV1C3 sind in Fig. 6 dargestellt. Der Versuch wurde mit einer VYDAC C4-Säule (0,46 x 25 cm) unter Verwendung eines linearen Gradienten von Acetonitril von 15 bis 30% bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min für 30 Minuten ausgeführt.
- Thrombin (10 NIH-Einheiten/10 g) wurde intravenös männlichen Mäusen (20-25 g) ohne Anästhesie verabreicht und die Antithrombinwirkung der geprüften Verbindung wurde durch Beobachten des Verschwindens von Roll-over- Reflexion und Tod als Indikatoren bewertet. Alle geprüften Verbindungen wurden in Kochsalzlösung aufgelöst und 0,05 ml/10 g wurden intravenös 5 Minuten vor der Thrombininjektion verabreicht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 Inhibitorwirkung gegen Thrombin-induzierten Tod
- *Bewertung Bewertung 0: kein Verschwinden der Roll-over- Reflexion (scheinbar normal)
- Bewertung 1: Verschwinden der Roll-over-Reflexion, jedoch kein Tod innerhalb 20 Minuten
- Bewertung 2: Tod innerhalb 20 Minuten
- Es geht aus der Tabelle deutlich hervor, daß erfindungsgemäßes chimäres Hirudin (HV1C3), verglichen mit Hirudin HV1, bei der Thrombin-induzierten Todreaktion in vivo eine etwa 4-5fach stärkere Inhibitorwirkung zeigte.
- Proben wurden in männliche Mäuse (20-25 g) unter Anästhesie und unter Verwendung von Natriumpentobarbital (40 mg/kg i.p.) über ihre Schwanzvene injiziert. Eine Punkturwunde wurde durch Einsatz einer 21G-Nadel (äußerer Durchmesser 0,85 mm) in die andere Seite der Schwanzvene 5 Minuten nach der Verabreichung der Testverbindungen hergestellt und die Blutungszeit der Wunde wurde gemessen. Ein Filterpapier wurde auf die Wunde gelegt und alle 15 Minuten gewechselt. Die Blutungszeit wird als die Zeit definiert, die erforderlich ist, bis kein roter Fleck mehr auf dem Filterpapier beobachtet wird. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2 Verlängerung der Blutungszeit
- Im allgemeinen ist Verlängerung der Blutungszeit eine der Nebenwirkungen von Gerinnungshemmung. Das erfindungsgemäße chimäre Hirudin (HV1C3) zeigte hier deutlich weniger Blutung als Hirudin HV1.
- Gereinigtes chimäres Hirudin HV1C3 von Beispiel 1 (4) wurde unter Verwendung von Sephadex G25 (Pharmacia) entsalzen, gefolgt von Futrieren durch ein 0,22 µm Filter unter sterilen Bedingungen. Die Lösung wurde in Rährchen ausgegeben und lyophilisiert. Das so erhaltene lyophilisierte Pulver von chimärem Hirudin HV1C3 wurde in Kochsalzlösung gelöst und als injizierbarer Arzneistoff verwendet.
- Die vorliegende Erfindung stellt ein neues Hirudin-Analogon bereit. Das erfindungsgemäße Hirudin-Analogon ist als gerinnungshemmendes Mittel mit starker Wirkung gegen Thrombin und gegen eine Tendenz, Bluten hervorzurufen, geeignet.
- (1) E. coli JM109/pMTSHV1C3 (Eintrag E. coli JM109/pMTPHOHV1C3 wurde geändert)
- Hinterlegungsstelle:
- Fermentation Research Institute,
- Agency of Industrial Science and Technology,
- Ministry of International Trade and Industry Adresse:
- 1-1-3, Tsukuba-shi Higashi, Ibaraki-ken, Japan
- Hintergungstag:
- 18. September 1990
- Hinterlegungsnummer:
- FERM BP-3104
- (2) E. coli RR1/pMTSHV1C3
- Hinterlegungsstelle:
- Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology,
- Ministry of International Trade and Industry Adresse:
- 1-1-3, Tsukuba-shi Higashi, Ibaraki-ken, Japan
- Hintergungstag:
- 11. Oktober 1990
- Hinterlegungsnummer:
- FERM BP-3130
- (3) E. coli JM109/pMTSHV1
- Hinterlegungsstelle:
- Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology,
- Ministry of International Trade and Industry Adresse:
- 1-1-3, Tsukuba-shi Higashi, Ibaraki-ken, Japan
- Hinterlegungstag:
- 6. Februar 1991
- Hinterlegungsnummer:
- FERM BP-3266
- (4) E. coli RR1/pMTSHV3
- Hinterlegungsstelle:
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- 1-1-3, Tsukuba-shi Higashi, Ibaraki-ken, Japan
- Hinterlegungstag:
- 6. Februar 1991
- Hinterlegungsnummer:
- FERM BP-3267
Claims (5)
1.
Hirudin-Analogon HV1C3 mit der in der nachstehenden Formel-1
gezeigten Aminosäuresequenz:
(Formel-1)
2. DNA-Sequenz, welche für die Aminosäuresequenz von Formel-1 von
Anspruch 1 kodiert.
3. Transformierter Mikroorganismus, erhalten durch Transformation von E.
coli mit einem Expressionsvektor, der eine für die Aminosäuresequenz von
Formel-1 von Anspruch 1 kodierende DNA-Sequenz, die daran funktionell
verknüpft ist, enthält.
4. Verfahren zur Herstellung eines Hirudin-Analogons, umfassend das
Züchten des in Anspruch 3 beschriebenen, transformierten Mikroorganismus,
das Exprimieren des in Formel-1 gezeigten Hirudin-Analogons und dessen
Gewinnung.
5. Gerinnungshemmendes Arzneimittel mit dem Hirudin-Analogon HV1C3
von Formel-1 von Anspruch 1 als Wirkstoff.
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