DE3485923T2 - Dna-gen, verfahren zu seiner herstellung und dieses gen enthaltendes plasmid. - Google Patents
Dna-gen, verfahren zu seiner herstellung und dieses gen enthaltendes plasmid.Info
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Description
- Die Erfindung betrifft die Verwendung eines DNA-Gens, das an der Sekretion eines exogenen oder fremden Genprodukts beteiligt ist. Genauer betrifft die vorliegende Erfindung eine DNA, die ein Gen umfaßt, das für ein Peptid zur Exkretion des gebildeten Proteins als Expression des DNA- Gens in den Zellen eines Wirts-Mikroorganismus durch die Membran codiert, wobei das Peptid im folgenden als "Signalpeptid" bezeichnet wird, wobei der DNA-Teil so prozessiert ist, daß ein exogenes Gen direkt an das DNA-Gen gebunden werden kann. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung des DNA-Gens und auch ein Plasmid, das den DNA-Genteil enthält.
- Techniken zur Herstellung einer großen Menge eines gewünschten Genprodukts unter Verwendung der rekombinanten DNA-Technik etablieren sich nun, wie aus der großen Anzahl verwandter Berichte und veröffentlichter Patentbeschreibungen hervorgeht. Mit der Etablierung dieser Techniken wurden auch genetische Analysen durchgeführt, und die Kenntnis, daß eine Reihe von Peptiden, umfassend 15 bis 30 Aminosäuren, an der Sekretion eines exprimierten Proteins aus der Zelle eines Wirts beteiligt ist, wurde auch von solchen Analysen gewonnen.
- Die Kenntnis über die Sekretion des exprimierten Proteins aus der Zelle wird "Signalhypothese" [J. Cell Biol., 67, 835 (1975)] genannt, und die Versuchsergebnisse zur Stützung dieser Hypothese häufen sich [Secretory Mechanisms, 9, Cambridge University Press, Cambridge (1979); Seikagaku (Journal of Biochemistry), 52, 141 (1980), etc.]. Ein Abriß über das Signalpeptid und dessen Funktion wird beispielsweise in der offengelegten japanischen Patentpublikation Nr. 69897/1983 gegeben, und es wird auch anerkannt, daß das Signalpeptid an der Permeation von Proteinen durch Membrane beteiligt ist.
- Gegenwärtig sind verschiedene Erfindungen, bei denen Signalpeptide verwendet werden, in offengelegten oder veröffentlichten Patentpublikationen beschrieben (z. B. offengelegte japanische Patentpublikationen Nrn. 19092/1980, 45395/1980, 137896/1981, 145221/1981 und 154999/1981). Gemäß einem der in diesen Publikationen beschriebenen Verfahren wird das Strukturgen, das für das durch einen Mikroorganismus zu sezernierende Protein codiert, an einer geeigneten Erkennungsstelle für eine Restriktions-Endonuclease geschnitten, und ein exogenes Gen wird daran durch einen Linker zur Anpassung an das Leseraster gebunden. Als Ergebnis besitzt das exogene Protein nach Expression eines solchen fusionierten Gens an seiner N-terminalen Stelle ein überflüssiges Peptid. Folglich besteht die Möglichkeit, daß ein solches überflüssiges Peptid die Sekretion inhibieren könnte oder einen ungünstigen Effekt auf die biologische Aktivität des exogenen Proteins haben könnte.
- Die EP-A-38 182 beschreibt, daß ein Signalpeptid mit einem exogenen exkretierbaren Protein inhärent in einem E. coli funktioniert hat und das Protein stromabwärts des Signalpeptids als reifes Protein sezerniert hat.
- Somit sind die Techniken nach dem Stand der Technik unter Verwendung von Signalpeptiden mit verschiedenen Problemen verbunden, und es würde zweckmäßig sein, diese Probleme zu lösen.
- Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die oben beschriebenen Probleme zu überwinden, und es ist Ziel der Erfindung, diese Aufgabe zu lösen, indem ein DNA-Gen, das die Verknüpfung eines Gens, das für ein exogenes Protein codiert, an das Gen, das für ein Signalpeptid codiert, unmittelbar danach ermöglicht, entwickelt und verwendet wird.
- Folglich wird erfindungsgemäß eine DNA bereitgestellt, die ein Gen umfaßt, das für ein natürliches bakterielles Signalpeptid codiert, wobei das Gen sich von dem entsprechenden natürlichen Gen dadurch unterscheidet, daß es gegen das Stromabwärtsende mindestens einen Teil einer Erkennungsstelle für eine Restriktions-Endonuclease, die künstlich von dem natürlichen Gen unter Verwendung der Degeneriertheit des genetischen Codes geschaffen wurde, so daß für die gleiche Aminosäuresequenz codiert wird, besitzt.
- Das Verfahren zur Herstellung einer wie oben definierten DNA umfaßt die Stufen:
- (a) Bereitstellen einer DNA, die ein Gen, das für ein natürliches bakterielles Signalpeptid codiert, enthält, und
- (b) Modifizieren der Basensequenz des Gens gegen sein Stromabwärtsende ohne Veränderung der Aminosäuresequenz, die der Basensequenz entspricht, wodurch eine Erkennungsstelle für eine Restriktions-Endonuclease geschaffen wird, von der mindestens ein Teil auf diesem Gen lokalisiert ist.
- Bei obigem Schema kann sich an Stufe (b) anschließen:
- (c) Schneiden der DNA mit der Restriktions-Endonuclease, die von dieser Stelle erkannt wird, wodurch ein geschnittenes Ende der Restriktions-Endonuclease erhalten wird,
- (d) Bereitstellen eines weiteren DNA-Fragments mit dem gleichen, durch eine Restriktions-Endonuclease geschnittenen Ende an seinem Stromaufwärtsende, gefolgt, sofern notwendig, von einem DNA-Teil, der nützlich ist, das Gen für das natürliche bakterielle Signalpeptid zu rekonstituieren, wobei auf das letztere ein exogenes Gen folgt, und
- (e) Verknüpfen der DNA-Fragmente der obigen Stufen (c) und (d) aneinander an den durch eine Restriktions-Endonuclease geschnittenen Enden, wodurch eine DNA erhalten wird, die ein Gen, das für ein natürliches bakterielles Signalpeptid codiert, und ein exogenes Gen in direkter Verknüpfung an das Stromabwärtsende des Signalpeptid-Gens umfaßt.
- Das erfindungsgemäße Plasmid umfaßt die Kontrollregion, die sich von einem Gen für die alkalische Phosphatase und einem Gen, das für das Signalpeptid der alkalischen Phosphatase codiert, ableitet, wobei das Gen, das für das Signalpeptid codiert, so charakterisiert ist, daß es eine künstlich geschaffene Erkennungsstelle für eine Restriktions-Endonuclease besitzt, so daß die Aminosäuresequenz, die von dieser Basensequenz codiert wird, nicht verändert wird, und daß die entsprechende Schnittstelle am Stromabwärtsende dieses Gens liegt.
- Um die extrazelluläre Exkretion von Proteinen von exogenen Genen durch ein Signalpeptid zu gewährleisten, besitzt somit die vorliegende Erfindung eine besondere Eigenschaft dahingehend, daß eine Erkennungs/Spaltstelle für die Restriktions-Endonuclease geschaffen wird, um ein exogenes Gen in das Signalpeptid-Gen zu inkorporieren, und daß die Schaffung dieser Stelle auf einer geschickten Verwertung der Tatsache, daß eine Degeneriertheit bezüglich der Codons, welche DNA-Basenpaare umfassen, vorliegt, beruht.
- Wenn die Spaltung an der geschaffenen Erkennungs/Schnittstelle für die Restriktions-Endonuclease durch die betroffene Restriktions-Endonuclease erfolgt und in dem Falle, in dem die Schnittstelle anschließend an das Stromabwärtsende der Signalpeptid-Gen-DNA vorliegt, folgt, daß ein exogenes Gen, das an seinem Stromabwärtsende eine DNA-Fraktion, die komplementär zu dem gebildeten, durch die Restriktions-Endonuclease geschnittenen Ende besitzt, hergestellt wird und an dem geschnittenen Ende an das Signalpeptid-Gen gebunden wird, wodurch das exogene Gen direkt an das Stromabwärtsende des Signalpeptid-Gens gebunden wird. In dem Falle, in dem die Schnittstelle des Signalpeptid-Gens nicht an seinem Stromabwärtsende, sondern stromaufwärts zu dessen Stromabwärtsende vorliegt und somit die Spaltung an einer Stelle stromaufwärts von dem Stromabwärtsende des Signalpeptid-Gens erfolgt, was zu einer Desintegration des Signalpeptid-Gens führt, umfaßt ein DNA-Fragment eine DNA (p) für ein exogenes Gen und eine DNA (q), welche an das Stromaufwärtsende des DNA-(p)-Gens gebunden ist, wobei die DNA (q) dem DNA-Teil der DNA für das Signalpeptid-Gen stromabwärts der Schnittstelle entspricht, und das DNA-Fragment dann so an das geschnittene Ende des Signalpeptid-Gens gebunden ist, daß das zuerst durch die Spaltung desintegrierte Signalpeptid-Gen für beide DNA-Stränge zugleich mit der Verwirklichung einer Struktur, worin das exogene Gen direkt an das Stromabwärtsende des Signalpeptids gebunden ist, wiederhergestellt wird.
- Das gebildete DNA-Gen kann somit die obigen Probleme umgehen, wenn es als Vektor, inkorporiert in ein geeignetes Plasmid oder einen geeigneten Phagen, verwendet wird, und es besitzt die folgenden Vorteile, wenn es in einem Wirts-Mikroorganismus zur Bildung eines gewünschten Proteins inkorporiert ist.
- (a) Die Reinigung der gebildeten Expressionsprodukte ist leicht. Nach dem Stand der Technik wurde die ganze Wirtszelle in einer geeigneten Stufe nach dem Wachstum des Wirts-Mikroorganismus zerstoßen, und nützliche Substanzen wurden durch Extraktion aus verschiedenen Zell-Inhaltsstoffen des verwendeten Mikroorganismus gereinigt. Folglich war eine enorme Menge an Arbeit notwendig, und die Reinigung war auch manchmal schwierig, je nach der gereinigten Substanz. Durch Verwendung eines Vektors, bei dem das erfindungsgemäße DNA-Gen verwendet wird, wird das gebildete Protein aus den Mikroorganismenzellen ausgeschieden, und es ist somit leicht, die gewünschte Substanz zu identifizieren und abgetrennt von dem Medium zu gewinnen, da die Bestandteile des Wachstumsmediums für den Mikroorganismus bekannt sind.
- (b) Die gebildete Substanz kann vor Zersetzung durch Peptidasen geschützt werden. Genauer, weil viele Peptidasen (Proteasen) in den mikrobiellen Zellen vorliegen, unterliegen überflüssige Proteine einer raschen Hydrolyse, aber die sofortige Ausscheidung des gewünschten nützlichen Proteins aus der mikrobiellen Zelle ohne unnötige Zurückhaltung darin wird zum Schutz des gewünschten Proteins vor der obigen Hydrolase führen.
- (c) Jedes beliebige exogene Protein kann exprimiert werden. Beispielsweise kann nach dem Verfahren der fusionierten Proteine nach dem Stand der Technik ein solches typisches Verfahren zum Erhalt des gewünschten Proteins aus dem fusionierten Protein durch Spaltung des fusionierten Proteins an der Stelle, an der das gewünschte Protein mit einem unerwünschten Protein fusioniert ist, für die Behandlung des fusionierten Proteins mit Bromcyan, welches für Methionin spezifisch ist, oder der Abbau mit Trypsin des fusionierten Proteins, wobei Trypsin für Lysin oder Arginin spezifisch ist, nur auf Proteine angewandt werden, die kein Methionin, Lysin oder Arginin enthalten. Andererseits muß bei Erzeugung eines Proteins nach dem direkten Expressionsverfahren [Nature, 281, 544 (1979)] ein Startcodon (Methionin) am N-terminalen Ende des Gens vorliegen, und einige gebildete Proteine werden mit Methionin am N-terminalen Ende erhalten (siehe offengelegte japanische Patentpublikation Nr. 68399/1981). Weil es technisch schwierig ist, durch Abbau ein solches Methionin am terminalen Ende durch Behandlung mit Bromcyan zu entfernen, besitzt das gebildete Protein mit dem Methionin folglich eine andere Natur als das natürliche Produkt. Im Gegensatz dazu, wenn das exogene Gen in einem Wirts-Mikroorganismus unter Verwendung eines Vektors mit dem erfindungsgemäßen DNA-Gen exprimiert wird, werden die gebildeten Proteine, sobald sie fusioniert sind oder ein Hybrid- Protein mit einem Signalpeptid bilden, spezifisch am Signal-Peptidaserest gespalten, wodurch ein reifes Protein mit der gewünschten Zusammensetzung, das aus den Wirts-Mikroorganismenzellen ausgeschieden wird, bereitgestellt wird.
- In den Zeichnungen bedeutet:
- Fig. 1 ein Diagramm der Nachbarschaft der verknüpften Stelle zwischen dem Gen, das für ein natürliches bakterielles Signalpeptid (1) codiert, und dem Strukturgen (2), wobei die Erkennungsstelle für die Restriktions-Endonuclease (3), die Restriktions-Schnittstelle (unterbrochene Linie) und die Schnittstelle des Signalpeptids (4) angezeigt sind;
- Fig. 2 ein Flußdiagramm zur Herstellung des erfindungsgemäßen Plasmids pTA 529;
- Fig. 3A und 3B Facsimiles von Autoradiogrammen, die erhalten wurden, wenn die Koloniehybridisierung durchgeführt wurde;
- Fig. 4 ein Diagramm, das das Ergebnis der Agarosegel-Elektrophorese anzeigt; und
- Fig. 5 ein Facsimile eines Autoradiogramms, das erhalten wurde, wenn die Basensequenz nach dem Maxam-Gilbert-Verfahren bestimmt wurde.
- Die DNA, die ein Gen, das für ein erfindungsgemäßes natürliches bakterielles Signalpeptid codiert (in der vorliegenden Beschreibung, insbesondere in der folgenden Beschreibung, wird "DNA entsprechend dem Gen, das für ein natürliches bakterielles Signalpeptid codiert" als DNA für ein natürliches bakterielles Signalpeptid-Gen bezeichnet), besitzt eine Erkennungsstelle für eine Restriktions-Endonuclease, die in der DNA künstlich geschaffen wurde, wie oben erwähnt. Und die Erkennungsstelle für die Restriktions-Endonuclease enthält mindestens ein Basenpaar der DNA als minimalen Teil davon.
- Ein Beispiel für das so definierte erfindungsgemäße DNA-Gen ist in Fig. 1 gezeigt. Diese Ausführungsform umfaßt den DNA-Teil (1) für das natürliche bakterielle Signalpeptid-Gen und den DNA-Teil (2) in Verknüpfung daran an seinem Stromabwärtsende. Das hierin erwähnte "DNA-Gen, das den DNA-Anteil entsprechend dem Gen, das für ein natürliches bakterielles Signalpeptid codiert, enthält" kann mindestens den DNA-Teil (1) umfassen. Bei der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck "stromabwärts" im Zusammenhang mit DNA die Richtung nach rechts oder Lokalisation auf der rechten Seite, wenn die 5' → 3'-Kette ( -Kette) oben gezeigt ist und die 3' ← 5'-Kette ( -Kette) unten gezeigt ist. Der Ausdruck "stromaufwärts" erklärt sich dann von selbst.
- Fig. 1 zeigt einen Teil des DNA-Gens, welches eine doppelsträngige DNA umfaßt, in der A, G, C und T für Adenin, Guanin, Cytosin bzw. Thymin stehen, und Lys, Ala und Trp für Lysin, Alanin bzw. Tryptophan stehen. Die Region (1) der doppelsträngigen DNA entspricht dem DNA-Teil für das natürliche bakterielle Signalpeptid-Gen, die Region (3) der Erkennungsstelle der Restriktions-Endonuclease Hind III und die unterbrochene Linie der Schnittstelle von Hind III. Die Region (2) entspricht dem DNA-Teil, der an das natürliche bakterielle Signalpeptid unmittelbar danach an seinem Stromabwärtsende geknüpft ist. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die DNA für das natürliche bakterielle Signalpeptid-Gen eine, die von einer alkalischen Phosphatase stammt. Diese DNA besitzt ein Codon GCC für Alanin an seinem Stromabwärtsende.
- Das in Fig. 1 gezeigte DNA-Gen entspricht daher einem, das durch Modifizieren des Codons GCC am Stromabwärtsende des DNA-Teils (1) aus der alkalischen Phosphatase in GCT und ferner durch Modifikation der anschließenden Base C in T erhalten worden ist. Da das Codon für Alanin degeneriert ist, ist GCT nach Modifikation ebenfalls das Codon für Alanin, und daher ist der DNA-Teil (1) in Fig. 1 immer noch eine DNA, die dem Gen, das für das Signalpeptid aus einer alkalischen Phosphatase codiert, entspricht.
- Die DNA für das natürliche bakterielle Signalpeptid-Gen aus alkalischer Phosphatase besitzt gerade stromaufwärts von dem Codon für Alanin an seinem Stromabwärtsende ein Codon AAA für Lysin, wobei dieses Codon für Alanin gerade stromabwärts davon von einem Codon CGG für Arginin begleitet ist.
- Folglich wird nach Modifikation des Codons GCC für Alanin am Stromabwärtsende der DNA für das natürliche bakterielle Signalpeptid-Gen aus alkalischer Phosphatase in GCT und Modifikation der Base C nach Alanin in T eine Erkennungsstelle (3) AAGCTT für die Restriktions-Endonuclease Hind III geschaffen, nämlich von dem Basenpaar am Stromabwärtsende der DNA für das Signalpeptid-Gen, vier Basenpaare stromaufwärts dazu und ein Basenpaar stromabwärts davon. Somit wird in der DNA für das natürliche bakterielle Signalpeptid-Gen eine Erkennungsstelle für eine Restriktions-Endonuclease, die mindestens das Basenpaar an dem Ende als Mindestteil seiner sie aufbauenden Mitglieder enthält, geschaffen.
- Bei der in Fig. 1 gezeigten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Schnittstelle in der Erkennungsstelle (3) von Hind III, wie durch die unterbrochene Linie gezeigt, und seine Position liegt zwischen der DNA für das natürliche bakterielle Signalpeptid-Gen und dem DNA-Teil, der daran unmittelbar danach an seinem Stromabwärtsende (die Region (2), die bereits in Fig. 1 verknüpft wurde) geknüpft werden soll (die Position der Schnittstelle bedeutet die auf der Stromabwärtsseite der doppelsträngigen DNA). Es ist erfindungsgemäß sehr bevorzugt, daß die Schnittstelle für die Restriktions-Endonuclease an einer derartigen Position vorliegt. Dies ist auf den folgenden Grund zurückzuführen. Die Schnittstelle wird verwendet, um ein exogenes Gen (die entsprechende DNA) direkt an das Gen, das für das natürliche bakterielle Signalpeptid codiert (die entsprechende DNA), zu knüpfen, während das fusionierte Protein oder das Hybridprotein, das durch Expression des Hybridgens gebildet wird, von der Signal-Peptidase an einer Position zwischen dem natürlichen bakteriellen Signalpeptid und dem daran anschließenden Protein geschnitten wird. Wenn daher die Schnittstelle für die Restriktions-Endonuclease somit mit der Schnittstelle für die Signal- Peptidase zusammenfällt, ist, wie im Falle der Ausführungsform der Erfindung, die in Fig. 1 gezeigt ist, nur die Supplementierung von AGCT an die 5'-Seite der -Kette des exogenen Gens (in dieser Ausführungsform beginnend mit dem Codon TGG für Trp) erforderlich, um die Verknüpfung des exogenen Gens an das kohäsive Ende des Gens für das natürliche bakterielle Signalpeptid nach Abbau mit Hind III zu ermöglichen. Wenn man in diesem Zusammenhang nichts dagegen hat, Basen an die 3'-Seite der -Kette des exogenen Gens zu supplementieren, kann die Schnittstelle der Restriktions- Endonuclease natürlich auf der Stromaufwärtsseite vorliegen, und die Existenz einer solchen Schnittstelle fällt auch unter den Umfang der vorliegenden Erfindung.
- Die "DNA entsprechend dem Gen, das für das natürliche bakterielle Signalpeptid codiert", die eine wichtige Komponente des DNA-Gens der vorliegenden Erfindung ist, kann eine Vielzahl an Basensequenzen, je nach dem verwendeten natürlichen bakteriellen Signalpeptid, haben. Spezifische Beispiele des natürlichen bakteriellen Signalpeptids sind das von β-Lactamase [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75, 3737 (1978)], das des Lipoproteins [ibid, 74, 1004 (1977)] und das der alkalischen Phosphatase [Eur. J. Biochem., 96, 49 (1979)]. Bezüglich der Signalpeptide kann auf "Tampakushitsu- Kakusan-Koso" (Protein, Nucleic Acid and Enzyme), Sonderauflage ("Genetic Manipulation"), Bd. 26, Nr. 4, S. 386-394, verwiesen werden. Erfindungsgemäß können diese Signalpeptide aus natürlichen Produkten ebenso wie DNA's, die nach deren Basensequenzen synthetisiert wurden, verwendet werden (dabei ist das erstere bevorzugt).
- Die DNA für das natürliche bakterielle Signalpeptid-Gen, die bevorzugt erfindungsgemäß verwendet wird, ist eine, die die Basensequenz der alkalischen Phosphatase besitzt, bevorzugt eine, die von der alkalischen Phosphatase stammt. Der Grund ist die Tatsache, daß die Vorteile, die mit Bezug auf Fig. 1 beschrieben worden sind, erhalten werden können.
- Bei einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen DNA-Gens, das in Fig. I gezeigt ist, das, wie im folgenden ausführlich beschrieben wird, durch Modifikation der DNA aus der alkalischen Phosphatase hergestellt wurde, ist der DNA-Teil (2) aus der alkalischen Phosphatase an den DNA-Teil (1) des Gens für das natürliche bakterielle Signalpeptid unmittelbar nach dessen Stromabwärtsende geknüpft. Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen DNA-Gens ist eine, bei der der DNA-Teil (2) der DNA-Teil ist, der dem Gen, das für das exogene Protein codiert, entspricht. Um bei dem Zweck für die Einführung der Schnittstelle für die Restriktions-Endonuclease zu bleiben, die Ausführungsform, bei der der DNA-Teil (2) von einem exogenen Gen stammt, kann als ein spezifisches Beispiel entsprechend der Aufgabe der vorliegenden Erfindung bezeichnet werden.
- Ein Beispiel für das erfindungsgemäße DNA-Gen, das unter die zuletzt genannte Ausführungsform davon fällt, umfaßt den DNA-Teil für das natürliche bakterielle Signalpeptid-Gen, bestehend aus dem Rest aus einem natürlichen Produkt und einem synthetisierten Rest. Genauer, der Rest stromaufwärts der Schnittstelle der Restriktions-Endonuclease, wobei diese Schnittstelle dazugehört, stammt von einem natürlichen Produkt, während der Rest stromabwärts der Schnittstelle ein synthetisierter Rest ist. Der synthetisierte Rest stromabwärts der Schnittstelle in dem Beispiel, das in Fig. 1 gezeigt ist, sind die vier Basen (AGCT) der -Kette, aber ein synthetisierter Rest ist ebenfalls in der -Kette erforderlich, wenn die Schnittstelle stromaufwärts der gezeigten Position vorliegt.
- Das Verfahren zur Herstellung des DNA-Gens, das für das Signalpeptid-Gen codiert, umfaßt die Stufen:
- (a) Bereitstellung einer DNA, die ein Gen, das für ein natürliches bakterielles Signalpeptid codiert, und
- (b) Modifizieren der Basensequenz des Gens gegen das Stromabwärtsende ohne Veränderung der Aminosäuresequenz entsprechend dieser Basensequenz, wodurch eine Erkennungsstelle für die Restriktions-Endonuclease geschaffen wird, von der zumindest ein Teil auf diesem Gen lokalisiert ist.
- Das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen DNA kann alternativ als ein Verfahren zur Modifizierung eines gegebenen DNA-Gens verstanden werden.
- Wie oben beschrieben, besitzt das erfindungsgemaße DNA-Gen einen DNA-Teil, der von einem exogenen Gen, das unmittelbar nach dem Stromabwärtsende des Gens für das natürliche bakterielle Signalpeptid vorliegt, stammt. Ein solches DNA-Gen kann durch Ausführen der Stufen (c) bis (e), die im folgenden für das DNA-Gen, dessen Herstellung oben beschrieben wurde, dargelegt sind, hergestellt werden:
- (c) Schneiden der DNA mit der von dieser Stelle erkannten Restriktions-Endonuclease, wodurch ein von der Restriktions-Endonuclease geschnittenes Ende erhalten wird;
- (d) Bereitstellen eines weiteren DNA-Fragments mit dem von der gleichen Restriktions-Endonuclease geschnittenen Ende an seinem Stromaufwärtsende, gefolgt, sofern notwendig, von einem DNA-Teil, der zur Rekonstitution des Gens für das natürliche bakterielle Signalpeptid nützlich ist, wobei auf das letztere ein exogenes Gen folgt; und
- (e) Verknüpfen der DNA-Fragmente der obigen Stufen (c) und (d) aneinander an den von der Restriktions-Endonuclease geschnittenen Enden, wodurch eine DNA erhalten wird, die ein Gen, das für ein natürliches bakterielles Signalpeptid codiert, und das exogene Gen, das direkt an das Stromabwärtsende des Signalpeptid-Gens verknüpft ist, umfaßt.
- Das "DNA-Fragment von (d)" ist nicht wesentlich dahingehend, daß es nicht benötigt wird, wenn die Schnittstelle an dem Stromabwärtsende der DNA des natürlichen bakteriellen Signalpeptids liegt, aber es wird benötigt, wenn die Schnittstelle stromaufwärts des Stromabwärtsendes der DNA liegt, und somit gibt es einen DNA-Teil zwischen der Schnittstelle und dem Stromabwärtsende der DNA, der abgespalten wird, wenn die Spaltung durchgeführt wird und somit benötigt wird, um die zuerst desintegrierte natürliche bakterielle Signalpeptid-DNA wiederherzustellen, wenn die Verknüpfung des exogenen Gens durchgeführt wird.
- Zur Schaffung einer Erkennungsstelle für die Restriktions-Endonuclease durch Modifikation von mindestens einem Basenpaar der DNA für das natürliche bakterielle Signalpeptid-Gen und, sofern erforderlich, der Gen- DNA stromabwärts von dem natürlichen bakteriellen Signalpeptid kann jedes Verfahren, das zu diesem Zweck geeignet ist, verwendet werden.
- Als Verfahren zur Modifikation der Basensequenz kann ein Verfahren wie das Punktmutationsverfahren, bei dem ein synthetisches Fragment verwendet wird, das Verfahren, bei dem ein Mutationsinduktor (Röntgenstrahlen, N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin etc.) verwendet wird, das Verfahren, bei dem die Mutation durch die Verwendung von Sulfidionen oder Nitritionen verursacht wird, oder das Verfahren durch Austausch mit einem synthetisierten Gen in Betracht gezogen werden. Jedoch ist als Verfahren, das einfach und zuverlässig bezüglich des Erhalts eines gewünschten DNA-Gens ist, es bevorzugt, das Punktmutationsverfahren zu verwenden, bei dem ein synthetisches Fragment verwendet wird [Science, 29, 19, September (1980)].
- Der wesentliche Punkt bei der Modifikation der Basensequenz ist die Schaffung einer Erkennungsstelle für die Restriktions-Endonuclease ohne Veränderung der Aminosäuresequenz innerhalb eines gegebenen Signalpeptids. Die Erkennungsstelle für die Restriktions-Endonuclease, die in dem Gen, das für das Signalpeptid codiert, liegt, sollte bevorzugt so nahe wie möglich dem Schnittpunkt des Signalpeptids durch die Signal-Peptidase sein, bevorzugter sollte dessen Schnittstelle mit dem Schnittpunkt des Signalpeptids, wie oben beschrieben, zusammenfallen. Gemäß der bevorzugtesten Ausführungsform, wie in Fig. 1 gezeigt, wird das Codon GCC an dem Stromabwärtsende der Basensequenz (1), die für das natürliche bakterielle Signalpeptid der alkalischen Phosphatase codiert, zu GCT modifiziert, wodurch die Aminosäuresequenz durch diese Modifikation nicht verändert wird, da GCC und GCT beide für Alanin codieren, und ferner wird die Base (c) gerade stromabwärts von dem Gen (1) für das Signalpeptid zu T modifiziert, wodurch die Erkennungsstelle für die Restriktions-Endonuclease Hind III geschaffen wird. In diesem Fall fallen der Schnittpunkt (gezeigt durch den Pfeil (4)) und die Schnittstelle für die Restriktions-Endonuclease (unterbrochene Linie) aufeinander. Folglich wird die Verknüpfung eines gewünschten exogenen Strukturgens an das Signalpeptid unmittelbar danach möglich gemacht. In diesem Falle ist das von der Restriktions-Endonuclease geschnittene Ende ein kohäsives Ende. Indem ein gewünschtes exogenes Gen mit einem kohäsiven Ende von AGCT an seinem Stromaufwärtsende versehen wird, ist es möglich, ein fusioniertes Protein zu erhalten, in dem das Signalpeptid und das exogene Protein direkt miteinander verknüpft sind, um die obige Aufgabe, wie oben beschrieben, zu erfüllen.
- Das erfindungsgemäße DNA-Gen kann als Vektor in einer derartigen Form verwendet werden, daß ein gewünschtes exogenes Strukturgen an das DNA- Gen geknüpft wird und daß, wenn notwendig, es in ein Plasmid oder in einen Phagen an einer geeigneten Position stromabwärts seines Promotors inseriert wird. Durch Einführen eines exogenen Gens, das in einen Vektor inkorporiert ist, in einen Wirts-Mikroorganismus, wie beispielsweise E. coli, und Kultivieren des Wirts-Mikroorganismus würde das durch Expression des exogenen Gens gebildete Protein durch Wirkung des natürlichen bakteriellen Signalpeptids aus den Mikroorganismenzellen ausgeschieden werden. Eine solche Verwendung der erfindungsgemäßen Gen-DNA kann natürlich in geeigneter Weise durchgeführt werden, wobei auf Textbücher oder Literatur betreffend die rekombinante DNA-Technologie Bezug genommen wird.
- Ein typisches Verfahren zur Verwendung des erfindungsgemäßen DNA- Gens ist die als Plasmid, das als Vektor verwendet werden soll. Ein solches Plasmid umfaßt einen DNA-Teil entsprechend der kontrollierenden Region aus der alkalischen Phosphatase und ein Gen, das für das Signalpeptid der alkalischen Phosphatase unter der Kontrolle dieser Region codiert, wobei das Gen, das für das Signalpeptid codiert, so definiert ist, daß es eine künstlich geschaffene Erkennungsstelle für eine Restriktions-Endonuclease besitzt, so daß die Aminosäuresequenz, die von der Basensequenz codiert wird, nicht verändert wird, und daß die entsprechende Schnittstelle am Stromabwärtsende des Gens liegt.
- Somit ist bei dem Plasmid das bevorzugte erfindungsgemäße DNA- Gen, wie oben beschrieben, in ein Plasmid inkorporiert, welches eine Kontrollregion der alkalischen Phosphatase besitzt, so daß das Gen unter Kontrolle dieser Region gesetzt wird, wodurch die Proliferation innerhalb eines Wirts-Mikroorganismus ermöglicht wird.
- Ein spezifisches Beispiel für dieses Plasmid besitzt das Codon (x) am Stromabwärtsende des natürlichen bakteriellen Signalpeptid-Gens entsprechend dem Gen, das für das Signalpeptid des Plasmids pYK codiert [dieses Plasmid wurde als E. coli K12c600, welcher dieses Plasmid enthält, nämlich E. coli K12c600 (pYK 283), bei dem Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science & Technology, Japan (FERM-BP 556) hinterlegt]. Ferner ist bei diesem Plasmid das Startcodon (y) des DNA-Teils daran stromabwärts von dem Codon (x) geknüpft, wobei die Codons (x und y), wie in Fig. 1 gezeigt, sind. Die bakteriologischen Eigenschaften von E. coli K12c600 (pYK 283) sind die gleichen wie die des Wirts-Mikroorganismus E. coli K12c600, ausgenommen die Eigenschaften, die von dem Plasmid pYK 283, das darin enthalten ist, stammen, und einige der spezifischen Eigenschaften sind in dem der Probe des bei dem Fermentation Research Insitute, Agency of Industrial Science & Technology hinterlegten Mikroorganismus beigefügten Dokument beschrieben.
- Das Plasmid pTA 529 kann nach dem in Fig. 2 gezeigten Verfahren gebildet werden. Es ist jedoch zu verstehen, daß es auch andere Verfahren als das in Fig. 2 gezeigte gibt, und die Plasmide, die andere erfindungsgemäße DNA-Gene inkorporieren, können auch auf ähnliche Weise hergestellt werden.
- Nun wird mit Bezug auf Fig. 2 das Plasmid pYK 283 ( ) der Behandlung mit der Restriktions-Endonuclease EcoRI in Gegenwart von Ethidiumbromid (EtBr) unter Bildung einer DNA , die eine doppelsträngige cyclische DNA mit einem Strangbruch in einem Strang ist, unterworfen, und das Plasmid mit dem Strangbruch wird dann dem Abbau durch die Exonuclease 111 unter Bildung einer einzelsträngigen DNA ( ) unterworfen. Die so erhaltene einzelsträngige DNA wird dann zu einer Hetero-Duplex-DNA durch die Wirkung der DNA-Polymerase I auf sie verarbeitet, wobei als Primer ein synthetisches Oligonucleotid zur Induzierung einer zuvor synthetisierten Punktmutation in eine doppelsträngige DNA verwendet wurde, welche dann in die Hetero-Duplex-DNA nach der Wirkung einer DNA-Ligase (T4-DNA- Ligase) konvertiert wurde. Danach wurde die Hetero-Duplex in E. coli K12c600 nach dem Verfahren von Kuschner [Genetic Engineering, 1978, 17 (1978)] eingeführt, um den Wirt zu transformieren, und Stämme, die Ampicillin-resistent geworden waren, werden erhalten ( ).
- Unter diesen Stämmen wurde der gewünschte Mutantenstamm nach Koloniehybridisierung (Methods in Enzymology, 68, 379, Academic Press, Inc., New York, 1979) erhalten. Schließlich wurde das Plasmid aus diesem Stamm entnommen, und es wurde nach dem Maxam-Gilbert-Verfahren (Methods in Enzymology, Bd. 65, Nucleic Acid Part I, 499-560 (1980), Academic Press) bestätigt, ob oder ob nicht die gewünschte Sequenz zum Erhalt des Plasmids pTA 529 gebildet worden war.
- Bezüglich der Einzelheiten zur Herstellung des Plasmids wird auf die im folgenden gezeigten Versuchsbeispiele verwiesen. Als Verfahren zur Synthese des Oligonucleotids als dem oben erwähnten Primer kann auf das Diester-Verfahren [Science, 203, 614 (1979)], das Triester-Verfahren [Nucleic Acids Research 8, 2331 (1980), ibid 9, 5193 (1980), ibid 8, 5491 (1980)] oder das Festphasen-Verfahren [Nature, 281, 18 (1979), Biochemistry 1980, 6096 (1980)], das Flüssigphasen-Verfahren oder das Verfahren unter Verwendung eines Enzyms [Nucleic Acids Research, 8, 5753 (1980)] etc. verwiesen werden. Im Falle der vorliegenden Erfindung ist das Festphasen-Verfahren bevorzugt.
- Als Oligonucleotid zur Induktion der Punktmutation wurde ein Fragment mit der folgenden Basensequenz synthetisiert:
- GA - CA - AAA - GC - TT - GG - GG - AA - TT - C --
- Darin steht G für Guanin, A für Adenin, C für Cytosin, T für Thymin und -- für Polystyrol.
- Unter Verwendung von 30 mg eines 1%igen Polystyrolharzes, an welches Cytosin gebunden worden war, eines 3'-terminalen Nucleotids vom Diester-Typ (20 mg eines Monomeren, 25 mg eines Dimeren und 35 mg eines Trimeren) und 20 mg des Kondensationsmittels Mesitylensulfonyltriazolid (im folgenden als MSNT bezeichnet) wurde die Kondensation erfolgreich wiederholt, wobei eine gewünschte Kettenlänge nach dem Verfahren von Nucleic Acid Research 8, 5491 (1980) erhalten wurde. Die Gesamtausbeute der Kondensation erwies sich als 35%. Nach Beendigung des letzten Kondensationsschritts wurde das Harz getrocknet, und 308 ul einer Lösung aus 0,5 M Picolinaldoxintetramethylguanidin in Pyridin-Wasser (9:1) wurde zugesetzt, und das Gemisch wurde über Nacht bei 37ºC stehengelassen. Danach wurde konz. Ammoniakwasser (4 ml) zugesetzt, und danach wurde das Gemisch über Nacht bei 55ºC stehengelassen, und das Harz wurde durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde in Wasser aufgelöst und mit Ether extrahiert (Entfernung der Schutzgruppen). Anschließend wurde der Etherextrakt einer Gelfiltration mit Sephadex® G-50 (Eluent: 50 mM Triethylammoniumbicarbonat, pH 7,5) unterworfen. Während der Gelfiltration wurde die Absorption bei 260 nm der jeweiligen Fraktionen gemessen, und der Peak, der zuerst eluierte, wurde gewonnen und der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) unterworfen. Danach folgte eine Umsetzung in 2 ml 80%iger Essigsäure bei Raumtemperatur für 10 Minuten zur Umwandlung in ein 5'-Hydroxylderivat, um das gewünschte synthetische Segment zu erhalten. Als Säule wurde die u-Bondapak® C 18 (Umkehrphase) verwendet. Die Basensequenz des synthetisierten Oligonucleotids wurde nach dem Maxam-Gilbert-Verfahren bestätigt.
- Als nächste Stufe wurden 300 pmol des synthetisierten Fragments gefriergetrocknet und mit 1,5 ul Polynucleotid-Kinase (15 Einheiten) in 20 ul einer Lösung aus 50 mM Tris-hydrochlorid-Puffer (pH 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 5 mM DTT (Dithiothreit) und 1,25 mM ATP bei 37ºC 2 Stunden lang umsetzen gelassen (Phosphorylierung) und danach bei 90ºC 2 Stunden lang zum Sieden erhitzt, um die Phosphorylierungsreaktion zu beenden. Dann wurde das Reaktionsgemisch mit Sephadex® G-50 unter Erhalt des gewünschten Oligomeren entsalzt.
- Das Plasmid pYK 283 (10 ug) wurde in 100 ul einer Lösung aus 100 mM Tris-hydrochlorid-Puffer (pH 7,5), 7 mM Magnesiumchlorid, 50 mM Natriumchlorid, 7 mM Mercaptoethanol, 120 ug/ml Ethidiumbromid und 0,01% Nonidet (eingetragenes Warenzeichen) P-40 aufgelöst, und 2 u¹ EcoRI (10.000 U/1,67 ml) wurden zugesetzt, um die Reaktion bei 37ºC 1 Stunde lang durchzuführen. Nach Entfernung der Proteine durch Zugabe von Phenol-Chloroform (1:1) wurde eine Ethanolfällung durchgeführt. Das Präzipitat wurde in 50 ul einer Lösung aus 10 mM Tris-hydrochlorid-Puffer (pH 7,5), 7 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Natriumchlorid, 7 mM Mercaptoethanol aufgelöst und mit 1,5 ul Exonuclease 111 (5.000 U/107 ul) bei 37ºC 1 Stunde lang reagieren gelassen.
- Nach Beendigung der Reaktion wurden 1,5 ul Hinf I (5.000 U/883 ul) und 1 ul bakterielle alkalische Phosphatase (BAP) (10.000 U/39 ul) der Lösung zugesetzt, und die Reaktion wurde 1 Stunde lang durchgeführt. Nach Entfernung der Proteine durch Zugabe von Phenol-Chloroform (1:1) wurde eine Ethanolfällung durchgeführt. Zu dem Präzipitat wurden 3 ul E. coli-DNA- Polymerase I, größeres Fragment (200 U/134 ul), und 3 ul T4 DNA-Ligase (200 U/80 ul) in einer Lösung aus 60 pmol des Oligonucleotids, das an dem 5'-Ende mit 2 ul Polynucleotid-Kinase (200 U/20 ul), wie oben synthetisiert, phosphoryliert war, 20 mM Tris-hydrochlorid-Puffer (pH 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 10 mM DTT, 750 uM jeweils von dATP, dGTP, dCTP und TTP und 1 mM ATP gegeben, und die Reaktion wurde über Nacht bei 14ºC durchgeführt. Nach Entfernen des Proteins durch Zugabe von Phenol-Chloroform (1:1) wurde eine Ethanolfällung durchgeführt, um eine geschlossene zirkuläre DNA zu erhalten.
- Unter Verwendung der obigen DNA in einer Menge, die etwa 2 ug der DNA-Menge des pYK 283 äquivalent ist, wurde die Transformation von E. coli K12c600 nach dem Verfahren von Kuschner durchgeführt. Genauer, nachdem der E. coli K12c600-Stamm in 2 ml L-Medium auf 0,3 bis 0,4 OD/550 nm kultiviert worden war, wurden die Mikroorganismen gewonnen und unter Eiskühlung in 1 ml einer Lösung aus 10 mM MOPS (3-[N-Morpholino]-propansulfonsäure) (pH 7,0), 10 mM Rubidiumchlorid suspendiert. Unmittelbar daran schloß sich die Gewinnung der Mikroorganismen an. Anschließend wurden die Mikroorganismen in 1 ml einer Lösung aus 100 mM MOPS (pH 6,5), 10 mM Rubidiumchlorid, 50 mM Calciumchlorid suspendiert und in einem Eisbad 30 Minuten lang stehengelassen.
- Wieder wurden die Mikroorganismen nach ihrer Gewinnung in 0,2 ml einer Lösung aus 100 mM MOPS (pH 6,5), 10 mM Rubidiumchlorid, 50 mM Calciumchlorid suspendiert, und 3 ul DMSO (Dimethylsulfoxid) und DNA (das Reaktionsgemisch nach Induktion der Punktmutation, gewonnen durch Ethanolfällung) wurden zugesetzt, und das Gemisch wurde weiter in einem Eisbad 30 Minuten lang stehengelassen. Danach wurden nach Erhitzen auf 45ºC für 1 Minute 2 ml L-Medium zugesetzt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde lang stehengelassen. Danach wurden 1200 Stämme, die Ampicillin-resistent geworden waren, auf eine L-Platte (1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% Natriumchlorid, 1,5% Agar), welche Ampicillin enthielt, erhalten.
- Die Klonierung wurde durch Koloniehybridisierung durchgeführt. Genauer, 550 Stämme der obigen 1200 Ampicillin-resistenten Stämme wurden auf ein Nitrocellulosefilter überführt, über Nacht auf einer L-Platte kultiviert, dann auf eine Spectinomycin-(300 ug/ml)-haltige L-Platte transferiert und weiter über Nacht kultiviert. Das Filter wurde in 0,5n Natriumhydroxid 15 Minuten lang eingetaucht und zweimal mit 0,5 M Tris-hydrochlorid- Puffer (pH 7,5), 1,5 M Natriumchlorid gewaschen. Danach wurde nach Waschen mit 0,03 M Natriumcitrat, 0,3 M Natriumchlorid das Filter bei 60ºC 1 Stunde lang getrocknet und weiter im Vakuumofen bei 80ºC 2 Stunden lang getrocknet. Das Filter wurde über Nacht bei 37ºC in einer Lösung (6 ml), welche 0,9 M Natriumchlorid, 0,09 M Tris-hydrochlorid-Puffer (pH 7,5), 0,006 M EDTA, 0,1% Ficoll, 0,1% Polyvinylpyrrolidon (PVP), 0,1% Rinderserumalbumin (BSA), 0,5% SDS, 10% Dextransulfat und 100 ug/ml E. coli-DNA enthielt, eingetaucht.
- Zu dem Filter wurden 2.500.000 cpm/ml des durch Markieren von 15 pmol des zuvor synthetisierten Oligonucleotids mit (γ-32P)ATP erhaltenen Produkts zugesetzt, und der Filter wurde weiter bei 37ºC 2 Tage lang stehengelassen. Anschließend wurde der Filter mit 0,9 M Natriumcitrat, 0,9 M Natriumchlorid bei 42ºC je dreimal für 3 Minuten gewaschen, und danach wurde er getrocknet. Die Autoradiographie des getrockneten Produkts ergab drei Stämme, die positive Reaktivität zeigten. Die Ergebnisse der Autoradiographie sind in den Fig. 3A und 3B gezeigt. A zeigt das Gesamtergebnis, und B zeigt einen Teilausschnitt davon in Vergrößerung. Der dichtschwarze Punkt in den Figuren ist der mutierte Stamm.
- Das Plasmid wurde aus den drei erhaltenen Stämmen herausgenommen und mit der Restriktions-Endonuclease Hind III hydrolysiert, wodurch bestätigt wurde, ob die Erkennungsstelle für die Restriktions-Endonuclease geschaffen worden war oder nicht. Das Plasmid wurde durch Kultivieren des transformierten Stammes in Gegenwart von 25 ug/ml Ampicillin in 5 ml L-Medium auf 0,4 OD/550 nm hergestellt, und Spectinomycin wurde auf eine Endkonzentration von 300 ug/ml zugesetzt, wonach die Kultur über Nacht stehengelassen wurde. Von der kultivierten Mikroorganismen-Bouillon wurde 2 ml entnommen und durch Zugabe von 100 ul einer Lösung, welche 2 mg/ml Lysozym, 50 mM Glucose, 10 mM CDTA (1,2-Diaminocyclohexan-N,N,N',N'-tetraessigsäure) und 25 mM Tris-hydrochlorid-Puffer (pH 8,0) enthielt, suspendiert, und die Suspension wurde unter Eiskühlung 30 Minuten lang stehengelassen. Danach wurde nach Zentrifugation (5 Minuten bei 12.000 g) der Überstand mit Chloroform-Phenol (1:1) extrahiert. Danach wurde 1 ml Ethanol zu der wäßrigen Schicht gegeben, und das Gemisch wurde bei -70ºC 5 Minuten lang stehengelassen und weiter zentrifugiert (5 Minuten bei 12.000 g).
- Die Bestätigung der Schaffung der Erkennungsstelle für die Restriktions-Endonuclease wurde durch 1% Agarosegel-Elektrophorese durchgeführt. Danach wurde die Ethanolfällung weiter zweimal für das erhaltene Präzipitat wiederholt, und das Präzipitat wurde mit Hind III hydrolysiert. Das Ergebnis der Elektrophorese ist in Fig. 4 gezeigt, in der A und B von der linken Seite Plasmid pYK 283 betreffen, wobei A durch Reaktion mit Hind III erhalten worden war und B die Kontrolle ist. C und D betreffen das erfindungsgemäße Plasmid, wobei C durch Reaktion mit EcoRI, D mit Hind III erhalten worden sind und E die Kontrolle ist.
- Im allgemeinen läßt sich aus dem Verhalten der DNA in der Gel- Elektrophorese ableiten, daß Behandlung von ccc DNA (kovalent geschlossene zirkuläre DNA) mit einem Restriktionsenzym sie zu einer geradkettigen DNA macht, wodurch ihre Mobilität kleiner wird. In Fig. 4 kann man an A und B sehen, daß keine Veränderung in der Bande, selbst durch Behandlung von pYK 283 mit der Restriktions-Endonuclease Hind III, vorliegt, was anzeigt, daß kein Spaltpunkt für Hind III vorliegt. Andererseits kann man an C (Behandlung mit EcoRI), D (Behandlung mit Hind III) und E (Kontrolle) sehen, daß die Mobilität der DNA, die einer Behandlung mit Restriktions-Endonuclease (C, D) unterworfen wurde, größer wird, wobei die Bande auf der -Seite von Kontrolle E erscheint. So kann man sehen, daß eine neue Erkennungsstelle für die Restriktions-Endonuclease Hind III geschaffen wurde. Ebenso wurde die Basensequenz in der Nachbarschaft der Erkennungsstelle von Hind 111 dieses Plasmids nach dem Maxam-Gilbert-Verfahren (Fig. 5) bestätigt. Die Basensequenz zwischen A und B in der Figur lautet GAATTCCCCAAGCTTTT- GTCA. In Fig. 5 zeigen die Pfeile (←) die modifizierte Basensequenz an. Somit kann man sehen, daß, wie durch die zwei Plasmide (pTA 529 und pYK 283) in 6 in Fig. 2 gezeigt wird, nur der Teil, der durch den Pfeil (↑) angezeigt wird, verändert wird, mit dem Ergebnis, daß die Erkennungsstelle für die Restriktions-Endonuclease Hind III (der Teil, um den ein Kreis mit einer durchbrochenen Linie gezogen ist) neu geschaffen wurde.
Claims (10)
1. DNA, umfassend ein Gen, das für ein natürliches
bakterielles Signalpeptid codiert, wobei das Gen sich von dem
entsprechenden natürlichen Gen dadurch unterscheidet, daß
es gegen sein Stromabwärtsende mindestens einen Teil einer
Erkennungsstelle einer Restriktions-Endonuclease, die
künstlich aus dem natürlichen Gen unter Verwendung der
Degeneriertheit des genetischen Codes geschaffen wurde, so
daß die gleiche Aminosäuresequenz codiert wird, besitzt.
2. DNA nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß die Schnittstelle in der Erkennungsstelle für
die Restriktions-Endonuclease am Stromabwärtsende dieses
Gens liegt.
3. DNA nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß die Erkennungsstelle für die Restriktions-
Endonuclease stromaufwärts von dem Stromabwärtsende des
Gens liegt und daß der Teil des Gens zwischen der
Erkennungsstelle und dem Stromabwärtsende so ist, daß das
natürliche bakterielle Signalpeptid noch codiert wird.
4. DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß es weiterhin ein exogenes
Gen in direkter Bindung an das Stromabwärtsende des
Signalpeptid-Gens enthält.
5. DNA nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß das Gen, das für ein natürliches bakterielles
Signalpeptid codiert, aus einer alkalischen Phosphatase
stammt, die Erkennungsstelle für die
Restriktions-Endonuclease die Hind-III-Erkennungsstelle ist und die Spalt
stelle für die Restriktions-Endonuclease am
Stromabwärtsende des Gens lokalisiert ist.
6. Verfahren zur Herstellung einer DNA nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß man
(a) eine DNA, die ein Gen, das für ein natürliches
bakterielles Signalpeptid codiert, enthält, bereitstellt
und
(b) die Basensequenz des Gens gegen sein
Stromabwärtsende ohne Veränderung der Aminosäuresequenz
entsprechend der Basensequenz modifiziert, wodurch eine
Erkennungsstelle für eine Restriktions-Endonuclease geschaffen
wird, von der mindestens ein Teil auf dem Gen lokalisiert
ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch
gekennzeichnet, daß man nach Stufe (b),
(c) die DNA mit der Restriktions-Endonuclease, die
von dieser Stelle erkannt wird, schneidet, wodurch ein
geschnittenes Ende der Restriktions-Endonuclease erhalten
wird,
(d) ein weiteres DNA-Fragment bereitstellt, das ein
durch die gleiche Restriktions-Endonuclease geschnittenes
Ende an seinem Stromaufwärtsende besitzt, an das sich,
sofern notwendig, ein DNA-Teil anschließt, der nützlich ist,
um das Gen für das natürliche bakterielle Signalpeptid zu
rekonstituieren, wobei auf das letztere ein exogenes Gen
folgt, und
(e) die DNA-Fragmente aus den obigen Stufen (c) und
(d) aneinander an den durch die Restriktions-Endonuclease
geschnittenen Enden bindet, wodurch eine DNA erhalten wird,
die ein Gen, das für ein natürliches bakterielles
Signalpeptid
codiert, und das exogene Gen, das direkt an das
Stromabwärtsende des Signalpeptid-Gens gebunden ist,
umfaßt.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch
gekennzeichnet, daß die Modifikation der
Basensequenz durch Punktmutation unter Verwendung eines
synthetischen Fragments erzielt wird.
9. Plasmid, umfassend die Kontrollregion, die sich von
einem Gen für die alkalische Phosphatase ableitet, und ein
Gen, das für das Signalpeptid der alkalischen Phosphatase
codiert, wobei das Gen, das für das Signalpeptid codiert,
so definiert ist, daß es eine künstlich geschaffene
Erkennungsstelle für eine Restriktions-Endonuclease besitzt, so
daß die Aminosäuresequenz, die durch die Basensequenz
codiert wird, nicht verändert wird, und daß die entsprechende
Schnittstelle am Stromabwärtsende des Gens liegt.
10. Plasmid pTA 529, enthaltend die in Fig. 1 gezeigte
Sequenz, wobei das Plasmid aus Plasmid pYK 283 (FERM BP-556),
wie in Fig. 2 gezeigt, erhältlich ist.
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1984
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