DE3486425T2

DE3486425T2 - Wachstumshormon-Analoga, pharmazeutische und veterinäre Zusammensetzungen, die diese enthalten, sowie Methoden für ihre Herstellung

Info

Publication number: DE3486425T2
Application number: DE3486425T
Authority: DE
Inventors: Haim Aviv; Marian Gorecki; Avigdor Levanon; Amos Oppenheim; Tikva Vogel; Elisha Zeelon; Menachem Zeevi
Original assignee: Savient Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Savient Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1983-07-15
Filing date: 1984-07-03
Publication date: 1996-10-17
Anticipated expiration: 2004-07-04
Also published as: ZA845345B; AU3034584A; BR8403523A; JP3146161B2; NZ208897A; DK347184A; FI842842A; ATE66959T1; AU577298B2; HU209878B; RO91332B; JP2568376B2; US4997916A; HK128095A; RO91332A; IL91826A0; IL91828A0; SK278576B6; EP0319049B1; DD229427A5

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Ein Aspekt der Gentechnologie besteht in der Insertion bzw. Einfügung von Fremd-DNA-Sequenzen aus eukaryontischen Quellen in Escherichia coli oder sonstige Mikroorganismen. Eine weitere Verfeinerung der Gentechnologie besteht darin, den erhaltenen Mikroorganismus dazu zu veranlassen, durch die Fremd-DNA codierte Polypeptide zu produzieren. Die Produktion von Polypeptiden kann als zweistufiges Verfahren, bei dem jede Stufe zahlreiche Unterstufen umfaßt, angesehen werden. Die beiden Stufen sind die Transkription und Translation. Zur wirksamen und mengenmäßig akzeptablen Polypeptidproduktion müssen beide Stufen des Verfahrens wirksam ablaufen. Die Transkription ist die Produktion von mRNA aus dem Gen (DNA). Die Translation ist die Produktion von Polypeptid aus der mRNA.
Eine kritische Unterstufe des Transkriptionsverfahrens ist die Initiation bzw. Einleitung, d.h. die Bindung von RNA- Polymerase an einen Promotor-Operator-Bereich. Die Sequenz von Desoxyribonucleotidbasen, die den Promotorbereich bilden, kann variieren und dabei die relative Leistungsfähigkeit des Promotors bewirken. Die Leistungsfähigkeit hängt von der Affinität der RNA-Polymerase zu dem Promotor ab.
Die Leistungsfähigkeit einer Translation wird durch die Stabilität der mRNA beeinflußt. Eine erhöhte Stabilität der mRNA gestattet eine verbesserte Translation. Obwohl die genauen Determinanten der mRNA-Stabilität nicht genau bekannt sind, ist es bekannt, daß die durch die Sequenz ihrer Basen bestimmte mRNA-Sekundärstruktur für die Stabilität eine Rolle spielt.
Die anfängliche Unterstufe der Translation umfaßt eine Bindung des Ribosoms an eine als Shine-Dalgarno-Sequenz oder ribosomale Bindungsstelle (RBS) bekannte Basesequenz auf der mRNA. Die Synthese von Polypeptiden beginnt, wenn das Ribosom längs der mRNA zum AUG-Startcodon für die Translation wandert. Im allgemeinen finden sich diese Codons etwa 10 Basen "stromabwärts" von der Shine-Dalgarno-Stelle. Faktoren, die die Leistungsfähigkeit der Translation steigern, sind solche, die eine Bindung der Ribosomen an die Shine-Dalgarno-Stelle fördern. Es wurde gezeigt, daß die Sekundärstruktur der mRNA im Bereich der Shine-Dalgarno-Sequenz und des AUG-Codons und der Abstand zwischen der Shine-Dalgarno-Sequenz und dem AUG-Codon beide eine kritische Rolle bei der Bestimmung der Leistungsfähigkeit der Translation spielen. Andere Faktoren, die die Leistungsfähigkeit der Translation beeinflussen, sind eine vorzeitige Termination bzw. Beendigung und eine Abschwächung. Die Leistungsfähigkeit der Translation läßt sich durch Entfernen der Schwächungsstellen verbessern.
Eine bei Versuchen zur Produktion großer Mengen eukaryotischer Polypeptide in Bakterienzellen auftretende Schwierigkeit besteht in der Unfähigkeit von große Mengen mRNA produzierenden Zellen, wirksam zu wachsen. Diese Schwierigkeit läßt sich dadurch beseitigen, daß man nach einem als Repression bekannten Verfahren eine Transkription verhindert. Bei der Repression werden Gene infolge der Wirkung eines Proteininhibitors (Repressorproteins), der eine Transkription durch Bindung an den Operatorbereich verhindert, abgeschaltet. Nachdem Mikroorganismen bis zu der gewünschten Zellendichte gewachsen sind, werden die einer Repression ausgesetzten Gene durch Zerstörung des Repressors oder durch Zusatz von als die Wirkung des Repressors überwindende Induktoren bekannten Molekülen aktiviert.
Es gibt zahlreiche Berichte in der Literatur betreffend das Klonen eukaryotischer Gene in Plasmiden mit dem PL-Promotor von λ-Bakteriophagen (H.V. Bernard et al., Gene (1979) 5, 59; C. Derom et al., Gene (1982) 17, 45; D. Gheysen et al., Gene (1982) 17, 55: J. Hedgpeth et al., Mol. Gen. Genet. (1978) 163, 197; E. Remaut et al., (1981), Gene 15, 81; und R. Derynck et al., Nature (1980) 287, 193). Darüber hinaus beschreibt die europäische Patentanmeldung Nr. 041 767 (Veröffentlichungsdatum: 16. Dezember 1981) Expressionsvektoren mit dem PL-Promotor von λ-Bakteriophagen. Keine dieser Literaturstellen beschreibt jedoch die Verwendung der CII-ribosomalen Bindungsstelle.
Die Verwendung eines Vektors mit dem PL-Promotor von Bakteriophagen und der CII-ribosomalen Bindungsstelle wurde bereits beschrieben (A.B. Oppenheim et al., J. Mol. Biol. (1982) 158, 327 und H. Shimatake und M. Rosenberg, Nature (1981) 292, 128). Diese Veröffentlichungen beschreiben die Produktion erhöhter Mengen an CII-Protein, sie befassen sich jedoch nicht mit der Produktion eukaryotischer Proteine bzw. beschrieben sie auch nicht.
1982 präsentierten Shatzman und Rosenberg auf dem 14. Miami Winter Symposium (A.R. Shatzman und M. Rosenberg, 14 Miami Winter Symposium, abstract p98 [1982]) ein Poster. Diese Zusammenfassung liefert eine nicht-befähigende Offenbarung der Verwendung eines Vektors mit PL aus λ-Bakteriophagen, Nut und der CII-ribosomalen Bindungsstelle zur Synthese eines "eukaryotischen" Polypeptids (SV40 kleines T Antigen, bei dem es sich in der Tat nicht um ein eukaryotisches Polypeptid, sondern ein Virusprotein handelt) in einer Menge über 5% des Zellproteins in einem ungenannten bakteriellen Wirt. Der verwendete Operator ist nicht definiert. Weder ein Replikationsursprung noch ein Gen für einen selektierbaren Phänotypus sind identifiziert. Dieses System, mit dem der Vektor verwendet wird, wird als bestimmte Wirtslysogene, in die der Vektor stabil transformiert werden kann, enthaltend beschrieben. Die vorliegende Erfindung kann in einer Ausführungsform, d.h. pMG100, bestimmte Ähnlichkeiten mit diesem Vektor aufweisen. Es erfolgt jedoch keine Transformation in ein Wirtslysogen, sondern in geeignete E. coli-Wirtsstämme, die den thermolabilen Repressor CI und das N-Gen, von dem jedoch der Rest des Lysogens entfernt wurde, enthalten. Darüber hinaus erfolgte hier die Verwendung zur Herstellung von bGH- und hGH-Analogen in Mengen über 20% des gesamten Zellproteins.
Darüber hinaus werden in anderen Ausführungsformen dieser Erfindung ribosomale Bindungsstellen, die sich von CII unterscheiden, benutzt. Ferner wurden bei den derzeit hauptsächlich bevorzugten Vektoren pND5 und seinen Derivaten nicht-essentieile Sequenzen entfernt, um einen Vektor zu schaffen, der eine Polypeptidproduktion in Mengen, die mehr als 10% über den mit pMG100 erhältlichen Mengen liegen, gestaltet.
Jüngst haben die Anmelder von der Existenz einer schwebenden US-Patentanmeldung auf den Namen M. Rosenberg (eingereicht unter Ser.No. 457,352 von den National Instritutes of Health, Dept. of Health and Human Services, Vereinigte Staaten von Amerika) Kenntnis erlangt. Teile dieser Anmeldung wurden vom National Technical Information Service, U.S. Dept. of Commerce, erhalten. Die Ansprüche sind jedoch nicht verfügbar und vertraulich. Die verfügbaren Teile der Anmeldung wurden überprüft. Die diesbezügliche Offenbarung ist nicht befähigend. Sie weist darauf hin, daß der Wirt wichtig ist (Seite 8, Zeile 17), sie nennt jedoch keinen geeigneten Wirt. Weiterhin beschreibt sie eine Abhängigkeit von der Verwendung einer λ- Mutante, die jedoch nicht spezifiziert ist (Seite 4, Zeile 20). Sie weist darauf hin, daß der Wirt anders als bei der vorliegenden Erfindung, bei der der Wirt nicht lysogen ist, Lysogene enthält (Seite 8, Zeile 18). Sie erwähnt das Klonieren und die Expression eines eukaryotischen Gens, eines Affenmetallothioneingens (Seite 7, Zeile 18), sie gibt jedoch keine Details an. Sie weist darauf hin, daß weder die Sequenz noch die Lage irgendeines Nucleotids im CII-ribosomalen Bindungsbereichs geändert wurden (Seite 3, Zeile 27). Erfindungsgemäß ist eine solche Änderung möglich.
Derzeit gibt es im Stand der Technik keine Offenbarung einer erfolgreichen Expression von Rinder- oder menschlichen Wachstumshormonen mit einem PL-CII-enthaltenden Vektorsystem, der Herstellung von bGH- oder hGH-Analogen mit biologischer Aktivität, von Zubereitungen mit solchen Polypeptid-Analogen oder deren Verwendungszwecken oder Induktions- bzw. Einleitungsverfahren zur Gewährleistung einer Polypeptidproduktion in Mengen über 20% des durch den Wirt produzierten Gesamtproteins.
Der einzige Literaturhinweis des Standes der Technik betreffend eine Produktion von bGH-Analogen durch mit gentechnisch erzeugten Vektoren transformierte Wirte betrifft die Verwendung des Trp-Promotors zur Produktion eines bGH-Analogen mit der Aminosäure Met am N-Ende der Phenylalaninform von natürlichem bGH (P.H. Seeburg et al., DNA (1983), 2, 37).

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft einen verbesserten Expressionsvektor, der nach Einführung in eine geeignete Bakterienwirtszelle, nämlich Escherichia coli, mit dem thermolabilen Repressor CI die Wirtszelle - nach Erhöhung der Temperatur der Wirtszelle auf eine Temperatur, bei der der Repressor zerstört wird - zur Expression eines in den Vektor insertierten gewünschten Gens und zur Produktion des durch das Gen codierten Polypeptids befähigt, umfassend:
ein doppelsträngiges DNA-Molekül mit in 5' bis 3'Reihenfolge:
einer DNA-Sequenz mit dem Promotor und Operator PLOL eines Lambda-Bakteriophagen;
der N-Nutzungsstelle zur Bindung von durch die Wirtszelle produziertem Antiterminator-N-Protein;
einer DNA-Sequenz mit einer ribosomalen Bindungsstelle, welche die mRNA des gewünschten Gens zur Bindung an Ribosomen innerhalb der Wirtszelle befähigt;
einem ATG-Initiationscodons oder einer DNA-Sequenz, das (die) nach Einfügung des gewünschten Gens in den Vektor in ein ATG- Initiationscodon umgewandelt wird, und
einer Restriktionsenzymstelle zur Einfügung des gewünschten Gens in den Vektor in Phase mit dem ATG-Initiationscodon, und zusätzlich einer DNA-Sequenz, die einen Replikationsursprung von einem bakteriellen Plasmid mit der Fähigkeit zur autonomen Replikation in der Wirtszelle enthält, und einer DNA-Sequenz, die ein mit einem selektierbaren oder identifizierbaren phänotypischen Merkmal, das bei Anwesenheit des Vektors in der Wirtszelle manifest wird, assoziiertes Gen enthält. Bevorzugte Vektoren sind pMG 100 und pND5.
Gene, d.h. cDNAs mit Codierung für gewünschte Polypeptide, z.B. Wachstumshormone, wie Rinder-, Schweine-, Geflügel- oder Humanwachstumshormone, Superoxiddismutase, Apoprotein E, virales Protein l von Maul- und Klauenseuchevirus, Protein A aus S. aureus, Interleukin III, ein Enzym oder Analoge hiervon, können in die Restriktionsenzymstelle des Vektors zur Schaffung von Plasmiden insertiert werden. Die Plasmide ihrerseits können in geeignete Wirte, in denen die Gene exprimiert und das gewünschte Polypeptid produziert werden können, eingeführt werden. Bevorzugte Plasmide für bGH sind pRec 2/3 und pROll und für hGH pTV18(1) und pTV 104(2). Geeignete Wirte sind Escherichia coli A1637, A1645, A2602 und A1563, derzeit insbesondere A1637.
Die erhaltenen Wirtsvektorsysteme können zur Herstellung von Polypeptiden verwendet werden. Die die Plasmide enthaltenden Wirtszellen werden unter geeigneten Bedingungen, die die Produktion von Polypeptid gestatten, wachsen gelassen, worauf das gebildete Polypeptid gewonnen wird. Derzeit bevorzugte Bedingungen sind ein 10- bis 30-, insbesondere 15-minütiges Wachstum bei etwa 42ºC und ein anschließendes Wachsenlassen bei etwa 37 - 39ºC bis zum Erreichen einer gesamten Wachstumsperiode von etwa 60 - 90 min, insbesondere ein etwa 75-minütiges Wachsenlassen bei 38 - 39ºC. Derzeit bevorzugte Wachstumsmedien sind Lactalbuminhydrolysat unter Zusatz von Glucose oder Hirnherzinfusion.
Unter Verwendung der Wirtsvektorsysteme wurden Analoge von bGH hergestellt. Diese Analogen können in veterinärmedizinischen Zubereitungen untergebracht werden.
Die betreffenden Analogen können direkt oder in solchen Zubereitungen zur Stimulierung der Milch- oder Fleischproduktion bei Rindern verwendet werden.

BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1: Konstruktion des Expressionsvektors pMG100.

Dieses Plasmid wurde durch Insertieren eines Fragments einer λ-Phagen-DNA, das zwischen Restriktionsstellen HaeIII (Stelle 38150) und Sau3a (Stelle 38362) enthalten war, in eine mit Hpal und BamHl gespaltene pKC30-Plasmid-DNA gebaut. Das HaeIII-Sau3a-Fragment trägt nutR, tRl, cy&supmin; und die ribosomale Bindungsstelle von CII-Protein (CII-RBS). Durch Subklonen der CII-RBS-haltigen DNA in pKC30 entsteht pMG100 mit einer einzigen BamHl-Restriktionsstelle unmittelbar nach dem ATG-Initiationscodon von CII-RBS und eine Ndel-Restriktionsstelle innerhalb der ATG-Tripletts (Bodeneinsatz). Die Zahlen in runden Klammern bezeichnen die Lage der Restriktionsstellen auf der λ-Phagen-DNA.

Fig. 2: Konstruktion des pRec 2/3-Plasmids.

Eine bGH-cDNA mit dem Plasmid D&sub4; wurde mit HaeII verdaut. Ein erhaltenes 1600 bp großes Fragment wurde gereinigt und 5 min bei 37ºC mit 5 Einheiten Sl-Exonuclease verdaut. Durch Ligation wurde ein synthetischer EcoRl-Linker mit der Sequenz:
GGAATTCC
CCTTAAGG
befestigt. Das Produkt wurde mit EcoRl gespalten und in mit EcoRl gespaltenes pBR322 insertiert. Es wurde ein Klon pALRl isoliert. Dieses gab nach der Spaltung mit EcoRl ein 1200 bp Fragment mit der Sequenz:
AATTCCCA....
GGGT....
am 5'Ende frei. Die Bildung dieser Sequenz belegt, daß pALRl eine EcoRl-Restriktionsstelle mit dem TTC-Codon für die Restzahl 1 (Phenylalanin) von authentischem bGH enthält. pALRl wurde einer teilweisen Spaltung mit Pstl unterworfen. Das Verdauungsprodukt wurde mit HindIII-Linkern ligiert und EcoRl und HindIII gespalten. Das bGH-cDNA enthaltende Fragment wurde isoliert und in pBR322 zwischen EcoRl- und HindIII-Restriktionsstelle subgeklont, wobei pAL500 erhalten wurde. Das subgeklonte bGH-cDNA-Fragment wurde dann aus pAL500 mit EcoRl und HindIII ausgeschnitten, mit DNA-Polymerase "Klenow"-Fragment "aufgefüllt" und in den an der BamHl-Stelle geöffneten und (wie oben beschrieben) "aufgefüllten" pMG100-Expressionsvektor insertiert (Fig. 1). Der erhaltene Vektor pREC 2/2 exprimiert ein modifiziertes bGH, das an seinem Aminoende wie folgt modifiziert ist:
MetAspGlnPhe¹Pro²....bGH
Das Plasmid pREC 2/2 wurde mit Pstl verdaut, worauf das den PL-Promotor und das 5'Ende des bGH-Gens (als "Fragment A" bezeichnet) enthaltende Fragment isoliert wurde. Dieses Fragment wurde an ein Pstl-Fragment von pAL 500 (als "Fragment B" bezeichnet) ligiert. Der danach erhaltene Vektor pRec 2/3 exprimiert ein modifiziertes bGH, das an seinem Aminoende wie folgt modifiziert ist:
MetAspGlnPhe¹Pro²....bGH

Fig. 3: Konstruktion der Expressionsvektoren pND5, pND55 und pROll.

Ein Plasmid pOG7 (A. Oppenheim, S.Gottesman und M.Gottesman, J. Mol. Biol. (1982) 158, 327) wurde mit Ndel gespalten. Die Enden des den PL-Promotor nutL tragenden großen Fragments, tR und CII-RBS wurden ligiert, wobei der pND5-Expressionsvektor erhalten wurde. Diese pND5-Vektor-DNA wird mit Ndel geöffnet. Eine Insertion dieses Ndel-Fragments aus pRec 2/3 (Fig. 2), die bGH-cDNA enthält, führt zu einem Plasmid pROll. Dieses ist offensichtlich ein besserer Expressor für die in Fig. 2 beschriebene modifizierte bGH als pRec 2/3. Eine Insertion synthetischer Linker mit der Sequenz:
TATGAGCTCA
ACTCGAGTAT
in mit Ndel gespaltenes pOG7 führt zu einem Expressionsvektor pND55, der vor ATG eine einzige Sacl-Restriktionsstelle enthält. Wird pND55 mit Sacl gespalten und mit DNA-Polymerase "Klenow"-Fragment behandelt, entsteht ein ATG-Initiationscodon, das dem PL-Promotor und CII-RBS folgt. Dieser Vektor eignet sich zur Expression der verschiedensten eukaryotischen Gene ohne ein ATG-Initiationscodon.

Fig. 4: Konstruktion von pTV 18(1) und pTV 104(2).

Durch Klonen von cDNA mit Codierung für hGH in die HindIII- Stelle von pBR 322 nach Standardverfahren wurde ein Plasmid pTVHGH hergestellt (Meth. Enzymol. (1979) 68, 75). Dieses Plasmid wurde mit HindIII verdaut. Das erhaltene 800 Basepaar- Fragment wurde gereinigt, weiter mit FnuDII verdaut und mit DNA-Polymerase "Klenow"-Fragment "aufgefüllt". Diese Behandlung entfernt Codons von den ersten 16 Aminosäuren von hGH. Das erhaltene DNA-Fragment wird mit einem synthetischen Linker, der die Codons für die Sequenz von hGH von Met¹&sup4; wiederherstellt und eine Ndel-Restriktionsstelle vor dem ATG-Codon für Met¹&sup4; regeneriert, ligiert. Nach der Behandlung mit Ndel wurde diese halbsynthetische DNA in den mit Ndel geöffneten pND5-Vektor insertiert. Das erhaltene Plasmid pTV 18(1) exprimiert hGH unter Steuerung des PL-Promotors. Dieses hGH ist ein Analoges ohne die ersten 13 Aminosäurereste und mit Met¹&sup4; an seinem N-Ende.
Das Plasmid pTV 18(1) wurde mit Ndel teilverdaut und mit einem synthetischen Linker mit den Codons für die Aminosäuren 1-13 von hGH ligiert:
TATGTTCCCAACCATTCCATTATCCCGTCTGTTCGACAACGC
ACAAGGGTTGGTAAGGTAATAGGGCAGACAAGCTGTTGCGAT.
Der Linker ist ferner zu der Ndel-Stelle auf pTV 18(1) komplementär und positioniert das komplette hGH-Gen in Phase mit dem ATG-Initiationscodon des pND5-Expressionsvektors (Fig. 3). Somit exprimiert das erhaltene Plasmid pTV 104(2) natives hGH mit einem Extramethionin am N-Ende.
Fig. 5 zeigt den Vektor pAL Trp 46, der den Trp-Promotor und die ersten sieben Aminosäuren des durch Transkription an das β-Galactosidasegen angeschmolzenen Trp E-Gen enthält.
Die Fig. 6, 7 und 8 zeigen eine Reihe von Expressionsvektoren (Tac) mit einem Teil des Trp-Promotors und Lac-Operators, gefolgt von Restriktionsstellen für die Insertion eines gewünschten Gens und die Expression von bGH unter der Steuerung des Tac-Promotors.
Die Fig. 9 und 10 zeigen Expressionsvektoren mit bGH cDNA unter der Steuerung des Histidinpromotors.
Fig. 11 zeigt die Insertion des bGH-Gens in einen Expressionsvektor unter der Steuerung des Lac-Promotors.
Fig. 12 zeigt die Expression des bGH-Gens unter Steuerung des Omp F-Promotors.

Fig. 13: Konstruktion eines Met&sup4;-bGH-Analogen pAL401 und von Expressionsvektoren pND6 und pND11 mit geänderten Restriktionsstellen:

pAL401, welches eine modifizierte Form von bGH ohne die ersten drei Aminosäuren am Aminoende des bGH (Met&sup4; bGH) exprimiert, wurde durch Dreifachligation wie folgt konstruiert:
a) ein bGH-DNA-Fragment von 623 Basepaaren mit PvuII und HindIII aus pAL500 ausgeschnitten;
b) ein durch Synthetisieren von zwei DNA-Strängen gebildeter Linker, der nach der Reinigung zur Bildung von:
CCATATGTCCTTGTCCGGCCTGTTTGCCAACGCTGTGCT
GCGACACGAGGCCCGAGTCGTGGACGTGGTCGACG
einem Annealing unterworfen wurde. Nach dem "Auffüllen" mit DNA-Polymerase "Klenow"-Fragment und anschließender Spaltung mit Ndel und PvuII entstand ein 58 Basepaar- Fragment, das gewonnen und gereinigt wurde.
c) pNDll, das wie folgt hergestellt wurde: Ein Expressionsvektor pOG7 wurde durch Eliminieren von HindIII und einer der Ndel-Stellen (im Abstand von dem ATG-Initiatorcodon) geändert, wobei pND6 erhalten wurde. Dann wurden HindIII- Linker in eine Sall-Stelle eingeführt, wobei pNDll entstand.

Fig. 14: Konstruktion von authentischem bGH, das am Aminoende mit Methionin modifiziert ist und verschiedener Analoger von bGH.

a) Das Plasmid pAL401 wird mit Ndel behandelt. Ein synthetischer DNA-Linker mit einem ATG-Initiationssignal und dem Code für die ersten drei Aminosäuren am Aminoende von nativem bGH wird in die Ndel-Stelle ligiert. Der erhaltene Vektor pAL601 führt zur Expression von nativem bGH mit einem Extramethioninrest am Aminoende.
b) Unter Verwendung der unter a) beschriebenen Strategie, jedoch unter Modifizierung der Struktur des Oligodesoxyribonucleotidlinkers wird eine Klasse von Vektoren mit Codierung für eine Reihe modifizierter Rinderwachstumshormone konstruiert. Die modifizierten Wachstumshormone beginnen mit Methionin am N-Ende, worauf in beiden Stellungen 1 und 2 irgendeine der zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäuren und in Stellung 3 irgendeine der zwanzig Aminosäuren mit Ausnahme von Glu, Gln, Lys, Met oder Trp folgen. Von der Stelle 4 bis zum COOH-Ende ist die Sequenz mit derjenigen von nativem bGH identisch.

Fig. 15. Schienbeintest:

Diese Figur zeigt den Vergleich zwischen der Wirkung von pRec 2/3-bGH-Analogem und authentischem bGH auf das Knochenplattenwachstum von Ratten, denen die Hypophyse entfernt wurde.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Es wurde ein Vektor entwickelt, der eine stärkere Genexpression und Polypeptidexpression ermöglicht. Bei dem Vektor handelt es sich um ein doppelsträngiges DNA-Molekül. Nach Einführung in eine geeignete Bakterienwirtsszelle mit dem thermolabilen Repressor CI und Erhöhen der Temperatur des Wirts auf eine Temperatur, bei der der Repressor zerstört wird, befähigt der Vektor die Wirtszelle zur Expression eines in den Vektor insertierten gewünschten Gens und zur Produktion des durch das Gen codierten Polypeptids.
Der Vektor enthält in der Reihenfolge 5' bis 3' folgendes:
eine DNA-Sequenz mit dem Promotor und Operator PLOL von Lambda-Bakteriophagen;
die N-Nutzungsstelle zur Bindung von durch die Wirtszelle produziertem Antigerminator-N-Protein;
eine DNA-Sequenz mit einer ribosomalen Bindungsstelle zur Befähigung der mRNA des gewünschten Gens, eine Bindung an Ribosome in der Wirtszelle einzugehen;
ein ATG-Initiationscodon oder eine DNA-Sequenz, die nach Insertion des gewünschten Gens in den Vektor in ein ATG-Initiationscodon umgewandelt wird und
eine Restriktionsenzymstelle zur Insertion des gewünschten Gens in den Vektor in Phase mit dem ATG-Initiationscodon.
Der Vektor enthält ferner eine DNA-Sequenz mit einem Replikationsursprung aus einem bakteriellen Plasmid mit der Fähigkeit zur autonomen Replikation in der Wirtszelle und eine DNA-Sequenz mit einem mit einem selektierbaren oder identifizierbaren phänotypischen Merkmal, das bei Anwesenheit des Vektors in der Wirtszelle manifest wird, assoziierten Gen.
Der Wirt zur Verwendung mit dem Vektor ist Escherichia coli. Die derzeit bevorzugten Stämme sind A1637, A1645, A2602 und A1563. A1637 ist der derzeit am meisten bevorzugte Stamm. Er wurde aus C600 durch Insertieren eines Transposons mit dem Tetracyclinresistenzgen innerhalb des Galactoseoperons sowie dem sich nahe des Galactoseoperons befindlichen Lambda- Expressionssystem erhalten. Er wurde bei der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland, Vereinigte Staaten von Amerika mit den verschiedensten Piasmiden (vgl. die später folgende detaillierte Beschreibung) hinterlegt. Sämtliche derartige Hinterlegungen wurden in Übereinstimmung mit dem Budapester Vertrag bezüglich der internationalen Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen durchgeführt.
A1645 wurde aus A1637 durch Selektion auf Gal&spplus; (Fähigkeit zur Fermentation von Galactose) sowie auf den Verlust der Tetracyclinresistenz erhalten. Er enthält noch das Lambda-Expressionssystem, ein Teil des Transposons wurde jedoch durch die Selektion entfernt. Sein Phänotyp ist C600 r&supmin;m&spplus; gal&spplus; thr&supmin; leu&supmin; lac Z&supmin; (λcI857 Δ Hl ΔBAM N+).
A2602 und A1563 rühren von SA500 her. Ihre Phänotypen sind SA500 his&supmin;ilu&supmin; gal&spplus; Δ8(λCI857ΔHlΔBAM N+)bzw. SA500 his&supmin;ilu&supmin;gal&spplus; Δ 8 lac ZxA2l (λCI859 int2 xisl nutL3 ΔHl).
Vorzugsweise handelt es sich bei dem Vektor um ein kovalent geschlossenes kreisförmiges doppelsträngiges Molekül. Es ist jedoch nicht von wesentlicher Bedeutung, daß der Vektor kovalent geschlossen ist.
Der Vektor erreicht seine erhöhten Expressionswerte, nachdem die Wirtszelle auf eine Temperatur erwärmt wurde, bei der der CI-Repressor zerstört wird. Zu diesem Zweck eignet sich eine Temperatur oberhalb etwa 42ºC. Da eine unnötige Wärmeschädigung der Wirtszellen weitestgehend vermieden werden soll, ist es im allgemeinen zweckmäßig, die Temperatur von 42ºC niemals um mehr als einige wenige Grade zu überschreiten.
Eine wichtige Komponente des Vektors ist die ribosomale Bindungsstelle. Geeignete Stellen sind CII von Lambda-Bakteriophagen mit der Sequenz:
TAAGGAAATACTTACAT
ATTCCTTTATGAATGTA;
ein synthetisches Oligonucleotid mit der Sequenz:
TAAGGAAGTACTTACAT
ATTCCTTCATGAATGTA; und
das Hauptkopfproteingen von Bakteriophagen Lambda mit der Sequenz:
TTTTTTTACGGGATTTTTTTATG
AAAAAAATGCCCTAAAAAAATAC.
Eine weitere Komponente des Vektors ist die Restriktionsenzymstelle zur Insertion gewünschter Gene in den Vektor in Phase mit dem ATG-Initiationscodon. Es können zahlreiche derartige Stellen benutzt werden. Die derzeit bevorzugten Stellen sind BamHl, Sacl und Ndel.
Der Vektor enthält ferner einen Replikationsursprung aus einem Bakterienplasmid mit der Fähigkeit zur autonomen Replikation in der Wirtszelle. Geeignete derartige Replikationsursprünge können aus einer Reihe von Quellen gewonnen werden. Derzeit bevorzugt sind von pBR322 oder pRl herrührende Replikationsursprünge.
Eine weitere Komponente des Vektors ist auch eine DNA-Sequenz mit einem mit einem selektierbaren oder identifizierbaren phänotypischen Merkmal, das bei Anwesenheit des Vektors in der Wirtszelle manifest wird, assoziierten Gen. Geeignete Gene sind solche, die mit einer Temperaturempfindlichkeit oder Arzneimittelresistenz, beispielsweise Resistenz gegen Ampicillin, Chloramphenicol oder Tetracyclin, assoziiert sind.
Im Vergleich zu den bislang in der wissenschaftlichen Literatur beschriebenen Vektoren können die erfindungsgemäßen Vektoren zur Gewährleistung einer verstärkten Expression der verschiedensten Gene mit Codierung für wünschenswerte Polypeptidprodukte benutzt werden. Geeignete Gene sind solche mit Codierung für Wachstumshormone, beispielsweise Rinder-, Schweine-, Geflügel- oder Humanwachstumshormone; Superoxiddismutase, Apoprotein E, Virusprotein l von Maul- und Klauenseuchevirus, Protein A aus S. aureus, Interleukin III, Enzyme oder Analoge hiervon. Unter einem Analogen ist ein Polypeptid mit derselben Aktivität, wie sie das natürlich vorkommende Polypeptid aufweist, jedoch einer oder mehreren unterschiedlichen Aminosäure(n) am N-Ende des Polypeptids entsprechend Ansprüchen 1 bis 3 zu verstehen.
Der Vektor kann nach dem Fachmann des Fachgebiets, auf dem die Erfindung liegt, bekannten Verfahren gebildet werden. Solche Verfahren sind detaillierter in den verschiedensten hierin angegebenen Veröffentlichungen beschrieben. Auf deren Inhalt wird in der vorliegenden Offenbarung Bezug genommen, um über den Stand der Technik vollständig zu informieren.
Ein derzeit bevorzugter Vektor ist pMG100 mit der in Fig. 1 dargestellten Restriktionskarte. Dieser Vektor hatte eine cDNA mit Codierung für Rinderwachstumshormon in seine BamHl-Restriktionsstelle insertiert. Das erhaltene Plasmid wird als pRec 2/3 bezeichnet. Seine Restriktionskarte ist in Fig. 2 dargestellt. Das Plasmid pRec 2/3 wurde nach üblichen Transformationsverfahren in den Escherichia coli-Stamm A1637 eingeführt. Das erhaltene Wirtvektorsystem wurde unter der Hinterlegungsnummer ATCC 39385 hinterlegt.
Ein zweiter derzeit bevorzugter Vektor ist pND5 mit der in Fig. 3 dargestellten Restriktionskarte. In seine Ndel-Restriktionsstelle war Rinderwachstumshormon cDNA insertiert worden. Das erhaltene Plasmid wird als pROll bezeichnet. Seine Restriktionskarte ist ebenfalls in Fig. 3 dargestellt. Das Plasmid pROll wurde mittels Transformation in den E. coli Stamm A1637 eingeführt. Das erhaltene Wirtvektorsystem wurde unter der Hinterlegungsnummer ATCC 39390 hinterlegt.
Der Vektor pND5 diente auch zum Klonieren von Humanwachstumshormon. Ein als pTV 18(1) bezeichnetes Plasmid und ein weiteres als pTV 104(2) bezeichnetes Plasmid wurden durch Insertieren von hGH cDNA in die Ndel-Restriktionsstelle geschaffen. pTV 18(1) ist in Fig. 4 dargestellt. Es wurde mittels Transformation in den E. coli-Stamm A1637 eingeführt. Das erhaltene Wirtvektorsystem wurde unter der Hinterlegungsnummer ATCC 39386 hinterlegt. pTV 104(2) ist in Fig. 4 dargestellt. Es wurde ebenfalls in den E. coli-Stamm A1637 eingeführt. Das erhaltene Wirtvektorsystem wurde unter der Hinterlegungsnummer ATCC 39384 hinterlegt.
Unter Benutzung derselben Maßnahmen können auch andere Plasmide durch Insertieren eines Gens mit Codierung für ein gewünschtes Polypeptid in die Restriktionsenzymstelle eines erfindungsgemäßen Vektors hergestellt werden.
Die vorgenannten speziellen Wirtvektorsysteme umfassen E. coli A1637. Wie jedoch bereits zuvor angedeutet, wurden auch noch andere Stämme einschließlcih A1645, A2602 und A1563 benutzt. Diese Wirtvektorsysteme können zur Produktion von Polypeptiden, z.B. Rinder- und Humanwachstumshormonen, herangezogen werden. Zu diesem Zweck wird das Wirtvektorsystem unter die Produktion des anschließend gewonnenen Polypeptids gestattenden Bedingungen wachsengelassen.
Geeignete Bedingungen umfassen das Wachsen des Wirtvektorsystems während einer geeigneten Zeitspanne bei etwa 42ºC und ein anschließendes (Weiter)wachsen bei etwa 37 - 39ºC für eine weitere Zeitspanne, wobei das Wachstum auf einem geeigneten Medium erfolgt.
Zweckmäßigerweise beträgt die anfängliche Wachstumsdauer bei 42ºC etwa 10 - 30 min. Danach erfolgt das Wachstum bei 37 - 39ºC ausreichend lange, um eine gesamte Wachstumsdauer von etwa 60 - 90 min zu erreichen. Vorzugsweise beträgt das Wachstum bei 42ºC etwa 15 min und anschließend bei 38 - 39ºC etwa 75 min. Geeignete Medien sind Lactalbuminhydrolysat unter Zusatz von Glucose oder Hirnherzinfusion. Um den Vektor im Wirt stabil zu halten, ist es entscheidend, den Wirt unter selektivem Druck, beispielsweise Antibiotikumzusatz, zu halten.
Mit Hilfe der zuvor geschilderten Maßnahmen wurde eine Reihe von bGH- und hGH-Analogen hergestellt. Diese besitzen die Aktivität der natürlich vorkommenden Hormone oder können diese aufweisen.
bGH-Analoge besitzen die Aktivität von natürlichem bGH und eine identische Aminosäuresequenz mit Ausnahme von Änderungen am N-Ende von bis zu fünf (5) Aminosäuren. Beispiele hierfür sind folgende:
1) Am N-Ende der Phenylalaninform von bGH ist die Aminosäure Methionin addiert.
2) Am N-Ende der Alaninform von bGH ist die Aminosäure Methionin addiert.
2) Am N-Ende der Phenylalaninform von bGH ist die Aminosäuresequenz Met-Asp-Gln addiert.
3) Am N-Ende der Alaninform von bGH ist die Aminosäuresequenz Ala-Gly addiert.
4) Am N-Ende der Alaninform von bGH ist die Aminosäuresequenz Met-Gly addiert.
5) Am N-Ende der Alaninform von bGH ist die Aminosäuresequenz Met-Asp-Pro-Met-Gly addiert.
6) Am N-Ende der Phenylalaninform von bGH ist die Aminosäuresequenz Met-Asp-Pro addiert.
7) Am N-Ende der Phenylalaninform von bGH ist die Aminosäuresequenz Met-Thr-Arg addiert.
8) Am N-Ende der Phenylalaninform von bGH sind die Aminosäuren bis zum Methionin (Stelle 4) entfernt.
Ein Analoges von bGH mit der Aminosäuresequenz:
Met-(X)n-Y-Met...
worin bedeuten:
Met das N-Ende;
X eine der zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäuren;
Y eine der zwanzig Aminosäuren mit Ausnahme von Glu, Gln, Lys, Met oder Trp;
n eine ganze Zahl von 0 bis 6 und
Met... die Sequenz von natürlichem bGH von Stelle 4 bis zum COOH-Ende (Steile 190).
Es können veterinärmedizinische Zubereitungen hergestellt werden, die wirksame Mengen eines oder mehrerer bGH-Analogen (Analoger) und einen geeigneten Träger enthalten. Solche Träger sind dem Fachmann bekannt. Die Analogen können direkt oder in Form einer Zubereitung an Rinder verabreicht werden, um die Milch- oder Fleischproduktion zu steigern.

BEISPIELE

Die folgenden Beispiele sollen das Verständnis der Erfindung fördern, diese jedoch in keiner Weise beschränken. Die Beispiele enthalten keine detaillierten Beschreibungen üblicher zur Konstruktion von Vektoren, zur Insertion von Genen mit Codierung für interessierende Polypeptide in solche Vektoren oder zur Einführung der gebildeten Plasmide in Bakterienwirte benutzter Verfahren. Diese Verfahren sind den Fachleuten bekannt und in zahlreichen Veröffentlichungen einschließlich der folgenden beschrieben:
Principles of Gene Manipulation, An Introduction to Genetic Engineering, 2.Ausgabe, herausgegeben von R.W. Old und S.B. Primrose, Univ. of Calif. Press (1981).
Met. Enzymol. Band 68, Recombinant DNA, herausgegeben von Ray Wu, Academic Press (1979).
Met. Enzymol. Band 65, Nucleic Acids (Teil 1), herausgegeben von Lawrence Grossman und Kivie Moldave, Academic Press (1980).
T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1982).
H.V. Bernard et al., Gene (1979) 5, 59.
A.B. Oppenheim et al., J. Mol. Biol. (1982) 158, 327.
E. Remaut et al., Gene (1981) 15, 81.

Beispiel 1

Expressionsvektoren

Der Ausdruck "Expressionsvektor" bezeichnet hierin eine Gruppe von Plasmiden mit der Eignung zur Expression gewünschter Gene in Bakterien, insbesondere in E. coli. Das gewünschte Gen kann in den Expressionsvektor insertiert werden. Andererseits können die Promotoren auf dem Expressionsvektor ausgeschnitten und vor das gewünschte Gene plaziert werden.

I. PL-Expressionsvektoren

A. mPG 100

pMG 100, vgl. Fig. 1, der in der Figurenbeschreibung detailliert beschrieben wurde, besteht aus in das Mehrfachkopieplasmid pBR322 insertierter λDNA. Die hervorspringenden Merkmale der λDNA sind, daß sie den λPL-Promotor, N-Nutzungsstellen L und R (nutL und nutR), die Terminations-Rl-Stelle (tRl), die CII-ribosomale Bindungsstelle und ein ATG-Initiationscodon enthält. Weitere Merkmale sind in Fig. 1 dargestellt.
pMG 100 wurde aus pKC30 hergestellt. pKC30 seinerseits wurde durch Subklonen des λPL-Promotors auf folgende Weise hergestellt:
λPhagen-DNA wurde mit Xhol- und Smal-Restriktionsendonucleasen verdaut. Das einzige Fragment aus 6393 Basepaaren wurde gereinigt und anschließend mit HindIII- und BamHl-Restriktionsendonucleasen verdaut. Das erhaltene Fragment bestand aus 2397 Basepaaren und enthielt den PL-Promotor. Nach seiner Reinigung wurde es in ein aus der HindIII- und Bamhl- Verdauungsprodukt isoliertes pBR322 DNA-Großfragment ligiert. Der Subklon wurde durch Koloniehybridisierung identifiziert und reindargestellt. Daraus wurde Plasmid-DNA isoliert (A. Oppenheim et al., J. Mol. Biol. (1982) 158, 327).
Dieses Plasmid und seine Derivate mit eukaryotischen Genen können in geeigneten E. coli-Wirten gehalten werden. Das wichtigste Merkmal des Wirts ist, daß er den wärmeempfindlichen Repressor CI857 und das Antiterminator-N-Protein bereitstellt (M.E. Gottesman et al., J. Mol. Biol. (1978) 140, 197).
Dieser Vektor besitzt gegenüber zuvor beschriebenen Expressionsvektoren zahlreiche Vorteile einschließlich der folgenden:

1. Extrem hohe Expressionsspiegel

Dieser Vektor besitzt die Fähigkeit, eine Expression von Fremdproteinen in E. coli in Mengen in der Größenordnung von 15 - 25% des gesamten zellulären Proteins zu steuern.

2. Wärmeinduzierbare Regulierung der Expression

Der PL-Promotor ist inaktiv, wenn der CI-Repressor an ihn gebunden ist. Der CI857-Repressor ist wärmeempfindlich, d.h. er geht mit dem Promotor bei 30ºC eine Bindung ein, wird jedoch bei 42ºC inaktiviert. Somit werden durch Erhöhen der Fermentationstemperatur auf 42ºC die Wirtbakterien dazu veranlaßt, das gewünschte Protein zu produzieren.
Die Vorteile eines solchen Systems sind folgende:
(a) Ein für E. coli toxisches Fremdprotein kann dann, wenn es gewünscht wird, produziert werden. Auf diese Weise läßt sich ein Absterben der Zelle zu einem frühen Zeitpunkt während des Fermentationsverfahrens vermeiden.
(b) Eine Überproduktion eines Proteins kann es stabilisieren und einen proteolytischen Abbau verhindern (Y.E. Cheng et al., Gene (1981) 14, 121). Somit kann eine "augenblickliche" Überproduktion unter Benutzung eines eng regulierten Promotors, wie PL, für eine kontinuierliche geringgradige Produktion bevorzugt sein.

3. Hohe Kopiezahl

Der PL-Promotor in pMG100 findet sich im Unterschied zu λ selbst, das in E. coli (nur) in geringer Kopiezahl vorhanden ist, auf einem Plasmid mit hoher Kopiezahl. Dies erhöht die Expressionsspiegel.

4. Ribosomenbindungsstelle und Initiationscodon

Dieser Expressionsvektor enthält eine starke prokaryotische ribosomale Bindungsstelle (RBS) sowie ein Translationsinitiationscodon (ATG). Somit können beliebige eukaryotische Gene ohne die Notwendigkeit des Zusatzes eines Initiationscodons geklont werden. Weiterhin erhöht die wirksame RBS die Expressionsspiegel.

5. Zweckmäßige Restriktionsstelle

Der Expressionsvektor besitzt eine BamHI-Stelle unmittelbar nach dem ATG-Initiationscodon. Diese gestattet eine geeignete Positionierung des gewünschten Gens für eine optimale Expression.

6. Nut-Stelle

N-Protein, das von dem Wirt bereitgestellt wird, geht eine Bindung mit der Nut-Stelle auf dem Expressionsvektor ein und verhindert auf diese Weise eine Beendigung der Transkription an der tRl-Stelle.

B. pND5

Wie aus Fig. 3 hervorgeht, enthält pND5 den PL-Promotor und die anderen wichtigen Komponenten der erfindungsgemäßen Expressionsvektoren. Er enthält eine einzige Ndel-Stelle unmittelbar nach der ribosomalen Bindungsstelle. Die ribosomale Bindungsstelle unterscheidet sich von der normalen CII-Stelle. Sie besitzt die Sequenz:
TAAGGAAGTACTTACAT
ATTCCTTCATGAATGTA
Sie kann von einer Mutante herrühren oder chemisch synthetisiert worden sein. Wie in der Figurenbeschreibung detailliert dargelegt, rührt pND5 von POG7 her (A. Oppenheim et al., J. Mol. Biol. (1982) 158, 327). Dieser Vektor enthält kein Translationsinitiationscodon. Offensichtlich sorgt er für eine bessere Expression von modifiziertem bGH und hGH, insbesondere einer erhöhten Ausbeute, in Bezug auf ein bGH-Analoges enthaltenden pMG100.

C. pND55

pND55 ist ein Derivat von pND5 und enthält die zweckmäßige Restriktionssteller Sacl vor CII-RBS und ein ATG-Initiationscodon. Spaltung des Plasmids an dieser Stelle und die anschließende Behandlung mit DNA-Polymerase "Klenow"-Fragment ermöglicht die Herstellung eines ATG-Initiationscodons, an das jedes gewünschte Gen ligiert werden kann. (Fig. 3 und Beschreibung von Fig. 3).

II. TRP-Expressionsvektoren

A. pAL Trp 46

pAL Trp 46 enthält den Trp-Promotor und die ersten sieben Aminosäuren des an das β-Galactosidasegen angeschmolzenen Trp-E Gens (Fig. 5). Das gewünschte Gen kann in eine BamHI-Stelle nach den 7 Aminosäuren von Trp E insertiert werden.

B. pAL Trp 47; Trp 46 mit Attenuatordeletion

Hierbei handelt es sich um ein Konstrukt auf der Basis von Trp 46, bei dem der Attenuatorbereich des Trp-Promotors beseitigt wurde.

C. Trp-Lac-Fusionen

Die Konstruktion dieses auf dem Plasmid p4754 gefundenen Promotors wird in Fig. 6 und 7 veranschaulicht. Eine Abänderung dieser Bauweise ergibt sich aus Fig. 8.

III. Histidinpromotorexpressionsvektoren

Die Konstruktion dieses Expressionsvektor wird in Fig. 9 und 10 veranschaulicht.

IV. Sonstige verwendete Promotoren

A. Lac

Dieses Promotor wurde bei der Konstruktion von pYL 301 (vgl. Fig. 11) verwendet.

B. Omp F

Hierbei handelt es sich um ein Promotorsystem, welches ein an einer Signalsequenz hängendes Protein exprimiert. Die Signalsequenz wird entfernt, in das Protein über die Membran transloziert wird (Fig. 12).

Beispiel 2

Rinderwachstumshormon

Der Ausgangspunkt für bGH-cDNA-Modifikationen ist das zuvor beschriebene Plasmid D&sub4; (E. Keshet et al., Nucleic Acids Research (1981) 9, 19). Das D&sub4;-Plasmid ist auch in der anhängigen US-Patentanmeldung mit der Ser.Nr. 245 943 (Anmeldetag: 20. März 1981), die sich auf die Priorität der israelischen Patentanmeldung mit der Ser.Nr. 59 690 (Anmeldetag: 24. März 1980) stützt, beschrieben. Es wurde zuvor bei der American Type Culture Collection in einem E. coli-Wirt unter der Hinterlegungsnummer ATCC 31826 hinterlegt.

I. pRec 2/3 bGH

Die Konstruktion von pRec 2/3 ist in Fig. 2 dargestellt und in der Figurenbeschreibung erläutert. bGH-cDNA aus D&sub4; wurde zur Bereitstellung des richtigen Leserahmens vor dem Insertieren in PMG100 manipuliert.
pRec 2/3 wurde durch Transformation nach üblichen bekannten Verfahren in verschiedene E. coli-Stämme einschließlich A1637 eingefügt. A1637 mit pRec 2/3 wurde unter der Hinterlegungsnummer ATCC 39385 hinterlegt. Dieser Stamm produziert beim Wachsen und bei der Induktion ein Analoges von bGH mit der am N-Ende der Phenylalaninform von natürlichem bGH addierten Aminosäuresequenz Met-Asp-Gln. Die Menge an durch pRec 2/3 produziertem bGH-Analogem betrug etwa 23% des von den Bakterien insgesamt produzierten Proteins (berechnet durch Scannen der Coomasie-gefärbten SDS-Polyacrylamidgele).

II. pROll

Die Konstruktion von pROll ist in Fig. 3 dargestellt und in der Figurenbeschreibung erläutert. Die pND5-Vektor-DNA wurde mit Ndel einer Restriktion unterworfen. Die Einfügung des Ndel-Fragments aus pRec 2/3 (Fig. 2) mit bGH-cDNA führt zum Plasmid pROll.
pROll wurde durch Transformation in E. coli A1637 eingeführt. Das erhaltene Wirtvektorsystem wurde unter der Hinterlegungsnummer ATCC 39390 hinterlegt. Wird dieser Stamm wachsen gelassen und induziert, liefert er dasselbe Analoge wie pRec 2/3. Vorläufige Ergebnisse belegen, daß pROll bis zu 20% mehr bGH-Analoges produziert als pRec 2/3. Die zum Wachsenlassen des Stamms, zur Gewinnung des produzierten bGH-Analogen und zum Reinigen desselben durchgeführten Maßnahmen entsprechen den für pRec 2/3 in Beispiel 4 beschriebenen Maßnahmen.

III. pAL401

Die Konstruktion von pAL401 ist in Fig. 13 dargestellt und in der Figurenbeschreibung erläutert. bGH-cDNA aus D&sub4; über PAL-500 (Fig. 2) wurde, wie in Fig. 13 gezeigt, in pNDll insertiert.
pAL401 kann nach Transformation in E. coli A1637 eingeführt werden. Der erhaltene Stamm produziert ein bGH-Analoges, bei welchem sich Met&sup4; von natürlichem bGH am N-Ende befindet und die Met&sup4; vorausgehenden Aminosäuren entfernt wurden.

IV. pAL601

Die Konstruktion von pAL601 ist in Fig. 14 dargestellt und in der Figurenbeschreibung erläutert. Es handelt sich hierbei um ein Derivat von pAL401 (Fig. 13).
pAL601 kann durch Transformation in E. coli A1637 eingeführt werden. Der erhaltene Stamm produziert ein bGH-Analoges, bei dem am N-Ende der Phenylalaninform von bGH Met addiert wurde.

Beispiel 3

Menschliches Wachstumshormon

Der Ausgangspunkt für hGH-cDNA war die Klonierung der cDNA aus von einem Hypophysentumor von Acromegalinpatienten gereinigter mRNA in die HindIII-Stelle von pBR322.

I. pTV 18(1)

Die Konstruktion von pTV 18(1) ist in Fig. 4 dargestellt und in der Figurenbeschreibung erläutert. hGH-cDNA wurde zur Bereitstellung des richtigen Leserahmens vor der Insertion in pND5 manipuliert.
pTV 18(1) wurde durch Transformation in E. coli A1637 eingeführt. Die erhaltenen Bakterien wurden unter der Hinterlegungsnummer ATCC 39386 hinterlegt. Dieser Stamm liefert beim Wachsen und bei der Induktion ein hGH-Analoges mit der Sequenz von natürlichem hGH beginnend mit Met¹&sup4; und ohne die Aminosäuren 1 - 13. Die Menge an durch pTV 18(1) produziertem hGH-Analogen betrug etwa 8% des durch die Bakterien insgesamt produzierten Proteins.

II. pTV 104(2)

Die Konstruktion von pTV 104(2) ist in Fig. 4 dargestellt und in der Figurenbeschreibung erläutert. hGH-cDNA wurde zur Bereitstellung des richtigen Leserahmens vor der Insertion in pND5 manipuliert.
pTV 104(2) wurde durch Transformation in E. coli A1637 eingeführt. Die erhaltenen Bakterien wurden unter der Hinterlegungsnummer ATCC 39384 hinterlegt. Dieser Stamm produziert beim Wachsen und bei der Induktion ein hGH-Analoges mit der Sequenz von natürlichem hGH mit am N-Ende vorgeschaltetem Met. Die Menge des durch pTV 104(2) produzierten hGH-Analogen betrug etwa 25% des von den Bakterien insgesamt produzierten Proteins.

Beispiel 4

Wachstum von pRec 2/3

Vorratskulturen: Vorratskulturen von pRec 2/3 in A1637 wurden auf BHI-Medium (vgl. Inokulum) wachsengelassen, dann mit 87% Glycerin mit Phosphatcitratpuffer zweifach verdünnt und bei -70ºC gelagert.
Inokulum: Das Inokulum wurde in BHI-Medium (37 g/l) Hirnherzinfusion (DIFCO) vermehrt. Steriles Medium in einer Rüttelflasche wird aus der Vorratskultur beimpft und 15 h auf einem Rüttler bei 200 U/min bei 30ºC inkubiert. Die folgenden Stufen bei der Inokulumvermehrung werden in gerührten und belüfteten Gärtanks durchgeführt. Steriles Medium wird mit 0,2 ml Flaschenkultur pro Liter beimpft und 15 h bei 30ºC und einem pH-Wert von 7 ± 0,5 unter Rühren und Belüften zum Aufrechterhalten eines Spiegels an gelöstem Sauerstoff über 20% Luftsättigung inkubiert.
Produktion: Das Produktionsmedium enthält:
Lactalbuminhydrolysat (enzymatisch) 20 g/l
Hefeextrakt 10 g/l
K&sub2;HPO&sub4; 2,5 g/l
NaCl 10 g/l
Ampicillin 0,1 g/l
Biotin 0,1 mg/l
Thiamin 1 mg/l
Spurenelementlösung 3 ml/l
Ampicillin, Biotin und Thiamin in Lösung werden getrennt filtrationssterilisiert und dem sterilen Produktionsmedium vor dem Beimpfen zugesetzt. Sterile Glucoselösung wird zunächst zur Bereitstellung von 10 g/l und dann während des Induktions- und Expressionsverfahrens zur Erhaltung eines Glucosespiegels über 10 g/l zugesetzt.
Die Spurenelementlösung enthält:
MgSO&sub4; 7H&sub2;O 170 g/l
FeCl&sub3; 16 g/l
ZnCl&sub2; 4H&sub2;O 2 g/l
CoCl&sub2; 6H&sub2;O 2 g/l
Na&sub2;MoO&sub4; 2H&sub2;O 2 g/l
CaCl&sub2; 2H&sub2;O 1 g/l
CuCl&sub2; 1 g/l
H&sub3;BO&sub3; 0,5 g/l
Konz. HCl 100 ml/l
Das Medium wird mit 5 - 10% Inokulumkultur beimpft und bei 30ºC inkubiert. Die Rühr/Belüftungs-Raten werden derart eingestellt, daß ein Spiegel an gelöstem Sauerstoff über 20% Luftsättigung erhalten bleibt. Der pH-Wert wird mit NH&sub3; auf 7 ± 0,2 gehalten. Nachdem die Zellenkonzentration etwa 3 g/l erreicht hat (OD&sub6;&sub6;&sub0; = 10), wird mit der Induktion bzw. Einleitung begonnen.
Die Temperatur wird auf 42ºC erhöht, 15 min auf diesem Wert gehalten und dann auf 38ºC erniedrigt. Nach 1- bis 1,5- stündiger Inkubation bei 38ºC werden die Kultur abgeschreckt und die Zellen durch Zentrifugieren zur Hormonreinigung gewonnen.

Gewinnung von bGH

1 kg Bakterienzellen wird in 10 Volumina der Lösung mit 50 mM Tris-Cl (pH-Wert: 7,4), 50 mM EDTA und 25% Saccharose in einem Warring-Mischer unter Steuerung der Mischergeschwindigkeit zur Minimierung des Schäumens suspendiert. Die homogene Suspension wird kontinuierlich durch eine Dynomill-Zellenbrechvorrichtung (Willy A. Bachofen, Basel) geleitet. Die homogene Suspension aufgebrochener Zellen wird zunächst durch Zentrifugieren in einer Sharpless-Zentrifuge und anschließendes kontinuierliches Zentrifugieren bei 20 000 U/min in einer Sorvall-Zentrifuge geklärt. Der Niederschlag aus beiden Zentrifugierstufen wird gesammelt, mit 50 mM Tris-Cl (pH-Wert: 7,4) gewaschen und in 500 ml desselben Puffers resuspendiert. Nach Zugabe von Lysozym bis zu einer Endkonzentration von 2 mg/ml wird die Suspension 1 h bei 37ºC inkubiert. Nach anschließender Zugabe von Triton X-100 bis zu einer Endkonzentration von 1% wird die Suspension auf 4ºC gekühlt und 20 min in einem Sorvall SS34-Rotor mit 20 000 U/min zentrifugiert. Der Niederschlag wird gesammelt, zweimal mit 50 mM Tris-Cl gewaschen, in 500 ml 50 mM Tris-Cl (pH-Wert: 7,4), 5 mM MgCl&sub2; resuspendiert und mit Desoxyribonuclease bis zu einer Endkonzentration von 20 µg/ml versetzt. Nach 30-minütigem Inkubieren bei Raumtemperatur wird der Niederschlag in der geschilderten Weise gesammelt, zweimal mit 500 ml 20 mM Tris-Cl (pH-Wert: 7,4), 100 mM NaCl und 10 mM EDTA und dann zweimal mit 500 ml destilliertem Wasser gewaschen. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren gesammelt und kann für unbestimmte Zeit bei -20ºC gelagert werden. Zu diesem Zeitpunkt ist das bGH, bestimmt durch Natriumdodecylsulfat-Gelelektrophorese, zu 80% rein. Die Ausbeute beträgt etwa 15 g bGH.

Reinigung des bGH

100 g Niederschlag werden in 40 ml destilliertem Wasser suspendiert und durch Titrieren mit 0,5 M NaOH eines pH-Werts von 11,8 in Lösung gebracht. Die Lösung wird dann 2 min lang beschallt und durch 20-minütiges Zentrifugieren bei 20 000 U/min in einem Sorvall SS34-Rotor geklärt. Anschließend wird die Lösung auf eine Sepharose CL-6B-Säule (5 x 100 cm), die mit 6,5 mM Boratpuffer eines pH-Werts von 11,8 ins Gleichgewicht gesetzt worden war, aufgegeben. Die Säule wird mit einer Geschwindigkeit von 100 ml/h entwickelt. Fraktionen von 12 ml werden aufgefangen. Der erste die Säule verlassende Peak wird verworfen. Die folgenden beiden Peaks werden getrennt und gepoolt. Der erst entspricht angehäuftem bGH mit niedriger Aktivität, der zweite bGH mit hoher Aktivität.
Eine DEAE-Sephacel (25 g/100 g Äquivalent ppt)-Säule wird mit 6,5 mM Boratpuffer eines pH-Werts von 9,0 ins Gleichgewicht gesetzt. Der zweite bGH-Peak wird mit HCl auf einen pH- Wert von 9,0 gebracht und mit einer Geschwindigkeit von 250 ml/h auf die DEAE-Sephacell-Säule aufgegeben. Die Säule wird mit 7,5 ml 6,5 mM Boratpuffer eines pH-Werts von 9,0 gewaschen und mit 6,5 mM Boratpuffer eines pH-Werts von 9,0 mit 75 mM NaCl eluiert. Die Fraktionen mit OD&sub2;&sub8;&sub0; über 0,3 werden gepoolt, gegen H&sub2;O in einer Millipore-Pellicon-Dialysevorrichtung dialysiert und danach lyophilisiert.

Beispiel 5

Aktivität des durch pRec 2/3 produzierten bGH-Analogen

1. Radioimmuntestvergleich des bGH-Analogen mit natürlichem bGH

Es wurde eine Lösung mit 100 ng/ml bGH-Analogem in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1% BSA) zubereitet. Diese Lösung wurde einer Reihenverdünnung auf Konzentrationen von 50, 25, 12,5, 6,25, 3,12, 1,56 und 0,78 ng/l unterworfen. Doppelte 0,1 ml Aliquote dieser Lösungen wurden mittels einer Doppelantikörpermaßnahme einem Radioimmuntest unterworfen. Die Verdünnungskurve war mit der mit natürlichem bGH erhaltenen Verdünnungskurve vergleichbar.

2. Radiorezeptorbindungstest

Mit Kaninchenlebermembranen wurde entsprechend T. Tushima und H.G. Freisen (Y. Chin., Endocr. Metab. (1973) 37, 334) unter Benutzung von ¹²&sup5;I-hGH als Tracer und authentischer bGH- Lösungen zur Erstellung von Eichkurven ein Radiorezeptorbindungstest durchgeführt. Dreifachproben wurden 2 h bei Raumtemperatur in 0,3 ml Testpuffer (50 mM Tris, 15 mM CaCl&sub2; und 5 mg/ml Rinderserumalbumin, pH-Wert: 7,6) inkubiert. Die Röhrchen enthielten ¹²&sup5;I-hGH (20 000 cpm Präparat von 30 - 60 µci/µg), 150 - 250 µg Lebermembranprotein und entweder natürliches bGH (1 - 100 ng) oder Extrakte von Bakterien-bGH. Das Ergebnis belegt, daß die bGH-Aktivität des bGH-Analogen mit derjenigen von natürlichem bGH vergleichbar ist.

3. Schienbeintest

Die biologische Aktivität des aus den gentechnisch manipulierten Bakterienzellen gemäß Beispiel 4 gewonnenen pRec 2/3 bGH-Analogen wurde mit Hilfe eines Schienbeintests (A.F. Parlow et al., Endocrinology (1965) 77, 1126) bewertet.
Ratten wurde im Alter von 28 - 30 Tagen die Hypophyse entfernt, worauf die Ratten 10 - 14 Tage ohne Behandlung blieben. Rinderwachstumshormon aus Rinderhirnanhangdrüsen oder rekombinantem E. coli wurde in 0,15 M NaCl + 0,01 M Borat (pH- Wert: 10,0) gelöst. Die Ratten (4 - 7 pro Gruppe) erhielten täglich subkutane Injektionen der bGH-Lösungen (5 - 125 µg/Tag in 0,2 ml) während 5 Tagen unter Normalfutter (Purina Rattenfutter und Wasser ad libitum). Am 6. Tag wurden die Versuchstiere getötet, ihre Vorderpfoten-Knieknochen entnommen, in Längsrichtung geschnitten, mit Aceton fixiert und mit 2% AgNO&sub3; gefärbt. Die Breite der Epiphysenplatten wurden durch Betrachten durch ein Präparierbinokular (Nikon) ausgemessen. Die Mittelwerte (40 Ablesungen pro Ratte) dienten zur Erstellung der Log-Dosis-Ansprech-Kurven. Die Ergebnisse sind in Fig. 15 dargestellt.

Beispiel 6

bGH-Analoge

Tabelle I enthält Angaben über eine Reihe von konstruierten Plasmiden und die aus ihnen produzierten Analogen. TABELLE I Plasmid Aminoende von bGH-Analogen

Beispiel 7

Wirkung von pRec 2/3 bGH-Analogem auf die Milchproduktion von Milchkühen

Die milchproduzierende Wirkung von bGH ist in der wissenschaftlichen Literatur gut belegt (vgl. Veröffentlichungen von J. Bines et al, Brit. J. Nutri. (1980) 43, 179 und C.Peel et al, J. Nutr. (1981) 111, 1662). D. Bauman et al, J. Dairy Sci. Vol. Supp. 1, Abst 86 (1982) berichteten, daß die Milchproduktion durch rDNA-bGH erhöht wurde. Es wurde ein Versuch durchgeführt, um die Wirkungen von pRec 2/3 bGH im Vergleich zu natürlichem bGH auf die Milchproduktion zu bestimmen. Achtzehn Holstein-Kühe im Alter von 141 - 154 Tagen nach der Geburt wurden nach folgendem Schema willkürlich einer Behandlung zugeordnet und entsprechend der Milchproduktion geblockt. Vorbehandlung Behandlung Tägliche GH-Injektion Vergleich Natürliches bGH pRec 2/3 bGH Tage Kochsalzlösung mg/Tag während 10 Tagen
Die bGHe wurden mit 0,1 M wäßrigem NaHCO&sub3;-Puffer (pH- Wert: 8,2) in einer Konzentration von 1 mg/ml unmittelbar vor den jeweiligen täglichen Injektionen in Lösung gebracht. Die Kühe erhielten täglich während 10 Tagen subkutan im Nackenbereich eine Placebo- oder bGH-Lösungsinjektion. Während der 5- tägigen Vorbehandlungsdauer wurden keine Injektionen verabreicht.
Die Kühe wurden zweimal täglich etwa um sechs Uhr früh und fünf Uhr nachmittags gemolken. Die Milchgewichte wurden mit dem Boumat-System aufgezeichnet und im Molkereidatensystem gespeichert.
Die durchschnittlichen Milchproduktionswerte für die Dauer der Vorbehandlung und der bGH-Behandlung sind in Tabelle II dargestellt. Der Produktionsgrad der Kontrollkühe blieb unverändert, während das Milchvolumen bei beiden bGH-Gruppen in ähnlichem Ausmaß stieg. Das natürliche bGH führte zu einer 11,9%igen Milchzunahme während der 10-tägigen Dauer, die Behandlung mit dem bGH-Analogen führte zu einer 10,2%igen Zunahme. Die Daten wurden wegen der geringen Zahl an Versuchstieren nicht auf eine statistische Signifikanz hin analysiert. Die Größenordnungen der Zunahme sind jedoch ähnlich wie die in der Literatur veröffentlichten.
Daraus wurde der Schluß gezogen, daß pRec 2/3 bGH die Milchproduktion bei Milchkühen ähnlich stimuliert wie natürliches bGH. TABELLE II Wirkung des Rinderwachstumshormons auf die Milchproduktion Natürliches bGH gegen pRec 2/3 bGH Durchschnittliche tägliche Milchproduktion (lb/Tag) Behandlungsgruppe Vorbehandlung 5 Tage Während GH 10 Tage % Zunahme gegenüber der Vorbebehandlung Kontrollgruppe Natürliches bGH 25 mg/Tag pRec 2/3 bGH 25 mg/Tag
Jede Kuh erhielt eine tägliche subkutane Injektion von entweder Placebo- oder bGH-Lösung einmal pro Tag während 10 Tagen.

Claims

1. Analoges von bGH mit der Aktivität von natürlich vorkommendem bGH und der Aminosäuresequenz Met-Asp-Gln, Met-Asp-Pro oder Met-Thr-Arg am N-Ende der Phenylalaninform von bGH.

2. Analoges von bGH mit der Aktivität von natürlich vorkommendem bGH und der Aminosäure Methionin oder der Aminosäuresequenz Ala-Gly, Met-Gly oder Met-Asp-Pro- Met-Gly am N-Ende der Alaninform von bGH.

3. Analoges von bGH mit der Aminosäuresequenz Met-(X)n-Y- Met..., wobei bedeuten:

Met das N-Ende;

X eine der zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäuren;

Y eine der zwanzig Aminosäuren mit Ausnahme von Glu, Gln, Lys, Met oder Trp;

n eine ganze Zahl von 0 bis 6 und

Met... die Sequenz von natürlichem bGH von der Stelle 4 bis zum COOH-Ende (Stellung 190).

Veterinärmedizinische Zubereitung, enthaltend eine wirksame Menge eines Analogen von bGH entsprechend einem der Ansprüche 2 oder 3 und einen geeigneten Träger.

5. Verfahren zur Gewinnung eines gereinigten tierischen Wachstumshormons oder eines Polypeptidanalogen desselben mit praktisch derselben Aminosäuresequenz und der biologischen Aktivität, wie sie das entsprechende natürlich vorkommende tierische Wachstumshormon aufweist, aus einer Bakterienzelle, in der das tierische Wachstumshormon oder Polypeptidanaloge mittels Expression eines Plasmids mit Codierung für das Hormon oder Polypeptidanaloge produziert wurde, durch:

a) Aufbrechen der Zellenwand der Bakterienzelle in einer auf neutralen pH-Wert gepufferten Lösung zur Bildung eines Lysats mit ausgefälltem Hormon oder Polypeptidanalogen;

b) Gewinnen des gebildeten ausgefällten Hormons oder Polypeptidanalogen;

c) Suspendieren des hierbei gewonnenen ausgefällten Hormons oder Polypeptidanalogen in destilliertem Wasser;

d) Behandeln der erhaltenen niederschlaghaltigen Suspension mit einer Natriumhydroxidlösung eines alkalischen pH-Werts von etwa 11,8 zum Löslichmachen des Niederschlags und somit des darin enthaltenen Hormons oder Polypeptidanalogen;

e) Abtrennen des löslich gemachten Hormons oder Polypeptidanalogen von sonstigen löslichen Komponenten durch Gelfiltrationschromatographie und

f) Unterwerfen des derart abgetrennten Hormons oder Polypeptidanalogen einer Ionenaustauschchromatographie zur Reinigung des Hormons oder Analogen und dabei Gewinnung von gereinigtem Hormon oder Polypeptidanalogen.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei es sich bei dem Hormon um Rinderwachstumshormon, Schweinewachstumshormon, Geflügelwachstumshormon, menschliches Wachstumshormon oder Polypeptidanaloge derselben handelt.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei die Zellen mechanisch aufgebrochen werden.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei dem Lysat vor der Gewinnung des ausgefällten Hormons oder Polypeptidanalogen desselben Lysozym zugesetzt wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei dem Lysat vor der Gewinnung des ausgefällten Hormons oder Polypeptidanalogen desselben Desoxyribonuclease zugesetzt wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 9, wobei der neutrale pH-Wert etwa 7,4 beträgt.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 10, wobei das Hormon oder Polypeptidanaloge durch Dialyse und anschließendes Lyophilisieren weiter konzentriert wird.