JPH01256390A - 新規ｄｎａとその生産方法、それを有する新規プラスミド、新規ポリペプチドとその生産方法、及び該ポリペプチドからなる新規抗腫瘍剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は新規ＤＮＡ、詳細には、サイモシンβ４　ぐ以
下、ＴＭ０１と称す）とＴＮＦとをコードする新規ＤＮ
Ａとその新規生産方法、それを含有する新規プラスミド
、該ＤＮＡにより発現される新規ポリペプチドとその生
産方法及び、該ポリペプチドからなる新規抗腫瘍剤に間
する。

〔従来の技術］ ＴＭ０１は、免疫能を回復させると報告されている胸腺
ホルモンであるサイモシンの１　ｆｉ　（ｒ現代化学Ｊ
　１９ｅ５年１２月号３４〜３８頁）なので、腫瘍細胞
等の恋性化骨髄細胞を単球細胞に分化誘導する作用を有
すると考えられており、そのアミノ酸配列も次の通りに
解明されている。

Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｕ−Ｉ　１ｅ−Ｇｌｕ　−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−
Ａｓｐ−Ｌｙｓ−８ｅｒ　−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−
Ｌｙｓ−Ｔｈ　ｒ　−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｉｎ−Ｇｌｕ
−Ｌｙｓ　−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−５ｅｒ
　　−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−１１ｅ−Ｇｌｕ　　−
Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｉｎ−Ａｌａ　　−Ｇｌｙ
−Ｇｌｕ−９ｅｒ。

しかし、従来の方法では、ウシ胸腺１ｇから、わずか４
６１μｇが分離できろ程度であり、また、精製操作も極
めて煩雑である［アナルズ　ニューヨーク　アカデミ−
オブ　サイエンシス゛（Ａｎｎａｌｓ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒ
ｋ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ）　。

ｖｏｌ　　２４９，１３４頁、１９７５年］。即ち、Ｔ
Ｍ０１は、それを高純度で大量に生産する方法が発明さ
れていないために、その有用性に関する研究は未だ大き
な発展をみていない。

一方、ＴＮＦは腫瘍壊死因子の総称であり、ヒト起源の
ものとしては、ザ　ジャーナル　オブバイオロジカル　
ケミストリー　［Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｒｉａ
ｌ、　Ｃｈｅｗ、、　、ｊＪ３Ｊｌ、　２３４５〜２３
５４頁（１９８５年）コに記載されているヒ［１胞株Ｈ
Ｌ−６０　（ＡＴＣＣ２４０）より得られたＴＮＦ−α
が知られており、そのアミノ酸配列も次の通りに解明さ
れている。

Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−３ｅｒ　− ５ｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ　−Ａｓｐ−
Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｖａｔ−Ｖ
ａｔ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐ　ｒ　ｏ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ａ　
Ｉ　ａ−Ｇ　１　ｕ−Ｇ　ｌ　ｙ　−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−
Ｇｉｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ　−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−
Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＡＩａ−Ａ
ｓｎ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｖａ　ｌ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｌ　ｅ　ｕ
−Ａｒ　ｇ　−Ａｓ　ｐ−Ａｓ　ｎ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｌ　
ｅ　ｕ−Ｖａ　ｌ　−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｇｌｕ
−Ｇｌｙ−Ｌ　ｅ　ＩＪ　−Ｔ　ｙ　ｒ　−Ｌ　ｅ　１
＋　−１１ｅ　−Ｔ　ｙ　ｒ　−５ｅｒ−Ｇｉｎ−Ｖａ
ｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ　−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌ
ｙ−Ｃｙｓ　−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｖａ
ｔ　−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｂｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ　−１
１ｅ−３ｅｒ−Ａｒｇ−１ｉｅ−Ａｌａ−Ｖａ　１−５
ｅ　ｒ−Ｔｙｒ−Ｇ　Ｉ　ｎ−Ｔｂ　ｒ　−Ｌｙｓ−Ｖ
ａｌ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ　−５ｅｒ−Ａｌａ−Ｉ
　　１ｅ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ　　−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇｌ
ｎ−Ａｒｇ−ＧＩＩＪ　　−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−
Ｇａｙ−Ａｌａ　　−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ
−Ｔｒｐ　　−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｔｙ
ｒ　−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ　−Ｇ
ｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ　−Ａｓｐ−Ａ
ｒｇ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ａｌａ　−Ｇｌｕ−Ｉ　　ｌｅ
−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ　　−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅ
ｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ　−Ａｌａ−Ｇｌｕ−９ｅｒ−Ｇｌ
ｙ−Ｇｌｎ　　−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｉ
　　１ｅ　　−１１ｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ　　。

（上記アミノ酸配列において、初めから１８番目のアミ
ノ酸であるＡｌａから最後のＬｅｕまでのアミノ酸配列
は、ＴＮＦ−αの第４エクソンの塩基配列の先頭にグア
ニン（Ｇ）を連結した形の塩基配列に対応する。従って
、明細書の他の部分における記載においては、上記Ａｌ
ａ−Ｌｅｕ部分はｒＴＮＦ−αの第４エクソンの塩基配
列の先頭にグアニンを連結した形の塩基配列に対応する
アミノ酸配列」と表現する） しかし、このＴ　Ｎ　Ｆ−αが抗腫瘍活性を示す細胞は
極めて限定されており［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）
　Ｊ　−２」Ｌ山−、９４３〜９４５頁（１９８５年）
］、又、脂肪細胞の異１ヒを光道させるいわゆるカケク
チン活性を有することも報告されている［セラビューテ
ィック　リサーチ （Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　、−
ヱー、第２号、１８４〜１９０頁、１９８７年］。その
ため、このＴＮＦ−αの欠陥を補うべく、いくつかの組
換えＴＮＦ（以下、ｒＴＮＦと称す）が発明されている
。

［発明が解決しようとする課題］ このような状況下において、本発明の目的は、ＴＨβ４
とＴＮＦとをコードし、ＴＨβ４を高純度で大量生産す
ることを初めて可能にした新規ＤＮＡとその生産方法、
それを含有する新規プラスミド、該ＤＮＡにより発現さ
れる新規ポリペプチドとその生産方法及び、該ポリペプ
チドからなる新規抗腫瘍剤を提供することにある。

［課題を解決するための手段］ 本発明により、次のアミノ酸配列をコードする新規ＤＮ
Ａが提供される。

（ＴＨβ４のアミノ酸配列）−Ａｓｐ−−Ｐ　ｒ　ｏ−
ｘ　−（ＴＮＦ−αの第４エクソンの塩基配列の先頭に
グアニンを連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配
列）（式中、Ｘは存在しないか、次のアミノ酸配列のい
ずれかを表す。

１）Ｖａｌ−５ｅｒ−９ｅｒ−５ｅｒ　−Ａ、　ｒ　ｇ
　−Ｔ　ｂ　ｒ　−Ｐ　ｒ　ｏ　−Ｓ　ｅ　ｒ　−Ａｓ
ｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｔ　− Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ　； ２）Ｖａ　１−Ａｒ　ｇ−３ｅ　ｒ−Ｓｅ　ｒ　−Ｓｅ
ｔ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ　− ５ｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ− Ｖａｌ−Ａｌａ−）Ｔｉｓ−Ｖａｔ　−Ｖａじ ３）Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ　−Ｔｈｒ−Ａｒ
ｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ− Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ− Ｖａ　　１−Ａｌ　　ａ−Ｈｉ　　５−Ｖａ　　１　−
Ｖａｌ： ４）Ｖａｌ−Ａｒｇ−５ｅｒ−３ｅｒ　　−Ｔｈｒ−Ａ
ｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ　　−９ｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−
Ｐｒｏ　　−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｖａｔ　　−Ｖ
　　ａ　　１　　： ５）Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ　　−Ｔｈｒ−Ａ
ｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ　− ９ｅｔ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ　− Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ　　−Ｖ　　ａ　　ｌ
　　ｍ　　） 本発明の新規ＤＮＡは、ＴＨβ４のアミノ酸配列をコー
ドするＤＮＡと、Ｘ−（ＴＮＦ−αの第４エクソンの塩
基配列の先頭にグアニンを連結した形の塩基配列に対応
するアミノ酸配列）をコードするＤＮＡとを、Ａｓｐ−
Ｐｒｏを連結部として連結させることにより生産される
。

得られたＤＮＡを発現させるには、それを適当なベクタ
ーＤＮＡに発現されるように組み込み、得られたｒＤＮ
Ａを用いで、動物細胞、酵母、枯草菌、大腸菌等の微生
物等の宿主を形質転換し、発現を誘導すればよい。

又、その発現により得られたポリペプチドを終濃度０．
５〜２　ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｑで、例えばギ酸または酢酸
等の適当な酸中て２４〜４８時間、３７℃で反応させる
と分解し、ＴＨβ４とｘ−（ＴＮＦ−αの第４エクソン
の塩基配列の先頭にグアニンを連結した形の塩基配列に
対応するアミノ酸配列）（式中、Ｘは前記定義通りであ
る）とが得られる。

工 生産の方法としては、次の３つの形態が考えられるが、
そのいずれによってもよい。

１）（ＴＨβ４のアミノ酸配列）−Ａｓｐ−Ｐｒｏをコ
ードするＤＮＡと、ｘ−（ＴＮＦ−ａの第４エクソンの
塩基配列の先頭にグアニンを連結した形の塩基配列に対
応するアミノ酸配列）をコードするＤＮＡを連結する。

２）（ＴＨβ４のアミノ酸配列）をコードするＤＮＡと
、Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ｘ−（ＴＮＦ−ａの第４エクソンの
塩基配列の先頭にグアニンを連結した形の塩基配列に対
応するアミノ酸配列）をコードするＤＮＡを連結する。

３）（ＴＨβ４のアミノ酸配列）をコードするＤＮＡと
、Ａｓｐ−ＰｒｏをコードするＤＮＡと、ｘ−（ＴＮＦ
−αの第４エクソンの塩基配列の先頭にグアニンを連結
した形の塩基配列に対応するアミノ酸配列）をコードす
るＤＮＡとをその順位で同時に連結する。

１）の場合の一例を説明すると、次の通りである。

悪性化骨髄細胞を生体外分化誘導物質で刺激して単球細
胞に分化する過程で合成されるｍ　ＲＮ　Ａの１種と相
補的なｃＤＮＡであるｐＨＨ５８［バイオケミカル　ア
ンド　バイオフィジカル　リサーチコミュニケーション
ス（ＢｌｏｃＨＥＭｌｃＡＬＡＮＤＢＩＯＰＨＹＳＩＣ
ＡＬ　ＲＥＳＥＡＲＣＨＣＯＭＭｔＪＮＩＣＡＴＩＯＮ
Ｓ）　、　ｖ　ｏ　ｌ　。

１３２、Ｎｏ、１．１００〜１０９頁（１９８５年）］
をＰｓｔｌで処理し、得られた約５３０ｂｐのＤＮＡ断
片を回収する。ついで、Ｈｉｎｆｌで処理し、約２２０
ｂｐのＰｓ　ｔ　Ｉ／）１ｉｎｆｌ断片と約３１０ｂｐ
の１（ｉｎｆｌ／ＰｓｔＩ断片とを回収する。前者のＰ
ｓ　ｔ　Ｉ／Ｈｉｎｆｌ断片をＭｎ１ｌ（米国ニューイ
ングランドバイラボス社製）で切断して１２７ｂｐのＭ
ｎｉ！Ｉ／ＨｉｎｆＩ断片を得、これをさきほどのＨｉ
　ｎ　ｆ　Ｉ　／　Ｐ　ｓ　ｔ　Ｉ断片と連結させて、
ＴＨβ４のアミノ酸配列をコードするＭｎｆｆ１ｌ／Ｐ
ｓｔｌ断片を得る。この断片を、プラスミドベクターｐ
Ｕｃ５４０のＭｎ１Ｉ／ＰｓｔＩ断片に連結させて、プ
ラスミドｐＵｃ５４０ＴＨβ４（約３．５ｋｂ）を生産
する。

ｐＵｃ５４０は、ファルマシア社より市販されているプ
ラスミドベクターｐＵＣ８のＥｃｏＲＩ／　Ｂ　ａ　ｍ
　Ｈ１部位に、同じく同社より市販されている、ｔａｃ
プロモーターを有するプラスミドｐＤＲ５４０のＥｃｏ
Ｒ１／ＢａｍＨＩ断片をクローニングしたものである。

ついでｐＵｃ５４０ＴＨβ４から、ＢａｍＨＩリンカ−
との結合を含む処理により、ＴＨβ４のアミノ酸配列と
、ｘ−（ＴＮＦ−αの第４エクソンの塩基配列の先頭に
グアニンを連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配
列）との連結部となるアミノ酸配列Ａｓｐ−Ｐｒｏとを
コードするＤＮＡを生産する。

ｘ−（ＴＮＦ−αの第４エクソンの塩基配列の先頭にグ
アニンを連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配列
）をコードするＤＮＡは、ヌクレイツク　アシッズ　リ
サーチ［（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、）　、
１０．７４３９〜７４４Ｂ頁（１９８１年）］、バイオ
ケミストリー［（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙコ１７．１
２５７〜１２６７頁（１９７８年）］等に記載されてい
る方法に準拠して、化学的に合成できる。

例えば、特閘昭６２−２８２５８７号公報（特願昭６ｌ
−１（３９５２２号出願）の実施例２に開示されている
ｐＵｃ５４０ＴＮＦ２１／２２［Ｘが存在しない場合に
対応する］、ｐＵＣ５４０丁ＮＦ６９／７０［ｘが前記
１）に対応する］、ｐＵｃ５４０ＴＮＦ？２／７３　Ｃ
ｘが前記２）に対応する］、実施例３に開示されている
ｐＵＣ５４０ＡＭＣＴ−１［Ｘが前記３）に対応するコ
、或いは、後記実施例で開示するｐＵｃ５４０ＡＭ１［
Ｘが前記４）に対応する］或いはＡＭ２　［Ｘが前記５
）に対応する］は、Ｘ−（ＴＮＦ−αの第４エクソンの
塩基配列の先頭にグアニンを連結した形の塩基配列に対
応するアミノ酸配列）をコードするＤＮＡ部分がＴａｃ
プロモーターのＢａｍＨ１下流に連結され、ＢａｍＨＩ
切断点直後に開始コドンとしてのＡＴＧを有し、これに
続くアミノ酸の第１コドンがＧなので、それらをＮｃｏ
Ｉ［日本ジーン（株）１１］、ムング　ビーン（Ｍｕｎ
ｇＢｅａｎ　）ヌクレアーゼ、Ｐｓｔｌで処理すること
により目的とするｘ−（ＴＮＦ−αの第４エクソンの先
頭にグアニンを連結した形の塩基配列に対応するアミノ
酸配列）をコードするＤＮＡを得ることができる。−例
として、ｐ　Ｕ　Ｃ５４０Ａ　Ｍ　１を使用した場合の
例を実施例で詳しく述べる。

本発明のＤＮＡをベクターＤＮＡに発現可能なように絹
み込むには、よく知られているように、プロモーター配
列（通常オペレータ配列の下流に存在している）とその
下流にシャイン・ダルガルノ配列（以下、ＳＤ配列と記
す）を有するベクターＤＮＡのＳＤ配列の下流に本発明
のＤＮＡを組み込むか、ベクターＤＮＡに本発明のＤＮ
Ａを組み込んだ後に、その上流にプロモータ配列（通常
オペレータ配列も）及びＳＤ配列を挿入すればよい。

ｒＤＮＡ技術により外来遺伝子の遺伝情報を微生物細胞
内で発現させる方法は、ｒ遺伝子組換え実用化技術（４
）Ｊ　　（１９８３年）（サイエンスフォーラム社）、
「モレキュラー　クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　
Ｃｌｏｎｉｎｇ）　Ｊ　　（１９８２年）［コールドス
プリング　ハーバ−ラボラトリ−（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎ
ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ）　］、ｒ組換え遺伝子の細
胞への導入と発現Ｊ　　（１９８３年）（共立出版株式
会社）等に記載されている。

大腸菌を宿主として用いた場合の例を実施例に示す。

又、酵母を宿主として用いる時は、以下のようにする。

アルコール脱水素酵素（ＡＤＨＩ）のプロモーターを挿
入したプラスミドベクターｐＭＡ５６［ネイチャー　　
（Ｎａｔｕｒｅ）　　−２」ＬＪ−１３４７〜３５０頁
（１９８２年）］は、プロモーター下流にＥｃｏＲ１部
位を有しているため、本発明のＤＮＡを、例えば、実施
例に記載しである組換え体よりＢａｍＨｒ−Ｐｓ　ｔ　
Ｉ断片として回収し、ｐＭＡ５６のＡＤＨＩプロモータ
ー下流のＥｃ。

Ｒ１部位にＥｃｏＲｒ／ＢａｍＨＩリンカ−１Ｐｓ　ｔ
　ｒ／Ｅｃ　ｏＲＩリンカ−を用いて挿入すればＡＤＨ
Ｉプロモーターの支配になり、本発明のＤＮＡの遺伝情
報は発現可能となる。

又、抑制酸性フォスファターゼ（ＰＨ０５）プロモータ
ーを有するｐＡＭ８２［プロシーディング　オブ　ナシ
ョナル　アカデミ−サイエンスオブ　ニーニスｘ　−（
Ｐｒｏｃｉ　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ。

Ｓ、Ａ、）ｌｉ、１〜５頁（１９８３年）］は、ＰＨ０
５プロモーター下流にＸｈｏ　Ｉ部位を有するため、本
発明のＤＮＡを、例えば、実施例に記載しである組換え
体よりＢａｍＨＩ−Ｐｓｔｌ断片として回収し、ｐＡＭ
８２のＰＨ０５プロモーター下流のＸｈｏ　Ｉ部位にＢ
ａｍＨＴ／Ｘｈｏｌリンカ−１Ｐｓ　ｔ　Ｉ／Ｘｈｏ　
Ｉリンカ−を用いて挿入すればＰＨ０５プロモーターの
支配になり、その遺伝情報は酵母で発現可能となる。

又、枯草菌を宿主として用いても、以下のようにして本
発明のＤＮＡの遺伝情報を発現させることができる。

バチルス　サブチリス　マーパース（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ　Ｍａｒｂｕｒｓ）株の有するα−ア
ミラーゼプロモーターを有するｐＴＵ８２８５　［ジー
ン（Ｇｅｎｅ）　、ユ土、１４８頁（１９８５年）］は
、プロモーター、及びシグナルペプチドの下流に１（ｉ
ｎｃｌＩ部位を有しているため、例えば、本発明のＤＮ
Ａを、実施例に記載されている組換え体よりＢａｍＨＩ
−Ｐｓｔｌ断片として回収し、ｐＴＵＢ２８５の１（ｉ
ｎｃＩＴ部にシグナルペプチドのアミノ酸フレームと合
うようなＨｉｎｃ１１／ＢａｍＨＩリンカ−１Ｈｉｎｃ
ｌｌ／Ｐｓｔｌリンカ−を用いて挿入してやれば、α−
アミラーゼプロモーターの支配をうけ、枯草菌でも発現
可能となる。

（３）１．１ぺ　　゛ 形質転換された宿主細胞を遠心分離などによって集め、
超音波或いはリゾチームなとて破砕する。

このとき低張ｔαを用いるが、ＳＤＳなとの界面活性剤
や塩酸グアニジンなどの蛋白変性剤を共存させたほうが
良い結果が得られる場合もある。

細胞破砕ｉ夜を遠心分離に付して上清液を得る。

このようにして得られる抗腫瘍性ポリペプチドを含む破
砕上清液を通常の蛋白質精製法に準じて精製する。

即ち、塩基性陰イオン交換体によるイオン交換クロマト
グラフィー、塩析法、透析法、ゲル濾過法、ｍ水りロマ
トグラフィー、高速分子篩クロマトグラフィー、電気泳
動法等を順次又は適宜組み合わせることによって精製で
きる。

例えば、塩基性陰イオン交換体としてはＤＥＡＥ−セフ
ァデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　　Ａ　−２５、八−
５０、ＤＥＡＥ−セファロース（５ｅｐｈａｒｏｓｅ　
）ＣＬ−６８，ＤＥＡＥ−セファミル（５ｅｐｌ＋ａｍ
　ｉ　Ｉ　）（以上、ファルマシア社！りが好ましく、
その池、ジエチルアミノ基、アミノエチル基又は四級化
アミノエチル基含有陰イオン交換体も使用できろ。

使用される緩衝液としては、ｐＨ６，０〜９．０のトリ
ス−ＨＣｌ又はリン酸緩衝液が望ましく、これらの０．
０５Ｍ程度の希薄な緩衝液て抗腫瘍性ポリペプチドの培
養液を希釈し、塩濃度０．１Ｍ以下の溶ｉ夜として陰イ
オン交換体と接触させて抗腫瘍性ポリペプチドを吸着さ
せる。

抗１１瘍性ポリペプチドの溶出は０．１〜０．２Ｎ１の
ＮａＣ１又はＫ　ＣＩ！等の塩類溶液で行う。抗腫瘍性
ポリペプチドは０．２Ｍ付近の塩濃度で溶出される。陰
イオン交換体との接触はカラム法が望ましいが、大量の
場合はバッチ法も採用できる。

陰イオン交換クロマトグラフィーを行う前に、前処理と
して限外濾過膜で低分子物質を除去することが望ましく
、精製効果を上げることが出来る。

陰イオン交換クロマトグラフィーで得られた溶液は透析
後、濃縮してゲル濾過に付す。ゲル濾適用の坦体として
は、セファデックスＧ−７５、Ｇ−１００（ファルマシ
ア社！り、セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　）　Ｓ
　−２００（ファルマシア社製）、バイオゲル（Ｂｉｏ
ｇｅｌ）　Ｐ　−１００（バイオラッド社製）及びトー
ヨーパールＨＷ−５０、ＨＷ−５５（東洋曹達工業社製
）等を使用する。

ゲル濾過に使用する緩衝液はｐＨｅ、Ｏ〜９．０のトリ
ス−ＨＩ３またはリン酸緩衝液である。吸着防止のため
、０．２〜０．５ＭのＮａＣｌ等の塩類を添加して使用
することが望ましい。

又、陰イオン交換クロマトグラフィーで得られた抗腫瘍
性ポリペプチド活性溶ｉαは、疏水クロマトグラフィー
で精製することもできる。この場合はブチルート−ヨー
パール６５０（東洋曹達工業社製）等を坦体とし、硫安
、ＮａＣ２等の塩類を用いて抗腫瘍性ポリペプチドを溶
出させろ。

ゲル濾過或いは疏水クロマトグラフィーで精製した抗Ｉ
Ｉ瘍性ポリペプチド含有液は、次いでモノ（Ｍｏｎｏ）
　Ｑ　　ＨＲ５１５カラム（ファルマシア社製の高性能
陰イオン交換体カラム）を使用するファルマシアＦ　Ｐ
　Ｔ、、　Ｃ（Ｆａｓｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ、　Ｐｅｐｔ
ｉｄｅ。

Ｐｏ１ｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈ
ｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）システムによる高性能陰イ
オン交換体クロマトグラフィーにＩｔ　Ｌ、て、精製標
品を得る。この高性能陰イオン交換体クロマトグラフィ
ーの条件は最初のＤＥＡＥ−セファローズ等の坦体を使
用する陰イオン交換クロマトグラフィーの場合と同じで
ある。

本発明の新規なりＮＡは、大別すると３つの有用性を持
つ。

第１の有用性は、それ自体が、新規な抗腫瘍性ポリペプ
チドをコードしている点にある。この抗腫瘍性は、Ｌ−
９２９細胞［プロシーデイングオブ　ナショナル　アカ
デミ−サイエンス　オブ　ニーニスニー　１１．３６６
６〜３６７０頁］及び繊維芽肉腫メス（Ｍｅｔｈ）　　
Ａ細胞［サイエンス（Ｓｃ　ｉ　ｅｎｃｅ　）　　−２
」ＬＪ−１９４４頁（１９８５年）］に対する細胞毒性
より確認されている。

更に、この新規ポリペプチドは、高い内因性ＴＮＦ産生
誘導活性を持っている。

第２の有用性は、その発現により得られるポリペプチド
をギ酸や酢酸などの適当な酸で処理すると、連結部であ
るＡｓｐ−Ｐｒｏの間で切断され、Ｔ’Ｈβ４と抗腫瘍
性ポリペプチドであるｘ　−（ＴＮＦ−αの第４エクソ
ンの塩基配列の先頭にグアニンを連結した形の塩基配列
に対応するアミノ酸配列）とを得られる点にある。前述
の如く、本発明のＤＮＡは大腸菌等に組み込むことによ
り大量生産できるので、従来、大量生産が不可能であっ
たＴＨβ４の大量生産が初めて可能になった。

第３の有用性は、本発明のＤＮＡがコードするアミノ酸
配列において、（ＴＮＦ−αの第４エクソンの塩基配列
の先頭にグアニンを連結した形の塩基配列に対応するア
ミノ酸配列）の先頭のアミノ酸であるアラニン（Ａｌａ
）の塩基配列がＧＣＧである場合には、制限酵素Ｎｒｕ
ｌ　（ＴＣＧＣＧＡ）の作用により、ＴＮＦ−αの第４
エクソン部分の塩基配列と同一の塩基配列の前で塩基配
列を切断し、任意の塩基配列を導入できるという点にあ
る。

なお、本発明の新規ＤＮＡがコードする新規ポリペプチ
ドのＬ９２９細胞に対する細胞毒性は、次のようにして
分析できる。

、＋。

Ａ９２９細胞を、５％仔牛脂児血清（以下ＦＣ５と記す
）を加えたイーグルミニマムエッセンシャル培地（以下
ＭＥＭと記す）で育成し、８Ｘ１０’個の細胞が１００
μｔの同上培地に含まれる様にし、９６大の平底プレー
トで育種する。

育種条件は３７℃、２時間、５％ＣＯ２，１００％Ｈ，
Ｏであり、通常の細胞培養に用いられる方法でよい。そ
の後、アクチノマイシンＤを培地中に終濃度ｌμｇ　／
　ｍ　９．どなるように加え、培養液の液量を１５０μ
ｔとする。即座に、検体を適当にＭＥＭ培地で稀釈した
ものを５０μを加える（この際稀釈率を適宜調製し、Ｅ
Ｄ、。を求める事ができる）。更に、最終液量２００μ
ｔとなったＬ９２９細胞を上記条件で１８時間培養する
。

細胞壊死活性を測定するには、まず全培地を除去し、つ
いで０．２％クリスタルバイオレットを含む２％メチル
アルコール溶液を加えて固定染色する。クリスタルバイ
オレットは全有核細胞を染色し、細胞壊死を生じた結果
プレート底面より遊離した細胞は染色しないので、細胞
壊死活性を直接測定できる。この染色度をＯＤ５ＱＯｎ
ｍでの吸収で測定し、対照群に対する染色度と比較する
事で細胞壊死活性を測定する。活性の定義は次の様に行
う。

Ｌ９２９ｗＩｉ胞が５０％生存できる検体原液の稀釈率
（Ｎ）を求める。対照としてウサギＴＮＳをを２．４Ｘ
１０’単位／ｍｇ／ｍｌのヒトＴＮＦを用いて決定する
。このウサギＴＮＳのＥＤ５０を与える稀釈率（Ｃ）を
求める。

する。

以下、実施例、実験例により本発明を更に詳細に説明す
る。

１）ｐＨＨ５Ｂ　（１００μｇ）を２５０単位のＰｓｔ
ｌで消化しく３７℃）、１．２％アガロースゲルで、５
３０塩基対からなるＰｓ　ｔ　Ｉ／Ｐｓｔｌ断片を分離
した。ゲルからこのＤＮＡを抽出し、ハイトロキシルア
パタイトカラムで精製して、２．７μｇのＤＮＡを回収
した。

２〉ついてこのＤＮＡを１２単位のＨｉｎｆＩて消化し
、８％アクリルアミドゲルで、２２０の塩基対からなる
”Ｐ　ｓ　ｔ　Ｉ／Ｈｉ　ｎ　ｆ　Ｉ’°断片と、３１
０塩基対からなる”ＨｉｎｆＴ／Ｐｓｔ１３°断片とを
別々に回収した。この回収は、ゲルから両断片を抽出後
、ＤＥＡＥセルロースカラムを用いろ通常の方法により
実施した。両断片の回収量は、紫外線吸収（ＯＤ　２６
０　ｎ　ｍ　）での検出が不可能と考え、回収率を１０
０％として、以下の計算式により推定した。

Ｐｓ　ｔ　Ｉ／Ｈ４ｎｆ　Ｉ断片の回収量Ｈ４ｎｆｌ／
ＰｓｔＩ断片の回収量 ３）ＰｓｔＩ／Ｈｉｎｆｌ断片を８単位のＭｎｌ！Ｉて
消化し、８％アクリルアミドゲルで、１２７塩基対から
なるＭ　ｎ　ｌ！　Ｉ　／　Ｈｉ　ｎ　ｆ　Ｔ断片を分
離、回収した。（回収量は約１００〜１５０ｎｇ）φ ４）２６μｇのＭｎｌ！　Ｉ／Ｈｉｎｆ　Ｉ断片と、６
５℃ｇのＨｉｎｆＩ／Ｐｓｔｌ断片を混ぜ、８７単泣の
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え、１６°Ｃて１時間反応させ
た。ついて、７０℃、５分の処理によって酵素を失活さ
せた後、１５単位のＰｓｔｌを加え、３７℃で２時間培
養して約９０ｎｇのＤＮＡを得た。

５）上記４）で得られたＤＮＡを、１００ｍＭのＮａＣ
１の存在下、エタノール（終濃度７０％）中でｐＵｃ５
４０のＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ断片（２６μｇ）と混じた
。沈澱物を回収し、５μｉの蒸留水に溶かし、約０．５
μりになる迄凍結乾燥して、エタノールと蒸留水を除去
した。ついて、１０Ｘリガーゼ反応緩衝液［１０ｍＭの
ＡＴＰ＋６６０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７，６）＋６
６ｍＭの塩化マグネシウム＋５０ｍＭのジチオスレイト
ール］を０．４μＩ！、Ｔ４ＤＮＡｌ／ガーゼを３５単
位加えて、４℃で一晩培養して、約３．５ｋ　ｂのｐＵ
ｃ５４０ＴＨβ４を得た。

６）１００μｇのｐＵｃ５４０ＴＨβ４を１９０単位の
ＨｉｎｆＩにより、３７℃で一晩消化させ、そのうちの
５０℃ｇを、８０μＭのデオキシＡＴＰと８０μＭのデ
オキシＴＴＰの存在下、ＤＮＡポリメラーゼ■のフレノ
ウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片（４０単位）と混じ、室温で３
０分間培養した。

７）７０℃、５分間の加熱処理で上記フレノウ断片を失
活させた後、１２０単位のＢａｍＨＩを加えて３７℃で
３時間培養した。

７）８％アクリルゲルを使い、ＢａｍＨ■部位、Ｈｉｎ
ｆ　１部位をＡ及びＴで峰復して平滑末端として、ＤＥ
ＡＥセルロースカラムを使い、約４５０ｎｇの１３５ｂ
ｐのＤＮＡを分離、回収した。

８）上記７）で得られたＤＮＡの２７μｇと、１．６μ
ｇのＢａｍＨＩリンカ−とを、８７単位のＴ４ＤＮＡリ
ガーゼの存在下で合わせて、４℃で一晩培養して、（Ｔ
Ｈβ４のアミノ酸配列）−Ａ　ｓ　ｐ　−Ｐ　ｒ　ｏ　
　をコードするＤＮＡを生産した。

９）ヒト急性単球性白血病細胞ＴＨＰ−１から精製され
た抗腫瘍性ポリペプチドのゲノム遺伝子（特開昭６２−
２８２５８７号公報）をＸｈｏ　Ｉ。

ＰｓｔＩて切断し、第１図に示すＸｈｏｌ／Ｐｓｔｌ断
片を回収した。次にこの断片を、Ｔａｃプロモーター及
びＳＤ配列を有するプラスミドベクターｐＵｃ５４０の
５ａｆｆｉ　Ｉ／Ｐｓ　ｔ　１部位に挿入して、プラス
ミドｐＵｃ５４０ＴＮＦｘ／ｐを調製した。

１０）別途、第１図に示すＸｈｏｌ／Ｐｓｔｌ断片をＨ
ｉｎｃＴＩて切断し、２９４塩基対のＸｈｏ！／Ｈｉｎ
ｃＩＩ断片と、５２１塩基対のＨｉｎｃｌＩ／Ｐｓｔｌ
断片を回収し、又、２９４塩基対の該断片をＤｄｅＩで
部分分解して、２０Ｇ塩基対のＤｄｅｌ／Ｈ４ｎｃｌｌ
断片を回収した。

この様にして回収した５２１塩基対の Ｈ４ｎｃｒｒ／Ｐｓｔｒ断片、２０Ｇ塩基対のＤｄｅｌ
／ＨｉｎｃＩＩ断片を、ＡＢ１社（米国）の３８０Ａ型
ＤＮＡシンセサイザーで合成した、第１表に示す７２／
７３塩基対の２本鎖ＤＮＡと結合させた後に、ｐＵｃ５
４０ＴＮ’　ｘ／ｐのＢａｍＨＩ／Ｐ　ｓ　ｔ　１部位
に挿入してｐＵｃ５４０ＴＮ’ＡＭＩを生成した。

第　　　　１　　　　表 八　　　　　　　　　声　　　　１ ７２／７３　　塩基対 １１）　ｐＵｃ５４０ＴＮ’ＡＭＩ　（１００１１ｇ）
　ニ１２０単位のＮ　ｃ、、　ｏ　Ｉを加え、３７℃で
一晩培養した。寒天ゲル電気泳動で完全消化を確認後、
フェノール抽出、クロロホルム抽出を行い、セファデッ
クス０５０カラムでＤＮＡを精製した。

１２）９０単位のムング　ビーン　ヌクレアーゼを力σ
えて３７℃で１０分間経過させた。次いで、７０℃で５
分間の加熱処理を行って、該ヌクレアーゼを失活させた
。

１３）１６０単位のＰｓｔｌを加えて３７℃で一晩培養
した。次いて、５％アクリルアミドゲルで、７７０塩基
対のＤＮＡ（約１μｇ）を回収した。

１４）上記した１）〜８）の手順で得られたＤＮＡ　（
２８，６ｎｇ）と、上記した９）　〜１３）の手順で得
られたＤＮＡ　（１５７ｇｇ）を、８７単位の７４ＤＮ
Ａリガーゼの存在下、４℃で一晩培養した。次いで、７
０℃で１０分間の加熱処理により該リガーゼを失活させ
た。

＋５）０．８単位のＰｓｔｌを加え、３７℃で１２時間
培養した後、７０℃で１０分間の加熱処理によりＰｓｔ
ｌを失活させた。次いで、プラスミドベクターｐＵｃ５
４０のＢａｍＨＩ／Ｐｓｔｌ断片（７６ｕ　ｇ）と混ぜ
、９０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下、４℃で一晩
培養して、プラスミドｐＵｃ５４０　（ＴＨβ４のアミ
ノ酸配列）−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ｘ−（ＴＮＦ−ａの第４
エクソンの塩基配列の先頭にグアニンを連結した形の塩
基配列に対応するアミノ酸配列）（式９式％ Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａｔ　　を表す）を生成した。

１６）上記１５）で生成したプラスミドを有する大腸菌
（ＤＨ−１）を、アンピシリン（５０ｇｇ／ｍ　’ｉ　
）とカナマイシン（１０ｇｇ　／　ｍ　Ｌ　）を含む１
０ｍｆｆ１のＮＺＹ培地［５ｇのＮａＣＬ、２ｇ＋７）
Ｍ　ｇ　Ｃｌ　２・７Ｈｅ０．１０ｇのＮＺアミンＡ（
株式会社和光純薬製）、５ｇのイーストエキスを混合し
、蒸留水で全量を１ｔとした培地］で３７℃で一晩、振
どう培養した。この培養液の１０　ｍ　Ｌを、アンピシ
リン（５０ｇｇ　／　ｍ　ｉ　）とカナマイシン（１０
ｇｇ／ｍｆｆ１）を含む１００　ｍ　ＥのＮＺＹ培地に
加え、３７℃で６時間振どう培養した。

次いで、この培養液の全量（約１００　ｍ　ｌ　）を、
０．７ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド
、アンピシリン（５０ｇｇ／ｍｌり、カナマイシン（１
０μｇ　／　ｍ　Ｌ　）を含む１之のＮＺＹ培地に加え
て、３７℃−晩垢とう培養した。

１７）このようにして得られた大腸菌を遠心分離（５０
００ｒｐｍ、１０分）に付し、沈澱を１００　ｍ　ｌ！
のＰＢＳ（−）にラスイ社製）に懸濁した。この！３濁
液を遠心分離（５０００ｒｐｍ、１０分）に付して菌体
を集め、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオライ
ド（蛋白分解酵素阻害剤）に懸濁した。得られた菌体浮
遊液を１０ｍｆｆ１ずつ超音波に付して［ブランソン　
ソニファイア（Ｂｒａｎｓｏｎ　ｓｏ旧ｆｉｅｒ）の目
盛り４０で６分間を３回）、大腸菌を破壊した。

１８）１００００　ｒ　ｐｍ、１時間の遠心操作に付し
て上清を回収した。この上清の、Ｌ９２９１１胞に対す
るＴＮＦ活性は１．８５Ｘ１０６単泣／ｍＩ！だった・ ＋９）上記上清の硫安画分く６０％飽和）を分取した。

この両分を１０００Ｏｒ　ｐｍ、３０分の遠心処理に付
して沈；澱を得、この沈澱を５ｍｆｆ１のＰＢＳ（−）
に溶かし、５１の１０ｍＭ）リス−ＨＣＬ　（ｐＨ７，
４）＋　１０ｍＭＮａＣｉ！に対して透析した。次いで
、１３０００ｒｐｍて一晩遠心処理に付して不溶物を除
いて、上清を回収した。

２０）この上清をファルマシア社製のモノＱＦＰＬＣカ
ラムクロマトグラフィーに付した。流速は２．０ｍｌ！
、／分とし、ＮａＣ１！ｉ！ｉ度を０．ＯＩＭからＩＭ
まで直線的に上げる段階的溶出法により各２０ｍ１！の
画分を集めた。溶出パターンを第２図に示す。

第２図において、横軸に沿った連続番号はそれぞれの画
分を表し、曲線は蛋白の溶出量を表し、柱状グラフは、
Ｌ９２９細胞に対するＴＮＦ活性（単位）を表し、直線
は溶出液の塩濃度（０，ＯＩＭ〜ＩＭ）を表している。

２＋）　　（ＴＨβ４のアミノ酸配列）−Ａｓｐ−Ｐｒ
ｏ−ｘ−（ＴＮＦ−αの第４エクソンの塩基配列の先頭
にグアニンを連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸
配列）（式中、Ｘは Ｖａｌ−Ａｒｇ−３ｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ　−Ａｒｇ−
Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖ
ａｌ−Ａｌａ−Ｈｉｓ　−Ｖａ　Ｉ−Ｖａ　１　　を表
す）の構造をした蛋白を多量に含む活性画分（２３〜２
７）を集め、再度モノＱカラムにかけて、はぼ単一ビー
ク（精製度〉９５％）を持つ画分（７，５ｍ２）を分取
した。

溶出パターンを第３図に示す。

第３図において、横軸に沿った連続番号、曲線、柱状グ
ラフ、直線が表すものは第２図におけると同しである。

上記画分のＬ９２９細胞に対するＴＮＦ活性は、２．５
Ｘ１０’単位／　ｍ　ｌだった。又、ファルマシアスペ
ローズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　５ｕｐｅｒｏｓｅ）　１
２カラム（ゲル濾過）に付して分子量を調べたら、６７
０００ダルトン以上であり、３全体ないし４量体の構造
をとっているものと推定された。又、５ｐｓ＝気泳動法
によると、２２０００ダルトンであった。

、ニーｐ、■」一 実施例中の９）〜１３）の手順で得られたｒＤＮＡ（以
下、ｒＴＮＦ−９−ＡＭ！と称す）を有する大腸菌ＪＭ
Ｉ　０３を、アンピシリン５０μｇ　／　ｍ　Ｌを含む
Ｉ　ＸＹＴ培地（バクトドリブトン　０．８％、バクト
イ−ストエキス　０．５％、ＮａＣ１Ｏ，５％）で３７
℃で前培養した後、アンピシリン５０μｇ　／　ｍ　Ｌ
を含むｌ　ＸＹＴ培地１００　ｍ　ｌを含む５００　ｍ
　ｌ坂ロフラスコに１％植菌し、同様に３７℃で培養し
、０Ｄ６６゜＝０．３に達した時にイソプロピルβ−Ｄ
−チオガラクトピラノシドを最終濃度０．７ｍＭになる
ように添加し、更に２４時間培養を続けた。大腸菌を遠
心分離により集め、ＩＸＰＢＳ　（ＮａＣ１００８％、
ＫＣｆｆｉ　　Ｏ，０２％、　Ｋ　ＨａＰ　Ｏａｏ、０
２％、Ｎａ２ＨＰ０．　０．１１５％）で洗浄後、再び
］、　Ｏｍ　ｌのＩＸＰＢＳに懸濁し、超音波で大腸菌
を破砕した。次いで、通常の蛋白質精製法により、ｒ　
Ｔ　Ｎ　Ｆ　−Ｓ　−Ａ　Ｍ　１により発現されたポリ
ペプチドを分離、精製した。このポリペプチド（以下、
ＡＭＩと称す）のアミノ酸配列は次の通りであり、その
分子量はｌ　７５００±５００　（ＳＤＳポリアクリル
アミド電気泳動法）であった。

Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｓｅｔ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ＝Ａｒｇ−Ｔ
ｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ　−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖ
ａｌ−Ａｌａ−Ｈｉｓ　　−Ｖａ　Ｉ−Ｖａ　Ｉ−（Ｔ
ＮＦ−ａの第４エクソンの塩基配列の先頭にグアニンを
連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配列） ヱ土亘２ 実施例中の第１表に示された合成りＮＡの先頭から５番
目のアミノ酸である５ｅｒｔｉ：ＣｙＳに代え、実施例
中の９）〜１３）と同じ手順で得られたｒＤＮＡ（以下
、ｒＴＮＦ−５−ＡＭ２と称す）を有する大腸菌ＪＭ１
０３を、参考例１と同様に処理して、ｒＴＮＦ−５−Ａ
Ｍ２により発現されたポリペプチドを分離、精製した。

このポリペプチド（以下、ＡＭ２と称す）のアミノ酸配
列は次の通りであり、その分子量は１７５００±５００
（ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法）であった。

Ｖａｌ−Ａｒｇ−５ｅｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ　−Ａｒｇ−
Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−５ｅｔ−Ａｒｇ　−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−
Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｈｉｓ　　−Ｖａ　１−Ｖａ　ｌ　−
（ＴＮＦ−ａの第４エクソンの塩基配列の先頭にグアニ
ンを連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配列） １１且工　　　　　　゛・　　　　　゛１０週齢のＢＡ
ＬＢ／ｃ雄マウスの腹部皮肉に、同系腫瘍である繊維芽
肉腫メスＡ！胞を２×１０’ｌＩｌ移植した。７日後、
平均腫瘍径が５〜６ｍｍに達したマウスに、生理的食塩
水（対照）、実施例で得られた本発明のポリペプチド（
Ｌ９２９！Ｉ胞に対する活性単位として１００００単位
）又は、参考例２で生成されたＡＭ２　（Ｌ９２！１１
１１胞に対する活性単位としてｔｏｏｏｏ単位）を尾静
脈より投与した。この投与は合計３回（腫瘍移植後７．
１０．１３３日目行った。

腫瘍移植後７日目、１００日目１３３日目１７７日目２
１１日目腫瘍の短径と長径を１Ｊ１１定し、その相乗平
均を腫瘍径として記録した。結果（各群３匹の平均）を
第４図に示す。

第４図に示されるように、本発明のポリペプチドは対照
に対し、危険率５％以下で有意差があるが、ＡＭ２では
、対照に対して有意差は認められなかった。

ヱｌ且ユ　　　　　　　　　−　。

７週齢のＣ３Ｈ／Ｈｅ雄マウスに、ブライマーとしての
、実施例で得られた本発明のポリペプチド又は参考例１
で得られたＡＭＩをそれぞれ、Ｌ９２９ｍ胞に対する活
性単位として１単位又は１００００単位を尾静脈より投
与した。対照群には生理的食塩水を投与した。

その３時間後に、トリガーとしてのビシバニール（登録
商標、中外製薬株式会社製）を３ＫＥ［クリニッシェ　
アインハイト（ＫｌｉｎｉｓｃｈｅＥ　ｉ　ｎｈｅ　ｉ
　ｔ　）系単位であり、ＩＫＥは、０．１ｍｇの乾燥細
菌を含む製剤量に当たるコ尾静脈から投与した。その２
時間後に５！頚部動脈から採血し、血清を分離して、そ
のＴＮＦ活性を、Ｌ９２９．ｍ胞に対する活性単位とし
て測定した。結果（各群３匹、ＡＭＩ投与群は４匹の平
均）を第５図に示す。

第５ｖ！！Ｊに示されるように、本発明のポリペプチド
は１単位で約２０倍の内因性ＴＮＦ産生増強効果を示し
たが、ＡＭＩにはかかる効果はほとんどなかった。１０
０００単位では、共に、７０〜１５０倍という高い増強
効果を示した。

見１亘 実施例で得られた蛋白を凍結乾燥後、終濃度０．５〜２
ｍｇ／ｍ１４．３７℃、７０％ギ酸中て２４時間反応さ
せて、下記条件のＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動に
より、生成された蛋白を検出した。

分離ゲル：１５％アクリルアミド＋０．４％ビスアクリ
ルアミド十０．３７５Ｍ）リス −ＨＣＲ（ｐＨ８，８）＋０．１％ ＳＤＳ＋０．０８％ＴＥＭＥＤ　（Ｎ。

Ｎ、Ｎ、Ｎ−テトラメチレンエチレン ジアミン＋０．０８％過硫酸アンモニ ウム 濃縮ゲル：５％アクリルアミド十０．１３％ビスアクリ
ルアミド十０．１２５Ｍ）リス −ＨＣタ　（ｐＨ８，８）＋０．　１　％ＳＤＳ＋０．
　２　％Ｔ　　ＥＭＥ　　Ｄ　　＋０．０７５％過硫酸
アンモニウム 泳動バッファー：０．０２５Ｍ）リス−ＨＣ１＋０．１
９２Ｍグリシン＋ ０．１％ＳＤＳ　（ｐＨ約８．３） 泳動条件：２０ｍＡ定電流で約４．５〜５時間染色・脱
色：泳動終了後、ゲルを２０％トリクロロ酢酸で、室温
、３０分の条件で固 定し、コーマジー　ブリリアント ブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ’ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　ｂ
ｌｕｅ）Ｒ−２５０のエタノールφ酢酸φ水 （９：　２　：　９）混液中０．２５％溶液で蛋白のバ
ンドを染色する。

脱色は、エタノール・酢酸・水 （２５：　８　：　６５）混液て行う。

その結果、分子量約１７０００と、分子量約５０００の
ところにバンドが検出された。

これらのバンドはそれぞれ、ＴＮＦに対する抗体、ＴＨ
Ｐ４に対する抗体と結合することが確認された。

［発明の効果］ 本発明により、ｗＩ規な抗腫瘍性ポリペプチドをコード
する新規ＤＮＡが提供される。この抗ＩＩ！　Ｊ’Ｉ性
は、Ｌ−９２９細胞及び繊維芽肉腫メスＡｍ胞に対する
細胞毒性により確認されている。更に、この新規ポリペ
プチドは、高い内因性ＴＮＦ産生誘導活性を持っている
。

又、本発明の新規ポリペプチドをギ酸、酢酸等の適当な
酸で処理すると、ＴＨＰ４と抗１１瘍性ポリペプチドと
を得られる。本発明のＤＮＡは大腸菌等に組み込むこと
により大量生産できるので、従来、大量生産が不可能で
あったＴＨＰ４の大１生産が初めて可能になった。

又、本発明のＤＮＡがコードするアミノ＃配列において
、（ＴＮＦ−αの第４エクソンの塩基配列の先頭にグア
ニンを連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配列）
の先頭のアミノ酸であるアラニン（Ａｌａ）の塩基配列
がＧＣＧである場合には、制限酵素Ｎｒ　ｕ　Ｉ　（Ｔ
ＣＧＣＧＡ）の作用により、ＴＮＦ−αの第４エクソン
の塩基配列と同一の塩基配列の前で塩基配列を切断し、
任意の塩基配列を導入できるという利点がある。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＴＨＰ−１細胞から精製された抗腫瘍性ポリ
ペプチドのゲノム遺伝子のＸｈｏ　Ｉ／Ｐｓｔｌ断片の
塩基配列を示す。 第２図は、実施例で得られた本発明のポリペプチドを含
む遠心分離の上清を第１回のファルマシア社製のモノＱ
ＦＰＬＣカラムクロマトグラフィーに付した際の溶出パ
ターンを示す。 第３図は、第２図に示された溶出パターンを参考にして
集められた活性画分を第２回のファルマシア社製のモノ
ＱＦＰＬＣカラムクロマトグラフィーに付した際の溶出
パターンを示す。 第４図は、実施例で得られた本発明のポリペプチドの、
繊維芽肉腫メスＡｌｌ１胞に対する抗腫瘍効果を示すグ
ラフである。 第５図は、実施例で得られた本発明のポリペプチドの、
内因性ＴＮＦ産生増強効果を示すグラフである。 第２．３図において、横軸に沿った連続番号はそれぞれ
の両分を表し、曲線は蛋白の溶出量を表し、柱状グラフ
は、Ｌ９２９ｍ胞に対するＴＮＦ活性（単位）を表し、
直線は溶出液の塩１度（０゜０１Ｍ−ＩＭ）を表してい
る。 第４図において、Ｏは対照群の、△は本発明には含まれ
ないポリペプチドＡＭ２の、口は本発明のポリペプチド
のデータを示している。 特許出願人　抽　源一部　　（ばか１名）０＋＋、ｉ　
、ｅ　ｔｔｉ　ａアうＦ３３第　　５　　図 Ｉｎ　　　　　　　　　　　　　　　　ＸＸＬ手続補正
書（方式） 昭和６３年７月２７日 １、事件の表示 昭和６３年特許願第０８１６８３号 ２、発明の名称 新規ＤＮＡとその生産方法、それを有する新規プラスミ
ド、新規ポリペプチドとその生産方法、及び該ポリペプ
チドからなる新規抗腫瘍剤 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　〒１５８ 東京都世田谷区東玉川１−１０−２１ 昭和６３年６月２８日 ５、補正の対象 第４１！１

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記アミノ酸配列をコードするＤＮＡ。 （サイモシンβ＿４のアミノ酸配列）−Ａｓｐ−Ｐｒｏ
   −ｘ−（ＴＮＦ−αの第４エクソンの塩基配列の先頭に
   グアニンを連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配
   列） （式中、ｘは存在しないか、次のアミノ酸配列のいずれ
   かを表す。 １）【遺伝子配列があります】； ２）【遺伝子配列があります】； ３）【遺伝子配列があります】； ４）【遺伝子配列があります】； ５）【遺伝子配列があります】。）
2. （２）下記アミノ酸配列をコードするＤＮＡの生産方法
   において、 （サイモシンβ＿４のアミノ酸配列）−Ａｓｐ−Ｐｒｏ
   −ｘ−（ＴＮＦ−αの第４エクソンの塩基配列の先頭に
   グアニンを連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配
   列） （式中、ｘは存在しないか、次のアミノ酸配列のいずれ
   かである。 １）【遺伝子配列があります】； ２）【遺伝子配列があります】； ３）【遺伝子配列があります】； ４）【遺伝子配列があります】； ５）【遺伝子配列があります】。）、 （サイモシンβ＿４のアミノ酸配列）−Ａｓｐ−Ｐｒｏ
   をコードするＤＮＡと、ｘ−（ＴＮＦ−αの第４エクソ
   ンの塩基配列の先頭にグアニンを連結した形の塩基配列
   に対応するアミノ酸配列）をコードするＤＮＡとを連結
   させる工程； （サイモシンβ＿４のアミノ酸配列）をコードするＤＮ
   Ａと、Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ｘ−（ＴＮＦ−αの第４エクソ
   ンの塩基配列の先頭にグアニンを連結した形の塩基配列
   に対応するアミノ酸配列）をコードするＤＮＡとを連結
   させる工程； （サイモシンβ＿４のアミノ酸配列）をコードするＤＮ
   Ａと、Ａｓｐ−ＰｒｏをコードするＤＮＡと、ｘ−（Ｔ
   ＮＦ−αの第４エクソンの塩基配列の先頭にグアニンを
   連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配列）をコー
   ドするＤＮＡとをその順位で同時に連結させる工程；の
   いずれかを含む方法。
3. （３）下記アミノ酸配列をコードするＤＮＡを含有する
   プラスミド。 （サイモシンβ＿４のアミノ酸配列）−Ａｓｐ−Ｐｒｏ
   −ｘ−（ＴＮＦ−αの第４エクソンの塩基配列の先頭に
   グアニンを連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配
   列） （式中、ｘは存在しないか、次のアミノ酸配列のいずれ
   かを表す。 １）【遺伝子配列があります】； ２）【遺伝子配列があります】； ３）【遺伝子配列があります】； ４）【遺伝子配列があります】； ５）【遺伝子配列があります】。）
4. （４）下記アミノ酸配列で表されるポリペプチド。 （サイモシンβ＿４のアミノ酸配列）−Ａｓｐ−Ｐｒｏ
   −ｘ−（ＴＮＦ−αの第４エクソンの塩基配列の先頭に
   グアニンを連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配
   列） （式中、ｘは存在しないか、次のアミノ酸配列のいずれ
   かを表す。 １）【遺伝子配列があります】； ２）【遺伝子配列があります】； ３）【遺伝子配列があります】； ４）【遺伝子配列があります】； ５）【遺伝子配列があります】。）
5. （５）宿主微生物細胞内で増殖しうるプラスミドに挿入
   されている、下記アミノ酸配列をコードするＤＮＡを有
   する宿主微生物を培養することを特徴とする、下記アミ
   ノ酸配列で表されるポリペプチドの生産方法。 （サイモシンβ＿４のアミノ酸配列）−Ａｓｐ−Ｐｒｏ
   −ｘ−（ＴＮＦ−αの第４エクソンの塩基配列の先頭に
   グアニンを連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配
   列） （式中、ｘは存在しないか、次のアミノ酸配列のいずれ
   かを表す。 １）【遺伝子配列があります】； ２）【遺伝子配列があります】； ３）【遺伝子配列があります】； ４）【遺伝子配列があります】； ５）【遺伝子配列があります】。）
6. （６）下記アミノ酸配列で表されるポリペプチドからな
   る抗腫瘍剤。 （サイモシンβ＿４のアミノ酸配列）−Ａｓｐ−Ｐｒｏ
   −ｘ−（ＴＮＦ−αの第４エクソンの塩基配列の先頭に
   グアニンを連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配
   列） （式中、ｘは存在しないか、次のアミノ酸配列のいずれ
   かを表す。 １）【遺伝子配列があります】； ２）【遺伝子配列があります】； ３）【遺伝子配列があります】； ４）【遺伝子配列があります】； ５）【遺伝子配列があります】。）