CN105203657B - 酸枣仁对照提取物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种酸枣仁对照提取物及其制备方法和应用，属于中药质量控制技术领域。该酸枣仁对照提取物的制备方法包括以下步骤：粉碎；脱脂；提取；大孔树脂纯化；硅胶纯化；最终得酸枣仁对照提取物。采用特定的方法对酸枣仁药材进行脱脂，提取和纯化，最终得到具有特定成分的酸枣仁对照提取物，该对照提取物中不仅含有酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B等皂苷类成分，还含有斯皮诺素和6”’‑阿魏酰斯皮诺素等黄酮类成分。将该酸枣仁对照提取物作为对照用于酸枣仁及含酸枣仁药味中药制剂的质量控制中，具有反馈成分信息全面的优点，并且，使用该酸枣仁对照提取物时，无需进行繁琐的前处理步骤，可以直接溶解后检测，具有操作简便、检测成本低的优点。
Description
技术领域
本发明涉及中药质量控制技术领域，特别是涉及一种酸枣仁对照提取物及其制备方法和应用。
背景技术
酸枣仁，别名酸枣核、山枣仁。是鼠李科植物酸枣的干燥成熟种子。于秋末冬初采收成熟果实，除去果肉及核壳，收集种子，晒干而成。其生于向阳山坡、路旁，主要产于河南、河北、陕西、辽宁、山西、山东、云南等地。秋季果实成熟时采收，去果肉及硬核，取种子，生用或微炒用。
酸枣仁作为一种中药材，收载于中国药典中。中国药典分别对酸枣仁药材的皂苷类和黄酮类成分进行薄层色谱鉴别：其中，皂苷类成分的薄层鉴别方法为：取本品粉末1g，加甲醇30ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，作为供试品溶液。另取酸枣仁皂苷A、B对照品，分别加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录ⅥB)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以水饱和的正丁醇为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％香草醛硫酸溶液，立即检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。黄酮类成分的薄层鉴别方法为：取本品粉末1g，加石油醚(60～90℃)30ml，加热回流2小时，滤过，弃去石油醚液，药渣挥干，加甲醇30ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取酸枣仁对照药材1g，同法制成对照药材溶液。再取斯皮诺素对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录ⅥB)试验，吸取上述三种溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以水饱和的正丁醇为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％香草醛硫酸溶液，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝色荧光斑点。
但是，在该鉴别方法中，采用酸枣仁皂苷A、B对照品及斯皮诺素对照品、酸枣仁对照药材为对照，分别鉴别酸枣仁中皂苷类和黄酮类成分，这样的方法既提高了检测成本，操作又较为繁琐。
对于酸枣仁药材中有效成分的质量控制，中国药典采用高效液相色谱法分别对皂苷类和黄酮类成分进行了含量测定。但是，在该含量测定方法中，仍沿用常规的中药质量控制模式，即以酸枣仁皂苷A、B或斯皮诺素对照品等作为对照，对酸枣仁进行质量评价分析，这种模式评价指标相对单一，过分依赖中药化学对照品，不环保，检测成本高。
发明内容
基于此，有必要针对上述问题，制备一种酸枣仁对照提取物，并将其作为对照物应用于酸枣仁及含酸枣仁的中药制剂的质量控制中，具有反馈成分信息全面，且操作简便、检测成本低的优点。
一种酸枣仁对照提取物的制备方法，包括以下步骤：
粉碎：取酸枣仁药材，粉碎，得酸枣仁粗粉；
脱脂：取上述酸枣仁粗粉，置于超临界CO2萃取装置的萃取釜中，以超临界CO2萃取去除酸枣仁粗粉中的脂类成分，得药渣；
提取：取上述药渣，按照每克酸枣仁药材6ml-10ml的量加入体积百分浓度为40％-80％乙醇水溶液，加热回流1-4小时，过滤，得滤液；
大孔树脂纯化：将上述滤液浓缩后上样加至大孔吸附树脂柱上，以7-11个柱体积的体积百分浓度为0-10％的乙醇水溶液洗脱，弃去，再以3-5个柱体积的体积百分浓度为50％-70％的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，得酸枣仁对照提取物粗品；
硅胶纯化：取上述酸枣仁对照提取物粗品，以体积百分浓度为50％-70％的乙醇水溶液溶解，加入适量硅胶拌样，蒸干溶剂后上样至硅胶柱，先以20-30个柱体积的乙酸乙酯洗脱，弃去，再以40-60个柱体积的体积比为70:30-50:50的乙酸乙酯-甲醇洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，得酸枣仁对照提取物。
上述酸枣仁对照提取物的制备方法，首先将酸枣仁以超临界CO2萃取，去除其中的脂类成分，然后以50％-70％乙醇水溶液进行提取，再依次以大孔树脂和硅胶进行纯化，去除冗杂成分，最后得到具有特定成分的酸枣仁对照提取物。该提取物中不仅含有酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B等皂苷类成分，还含有斯皮诺素和6”’-阿魏酰斯皮诺素等黄酮类成分。因此，将该制备方法得到的酸枣仁对照提取物作为对照用于酸枣仁及含酸枣仁药味中药制剂的质量控制中，具有反馈成分信息全面的优点，并且，将该酸枣仁对照提取物作为对照使用，无需进行繁琐的前处理步骤，可以直接溶解后检测，具有操作简便、检测成本低的优点。
在其中一个实施例中，所述脱脂步骤中，采用以下条件进行超临界CO2萃取：萃取釜温度为40-60℃，压力为25-35Mpa，第一分离釜温度为40-50℃，压力为5.5-6.5Mpa，第二分离釜温度为30-40℃，压力为4-5Mpa，CO2流量为25-35L/小时，萃取2-4小时。采用上述条件，能够较好的脱去酸枣仁中的脂类杂质。并且，采用超临界CO2萃取的方式进行脱脂，与常规石油醚脱脂相比，安全性好，利于大生产中的应用，不需要在防爆车间中操作，极大的提高了其大生产的可操作性。
在其中一个实施例中，所述大孔树脂纯化的具体步骤为：将上述滤液浓缩后上样加至大孔吸附树脂柱上，以4-6个柱体积的水洗脱，弃去，再以3-5个柱体积的体积百分浓度为10％的乙醇水溶液洗脱，弃去，再以3-5个柱体积的体积百分浓度为50％-70％的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，得酸枣仁对照提取物粗品。采用上述条件，具有较好的大孔树脂纯化效果。
在其中一个实施例中，所述大孔树脂纯化的具体步骤为：将上述滤液浓缩后上样加至D101型大孔吸附树脂柱上，以5个柱体积的水洗脱，弃去，再以4个柱体积的体积百分浓度为10％的乙醇水溶液洗脱，弃去，再以4个柱体积的体积百分浓度为60％的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，回收溶剂至干，60℃减压干燥12小时，研成细粉，得酸枣仁对照提取物粗品。采用上述条件，具有最佳的大孔树脂纯化效果。
在其中一个实施例中，所述硅胶纯化步骤中，所述硅胶柱中填充的为粒径为300目的正相硅胶，洗脱过程具体为：先以25个柱体积的乙酸乙酯洗脱，弃去，再以17个柱体积的体积比为70:30的乙酸乙酯-甲醇洗脱，收集洗脱液，最后以33个柱体积的体积比为50:50的乙酸乙酯-甲醇洗脱，收集洗脱液，合并两次收集得到的洗脱液，回收溶剂，得酸枣仁对照提取物。所述硅胶柱可选用商品硅胶柱Grace Reveleris silica cartridges(column size12g)。采用上述条件，具有最佳的硅胶纯化效果。
在其中一个实施例中，所述硅胶纯化步骤中，将加入适量硅胶拌样并蒸干溶剂后的样品均匀填充至胶管中，将该胶管与低压制备液相相连，以该低压制备液相进行洗脱。以低压制备液相进行纯化，洗脱，具有操作方便，洗脱效果好的优点。
在其中一个实施例中，所述提取的具体步骤为：按照每克酸枣仁药材8ml的量加入体积百分浓度为60％乙醇水溶液，加热回流2次，每次1小时，过滤，合并滤液。采用分次回流提取的方法，具有更好的提取效率。
本发明还公开了一种酸枣仁对照提取物，通过上述的酸枣仁对照提取物的制备方法制备得到。
上述酸枣仁对照提取物，其中不仅含有酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B等皂苷类成分，还含有斯皮诺素和6”’-阿魏酰斯皮诺素等黄酮类成分。因此，将该制备方法得到的酸枣仁对照提取物作为对照用于酸枣仁及含酸枣仁药味中药制剂的质量控制中，具有反馈成分信息全面的优点，并且，将该酸枣仁对照提取物作为对照使用，无需进行繁琐的前处理步骤，可以直接溶解后检测，还具有操作简便、检测成本低的优点。
本发明还公开了一种酸枣仁对照提取物的应用，将上述的酸枣仁对照提取物用于酸枣仁及含酸枣仁的中药制剂的质量控制中。
将上述的酸枣仁对照提取物用于酸枣仁及含酸枣仁药味中药制剂的质量控制中，具有反馈成分信息全面的优点，并且，将该酸枣仁对照提取物作为对照使用，无需进行繁琐的前处理步骤，可以直接溶解后检测，还具有操作简便、检测成本低的优点。
在其中一个实施例中，所述酸枣仁及含酸枣仁的中药制剂的质量控制方法为：将所述酸枣仁对照提取物、待测样品以薄层色谱法和/或高效液相色谱法进行检测，对比判别；
所述薄层色谱法的检测条件为：
薄层板：硅胶薄层板；
展开剂：水饱和正丁醇；
显色剂及检视：以香草醛硫酸溶液为显色剂检视，和/或置于日光灯下检视，和/或置于365nm的紫外灯下检视；
所述高效液相色谱法包括黄酮类检测和皂苷类检测；
黄酮类检测条件为：
固定相：C18色谱柱；
柱温：20-30℃；
流动相：A相为乙腈，B相为水，按照以下梯度洗脱程序进行：
流速：1.0ml/min；
检测器：二极管阵列检测器；
皂苷类检测条件为：
固定相：C18色谱柱；
柱温：30-40℃；
流动相：A相为乙腈，B相为水，按照以下梯度洗脱程序进行：
流速：1.0ml/min；
检测器：蒸发光散射检测器。
采用以上方法能够很好地在薄层色谱及液相色谱中分离酸枣仁中的多种成分，较好的分离度将有利于后续的分析判别。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的一种酸枣仁对照提取物的制备方法，采用特定的方法对酸枣仁药材进行脱脂，提取和纯化，最终得到具有特定成分的酸枣仁对照提取物，该提取物中不仅含有酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B等皂苷类成分，还含有斯皮诺素和6”’-阿魏酰斯皮诺素等黄酮类成分。因此，将该制备方法得到的酸枣仁对照提取物作为对照用于酸枣仁及含酸枣仁药味中药制剂的质量控制中，具有反馈成分信息全面的优点，并且，将该酸枣仁提取物作为对照使用，无需进行繁琐的前处理步骤，可以直接溶解后检测，具有操作简便、检测成本低的优点。
本发明的一种酸枣仁对照提取物的应用，将上述的酸枣仁对照提取物用于酸枣仁及含酸枣仁药味中药制剂的质量控制中，除具有上述优点外，还对分析方法进行了优化，采用该分析方法，能够很好地在薄层色谱及液相色谱中分离酸枣仁中的多种成分，较好的分离度将有利于后续的分析判别。
并且，从酸枣仁对照提取物的应用中看出，酸枣仁对照提取物可以应用于枣仁安神胶囊、枣仁安神液和酸枣仁配方颗粒的定性定量分析，结果准确可靠，其整体评价效果与对照品、对照药材相当，甚至优于单用对照品作为对照的评价方法。另外，酸枣仁对照提取物的使用方法与对照品类似，称重后直接溶解即可，尤其在多成分含量测定时，对照提取物溶液的配制比对照品溶液的配制更加简便。因此，对照提取物评价模式具有可行性和一定的优势，值得推广应用。
附图说明
图1为实施例1中酸枣仁对照提取物制备方法工艺流程图；
图2为实施例1中酸枣仁对照提取物的黄酮类化合物的HPLC图谱；
图3为实施例1中酸枣仁对照提取物的皂苷类化合物的HPLC图谱；
图4为实施例1中日光下检视薄层色谱图；
图5为实施例1中UV365nm下检视薄层色谱图；
图6为实施例2中枣仁安神胶囊和枣仁安神液日光下检视的薄层色谱图；
图7为实施例2中枣仁安神胶囊和枣仁安神液UV365nm下检视的薄层色谱图；
图8为实施例3中酸枣仁配方颗粒日光下检视的薄层色谱图；
图9为实施例3中酸枣仁配方颗粒UV365nm下检视的薄层色谱图；
图10-图11为实施例3中酸枣仁配方颗粒和酸枣仁对照提取物的HPLC图谱；
图12为实施例3中酸枣仁对照提取物色谱图与酸枣仁配方颗粒色谱图20～105分钟区间的相似度示意图；
图13为对比例中不同酸枣仁对照提取物日光下检视的薄层色谱图；
图14为对比例中不同酸枣仁对照提取物UV365nm下检视的薄层色谱图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
以下实施例中使用到的仪器和试剂如下：
一、仪器：
超临界CO2萃取装置(江苏南通华安超临界萃取有限公司，型号：HA221-50-06)
二、试剂：
酸枣仁对照药材(中检院：121517-201103)；
斯皮诺素对照品(中检院：111869-201102)；
6”’-阿魏酰斯皮诺素对照品(上海同田生物技术股份有限公司：13111922)；
酸枣仁皂苷A对照品(中检院：110734-200611)；
酸枣仁皂苷B对照品(中检院：110814-200607)；
枣仁安神胶囊(市售，批号：130202)；
枣仁安神液(市售，批号：3260034、3260036)；
酸枣仁配方颗粒(市售，批号：503396T，404236L，402017L)。
实施例1
一种酸枣仁对照提取物，通过以下方法制备得到，其工艺流程如图1所示，具体如下：
1、粉碎。
取酸枣仁药材，粉碎，得酸枣仁粗粉。
2、脱脂。
取上述酸枣仁粗粉1kg，置于超临界CO2萃取装置的萃取釜中，按以下条件进行萃取：萃取釜温度为50℃，压力为30Mpa，第一分离釜温度为45℃，压力为6.0Mpa，第二分离釜温度为35℃，压力为4.5Mpa，CO2流量为30L/小时，萃取3小时。
萃取去除酸枣仁粗粉中的脂类成分后，得到药渣。
3、提取。
取上述药渣，按照每克酸枣仁药材8ml的量加入体积百分浓度为60％乙醇水溶液，加热回流2次，每次1小时，趁热过滤，得滤液，滤液呈橙红色。
4、大孔树脂纯化。
(1)浓缩：滤液回收乙醇至约2000ml(浓缩过程中会产生沉淀物，保留)。
(2)吸附：取以上浓缩液上清液250ml(沉淀物用适量的水溶解后，同法上样)上D101型大孔吸附树脂柱(柱内径4cm，高20cm)。
(3)洗脱：先以1200ml(4.78个柱体积)的水洗脱，弃去，再以1000ml(3.98个柱体积)的体积百分浓度为10％的乙醇水溶液洗脱，弃去，再以1000ml(3.98个柱体积)的体积百分浓度为60％的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液。
(4)浓缩干燥：将上述洗脱液回收溶剂至干，60℃减压干燥12小时，研成细粉，得酸枣仁对照提取物粗品。
5、硅胶纯化。
(1)上样：取上述酸枣仁粗品细粉2.0g，加适量60％乙醇溶解，加硅胶(60～100目)10g拌样，水浴上蒸干溶剂，均匀填充至空白胶管中，置低压制备液相上，连接预制硅胶柱(约300目，12g，内径2.5cm)。
(2)设定洗脱方法为：流速为30ml/min；先采用乙酸乙酯洗脱15min(约25个柱体积)，然后采用乙酸乙酯∶甲醇(70∶30)洗脱10min(约17个柱体积)，最后采用乙酸乙酯∶甲醇(50∶50)洗脱20min(约33个柱体积)，收集并合并乙酸乙酯∶甲醇(70∶30)洗脱液和乙酸乙酯∶甲醇(50∶50)洗脱液。
(3)浓缩干燥：回收洗脱液溶剂至干，60℃减压干燥2小时，即得酸枣仁对照提取物。
按照上述方法，制备了10个批次的酸枣仁对照提取物，以高效液相色谱法进行检测。
一、供试品制备。
1、酸枣仁对照提取物溶液的制备。
取实施例1中1-10批次的酸枣仁对照提取物10mg，以10ml甲醇溶解，即得。
2、对照品溶液的制备。
取斯皮诺素对照品和6"'-阿魏酰斯皮诺素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含斯皮诺素0.2mg、6"'-阿魏酰斯皮诺素0.1mg的混合溶液，即得。
取酸枣仁皂苷A对照品和酸枣仁皂苷B对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含酸枣仁皂苷A 50μg、酸枣仁皂苷B 30μg的混合溶液，即得。
二、检测。
1、黄酮类化合物的测定。
测定条件如下：
固定相：YMC Hydrosphere-C18色谱柱(250×4.6mm，5μm)；
柱温：20℃；
流动相：A相为乙腈，B相为水，按照以下梯度洗脱程序进行：
表1.梯度洗脱程序
流速：1.0ml/min；
检测器：二极管阵列检测器；
检测波长：335nm。
2、皂苷类化合物的测定。
测定条件如下：
固定相：Waters X-bridge C18色谱柱(250×4.6mm，5μm)；
柱温：35℃；
流动相：A相为乙腈，B相为水，按照以下梯度洗脱程序进行：
表2.梯度洗脱程序
流速：1.0ml/min；
检测器：蒸发光散射检测器。
三、结果。
得到如图2-3所示的酸枣仁对照提取物HPLC图谱，其中，图2为黄酮类化合物的HPLC图谱，标号为A的色谱峰为斯皮诺素(tR＝31.351min)；标号为B的色谱峰为6”’-阿魏酰斯皮诺素(tR＝67.348min)；图3为皂苷类化合物的HPLC图谱，标号为C的色谱峰为酸枣仁皂苷A(tR＝18.437min)；标号为D的色谱峰为酸枣仁皂苷B(tR＝22.161min)。
并以斯皮诺素、6”’-阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B对照品计算这几种成分的含量(以干燥品计算，含量以wt％计)，结果如下表所示。
表3.不同批次中各化学成分的含量及总量(％)
从上述结果中可以看出，采用本实施例的方法制备得到的酸枣仁对照提取物，具有较高含量的斯皮诺素、6”’-阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B，且不同批次之间的酸枣仁对照提取物中各成分含量相对稳定。
再将上述10个批次的酸枣仁对照提取物，以薄层色谱法进行检测。
一、供试品制备。
1、酸枣仁对照提取物溶液的制备：取实施例1中1-10批次的酸枣仁对照提取物10mg，以1ml甲醇溶解，即得。
2、对照品溶液的制备：再取斯皮诺素对照品、6”’-阿魏酰斯皮诺素对照品、酸枣仁皂苷A对照品和酸枣仁皂苷B对照品，分别加甲醇制成每1ml各含1mg的溶液，作为对照品溶液。
3、酸枣仁对照药材溶液的制备：取酸枣仁对照药材1g，加石油醚(60～90℃)30ml，加热回流2小时，滤过，滤渣挥干，加甲醇30ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液。
4、酸枣仁药材溶液的制备同酸枣仁对照药材溶液。
二、检测。
测定条件如下：
薄层板：硅胶薄层板(Merck硅胶60预制板)；
展开剂：水饱和正丁醇；
显色剂及检视：晾干后喷以1％香草醛硫酸溶液，80℃加热2分钟，分别置日光及紫外光灯(365nm)下检视。
三、结果。
结果如图4-图5所示，其中：图4为日光下检视薄层色谱图，图5为UV365nm下检视薄层色谱图(t：21℃，RH：30％)。标号1-9为上述批号1-9的酸枣仁对照提取物，标号10-11为酸枣仁药材，标号12为酸枣仁对照药材，标号13为斯皮诺素对照品，标号14为6”’阿魏酰斯皮诺素对照品，标号15为酸枣仁皂苷A对照品，标号16为酸枣仁皂苷B对照品。
从酸枣仁对照提取物薄层色谱图中可以看出：酸枣仁对照提取物的薄层色谱图与酸枣仁药材图谱、酸枣仁对照药材图谱斑点对应性好，图谱信息量丰富。
实施例2
将上述实施例1制备得到的酸枣仁对照提取物用于枣仁安神胶囊、枣仁安神液的鉴别和含量测定中。
一、薄层鉴别。
1、供试品制备。
(1)枣仁安神胶囊、枣仁安神液供试品溶液的制备。
枣仁安神胶囊：取本品内容物4g，加***50ml，加热回流30分钟，滤过，药渣挥干溶剂，加甲醇50ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次25ml，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次10ml，取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。
枣仁安神液：取本品20ml，通过D101型大孔吸附树脂(柱内径为1.5cm，柱高为10cm)，用水洗脱至无色，弃去洗脱液，再用70％甲醇、甲醇各30ml依次洗脱，收集洗脱液，合并，蒸干，残渣加水20ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次25ml，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次10ml，取正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。
(2)酸枣仁对照提取物溶液的制备同实施例1。
(3)对照品溶液的制备同实施例1。
(4)酸枣仁药材和对照药材溶液的制备同实施例1。
2、检测。
测定条件同实施例1。
3、结果。
结果如图6-图7所示，其中：图6为日光下检视薄层色谱图，图7为UV365nm下检视薄层色谱图。标号1为枣仁安神胶囊(130202)，标号2为枣仁安神液(3260034)，标号3为枣仁安神液(3260036)，标号4-9为上述批号1-6的酸枣仁对照提取物，标号10-11为酸枣仁药材，标号12为酸枣仁对照药材，标号13为斯皮诺素对照品，标号14为6”’-阿魏酰斯皮诺素对照品，标号15为酸枣仁皂苷A对照品，标号16为酸枣仁皂苷B对照品。
从上述薄层色谱图中可以看出：将酸枣仁对照提取物应用于枣仁安神胶囊、枣仁安神液的薄层鉴别中，结果显示酸枣仁对照提取物图谱与枣仁安神胶囊、枣仁安神液图谱显相同颜色的荧光斑点。酸枣仁对照提取物鉴别效果与酸枣仁对照药材类似，优于单用对照品鉴别的效果。
二、高效液相色谱含量测定。
1、供试品制备。
(1)枣仁安神胶囊、枣仁安神液供试品溶液的制备。
枣仁安神胶囊：取装量差异项下的本品内容物，混匀，研细，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率380W，频率37kHz)30分钟(必要时需摇散药粉)，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
枣仁安神液：精密量取本品3ml，置10ml量瓶中，加80％甲醇至刻度，剧烈振摇，滤过，取续滤液，即得。
(2)酸枣仁对照提取物溶液的制备。
精密称取酸枣仁对照提取物约4mg，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
(3)对照品溶液的制备。
取斯皮诺素对照品和6"'-阿魏酰斯皮诺素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含斯皮诺素0.2mg、6"'-阿魏酰斯皮诺素0.1mg的混合溶液，即得。
2、检测。
以高效液相色谱法进行检测。
3、结果。
分别以对照品和酸枣仁对照提取物中的斯皮诺素和6”’-阿魏酰斯皮诺素峰面积计算枣仁安神胶囊、枣仁安神液中斯皮诺素和6”’-阿魏酰斯皮诺素的含量，结果如下表所示。
表4.枣仁安神胶囊、枣仁安神液中各成分的含量结果比较(n＝2)
从上述结果中可以看出，将酸枣仁对照提取物应用于枣仁安神胶囊、枣仁安神液的含量测定项，检测结果显示：对照提取物计算法和对照品计算法的结果差异小。表明酸枣仁对照提取物可以应用于枣仁安神胶囊和枣仁安神液中斯皮诺素和6”’-阿魏酰斯皮诺素的含量测定，结果可靠。
实施例3
酸枣仁配方颗粒为酸枣仁单味药制剂，目前暂无质量标准。本发明参考上述酸枣仁对照提取物已建立的方法，分别采用对照品和对照提取物的评价模式在薄层色谱鉴别、指纹图谱和含量测定三个方面对酸枣仁配方颗粒的质量进行评价，并比较两种评价模式的结果差异。
一、薄层鉴别
1、供试品制备。
(1)酸枣仁配方颗粒供试品溶液的制备。
取本品研细，取约0.3g，加甲醇20ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。
(2)酸枣仁对照提取物溶液的制备同实施例1。
(3)对照品溶液的制备同实施例1。
(4)酸枣仁药材和对照药材溶液的制备同实施例1。
2、检测。
测定条件同实施例1。
3、结果。
结果如图8-图9所示，其中：图8为日光下检视薄层色谱图，图9为UV365nm下检视薄层色谱图(t：21℃，RH：30％)。标号1-3为酸枣仁配方颗粒(503396T，404236L，402017L)，标号4-9为上述批号1-6的酸枣仁对照提取物，标号10-11为酸枣仁药材，标号12为酸枣仁对照药材，标号13为斯皮诺素对照品，标号14为6”’-阿魏酰斯皮诺素对照品，标号15为酸枣仁皂苷A对照品，标号16为酸枣仁皂苷B对照品。
从上述薄层色谱图中可以看出：酸枣仁对照提取物和各对照品均可用于酸枣仁配方颗粒的薄层色谱鉴别，但酸枣仁对照提取物展示的图谱信息量更丰富，鉴别效果类似于酸枣仁对照药材。而且酸枣仁对照提取物溶液的制备方法与对照品溶液的制备方法一致，直接加溶剂溶解即可，简单方便。
二、指纹图谱。
1、供试品制备。
(1)酸枣仁配方颗粒供试品溶液的制备。
取本品适量，研细，取约0.3g，精密称定，置平底烧瓶中，精密加入甲醇20ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(2)酸枣仁对照提取物溶液的制备同实施例1。
2、检测。
测定条件如下：
固定相：YMC Hydrosphere-C18色谱柱(250×4.6mm，5μm)；
柱温：20℃；
流动相：A相为乙腈，B相为0.1g/100ml磷酸溶液，按照以下梯度洗脱程序进行：
表5.梯度洗脱程序
流速：1.0ml/min；
检测器：二极管阵列检测器；
检测波长：204nm。
3、结果。
理论板数按斯皮诺素峰计算应不低于5000，得到图10-11的HPLC图谱，其中，图10中a图为酸枣仁对照提取物的HPLC图谱，图10中b图和图11分别为酸枣仁配方颗粒(503396T，404236L，402017L)HPLC图谱。标号为3的色谱峰为斯皮诺素；标号为4的色谱峰为6”’-阿魏酰斯皮诺素，标号为9的色谱峰为酸枣仁皂苷A；标号为10的色谱峰为酸枣仁皂苷B。
从图10-11中可以看出，酸枣仁对照提取物色谱图中的10个特征色谱峰在酸枣仁配方颗粒供试品色谱图中均存在。另外，由于酸枣仁对照提取物经过纯化处理，与酸枣仁配方颗粒对应的这10个色谱峰主要集中在20～105分钟的区间，故将所得色谱图AIA格式数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价***软件(2012.130723版本)，计算20～105分钟区间酸枣仁对照提取物色谱图与酸枣仁配方颗粒色谱图的相似度(结果见表6和图12)，结果显示两者的相似度均在0.95以上，表明酸枣仁对照提取物与酸枣仁配方颗粒指纹图谱的相关性良好。
表6酸枣仁对照提取物与酸枣仁配方颗粒指纹图谱相似度结果
三、高效液相色谱含量测定。
1、供试品制备。
(1)酸枣仁配方颗粒供试品溶液的制备同上指纹图谱项。
(2)酸枣仁对照提取物溶液的制备同上指纹图谱项。
(3)对照品溶液的制备：
取斯皮诺素对照品和6"'-阿魏酰斯皮诺素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含斯皮诺素0.2mg、6"'-阿魏酰斯皮诺素0.1mg的混合溶液，即得。
取酸枣仁皂苷A对照品和酸枣仁皂苷B对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含酸枣仁皂苷A 50μg、酸枣仁皂苷B 30μg的混合溶液，即得。
2、检测。
(1)、斯皮诺素和6"'-阿魏酰斯皮诺素的测定。
检测波长为335nm，其余同指纹图谱项。分别精密吸取对照品溶液、对照提取物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
(2)、酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B的测定。
按照实施例1中皂苷类化合物的测定方法，分别精密吸取对照品溶液5μl和25μl、对照提取物溶液5μl和25μl以及供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得。
3、结果。
(1)、斯皮诺素和6"'-阿魏酰斯皮诺素的含量。
酸枣仁配方颗粒中各成分的含量如下表所示。
表7酸枣仁配方颗粒中各成分的含量结果比较(n＝2)
由上表可见，分别采用对照品法和对照提取物法计算酸枣仁配方颗粒中斯皮诺素和6”’-阿魏酰斯皮诺素的含量，两种方法的测定结果差异小(相对平均偏差在3.0％以下)，表明酸枣仁对照提取物可以应用于酸枣仁配方颗粒中斯皮诺素和6”’-阿魏酰斯皮诺素的含量测定，结果可靠。
(2)、酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B的含量。
酸枣仁配方颗粒中各成分的含量如下表所示。
表8酸枣仁配方颗粒中各成分的含量结果比较(n＝2)
由上表可见，分别采用对照品法和对照提取物法计算酸枣仁配方颗粒中酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B的含量，两种方法的测定结果差异小(相对平均偏差在3.0％以下)，表明酸枣仁对照提取物可以应用于酸枣仁配方颗粒中酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B的含量测定，结果可靠。
对比例
本对比例的酸枣仁对照提取物，采用以下不同的制备方法制备得到：
酸枣仁对照提取物A，其制备方法与实施例1的制备方法基本相同，不同之处在于该酸枣仁提取物A的制备过程中没有经过脱脂步骤，直接提取后以大孔树脂和硅胶纯化。
酸枣仁对照提取物B，其制备方法与实施例1的制备方法基本相同，不同之处在于该酸枣仁对照提取物B的制备过程中没有经过大孔树脂和硅胶纯化。
酸枣仁对照提取物C，其制备方法与实施例1的制备方法基本相同，不同之处在于该酸枣仁对照提取物C的制备过程中没有脱脂，也没有经过大孔树脂和硅胶纯化。
一、对比性状特性
将本对比例制备得到的酸枣仁对照提取物与实施例1中制备得到的酸枣仁对照提取物进行性状特性比较，结果如下表所示。
表9性状对比
| 样品 | 在甲醇中溶解性 | 引湿性 |
| 实施例1得到的对照提取物 | 全部溶解 | 有引湿性 |
| 酸枣仁对照提取物A | 全部溶解 | 有引湿性 |
| 酸枣仁对照提取物B | 有不溶物 | 极具引湿性 |
| 酸枣仁对照提取物C | 有不溶物 | 极具引湿性 |
从上表中可以看出，酸枣仁对照提取物B和C在甲醇中的溶解性比较差，有不溶物；酸枣仁对照提取物B和C极具引湿性，不易保存。而实施例1得到的酸枣仁对照提取物在甲醇中全部溶解，引湿性也得到改善，易保存。
二、对比薄层色谱。
将本对比例制备得到的酸枣仁对照提取物与实施例1中制备得到的酸枣仁对照提取物以薄层色谱法进行检测，检测方法同上，检测结果如图12-13所示。
其中：图13为日光下检视薄层色谱图，图14为UV365nm下检视薄层色谱图(t：24℃，RH：35％)。标号1-4，10为上述酸枣仁对照提取物C，标号5-9，11-12为上述酸枣仁对照提取物B，标号13为酸枣仁对照药材，标号14为酸枣仁皂苷A对照品，标号15为酸枣仁皂苷B对照品，标号16为斯皮诺素对照品。
从图13-14的薄层色谱图中可以看出：与实施例1图谱(图4-图5)相比，酸枣仁对照提取物B和C薄层图谱中，在靠近溶剂前沿的区域油脂等杂质成分的斑点很多，黄酮类和皂苷类有效成分的斑点清晰度不够，影响薄层色谱的鉴别效果。
三、对比成分含量。
将本对比例制备得到的酸枣仁对照提取物A、B和C与实施例1中制备得到的酸枣仁对照提取物以高效液相色谱法进行检测，检测方法同上，检测结果如下表所示。
表10不同酸枣仁对照提取物中各成分含量(％)
从上表中可以看出，与实施例1得到的酸枣仁对照提取物比较，酸枣仁对照提取物A中所含有的酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B含量及指标性成分的总含量均较低；而酸枣仁对照提取物B和C，各指标性成分的含量及总含量均非常低；而实施例1中各指标性成分的含量及总含量均较高。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种酸枣仁对照提取物的制备方法，包括以下步骤：
粉碎：取酸枣仁药材，粉碎，得酸枣仁粗粉；
脱脂：取上述酸枣仁粗粉，置于超临界CO2萃取装置的萃取釜中，以超临界CO2萃取去除酸枣仁粗粉中的脂类成分，得药渣；
提取：取上述药渣，按照每克酸枣仁药材6ml-10ml的量加入体积百分浓度为40％-80％乙醇水溶液，加热回流1-4小时，过滤，得滤液；
大孔树脂纯化：将上述滤液浓缩后上样加至大孔吸附树脂柱上，以7-11个柱体积的体积百分浓度为0-10％的乙醇水溶液洗脱，弃去，再以3-5个柱体积的体积百分浓度为50％-70％的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，得酸枣仁对照提取物粗品；
硅胶纯化：取上述酸枣仁对照提取物粗品，以体积百分浓度为50％-70％的乙醇水溶液溶解，加入适量硅胶拌样，蒸干溶剂后上样至硅胶柱，先以20-30个柱体积的乙酸乙酯洗脱，弃去，再以40-60个柱体积的体积比为70:30-50:50的乙酸乙酯-甲醇洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，得酸枣仁对照提取物。
2.根据权利要求1所述的酸枣仁对照提取物的制备方法，其特征在于，所述脱脂步骤中，采用以下条件进行超临界CO2萃取：萃取釜温度为40-60℃，压力为25-35Mpa，第一分离釜温度为40-50℃，压力为5.5-6.5Mpa，第二分离釜温度为30-40℃，压力为4-5Mpa，CO2流量为25-35L/小时，萃取2-4小时。
3.根据权利要求1所述的酸枣仁对照提取物的制备方法，其特征在于，所述大孔树脂纯化的具体步骤为：将上述滤液浓缩后上样加至大孔吸附树脂柱上，以4-6个柱体积的水洗脱，弃去，再以3-5个柱体积的体积百分浓度为10％的乙醇水溶液洗脱，弃去，再以3-5个柱体积的体积百分浓度为50％-70％的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，得酸枣仁对照提取物粗品。
4.根据权利要求3所述的酸枣仁对照提取物的制备方法，其特征在于，所述大孔树脂纯化的具体步骤为：将上述滤液浓缩后上样加至D101型大孔吸附树脂柱上，以5个柱体积的水洗脱，弃去，再以4个柱体积的体积百分浓度为10％的乙醇水溶液洗脱，弃去，再以4个柱体积的体积百分浓度为60％的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，回收溶剂至干，60℃减压干燥12小时，研成细粉，得酸枣仁对照提取物粗品。
5.根据权利要求1所述的酸枣仁对照提取物的制备方法，其特征在于，所述硅胶纯化步骤中，所述硅胶柱中填充的为粒径为300目的正相硅胶，洗脱过程具体为：先以25个柱体积的乙酸乙酯洗脱，弃去，再以17个柱体积的体积比为70:30的乙酸乙酯-甲醇洗脱，收集洗脱液，最后以33个柱体积的体积比为50:50的乙酸乙酯-甲醇洗脱，收集洗脱液，合并两次收集得到的洗脱液，回收溶剂，得酸枣仁对照提取物。
6.根据权利要求5所述的酸枣仁对照提取物的制备方法，其特征在于，所述硅胶纯化步骤中，将加入适量硅胶拌样并蒸干溶剂后的样品均匀填充至胶管中，将该胶管与低压制备液相相连，以该低压制备液相进行洗脱。
7.根据权利要求1所述的酸枣仁对照提取物的制备方法，其特征在于，所述提取的具体步骤为：按照每克酸枣仁药材8ml的量加入体积百分浓度为60％乙醇水溶液，加热回流2次，每次1小时，过滤，合并滤液。
8.一种酸枣仁对照提取物，其特征在于，通过权利要求1-7任一项所述的酸枣仁对照提取物的制备方法制备得到。
9.一种酸枣仁对照提取物的应用，其特征在于，将权利要求8所述的酸枣仁对照提取物用于酸枣仁及含酸枣仁的中药制剂的质量控制中。
10.根据权利要求9所述的酸枣仁对照提取物的应用，其特征在于，所述酸枣仁及含酸枣仁的中药制剂的质量控制方法为：将所述酸枣仁对照提取物、待测样品以薄层色谱法和/或高效液相色谱法进行检测，对比判别；
所述薄层色谱法的检测条件为：
薄层板：硅胶薄层板；
展开剂：水饱和正丁醇；
显色剂及检视：以香草醛硫酸溶液为显色剂检视，再置于日光灯下检视，和/或置于365nm的紫外灯下检视；
所述高效液相色谱法包括黄酮类检测和皂苷类检测；
黄酮类检测条件为：
固定相：C18色谱柱；
柱温：20-30℃；
流动相：A相为乙腈，B相为水，按照以下梯度洗脱程序进行：
流速：1.0ml/min；
检测器：二极管阵列检测器；
皂苷类检测条件为：
固定相：C18色谱柱；
柱温：30-40℃；
流动相：A相为乙腈，B相为水，按照以下梯度洗脱程序进行：
流速：1.0ml/min；
检测器：蒸发光散射检测器。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |