CN110376318A - 一种酸枣仁对照提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种酸枣仁对照提取物及其制备方法和应用，所述提取物浅褐色干燥粉末，其是由含重量百分比酸枣仁提取物67‑84％和辅料16‑33％组成，其中酸枣仁提取物中含有斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B含量总和不低于4％；该酸枣仁对照提取物一致性好、性状稳定、均匀，可用于酸枣仁药材、酸枣仁制剂的质量控制，对有效化合物定性定量的分析测定。

Description

一种酸枣仁对照提取物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于化学领域，尤其是涉及一种酸枣仁对照提取物及其制备方法。

背景技术

药品检验是验证药品质量的一个重要手段，随着仪器分析的广泛使用，越来越多地使用 药品标准物质。在药品检验工作中常会用对照品作为检查药品质量的特殊参照物，以它作为 确定药品真伪优劣的对照标准。对照品在药品检验中具有十分重要的地位。

现在中药标准中，单一成分控制质量的模式难以很好的反映中药质量，采用多种成分或 特征色谱峰综合控制质量的方法越来越引起人们的重视。然而，商品化的对照品的供不应求 和高昂的检测成本限制了多成分的质量控制在实际生产、科研和监管领域的应用。使用对照 提取物既可以解决单体对照品制备难度大、紧缺的问题，又可以达到对指标成分控制的目的， 对中药的质量控制和标准执行都有重要的意义。

现行中药质量控制模式基本上是沿着天然药物化学的发展，对中药某一种或几种有效成 分为目标的分析方法和既有定性又可定量的质量标准的构思，参照国外植物药的质量控制方 法，借鉴化学药品质量控制的模式，并借助文献报道建立相应的简单理化鉴别，再发展到以 光谱、色谱为主的鉴别和含量测定的质量标准。每一味中药材都是多成分的综合体，这决定 了其特有的整体性和模糊性，也表明以药材中一两个甚至几个成分作为药材质量的评价方法 存在很大的局限性。

1990版《中国药典》增加了对照药材的薄层色谱鉴别，使得中药及中成药的鉴别有了很 大的进展。目前中药和国外的草药越来越重视多成分或多组分的检测，例如德国银杏叶提取 物的质量控制。指纹图谱的分析方法，可以从整体上对药材进行质量控制，现在仍然有很大 的研究价值。目前中国药典在控制药材质量方面有两种“对照品”，化学对照品和中药对照 药材。其中化学对照品可用于药材的定性鉴别和定量分析，中药对照药材则用于显微鉴别和 薄层鉴别。然而，化学对照品和中药对照药材在中药质量控制上都有其局限性。首先，中药 中化学成分多样化，单一或者几个化合物并不能反映药材的全貌，而现有的标准往往有很多 漏洞，以次充好的现象时有发生。中药对照药材受到产地、生长环境的影响，很难保证每一 批的质量一致，而且只能用于定性鉴别，无法反映药材成分含量的高低。

中药对照提取物有四个基本要求(ASCS):Authenticity，药材来源可靠，具有代表性； Specificity，使用的检测方法具有专属性；Con-sistency，不同批次对照提取物应保持一致； Stability，性状稳定、均匀、便于使用。运用薄层色谱指纹图谱以及高效液相色谱指纹图谱 的方法，中药对照提取物能满足定性鉴别的需要。通过标化的对照提取物还可以进一步进行 半定量甚至定量的分析。中药对照提取物将对中药质量控制有重要义。

酸枣仁作为一种中药材，收载于中国药典中。中国药典分别对酸枣仁药材的皂苷类和黄 酮类成分进行薄层色谱鉴别：其中，皂苷类成分的薄层鉴别方法为：取本品粉末1g，加甲醇 30ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，作为供试品溶液。另取 酸枣仁皂苷A、B对照品，分别加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液。照薄 层色谱法(附录ⅥB)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以水 饱和的正丁醇为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％香草醛硫酸溶液，立即检视。供试品色 谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。黄酮类成分的薄层鉴别方法为： 取本品粉末1g，加石油醚(60～90℃)30ml，加热回流2小时，滤过，弃去石油醚液，药渣挥干，加甲醇30ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品 溶液。另取酸枣仁对照药材1g，同法制成对照药材溶液。再取斯皮诺素对照品，加甲醇制成 每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录ⅥB)试验，吸取上述三种溶液 各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以水饱和的正丁醇为展开剂，展开，取出，晾干， 喷以1％香草醛硫酸溶液，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应 的位置上，显相同的蓝色荧光斑点。但是，在该鉴别方法中，采用酸枣仁皂苷A、B对照品及 斯皮诺素对照品、酸枣仁对照药材为对照，分别鉴别酸枣仁中皂苷类和黄酮类成分，这样的方法既提高了检测成本，操作又较为繁琐。

国家药典委员会发布的中国药典质量标准中，对酸枣仁作为药材时有效成分之一的以酸 枣仁皂苷A、B或斯皮诺素含量做了规定，但是也正由于中药对照提取物有上述特定的要求， 目前现有技术还未有或未有成熟的酸枣仁对照提取物及其制备方法来代替酸枣仁对照药材的 应用。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种为了解决上述技术问题，本发明对 酸枣仁制剂或酸枣仁药材检测中存在的检测标准不全面，使用多种对照品检测成本高的问题， 本发明提供一种对酸枣仁药材、酸枣仁提取物及其酸枣仁制剂中的化合物同时进行检测的酸 枣仁对照提取物，该酸枣仁对照提取物一致性好、性状稳定、均匀，可用于酸枣仁药材、酸 枣仁处方的质量控制，对有效化合物定性定量的分析测定。

本发明还提供了酸枣仁对照提取物的制备方法。该方法操作简便、成本低、重复性好且 提取率高。

本发明还提供了用酸枣仁对照提取物代替对照药材检测含酸枣仁成分的样品的控制方 法。

本发明是通过下述技术方案实现的：

本发明的一种酸枣仁对照提取物，所述提取物为浅褐色干燥粉末，其是由含重量百分 比酸枣仁提取物67-84％和辅料16-33％组成，其中酸枣仁提取物中含有斯皮诺素、酸枣仁皂苷 A、酸枣仁皂苷B含量总和不低于4％。

上述酸枣仁对照提取物所述斯皮诺素的含量≥3.0％，酸枣仁皂苷A的含量≥1.0％，酸 枣仁皂苷B的含量≥1.0％。

本发明所述的酸枣仁对照提取物通过下述方法制备得到的：

步骤1.脱脂酸枣仁：取酸枣仁粉末，用石油醚脱脂即得或脱脂酸枣仁药材市购；

步骤2.酸枣仁干膏：取不同来源及批次的脱脂酸枣仁药材粉末，用50-95％乙醇提取提取 液滤过，蒸干得到酸枣仁干膏；

步骤3.酸枣仁提取物：酸枣仁干膏溶解于甲醇，再加入辅料搅拌均匀、蒸干、研磨过筛 即得酸枣仁提取物；

步骤4.酸枣仁对照提取物：将不同来源或批次的酸枣仁提取物进行调配勾兑，得到酸枣 仁对照提取物。

上述步骤1中脱脂方法为，酸枣仁粉末，用石油醚加热回流1-3次，每次1-3小时，过滤后，药渣再用石油醚冲洗1-3次，合并石油醚提取液和洗涤液，干燥，蒸干石油醚即得脱脂酸枣仁粉末。

上述步骤1中脱脂酸枣仁药材粉末与50-95％乙醇(优选70％乙醇)的重量体积比为1:8～ 1:50(优选1：20-25)；所述提取1-3次，每次1-3小时。

步骤1中所述的过滤是用中速滤纸或者2000目筛网过滤。

所述步骤2中甲醇用量为2-5倍干膏重量。

所述步骤2中在酸枣仁干膏甲醇溶液中加入干膏重量的10％～60％(优选20-40％)的辅料。

所述辅料包括但不限于：微粉硅胶、药用淀粉等。

优选辅料为20-50％(优选40％)微粉硅胶，和/或10-30％(优选20％)药用淀粉。所述辅 料填加能够保证提取物性状稳定、均匀且便于使用。

步骤2中所述蒸干后研磨过筛是过90～200目(优选200目)筛网过滤。

步骤3中所述的调配具体指：将不同来源或批次的酸枣仁提取物进行调配，应使最终的 酸枣仁对照提取物中对应原药材比例为1：(2-5)(g/g)，(优选1：3-4g/g)，其中(含量以 wt％计)酸枣仁对照提取物所述斯皮诺素的含量≥3.0％，酸枣仁皂苷A的含量≥1.0％，酸枣 仁皂苷B的含量≥1.0％。

本发明在所述步骤2与步骤3之间还包括以薄层色谱法和/或高效液相色谱法对不同批次 的酸枣仁提取物的斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B进行检测的步骤。

或为保证本发明的酸枣仁对照提取物的可靠性、成分一致性、均一性。优选在步骤1前增 加不同药材来源的筛选步骤：将不同来源或批次的原料药材以薄层色谱法和/或高效液相色谱 法进行检测；然后对不同来源或批次的原料药材的通过薄层色谱法和/或高效液相色谱法得到 的色谱图和/或测定的含量进行比较分析，剔除色谱图和/或测定的含量异常的原料药材，保 留色谱图和/或测定的含量一致的原料药材进行下一步的酸枣仁干膏的制备。

原药材的薄层色谱法和/或高效液相色谱法与酸枣仁的薄层色谱法和/或高效液相色谱法 的中对照品、检测条件相同。

本发明的酸枣仁对照提取物以单位剂量形式存在，所述单位剂量形式是指制剂的单位， 如片剂的每片、胶囊的每粒等，

本发明的制剂包括但不限于片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶 囊剂、软胶囊剂、口服液、***剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉 剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂。

本发明的药物制剂，其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀 释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。适 用的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂。适宜的崩解剂包括淀粉、聚 乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠。适宜的润滑剂包括，例如硬脂酸镁。适 宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。可通过混合，填充，压片等常用的方法制备 固体口服组合物。进行反复混合可使活性物质分布在整个使用大量填充剂的那些组合物中。

口服液体制剂的形式例如可以是水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂，或者 可以是一种在使用前可用水或其它适宜的载体复配的干燥产品。这种液体制剂可含有常规的 添加剂，诸如悬浮剂，例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维 素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪，乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨醇一油酸酯或***胶； 非水性载体(它们可以包括食用油)，例如杏仁油、分馏椰子油、诸如甘油的酯的油性酯、丙 二醇或乙醇；防腐剂，例如对羟基苯甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可 含有常规的香味剂或着色剂。

对于注射剂，制备的液体单位剂型含有本发明的活性物质和无菌载体。根据载体和浓度， 可以将此化合物悬浮或者溶解。溶液的制备通常是通过将活性物质溶解在一种载体中，在将 其装入一种适宜的小瓶或安瓿前过滤消毒，然后密封。辅料例如一种局部麻醉剂、防腐剂和 缓冲剂也可以溶解在这种载体中。为了提高其稳定性，可在装入小瓶以后将这种组合物冰冻， 并在真空下将水除去。

本发明的酸枣仁对照提取物，在制备成药剂时可选择性的加入适合的药物可接受的载体， 所述药物可接受的载体选自：甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐 酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素C、EDTA二钠、EDTA钙钠，一价碱金属的碳酸盐、 醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍 生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土温80、琼脂、碳酸钙、 碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β－环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、 硬脂酸钙、硬脂酸镁等。

本发明的酸枣仁对照提取物还可以作为酸枣仁标准提取物，用于原料药使用或作为药物 组合物的有效成分，其重量比为0.01-99.9％。

本发明提供了酸枣仁对照提取物的制备方法步骤如下：见图3工艺流程图

步骤1.脱脂酸枣仁：取酸枣仁粉末，用石油醚脱脂即得或脱脂酸枣仁市购；

步骤2.酸枣仁干膏：取不同来源及批次的脱脂酸枣仁药材粉末，用50-95％乙醇提取提取 液滤过，蒸干得到酸枣仁干膏；

步骤3.酸枣仁提取物：酸枣仁干膏溶解于甲醇，再加入辅料搅拌均匀、蒸干、研磨过筛 即得酸枣仁提取物；

步骤4.酸枣仁提取物检测：以薄层色谱法和/或高效液相色谱法对不同批次的酸枣仁提 取物的酸枣仁皂苷A、B，斯皮诺素进行检测；

步骤5.酸枣仁对照提取物：将检测后的酸枣仁不同来源或批次的酸枣仁提取物进行调配 勾兑，得到酸枣仁对照提取物。

上述步骤2中酸枣仁药材粉末与50-95％乙醇(优选70％乙醇)的重量体积比为1:8～1:50 (优选1:20-25)；所述提取1-3次，每次1-3小时。

步骤2中所述的过滤是用中速滤纸或者2000目筛网过滤。

步骤3中所述甲醇用量为2-5倍干膏重量。

步骤3中在酸枣仁干膏甲醇溶液中加入干膏重量的10％～60％(优选20-40％)的辅料。

所述辅料包括但不限于：微粉硅胶、药用淀粉等。优选辅料为20-50％(优选40％)微粉 硅胶，和/或10-30％(优选20％)药用淀粉。所述辅料填加能够保证提取物性状稳定、均匀且 便于使用。

步骤3中所述蒸干后研磨过筛是过90～200目(优选200目)筛网过滤。

步骤4中所述其中薄层色谱法包括如下步骤：

(1)化学对照品溶液：精密称取酸枣仁皂苷A、B，斯皮诺素对照品，用甲醇配制成1mg/ml 的溶液即可；

(2)酸枣仁提取物溶液：精密称定适量提取物对照品，用甲醇配制成60mg/ml的浓度， 过0.45μm滤膜即可；

(3)所述薄层色谱法检测条件为：

薄层板:硅胶G60板

展开缸：双槽展开缸

点样:提取物溶液、化学对照品溶液点样量均为2μl；自动点样器条状点样， 条带8×1mm

展开剂:水饱和的正丁醇

展距:上行8cm，温度:20℃左右；相对湿度:<50％

检视:展开完毕，挥干薄层板面溶剂，将薄层板放置在真空干燥箱中干燥3h 以上，取一块薄层板喷加5％AlCl₃乙醇溶液，105℃加热3min后于 UV366nm下观察以斯皮诺素为主的黄酮类成分的荧光色谱图像；另一块 薄层板于相对湿度不超过50％，温度不超过25℃的环境中浸渍1％香草 醛70％浓硫酸乙酸乙酯溶液，迅速在白光下观察酸枣仁皂苷a及酸枣仁 皂苷b的天蓝色条斑；

其中高效液相色谱法包括如下步骤：

(1)化学对照品溶液的制备：精密称取酸枣仁皂苷A、B以及斯皮诺素，用甲醇溶解酸 枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B各配制成0.1mg/ml，和斯皮诺素0.2mg/ml的对照品溶 液，

(2)酸枣仁提取物供试品溶液的制备：取酸枣仁提取物，精密称定，加甲醇超声处理15min，滤过，配制成8mg/ml浓度的溶液，摇匀，滤过，取续滤液，即得，

(3)色谱条件：

所述的高效液相色谱法检测条件：

色谱仪器：高效液相色谱仪，配有DAD检测器、ELSD检测器

色谱柱：C₁₈柱(250mm×4.6mm，5μm)；

斯皮诺素流动相

检测波长：335nm柱温35℃

皂苷A和B流动相

载气流速1.60SLM，温度85℃，Gain值9，流动相流速：1.0mL/min

(4)检测方法：精密吸取提取物溶液，对照品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图及计 算含量。

上述步骤5所述的调配具体指：将不同来源或批次的酸枣仁提取物进行调配，应使最终 的酸枣仁对照提取物中对应原药材比例为1：(2-5)，优选1：3-4(g/g)，其中(含量以wt％ 计)酸枣仁提取物中含有斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B含量总和不低于4％,并且斯 皮诺素的含量≥3.0％，酸枣仁皂苷A的含量≥1.0％，酸枣仁皂苷B的含量≥1.0％。

本发明所述的调配标注中的各成分的含量的范围也是经过多次反复实验综合保持稳定 性、一致性以及后面的应用等得出的最佳数据。

本发明还提供了一种酸枣仁药材或中药制剂的鉴别方法，或酸枣仁或含酸枣仁有效成分 的药材或中药制剂的质量控制方法，将上述制备得到的所述酸枣仁照提取物、待测样品以薄 层色谱法和/或高效液相色谱法进行检测，对比判别。

本发明的有益效果通过试验例阐述

1、本发明的酸枣仁对照提取物的制备方法采用了粗提、精制、加辅料干燥、研磨过筛和 调配的步骤，操作简便、重复性好且提取率高。用此制备方法制备得到的酸枣仁对照提取物 因是多次或不同批次的提取物进行调配而成，克服了因中药对照药材受到产地、生长环境的 影响，很难保证每一批的质量一致的缺陷，从而保证了不同批次的酸枣仁对照提取物的一致 性；同时通过添加适当的溶剂，保证提取物与药材成分的一致性；选取具有代表性的药材作 为原料，得到的产物具有代表性，作为对照提取物更能直观反映待检测药材的质量；通过添 加辅料，保证提取物性状稳定、均匀且便于使用。满足了中药对照提取物有四个基本要求 (ASCS):Authenticity，药材来源可靠，具有代表性；Specificity，使用的检测方法具有 专属性；Con-sistency，不同批次对照提取物应保持一致；Stability，性状稳定、均匀、便 于使用。

2、采用本发明的酸枣仁对照提取物的制备方法最终得到的酸枣仁提取物中含有斯皮诺 素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B含量总和不低于4％,并且斯皮诺素的含量≥3.0％，酸枣仁皂 苷A的含量≥1.0％，酸枣仁皂苷B的含量≥1.0％，且对照提取物薄层色谱指纹图谱、HPLC指 纹图谱与药材对应一致；所述酸枣仁提取物的薄层色谱中，366nmUV下可以看到斯皮诺素以 及高于斯皮诺素的一条荧光条带，其他几个黄酮条带相对颜色浅；喷加1％香草醛浓硫酸试剂 后直接在白光下观察看到两条明显的蓝色条带，从下到上为酸枣仁皂苷A、B和含量较少的显 蓝色的皂苷条带；对照提取物薄层色谱指纹图谱条带和高效液相指纹图谱色谱峰与药材对应 一致。

3、对照药材相比使用方便，对照提取物只需要简单的溶解即可使用而不需要繁琐的提取 过程。

4、本发明还提供了药材或中药制剂的鉴别方法，或酸枣仁或含酸枣仁/酸枣仁有效成分 的药材或中药制剂的质量控制方法，不仅可以对药材或中药制剂进行定性鉴别，而且还可以 用于半定量甚至定量分析。

5、通过显色方法的筛选，也采用了喷雾1％香草醛浓硫酸试剂做比较，但此法对环境温 湿度要求较高，故最终采用浸渍显色剂的方法更适合本发明的日常检验。

附图说明

图1是酸枣仁(脱脂)药材及提取物对照品TLC色谱图

其中，图1-A：UV366nm下观察(TLC板)；图1-B：白光下观察酸枣仁皂苷(TLC板)；

图1-A：S：斯皮诺素对照品；图1-B：A：酸枣仁皂苷A，B:酸枣仁皂苷B；1-2：酸枣 仁提取物对照品ERS；3-8：脱脂后酸枣仁药材。

图2是酸枣仁(脱脂)药材及对照提取物HPLC色谱图

图2-A酸枣仁对照提取物6批药材HPLC-ELSD图谱(自上而下1-6：脱脂酸枣仁药材、酸枣仁对照提取物ERS、酸枣仁皂苷B，酸枣酸枣仁皂苷A)

图2-B酸枣仁对照提取物以及6批药材HPLC-DAD图谱(自上而下1-6：脱脂酸枣仁药材、酸枣仁对照提取物ERS、斯皮诺素)。

图3为本发明酸枣仁对照提取物制备流程图。

图4是喷雾1％香草醛浓硫酸试剂显色的TCL图，图4-A：喷雾1％香草醛浓硫酸试剂(白光 下观察)；图4-B：喷雾1％香草醛浓硫酸试剂后105℃加热板加热到显紫色油脂斑点(白光 下观察)。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围 并不受具体实施方式的限制。

除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如 “包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件 或其它组成部分。

实施例1、本发明酸枣仁对照提取物代替对照药材的对比试验

用薄层色谱法以及高效液相色谱法分别以化学对照品和酸枣仁对照提取物为参照物质对 市售药材进行分析。

1薄层色谱

1.1样品制备

化学对照品溶液：化学对照品溶液：精密称取酸枣仁皂苷A、B，斯皮诺素对照品，用甲 醇配制成1mg/ml的溶液即可；

酸枣仁对照提取物溶液：精密称定适量对照提取物，用甲醇配制成60mg/ml的浓度，过 0.45um滤膜即可；

药材供试品溶液：取酸枣仁药材粉末4g，加石油醚(60～90℃)100ml，超声提取1小时，滤过、弃去石油醚液，药渣挥干，加甲醇100ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干， 残渣加甲醇2ml使溶解，作为药材供试品溶液。

1.2薄层色谱检测

色谱条件：

薄层板:预制(普通)硅胶G60板(Merck)20×10cm,两块

展开缸：双槽展开缸(CAMAG,瑞士)

点样:提取物对照品溶液、药材供试品溶液点样量均为2μl；自动点样器条状点样，条带8×1mm。

展开剂:水饱和的正丁醇(中国药典条件)

展距:上行8cm。温度:20℃左右；相对湿度:<50％

检视:展开完毕，挥干薄层板面溶剂，将薄层板放置在真空干燥箱中干燥3h以 上，取一块薄层板喷加5％AlCl₃乙醇溶液，105℃加热3min后于UV366nm 下观察以斯皮诺素(spinosin)为主的黄酮类成分的荧光色谱图像；另 一块薄层板于相对湿度不超过50％，温度不超过25℃的环境中浸渍1％香 草醛70％浓硫酸乙酸乙酯溶液，迅速在白光下观察酸枣仁皂苷a (jujuboside a)及酸枣仁皂苷b(jujuboside b)的天蓝色条斑。

检测结果如图1所示，图1-A：UV366nm下观察(TLC板)；图1-B：白光下观察酸枣仁皂苷(TLC板)；图.1-A：S：斯皮诺素对照品；图.1-B：A：酸枣仁皂苷A，B:酸枣仁皂苷B； 1-2：酸枣仁提取物对照品ERS；3-8：脱脂后酸枣仁药材。

结论：366nmUV下可以看到斯皮诺素以及高于斯皮诺素的一条荧光条带，其他几个黄酮条 带相对颜色浅。喷加1％香草醛浓硫酸试剂后直接在白光下观察可以看到两条明显的蓝色条带， 从下到上为酸枣仁皂苷A、B。另外还可以看到一些含量较少的显蓝色的皂苷条带。酸枣然对 照提取物与药材的图谱一致。

2高效液相色谱

2.1样品制备

化学对照品溶液的制备：精密称取酸枣仁皂苷A、B以及斯皮诺素，用甲醇溶解配制成0.1mg/ml(皂苷A、B)和0.2mg/ml(斯皮诺素)的对照品溶液。

酸枣仁对照提取物溶液：取酸枣仁提取物取，精密称定，加甲醇超声处理15min，滤过， 配制成8mg/ml浓度的溶液，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

药材供试品溶液：取酸枣仁药材粉末5g，精密称定，至烧瓶中，加石油醚(60-90)100ml 置70℃水浴中加热回流2小时，过滤后将滤渣用石油醚冲洗两次，完全干燥后精密加入70％ 乙醇100ml，置70℃水浴中加热回流2小时，过滤，将滤液置于蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇 使溶解并转移至25ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，过滤即得。

2.2高效液相色谱检测

色谱仪：Agilent 1260series高效液相色谱仪

色谱柱：Kromasil 100-5C184.6*250mm，5μm。

DAD检测器Agilent G1315D(检测斯皮诺素)检测波长：335nm柱温35℃

ELSD检测器Agilent 380-ELSD(检测皂苷A和B)：载气流速1.60SLM，温度85℃，Gain 值9

流动相流速：1.0mL/min

进样量：供试品-10ul，斯皮诺素分别-5ul和10ul，皂苷A-5ul和15ul，皂苷B-5ul和15ul

进样次数：各两针

流动相：按下表比例洗脱

斯皮诺素

皂苷A和B

测定法分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录 色谱图，即得。

结论：HPLC-DAD色谱图显示，酸枣仁提取物对照品与酸枣仁药材色谱图谱基本一致，各 指标成分特征峰明显。本品TLC以及HPLC谱图重复性和重现性良好，符合提取物对照品的要 求。

实施例2、酸枣仁对照提取物的性状分析

1.表观状态：实施例3得到的酸枣仁对照提取物为浅灰褐色粉末。

2.水分测定：按照2010版中国药典附录IX G(减压干燥法)进行。检测结果为酸枣仁对照 提取物含水量为5.65％。

3.一致性测试：按本方法制备10批次酸枣仁对照提取物，经测定各批次间的针对酸枣仁皂苷 A、B，斯皮诺素薄层色谱检测结果差异很小，酸枣仁皂苷A、B，斯皮诺素斑点均有明显的显 示，且分布非常一致；经高效液相色谱检测其酸枣仁皂苷A、B，斯皮诺素含量均在调配标准 范围之内。因此利用本发明的酸枣仁对照提取物的制备方法制备得到的酸枣仁对照提取物一 致性非常好。

4.稳定性测试：

取10个不同批次的按酸枣仁对照提取物的供试品，按照国家药典委员会制订的“国家药 品标准物质研制技术要求”的相关规定，考察指标包括性状和溶解性。

供试品开口置适宜的洁净容器中，60℃温度下放置10天，于第5天和第10天取样，按稳定性重点考察项目进行检测。

结果显示，高温试验前后供试品性状无明显变化，高温试验前后薄层色谱图也无明显变 化，溶出率测定结果用SPSS进行独立样本t-检验，计算结果P＞0.05，说明无显著性差异。

实施例3、酸枣仁对照提取物的制备

仪器及试药：Linomat 5薄层色谱半自动点样仪、ATS 4薄层色谱全自动点样仪、薄层色 谱双槽展开缸、Chromatogram Immersion Device III色谱显色用浸渍槽和TLCvisualizer 薄层色谱摄像仪(瑞士，CAMAG)。

Agilent 1260series高效液相色谱仪，配有DAD检测器(美国，AgilentTechnologies)， ELSD检测器Agilent 380-ELSD

甲醇、乙醇、异丙醇均为分析纯(天津大茂化学试剂厂)。甲苯、石油醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、浓氨水和三乙胺均为分析纯(广州化学试剂厂)。

酸枣仁皂苷A、B，斯皮诺素对照品标示纯度均≥98％，(四川维克奇生物科技有限公司)；

拟用于制备对照提取物的药材:脱脂酸枣仁。

本实施例提供了本发明酸枣仁对照提取物的制备方法，其方法流程图如图3所示。

脱脂酸枣仁药材可以按照下述方法脱脂，也可以药典购买脱脂酸枣仁药材。

一、提取：

取脱脂酸枣仁药材(取酸枣仁药材5g，精密称定，至烧瓶中，加石油醚(60-90)100ml 置70℃水浴中加热回流2小时，过滤后将滤渣用石油醚冲洗两次，完全干燥后即得脱脂酸枣仁 药材或市购酸枣仁)。精密加入70％乙醇100ml，置70℃水浴中加热回流2小时，过滤，将滤液， 滤液浓缩干燥即得脱脂后的酸枣仁提取粉末。

二、干膏制备：选取脱脂酸枣仁提取粉末，药材粉末过二号筛(850±29μm，24目)，然后加 入其质量25倍体积的的甲醇(即固液比w/V))，超声60min(功率500w，常温)或回流提取提 取120min后中速定性滤纸过滤，收集滤渣1和滤液1，滤渣1按相同方法再次提取二次，并将再 次提取二次收集的滤液与滤液1合并即为提取液，将提取液蒸干溶剂即得干膏；

三、酸枣仁提取物的制备

用干膏2-5倍(重量体积比)的甲醇将干膏溶解完全后，再加干膏重量40％微粉硅胶和干 膏重量20％药用淀粉，用旋转蒸发仪蒸干，粉碎过200目筛，得到酸枣仁提取物。

四、提取物检测：制备6批酸枣仁提取物，按照实施例1的检测方法

五、调配得到酸枣仁对照提取物

将步骤四的6个批次的酸枣仁提取物按一定比例混合勾兑到酸枣仁对照提取物，调配标准 为：最终产品对应原药材比例大约为1：3-4(g/g)，应使最终的酸枣仁对照提取物中含有斯 皮诺素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B含量总和不低于4％，其中素的含量≥3.0％，酸枣仁皂苷A 的含量≥1.0％，酸枣仁皂苷B的含量≥1.0％。结果如下表

实施例4、显色剂显色方法

本发明浸渍1％香草醛70％浓硫酸乙酸乙酯溶液，迅速在白光下观察酸枣仁皂苷a(jujuboside a)及酸枣仁皂苷b(jujuboside b)的天蓝色条斑。

对比例1：喷雾1％香草醛浓硫酸试剂(白光下观察)；

对比例2：喷雾1％香草醛浓硫酸试剂后105℃加热板加热到显紫色油脂斑点(白光下观察)；

结果：如图1-B,图4-A、图4-B。图4-A、图4-B喷雾显色的TCL图像不是特别清晰，显色法对环境温湿度要求较高，不适合日常检验，故最终采用浸渍显色剂的方法。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想 将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。 对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得 本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择 和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (10)

1.一种酸枣仁对照提取物，其特征在于，述提取物为浅褐色干燥粉末，其是由含重量百分比酸枣仁提取物67-84％和辅料16-33％组成，其中酸枣仁提取物中含有斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B含量总和不低于4％。

2.如权利要求1所述的酸枣仁对照提取物，其特征在于，酸枣仁对照提取物所述斯皮诺素的含量≥3.0％，酸枣仁皂苷A的含量≥1.0％，酸枣仁皂苷B的含量≥1.0％。

3.如权利要求1所述的酸枣仁对照提取物，其特征在于，所述酸枣仁提取物的薄层色谱中，366nmUV下可以看到斯皮诺素以及高于斯皮诺素的一条荧光条带，其他几个黄酮条带相对颜色浅；喷加1％香草醛浓硫酸试剂后直接在白光下观察看到两条明显的蓝色条带，从下到上为酸枣仁皂苷A、B和含量较少的显蓝色的皂苷条带；对照提取物薄层色谱指纹图谱条带和高效液相指纹图谱色谱峰与药材对应一致。

4.如权利要求1所述的酸枣仁对照提取物，其特征在于，所述辅料为微粉硅胶、药用淀粉中一种或两种。

5.如权利要求1所述的一种酸枣仁对照提取物，其特征在于，是通过下述方法制备得到的：

步骤1.脱脂酸枣仁：取酸枣仁粉末，用石油醚脱脂即得或脱脂酸枣仁药材市购；

步骤2.酸枣仁干膏：取不同来源及批次的脱脂酸枣仁药材粉末，用50-95％乙醇提取提取液滤过，蒸干得到酸枣仁干膏；

步骤3.酸枣仁提取物：酸枣仁干膏溶解于甲醇，再加入辅料搅拌均匀、蒸干、研磨过筛即得酸枣仁提取物；

步骤4.酸枣仁对照提取物：将不同来源或批次的酸枣仁提取物进行调配勾兑，得到酸枣仁对照提取物。

6.如权利要求4所述的一种酸枣仁对照提取物，其特征在于，步骤1.前增加不同酸枣仁药材来源的筛选步骤：将不同来源或批次的原料药材以薄层色谱法和/或高效液相色谱法进行检测；然后对不同来源或批次的原料药材的通过薄层色谱法和/或高效液相色谱法得到的色谱图和/或测定的斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B含量进行比较分析，剔除色谱图和/或测定的含量异常的原料药材，保留色谱图和/或测定的含量一致的原料药材进行下一步的脱脂酸枣仁的制备；或者在步骤3.与步骤4.之间还包括以薄层色谱法和/或高效液相色谱法对不同批次的酸枣仁提取物的斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B进行检测的步骤。

7.如权利要求5所述的一种酸枣仁对照提取物，其特征在于，步骤1中脱脂酸枣仁药材粉末与50-95％乙醇的重量体积比为1:8～1:50；回流提取1-3次，每次1-3小时；步骤2中甲醇用量为2-5倍干膏重量；步骤3中所述的调配具体指：将不同来源或批次的酸枣仁提取物进行调配，应使最终的酸枣仁对照提取物中对应原药材比例为1：(2-5)g/g，其中含量以wt％计所述斯皮诺素的含量≥3.0％，酸枣仁皂苷A的含量≥1.0％，酸枣仁皂苷B的含量≥1.0％。

8.如权利要求5或7中所述的一种酸枣仁对照提取物，其特征在于：所述步骤1中脱脂方法为，酸枣仁粉末，用石油醚加热回流1-3次，每次1-3小时，过滤后，药渣再用石油醚冲洗1-3次，合并石油醚提取液和洗涤液，干燥，蒸干石油醚即得脱脂酸枣仁粉末。

9.如权利要求6所述的一种酸枣仁对照提取物，其特征在于，所述酸枣仁提取物的薄层色谱法和/或高效液相色谱法检测方法，包括如下步骤：

其中薄层色谱法包括如下步骤：

(1)化学对照品溶液：精密称取酸枣仁皂苷A、B，斯皮诺素对照品，用甲醇配制成1mg/ml的溶液即可；

(2)酸枣仁提取物溶液：精密称定适量提取物对照品，用甲醇配制成60mg/ml的浓度，过0.45μm滤膜即可；

(3)所述薄层色谱法检测条件为：

薄层板:硅胶G60板

展开缸:双槽展开缸

点样:提取物溶液、化学对照品溶液点样量均为2μl；自动点样器条状点样，条带8×1mm

展开剂:水饱和的正丁醇

展距:上行8cm，温度:20℃左右；相对湿度:<50％

检视:展开完毕，挥干薄层板面溶剂，将薄层板放置在真空干燥箱中干燥3h以上，取一块薄层板喷加5％AlCl₃乙醇溶液，105℃加热3min后于UV366nm下观察以斯皮诺素为主的黄酮类成分的荧光色谱图像；另一块薄层板于相对湿度不超过50％，温度不超过25℃的环境中浸渍1％香草醛70％浓硫酸乙酸乙酯溶液，迅速在白光下观察酸枣仁皂苷a及酸枣仁皂苷b的天蓝色条斑；

其中高效液相色谱法包括如下步骤：

(1)化学对照品溶液的制备：精密称取酸枣仁皂苷A、B以及斯皮诺素，用甲醇溶解酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B各配制成0.1mg/ml，和斯皮诺素0.2mg/ml的对照品溶液，

(2)酸枣仁提取物供试品溶液的制备：取酸枣仁提取物，精密称定，加甲醇超声处理15min，滤过，配制成8mg/ml浓度的溶液，摇匀，滤过，取续滤液，即得，

(3)色谱条件：

所述的高效液相色谱法检测条件：

色谱仪器：高效液相色谱仪，配有DAD检测器、ELSD检测器

色谱柱：C₁₈柱(250mm×4.6mm，5μm)；

斯皮诺素流动相

检测波长：335nm柱温35℃

皂苷A和B流动相

载气流速1.60SLM，温度85℃，Gain值9，流动相流速：1.0mL/min

(4)检测方法：精密吸取提取物溶液，对照品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图及计算含量。

10.一种酸枣仁药材或酸枣仁制剂或酸枣仁或含酸枣仁有效成分的药材或制剂的质量控制方法，其特征在于，将权利要求1中所述的酸枣仁对照提取物、待测样品以薄层色谱法和/或高效液相色谱法进行检测，对比判别，

其中薄层色谱法包括如下步骤：

(1)化学对照品溶液：精密称取酸枣仁皂苷A、B，斯皮诺素对照品，用甲醇配制成1mg/ml的溶液即可；

(2)酸枣仁对照提取物溶液：精密称定适量对照提取物，用甲醇配制成60mg/ml的浓度，过0.45μm滤膜即可；

(3)待测样品：药材或含酸枣仁制剂：取样品脱脂，用甲醇回流提取1-3次，每次1-3小时，过滤，滤液蒸干用甲醇溶解即可；

薄层板:硅胶G60板

展开缸:双槽展开缸

点样:提取物对照品溶液、药材供试品溶液点样量均为2μl；自动点样器条状点样，条带8×1mm

展开剂:水饱和的正丁醇

展距:上行8cm，温度:20℃左右；相对湿度:<50％

检视:展开完毕，挥干薄层板面溶剂，将薄层板放置在真空干燥箱中干燥3h以上，取一块薄层板喷加5％AlCl₃乙醇溶液，105℃加热3min后于UV366nm下观察以斯皮诺素为主的黄酮类成分的荧光色谱图像；另一块薄层板于相对湿度不超过50％，温度不超过25℃的环境中浸渍1％香草醛70％浓硫酸乙酸乙酯溶液，迅速在白光下观察酸枣仁皂苷a及酸枣仁皂苷b的天蓝色条斑；

其中高效液相色谱法包括如下步骤：

(1)化学对照品溶液的制备：精密称取酸枣仁皂苷A、B以及斯皮诺素，用甲醇溶解酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B各配制成0.1mg/ml，和斯皮诺素0.2mg/ml的对照品溶液；

(2)酸枣仁对照提取物供试品溶液的制备：取酸枣仁对照提取物取，精密称定，加甲醇超声处理15min，滤过，配制成8mg/ml浓度的溶液，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

(3)待测样品：药材或含酸枣仁制剂脱脂，脱脂后用50-95％乙醇加热回流每次1-3次，每次1-3小时，过滤，滤液蒸干，残渣用甲醇溶解即可；

色谱条件：

所述的高效液相色谱法检测条件：

色谱仪器：高效液相色谱仪，配有DAD检测器、ELSD检测器

色谱柱：C₁₈柱250mm×4.6mm，5μm；

斯皮诺素流动相

检测波长：335nm 柱温35℃，

酸枣仁皂苷A和B流动相

载气流速1.60SLM，温度85℃，Gain值9，流动相流速：1.0mL/min；

(4)检测方法：精密吸取化学对照品溶液，酸枣仁对照提取物溶液、待测样品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图及计算含量。