CN107573399B - 一种酸枣仁皂苷a对照品的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种酸枣仁皂苷A对照品的制备方法。具体地，本发明的方法包括以下步骤：(i)提供酸枣仁皂苷A的醇提物；(ii)溶解所述的醇提物，并利用中压制备柱分离所述的醇提混合物，从而获得酸枣仁皂苷A半成品；(iii)溶解所述的酸枣仁皂苷A半成品，并利用凝胶柱进行分离，从而获得酸枣仁皂苷A粗品；(iv)溶解所述的酸枣仁皂苷A粗品，高压制备，得酸枣仁皂苷A高压流份；和(v)浓缩并冷冻干燥酸枣仁皂苷A高压流份，即获得酸枣仁皂苷A对照品。本发明工艺稳定、操作方便、分离效率高，成本低廉经济环保，具有较高的经济价值和学术价值。

Description

一种酸枣仁皂苷A对照品的制备方法

技术领域

本发明属于中药现代化技术领域，涉及一种中药化学对照品的制备方法，具体来说，本发明提供一种从酸枣仁药材中分离高纯度酸枣仁皂苷A对照品的方法。

背景技术

酸枣仁(Ziziphi Spinosae Semen)为鼠李科枣属植物酸枣(Ziziphus jujubaMill.var.spinosa(Bunge)Huex H.F.Chou)的干燥成熟种子,别名枣仁、酸枣核,味甘,性平,具有补肝、宁心、敛汗、生津的作用,用于虚烦不眠,惊悸多梦,体虚多汗,津伤口渴等证,《本草纲目》将其列为上品。酸枣仁药用价值高,其药理作用已被深入研究。酸枣仁皂苷是酸枣仁中含量较高的成分,具有广泛的生物活性,如镇静催眠、抗心肌缺血、抗抑郁、降血脂和降压等。

酸枣仁皂苷A是在2015年版《中国药典》一部中收载的指标成分，酸枣仁皂苷A(Jujuboside A)，分子式为C₅₈H₉₄O₂₆，结构式如下：

目前国内关于酸枣仁皂苷A分离纯化文献报道很少，加之，酸枣仁皂苷A已在2015版药典中被列为标准，对其需求量越来越大，而酸枣仁皂苷A在药材中含量很低，从药材中分离出单体非常困难，市面上供应量严重不足，因此从酸枣仁中分离纯化酸枣仁皂苷A对照品显得非常必要，具有广泛的应用价值。

发明内容

本发明的第一方面提供了一种酸枣仁皂苷A对照品的制备方法，所述的方法包括以下步骤：

(i)提供酸枣仁皂苷A的醇提物；

(ii)所述的醇提物与第一溶剂混合，溶解并得到第一混合物，并利用中压制备柱对所述的第一混合物进行过柱分离，从而获得酸枣仁皂苷A半成品；

(iii)所述的酸枣仁皂苷A半成品与第二溶剂混合，溶解并得到第二混合物，并利用凝胶柱对所述的第二混合物进行纯化，从而获得酸枣仁皂苷A粗品；

(iv)所述的酸枣仁皂苷A粗品与第三溶剂混合，溶解并得到第三混合物，利用高压柱对所述的第三混合物进行高压制备，从而得到目标高压流份；

(v)浓缩并冷冻干燥(iv)所得高压流份，即获得酸枣仁皂苷A对照品。

在另一优选例中，所述步骤(ii)中的第一溶剂为30-50％乙腈溶液；和/或中压制备柱的洗脱剂为30％～45％乙腈溶液。

在另一优选例中，所述步骤(ii)中的中压制备柱设有柱压0-2MPa；此处，当中压制备柱的柱压为0MPa时，是指中压制备柱处于标准大气压下。

在另一优选例中，所述步骤(ii)中的中压制备柱设有柱压0.5-2Mpa；此处，当中压制备柱的柱压为0MPa时，是指中压制备柱处于标准大气压下。

在另一优选例中，所述步骤(ii)中的中压制备柱的填料为十八烷基硅烷键合硅胶。

在另一优选例中，所述步骤(ii)中的中压制备柱的填料粒径为40～60μm。

在另一优选例中，所述的酸枣仁皂苷A半成品纯度≥60.0％。

在另一优选例中，所述步骤(iii)的凝胶柱中使用的填料为葡聚糖凝胶。

在另一优选例中，所述步骤(iii)中，凝胶柱中使用的洗脱剂为40％～60％甲醇。

在另一优选例中，所述步骤(iii)中，第二溶剂为40％～60％甲醇。

在另一优选例中，所述步骤(iii)中凝胶柱纯化操作次数大于等于2次。

在另一优选例中，所述的酸枣仁皂苷A粗品纯度≥95％。

在另一优选例中，所述步骤(iv)的高压柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶。

在另一优选例中，所述步骤(iv)的高压柱填料粒径为5μm～15μm。

在另一优选例中，所述步骤(iv)中的高压柱设有柱压0-15MPa。

在另一优选例中，所述步骤(iv)中的高压柱设有柱压5-10Mpa。

在另一优选例中，所述步骤(iv)中的高压柱设有柱压7-9Mpa。

在另一优选例中，所述步骤(iv)中，高压柱洗脱剂为40％～65％甲醇-水溶液。

在另一优选例中，所述步骤(iv)中，第三溶剂为40％～65％甲醇-水溶液。

在另一优选例中，所述步骤(iv)中使用的甲醇的纯度≥99.7％。

在另一优选例中，所述步骤(iv)中，高压柱洗脱剂流速为40～65ml/min。

在另一优选例中，所述的酸枣仁皂苷A的醇提物由包括以下步骤的方法制备得到：

(i-1)混合酸枣仁药材和乙醇溶液，在50～70℃下进行提取，固液分离后浓缩液体部分，从而获得第一浓缩液；

(i-2)使用大孔树脂吸附所述的第一浓缩液，然后分别用5～8倍柱体积的水和3-5倍柱体积的15-30％乙醇溶液洗脱杂质，再用1～3倍柱体积的50～65％乙醇溶液洗脱目标物质，收集洗脱液，浓缩以获得第二浓缩液；和

(i-3)向第二浓缩液中加入1～2倍量的正丁醇，进行萃取，收集正丁醇层，浓缩以获得步骤(i)中所述的酸枣仁皂苷A醇提物。

在另一优选例中，所述的乙醇溶液与酸枣仁药材以体积质量比(L/kg)为10-20倍量混合。

在另一优选例中，所述步骤(i-1)中的乙醇溶液的体积百分比浓度为60～75％。

在另一优选例中，所述的大孔树脂为苯乙烯型非极性共聚体。

在另一优选例中，所述的大孔树脂为D101型苯乙烯型非极性共聚体。

在另一优选例中，所述的大孔树脂粒径为0.3～1.25mm。

本发明的第二方面提供了一种酸枣仁皂苷A对照品，所述的酸枣仁皂苷A对照品由如本发明第一方面所述的方法制备所得。

在另一优选例中，所述的酸枣仁皂苷A对照品纯度≥99.0％。

在另一优选例中，所述的酸枣仁皂苷A对照品纯度≥99.5％。

在另一优选例中，所述的酸枣仁皂苷A对照品纯度≥99.8％。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为实施例1所得酸枣仁皂苷A对照品的HPLC检测图谱。

图2为对比例1所得酸枣仁皂苷A的HPLC检测图谱。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，首次研发出一种高纯度酸枣仁皂苷A对照品的制备方法。本制备方法采用中压制备柱分离纯化酸枣仁皂苷A醇提物，在一定的压强下，分离效率大大提高。然后采用凝胶纯化。最后进行高压制备，进一步提高酸枣仁皂苷A的纯度。在此基础上，完成了本发明。

本发明的制备方法

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明一种优选的技术方案如下：

A.原料提取：将酸枣仁药材按照体积质量比L/Kg加入5～8倍量的乙醇溶液，所使用的乙醇溶液的体积百分比浓度为60-75％；将酸枣仁药材和乙醇溶液在60℃下热提取至少2次，每次大约2小时，冷却至室温，抽滤，合并滤液，浓缩至无醇味；

B.大孔树脂富集：将步骤A的浓缩液用大孔树脂静态吸附过夜，然后然后分别用2-3倍量柱体积的水和2-5倍量柱体积的15-30％乙醇溶液洗脱杂质，再用1-3倍量柱体积的50-65％乙醇溶液洗脱目标物质，收集洗脱液，浓缩至原体积的1/10；

C.萃取：向步骤B的浓缩液中加入1-2倍量的正丁醇，进行萃取，收集正丁醇层，浓缩以获得步骤(i)中所述的酸枣仁皂苷A醇提物；

D.中压制备：将步骤C的酸枣仁皂苷A醇提物用50％乙腈水溶解上中压制备柱，用30％乙腈洗脱，浓缩得到纯度为60％左右的酸枣仁皂苷A半成品；

E.凝胶纯化：将步骤D所得到的60％左右的酸枣仁皂苷A粗品用50％甲醇水溶解上凝胶柱纯化，用50％甲醇水洗脱，HPLC跟踪检测，收集目标流份，经浓缩、冷冻干燥后，得到纯度为95％左右的酸枣仁皂苷A粗品；

F.高压制备：将步骤E所得到的95％左右的酸枣仁皂苷A粗品用58％甲醇水溶解，进行高压制备，58％甲醇水洗脱，收集目标流份；

G.产品回收：将步骤F得到的高压流份浓缩、冷冻干燥，得纯度为100％酸枣仁皂苷A对照品。

本发明的主要优点

1、工艺步骤少，耗时短，得率高，操作简便，易于工业化生产；

2、溶剂消耗少，工艺过程中的溶剂都可回收再利用；

2、溶剂毒性小，所用的溶剂为乙醇、甲醇、乙腈、纯水，环境污染小；

4、具有较高的学术价值。目前国内关于酸枣仁皂苷A分离纯化的文献报道较少，结合中压、凝胶以及高压色谱的用于酸枣仁皂苷A的分离纯化属首次。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1

酸枣仁皂苷A对照品的制备方法，其按如下工艺步骤进行：

A.原料提取；将酸枣仁药材100Kg，加入600L体积分数为70％的乙醇溶液，在60℃下热提取2次，每次2小时，冷却至室温，抽滤，合并滤液，浓缩至无醇味，共30L；

B.大孔树脂富集：称取20KgD101大孔吸附树脂装柱，将步骤A的浓缩液用大孔树脂静态吸附过夜15个小时，然后分别用80L的水和50L柱体积的30％乙醇溶液洗脱杂质，再用30L的60％乙醇溶液洗脱目标物质，收集洗脱液，浓缩至1000ml；

C.萃取：向步骤B的浓缩液中加入2000ml正丁醇，进行萃取，收集正丁醇层，浓缩以获得步骤(i)中所述的酸枣仁皂苷A醇提物；

D.中压制备：将步骤C的酸枣仁皂苷A醇提物用50％乙腈水溶解上中压制备柱，用30％乙腈洗脱，浓缩得到纯度为60％左右的酸枣仁皂苷A半成品30g；

E.凝胶纯化：将步骤D所得到的60％左右的酸枣仁皂苷A粗品30g，用50％甲醇水溶解上凝胶柱纯化，用50％甲醇水洗脱，HPLC跟踪检测，收集目标流份，经浓缩，得到纯度为95％左右的酸枣仁皂苷A粗品24g；

F.高压制备：将步骤E所得到的95％左右的酸枣仁皂苷A粗品24g用58％甲醇水溶解，进行高压制备，58％甲醇水洗脱，收集目标流份；

G.产品回收：将步骤F得到的高压流份浓缩、冷冻干燥，得酸枣仁皂苷A对照品20g。

图1为本实施例所得酸枣仁皂苷A对照品的HPLC检测图谱。

检测条件：SB-C18 4.6×250mm 5um 波长203nm 柱温30℃ 流速1ml/min 进样5ul

流动相：27％乙腈(B)-水(A)0-65min

所得酸枣仁皂苷A对照品经HPLC分析纯度为100％。

实施例2

A.原料提取；将酸枣仁药材500Kg，加入2500L体积分数为70％的乙醇溶液，在60℃下热提取2次，每次2小时，冷却至室温，抽滤，合并滤液，浓缩至无醇味，共150L；

B.大孔树脂富集：称取100KgD101大孔吸附树脂装柱，将步骤A的浓缩液用大孔树脂静态吸附过夜20个小时，然后分别用400L的水和250L柱体积的30％乙醇溶液洗脱杂质，再用150L的60％乙醇溶液洗脱目标物质，收集洗脱液，浓缩至5000ml；

C.萃取：向步骤B的浓缩液中加入10L正丁醇，进行萃取，收集正丁醇层，浓缩以获得步骤(i)中所述的酸枣仁皂苷A醇提物；

D.中压制备：将步骤C的酸枣仁皂苷A醇提物用50％乙腈水溶解上中压制备柱，用30％乙腈洗脱，浓缩得到纯度为60％左右的酸枣仁皂苷A半成品150g；

E.凝胶纯化：将步骤D所得到的60％左右的酸枣仁皂苷A粗品150g，用50％甲醇水溶解上凝胶柱纯化，用50％甲醇水洗脱，HPLC跟踪检测，收集目标流份，经浓缩，得到纯度为95％左右的酸枣仁皂苷A粗品120g；

F.高压制备：将步骤E所得到的95％左右的酸枣仁皂苷A粗品120g用58％甲醇水溶解，进行高压制备，58％甲醇水洗脱，收集目标流份；

G.产品回收：将步骤F得到的高压流份浓缩、冷冻干燥，得酸枣仁皂苷A对照品100g。

所得酸枣仁皂苷A对照品经HPLC分析纯度为100％。

对比例1

A.原料提取；将酸枣仁药材200Kg，加入1200L体积分数为70％的乙醇溶液，在60℃下热提取2次，每次2小时，冷却至室温，抽滤，合并滤液，浓缩至无醇味，共60L；

B.大孔树脂富集：称取40KgD101大孔吸附树脂装柱，将步骤A的浓缩液用大孔树脂静态吸附过夜15个小时，然后分别用160L的水和100L柱体积的30％乙醇溶液洗脱杂质，再用60L的60％乙醇溶液洗脱目标物质，收集洗脱液，浓缩至2000ml；

C.萃取：向步骤B的浓缩液中加入4000ml正丁醇，进行萃取，收集正丁醇层，浓缩以获得步骤(i)中所述的酸枣仁皂苷A醇提物；

D.中压制备：将步骤C的酸枣仁皂苷A醇提物用50％乙腈水溶解上中压制备柱，用30％乙腈洗脱，浓缩得到纯度为60％左右的酸枣仁皂苷A半成品60g；

E.凝胶纯化：将步骤D所得到的60％左右的酸枣仁皂苷A粗品30g，用50％甲醇水溶解上凝胶柱纯化，用50％甲醇水洗脱，HPLC跟踪检测，收集目标流份，经浓缩，得到纯度为95％左右的酸枣仁皂苷A 48g。

图2为本对比例所得酸枣仁皂苷A的HPLC检测图谱。

由此可见，未使用高压的情况下，按照传统的中压和凝胶纯化，难以获得高纯度的酸枣仁皂苷A对照品。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.一种酸枣仁皂苷A对照品的制备方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：

(i)提供酸枣仁皂苷A的醇提物；

(ii)所述的醇提物与第一溶剂混合，溶解并得到第一混合物，并利用中压制备柱对所述的第一混合物进行过柱分离，从而获得酸枣仁皂苷A半成品；所述步骤(ii)中的中压制备柱设有柱压0-2MPa；此处，当中压制备柱的柱压为0MPa时，是指中压制备柱处于标准大气压下；

(iii)所述的酸枣仁皂苷A半成品与第二溶剂混合，溶解并得到第二混合物，并利用凝胶柱对所述的第二混合物进行纯化，从而获得酸枣仁皂苷A粗品；所述步骤(iii)的凝胶柱中使用的填料为葡聚糖凝胶；

(iv)所述的酸枣仁皂苷A粗品与第三溶剂混合，溶解并得到第三混合物，利用高压柱对所述的第三混合物进行高压制备，从而得到目标高压流份；高压柱设有柱压5-15Mpa；

(v)浓缩并冷冻干燥(iv)所得高压流份，即获得酸枣仁皂苷A对照品。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(ii)中的第一溶剂为30-50％乙腈溶液；和/或中压制备柱的洗脱剂为30％～45％乙腈溶液。

3.如权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述步骤(ii)中的中压制备柱设有柱压0.5-2MPa；

此处，当中压制备柱的柱压为0MPa时，是指中压制备柱处于标准大气压下。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(iii)中，第二溶剂为40％～60％甲醇。

5.如权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述步骤(iii)中，凝胶柱中使用的洗脱剂为40％～60％甲醇。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(iv)的高压柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶。

7.如权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述步骤(iv)中的高压柱设有柱压7-15MPa。

8.如权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述步骤(iv)中，高压柱洗脱剂为40％～65％甲醇-水溶液。

9.如权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述的酸枣仁皂苷A的醇提物由包括以下步骤的方法制备得到：

(i-1)混合酸枣仁药材和乙醇溶液，在50～70℃下进行提取，固液分离后浓缩液体部分，从而获得第一浓缩液；

(i-2)使用大孔树脂吸附所述的第一浓缩液，然后分别用5～8倍柱体积的水和3-5倍柱体积的15-30％乙醇溶液洗脱杂质，再用1～3倍柱体积的50～65％乙醇溶液洗脱目标物质，收集洗脱液，浓缩以获得第二浓缩液；和

(i-3)向第二浓缩液中加入1～2倍量的正丁醇，进行萃取，收集正丁醇层，浓缩以获得步骤(i)中所述的酸枣仁皂苷A醇提物。

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