CN110857939B - 一种具有改善睡眠功能的中药组合物的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于中药检测技术领域，公开了一种具有改善睡眠功能的中药组合物的检测方法，包括用薄层色谱法鉴别灵芝、首乌藤和酸枣仁及用高效液相色谱法测定斯皮诺素的含量，所述方法对灵芝及首乌藤采用相同的前处理方法，并选择特定的展开剂体系，使灵芝及首乌藤中的各种成分均能很好地分离，实现了两种药材的同时鉴别；各自供试品色谱中，在与阳性对照品色谱对应的位置上，显示相同颜色的斑点，而阴性对照品色谱中均无干扰斑点，表明本发明的方法具有较强的专属性。同时，本发明的方法简化了操作过程，减少了鉴别所需时间，提高了工作效率，降低了检测成本，同时也为中药组合物中各成分的薄层色谱法鉴别提供了新思路，有利于中药质量控制标准的提高。

Description

一种具有改善睡眠功能的中药组合物的检测方法

技术领域

本发明属于中药检测技术领域，具体涉及一种具有改善睡眠功能的中药组合物的检测方法。

背景技术

充足的睡眠、均衡的饮食和适当的运动，是国际社会公认的三项健康标准。人的一生当中，有三分之一的时间都是在睡眠中度过的，睡眠作为生命所必须的过程，是健康不可缺少的组成部分。持续的睡眠障碍可导致躯体和精神损害、社会经济损失等不良后果，包括心血管疾病、精神疾病的发生，免疫力低下，甚至死亡率的增加等问题，已成为严重公共卫生问题。

为此，中国专利文献CN102188610A公开了一种具有改善睡眠功能的中药组合物，包括灵芝、龙眼肉、酸枣仁、柏子仁、首乌藤、黄精、大枣等提取物，但其只介绍了所述中药组合物的原料组成及其制备方法，并未给出相应的产品检测方法，不利于该组合物在生产、流通及使用过程中内在质量的控制。现有技术中，关于灵芝和首乌藤的检测分析方法有很多种，如中国期刊文献“过敏康颗粒质量控制方法研究”公开了首乌藤及灵芝的薄层色谱鉴别方法，考虑到两种药材的成分及性质差异比较大，很难在同一条件下同时鉴别，故该方法对首乌藤及灵芝的前处理方式不尽相同，最终选择的展开剂体系也大相径庭，前者选用的展开剂为苯-乙醇体系，后者选用的展开剂为石油醚(60～90℃)-甲酸乙酯-甲酸体系，操作十分不方便，特别是当需要大批量检测时，其工作量非常大，工作效率低。

发明内容

因此，本发明旨在提供一种具有改善睡眠功能的中药组合物的检测方法。

为此，本发明提供了一种中药组合物的检测方法，包括用薄层色谱法鉴别所述中药组合物中灵芝、首乌藤和酸枣仁，其中，所述薄层色谱法包括如下步骤：

(1)阳性对照品溶液及供试品溶液的制备

取灵芝的阳性对照品、首乌藤的阳性对照品及酸枣仁的阳性对照品，分别加第一溶剂，滤过，滤液蒸干后加第二溶剂，分别作为各自的阳性对照品溶液；

取中药组合物，加第一溶剂，滤过，滤液蒸干后加第二溶剂，作为供试品溶液；

(2)照薄层色谱试验

吸取上述灵芝的阳性对照品溶液、首乌藤的阳性对照品溶液及供试品溶液，分别点在同一硅胶薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置于紫外灯下检视和/或喷以硫酸乙醇溶液并烘干至斑点显色清晰；和，

吸取上述酸枣仁的阳性对照品溶液及供试品溶液，分别点在同一硅胶薄层板上，以水饱和正丁醇为展开剂，展开，取出，晾干，置于紫外灯下检视。

进一步地，所述灵芝的阳性对照品选自灵芝对照药材或灵芝提取物中的至少一种；所述首乌藤的阳性对照品选自首乌藤对照药材或首乌藤提取物中的至少一种；所述酸枣仁的阳性对照品选自酸枣仁对照药材或酸枣仁提取物中的至少一种。

进一步地，所述第一溶剂为甲醇、乙醇、丙醇中的一种或几种；所述第二溶剂为甲醇、乙醇、丙醇中的一种或几种。

进一步地，所述薄层色谱法包括如下步骤：

(1)对照药材溶液、提取物溶液、阴性对照品溶液及供试品溶液的制备

取灵芝对照药材1.5～3g、首乌藤对照药材0.2～0.3g、酸枣仁对照药材0.5～1.5g，分别向其中加入乙醇20～40mL，超声处理20～40分钟，滤过，滤液蒸干后加入乙醇0.5～1.5mL使溶解，分别作为各自的对照药材溶液；

取灵芝提取物0.5～1.5g、首乌藤提取物0.5～1.5g及酸枣仁提取物0.5～1.5g，分别向其中加入乙醇20～40mL，超声处理20～40分钟，滤过，滤液蒸干后加入乙醇0.5～1.5mL使溶解，分别作为各自的提取物溶液；

取不含灵芝提取物的阴性对照品4.5～5.5g、不含首乌藤提取物的阴性对照品4.5～5.5g及不含酸枣仁提取物的阴性对照品4.5～5.5g，分别向其中加入乙醇20～40mL，超声处理20～40分钟，滤过，滤液蒸干后加入乙醇0.5～1.5mL使溶解，分别作为各自的阴性对照品溶液；

取中药组合物4.5～5.5g，向其中加入乙醇20～40mL，超声处理20～40分钟，滤过，滤液蒸干后加入乙醇0.5～1.5mL使溶解，作为供试品溶液；

(2)照薄层色谱试验

吸取上述灵芝对照药材溶液4～6μL、首乌藤对照药材溶液4～6μL、灵芝提取物溶液4～6μL、首乌藤提取物溶液4～6μL、不含灵芝提取物的阴性对照品溶液4～6μL、不含首乌藤提取物的阴性对照品溶液4～6μL及供试品溶液4～6μL，分别点在同一硅胶薄层板上，以体积比为5∶5∶0.2的环己烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置于366nm紫外灯下检视和/或喷以硫酸乙醇溶液并烘干至斑点显色清晰；和，

吸取上述酸枣仁对照药材溶液4～6μL、酸枣仁提取物溶液4～6μL、不含酸枣仁提取物的阴性对照品溶液4～6μL及供试品溶液4～6μL，分别点在同一硅胶薄层板上，以水饱和正丁醇为展开剂，展开，取出，晾干，置于366nm紫外灯下检视。

进一步地，所述薄层色谱法包括如下步骤：

(1)对照药材溶液、提取物溶液、阴性对照品溶液及供试品溶液的制备

取灵芝对照药材2g、首乌藤对照药材0.25g、酸枣仁对照药材1g，分别向其中加入乙醇30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干后加入乙醇1mL使溶解，分别作为各自的对照药材溶液；

取灵芝提取物1g、首乌藤提取物1g及酸枣仁提取物1g，分别向其中加入乙醇30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干后加入乙醇1mL使溶解，分别作为各自的提取物溶液；

取不含灵芝提取物的阴性对照品5g、不含首乌藤提取物的阴性对照品5g及不含酸枣仁提取物的阴性对照品5g，分别向其中加入乙醇30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干后加入乙醇1mL使溶解，分别作为各自的阴性对照品溶液；

取中药组合物5g，向其中加入乙醇30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干后加入乙醇1mL使溶解，作为供试品溶液；

(2)照薄层色谱试验

吸取上述灵芝对照药材溶液5μL、首乌藤对照药材溶液5μL、灵芝提取物溶液5μL、首乌藤提取物溶液5μL、不含灵芝提取物的阴性对照品溶液5μL、不含首乌藤提取物的阴性对照品溶液5μL及供试品溶液5μL，分别点在同一硅胶薄层板上，以体积比为5∶5∶0.2的环己烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置于366nm紫外灯下检视和/或喷以硫酸乙醇溶液并烘干至斑点显色清晰；和，

吸取上述酸枣仁对照药材溶液5μL、酸枣仁提取物溶液5μL、不含酸枣仁提取物的阴性对照品溶液5μL及供试品溶液5μL，分别点在同一硅胶薄层板上，以水饱和正丁醇为展开剂，展开，取出，晾干，置于366nm紫外灯下检视。

进一步地，所述检测方法还包括用高效液相色谱法测定所述中药组合物中斯皮诺素的含量，其中，所述高效液相色谱法包括如下步骤：

(1)斯皮诺素的标准溶液及中药组合物的样品溶液的配制

取斯皮诺素对照品，加第三溶剂制备斯皮诺素的标准溶液；

取中药组合物，加第三溶剂，过滤，所得滤液即为所述中药组合物的样品溶液。

(2)吸取上述斯皮诺素的标准溶液，注入高效液相色谱仪，根据测定结果绘制峰面积-溶液浓度的标准曲线图；

(3)吸取上述中药组合物的样品溶液，注入高效液相色谱仪，根据样品峰面积及标准曲线图，计算所述中药组合物中斯皮诺素的含量。

进一步地，所述第三溶剂为甲醇。

进一步地，所述高效液相色谱法包括以下步骤：

(1)色谱条件与***适应性试验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，所述填充剂粒径不大于2.5μm；以乙腈为流动相A，以水为流动相B进行梯度洗脱；柱温25～35℃；检测波长330～340nm；理论板数按斯皮诺素计算应不低于5000；所述梯度洗脱过程为：

0～10min，流动相A％：12→19，流动相B：88→81；

10～12min，流动相A％：19→100，流动相B：81→0；

12～15min，流动相A％：100，流动相B：0；

15～16min，流动相A％：100→12，流动相B：0→88；

(2)斯皮诺素的标准溶液及所述中药组合物的样品溶液的配制

取斯皮诺素对照品，加甲醇并稀释成至少3种不同浓度的斯皮诺素的标准溶液；

取所述中药组合物1g，加甲醇25mL，超声处理30分钟，用0.22μm有机滤膜过滤，所得滤液即为所述中药组合物的样品溶液；

(3)吸取上述斯皮诺素的标准溶液1μL注入高效液相色谱仪，根据测定结果绘制峰面积-溶液浓度的标准曲线图；

(4)吸取上述中药组合物的样品溶液1μL，注入高效液相色谱仪，根据样品峰面积及标准曲线图，计算所述中药组合物中斯皮诺素的含量。

本发明中，所述中药组合物具有改善睡眠的功能，其原料包括灵芝提取物、酸枣仁提取物及首乌藤提取物。

本发明的技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的中药组合物的检测方法，所述方法包括用薄层色谱法鉴别所述中药组合物中灵芝、首乌藤和酸枣仁及用高效液相色谱法测定所述中药组合物中斯皮诺素的含量，所述方法对灵芝及首乌藤采用采用相同的前处理方法，并选择特定的展开剂体系，使灵芝及首乌藤中的各种成分均能很好地分离，实现了两种药材的同时鉴别，各自供试品色谱中，在与阳性对照品色谱对应的位置上，显示相同颜色的斑点，而阴性对照品色谱中均无干扰斑点，表明本发明同时鉴定中药组合物中灵芝及首乌藤的方法具有较强的专属性。同时，本发明的方法简化了操作过程，减少了鉴别所需的时间，提高了工作效率，降低了检测成本，同时也为中药组合物中各成分的薄层色谱法鉴别提供了新思路，有利于中药质量控制标准的提高。

2.本发明提供的中药组合物的检测方法，所述方法对酸枣仁提取物进行薄层色谱法鉴定时，前处理条件与灵芝及首乌藤的前处理条件相同，进一步简化了操作过程，提高了工作效率。

3.本发明提供的中药组合物的检测方法，具有良好的稳定性、专属性强、准确度高、重复性良好等特点，可有效控制所述中药组合物在生产、流通及使用等环节中的产品质量。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例1的灵芝和首乌藤同时鉴别的薄层色谱图；

图2是本发明实施例2的酸枣仁鉴别的薄层色谱图；

图3是本发明用高效液相色谱法测定中药组合物中斯皮诺素含量的适用性色谱图；

图4是本发明用高效液相色谱法测定中药组合物中斯皮诺素含量的专属性考察色谱图；

图5是本发明用高效液相色谱法测定中药组合物中斯皮诺素含量的线性关系考察图。

附图标记说明：

1-不含首乌藤提取物的阴性对照品；2-首乌藤提取物；3-首乌藤对照药材；4-不含灵芝提取物的阴性对照品；5-灵芝提取物；6-灵芝对照药材；7-9供试品(20170204-1、20170204-2、20170204-3)；10-不含酸枣仁的阴性对照品；11-酸枣仁提取物；12-酸枣仁对照药材。

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。

以下实施例中，改善睡眠功能的中药组合物由完美(中国)有限公司提供；不含首乌藤提取物的阴性对照品、不含灵芝提取物的阴性对照品以及不含酸枣仁提取物的阴性对照品由完美(中国)有限公司提供；灵芝提取物、首乌藤提取物和酸枣仁提取物由广东一方制药有限公司提供；灵芝对照药材、首乌藤对照药材、酸枣仁对照药材和斯皮诺素对照品采购自中国食品药品检定研究院。

以下实施例中，甲醇、乙醇及丙醇均为分析纯，体积浓度≥95％；乙腈为色谱级，体积浓度≥99.9％。

实施例1

本实施例1提供了一种具有改善睡眠的功能的中药组合物的质量控制方法，包括以下步骤：

1.用薄层色谱法鉴别所述中药组合物中灵芝及首乌藤

取改善睡眠功能的中药组合物、不含首乌藤提取物的阴性对照品、不含灵芝的阴性对照品各5g、灵芝提取物1g、首乌藤提取物1g，加乙醇30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液水浴蒸干后加乙醇1mL使其溶解，分别作为供试品溶液、阴性对照品溶液以及提取物溶液。另取灵芝对照药材2g、首乌藤对照药材约0.25g同法制成对照药材溶液。

照《中华人民共和国药典》2015年版通则0502试验，吸取上述溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板(20cm×10cm，青岛海浪硅胶干燥剂有限公司)上，以环己烷-乙酸乙酯-甲酸(体积比为5∶5∶0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇试液，105℃烘干至显色清晰。结果如图1所示，供试品及提取物色谱在与对照药材色谱相同位置处出现相同颜色的主要斑点，阴性对照品色谱在与对照药材色谱相同位置处未出现主要相同颜色斑点。

2.用薄层色谱法鉴别所述中药组合物中酸枣仁

取改善睡眠功能的中药组合物、不含酸枣仁提取物的阴性对照品各5g、酸枣仁提取物1g，加乙醇30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液水浴蒸干后加乙醇1mL使其溶解，作为供试品溶液、阴性对照品溶液以及提取物溶液。另取酸枣仁对照药材1g，同法制成对照药材溶液。

照《中华人民共和国药典》2015年版通则0502试验，吸取上述溶液各1μL，分别点于同一硅胶G薄层板(20cm×10cm，青岛海浪硅胶干燥剂有限公司)上，以水饱和正丁醇为展开剂，展开，取出，晾干，于366nm紫外灯下检视。结果如图2所示，供试品及提取物溶液色谱在与对照药材色谱相同位置处出现相同颜色的主要斑点，阴性对照品色谱在与对照药材色谱相同位置处未出现主要相同颜色斑点。

3.用高效液相法测定所述中药组合物中斯皮诺素的含量

(1)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，所述填充剂粒径为2.5μm；以乙腈为流动相A，以水为流动相B进行梯度洗脱；柱温30℃；流速为1mL/min；检测波长335nm；理论板数按斯皮诺素计算应不低于5000；所述梯度洗脱程具体为：

0～10min，流动相A％：12→19，流动相B：88→81；

10～12min，流动相A％：19→100，流动相B：81→0；

12～15min，流动相A％：100，流动相B：0；

15～16min，流动相A％：100→12，流动相B：0→88。

(2)斯皮诺素的标准溶液及所述中药组合物的样品溶液的配制

取斯皮诺素对照品，加甲醇溶解并稀释成浓度分别为10.7μg/mL、21.4μg/mL、42.8μg/mL、85.6μg/mL、107μg/mL的斯皮诺素的标准溶液；

取所述中药组合物1g，置于25mL容量瓶中，加入体积浓度为70％甲醇约20mL，充分摇匀。将容量瓶放入超声清洗器中，超声处理30分钟，放冷，用体积浓度为70％甲醇定容至刻度，摇匀后用0.22μm有机滤膜过滤，所得滤液即为所述中药组合物的样品溶液。

(3)测定及计算

精密吸取所述斯皮诺素的标准溶液1μL注入高效液相色谱仪，根据测定结果绘制峰面积-溶液浓度标准曲线图；

精密吸取所述中药组合物的样品溶液1μL注入高效液相色谱仪，根据样品峰面积及标准曲线图，计算所述中药组合物中斯皮诺素的含量。

实施例2

本实施例2提供了一种具有改善睡眠的功能的中药组合物的质量控制方法，包括以下步骤：

1.用薄层色谱法鉴别所述中药组合物中灵芝及首乌藤

取改善睡眠功能的中药组合物、不含首乌藤提取物的阴性对照品、不含灵芝的阴性对照品各5g、灵芝提取物1g、首乌藤提取物1g，加甲醇20mL，超声处理40分钟，滤过，滤液水浴蒸干后加丙醇1.5mL使其溶解，分别作为供试品溶液、阴性对照品溶液以及提取物溶液。另取灵芝对照药材2g、首乌藤对照药材约0.25g同法制成对照药材溶液。

照《中华人民共和国药典》2015年版通则0502试验，吸取上述溶液各4μL，分别点于同一硅胶G薄层板(20cm×10cm，青岛海浪硅胶干燥剂有限公司)上，以环己烷-乙酸乙酯-甲酸(体积比为5∶5∶0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，于紫外光灯(366nm)下检视。结果如图5所示，供试品及提取物色谱在与对照药材色谱相同位置处出现相同颜色的主要斑点，阴性对照品色谱在与对照药材色谱相同位置处未出现主要相同颜色斑点。

2.用薄层色谱法鉴别所述中药组合物中酸枣仁

取改善睡眠功能的中药组合物、不含酸枣仁提取物的阴性对照品各5g、酸枣仁提取物1g，加甲醇20mL，超声处理40分钟，滤过，滤液水浴蒸干后加丙醇1.5mL使其溶解，作为供试品溶液、阴性对照品溶液以及提取物溶液。另取酸枣仁对照药材1g，同法制成对照药材溶液。

照《中华人民共和国药典》2015年版通则0502试验，吸取上述溶液各1μL，分别点于同一硅胶G薄层板(20cm×10cm，青岛海浪硅胶干燥剂有限公司)上，以水饱和正丁醇为展开剂，展开，取出，晾干，于366nm紫外灯下检视。结果显示，供试品及提取物溶液色谱在与对照药材色谱相同位置处出现相同颜色的主要斑点，阴性对照品色谱在与对照药材色谱相同位置处未出现主要相同颜色斑点。

3.用高效液相法测定所述中药组合物中斯皮诺素的含量

(1)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，所述填充剂粒径为1.7μm；以乙腈为流动相A，以水为流动相B进行梯度洗脱；柱温25℃；流速为0.5mL/min；检测波长340nm；理论板数按斯皮诺素计算应不低于5000；所述梯度洗脱程具体为：

0～10min，流动相A％：12→19，流动相B：88→81；

10～12min，流动相A％：19→100，流动相B：81→0；

12～15min，流动相A％：100，流动相B：0；

15～16min，流动相A％：100→12，流动相B：0→88。

(2)斯皮诺素的标准溶液及所述中药组合物的样品溶液的配制

取斯皮诺素对照品，加甲醇溶解并稀释成浓度分别为10.7μg/mL、21.4μg/mL、42.8μg/mL、85.6μg/mL、107μg/mL的斯皮诺素的标准溶液；

取所述中药组合物1g，置于25mL容量瓶中，加入体积浓度为70％甲醇约20mL，充分摇匀。将容量瓶放入超声清洗器中，超声处理30分钟，放冷，用体积浓度为70％甲醇定容至刻度，摇匀后用0.22μm有机滤膜过滤，所得滤液即为所述中药组合物的样品溶液。

(3)测定及计算

精密吸取所述斯皮诺素的标准溶液1μL注入高效液相色谱仪，根据测定结果绘制峰面积-溶液浓度标准曲线图；

精密吸取所述中药组合物的样品溶液1μL注入高效液相色谱仪，根据样品峰面积及标准曲线图，计算所述中药组合物中斯皮诺素的含量。

实施例3

本实施例3提供了一种具有改善睡眠的功能的中药组合物的质量控制方法，包括以下步骤：

1.用薄层色谱法鉴别所述中药组合物中灵芝及首乌藤

取改善睡眠功能的中药组合物、不含首乌藤提取物的阴性对照品、不含灵芝的阴性对照品各5g、灵芝提取物1g、首乌藤提取物1g，加丙醇40mL，超声处理20分钟，滤过，滤液水浴蒸干后加甲醇0.5mL使溶解，分别作为供试品溶液、阴性对照品溶液以及提取物溶液。另取灵芝对照药材2g、首乌藤对照药材约0.25g同法制成对照药材溶液。

照《中华人民共和国药典》2015年版通则0502试验，吸取上述溶液各6μL，分别点于同一硅胶G薄层板(20cm×10cm，青岛海浪硅胶干燥剂有限公司)上，以环己烷-乙酸乙酯-甲酸(体积比为5∶5∶0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，于紫外光灯(366nm)下检视，后喷以10％硫酸乙醇试液，105℃烘干至显色清晰。结果如图5所示，供试品及提取物色谱在与对照药材色谱相同位置处出现相同颜色的主要斑点，阴性对照品色谱在与对照药材色谱相同位置处未出现主要相同颜色斑点，且365nm紫外光灯检视的结果与喷以10％硫酸乙醇试剂并在105℃下烘干显示的结果一致。

2.用薄层色谱法鉴别所述中药组合物中酸枣仁

取改善睡眠功能的中药组合物、不含酸枣仁提取物的阴性对照品各5g、酸枣仁提取物1g，加丙醇40mL，超声处理20分钟，滤过，滤液水浴蒸干后加丙醇0.5mL使其溶解，作为供试品溶液、阴性对照品溶液以及提取物溶液。另取酸枣仁对照药材1g，同法制成对照药材溶液。

照《中华人民共和国药典》2015年版通则0502试验，吸取上述溶液各1μL，分别点于同一硅胶G薄层板(20cm×10cm，青岛海浪硅胶干燥剂有限公司)上，以水饱和正丁醇为展开剂，展开，取出，晾干，于366nm紫外灯下检视。结果显示，供试品及提取物溶液色谱在与对照药材色谱相同位置处出现相同颜色的主要斑点，阴性对照品色谱在与对照药材色谱相同位置处未出现主要相同颜色斑点。

3.用高效液相法测定所述中药组合物中斯皮诺素的含量

(1)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，所述填充剂粒径为2.2μm；以乙腈为流动相A，以水为流动相B进行梯度洗脱；柱温35℃；流速为1mL/min；检测波长330nm；理论板数按斯皮诺素计算应不低于5000；所述梯度洗脱程具体为：

0～10min，流动相A％：12→19，流动相B：88→81；

10～12min，流动相A％：19→100，流动相B：81→0；

12～15min，流动相A％：100，流动相B：0；

15～16min，流动相A％：100→12，流动相B：0→88。

(2)斯皮诺素的标准溶液及所述中药组合物的样品溶液的配制

取斯皮诺素对照品，加甲醇溶解并稀释成浓度分别为10.7μg/mL、21.4μg/mL、42.8μg/mL、85.6μg/mL、107μg/mL的斯皮诺素的标准溶液；

取所述中药组合物1g，置于25mL容量瓶中，加入体积浓度为70％甲醇约20mL，充分摇匀。将容量瓶放入超声清洗器中，超声处理30分钟，放冷，用体积浓度为70％甲醇定容至刻度，摇匀后用0.22μm有机滤膜过滤，所得滤液即为所述中药组合物的样品溶液。

(3)测定及计算

精密吸取所述斯皮诺素的标准溶液1μL注入高效液相色谱仪，根据测定结果绘制峰面积-溶液浓度标准曲线图；

精密吸取所述中药组合物的样品溶液1μL注入高效液相色谱仪，根据样品峰面积及标准曲线图，计算所述中药组合物中斯皮诺素的含量。

实验例1 方法的适用性考察

按照本发明的质量控制方法中制备中药组合物的样品溶液的方法制备样品溶液，吸取1μL样品溶液注入高效液相色谱仪，并按照本发明实施例1的高效液相色谱条件，记录色谱图，如图3所示。用色谱数据处理软件计算斯皮诺素色谱峰的***适用性，结果如下表1所示。

表1斯皮诺素色谱峰的***适用性考察结果

由上表1可知，斯皮诺素色谱峰的***适用性考察结果符合判定标准，表明本发明的斯皮诺素测定方法具有很好的***适用性。

实验例2 方法的专属性考察

按照本发明的质量控制方法中制备中药组合物的样品溶液的方法分别制备不含酸枣仁的阴性对照品溶液及中药组合物的样品溶液，分别吸取1μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，如图4所示。结果显示不含酸枣仁的阴性对照品溶液色谱图中未见与所述中药组合物的样品溶液色谱图中和斯皮诺素具有相同保留时间的色谱峰，证明阴性对照品无干扰。

实验例3 方法的线性关系考察

取浓度分别为10.7μg/mL、21.4μg/mL、42.8μg/mL、85.6μg/mL、107μg/mL的斯皮诺素的标准溶液1μL，分别注入高效液相色谱仪，按照实施例1的色谱条件，记录色谱图。以保留时间定性，测得峰面积；以标准溶液浓度x为横坐标，峰面积y为纵坐标，进行线性回归计算，结果如下表2及图5所示。

表2线性关系考察结果

由上表2可以看出，斯皮诺素在10.7～107.0μg/mL浓度范围内线性关系良好。

实验例4 方法的重复性考察

精密称定同一批号的中药组合物6份，每份1.0g(精确到0.001g)，按照本发明的质量控制方法中制备中药组合物的样品溶液的方法制备6份样品溶液，重复进样6次，按照实施例1的色谱条件，记录色谱图。样品中斯皮诺素的含量用色谱数据处理软件中的外标法或公式(1)计算，结果如下表3所示。

式中：X-试样中斯皮诺素的含量，g/100g；

C-由标准曲线查得测定样液中斯皮诺素的浓度，μg/mL；

V-被测样液的最终定容体积，mL；

m-试样的质量，g。

表3重复性考察结果

由上表3可知，本发明的重复性考察结果符合判定标准，表明本发明的方法具有很好的重复性。

实验例5 方法的精密度考察

精密称取同一批次的中药组合物1.0407g，定容体积为25mL，按照本发明的质量控制方法中制备中药组合物的样品溶液的方法制备6份样品溶液，重复进样6次，记录色谱峰面积，结果如下表4所示。

表4精密度考察结果

	1	2	3	4	5	6	RSD(％)
								峰面积	581854	580775	577947	580542	579019	580485	0.24

由上表4可知，本发明的方法精密度良好。

实验例6 方法的准确度考察

根据《中华人民共和国药典》2015版四部《9101药品质量标准分析方法验证指导原则》中对准确度的数据要求，本实验采用3种不同的浓度，每种浓度分别制备3份样品溶液进行测定，样品溶液的制备按照本发明的质量控制方法中制备中药组合物的样品溶液的方法。用9份样品的测定结果进行评价，即高、中、低浓度对照品加入质量与所取样品中待测定成分质量之比控制在0.8∶1、1∶1、1.2∶1左右。

精密称取已知斯皮诺素含量的中药组合物9份(批号：20180612-1，含量：0.114g/100g)，每份0.5g(精确到0.001g)。其中三份精密添加浓度为1.07mg/mL的斯皮诺素对照品溶液0.40mL，即斯皮诺素的添加量为428μg；另取三份精密添加斯皮诺素对照品溶液0.5mL，即斯皮诺素的添加量为535μg；最后三份精密添加斯皮诺素对照品溶液0.6mL，即斯皮诺素的添加量为642μg。按照本发明的质量控制方法中制备中药组合物的样品溶液的方法制成样品溶液，按照实施例1的色谱条件，依次测定各自的斯皮诺素的含量，并按公式(2)计算回收率，结果如下表5所示。

式中：A-供试品中斯皮诺素的含量，μg；

B-加入斯皮诺素的量，μg；

C-添加斯皮诺素样品溶液中斯皮诺素的测得量，μg。

表5准确度考察结果

由上表5可知，本发明的回收率均在95％-105％之间，表明本发明的方法具有较好的准确度。

实验例7 方法的检测限考察

根据《中华人民共和国药典》2015版四部《9101药品质量标准分析方法验证指导原则》中检测限的确定方法，选择信噪比法来确定本实验的检测限，即分析方法的检测限(DL)由信噪比(S/N)计算，DL定义为S/N＝3时对应的待分析物浓度。具体为：

精密称取已知斯皮诺素含量的中药组合物1.0407g，其中，斯皮诺素含量为0.114g/100g，按照本发明的质量控制方法中制备中药组合物的样品溶液的方法制备样品溶液，取0.05mL所述样品溶液置于25mL容量瓶中，用体积浓度为70％甲醇定容至刻度，摇匀，用0.22μm有机滤膜滤过，取滤液，依照实施例1的色谱条件，注入超高效液相色谱仪中，记录色谱图，通过工作站色谱软件计算出信噪比为3.6，得出该分析方法的检出限为0.095ug/mL。

实施例8 方法的耐用性考察

取三批中药组合物样品，分别按照本发明的质量控制方法中制备中药组合物的样品溶液的方法制备3份样品溶液，分别按照《中国药典2015版》酸枣仁项下的色谱方法和本发明的高效液相色谱方法进行含量测定，结果见下表6所示。

表6耐用性考察结果

由上表6可知，不同的色谱条件下测得的斯皮诺素的含量相对偏差小于5％，说明本发明的测定方法耐用性较好。

实验例9 样品的稳定性考察

取同一组合物的样品溶液，按照实施例1的色谱条件，分别于0、4、12、24h进样测定，结果见下表9所示。

表7稳定性考察结果

由上表7可知，斯皮诺素色谱峰峰面积的RSD为0.62％，表明本发明所述组合物的样品溶液在24h内基本稳定。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举，而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (7)

1.一种中药组合物的检测方法，包括用薄层色谱法鉴别所述中药组合物中灵芝、首乌藤和酸枣仁，其特征在于，所述薄层色谱法包括如下步骤：

（1）阳性对照品溶液及供试品溶液的制备

取灵芝的阳性对照品、首乌藤的阳性对照品及酸枣仁的阳性对照品，分别加第一溶剂，滤过，滤液蒸干后加第二溶剂，分别作为各自的阳性对照品溶液；

取中药组合物，加第一溶剂，滤过，滤液蒸干后加第二溶剂，作为供试品溶液；

（2）照薄层色谱试验

吸取上述灵芝的阳性对照品溶液、首乌藤的阳性对照品溶液及供试品溶液，分别点在同一硅胶薄层板上，以体积比为5：5：0.2的环己烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置于紫外灯下检视和/或喷以硫酸乙醇溶液并烘干至斑点显色清晰；和，

吸取上述酸枣仁的阳性对照品溶液及供试品溶液，分别点在同一硅胶薄层板上，以水饱和正丁醇为展开剂，展开，取出，晾干，置于紫外灯下检视；

所述第一溶剂为甲醇、乙醇、丙醇中的一种或几种；所述第二溶剂为甲醇、乙醇、丙醇中的一种或几种；

中药组合物的原料包括灵芝提取物、酸枣仁提取物和首乌藤提取物。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述灵芝的阳性对照品选自灵芝对照药材或灵芝提取物中的至少一种；所述首乌藤的阳性对照品选自首乌藤对照药材或首乌藤提取物中的至少一种；所述酸枣仁的阳性对照品选自酸枣仁对照药材或酸枣仁提取物中的至少一种。

3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述薄层色谱法包括如下步骤：

（1）对照药材溶液、提取物溶液、阴性对照品溶液及供试品溶液的制备

取灵芝对照药材1.5～3g、首乌藤对照药材0.2～0.3g、酸枣仁对照药材0.5～1.5g，分别向其中加入乙醇20～40mL，超声处理20～40分钟，滤过，滤液蒸干后加入乙醇0.5～1.5mL使溶解，分别作为各自的对照药材溶液；

取灵芝提取物0.5～1.5g、首乌藤提取物0.5～1.5g及酸枣仁提取物0.5～1.5g，分别向其中加入乙醇20～40mL，超声处理20～40分钟，滤过，滤液蒸干后加入乙醇0.5～1.5mL使溶解，分别作为各自的提取物溶液；

取不含灵芝提取物的阴性对照品4.5～5.5g、不含首乌藤提取物的阴性对照品4.5～5.5g及不含酸枣仁提取物的阴性对照品4.5～5.5g，分别向其中加入乙醇20～40mL，超声处理20～40分钟，滤过，滤液蒸干后加入乙醇0.5～1.5mL使溶解，分别作为各自的阴性对照品溶液；

取中药组合物4.5～5.5g，向其中加入乙醇20～40mL，超声处理20～40分钟，滤过，滤液蒸干后加入乙醇0.5～1.5mL使溶解，作为供试品溶液；

（2）照薄层色谱试验

吸取上述灵芝对照药材溶液4～6μL、首乌藤对照药材溶液4～6μL、灵芝提取物溶液4～6μL、首乌藤提取物溶液4～6μL、不含灵芝提取物的阴性对照品溶液4～6μL、不含首乌藤提取物的阴性对照品溶液4～6μL及供试品溶液4～6μL，分别点在同一硅胶薄层板上，以体积比为5：5：0.2的环己烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置于366nm紫外灯下检视和/或喷以硫酸乙醇溶液并烘干至斑点显色清晰；和，

吸取上述酸枣仁对照药材溶液4～6μL、酸枣仁提取物溶液4～6μL 、不含酸枣仁提取物的阴性对照品溶液4～6μL及供试品溶液4～6μL，分别点在同一硅胶薄层板上，以水饱和正丁醇为展开剂，展开，取出，晾干，置于366nm紫外灯下检视。

4.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述薄层色谱法包括如下步骤：

（1）对照药材溶液、提取物溶液、阴性对照品溶液及供试品溶液的制备

取灵芝对照药材2g、首乌藤对照药材0.25g、酸枣仁对照药材1g，分别向其中加入乙醇30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干后加入乙醇1mL使溶解，分别作为各自的对照药材溶液；

取灵芝提取物1g、首乌藤提取物1g及酸枣仁提取物1g，分别向其中加入乙醇30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干后加入乙醇1mL使溶解，分别作为各自的提取物溶液；

取不含灵芝提取物的阴性对照品5g、不含首乌藤提取物的阴性对照品5g及不含酸枣仁提取物的阴性对照品5g，分别向其中加入乙醇30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干后加入乙醇1mL使溶解，分别作为各自的阴性对照品溶液；

取中药组合物5g，向其中加入乙醇30mL，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干后加入乙醇1mL使溶解，作为供试品溶液；

（2）照薄层色谱试验

吸取上述灵芝对照药材溶液5μL、首乌藤对照药材溶液5μL、灵芝提取物溶液5μL、首乌藤提取物溶液5μL、不含灵芝提取物的阴性对照品溶液5μL、不含首乌藤提取物的阴性对照品溶液5μL及供试品溶液5μL，分别点在同一硅胶薄层板上，以体积比为5：5：0.2的环己烷-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置于366nm紫外灯下检视和/或喷以硫酸乙醇溶液并烘干至斑点显色清晰；和，

吸取上述酸枣仁对照药材溶液5μL、酸枣仁提取物溶液5μL、不含酸枣仁提取物的阴性对照品溶液5μL及供试品溶液5μL，分别点在同一硅胶薄层板上，以水饱和正丁醇为展开剂，展开，取出，晾干，置于366nm紫外灯下检视。

5.根据权利要求1或2所述的检测方法，还包括用高效液相色谱法测定所述中药组合物中斯皮诺素的含量，其特征在于，所述高效液相色谱法包括如下步骤：

（1）斯皮诺素的标准溶液及中药组合物的样品溶液的配制

取斯皮诺素对照品，加第三溶剂制备斯皮诺素的标准溶液；

取中药组合物，加第三溶剂，过滤，所得滤液即为所述中药组合物的样品溶液；

（2）吸取上述斯皮诺素的标准溶液，注入高效液相色谱仪，根据测定结果绘制峰面积-溶液浓度的标准曲线图；

（3）吸取上述中药组合物的样品溶液，注入高效液相色谱仪，根据样品峰面积及标准曲线图，计算所述中药组合物中斯皮诺素的含量。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述第三溶剂为甲醇。

7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法包括以下步骤：

（1）色谱条件与***适应性试验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，所述填充剂粒径不大于2.5μm；以乙腈为流动相A，以水为流动相B进行梯度洗脱；柱温25～35℃；检测波长330～340nm；理论板数按斯皮诺素计算应不低于5000；所述梯度洗脱过程为：

0～10min，流动相A%：12→19，流动相B：88→81；

10～12min，流动相A%：19→100，流动相B：81→0；

12～15min，流动相A%：100，流动相B：0；

15～16min，流动相A%：100→12，流动相B：0→88；

（2）斯皮诺素的标准溶液及所述中药组合物的样品溶液的配制

取斯皮诺素对照品，加甲醇并稀释成至少3种不同浓度的斯皮诺素的标准溶液；

取所述中药组合物1g，加甲醇25mL，超声处理30分钟，用0.22μm有机滤膜过滤，所得滤液即为所述中药组合物的样品溶液；

（3）吸取上述斯皮诺素的标准溶液1μL注入高效液相色谱仪，根据测定结果绘制峰面积-溶液浓度的标准曲线图；

（4）吸取上述中药组合物的样品溶液1μL，注入高效液相色谱仪，根据样品峰面积及标准曲线图，计算所述中药组合物中斯皮诺素的含量。

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